HK1007334B - Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties - Google Patents

Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties Download PDF

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Claims (63)

  1. Gewebeplasminogenaktivator-(t-PA)-Variante, die in einem Assay auf enzymatische Aktivität eine größere Differenzaktivität zwischen der einkettigen Form und der zweikettigen Form als rekombinanter Wildtyp-t-PA aufweist, aufgrund von:
    (a) einer anderen Aminosäure als Phenylalanin, die an Aminosäure-Position 305 des Wildtyp-t-PAs substituiert ist; oder
    (b) einer Aminosäure, die nach einer oder beiden der Aminosäure-Positionen 304 und 305 des Wildtyp-t-PAs eingefügt ist; oder
    (c) einer oder mehrerer Aminosäuren, die an den Aminosäure-Positionen 297 bis einschließlich 305 des Wildtyp-t-PAs gelöscht sind; wobei die Numerierung der Aminosäure-Positionen jener in Fig. 1 entspricht.
  2. Variante nach Anspruch 1, worin die substituierte oder eingefügte Aminosäure eine Seitenkette besitzt, die als Wasserstoffbindungs-Donor wirken kann oder wirkt.
  3. Variante nach Anspruch 2, worin die Aminosäure Histidin, Tyrosin, Asparagin, Lysin, Arginin oder Glutamin ist.
  4. Variante nach Anspruch 3, worin die Aminosäure Histidin ist.
  5. Variante nach Anspruch 1, worin die Löschung an Position 297, 300, 304 oder 305 erfolgt.
  6. Variante nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus    F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; i304H t-PA; i304T t-PA; i304N t-PA; i304K t-PA; i304R t-PA; i304Q t-PA; i304HH t-PA; i305H t-PA; i305T t-PA; i305N t-PA; i305K t-PA; i305R t-PA; i305Q t-PA; i304H, i305H t-PA; i305HH t-PA; d297 t-PA; d298 t-PA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301 t-PA; d302 t-PA; d303 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297-298 t-PA; d297-299 t-PA; d297-300 t-PA; d297-301 t-PA; d297-302 t-PA; d297-303 t-PA; d297-304 t-PA; d297-305 t-PA; d300-301 t-PA; d300-302 t-PA; d300-303 t-PA; d300-304 t-PA; d300-305 t-PA; d304-305 t-PA; d297,d300 t-PA; d297,d305 t-PA; dl-44,N184D,F305H t-PA; dl-44,F305H t-PA; dl-44,I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; dl-44,I210R, G211A, K212R, V213K,F305H t-PA; dl-44,V213K,F305H t-PA; dl-44,T252R, F305H t-PA; dl-44,V213K,T252R,F305H t-PA; dl-44, I210K,F305H t-PA; dl-44,I210R,G211H,K212Q,V213K,F305H t-PA; I210R,G211H,K212Q,V213K, F305H t-PA; I210R,G211A,K212R, V213R,F305H t-PA; dl-44,N184D, I210R,G211A,K212R, V213R,T252R, F305H t-PA; N184D,I210R,G211A, K212R,V213R, T252R,F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA; d92-179, I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d92-179,N184D,I210R, G211A, K212R,V213R,T252R,F305H t-PA; d92-179, I210H,G211A, K212R,V213R, T252R,F305H t-PA; Y67N,F305H t-PA; und dl-44,Y67N,F305H t-PA.
  7. Variante nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus    F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; i304H t-PA; dl-44, F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA; dl-44, N184D, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R, V213K, F305H t-PA; I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; dl-44, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; und N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA.
