GR20210100091A - Detection and mutational analysis og an rna virus in an environmental sample - Google Patents
Detection and mutational analysis og an rna virus in an environmental sample Download PDFInfo
- Publication number
- GR20210100091A GR20210100091A GR20210100091A GR20210100091A GR20210100091A GR 20210100091 A GR20210100091 A GR 20210100091A GR 20210100091 A GR20210100091 A GR 20210100091A GR 20210100091 A GR20210100091 A GR 20210100091A GR 20210100091 A GR20210100091 A GR 20210100091A
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- seq
- viral rna
- rna
- environmental samples
- nested pcr
- Prior art date
Links
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 22
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 title abstract 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 19
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 31
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims abstract description 29
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims description 70
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 58
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 53
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 52
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 50
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 48
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 41
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 41
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 31
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 29
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 29
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 19
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 17
- 230000009948 RNA mutation Effects 0.000 claims description 12
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims description 10
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 4
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 claims description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000011499 joint compound Substances 0.000 claims description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 claims 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 claims 1
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 claims 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 22
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 10
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 7
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 6
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102100021798 SH2 domain-containing protein 3C Human genes 0.000 description 6
- 101000779242 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF3a protein Proteins 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101150001656 ORF3a gene Proteins 0.000 description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 4
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 102220621765 AP-3 complex subunit beta-1_Q57H_mutation Human genes 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 3
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229920001903 high density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004700 high-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101800001631 3C-like serine proteinase Proteins 0.000 description 1
- -1 Arginine amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- NOIFOWJJGQVKJH-UHFFFAOYSA-N C(=N)=S.C(Cl)(Cl)Cl Chemical compound C(=N)=S.C(Cl)(Cl)Cl NOIFOWJJGQVKJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101150107604 NSP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710193592 ORF3a protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 101800004803 Papain-like protease Proteins 0.000 description 1
- 101800002227 Papain-like protease nsp3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001074 Papain-like proteinase Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 101001024637 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000008910 Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008826 genomic mutation Effects 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002117 illicit drug Substances 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102220142797 rs769948709 Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ RNA ΙΩΝ ΣΕ DETECTION AND ANALYSIS OF RNA VIRUS MUTATIONS IN
ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ENVIRONMENTAL SAMPLES
ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ DESCRIPTION
ΤΕΧΝΙΚΟ ΠΕΔΙΟ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με την ανίχνευση και την ανάλυση μεταλλάξεων ενός ιού και πιο συγκεκριμένα ενός RNA ιού, σε περιβαλλοντικά δείγματα. The present invention relates to the detection and analysis of mutations of a virus, and more specifically of an RNA virus, in environmental samples.
ΥΠΟΒΑΘΡΟ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ BACKGROUND OF THE INVENTION
Οι ιοί RNA έχουν εμφανιστεί ως μια από τις πιο κοινές κατηγορίες παθογόνων που προκαλούν σοβαρές ασθένειες. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι επιδεικνύουν εντυπωσιακές δυνατότητες προσαρμογής σε διάφορα περιβάλλοντα και αντιμετωπίζουν τις προκλήσεις που συναντούν [Moratorio, G., et al., Attenuation of RNA viruses by redirecting their evolution in sequence space. Nat Microbiol, 2017. 2: p. 17088]. Αυτή η εξαιρετική ικανότητα αντιμετώπισης του ανοσοποιητικού συστήματος και των αμυντικών μηχανισμών του κυττάρου ξενιστή, καθώς επίσης και η αντοχή τους στα αντιικά φάρμακα, οφείλεται κυρίως στους εξαιρετικά υψηλούς ρυθμούς μετάλλαξής τους, οι οποίοι προκαλούνται από την απουσία μηχανισμών διόρθωσης της RNA-εξαρτώμενης πολυμεράσης, γεγονός που οδηγεί σε παράλειψη διόρθωσης των σφαλμάτων και σε αυξημένο αριθμό γενωμικών μεταλλάξεων [Simon-Loriere, Ε. and E.C. Holmes, Why do RNA viruses recombine? Nat Rev Microbiol, 2011 . 9(8): p. 617-26]. Κατά συνέπεια, ο έλεγχος των ασθενειών που προκαλούνται από ιούς RNA υπήρξε πάντα μια σημαντική πρόκληση στον τομέα της ιατρικής, επειδή τα υψηλά ποσοστά μετάλλαξης και προσαρμογής των RNA ιών μπορούν να τους κάνουν ανθεκτικούς σε νέα εμβόλια και αντιιικά φάρμακα. Παραδείγματα ιών RNA περιλαμβάνουν τους ιούς που προκαλούν το κοινό κρυολόγημα, γρίπη, SARS, MERS, ο ιος του δάγκειου πυρετού, ηπατίτιδα C, ηπατίτιδα Ε, πυρετός του Δυτικού Νείλου, Έμπολα, λύσσα, πολιομυελίτιδα, καθώς και τον πρόσφατα αναδυόμενο SARS-CoV-2. RNA viruses have emerged as one of the most common classes of pathogens causing serious disease. This can be attributed to the fact that they show impressive adaptability to various environments and face the challenges they encounter [Moratorio, G., et al., Attenuation of RNA viruses by redirecting their evolution in sequence space. Nat Microbiol, 2017. 2: p. 17088]. This exceptional ability to counter the immune system and host cell defense mechanisms, as well as their resistance to antiviral drugs, is mainly due to their extremely high mutation rates, which are caused by the absence of RNA-dependent polymerase proofreading mechanisms, which leading to failure to correct errors and an increased number of genomic mutations [Simon-Loriere, E. and E.C. Holmes, Why do RNA viruses recombine? Nat Rev Microbiol, 2011 . 9(8): p. 617-26]. Consequently, controlling diseases caused by RNA viruses has always been a major challenge in the field of medicine, because the high rates of mutation and adaptation of RNA viruses can make them resistant to new vaccines and antiviral drugs. Examples of RNA viruses include the viruses that cause the common cold, influenza, SARS, MERS, dengue virus, hepatitis C, hepatitis E, West Nile, Ebola, rabies, polio, as well as the recently emerging SARS-CoV- 2.
Οι κορονοϊοί αποτελούν μια οικογένεια ιών RNA θετικού κλώνου, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από ένα μονόκλωνο γονιδίωμα RNA μεγέθους 26-32 χιλιάδων βάσεων (kb) [Su, S., et al., Epidemiology, Genetic Recombination, and Pathogenesis of Coronaviruses. Trends Microbiol, 2016. 24(6): p. 490-502], Ένας κορονοϊός που εμφανίστηκε πρόσφατα είναι ο SARS-CoV-2, ο οποίος ήταν η αιτία μιας σειράς σοβαρών περιπτώσεων πνευμονίας άγνωστης προέλευσης, όπως ανέφεραν οι κινεζικές αρχές υγείας στα τέλη του 2019. Αναλύσεις δειγμάτων κατώτερης αναπνευστικής οδού με τεχνικές αλληλούχησης, οδήγησαν στην ταυτοποίηση ενός νέου κορονοϊού, ο οποίος εμφανίζει ομολογία αλληλουχίας σε ποσοστό > 85% με έναν ιό που προκαλεί έντονο οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS) στις νυχτερίδες και μοιάζει με κορονοϊό (CoV), ο οποίος ονομάστηκε 2019-nCoV και ορίστηκε ως το αιτιολογικό παθογόνο της νόσου COVID-19 [Zhu, Ν., et al., A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med, 2020. 382(8): p. 727-733]. Αυτό το έβδομο μέλος της οικογένειας CoV που προκαλεί ασθένεια στους ανθρώπους, χαρακτηρίστηκε περαιτέρω δείχνοντας ομολογία αλληλουχίας περίπου 79% και 50% με τον SARS-CoV στο ξέσπασμα του 2002 στην Κίνα και το αναπνευστικό σύνδρομο της Μέσης Ανατολής (MERS)-CoV του 2012 στη Μέση Ανατολή, αντίστοιχα [Lu, R., et al., Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet, 2020. 395(10224): p. 565-574], Ο νέος αυτός κορονοϊός ονομάστηκε SARS-CoV-2 [Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of, V., The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat Microbiol, 2020. 5(4): p. 536-544], εξαπλώθηκε γρήγορα στις περισσότερες χώρες παγκοσμίως, οδηγώντας στην ανακοίνωση της πανδημίας COVID-19 από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) στις 12 Μαρτίου 2020. Coronaviruses are a family of positive-strand RNA viruses characterized by a single-stranded RNA genome of 26-32 thousand bases (kb) in size [Su, S., et al., Epidemiology, Genetic Recombination, and Pathogenesis of Coronaviruses. Trends Microbiol, 2016. 24(6): p. 490-502], A newly emerged coronavirus is SARS-CoV-2, which has been the cause of a series of severe cases of pneumonia of unknown origin, as reported by Chinese health authorities in late 2019. Analyzes of lower respiratory tract samples by sequencing techniques , led to the identification of a novel coronavirus, which shows > 85% sequence homology to a severe acute respiratory syndrome (SARS) virus in bats and resembles a coronavirus (CoV), which was named 2019-nCoV and designated as the causative pathogen of the disease COVID-19 [Zhu, N., et al., A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med, 2020. 382(8): p. 727-733]. This seventh member of the CoV family causing disease in humans was further characterized showing approximately 79% and 50% sequence homology with SARS-CoV in the 2002 outbreak in China and Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV in 2012 in Middle East, respectively [Lu, R., et al., Genomic characterization and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet, 2020. 395(10224): p. 565-574], This new coronavirus was named SARS-CoV-2 [Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of, V., The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV -2. Nat Microbiol, 2020. 5(4): p. 536-544], spread rapidly to most countries worldwide, leading to the announcement of the COVID-19 pandemic by the World Health Organization (WHO) on March 12, 2020.
Ο ιός SARS-CoV-2 ανήκει στο γένος beta-coronavirus, με γονιδίωμα 29,903 νουκλεοτιδίων. Η εξάπλωση του SARS-CoV-2 από άνθρωπο σε άνθρωπο συμβαίνει κυρίως μέσω είτε των αναπνευστικών σταγονιδίων που δημιουργούνται από ένα μολυσμένο άτομο που φτερνίζεται, βήχει και μιλάει, είτε με άμεση επαφή [Li, Q., et al., Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-lnfected Pneumonia. N Engl J Med, 2020. 382(13): p. 1199-1207], Ωστόσο, η ανίχνευση του SARS-CoV-2 στα κόπρανα των ασθενών [Wang, W., et al., Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA, 2020. 323(18): p. 1843-1844] καθώς και σε μη επεξεργασμένα λύματα [Ahmed, W., et al., First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. Sci Total Environ, 2020. 728: p. 138764] έχει εγείρει ερωτήματα σχετικά με τους τρόπους μετάδοσης [Heller, L., C.R. Mota, and D.B. Greco, COVID-19 faecal-oral transmission: Are we asking the right questions? Sci Total Environ, 2020. 729: p. 138919]. The SARS-CoV-2 virus belongs to the beta-coronavirus genus, with a genome of 29,903 nucleotides. Human-to-human spread of SARS-CoV-2 occurs primarily through either respiratory droplets generated by an infected person sneezing, coughing, and talking, or by direct contact [Li, Q., et al., Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-infected Pneumonia. N Engl J Med, 2020. 382(13): p. 1199-1207], However, the detection of SARS-CoV-2 in the feces of patients [Wang, W., et al., Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA, 2020. 323(18): p. 1843-1844] as well as in untreated wastewater [Ahmed, W., et al., First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community . Sci Total Environ, 2020. 728: p. 138764] has raised questions about modes of transmission [Heller, L., C.R. Mota, and D.B. Greco, COVID-19 faecal-oral transmission: Are we asking the right questions? Sci Total Environ, 2020. 729: p. 138919].
Λόγω της έλλειψης ανοσίας, εμβολίων και αποτελεσματικής θεραπείας, η ταυτοποίηση και απομόνωση των ασθενών με COVID-19 υιοθετήθηκε άμεσα σε παγκόσμιο επίπεδο και εξακολουθεί να παραμένει η κύρια προσέγγιση για τη διαχείριση της ασθένειας. Παρόλο που οι συνολικοί πόροι των συστημάτων υγειονομικής περίθαλψης χρησιμοποιούνται σχεδόν αποκλειστικά για την αντιμετώπιση των διαγνωστικών αναγκών, μόνο συμπτωματικές και ύποπτες περιπτώσεις υφίστανται έλεγχο μέχρι στιγμής στις περισσότερες χώρες. Συνεπώς, η ανικανότητα για διαγνωστικό έλεγχο σε ολόκληρο τον πληθυσμό, καθώς και ο υψηλός ρυθμός μετάδοσης του SARS-CoV-2, έχουν οδηγήσει σε εκθετική αύξηση των μολυσμένων ατόμων, συσσώρευση ασθενών στα νοσοκομεία και υψηλό ποσοστό θνησιμότητας από COVID-19 [Sharfstein, J.M., S.J. Becker, and Μ. Μ. Mello, Diagnostic Testing for the Novel Coronavirus. JAMA, 2020. 323(15): p. 1437-1438]. Due to the lack of immunity, vaccines and effective treatment, the identification and isolation of patients with COVID-19 was immediately adopted globally and still remains the main approach to managing the disease. Although the total resources of health care systems are used almost exclusively to address diagnostic needs, only symptomatic and suspected cases are screened so far in most countries. Consequently, the inability to screen the entire population, as well as the high transmission rate of SARS-CoV-2, has led to an exponential increase in infected individuals, an accumulation of patients in hospitals, and a high mortality rate from COVID-19 [Sharfstein, J.M. , S.J. Becker, and M. M. Mello, Diagnostic Testing for the Novel Coronavirus. JAMA, 2020. 323(15): p. 1437-1438].
Εκτός από την ανίχνευση μιας ενεργού λοίμωξης, η διαθεσιμότητα γονιδιωματικών ιικών αλληλουχιών θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά την κατανόησή μας σχετικά με την εξέλιξη και την εξάπλωση των ιών RNA, όπως ο SARS-CoV-2, να διευκολύνει την αναγνώριση στελεχών με επιλεκτικό πλεονέκτημα και να παρέχει ένα εργαλείο διαστρωμάτωσης κινδύνου για την μολυσματικότητα αυτών των ιών τόσο σε επίπεδο μεμονωμένων ασθενών, όσο και σε επίπεδο κοινότητας / έθνους. Γονιδιώματα SARS-CoV-2 που προέρχονατι από άτομα θετικά για COVID-19, κατατίθενται στη βάση δεδομένων GISAID (https://www.gisaid.org/) και αναλύονται από το Nextstrain (https://nextstrain.org/sars-cov-2). In addition to detecting an active infection, the availability of genomic viral sequences could significantly improve our understanding of the evolution and spread of RNA viruses such as SARS-CoV-2, facilitate the identification of strains with a selective advantage, and provides a risk stratification tool for the infectivity of these viruses both at the individual patient level and at the community/nation level. SARS-CoV-2 genomes from individuals positive for COVID-19 are deposited in the GISAID database (https://www.gisaid.org/) and analyzed by Nextstrain (https://nextstrain.org/sars-cov -2).
Μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη της ακίδας (S), μια τριμερή γλυκοπρωτεΐνη της επιφάνειας των ιοσωματίων, η οποία χρησιμοποιείται από το SARS-CoV-2 για να αλληλεπιδράσει με τον υποδοχέα ACE2 των κυττάρων στόχων [Hoffmann, Μ., et al., SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell, 2020. 181 (2): p. 271-280 e8], έχει ήδη επιβεβαιωθεί πως επηρεάζουν την μολυσματικότητα, την μετάδοση, καθώς και την ικανότητα του SARS-CoV-2 να διαφεύγει της ανοσοεπιτήρησης [Korber, Β., et al., Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike: Evidence that D614G Increases Infectivity of the COVID-19 Virus. Cell, 2020. 182(4): p. 812-827 e19. and Li, Q., et al., The Impact of Mutations in SARS-CoV-2 Spike on Viral Infectivity and Antigenicity. Cell, 2020. 182(5): p. 1284-1294 e9]. Mutations in the spike (S) protein, a trimeric glycoprotein of the viral surface, which is used by SARS-CoV-2 to interact with the ACE2 receptor of target cells [Hoffmann, M., et al., SARS-CoV -2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell, 2020. 181 (2): p. 271-280 e8], have already been confirmed to affect infectivity, transmissibility, as well as the ability of SARS-CoV-2 to evade immune surveillance [Korber, B., et al., Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike : Evidence that D614G Increases Infectivity of the COVID-19 Virus. Cell, 2020. 182(4): p. 812-827 e19. and Li, Q., et al., The Impact of Mutations in SARS-CoV-2 Spike on Viral Infectivity and Antigenicity. Cell, 2020. 182(5): p. 1284-1294 e9].
Η επιδημιολογία με βάση την ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων, όπως η επιδημιολογία με βάση τα λύματα (WBE), έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε πολλές μελέτες παγκοσμίως, με την πιο σημαντική εφαρμογή μέχρι στιγμής να είναι η εκτίμηση της κατανάλωσης ναρκωτικών ουσιών. [Gonzalez-Marino, I., et al., Spatiotemporal assessment of illicit drug use at large scale: evidence from 7 years of international wastewater monitoring. Addiction, 2020. 115(1): p. 109-120]. Αν και o έλεγχος WBE δεν μπορεί να αντικαταστήσει τον κλινικό έλεγχο και τη διάγνωση, εξακολουθεί να αντιπροσωπεύει έναν πολύ φθηνότερο και γρηγορότερο τρόπο επιτήρησης της νόσου σε επίπεδο πληθυσμού, χωρίς σφάλματα από θα μπορούσαν να προέρχονται από την επιλογή ατόμων. Κατά τον τρόπο αυτό, ο έλεγχος WBE θα μπορούσε για παράδειγμα να ανιχνεύσει ασυμπτωματικούς φορείς του ιού που είναι λιγότερο πιθανό να υποβληθούν σε διαγνωστικά τεστ και συμπτωματικούς ασθενείς που αποφεύγουν τα τεστ λόγω στιγματισμού και κοινωνικής απομόνωσης, καθώς επίσης να παρέχει επιτήρηση των σημαντικών γενωμικών παραλλαγών / στελέχων του ιού σε επίπεδο πληθυσμού και σε πραγματικό χρόνο. Epidemiology based on the analysis of environmental samples, such as wastewater-based epidemiology (WBE), has been successfully applied in many studies worldwide, the most important application so far being the assessment of drug consumption. [Gonzalez-Marino, I., et al., Spatiotemporal assessment of illicit drug use at large scale: evidence from 7 years of international wastewater monitoring. Addiction, 2020. 115(1): p. 109-120]. Although WBE testing cannot replace clinical testing and diagnosis, it still represents a much cheaper and faster way to monitor the disease at a population level, without errors that could come from the selection of individuals. In this way, WBE testing could for example detect asymptomatic carriers of the virus who are less likely to be tested and symptomatic patients who avoid testing due to stigma and social isolation, as well as provide surveillance of important genomic variants / of virus strains at the population level and in real time.
Παρά το όφελος της ανάλυσης περιβαλλοντικών δειγμάτων, όπως τα λύματα, για την αποτελεσματική παρακολούθηση του ιού στον πληθυσμό, έχουν προκύψει αρκετές προκλήσεις, που οδηγούν σε σοβαρούς περιορισμούς στην ακρίβεια ανίχνευσης ιών RNA, όπως το SARS-CoV-2 [Alygizakis, Ν., et al., Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends Analyt Chem, 2020: p. 116125]. Πρώτα απ 'όλα, τα χαρακτηριστικά του σημείου δειγματοληψίας μπορεί να έχουν άμεση επίδραση στην ανίχνευση του ιού. Πιο συγκεκριμένα, οι βιομηχανικές επιρροές, οι μεταβολές του pH στο σημείο της δειγματοληψίας, καθώς και οι απορροές βροχής μπορούν να επηρεάσουν την ποιότητα του δείγματος και επομένως να έχουν τεράστια επίδραση στην αποτελεσματικότητα ανίχνευσης του ιού. Επιπλέον, ο όγκος του δείγματος και η μέθοδος δειγματοληψίας είναι δύο σημαντικοί παράγοντες για την ανίχνευση ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα. Αν και έχουν αναπτυχθεί αρκετά πρωτόκολλα για την αύξηση του όγκου του δείγματος (για παράδειγμα, διήθηση ασκού και σύνθετη δειγματοληψία) προκειμένου να αυξηθεί η πιθανότητα ανίχνευσης του ιού, αυτά τα δείγματα είναι συχνά δύσκολά στο χειρισμό τους στο εργαστήριο [Larsen, D.A. and K.R. Wigginton, Tracking COVID-19 with wastewater. Nat Biotechnol, 2020. 38(10): p. 1151-1153], Despite the benefit of analyzing environmental samples, such as wastewater, for effective virus monitoring in the population, several challenges have arisen, leading to severe limitations in the detection accuracy of RNA viruses, such as SARS-CoV-2 [Alygizakis, N., et al., Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends Analyt Chem, 2020: p. 116125]. First of all, the characteristics of the sampling point can have a direct effect on the detection of the virus. More specifically, industrial influences, changes in pH at the point of sampling, as well as rain runoff can affect sample quality and therefore have a huge impact on virus detection efficiency. In addition, sample volume and sampling method are two important factors for the detection of viruses in environmental samples. Although several protocols have been developed to increase sample volume (for example, bag filtration and composite sampling) in order to increase the likelihood of virus detection, these samples are often difficult to handle in the laboratory [Larsen, D.A. and K.R. Wigginton, Tracking COVID-19 with wastewater. Nat Biotechnol, 2020. 38(10): p. 1151-1153],
Μια άλλη σημαντική πρόκληση σχετικά με την ανίχνευση ιών RNA σε περιβαλλοντικά δείγματα, όπως τα λύματα, είναι η μειωμένη σταθερότητα του RNA του ιού, η οποία δεν παρατηρείται σε ανθρώπινα δείγματα. Γ ια παράδειγμα, η επί του παρόντος καθιερωμένη μέθοδος ανίχνευσης και ελέγχου SARS-CoV-2 σε ανθρώπινα δείγματα περιλαμβάνει ένα στάδιο απομόνωσης του RNA από ένα ρινοφαρυγγικό στυλεό, το οποίο ακολουθείται από μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφήςποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-qPCR) που πραγματοποιείται σε ένα στάδιο για την ανίχνευση του ιικού RNA. Αυτή η προσέγγιση περιλαμβάνει τη χρήση ειδικών για τον ιό εκκινητών RT, με αποτέλεσμα μόνο τη σύνθεση μορίων cDNA του ιικού mRNA, τα οποία στη συνέχεια αξιοποιούνται ως εκμαγεία για την αντίδραση qPCR. Ωστόσο, λόγω της φύσης των περιβαλλοντικών δειγμάτων, η υπάρχουσα θερμοκρασία και το pH στην περιοχή της δειγματοληψίας μπορούν να προκαλέσουν τυχαία αποικοδόμηση του ιικού RNA, οδηγώντας έτσι σε σοβαρούς περιορισμούς όσον αφορά την ανίχνευση με συγκεκριμένη μεθοδολογία RT-qPCR ενός σταδίου. Another major challenge regarding the detection of RNA viruses in environmental samples, such as wastewater, is the reduced stability of viral RNA, which is not observed in human samples. For example, the currently established method for detecting and testing SARS-CoV-2 in human samples involves a step of isolating RNA from a nasopharyngeal swab, followed by a reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) reaction performed in one step to detect viral RNA. This approach involves the use of virus-specific RT primers, resulting only in the synthesis of viral mRNA cDNA molecules, which are then used as templates for the qPCR reaction. However, due to the nature of environmental samples, the prevailing temperature and pH in the sampling area can cause random degradation of viral RNA, thus leading to severe limitations in detection by a specific one-step RT-qPCR methodology.
Επομένως, υπάρχει ακόμη η ανάγκη για την ανάπτυξη βελτιωμένης μεθόδου για την ανίχνευση RNA ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα, η οποία θα ξεπερνά τα μειονεκτήματα των προηγούμενων μεθόδων. Therefore, there is still a need to develop an improved method for the detection of RNA viruses in environmental samples, which will overcome the disadvantages of previous methods.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ SUMMARY OF THE INVENTION
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μια μέθοδο για την ανίχνευση RNA ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα, η οποία περιλαμβάνει απομόνωση του RNA από το δείγμα, αντίστροφη μεταγραφή του απομονωμένου RNA με τυχαία ολιγονουκλεοτίδια για να δημιουργηθεί το συμπληρωματικό DNA (cDNA) και πραγματοποίηση nested PCR. The present invention provides a method for detecting viral RNA in environmental samples, which comprises isolating the RNA from the sample, reverse transcribing the isolated RNA with random oligonucleotides to generate the complementary DNA (cDNA), and performing nested PCR.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει περαιτέρω μια μέθοδο για την ανάλυση μεταλλάξεων RNA ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα, και περιλαμβάνει απομόνωση του RNA από το δείγμα, αντίστροφη μεταγραφή του εκχυλισμένου RNA με τυχαία ολιγονουκλεοτίδια για να δημιουργηθεί το συμπληρωματικό DNA (cDNA), πραγματοποίηση nested PCR και προσδιορισμός της αλληλουχίας των προϊόντων PCR χρησιμοποιώντας μαζικά παράλληλη αλληλούχηση. The present invention further provides a method for analyzing viral RNA mutations in environmental samples, and includes isolating the RNA from the sample, reverse transcribing the extracted RNA with random oligonucleotides to generate the complementary DNA (cDNA), performing nested PCR, and determining the sequence of PCR products using massively parallel sequencing.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει περαιτέρω μια μέθοδο για την ανίχνευση του ιού SARS-CoV-2 σε περιβαλλοντικά δείγματα, η οποία περιλαμβάνει απομόνωση του RNA από το δείγμα, αντίστροφη μεταγραφή του απομονωμένου RNA με τυχαία ολιγονουκλεοτίδια για να δημιουργηθεί το συμπληρωματικό DNA (cDNA) και πραγματοποίηση nested PCR. The present invention further provides a method for detecting SARS-CoV-2 virus in environmental samples, which comprises isolating the RNA from the sample, reverse transcribing the isolated RNA with random oligonucleotides to generate the complementary DNA (cDNA), and performing nested PCR.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει περαιτέρω μια μέθοδο για την ανάλυση μεταλλάξεων του ιού SARS-CoV-2 σε περιβαλλοντικά δείγματα, και περιλαμβάνει απομόνωση του RNA από το δείγμα, αντίστροφη μεταγραφή του εκχυλισμένου RNA με τυχαία ολιγονουκλεοτίδια για να δημιουργηθεί το συμπληρωματικό DNA (cDNA), πραγματοποίηση nested PCR και προσδιορισμός της αλληλουχίας των προϊόντων PCR χρησιμοποιώντας μαζικά παράλληλη αλληλούχηση. The present invention further provides a method for analyzing mutations of SARS-CoV-2 in environmental samples, and comprises isolating the RNA from the sample, reverse transcribing the extracted RNA with random oligonucleotides to generate the complementary DNA (cDNA), performing nested PCR and sequencing of PCR products using massively parallel sequencing.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει περαιτέρω “«kit»” για την ανίχνευση της παρουσίας SARS-CoV-2 ή για την ανίχνευση ορισμένων μεταλλάξεων του SARS-CoV-2 σε ένα δείγμα με τη χρήση nested PCR. The present invention further provides a kit for detecting the presence of SARS-CoV-2 or for detecting certain mutations of SARS-CoV-2 in a sample using nested PCR.
ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΕΙΚΟΝΩΝ Η Εικόνα 1 δείχνει ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης προϊόντων PCR από τη δοκιμασία που βασίζεται στο CDC / 2019-nCoV_N1 και από προσδιορισμούς της παρούσας εφεύρεσης. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 shows agarose gel electrophoresis of PCR products from the CDC/2019-nCoV_N1-based assay and from assays of the present invention.
Η Εικόνα 2 δείχνει ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης προϊόντων PCR από προσδιορισμούς της παρούσας εφεύρεσης. Figure 2 shows agarose gel electrophoresis of PCR products from assays of the present invention.
Η Εικόνα 3 δείχνει καμπύλες ποσοτικοποίησης και πρότυπες καμπύλες αναφοράς από προσδιορισμούς nested PCR πραγματικού χρόνου της παρούσας εφεύρεσης. Figure 3 shows quantification curves and standard reference curves from nested real-time PCR assays of the present invention.
Η Εικόνα 4 δείχνει καμπύλες ποσοτικοποίησης και πρότυπες καμπύλες αναφοράς από προσδιορισμούς nested PCR πραγματικού χρόνου της παρούσας εφεύρεσης. Figure 4 shows quantification curves and standard reference curves from real-time nested PCR assays of the present invention.
Η Εικόνα 5 δείχνει ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης προϊόντων PCR από προσδιορισμούς nested PCR της παρούσας εφεύρεσης. Figure 5 shows agarose gel electrophoresis of PCR products from nested PCR assays of the present invention.
Οι Εικόνες 6-19 δείχνουν περιοχές του RNA του SARS-CoV-2. Figures 6-19 show regions of SARS-CoV-2 RNA.
ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Η ανίχνευση RNA ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα παρουσιάζει ορισμένες προκλήσεις, οι οποίες δεν υπάρχουν σε δείγματα που λαμβάνονται από ένα άτομο, για παράδειγμα από έναν ανθρώπινο οργανισμό. Έτσι, η ποιότητα του δείγματος μπορεί να επηρεαστεί από περιβαλλοντικούς ή άλλους παράγοντες. Επιπρόσθετα, η σταθερότητα του RNA του ιού στο περιβάλλον μειώνεται, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται διάφορα προϊόντα αποσύνθεσης. Επομένως, μια μέθοδος για την ανίχνευση ή την ανάλυση μεταλλάξεων RNA ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα πρέπει να εμφανίζει υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία. Detection of viral RNA in environmental samples presents certain challenges that are not present in samples obtained from an individual, for example a human organism. Thus, the quality of the sample may be affected by environmental or other factors. In addition, the stability of the viral RNA in the environment is reduced, resulting in the generation of various degradation products. Therefore, a method to detect or analyze viral RNA mutations in environmental samples must exhibit high specificity and sensitivity.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μια μέθοδο για την ανίχνευση RNA ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα, και περιλαμβάνει τα εξής στάδια: The present invention provides a method for the detection of RNA viruses in environmental samples, and comprises the following steps:
α) απομόνωση του RNA από το δείγμα, a) isolation of RNA from the sample,
β) αντίστροφη μεταγραφή του απομονωμένου RNA με τυχαία ολιγονουκλεοτίδια για τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cDNA), b) reverse transcription of the isolated RNA with random oligonucleotides to generate complementary DNA (cDNA);
γ) πραγματοποίηση μιας nested PCR, η οποία στοχεύει μια περιοχή του RNA ιού, δ) ανίχνευση του προϊόντος της nested PCR. c) carrying out a nested PCR, which targets a region of the RNA virus, d) detection of the product of the nested PCR.