  8. Menschliche Gewebeplasminogenaktivator-(t-PA)-Variante, die in der Lage ist, eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten aufzuweisen: eine größere Differenzaktivität zwischen der einkettigen Form und der zweikettigen Form als rekombinanter Wildtyp-t-PA, ein größeres Verhältnis von fibrin-abhängiger spezifischer Aktivität zu fibrinogen-abhängiger spezifischer Aktivität in einem S-2251-Assay als Wildtyp-rt-PA, oder ein größeres Verhältnis von plasmagerinnungs-abhängiger spezifischer Aktivität zu plasma-abhängiger spezifischer Aktivität in einem S-2251-Assay als Wildtyp-rt-PA, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine Aminosäure-Substitution in ihrer Proteasen-Domäne im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-t-PA enthält (von Aminosäure 264 bis Aminosäure 527), wobei die Substitution für diese biologische Aktivität verantwortlich ist, vorausgesetzt, daß die Varianten d296-302 t-PA, R304E t-PA, R304S t-PA und A473S t-PA ausgeschlossen sind, und wobei die Substitution alleinige Substitutionen in den Bereichen 270 - 280, 448 - 450 und 502 - 527 und Substitutionen in den Bereichen 411 - 416, 416 - 423 oder 423 - 430 ausschließt; wobei die Numerierung der Aminosäure-Positionen jener in Fig. 1 entspricht.
  9. Variante nach Anspruch 8, worin die Substitution das Ersetzen einer Arg, Asp, His, Glu oder Lys durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure umfaßt.
  10. Variante nach Anspruch 9, worin die zum Ersetzen verwendete Aminosäure Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Tyrosin ist.
  11. Variante nach Anspruch 9, worin die zum Ersetzen verwendete Aminosäure Alanin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Tyrosin ist.
  12. Variante nach Anspruch 9, worin die zum Ersetzen verwendete Aminosäure Alanin, Serin oder Threonin ist.
  13. Variante nach Anspruch 12, worin die Substitution an Position 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 331, 332, 339, 342, 347, 348, 349, 351, 364, 365, 366, 408, 410, 432, 434, 440, 445, 449, 453, 460, 462 oder 477 oder an Kombinationen davon des entsprechenden Wildtyp-t-PAs erfolgt.
  14. Variante nach Anspruch 13, worin die Substitution an (den) Position(en) 267, 283 + 287, 296 - 299, 303 - 304, 331 - 332, 339 + 342, 347 - 349 + 351, 364 - 366, 408, 410, 432 + 434, 440, 445 + 449, 449 + 453, 460 + 462 oder 477 des entsprechenden Wildtyp-t-PAs erfolgt, wobei das "+" Änderungen nur an den angegebenen Positionen und das "-" Änderungen an allen angegebenen Positionen angibt.
  15. Variante nach Anspruch 14, d.h. R267A t-PA, D283A, H287A t-PA, K296A, H297A, R298A, R299A t-PA, E303A, R304A t-PA, H331A, H332A t-PA, R339A, R342A t-PA, E347A, E348A, E349A, K351A t-PA, D364A, D365A, D366A t-PA, E408A t-PA, E410A t-PA, H432A, R434A t-PA, R440A t-PA, H445A, R449A t-PA, R449A, D453A t-PA, D460A, R462A t-PA, oder D477A t-PA.
  16. Variante nach Anspruch 14 mit einer Substitution an jeder der Aminosäure-Positionen 296 bis einschließlich 299.
  17. Variante nach Anspruch 16 mit einem substituierten Alanin an jeder der Aminosäure-Positionen 296 bis einschließlich 299.
  18. Variante nach Anspruch 16 mit einem substituierten Alanin an jeder der Aminosäure-Positionen 296 bis einschließlich 299.
  19. Variante nach Anspruch 12, worin die Substitution an den Positionen 416 - 418 oder 426 - 427 + 429 - 430 des entsprechenden Wildtyp-t-PAs erfolgt, wobei das "+" Änderungen nur an den angegebenen Positionen und das "-" Änderungen an allen angegebenen Positionen angibt.
  20. Variante nach Anspruch 19, d.h. K416A, H417A, E418A t-PA oder E426A, R427A, K429A, E430A t-PA.
  21. Variante nach irgendeinem der Ansprüche 8 - 20, der zumindest ein Abschnitt der Fingerdomäne des entsprechenden Wildtyp-t-PAs fehlt.
  22. Variante nach irgendeinem der Ansprüche 8 - 21, die eine Aminosäure-Substitution, -Einfügung oder -Löschung an einer Position 117 - 119, 184 - 186 oder 448 - 450 des entsprechenden menschlichen Wildtyp-t-PAs aufweist.