Ένας ιός RNA είναι ένας ιός που έχει RNA ως γενετικό υλικό. Κατά προτίμηση, ο ιός RNA επιλέγεται από ιούς που προκαλούν κοινό κρυολόγημα, γρίπη, SARS, MERS, Ιό δάγκειου πυρετού, ηπατίτιδα C, ηπατίτιδα Ε, πυρετός του Δυτικού Νείλου, Έμπολα, λύσσα, πολιομυελίτιδα και SARS-CoV-2. Προτιμότερο είναι ο ιός RNA να είναι ο SARS-CoV-2. An RNA virus is a virus that has RNA as its genetic material. Preferably, the RNA virus is selected from viruses that cause the common cold, influenza, SARS, MERS, Dengue virus, hepatitis C, hepatitis E, West Nile, Ebola, rabies, polio and SARS-CoV-2. It is preferred that the RNA virus is SARS-CoV-2.
Ο όρος «περιβαλλοντικό δείγμα» αναφέρεται σε ένα δείγμα που λαμβάνεται από μια μη βιολογική πηγή, όπως έδαφος, λάσπη ή νερό. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το περιβαλλοντικό δείγμα είναι δείγμα νερού που λαμβάνεται από φυσικό περιβάλλον ή από βιομηχανικό, υγειονομικό ή οικιστικό περιβάλλον. Κατά προτίμηση, το περιβαλλοντικό δείγμα είναι δείγμα λυμάτων. The term "environmental sample" refers to a sample taken from a non-biological source, such as soil, mud or water. In some cases, the environmental sample is a water sample taken from a natural environment or from an industrial, sanitary or residential environment. Preferably, the environmental sample is a wastewater sample.
Η απομόνωση του RNA από το περιβαλλοντικό δείγμα μπορεί να διεξαχθεί χρησιμοποιώντας πολύ γνωστές μεθόδους, όπως η απομόνωση RNA με βάση μαγνητικά σφαιρίδια, ή στήλη πυριτίου ή με χρήση ισοθειοκυανικής γουανιδίνηςφαινόλης-χλωροφόρμιου. Όταν το περιβαλλοντικό δείγμα αποτελεί δείγμα λυμάτων, πριν την απομόνωση του RNA μπορεί να προηγηθεί, σύμφωνα με μια εφαρμογή της εφεύρεσης, από μια συμπύκνωση του δείγματος που μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας γνωστές μεθόδους, όπως υπερδιήθηση ή η καταβύθιση πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Isolation of RNA from the environmental sample can be performed using well-known methods, such as RNA isolation based on magnetic beads, or a silica column, or using guanidinephenol isothiocyanate-chloroform. When the environmental sample is a sewage sample, before the isolation of the RNA it can be preceded, according to an application of the invention, by a concentration of the sample which can be carried out using known methods, such as ultrafiltration or polyethylene glycol (PEG) precipitation.
Το απομονωμένο RNA υποβάλλεται σε αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής με τυχαία ολιγονουκλεοτίδια. Τυχαία ολιγονουκλεοτίδια συντίθενται εντελώς τυχαία για να δημιουργηθεί ένα πλήθος αλληλουχιών που έχουν τη δυνατότητα να υβριδοποιηθούν σε πολλές τυχαίες περιοχές ενός εκμαγείου RNA και να δρουν ως εκκινητής για να ξεκινήσει η σύνθεση μονόκλωνου cDNA. Τα ολιγονουκλεοτίδια αυτά αναφέρονται επίσης συνήθως ως τυχαίοι εκκινητές. Κατά προτίμηση, τα τυχαία ολιγονουκλεοτίδια είναι εξαμερή. The isolated RNA is subjected to a reverse transcription reaction with random oligonucleotides. Random oligonucleotides are synthesized completely randomly to generate a plurality of sequences that have the potential to hybridize to multiple random regions of an RNA template and act as a primer to initiate single-stranded cDNA synthesis. These oligonucleotides are also commonly referred to as random primers. Preferably, the random oligonucleotides are hexamers.
To cDNA υποβάλλεται σε nested PCR. Η nested PCR είναι μια πολύ γνωστή παραλλαγή της PCR, η οποία περιλαμβάνει δύο ομάδες εκκινητών που χρησιμοποιούνται σε δύο διαδοχικές αντιδράσεις PCR. Το πρώτο σετ εκκινητών (ονομάζονται επίσης εξωτερικοί εκκινητές), χρησιμοποιείται σε μια αρχική αντίδραση PCR. Στη συνέχεια, τα αμπλικονίων που προέκυψαν από την πρώτη αντίδραση PCR χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία για ένα δεύτερο σύνολο εκκινητών (που ονομάζονται επίσης εσωτερικοί εκκινητές) και για μια δεύτερη αντίδραση PCR. Έτσι, μια μεθοδολογία nested PCR περιλαμβάνει τη χρήση δύο ζευγών εκκινητών και δύο αντιδράσεων PCR. Το προϊόν της δεύτερης αντίδρασης PCR είναι το προϊόν της nested PCR. The cDNA is subjected to nested PCR. Nested PCR is a well-known variant of PCR, which involves two sets of primers used in two consecutive PCR reactions. The first set of primers (also called outer primers), is used in an initial PCR reaction. The amplicons resulting from the first PCR reaction are then used as templates for a second set of primers (also called internal primers) and a second PCR reaction. Thus, a nested PCR methodology involves the use of two primer pairs and two PCR reactions. The product of the second PCR reaction is the product of the nested PCR.
Η ανίχνευση του προϊόντος της nested PCR μπορεί να πραγματοποιηθεί ποιοτικά ή ποσοτικά, χρησιμοποιώντας μεθόδους πολύ γνωστές στον κλάδο. Όταν η ανίχνευση διεξάγεται ποιοτικά, μπορεί να πραγματοποιηθεί για παράδειγμα, με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Όταν η ανίχνευση διεξάγεται ποσοτικά, μπορεί να πραγματοποιηθεί, για παράδειγμα, με χρήση ενός ιχνηθέτη φθορισμού, όπως ένας ιχνηθέτης ειδικός για συγκεκριμένη αλληλουχία. Detection of the nested PCR product can be performed qualitatively or quantitatively, using methods well known in the art. When the detection is carried out qualitatively, it can be performed, for example, by agarose gel electrophoresis. When detection is carried out quantitatively, it can be carried out, for example, using a fluorescent probe, such as a sequence-specific probe.
Η μέθοδος nested PCR έχει σχεδιαστεί για να στοχεύει μια περιοχή του RNA του ιού. Αυτό σημαίνει ότι οι εκκινητές της μεθοδολογίας nested PCR έχουν σχεδιαστεί για να ενισχύουν μόνο cDNA, το οποίο είναι συμπληρωματικό προς μια περιοχή του RNA του ιού. The nested PCR method is designed to target a region of viral RNA. This means that the primers of the nested PCR methodology are designed to amplify only cDNA, which is complementary to a region of the viral RNA.
Σύμφωνα με μια προτιμώμενη υλοποίηση της παρούσας εφεύρεσης, εάν το αποτέλεσμα της πρώτης nested PCR είναι αρνητικό, δηλαδή εάν δεν ανιχνευθεί cDNA συμπληρωματικό προς το RNA του ιού, το δείγμα υποβάλλεται σε δεύτερη nested PCR που στοχεύει μια δεύτερη περιοχή του RNA του ιού. Εάν δεν ανιχνευθεί cDNA συμπληρωματικό προς το RNA του ιού μετά τη δεύτερη nested PCR, το δείγμα υποβάλλεται σε τρίτη nested PCR που στοχεύει μια τρίτη περιοχή του RNA του ιού. Εάν δεν ανιχνευθεί cDNA συμπληρωματικό του RNA του ιού μετά την τρίτη nested PCR, το δείγμα υποβάλλεται σε τέταρτη nested PCR που στοχεύει μια τέταρτη περιοχή του RNA του ιού. Η πρώτη, δεύτερη τρίτη και τέταρτη περιοχή του RNA του ιού είναι διαφορετικές περιοχές του RNA του ιού, πράγμα που σημαίνει ότι δεν υπάρχει αλληλοεπι κάλυψη μεταξύ των περιοχών. According to a preferred embodiment of the present invention, if the result of the first nested PCR is negative, i.e. if no cDNA complementary to the viral RNA is detected, the sample is subjected to a second nested PCR targeting a second region of the viral RNA. If no cDNA complementary to the viral RNA is detected after the second nested PCR, the sample is subjected to a third nested PCR targeting a third region of the viral RNA. If no cDNA complementary to the viral RNA is detected after the third nested PCR, the sample is subjected to a fourth nested PCR targeting a fourth region of the viral RNA. The first, second, third, and fourth regions of the viral RNA are different regions of the viral RNA, meaning that there is no overlap between the regions.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει περαιτέρω μια μέθοδο για την ανίχνευση μιας μετάλλαξης RNA ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα, και περιλαμβάνει τα στάδια: α) απομόνωση του RNA από το δείγμα, The present invention further provides a method for detecting a viral RNA mutation in environmental samples, and comprises the steps of: a) isolating the RNA from the sample;
β) αντίστροφη μεταγραφή του απομονωμένου RNA με τυχαία ολιγονουκλεοτίδια για τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cDNA) b) reverse transcription of the isolated RNA with random oligonucleotides to generate complementary DNA (cDNA)
γ) πραγματοποίηση μιας nested PCR που στοχεύει μια περιοχή του RNA ιού, η οποία περιλαμβάνει μια θέση παραλλαγής ενδιαφέροντος, c) performing a nested PCR targeting a region of the RNA virus, which includes a variant site of interest,
δ) ανίχνευση του προϊόντος της nested PCR, d) detection of the nested PCR product,
ε) αλληλούχηση του προϊόντος της nested PCR με τη χρήση μαζικά παράλληλης αλληλούχησης. e) sequencing the nested PCR product using massively parallel sequencing.
Η μαζικά παράλληλη αλληλούχηση ονομάζεται επίσης αλληλούχηση επόμενης γενιάς (NGS) ή αλληλούχηση δεύτερης γενιάς και περιλαμβάνει προσεγγίσεις υψηλής απόδοσης στην αλληλούχηση DNA. Συνήθως, η μαζική παράλληλη αλληλούχηση περιλαμβάνει τη δημιουργία DNA βιβλιοθηκών αλληλούχησης με PCR, την αλληλούχηση με σύνθεση του DNA και την ταυτόχρονη αλληλούχηση διαχωρισμένων, ενισχυμένων εκμαγείων DNA με μαζικά παράλληλο τρόπο χωρίς την απαίτηση για ένα στάδιο φυσικού διαχωρισμού. Ένα παράδειγμα μαζικής παράλληλης αλληλούχησης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση είναι η αλληλούχηση αμπλικονίου ή το στοχευμένο DNA-seq. Massively parallel sequencing is also called next-generation sequencing (NGS) or second-generation sequencing and includes high-throughput approaches to DNA sequencing. Typically, massively parallel sequencing involves generating DNA sequencing libraries by PCR, sequencing by DNA synthesis, and simultaneously sequencing separated, amplified DNA templates in a massively parallel fashion without the requirement for a physical separation step. An example of massively parallel sequencing that can be used in accordance with the present invention is amplicon sequencing or targeted DNA-seq.
Σύμφωνα με μια προτιμώμενη πραγματοποίηση της παρούσας εφεύρεσης, ο ιός RNA είναι ο SARS-CoV-2. According to a preferred embodiment of the present invention, the RNA virus is SARS-CoV-2.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης γονιδιωματικές περιοχές του SARS-CoV-2, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως στόχοι για τις nested PCR. Δηλαδή, οι παρόντες εφευρέτες έχουν βρει ότι οι περιοχές του RNA του SARS-CoV-2 που αποτελούνται από οποιαδήποτε από τις SEQ ID NO: 1 - 70 εμφανίζουν υψηλότερη σταθερότητα σε σύγκριση με άλλες περιοχές. Αυτό σημαίνει ότι μια περιοχή που αποτελείται από οποιοδήποτε από τα SEQ ID NO: 1 - 70 είναι πιο πιθανό να υπάρχει σε ένα περιβαλλοντικό δείγμα που περιλαμβάνει SARS-CoV-2 και επομένως είναι καλύτερος στόχος για μια nested PCR σε σύγκριση με άλλες περιοχές του RNA του ιού. The present invention also provides genomic regions of SARS-CoV-2, which can be used as targets for nested PCRs. That is, the present inventors have found that regions of SARS-CoV-2 RNA consisting of any of SEQ ID NO: 1 - 70 exhibit higher stability compared to other regions. This means that a region consisting of any of SEQ ID NOs: 1 - 70 is more likely to be present in an environmental sample containing SARS-CoV-2 and is therefore a better target for a nested PCR compared to other regions of the RNA of the virus.
Έτσι, κατά προτίμηση, η nested PCR της παρούσας εφεύρεσης, ή οποιαδήποτε nested PCR, εάν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία δοκιμασίες, στοχεύει μια περιοχή του RNA του SARS-CoV-2 που αποτελείται από οποιαδήποτε από τις SEQ ID NO: 1 - 70 (όπως φαίνεται στα σχήματα 6-19). Πιο ιδανικά, η nested PCR της παρούσας εφεύρεσης ή οποιοσδήποτε nested PCR, εάν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία δοκιμασίες, στοχεύει μια περιοχή του RNA του SARS-CoV-2 που αποτελείται από οποιαδήποτε από τις SEQ ID NO: 1 - 36. Ακόμη πιο ιδανικά, η nested PCR της παρούσας εφεύρεσης ή οποιαδήποτε nested PCR, εάν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία δοκιμασίες, στοχεύει μια περιοχή του RNA του SARS-CoV-2 που αποτελείται από την SEQ ID NO: 1 - 24. Ιδανικότερα, η nested PCR της παρούσας εφεύρεσης ή οποιαδήποτε nested PCR, εάν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία δοκιμασίες, στοχεύει μια περιοχή του RNA του SARS-CoV-2 που αποτελείται από οποιαδήποτε από τις SEQ ID NO: 2, 4, 8, 11, 14, 15, 18, 19. Όταν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία nested PCR, κάθε δοκιμασία στοχεύει σε μια διαφορετική περιοχή του RNA του ιού. Thus, preferably, the nested PCR of the present invention, or any nested PCR if more than one assay is used, targets a region of SARS-CoV-2 RNA consisting of any of SEQ ID NOs: 1 - 70 (as shown in Figures 6-19). More ideally, the nested PCR of the present invention, or any nested PCR if more than one assay is used, targets a region of SARS-CoV-2 RNA consisting of any of SEQ ID NOs: 1 - 36. Even more ideally, the nested PCR of the present invention or any nested PCR, if more than one assay is used, targets a region of SARS-CoV-2 RNA consisting of SEQ ID NO: 1 - 24. Ideally, the nested PCR of the present invention or any nested PCR, if more than one assay is used, targets a region of SARS-CoV-2 RNA consisting of any of SEQ ID NO: 2, 4, 8, 11, 14, 15, 18, 19. When used more than one nested PCR, each assay targeting a different region of the viral RNA.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επιπλέον ζεύγη εκκινητών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στις nested PCR για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 σε περιβαλλοντικά δείγματα. The present invention provides additional primer pairs that can be used in nested PCRs for the detection of SARS-CoV-2 in environmental samples.
Σύμφωνα με μια προτιμώμενη πραγματοποίηση, ο πρόσθιος και ο ανάστροφος εκκινητής της πρώτης αντίδρασης (εξωτερικό σετ) της nested PCR αποτελείται από SEQ ID NO: 71 και SEQ ID NO: 72 αντίστοιχα, ενώ ο πρόσθιος και ο ανάστροφο εκκινητής της δεύτερης αντίδρασης ( το εσωτερικό σετ) της nested PCR αποτελείται από SEQ ID NO: 73 και SEQ ID NO: 74, αντίστοιχα. Όταν η ανίχνευση των προϊόντων της nested PCR διεξάγεται ποσοτικά, ο ανιχνευτής είναι ένας ιχνηθέτης φθορισμού FAM-BHQ1 που αποτελείται από SEQ ID NO: 75. According to a preferred embodiment, the forward and reverse primers of the first reaction (outer set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72 respectively, while the forward and reverse primers of the second reaction (the inner set) of the nested PCR consists of SEQ ID NO: 73 and SEQ ID NO: 74, respectively. When detection of nested PCR products is performed quantitatively, the probe is a FAM-BHQ1 fluorescent probe consisting of SEQ ID NO: 75.
Σύμφωνα με μια ακόμη προτιμώμενη πραγματοποίηση, ο πρόσθιος και ο ανάστροφος εκκινητής της πρώτης αντίδρασης (εξωτερικό σετ) της nested PCR αποτελείται από SEQ ID NO: 76 και SEQ ID NO: 77 αντίστοιχα, ενώ ο πρόσθιος και ο ανάστροφο εκκινητής της δεύτερης αντίδρασης ( το εσωτερικό σετ) της nested PCR αποτελείται από SEQ ID NO: 78 και SEQ ID NO: 79, αντίστοιχα. Όταν η ανίχνευση των προϊόντων της nested PCR διεξάγεται ποσοτικά, ο ανιχνευτής είναι ένας ιχνηθέτης φθορισμού FAM-BHQ1 που αποτελείται από SEQ ID NO: 80. According to a further preferred embodiment, the forward and reverse primers of the first reaction (outer set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 77 respectively, while the forward and reverse primers of the second reaction (the inner set) of the nested PCR consists of SEQ ID NO: 78 and SEQ ID NO: 79, respectively. When detection of the nested PCR products is carried out quantitatively, the probe is a FAM-BHQ1 fluorescent probe consisting of SEQ ID NO: 80.
Σύμφωνα με μια ακόμη προτιμώμενη πραγματοποίηση, ο πρόσθιος και ο ανάστροφος εκκινητής της πρώτης αντίδρασης (εξωτερικό σετ) της nested PCR αποτελείται από SEQ ID NO: 81 και SEQ ID NO: 82 αντίστοιχα, ενώ ο πρόσθιος και ο ανάστροφο εκκινητής της δεύτερης αντίδρασης ( το εσωτερικό σετ) της nested PCR αποτελείται από SEQ ID NO: 83 και SEQ ID NO: 84, αντίστοιχα. Όταν η ανίχνευση των προϊόντων της nested PCR διεξάγεται ποσοτικά, ο ανιχνευτής είναι ένας ιχνηθέτης φθορισμού FAM-BFIQ1 που αποτελείται από SEQ ID NO: 85. According to a further preferred embodiment, the forward and reverse primers of the first reaction (outer set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 81 and SEQ ID NO: 82 respectively, while the forward and reverse primers of the second reaction (the inner set) of the nested PCR consists of SEQ ID NO: 83 and SEQ ID NO: 84, respectively. When detection of the nested PCR products is carried out quantitatively, the probe is a FAM-BFIQ1 fluorescent probe consisting of SEQ ID NO: 85.
Σύμφωνα με μια ακόμη προτιμώμενη πραγματοποίηση, ο πρόσθιος και ο ανάστροφος εκκινητής της πρώτης αντίδρασης (εξωτερικό σετ) της nested PCR αποτελείται από SEQ ID NO: 86 και SEQ ID NO: 87 αντίστοιχα, ενώ ο πρόσθιος και ο ανάστροφο εκκινητής της δεύτερης αντίδρασης ( το εσωτερικό σετ) της nested PCR αποτελείται από SEQ ID NO: 88 και SEQ ID NO: 89, αντίστοιχα. Όταν η ανίχνευση των προϊόντων της nested PCR διεξάγεται ποσοτικά, ο ανιχνευτής είναι ένας ιχνηθέτης φθορισμού FAM-BFIQ1 που αποτελείται από SEQ ID NO: 90. According to a further preferred embodiment, the forward and reverse primers of the first reaction (outer set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 87 respectively, while the forward and reverse primers of the second reaction (the inner set) of the nested PCR consists of SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89, respectively. When detection of nested PCR products is performed quantitatively, the probe is a FAM-BFIQ1 fluorescent probe consisting of SEQ ID NO: 90.
FI παρούσα εφεύρεση παρέχει περαιτέρω ένα “kit” για την ανίχνευση της παρουσίας SARS-CoV-2 σε ένα δείγμα, όπως ένα περιβαλλοντικό δείγμα, με nested PCR, όπου το “kit” περιλαμβάνει: The present invention further provides a kit for detecting the presence of SARS-CoV-2 in a sample, such as an environmental sample, by nested PCR, wherein the kit includes:
a) τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια που αποτελούνται από SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 αντίστοιχα και προαιρετικά έναν ιχνηθέτη φθορισμού που αποτελείται από SEQ ID NO: 75, ή b) τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια που αποτελούνται από SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 αντίστοιχα και προαιρετικά έναν ιχνηθέτη φθορισμού που αποτελείται από SEQ ID NO: 80, ή c) τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια που αποτελούνται από SEQ ID NO: 81 , SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 αντίστοιχα και προαιρετικά έναν ιχνηθέτη φθορισμού που αποτελείται από SEQ ID NO: 85, ή d) τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια που αποτελούνται από SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 αντίστοιχα και προαιρετικά έναν ιχνηθέτη φθορισμού που αποτελείται από SEQ ID NO: 90. Κατά προτίμηση, το “kit” περιλαμβάνει τουλάχιστον δύο από τα a), b), c) και d), ακόμη προτιμότερα, το “kit” περιλαμβάνει τουλάχιστον τρία από τα a), b), c) και d) και ιδανικά, το “kit” περιλαμβάνει a), b), c) και d). a) four oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 respectively and optionally a fluorescent marker consisting of SEQ ID NO: 75, or b) four oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 respectively and optionally a fluorescent probe consisting of SEQ ID NO: 80, or c) four oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 81 , SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 respectively and optionally a fluorescent probe consisting of SEQ ID NO: 85, or d) four oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 86 , SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 respectively and optionally a fluorescent tracer consisting of SEQ ID NO: 90. Preferably, the "kit" comprises at least two of a), b) , c) and d), even more preferably, the “kit” includes at least three of a), b), c) and d) and ideally, the “kit” includes a), b), c) and d).
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επιπλέον ζεύγη εκκινητών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στις nested PCR για την ανίχνευση ορισμένων μεταλλάξεων του SARS-CoV-2 σε περιβαλλοντικά δείγματα σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση. The present invention provides additional primer pairs that can be used in nested PCRs to detect certain mutations of SARS-CoV-2 in environmental samples according to the present invention.
Σύμφωνα με μια προτιμώμενη πραγματοποίηση, για την ανίχνευση της παρερμηνεύσιμης μετάλλαξης D614G (23403A>G) στο γονίδιο S, ο πρόσθιος και ανάστροφος εκκινητής της πρώτης αντίδρασης (εξωτερικό σετ) της nested PCR αποτελούνται από SEQ ID NO: 91 και SEQ ID NO: 92 αντίστοιχα, και ο πρόσθιος και ανάστροφος εκκινητής της δεύτερης αντίδρασης (εσωτερικό σετ) της nested PCR αποτελούνται από SEQ ID NO: 93 και SEQ ID NO: 94 αντίστοιχα. According to a preferred embodiment, for the detection of the missense mutation D614G (23403A>G) in the S gene, the forward and reverse primers of the first reaction (outer set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 91 and SEQ ID NO: 92 respectively, and the forward and reverse primer of the second reaction (inner set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 93 and SEQ ID NO: 94 respectively.
Σύμφωνα με μια προτιμώμενη πραγματοποίηση, για την ανίχνευση της παρερμηνεύσιμης μετάλλαξης Q57H (25563G>T) στο γονίδιο ORF3a, ο πρόσθιος και ανάστροφος εκκινητής της πρώτης αντίδρασης (εξωτερικό σετ) της nested PCR αποτελούνται από SEQ ID NO: 95 και SEQ ID NO: 96 αντίστοιχα, και ο πρόσθιος και ανάστροφος εκκινητής της δεύτερης αντίδρασης (εσωτερικό σετ) της nested PCR αποτελούνται από SEQ ID NO: 97 και SEQ ID NO: 98 αντίστοιχα. According to a preferred embodiment, for the detection of the missense mutation Q57H (25563G>T) in the ORF3a gene, the forward and reverse primers of the first reaction (outer set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 95 and SEQ ID NO: 96 respectively, and the forward and reverse primer of the second reaction (inner set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 97 and SEQ ID NO: 98 respectively.
Σύμφωνα με μια προτιμώμενη πραγματοποίηση, για την ανίχνευση της παρερμηνεύσιμης μετάλλαξης P323L (14408C>T) στο γονίδιο ORF1ab/RdRP, ο πρόσθιος και ανάστροφος εκκινητής της πρώτης αντίδρασης (εξωτερικό σετ) της nested PCR αποτελούνται από SEQ ID NO: 99 και SEQ ID NO: 100 αντίστοιχα, και ο πρόσθιος και ανάστροφος εκκινητής της δεύτερης αντίδρασης (εσωτερικό σετ) της nested PCR αποτελούνται από SEQ ID NO: 101 και SEQ ID NO: 102 αντίστοιχα. According to a preferred embodiment, to detect the missense mutation P323L (14408C>T) in the ORF1ab/RdRP gene, the forward and reverse primers of the first reaction (outer set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO : 100 respectively, and the forward and reverse primer of the second reaction (inner set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 101 and SEQ ID NO: 102 respectively.
Σύμφωνα με μια προτιμώμενη πραγματοποίηση, για την ανίχνευση της παρερμηνεύσιμης μετάλλαξης R203K (28881 G>A) και G204R (28883G>C) στο γονίδιο Ν, ο πρόσθιος και ανάστροφος εκκινητής της πρώτης αντίδρασης (εξωτερικό σετ) της nested PCR αποτελούνται από SEQ ID NO: 103 και SEQ ID NO: 104 αντίστοιχα, και ο πρόσθιος και ανάστροφος εκκινητής της δεύτερης αντίδρασης (εσωτερικό σετ) της nested PCR αποτελούνται από SEQ ID NO: 105 και SEQ ID NO: 106 αντίστοιχα. According to a preferred embodiment, to detect the missense mutation R203K (28881 G>A) and G204R (28883G>C) in the N gene, the forward and reverse primers of the first reaction (outer set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO : 103 and SEQ ID NO: 104 respectively, and the forward and reverse primer of the second reaction (inner set) of the nested PCR consist of SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 106 respectively.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει περαιτέρω ένα “kit” για την ανίχνευση μιας μετάλλαξης του SARS-CoV-2 σε ένα δείγμα, όπως ένα περιβαλλοντικό δείγμα, με nested PCR, όπου το “kit” περιλαμβάνει The present invention further provides a kit for detecting a mutation of SARS-CoV-2 in a sample, such as an environmental sample, by nested PCR, wherein the kit comprises
τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια που αποτελούνται από SEQ ID NO: 91 , SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 αντίστοιχα, ή four oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 91 , SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 respectively, or
τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια που αποτελούνται από SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 αντίστοιχα, ή four oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 respectively, or
τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια που αποτελούνται από SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 , SEQ ID NO: 102 αντίστοιχα, ή four oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 , SEQ ID NO: 102 respectively, or
τέσσερα ολιγονουκλεοτίδια που αποτελούνται από SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 αντίστοιχα. four oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 respectively.
Η παρούσα εφεύρεση επιτρέπει την ανίχνευση ενός ιού RNA, όπως ο SARS-CoV-2, με υψηλή ειδικότητα και εκλεκτικότητα ακόμη και όταν ο ιός υπάρχει σε ένα περιβαλλοντικό δείγμα σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Επιπλέον, η παρούσα εφεύρεση επιτρέπει την ταυτοποίηση του προφίλ μεταλλάξεων και του γονιδιωματικού προφίλ RNA ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα, το οποίο αντιπροσωπεύει μια αποτελεσματική και οικονομικά αποδοτική προσέγγιση για τη δημιουργία ενός συστήματος έγκαιρης προειδοποίησης για την παρακολούθηση της γονιδιωματικής επιδημιολογίας ενός ιού RNA στο επίπεδο κοινότητας / πληθυσμού. The present invention enables the detection of an RNA virus, such as SARS-CoV-2, with high specificity and selectivity even when the virus is present in an environmental sample at very low concentrations. In addition, the present invention enables the identification of the mutation profile and the genomic profile of RNA viruses in environmental samples, which represents an efficient and cost-effective approach to create an early warning system to monitor the genomic epidemiology of an RNA virus at the community level / population.