  23. Variante nach Anspruch 22, der die funktionelle Kohlenhydrat-Struktur bei Aminosäure 184 fehlt.
  24. Variante nach irgendeinem der Ansprüche 8 - 23, die innerhalb der Wachstumsfaktor-Domäne des entsprechenden Wildtyp-t-PAs glykosyliert ist.
  25. Variante nach Anspruch 24, die ein Asparagin an Position 67 des entsprechenden Wildtyp-t-PAs enthält.
  26. Variante nach irgendeinem der Ansprüche 8 - 25, der die Aminosäuren 92 bis einschließlich 179 des entsprechenden Wildtyp-t-PAs fehlen.
  27. Gewebeplasminogenaktivator-(t-PA)-Variante nach Anspruch 8, die an jeder der Positionen 296 - 299 ein substituiertes Alanin aufweist.
  28. Verfahren zur Identifizierung von Gewebeplasminogenaktivator-(t-PA)-Varianten, die eine größere Differenzaktivität zwischen der einkettigen Form und der zweikettigen Form als rekombinanter Wildtyp-t-PA aufweisen, umfassend:
    (a) Substituieren einer anderen Aminosäure als Phenylalanin an Aminosäure-Position 305 des Wildtyp-t-PAs; oder
    (b) Einfügen einer Aminosäure nach einer oder beiden Aminosäure-Positionen 304 und 305 des Wildtyp-t-PAs; oder
    (c) Löschen einer oder mehrerer Aminosäuren an den Aminosäure-Positionen 297 bis einschließlich 305 des Wildtyp-t-PAs; wobei die Numerierung der Aminosäure-Positionen jener in Fig. 1 entspricht.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die substituierte oder eingefügte Aminosäure eine Seitenkette besitzt, die als Wasserstoffbindungs-Donor wirken kann oder wirkt.
  30. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Aminosäure Histidin ist.
  31. Verfahren zur Identifizierung von Gewebeplasminogenaktivator-Varianten mit spezifizierter biologischer Aktivität, umfassend:
    (a) Einbringen zumindest einer Aminosäure-Substitution in die Proteasen-Domäne von Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) (Aminosäure-Positionen 264 - 527), wobei die Substitution alleinige Substitutionen in den Bereichen 270 - 280, 448 - 450 und 502 - 527 des entsprechenden Wildtyp-t-PAs ausschließt; und
    (b) Screenen der resultierenden t-PA-Variante auf ihre Fähigkeit, eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten aufzuweisen: (a) eine größere Differenzaktivität zwischen der einkettigen Form und der zweikettigen Form als rekombinanter Wildtyp-t-PA, (b) ein größeres Verhältnis von fibrin-abhängiger spezifischer Aktivität zu fibrinogen-abhängiger spezifischer Aktivität in einem S-2251-Assay als Wildtyp-rt-PA, oder (c) ein größeres Verhältnis von plasmagerinnungs-abhängiger spezifischer Aktivität zu plasma-abhängiger spezifischer Aktivität in einem S-2251-Assay als Wildtyp-rt-PA; vorausgesetzt, daß das Screenen auf Aktivität (a) ausgeschlossen ist, falls die Substitution im t-PA-Bereich von Position 411 bis 416, 416 - 423 oder 423 - 430 liegt; wobei die Numerierung der Aminosäure-Positionen jener in Fig. 1 entspricht.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, worin die zu screenende t-PA-Variante in einem transienten Expressionssystem produziert wird.
  33. Verfahren nach Anspruch 31, worin die Substitution das Ersetzen eines Arg, Asp, His, Glu oder Lys von Wildtyp-t-PA durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure umfaßt.