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ EXAMPLES
Παράδειγμα 1 Example 1
Ανάλυση σταθερότητας του RNA του SARS-CoV-2 Stability analysis of SARS-CoV-2 RNA
Η ανάλυση σταθερότητας του RNA του SARS-CoV-2 με χρήση υπολογιστή, πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο ScanFold [Andrews, R.J., J. Roche, and W.N. Moss, ScanFold: an approach for genome-wide discovery of local RNA structural elements-applications to Zika virus and HIV. PeerJ, 2018. 6: p. e6136], ο οποίος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιορίσει τα δομικά χαρακτηριστικά των ιικών μεταγράφωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, το γονιδίωμα αναφοράς Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) αναλύθηκε με τον αλγόριθμο Scan Fold-Scan, χρησιμοποιώντας περιοχές 300 νουκλεοτιδίων και βήμα ανάλυσης ίσο με 150 νουκλεοτίδια, οδηγώντας έτσι στην ανάλυση 198 διαφορετικών περιοχών του γονιδιώματος. Οι περιοχές αυτές αναλύθηκαν με τον αλγόριθμο RNAfold, ο οποίος συμπεριλαμβάνεται στο πακέτο εφαρμογών ViennaRNA. Για κάθε περιοχή ανάλυσης, υπολογίστηκε η δομή με βάση την ελάχιστη ελεύθερη ενέργεια (MFE) AG°, η τιμή της οποίας προβλέφθηκε χρησιμοποιώντας το μοντέλο ενέργειας Τ urner στους 18°C. Γ ια το χαρακτηρισμό της MFE κάθε περιοχής 300 νουκλεοτιδίων του γονιδιώματος του ιού, υπολογίστηκε η τιμή AG° z-score για κάθε περιοχή. Ο αλγόριθμος ScanFold χρησιμοποιεί κάθε προβλεπόμενη τιμή MFE της αλληλουχίας προς ανάλυση (MFEnative) και τη συγκρίνει με τιμές MFE από 100 τυχαίες εκδόσεις αλληλουχίας με την ίδια σύνθεση νουκλεοτιδίων (MFErandom), χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση που έχει χαρακτηριστεί από τους Clote et. Al [Clote, Ρ., et al., Structural RNA has lower folding energy than random RNA of the same dinucleotide frequency. RNA, 2005. 11(5): p. Computational stability analysis of SARS-CoV-2 RNA was performed with the ScanFold algorithm [Andrews, R.J., J. Roche, and W.N. Moss, ScanFold: an approach for genome-wide discovery of local RNA structural elements-applications to Zika virus and HIV. PeerJ, 2018. 6: p. e6136], which can be used to determine structural features of viral transcripts. More specifically, the Wuhan-Hu-1 reference genome (NC_045512.2) was analyzed with the Scan Fold-Scan algorithm, using regions of 300 nucleotides and an analysis step equal to 150 nucleotides, thus leading to the analysis of 198 different regions of the genome. These regions were analyzed with the RNAfold algorithm, which is included in the ViennaRNA application package. For each analysis region, the structure was calculated based on the minimum free energy (MFE) AG°, the value of which was predicted using the T urner energy model at 18°C. To characterize the MFE of each 300 nucleotide region of the viral genome, the AG° z-score was calculated for each region. The ScanFold algorithm takes each predicted MFE value of the sequence to be analyzed (MFEnative) and compares it with MFE values from 100 random versions of the sequence with the same nucleotide composition (MFERandom), using an approach characterized by Clote et. Al [Clote, P., et al., Structural RNA has lower folding energy than random RNA of the same dinucleotide frequency. RNA, 2005. 11(5): p.
578-91], 578-91],
Επιπλέον, οι τιμές p-value που προέκυψαν αντιστοιχούν στον αριθμό των τιμών MFErandom, οι οποίες ήταν πιο σταθερές (πιο αρνητικές) από την MFEnative. Επιπλέον, η ανάλυση με το ScanFold επιτρέπει τον χαρακτηρισμό της πιθανής δομικής ποικιλομορφίας της προς ανάλυση ακολουθίας, υπολογίζοντας την ποικιλομορφία του συνόλου (ED) και την κεντροειδή δομή. Η κεντροειδής δομή απεικονίζει τα ζεύγη βάσεων που ήταν "πιο συνηθισμένα" (δηλαδή είχαν την ελάχιστη απόσταση ζευγών βάσεων) μεταξύ όλων των διαμορφώσεων συνόλου Boltzmann που προβλέπονται για την ακολουθία προς ανάλυση. Στη συνέχεια, ο ED προσπαθεί να ποσοτικοποιήσει την ποικιλία των διαφορετικών δομών, που υπήρχαν στο σύνολο. Συγκεκριμένα, οι υψηλότεροι αριθμοί ED υποδηλώνουν πολλαπλές δομές μοναδικές από την προβλεπόμενη MFE, ενώ οι χαμηλοί αριθμοί ED υποδηλώνουν την παρουσία μιας κυρίαρχης δομής MFE που αντιπροσωπεύεται ιδιαίτερα στο σύνολο. In addition, the resulting p-values correspond to the number of MFErandom values, which were more stable (more negative) than MFEnative. In addition, analysis with ScanFold allows the characterization of the potential structural diversity of the sequence to be analyzed by calculating ensemble diversity (ED) and centroid structure. The centroid plot depicts the base pairs that were "most common" (ie had the smallest base pair distance) among all Boltzmann ensemble configurations predicted for the sequence to be analyzed. ED then attempts to quantify the variety of different structures that were present in the ensemble. Specifically, higher ED numbers indicate multiple structures unique to the predicted MFE, while low ED numbers indicate the presence of a dominant MFE structure that is highly represented in the ensemble.
Για να αυξηθεί η ακρίβεια της ανάλυσης σταθερότητας SARS-Cov-2, χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον αλγόριθμοι, συμπεριλαμβανομένου του VfoldCPX Server [Xu, X. and S.J. Chen, VfoldCPX Server: Predicting RNA-RNA Complex Structure and Stability. PLoS One, 2016. 11(9): p. e0163454], Ως αποτέλεσμα, ελήφθησαν υπόψη παράμετροι όπως οι αλληλεπιδράσεις βρόχου-βρόχου και η χρήση εντροπίας φυσικού βρόχου για τον προσδιορισμό των πιο σταθερών περιοχών του SARS-Cov-2. Η εκτεταμένη ανάλυση με το VfoldCPX οδήγησε σε ένα σύνολο ενεργειακά σταθερών δομών, που ταξινομούνται με βάση τη σταθερότητά τους, παρέχοντας έτσι λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τις πιο σταθερές γονιδιωματικές περιοχές SARS-Cov-2. To increase the accuracy of the SARS-Cov-2 stability analysis, additional algorithms were used, including the VfoldCPX Server [Xu, X. and S.J. Chen, VfoldCPX Server: Predicting RNA-RNA Complex Structure and Stability. PLoS One, 2016. 11(9): p. e0163454], As a result, parameters such as loop-loop interactions and the use of natural loop entropy were taken into account to determine the most stable regions of SARS-Cov-2. Extensive analysis with VfoldCPX resulted in a set of energetically stable structures, ranked by their stability, thus providing detailed information about the most stable SARS-Cov-2 genomic regions.
Η βιοπληροφορική ανάλυση με τους αλγορίθμους ScanFold και VfoldCPX, καθώς και η οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων με το λογισμικό IGV, παρείχε μια επισκόπηση σχετικά με τις προβλεπόμενες πιο σταθερές περιοχές του SARS-Cov-2, οδηγώντας στον εντοπισμό των πιο υποσχόμενων ακολουθιών 300 νουκλεοτιδίων με αρνητικές τιμές ζ-scores, οι οποίες προβλέπεται να έχουν χαμηλές τιμές MFEnative, και επομένως είναι πιο σταθερές. Αλληλουχίες με αξιοσημείωτες αρνητικές βαθμολογίες z-score κατανεμήθηκαν σε ολόκληρο το γονιδίωμα του SARS-CoV-2. Με βάση τα αποτελέσματα οπτικοποίησης, οι πιο σταθερές αλληλουχίες με αρνητικές βαθμολογίες z-score στοιχίθηκαν σε διάφορα γονίδια του γονιδιώματος SARS-CoV-2. Bioinformatic analysis with ScanFold and VfoldCPX algorithms, as well as visualization of the results with IGV software, provided an overview on the predicted most stable regions of SARS-Cov-2, leading to the identification of the most promising 300-nucleotide sequences with negative values z-scores, which are predicted to have low MFEnative values, and are therefore more stable. Sequences with significant negative z-scores were distributed throughout the SARS-CoV-2 genome. Based on the visualization results, the most stable sequences with negative z-scores were assigned to various genes of the SARS-CoV-2 genome.
Παράδειγμα 2 Example 2
Ανίχνευση του SARS-CoV-2 σε λύματα. Detection of SARS-CoV-2 in wastewater.
Υλικά και μέθοδοι Materials and methods
Δειγματοληψία λυμάτων Wastewater sampling
Τα 24ωρα δείγματα σύνθετων υγρών αποβλήτων συλλέχθηκαν από το εργοστάσιο επεξεργασίας λυμάτων της Αθήνας, το οποίο έχει σχεδιαστεί για να εξυπηρετεί πληθυσμό ισοδύναμο των 5.200.000. Στο εργοστάσιο επεξεργασίας λυμάτων της Αθήνας έχει σχεδιαστεί μια πρωτογενής καθίζηση, διαδικασία βιολογικής αφαίρεσης αζώτου και φωσφόρου από λάσπη και δευτερογενής καθίζηση. Το εύρος pH (7, 5-8,0) και το εύρος θερμοκρασίας (17-20 ° C) για τα δείγματα που συλλέχθηκαν παρέχονται από το εργοστάσιο επεξεργασίας λυμάτων της Αθήνας. Όλα τα δείγματα είναι αναλογικά της ροής. Τα δείγματα υγρών λυμάτων συλλέχθηκαν σε προκαθορισμένες φιάλες πολυαιθυλενίου υψηλής πυκνότητας (HDPE), μεταφέρθηκαν σε πάγο στο εργαστήριο και αποθηκεύτηκαν στους 4°C. Όλα τα δείγματα που συλλέχθηκαν, αναλύθηκαν αμέσως μετά την άφιξη στο εργαστήριο. Το προσωπικό δειγματοληψίας ακολούθησε τους κατάλληλους κανονισμούς και οδηγίες και φορούσε τον ενδεδειγμένο εξοπλισμό ατομικής προστασίας. The 24-hour composite wastewater samples were collected from the Athens sewage treatment plant, which is designed to serve a population equivalent of 5,200,000. At the Athens sewage treatment plant, a primary sedimentation, biological nitrogen and phosphorus removal process from sludge and secondary sedimentation has been designed. The pH range (7.5–8.0) and temperature range (17–20 °C) for the samples collected were provided by the Athens Wastewater Treatment Plant. All samples are flow proportional. Liquid sewage samples were collected in pre-defined high-density polyethylene (HDPE) bottles, transported on ice to the laboratory and stored at 4°C. All samples collected were analyzed immediately upon arrival at the laboratory. Sampling personnel followed appropriate regulations and guidelines and wore appropriate personal protective equipment.
Συμπύκνωση δειγμάτων και απομόνωση RNA Sample concentration and RNA isolation
Τα δείγματα που συλλέχθηκαν, συμπυκνώθηκαν αμέσως μετά την άφιξή τους με τη μέθοδο καταβύθισης με πολυαιθυλενογλυκόλη 8000 (PEG 8000; Promega Corporation, Madison, Wl, USA). Πιο συγκεκριμένα, 50 mL λυμάτων φυγοκεντρήθηκαν σε 4,750 g για 30 λεπτά στους 4°C, προκειμένου να απομακρυνθούν βακτήρια και μεγάλα σωματίδια. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε έναν καθαρό σωλήνα φυγοκέντρησης, που περιείχε 3.5 g PEG και 0.8 g NaCI, αναμίχθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος έως ότου διαλυθεί πλήρως, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 10,050 g για 2 h στους 4°C. Το μεγαλύτερο μέρος του υπερκείμενου διαλύματος απορρίφθηκε χωρίς να καταστραφεί το ιικό ίζημα και στη συνέχεια ο σωλήνας φυγοκεντρήθηκε στα 10,050 g για 5 λεπτά στους 4°C, και τελικά το ιικό ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε 500 μL νερό χωρίς νουκελάσες. Collected samples were concentrated immediately upon arrival by precipitation with polyethylene glycol 8000 (PEG 8000; Promega Corporation, Madison, WI, USA). More specifically, 50 mL of wastewater was centrifuged at 4,750 g for 30 min at 4°C in order to remove bacteria and large particles. The supernatant was transferred to a clean centrifuge tube, containing 3.5 g PEG and 0.8 g NaCl, mixed at room temperature until completely dissolved, and then centrifuged at 10,050 g for 2 h at 4°C. Most of the supernatant was discarded without destroying the viral pellet, and then the tube was centrifuged at 10,050 g for 5 min at 4°C, and finally the viral pellet was solubilized in 500 μL of nuclease-free water.
Η απομόνωση RNA πραγματοποιήθηκε, σε 200 μ συμπυκνωμένο δείγμα χρησιμοποιώντας το «kit» Water DNA / RNA Magnetic Bead (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, αμέσως μετά την συμπύκνωση. RNA isolation was performed, on a 200 µl concentrated sample using the Water DNA / RNA Magnetic Bead kit (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA), according to the manufacturer's instructions, immediately after concentration.
Σύνθεση μονόκλωνου cDNA Synthesis of single-stranded cDNA
Η αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA από τα δείγματα λυμάτων πραγματοποιήθηκε αντιδράσεις όγκου 20 μl, οι οποίες περιείχαν 5.0 μl RNA, 1.0 μl of 10mM dNTPs mix (Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany), 100 U αντίστροφη μεταγραφάσης Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 50 U ανασυνδυασμένου αναστολέα ριβονουκλεάσης RNaseOUT (Invitrogen) and 1.0 μl τυχαία εξαμερή συγκέντρωσης 50 μΜ (Invitrogen). Το μίγμα ολικού RNA, dNTPs και τυχαίων εξαμερών επωάστηκε στους 65°C για 5 λεπτά, ενώ η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με επώαση στους 25°C για 10 λεπτά και στους 50°C για 50 λεπτά. Η απενεργοποίηση του ενζύμου πραγματοποιήθηκε στους 70°C για 15 λεπτά. Τέλος, το AMPLIRUN SARS-CoV-2 RNA (Vircell S.L., Granada, Spain) χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα ελέγχου για το γονιδίωμα του SARS-CoV-2. Reverse transcription of total RNA from the sewage samples was performed in 20 μl volume reactions, which contained 5.0 μl RNA, 1.0 μl of 10 mM dNTPs mix (Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany), 100 U of Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 50 U of recombinant ribonuclease inhibitor RNaseOUT (Invitrogen) and 1.0 μl random hexamer at a concentration of 50 μM (Invitrogen). The mixture of total RNA, dNTPs and random hexamers was incubated at 65°C for 5 min, while reverse transcription was performed by incubation at 25°C for 10 min and at 50°C for 50 min. Enzyme inactivation was performed at 70°C for 15 min. Finally, AMPLIRUN SARS-CoV-2 RNA (Vircell S.L., Granada, Spain) was used as a control sample for the SARS-CoV-2 genome.
Nested PCR Nested PCR
Ο θερμικός κυκλοποιητής Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις nested PCR. Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης ήταν 25 μl και περιλάμβανε 5.0 μl εκμαγείου cDNA (πρώτη PCR) ή 2.0 μl εκμαγείου PCR προϊόντος (δεύτερη PCR), 1.0 μl of 10ιπΜ dNTPs mix (Jena Bioscience GmbH), 500 nM από τον πρόσθιο και ανάστροφο εκκινητή και 1 U πολυμεράσης Kapa Taq polymerase (Kapa Biosystems, Inc., Woburn, ΜΑ). To θερμικό πρωτόκολλο περιλάμβανε ένα στάδιο ενεργοποίησης της πολυμεράσης στους 95°C για 3 λεπτά, το οποίο ακολούθησαν 15 κύκλοι (πρώτη PCR) ή 40 κύκλοι (δεύτερη PCR) που περιλάμβαναν αποδιάταξη στους 95°C για 30 sec, υβριδοποίηση των εκκινητών στους 60°C για 30 sec και επιμήκυνση στους 72°C για 1 λεπτό, ενώ τέλος ακολούθησε ένα στάδιο τελικής επιμήκυνσης στους 72°C για 5 λεπτά. Μετά την ολοκλήρωση της δεύτερης αντίδρασης PCR, 10μl του PCR προϊόντος ηλεκτροφορήθηκαν σε 1.5% β/ο πήκτωμα αγαρόζης, οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Και φωτογραφήθηκαν υπό ακτινοβολία UV. The Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) was used for the nested PCR reactions. The total reaction volume was 25 μl and included 5.0 μl of cDNA template (first PCR) or 2.0 μl of PCR product template (second PCR), 1.0 μl of 10 µM dNTPs mix (Jena Bioscience GmbH), 500 nM of the forward and reverse primers and 1 U of Kapa Taq polymerase (Kapa Biosystems, Inc., Woburn, MA). The thermal protocol included a polymerase activation step at 95°C for 3 min, followed by 15 cycles (first PCR) or 40 cycles (second PCR) of denaturation at 95°C for 30 sec, primer annealing at 60° C for 30 sec and elongation at 72°C for 1 min, followed by a final elongation step at 72°C for 5 min. After completion of the second PCR reaction, 10 µl of the PCR product was electrophoresed on a 1.5% w/v agarose gel, visualized by ethidium bromide staining. And they were photographed under UV radiation.
Nested PCR πραγματικού χρόνου Nested real-time PCR
Η μεθοδολογίες PCR σε πραγματικό χρόνο βασισμένες στη χρήση ιχνηθέτη φθορισμού πραγματοποιήθηκαν στο μηχάνημα 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Τα PCR προϊόντα της πρώτης συμβατικής PCR - όπως περιγράφεται προηγουμένως - χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγεία για την αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο (δεύτερη αντίδραση). Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης ήταν 20 μl και περιλάμβανε 2.0 μl PCR προϊόν, 10 μl Kapa Probe Fast Universal 2X qPCR Master Mix (Kapa Biosystems), 500 nM από τον πρόσθιο και ανάστροφο εκκινητή και 125 nM από τον ιχνηθέτη φθορισμού. Το θερμικό πρωτόκολλο περιλάμβανε ένα στάδιο ενεργοποίησης της πολυμεράσης στους 95°C για 3 λεπτά, το οποίο ακολούθησαν 40 κύκλοι που περιλάμβαναν αποδιάταξη στους 95°C για 15 sec και ένα στάδιο υβριδοποίησης εκκινητών/ιχνηθέτη και επιμήκυνσης στους 60°C για 1 λεπτό. Real-time PCR methodologies based on the use of a fluorescent probe were performed on the 7500 Fast Real-Time PCR System machine (Applied Biosystems). The PCR products of the first conventional PCR - as previously described - were used as templates for the real-time PCR reaction (second reaction). The total reaction volume was 20 μl and included 2.0 μl PCR product, 10 μl Kapa Probe Fast Universal 2X qPCR Master Mix (Kapa Biosystems), 500 nM of the forward and reverse primers, and 125 nM of the fluorescent probe. The thermal protocol included a polymerase activation step at 95°C for 3 min, followed by 40 cycles of denaturation at 95°C for 15 sec and a primer/probe hybridization and extension step at 60°C for 1 min.
Results Results
Λαμβάνοντας υπόψη την απαιτητική φύση των δειγμάτων λυμάτων, ο πρώτος στόχος της μελέτης ήταν να βελτιώσει την ευαισθησία της ανίχνευσης του SARS-CoV-2 με προσδιορισμούς που βασίζονται σε PCR. Με βάση τα αποτελέσματα της βιοπληροφορικής ανάλυσης σχετικά με τη σταθερότητα του RNA του SARS-CoV-2 (Παράδειγμα 1), σχεδιάστηκαν τέσσερις διαφορετικοί προσδιορισμοί nested PCR / PCR σε πραγματικό χρόνο: 1. στο Ν γονίδιο - προϊόν: φωσφοπρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου (προσδιορισμός Ν), 2. στο γονίδιο ORFlab - προϊόν: ελικάση (προσδιορισμός Helicase), 3. στο γονίδιο ORFlab - προϊόν: nsp3 (προσδιορισμός NSP3) και 4. στο γονίδιο ORF3a - προϊόν: πρωτεΐνη ORF3a (δοκιμή ORF3a). Οι εκκινητές και οι ιχνηθέτες αυτών των προσδιορισμών φαίνονται παρακάτω στον Πίνακα 1. Considering the demanding nature of wastewater samples, the first aim of the study was to improve the sensitivity of SARS-CoV-2 detection with PCR-based assays. Based on the results of the bioinformatic analysis on the stability of SARS-CoV-2 RNA (Example 1), four different nested PCR / real-time PCR assays were designed: 1. in the N gene - product: nucleocapsid phosphoprotein (N assay) , 2. in ORFlab gene - product: helicase (Helicase assay), 3. in ORFlab gene - product: nsp3 (NSP3 assay) and 4. in ORF3a gene - product: ORF3a protein (ORF3a assay). Primers and probes for these assays are shown below in Table 1.
Πίνακας 1 Table 1
FP: Πρόσθιος εκκινητής, RP: Ανάστροφος εκκινητής, Pr: ιχνηθέτης ποσοτικής FP: Forward Primer, RP: Reverse Primer, Pr: Quantitative Tracer
Για τη διερεύνηση της ικανότητας των προσδιορισμών nested PCR / PCR σε πραγματικό χρόνο να βελτιώσουν την ευαισθησία της ανίχνευσης του SARS-CoV-2, αναλύθηκαν σειριακές αραιώσεις του πρότυπου δείγματος ελέγχου, οι οποίες κάλυπταν 9 τάξεις μεγέθους (από 1000 μέχρι 2.5 αντίγραφα RNA/αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής), με τη χρήση: a. nested PCR / PCR σε πραγματικό χρόνο, και b. της δοκιμασίας PCR με τη χρήση του σετ εκκινητών “2019-nCoV_N1” και του ιχνηθέτη που προτείνει το CDC (CDC/2019-nCoV_N1 -based assay) (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html). Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία CDC/2019-nCoV_N1 , πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση του RNA του SARS-CoV-2 μέχρι: 5 αντίγραφα cDNA/αντίδραση PCR (αδύναμο PCR προϊόν) (Εικόνα 1 A). Η εφαρμογή των δοκιμασιών nested PCR / PCR σε πραγματικό χρόνο οδήγησε στη βελτίωση της απόδοσης ανίχνευσης στα 2 αντίγραφα cDNA/αντίδραση PCR για τα γονίδια Ν (Εικόνα 1Β), ORF3a (Εικόνα 1C) και Helicase (Εικόνα 2Α). Η χρήση της δοκιμασίας NSP3 οδήγησε στην ανίχνευση του SARS-CoV-2 μέχρι και σε 5 αντίγραφα cDNA/αντίδραση PCR (Εικόνα 2Β). Παρόμοια αποτελέσματα σχετικά με την απόδοση και το όριο ανίχνευσης παρατηρήθηκαν στο πρότυπο δείγμα ελέγχου του SARS-CoV-2 από τις δοκιμασίες nested PCR σε πραγματικό χρόνο. Η εικόνα 3Α δείχνει τις καμπύλες ποσοτικοποίησης (αριστερά) και τις πρότυπες καμπύλες αναφοράς (δεξιά) της δοκιμασίας nested PCR σε πραγματικό χρόνο στο γονίδιο Ν. Η εικόνα 3Β δείχνει τις καμπύλες ποσοτικοποίησης (αριστερά) και τις πρότυπες καμπύλες αναφοράς (δεξιά) της δοκιμασίας nested PCR σε πραγματικό χρόνο στο γονίδιο ORF3a. Η εικόνα 4Α δείχνει τις καμπύλες ποσοτικοποίησης (αριστερά) και τις πρότυπες καμπύλες αναφοράς (δεξιά) της δοκιμασίας nested PCR σε πραγματικό χρόνο στο γονίδιο Helicase. Η εικόνα 4Β δείχνει τις καμπύλες ποσοτικοποίησης (αριστερά) και τις πρότυπες καμπύλες αναφοράς (δεξιά) της δοκιμασίας nested PCR σε πραγματικό χρόνο στο γονίδιο NSP3. To investigate the ability of nested PCR / real-time PCR assays to improve the sensitivity of SARS-CoV-2 detection, serial dilutions of the standard control sample were analyzed, covering 9 orders of magnitude (from 1000 to 2.5 RNA copies/reaction reverse transcription), using: a. nested PCR / real-time PCR, and b. of the PCR assay using the “2019-nCoV_N1” primer set and the probe recommended by the CDC (CDC/2019-nCoV_N1 -based assay) (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/ rt-pcr-panel-primer-probes.html). Using the CDC/2019-nCoV_N1 assay, SARS-CoV-2 RNA was detected up to: 5 cDNA copies/PCR reaction (weak PCR product) (Figure 1 A). Application of nested PCR / real-time PCR assays led to improved detection efficiency in the 2-copy cDNA/PCR reaction for the N (Figure 1B), ORF3a (Figure 1C) and Helicase (Figure 2A) genes. Use of the NSP3 assay resulted in the detection of SARS-CoV-2 in up to 5 cDNA copies/PCR reaction (Figure 2B). Similar results regarding throughput and detection limit were observed in the SARS-CoV-2 standard control sample from the nested real-time PCR assays. Figure 3A shows the quantification curves (left) and standard reference curves (right) of the nested real-time PCR assay on the N gene. Figure 3B shows the quantification curves (left) and standard reference curves (right) of the nested assay Real-time PCR on the ORF3a gene. Figure 4A shows the quantification curves (left) and standard reference curves (right) of the nested real-time PCR assay on the Helicase gene. Figure 4B shows the quantification curves (left) and standard reference curves (right) of the nested real-time PCR assay on the NSP3 gene.
H ανίχνευση του SARS-CoV-2 σε λύματα βελτιώνεται με την ενίσχυση πολλαπλών στόχων Detection of SARS-CoV-2 in wastewater is improved by multi-target amplification
Η ανεπτυγμένη μεθοδολογία με τις δοκιμασίες nested PCR / PCR σε πραγματικό χρόνο, καθώς και η δοκιμασία CDC/2019-nCoV_N1 εφαρμόστηκαν σε 30 δείγματα λυμάτων (S1-S30), τα οποία συλλέχθηκαν από τον Αύγουστο (ν=2 δείγματα), Σεπτέμβριο (ν=16 δείγματα) και Οκτώβριο (ν=12 δείγματα) του 2020. Οι τιμές CT των θετικών δειγμάτων κάθε δοκιμασίας παρουσιάζονται στον πίνακα 2, ενώ τα πηκτώματα αγαρόζης στο οποία έχουν ηλεκτροφορηθεί περιλαμβάνονται στις εικόνες 5A-D. The developed methodology with the nested PCR / real-time PCR assays as well as the CDC/2019-nCoV_N1 assay were applied to 30 wastewater samples (S1-S30), which were collected from August (n=2 samples), September (n =16 samples) and October (ν=12 samples) of 2020. The CT values of the positive samples of each assay are presented in Table 2, while the agarose gels on which they have been electrophoresed are included in Figures 5A-D.
Πίνακας 2. Τιμές CTτης ανεπτυγμένης μεθοδολογίας με τις δοκιμασίες nested PCR / PCR σε πραγματικό χρόνο, καθώς και της δοκιμασίας CDC/2019-nCoV_N1 που προέκυψαν από τα θετικά δείγματα για SARS-CoV-2. Table 2. CT values of the developed methodology with the nested PCR / real-time PCR assays, as well as the CDC/2019-nCoV_N1 assay obtained from the positive samples for SARS-CoV-2.
Ο ιός SARS-CoV-2 ανιχνεύτηκε, από τουλάχιστον μια δοκιμασία, σε 17 δείγματα (17/30; 56.7%), ενώ 3 δείγματα ήταν αρνητικά (13/30; 43.3%). Από τα 17 θετικά δείγμα, η δοκιμασία CDC/2019-nCoV_N1 ανίχνευσε 5 δείγματα (ευαισθησία: 29.4%). Η ανεπτυγμένη μεθοδολογία με τις δοκιμασίες nested PCR / PCR σε πραγματικό χρόνο οδήγησε στην ανίχνευση του SARS-CoV-2 σε: α. 10 δείγματα (ευαισθησία: 58.8%) με τη δοκιμασία Ν, β. 9 δείγματα (ευαισθησία: 52.9%) με τη δοκιμασία NSP3, γ. 7 δείγματα (ευαισθησία: 41.2%) με τη δοκιμασία Helicase και δ. The SARS-CoV-2 virus was detected, by at least one test, in 17 samples (17/30; 56.7%), while 3 samples were negative (13/30; 43.3%). Of the 17 positive samples, the CDC/2019-nCoV_N1 assay detected 5 samples (sensitivity: 29.4%). The developed methodology with nested PCR / real-time PCR assays led to the detection of SARS-CoV-2 in: a. 10 samples (sensitivity: 58.8%) with the N test, b. 9 samples (sensitivity: 52.9%) with the NSP3 test, c. 7 samples (sensitivity: 41.2%) with the Helicase test and d.
5 δείγματα (ευαισθησία: 29.4%) με τη δοκιμασία ORF3a. Όπως ήταν αναμενόμενο, η εφαρμογή της ανεπτυγμένης μεθοδολογίας με τις δοκιμασίες nested PCR / PCR σε πραγματικό χρόνο οδήγησε σε σημαντικά μειωμένες τιμές CT (Πίνακας 2) σε σύγκριση με τη δοκιμασία CDC/2019-nCoV_N1 , τονίζοντας τη βελτιωμένη αναλυτική τους απόδοση. Η ανάλυση των δειγμάτων με τις δοκιμασίες nested PCR (Εικόνες 3Α, 3Β, 4Α, 4Β) οδήγησαν στα ίδια αποτελέσματα για τη συντριπτική πλειοψηφία των δειγμάτων. Πιο συγκεκριμένα, η συμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων nested PCR και PCR σε πραγματικό χρόνο ήταν 100% για τις δοκιμασίες Ν και ORF3a. Μια διαφορά παρατηρήθηκε σε ένα δείγμα (S20), το οποίο βρέθηκε αρνητικό στη δοκιμασία NSP3 με nested PCR, καθώς επίσης 3 δείγματα (S1 , S8, and S15) έδειξαν αδύναμο θετικό σήμα στις δοκιμασία Helicase, συγκριτικά με τη δοκιμασία nested PCR σε πραγματικό χρόνο. Από αυτή την άποψη, η συνολική συμφωνία των δοκιμασιών nested PCR και PCR σε πραγματικό χρόνο ήταν 96,7%. 5 samples (sensitivity: 29.4%) with the ORF3a assay. As expected, the application of the developed methodology with the nested PCR / real-time PCR assays resulted in significantly reduced CT values (Table 2) compared to the CDC/2019-nCoV_N1 assay, highlighting their improved analytical performance. Analysis of the samples with nested PCR assays (Figures 3A, 3B, 4A, 4B) yielded the same results for the vast majority of samples. More specifically, the agreement between nested PCR and real-time PCR results was 100% for the N and ORF3a assays. A difference was observed in one sample (S20), which was negative in the NSP3 assay by nested PCR, and also 3 samples (S1 , S8, and S15) showed a weak positive signal in the Helicase assay, compared to the real-time nested PCR assay . In this regard, the overall agreement of the nested PCR and real-time PCR assays was 96.7%.