  34. Verfahren nach Anspruch 33, worin das Ersetzen an (den) Position(en) 267, 283 + 287, 296 - 299, 303 - 304, 322, 331 - 332, 339 + 342, 347 - 349 + 351, 353 + 355 - 356, 360 - 362, 364 - 366, 408, 410, 416 - 418, 426 - 427 + 429 - 430, 432 - 434, 440, 445 + 449, 449 + 453, 460 + 462 oder 477 oder Kombinationen davon des entsprechenden Wildtyp-t-PAs erfolgt, wobei das "+" Änderungen nur an den angegebenen Positionen und das "-" Änderungen an allen angegebenen Positionen angibt.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, worin die zum Ersetzen verwendete Aminosäure Alanin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Tyrosin ist.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, worin die zum Ersetzen verwendete Aminosäure Alanin ist.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, worin das Ersetzen an (den) Position(en) 267, 283 + 287, 296 - 299, 303 - 304, 331 - 332, 339 + 342, 347 - 349 + 351, 364 - 366, 408, 410, 416 - 418, 426 - 427 + 429 - 430, 432 - 434, 440, 445 + 449, 449 + 453, 460 + 462 oder 477 des entsprechenden Wildtyp-t-PAs erfolgt, wobei das "+" Änderungen nur an den angegebenen Positionen und das "-" Änderungen an allen angegebenen Positionen angibt.
  38. DNA-Molekül, das für die Variante nach Anspruch 1 kodiert.
  39. DNA-Molekül, das für die Variante nach Anspruch 8 kodiert.
  40. DNA-Molekül nach Anspruch 39, worin die Variante an jeder der Positionen 296 - 299 ein substituiertes Alanin aufweist.
  41. DNA-Molekül nach Anspruch 39, das für R267A t-PA, D283A, H287A t-PA, K296A, H297A, R298A, R299A t-PA, E303A, R304A t-PA, H331A, H332A t-PA, R339A, R342A t-PA, E347A, E348A, E349A, K351A t-PA, D364A, D365A, D366A t-PA, E408A t-PA, E410A t-PA, K416A, H417A, E418A t-PA, E426A, R427A, K429A, E430A t-PA, H432AR434A t-PA, R440A t-PA, H445A, R449A t-PA, R449A, D453A t-PA, D460A, R462A t-PA, oder D477A t-PA. kodiert.
  42. Replikabler Expressionsvektor, der in der Lage ist, in einer transformierten Wirtszelle die DNA-Sequenz nach Anspruch 38 zu exprimieren.
  43. Replikabler Expressionsvektor nach Anspruch 42, worin die transformierte Wirtszelle eukaryotisch ist.
  44. Replikabler Expressionsvektor, der in der Lage ist, in einer transformierten Wirtszelle die DNA-Sequenz nach Anspruch 39 zu exprimieren.
  45. Replikabler Expressionsvektor nach Anspruch 44, worin die transformierte Wirtszelle prokaryotisch ist.
  46. Replikabler Expressionsvektor nach Anspruch 44, worin die Variante an jeder der Positionen 296 - 299 ein substituiertes Alanin aufweist.
  47. Vektor nach Anspruch 46, der pTPA33-2 ist, erhältlich mit der Hinterlegungsnummer ATCC 68.059.
  48. Wirtszellen, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 42.
  49. Eukaryotische Wirtszellen, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 43.
  50. Zellen nach Anspruch 49, die Hefezellen sind.
  51. Zellen nach Anspruch 49, die Säugetierzellen sind.
  52. Wirtszellen, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 44.
  53. Wirtszellen nach Anspruch 52, die eukaryotische Zellen sind.
  54. Wirtszellen nach Anspruch 53, die zur transienten Expression der für die Variante kodierenden DNA-Sequenz befähigt sind.
  55. Prokaryotische Wirtszellen, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 45.
  56. Wirtszellen nach Anspruch 52, worin die Variante an jeder der Positionen 296 - 299 ein substituiertes Alanin aufweist.
  57. E. coli-Wirtszellen, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 47.
  58. Zusammensetzung zur Behandlung eines vaskulären Zustands oder Erkrankung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Variante nach Anspruch 1 in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  59. Zusammensetzung zur Behandlung eines vaskulären Zustands oder Erkrankung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Variante nach Anspruch 8 in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  60. Zusammensetzung nach Anspruch 59, worin die Variante an jeder der Positionen 296 - 299 ein substituiertes Alanin aufweist.
  61. Zusammensetzung zum Verhindern von Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Variante nach Anspruch 1 in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  62. Zusammensetzung zum Verhindern von Fibrinablagerung oder Adhäsionsbildung oder -wiederbildung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Variante nach Anspruch 8 in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  63. Zusammensetzung nach Anspruch 62, worin die Variante an jeder der Positionen 296 - 299 ein substituiertes Alanin aufweist.
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