Πιο σημαντικά, στην πλειοψηφία των θετικών δειγμάτων (10/17; 58.8%) ο ιός SARS-CoV-2 ανιχνεύτηκε με μια δοκιμασία, ενώ μόνο ένα (1/17; 5.9%) και πέντε (5/17; 29.4%) δείγματα βρέθηκαν θετικά από τέσσερις ή τρεις δοκιμασίες, αντίστοιχα. Κατ’ επέκταση, πραγματοποιήθηκε μια πολύ σημαντική βελτίωση της ειδικότητας ανίχνευσης από το συνδυασμό: α. των δοκιμασιών Ν και NSP3 - 14 θετικά δείγματα (ευαισθησία 82.4%), και β. των δοκιμασιών Ν, NSP3 και Helicase - 16 θετικά δείγματα (ευαισθησία 94.1%). Τα αποτελέσματα αυτά σαφώς υποδηλώνουν πως η ανίχνευση του SARS-CoV-2 σε λύματα δεν είναι ανεξάρτητη από τη γενωμική περιοχή, καθώς η στόχευση διαφορετικών περιοχών του RNA του SARS-CoV-2 οδήγησε σε διαφορετικά αποτελέσματα, ενώ η εφαρμογή περισσότερων της μιας δοκιμασιών οδήγησε στην σημαντικά βελτιωμένη ευαισθησία ανίχνευσης. More importantly, in the majority of positive samples (10/17; 58.8%) SARS-CoV-2 was detected by one test, while only one (1/17; 5.9%) and five (5/17; 29.4%) samples tested positive by four or three tests, respectively. By extension, a very significant improvement in detection specificity was achieved by the combination of: a. of the N and NSP3 tests - 14 positive samples (sensitivity 82.4%), and b. of the N, NSP3 and Helicase tests - 16 positive samples (sensitivity 94.1%). These results clearly suggest that the detection of SARS-CoV-2 in wastewater is not independent of the genomic region, as targeting different regions of SARS-CoV-2 RNA led to different results, while the application of more than one assay led to in the significantly improved detection sensitivity.
Παοάδειγμα 3 Example 3
Ανάλυση μεταλλάξεων του SARS-CoV-2 σε λύυατα υε τη χρήση στοχευμένης αλληλούχησης DNA Analysis of SARS-CoV-2 mutations in solutions using targeted DNA sequencing
Υλικά και μέθοδοι Materials and methods
Η δειγματοληψία, η συμπύκνωση των δειγμάτων και η απομόνωση RNA, η σύνθεση μονόκλωνου cDNA και οι αντιδράσεις nested PCR πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στο Παράδειγμα 2. Sampling, sample concentration and RNA isolation, single-stranded cDNA synthesis, and nested PCR reactions were performed as described in Example 2.
Ανάλυση μεταλλάξεων του SARS-CoV-2 σε δείγματα λυμάτων με τη χρήση αλληλούχησης νέας γενιάς Analysis of SARS-CoV-2 mutations in wastewater samples using next-generation sequencing
Αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε μια μεθοδολογία στοχευμένης DNA αλληλούχησης, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία αλληλούχησης με ημιαγωγό, για την ταυτοποίηση των παραλλαγών/μεταλλάξεων του ιού σε δείγματα λυμάτων. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες nested PCR όπως περιγράφονται στο Παράδειγμα 2, οι οποίες στόχευαν κάθε παραλλαγή/μετάλλαξη, ώστε να ενισχύσουν τις περιοχές -στόχους. Τα nested PCR προϊόντα που δημιουργήθηκαν, ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης για την εκτίμηση των αποτελεσμάτων. A targeted DNA sequencing methodology, using semiconductor sequencing technology, was developed and applied to identify virus variants/mutations in wastewater samples. Nested PCR assays were performed as described in Example 2, targeting each variant/mutation to amplify the target regions. The generated nested PCR products were electrophoresed in an agarose gel to evaluate the results.
Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το Ion Xpress Plus Fragment Library «kit» (Ion Torrent, Thermo Fisher Scientific Inc.) για την κατασκευή των DNA βιβλιοθηκών προς αλληλούχηση, και συνολικά 1 μg μίγματος καθαρισμένων PCR προϊόντων ως αρχική ποσότητα δείγματος. Η πρόσδεση ειδικών προσαρμογέων (adapters), το “nick-repair” και ο καθαρισμός του μίγματος PCR προϊόντων πραγματοποιήθηκαν με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η βιβλιοθήκη με τους προσκολλη μένους προσαρμογείς ποσοτικοποιήθηκε με τη χρήση του Ion Library TaqMan Quantitation «kit» (Ion Torrent) στο μηχάνημα ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Then, the Ion Xpress Plus Fragment Library 'kit' (Ion Torrent, Thermo Fisher Scientific Inc.) was used to construct the DNA libraries to be sequenced, and a total of 1 μg of a mixture of purified PCR products was used as the initial sample amount. The ligation of special adapters (adapters), the “nick-repair” and the purification of the mixture of PCR products were carried out based on the manufacturer's instructions. The library with attached adapters was quantified using the Ion Library TaqMan Quantitation 'kit' (Ion Torrent) on the ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
To εκμαγείο αλληλούχησης δημιουργήθηκε με PCR σε γαλάκτωμα στο μηχάνημα OneTouch 2 System (Ion Torrent), με τη χρήση του Ion PGM Hi-Q View OT2 «kit» (Ion Torrent), ακολουθώντας με ακρίβεια τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το μηχάνημα Ion OneTouch ES instrument (Ion Torrent) για τη διαδικασία εμπλουτισμού του εκμαγείου αλληλούχησης. Τελικά, πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση νέας γενιάς με τη χρήση ημιαγωγού, στο μηχάνημα Ion Torrent PGM, για την αλληλούχηση των PCR προϊόντων που περιέχουν τις παραλλαγές/μεταλλάξεις του ιού. The sequencing template was generated by in-emulsion PCR on the OneTouch 2 System machine (Ion Torrent), using the Ion PGM Hi-Q View OT2 'kit' (Ion Torrent), following the manufacturer's instructions exactly. The Ion OneTouch ES instrument (Ion Torrent) was then used for the sequencing template enrichment process. Finally, next-generation sequencing was performed using a semiconductor, on the Ion Torrent PGM machine, to sequence the PCR products containing the virus variants/mutations.
Αποτελέσματα Results
Στην παρούσα μελέτη, πέντε παρερμηνεύσιμες μεταλλάξεις αποτέλεσαν στόχους, ονομαστικά, α. D614G (23403A>G) - γονίδιο S, β. Q57H (25563G>T) -γονίδιο ORF3a, γ. P323L (14408C>T) - γονίδιο ORF1ab/RdRP, δ. R203K (28881 G>A) - γονίδιο Ν και ε. G204R (28883G>C) - γονίδιο Ν. Για την ανάλυση των μεταλλάξεων που αναφέρθηκαν προηγουμένως με στοχευμένη αλληλούχηση DNA, σχεδιάστηκαν και εφαρμόστηκαν νέες δοκιμασίες nested PCR σε 5 δείγματα λυμάτων, τα οποία συλλέχθηκαν από το Σεπτέμβρη 2020 και 8 δείγματα από τον Οκτώβριο/Νοέμβριο 2020. Οι εκκινητές των δοκιμασιών αυτών φαίνονται στον πίνακα 3 παρακάτω. In the present study, five missense mutations were targeted, namely, a. D614G (23403A>G) - gene S, b. Q57H (25563G>T) -ORF3a gene, c. P323L (14408C>T) - ORF1ab/RdRP gene, d. R203K (28881 G>A) - N gene and e. G204R (28883G>C) - N gene. To analyze the previously reported mutations by targeted DNA sequencing, new nested PCR assays were designed and applied to 5 wastewater samples, which were collected from September 2020 and 8 samples from October/November 2020. The primers of these assays are shown in table 3 below.
Table 3 Table 3
FP: Πρόσθιος εκκινητής, RP: Ανάστροφος εκκινητής FP: Forward primer, RP: Reverse primer
Στη συνέχεια, τα PCR προϊόντα χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία “barcoded” βιβλιοθηκών DNA για αλληλούχηση, οι οποίες αντιστοιχούσαν στο Σεπτέμβριο και Οκτώβριο/Νοέμβριο 2020. Το προφίλ των γενωμικών παραλλαγών (λίστα με τις παραλλαγές μια βάσης ή πολλών βάσεων) του SARS-CoV-2, το οποίο προέκυψε από την προσέγγιση αλληλούχησης υψηλής απόδοσης που αναπτύχθηκε, παρουσιάζεται στους πίνακες 4 και 5 παρακάτω. The PCR products were then used to generate “barcoded” DNA libraries for sequencing, which corresponded to September and October/November 2020. The genomic variant profile (list of single-base or multi-base variants) of SARS-CoV- 2, which resulted from the high-throughput sequencing approach developed, is presented in Tables 4 and 5 below.
Πίνακας 4. Προφίλ των γενωμικών παραλλαγών του SARS-CoV-2 σε δείγματα Σεπτεμβρίου 2020, όπως προέκυψε από τη στοχευμένη αλληλούχηση DNA. Table 4. Profile of SARS-CoV-2 genomic variants in September 2020 samples as inferred by targeted DNA sequencing.
Table 5. Προφίλ των γενωμικών παραλλαγών του SARS-CoV-2 σε δείγματα Οκτωβρίου/Νοεμβρίου 2020, όπως προέκυψε από τη στοχευμένη αλληλούχηση DNA. Table 5. Profile of SARS-CoV-2 genomic variants in October/November 2020 samples, as revealed by targeted DNA sequencing.
Η ανάλυση έδειξε πως το στέλεχος G614 του SARS-CoV-2, το οποίο προκύπτει από τη σημειακή μετάλλαξη D614G (23403A>G) στο γονίδιο S, κυριαρχεί σχεδόν αποκλειστικά, >99.9%, έναντι του στελέχους D614 στα δείγματα λυμάτων. Το εύρημα αυτό έρχεται σε συμφωνία με τα γενωμικά δεδομένα της βάσης δεδομένων GISAID, που υποστηρίζουν πως το στέλεχος G164 υπάρχει σε ποσοστό >98% και ~100% παγκοσμίως και στην Ευρώπη, αντίστοιχα. Παρόμοια, η αντικατάσταση P323L (14408C>T) στο γονίδιο ORF1ab/RdPR είναι επικρατούσα, -99.9%, και στις δύο περιόδους δειγματοληψίας, και βρίσκεται επίσης σε συμφωνία με τα επιδημιολογικά δεδομένα σε επίπεδο γενωμικής (-99% παγκοσμίως και στην Ευρώπη). Επιπρόσθετα, η μετάλλαξη Q57H (25563G>T) στο γονίδιο ORF3a παρατηρήθηκε στα δείγματα Οκτωβρίου/Νοεμβρίου σε ποσοστό -47%, αποτέλεσμα που έρχεται σε συμφωνία με την αυξανόμενη τάση που παρατηρείται παγκοσμίως τους τελευταίους μήνες (-43% στο τέλος του Νοεμβρίου 2020). The analysis showed that the G614 strain of SARS-CoV-2, which results from the point mutation D614G (23403A>G) in the S gene, dominates almost exclusively, >99.9%, over the D614 strain in the sewage samples. This finding is in agreement with genomic data from the GISAID database, which support that the G164 strain is >98% and ~100% present worldwide and in Europe, respectively. Similarly, the P323L (14408C>T) substitution in the ORF1ab/RdPR gene is prevalent, -99.9%, in both sampling periods, and is also in agreement with genome-wide epidemiological data (-99% worldwide and in Europe). In addition, the Q57H (25563G>T) mutation in the ORF3a gene was observed in the October/November samples at a rate of -47%, a result that is consistent with the increasing trend observed worldwide in recent months (-43% at the end of November 2020) .
Εκτός από τη χαρακτηρισμένη μετάλλαξη D614G, παρατηρήθηκε μια προηγουμένως άγνωστη σημειακή μετάλλαξη εντός του γονιδίου S, η H625R (23436A>G), σε ποσοστό 5.7% στα δείγματα Σεπτεμβρίου. Πιο συγκεκριμένα, η αντικατάσταση 23436A>G οδηγεί σε αλλαγή του αμινοξέος Ιστιδίνη σε Αργινίνη στη θέση 625 της πρωτεΐνης της ακίδας. Σε αντίθεση με την μετάλλαξη D614G, η οποία περιλαμβάνει την αντικατάσταση αμινοξέων με διαφορετικά χαρακτηριστικά πολικότητας, η μετάλλαξη H625R περιλαμβάνει την αντικατάσταση αμινιξέων με θετικά φορτισμένες πλευρικές αλυσίδες. Αν και η αντικατάσταση αυτή αφορά παρόμοια αμινοξέα, η ανάλυση της πρωτεϊνικής δομής με χρήση υπολογιστή έδειξε πως η μετάλλαξη H625R οδηγεί σε μικρές αλλαγές στην αναδίπλωση της πρωτεΐνης της ακίδας. Κατ’ επέκταση, η H625R μεταλλαγμένη πρωτεΐνη της ακίδας ενδέχεται να επιδεικνύει διαφορετικές βιοχημικές ιδιότητες, οι οποίες θα πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω, καθώς μπορεί να επιφέρουν σημαντικές αλλαγές όσον αφορά τη λειτουργία της πρωτεΐνης, αυξάνοντας την μεταδοτικότητα και τη μολυσματικότητα του ιού. Επιπλέον, ανιχνεύτηκε μια νέα σημειακή μετάλλαξη, η A54V (25553C>T), σε ποσοστό -9% στα δείγματα Σεπτεμβρίου, η οποία οδηγεί σε αντικατάσταση του αμινοξέος Αλανίνη σε Βαλίνη στη θέση 54 του πολυπεπτιδίου ORF3a. Και τα δύο αμινοξέα αντιπροσωπεύουν αλιφατικά, ουδέτερα αμινοξέα και συνεπώς δεν αναμένεται η συγκεκριμένη μετάλλαξη να επιφέρει σημαντικές αλλαγές όσον αφορά τη λειτουργία του ORF3a. In addition to the characterized D614G mutation, a previously unknown point mutation within the S gene, H625R (23436A>G), was observed in 5.7% of September samples. More specifically, the 23436A>G substitution results in a Histidine to Arginine amino acid change at position 625 of the spike protein. In contrast to the D614G mutation, which involves the substitution of amino acids with different polarity characteristics, the H625R mutation involves the substitution of amino acids with positively charged side chains. Although this substitution involves similar amino acids, computer analysis of the protein structure showed that the H625R mutation leads to small changes in the folding of the spike protein. By extension, the H625R mutant spike protein may exhibit different biochemical properties, which should be further investigated, as they may induce significant changes in protein function, increasing viral transmissibility and virulence. In addition, a new point mutation, A54V (25553C>T), was detected in -9% of the September samples, which results in an Alanine to Valine amino acid substitution at position 54 of the ORF3a polypeptide. Both amino acids represent aliphatic, neutral amino acids and thus this particular mutation is not expected to cause significant changes in ORF3a function.
Σχετικά με το γονίδιο Ν, παρατηρήθηκε μια σημαντικά πτωτική πορεία για τις παρερμηνεύσιμες σημειακές μεταλλάξεις 28881 G>A (R203K) και 28883G>C (G204R), καθώς και για την συνώνυμη αντικατάσταση 28882G>A, από -90% στα δείγματα Σεπτεμβρίου σε -70% στα δείγματα Οκτωβρίου/Νοεμβρίου. Τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας έρχονται σε συμφωνία με την πτωτική τάση σε παγκόσμιο επίπεδο των αντικαταστάσεων 28881 G>A, 28882G>A και 28883G>C (από 45% στα τέλη Σεπτεμβρίου σε 28% στα τέλη Νοεμβρίου), αν και το απόλυτο ποσοστό στα ελληνικά δείγματα παραμένει σημαντικά υψηλότερο. Αξίζει να αναφερθεί πως η σημειακή μετάλλαξη 28884G>T, η οποία έχει παρατηρηθεί σε -1% παγκοσμίως, βρέθηκε σε μεγαλύτερα ποσοστό στα δεδομένα της παρούσας έρευνας. Πιο συγκεκριμένα, η αντικατάσταση 28884G>T ανιχνεύτηκε σε -70% και 35% στα δείγματα Σεπτεμβρίου και Οκτωβρίου/Νοεμβρίου, αντίστοιχα. Σημαντικό επίσης είναι το γεγονός πως η ανάλυση υπέδειξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της 28884G>T και της 28883G>C, οδηγώντας σε μια νέα αντικατάσταση του αμινοξέος Γλυκίνη σε Λεύκινη στη θέση 204 (G204L) της πρωτεΐνης του νουκλεοκαψιδίου, συγκριτικά με τις ατομικές αντικαταστάσεις 28883G>C (G204R) ή 28884G>T (G204V). Εκτός από την ανίχνευση των τεσσάρων διαδοχικών παραλλαγών στις γενωμικές θέσεις 28881-28884, τα δεδομένα αλληλούχησης που προέκυψαν αποκάλυψαν την ύπαρξη μιας ταυτόχρονης έλλειψης 4 νουκλεοτιδίων μετά τη θέση 28880 (θέσεις: 28881 ως 28884) και μιας προσθήκης 4 νουκλεοτιδίων (προσθήκη ACAT) μεταξύ των θέσεων 28885-28886 (Πίνακας 2). Οι δύο αυτές ταυτόχρονες παραλλαγές οδηγούν στις παρερμηνεύσιμες μεταλλάξεις R203K και G204H της πρωτεΐνης του νουκλεοκαψιδίου. Regarding the N gene, a significantly decreasing trend was observed for the missense point mutations 28881 G>A (R203K) and 28883G>C (G204R), as well as the synonymous substitution 28882G>A, from -90% in September samples to - 70% in October/November samples. The results of the present study are consistent with the global downward trend of 28881 G>A, 28882G>A and 28883G>C substitutions (from 45% at the end of September to 28% at the end of November), although the absolute percentage in Greek samples remains significantly higher. It is worth mentioning that the point mutation 28884G>T, which has been observed in -1% worldwide, was found in a higher percentage in the data of the present research. More specifically, the 28884G>T substitution was detected in -70% and 35% of the September and October/November samples, respectively. Also important is the fact that the analysis indicated a significant correlation between 28884G>T and 28883G>C, leading to a new substitution of the amino acid Glycine to Leucine at position 204 (G204L) of the nucleocapsid protein, compared to the individual 28883G substitutions. >C (G204R) or 28884G>T (G204V). In addition to the detection of the four tandem variants at genomic positions 28881-28884, the resulting sequencing data revealed the existence of a simultaneous 4-nucleotide deletion after position 28880 (positions: 28881 to 28884) and a 4-nucleotide addition (ACAT addition) between positions 28885-28886 (Table 2). These two simultaneous variants lead to the missense mutations R203K and G204H of the nucleocapsid protein.
Τα ευρήματα υποδεικνύουν με σαφή τρόπο ότι η R203K συνυπάρχει με τις παραλλαγές G204R, G204L ή G204H. Αν και όλες αυτές οι μεταλλάξεις βρίσκονται στην περιοχή σύνδεσης (LKR) της φωσφοπρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου, η οποία εκτείνεται από την αμινοξική θέση 175 ως την 254, μόνο η R203K ανήκει στο υψηλής σημασίας πλούσιο σε σερίνη/αργινίνη μοτίβο της LKR, το οποίο περιέχει πιθανές τοποθεσίες φωσφορυλίωσης [Peng, Υ., et al., Structures of the SARS-CoV-2 nucleocapsid and their perspectives for drug design. EMBO J, 2020. 39(20): p. e105938]. Συνεπώς, η απουσία του αμινοξέος R203, εξαιτίας της μετάλλαξης R203K, αναμένεται να έχει άμεσο αντίκτυπο στην αναδίπλωση και τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης Ν, ενώ οποιαδήποτε από τις παραλλαγές στη θέση 204 της πρωτεΐνης (G204R, G204L ή G204H) οδηγεί μόνο σε λεπτές τροποποιήσεις. The findings clearly indicate that R203K coexists with the G204R, G204L or G204H variants. Although all these mutations are located in the binding region (LKR) of the nucleocapsid phosphoprotein, which spans from amino acid position 175 to 254, only R203K belongs to the highly important serine/arginine-rich motif of LKR, which contains potential sites phosphorylation [Peng, Y., et al., Structures of the SARS-CoV-2 nucleocapsid and their perspectives for drug design. EMBO J, 2020. 39(20): p. e105938]. Therefore, the absence of amino acid R203, due to the R203K mutation, is expected to have a direct impact on the folding and functionality of the N protein, while any of the variants at position 204 of the protein (G204R, G204L or G204H) lead to only subtle modifications.
Τέλος, αποκαλύφθηκε μια σημαντική αυξανόμενη τάση από 7% στα δείγματα Σεπτεμβρίου σε 27% στα δείγματα Οκτωβρίου/Νοεμβρίου της missense μετάλλαξης S194L (28854C>T), η οποία παρατηρήθηκε και σε παγκόσμιο επίπεδο (13% το Σεπτέμβριο έως 21% τον Νοέμβριο). Παρόμοια με το R203K, η μετάλλαξη S194L βρίσκεται επίσης στο μοτίβο σερίνης/αργινίνης της πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου και περιλαμβάνει την αντικατάσταση της υδροξυλικής ουδέτερης σερίνης (S) με την αλειφατική ουδέτερη λεύκινη (L). Δεδομένου ότι αυτή η περιοχή ρυθμίζει τον ολιγομερισμό της Ν πρωτεΐνης κατά τη φωσφορυλίωση, η επαγόμενη από τη μετάλλαξη απουσία του S194 θα μπορούσε να έχει σημαντικό αντίκτυπο στη λειτουργία του νουκλεοκαψιδίου, η οποία έρχεται επίσης σύμφωνα με τις δραματικές αλλαγές στην προβλεπόμενη δομή πρωτεΐνης και συνεπώς αξίζει περαιτέρω μελέτη. Finally, a significant increasing trend from 7% in September samples to 27% in October/November samples of the missense mutation S194L (28854C>T) was revealed, which was also observed globally (13% in September to 21% in November). Similar to R203K, the S194L mutation is also located in the serine/arginine motif of the nucleocapsid protein and involves the replacement of the hydroxylated neutral serine (S) with the aliphatic neutral leucine (L). Since this region regulates the oligomerization of the N protein upon phosphorylation, the mutation-induced absence of S194 could have a significant impact on nucleocapsid function, which is also consistent with the dramatic changes in the predicted protein structure and thus deserves further study.
Claims (24)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20210100091A GR1010565B (en) | 2021-02-11 | 2021-02-11 | Detection and mutational analysis og an rna virus in an environmental sample |
| PCT/EP2021/057316 WO2022171313A1 (en) | 2021-02-11 | 2021-03-22 | Detection and mutational analysis of an rna virus in an environmental sample |
| EP21716968.9A EP4291684A1 (en) | 2021-02-11 | 2021-03-22 | Detection and mutational analysis of an rna virus in an environmental sample |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20210100091A GR1010565B (en) | 2021-02-11 | 2021-02-11 | Detection and mutational analysis og an rna virus in an environmental sample |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR20210100091A true GR20210100091A (en) | 2022-09-06 |
| GR1010565B GR1010565B (en) | 2023-11-17 |
Family
ID=75426557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20210100091A GR1010565B (en) | 2021-02-11 | 2021-02-11 | Detection and mutational analysis og an rna virus in an environmental sample |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4291684A1 (en) |
| GR (1) | GR1010565B (en) |
| WO (1) | WO2022171313A1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111004870A (en) * | 2020-03-10 | 2020-04-14 | 中山大学达安基因股份有限公司 | Novel coronavirus N gene nucleic acid detection kit |
| CN111154922A (en) * | 2020-04-07 | 2020-05-15 | 广东环凯生物科技有限公司 | SARS-CoV-2 dry powder LAMP rapid detection kit |
| CN111560478A (en) * | 2020-05-27 | 2020-08-21 | 广州凯普医药科技有限公司 | Kit for detecting novel coronavirus by combining reverse transcription PCR with Sanger sequencing in one-step method |
| CN111676318A (en) * | 2020-06-18 | 2020-09-18 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | Amplification primer and method for novel coronavirus whole genome |
| CN111676325A (en) * | 2020-07-07 | 2020-09-18 | 云南科耀生物科技有限公司 | Primer combination for detecting SARS-CoV-2 whole genome and application method |
| CN111733295A (en) * | 2020-07-31 | 2020-10-02 | 广州领上源生物科技有限公司 | Primer group and kit for detecting novel coronavirus |
-
2021
- 2021-02-11 GR GR20210100091A patent/GR1010565B/en active IP Right Grant
- 2021-03-22 WO PCT/EP2021/057316 patent/WO2022171313A1/en active Application Filing
- 2021-03-22 EP EP21716968.9A patent/EP4291684A1/en active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111004870A (en) * | 2020-03-10 | 2020-04-14 | 中山大学达安基因股份有限公司 | Novel coronavirus N gene nucleic acid detection kit |
| CN111154922A (en) * | 2020-04-07 | 2020-05-15 | 广东环凯生物科技有限公司 | SARS-CoV-2 dry powder LAMP rapid detection kit |
| CN111560478A (en) * | 2020-05-27 | 2020-08-21 | 广州凯普医药科技有限公司 | Kit for detecting novel coronavirus by combining reverse transcription PCR with Sanger sequencing in one-step method |
| CN111676318A (en) * | 2020-06-18 | 2020-09-18 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | Amplification primer and method for novel coronavirus whole genome |
| CN111676325A (en) * | 2020-07-07 | 2020-09-18 | 云南科耀生物科技有限公司 | Primer combination for detecting SARS-CoV-2 whole genome and application method |
| CN111733295A (en) * | 2020-07-31 | 2020-10-02 | 广州领上源生物科技有限公司 | Primer group and kit for detecting novel coronavirus |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KITAMURA KOUICHI; SADAMASU KENJI; MURAMATSU MASAMICHI; YOSHIDA HIROMU: "Efficient detection of SARS-CoV-2 RNA in the solid fraction of wastewater", SCIENCE OF THE TOTAL ENVIRONMENT, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 763, 18 December 2020 (2020-12-18), AMSTERDAM, NL , XP086453967, ISSN: 0048-9697, DOI: 10.1016/j.scitotenv.2020.144587 * |
| LA ROSA GIUSEPPINA; IACONELLI MARCELLO; MANCINI PAMELA; BONANNO FERRARO GIUSY; VENERI CAROLINA; BONADONNA LUCIA; LUCENTINI LUCA; S: "First detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewaters in Italy", SCIENCE OF THE TOTAL ENVIRONMENT, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 736, 23 May 2020 (2020-05-23), AMSTERDAM, NL , XP086194959, ISSN: 0048-9697, DOI: 10.1016/j.scitotenv.2020.139652 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022171313A1 (en) | 2022-08-18 |
| GR1010565B (en) | 2023-11-17 |
| EP4291684A1 (en) | 2023-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Khan et al. | Isothermal SARS-CoV-2 diagnostics: tools for enabling distributed pandemic testing as a means of supporting safe reopenings | |
| US11186867B2 (en) | Next generation genomic sequencing methods | |
| AU2014342414B2 (en) | Next generation genomic sequencing methods | |
| WO2020056924A1 (en) | Method for detecting nucleic acid | |
| Arola et al. | Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis | |
| JP2011525365A (en) | System and method for detection of HIV affinity variants | |
| JP2009502137A (en) | Method for rapid identification and quantification of nucleic acid variants | |
| KR20220155998A (en) | Compositions, kits and methods for detection of viral sequences | |
| RU2731390C1 (en) | Test system and method for detecting rna of coronavirus sars-cov-2, virus-agent of coronavirus disease 2019 covid-19, by polymerase chain reaction in real time (embodiments) | |
| JP2023516472A (en) | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-COV-2), influenza A and influenza B | |
| WO2021198325A1 (en) | Assays for the detection of sars-cov-2 | |
| Mahony et al. | Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses | |
| AU2017203556A1 (en) | Ion torrent genomic sequencing | |
| US20120244523A1 (en) | System and Method for Detection of HIV Integrase Variants | |
| US20230416824A1 (en) | Systems for the detection of targeted gene variations and viral genomes and methods of producing and using same | |
| GR20210100091A (en) | Detection and mutational analysis og an rna virus in an environmental sample | |
| Nukiwa et al. | Simplified screening method for detecting oseltamivir resistant pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus by a RT-PCR/restriction fragment length polymorphism assay | |
| JP2007514440A (en) | Sensitive and specific test to detect SARS coronavirus | |
| US20120322665A1 (en) | System and method for detection of hiv-1 clades and recombinants of the reverse transcriptase and protease regions | |
| Regnault et al. | Deep impact of random amplification and library construction methods on viral metagenomics results. Viruses. 2021; 13: 253 | |
| Lopez et al. | Endonuclease-based genotyping of the RBM as a method to track the emergence or evolution of SARS-CoV-2 variants | |
| Castell et al. | Xinsheng Nan, Patrick Hardinge 1Ε, Sven Hoehn, Shrinivas Nivrutti Dighe, John Ukeri 2, Darius F. Pease 3, Joshua Griffin 3, Jessica I. Warrington, Zack Saud 5, Emma Hottinger 3, Gordon Webster, Davey Jones 4, Peter Kille, Andrew Weightman, Richard Stanton 5 | |
| CN113444840A (en) | Rapid detection method of novel coronavirus based on isothermal amplification | |
| Warneford-Thomson et al. | 4. COV-ID: A LAMP SEQUENCING APPROACH FOR HIGH-THROUGHPUT CO-DETECTION OF SARS-COV-2 AND INFLUENZA VIRUS IN HUMAN SALIVA | |
| WO2022025824A1 (en) | Methods for detecting rna viruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PG | Patent granted |
Effective date: 20231211 |