GR20160100568A - Method for the photometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins - Google Patents
Method for the photometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteinsInfo
- Publication number
- GR20160100568A GR20160100568A GR20160100568A GR20160100568A GR20160100568A GR 20160100568 A GR20160100568 A GR 20160100568A GR 20160100568 A GR20160100568 A GR 20160100568A GR 20160100568 A GR20160100568 A GR 20160100568A GR 20160100568 A GR20160100568 A GR 20160100568A
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- protein
- sample
- fraction
- cells
- carbonyl groups
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 181
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 181
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 title claims abstract description 61
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 59
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 35
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 33
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 23
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 22
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 16
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 claims description 14
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 13
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 12
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 claims description 10
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 9
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 8
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 6
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 5
- 239000002265 redox agent Substances 0.000 claims description 5
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 4
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims description 3
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N iso-butyl acetate Natural products CC(C)COC(C)=O GJRQTCIYDGXPES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M isocaproate Chemical compound CC(C)CCC([O-])=O FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid methyl ester Natural products COC(=O)CC(C)C OQAGVSWESNCJJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- -1 tissue homogenate Substances 0.000 claims description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims 4
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 claims 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 69
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 153
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 71
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 22
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 15
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 12
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 12
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 10
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 4
- 108091006003 carbonylated proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 description 3
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.CCOC(C)=O LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940071870 hydroiodic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 3
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxynonenal Chemical compound CCCCCC(O)C=CC=O JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 2
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- HUCVOHYBFXVBRW-UHFFFAOYSA-M caesium hydroxide Chemical compound [OH-].[Cs+] HUCVOHYBFXVBRW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 2
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- CPRMKOQKXYSDML-UHFFFAOYSA-M rubidium hydroxide Chemical compound [OH-].[Rb+] CPRMKOQKXYSDML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 3-methylphenylacetic acid Chemical compound CC1=CC=CC(CC(O)=O)=C1 GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRBKEAMVRSLQPH-UHFFFAOYSA-N 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 MRBKEAMVRSLQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-2-(4,4-dimethyl-2-oxoimidazolidin-1-yl)-n-[3-(trifluoromethyl)phenyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1NC(C)(C)CN1C(N=C1N)=NC=C1C(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N Dinitrochlorobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C([N+]([O-])=O)=C1 VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000015930 Lon proteases Human genes 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001181114 Neta Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033647 Pancreatitis acute Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023294 Protease La Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 206010043391 Thalassaemia beta Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000003229 acute pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000006851 antioxidant defense Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- XEXFVRMLYUDDJY-UHFFFAOYSA-N azane;hydrate;hydrochloride Chemical compound [NH4+].[NH4+].[OH-].[Cl-] XEXFVRMLYUDDJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N chloric acid Chemical compound OCl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940005991 chloric acid Drugs 0.000 description 1
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012493 hydrazine sulfate Substances 0.000 description 1
- 229910000377 hydrazine sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229940097156 peroxyl Drugs 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 229940117957 triethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 150000007968 uric acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Abstract
Description
Μέθοδος για την φωτομετρική ανίχνευση και/ή ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων Method for the photometric detection and/or quantification of protein carbonyl groups
ΠΕΔΙΟ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ FIELD OF THE INVENTION
Η εφεύρεση περιγράφει νέες μεθόδους και κιτ για την φωτομετρική ανίχνευση και/ή ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων. Οι μέθοδοι αυτές είναι χρήσιμες σε ένα πλήθος εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού του επιπέδου της κυπαρικής οξείδωσης, καθώς και για τη επιλογή παραγόντων που ελαπώνουν το επίπεδο κυπαρικής οξείδωσης. Παρέχονται επίσης κιτ για χρήση στην φωτομετρική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα ή περισσότερα δείγματα. The invention describes new methods and kits for the photometric detection and/or quantification of protein carbonyl groups. These methods are useful in a number of applications, including determining the level of cellular oxidation, as well as for selecting agents that decrease the level of cellular oxidation. Kits are also provided for use in the photometric quantification of protein carbonyl groups in one or more samples.
ΣΤΑΘΜΗ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ STATE OF THE ART
Η ακριβής ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την αξιολόγηση της έκτασης της οξειδωτικής βλάβης των πρωτεϊνών. Η οξείδωση των πρωτεϊνών είναι το αποτέλεσμα μιας βιολογικής διαδικασίας που περιγράφεται γενικά ως οξειδωτικό στρες, μια κατάσταση την οποία υφίστανται όλοι οι αερόβιοι οργανισμοί όπως ο άνθρωπος. Accurate quantification of protein carbonyl groups is a prerequisite for assessing the extent of oxidative damage to proteins. Protein oxidation is the result of a biological process generally described as oxidative stress, a condition experienced by all aerobic organisms such as humans.
Το οξειδωτικό στρες εμπλέκεται σε φυσιολογικές λειτουργίες και καταστάσεις του ανθρώπινου οργανισμού, όπως ο κυπαρικός κύκλος, η διαφοροποίηση και η γήρανση, καθώς και σε παθολογικές καταστάσεις που ευθύνονται για όλες τις ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της φαρμακευτικής αντιμετώπισής τους και του προσδιορισμού της κατάλληλης φαρμακευτικής δόσης. Ως εκ τούτου, η βιοχημεία του οξειδωτικού στρες θεωρείται από τις πλέον καινοτόμες και ταχέως αναπτυσσόμενες όλων των γνωστικών αντικειμένων των βιολογικών επιστημών. Oxidative stress is involved in normal functions and states of the human body, such as the cell cycle, differentiation and aging, as well as in pathological conditions responsible for all diseases, including their drug treatment and determining the appropriate drug dose. Therefore, the biochemistry of oxidative stress is considered one of the most innovative and rapidly developing of all biological sciences.
Οξειδωτικό στρες παρουσιάζεται κάθε φορά που η αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού προσβάλλεται από δραστικά είδη οξυγόνου (εφεξής καλούμενα και ROS) όπως οι ρίζες σουπεροξειδίου και υδροξυλίου. Τα ROS προσβάλλουν βιομόρια ζωτικής σημασίας για το μεταβολισμό των κυττάρων, όπως τα μεμβρανικά λιπίδια, το RNA/DNA, και οι πρωτεΐνες, και προκαλεί σοβαρές μοριακές βλάβες και συγκεκριμένα οξειδωτικές τροποποιήσεις και αποικοδομήσεις. Oxidative stress occurs whenever the body's antioxidant defenses are attacked by reactive oxygen species (hereinafter referred to as ROS) such as superoxide and hydroxyl radicals. ROS attack biomolecules vital for cell metabolism, such as membrane lipids, RNA/DNA, and proteins, and causes severe molecular damage, specifically oxidative modifications and degradation.
Οι πρωτεΐνες είναι μεταξύ των κύριων στόχων του οξειδωτικού στρες, που οδηγεί σε αναστολή του βιολογικού ρόλου τους, ιδιαίτερα των βιοχημικών αντιδράσεων που καταλύονται από ένζυμα κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού. Οι πρωτεΐνες μπορεί να υποστούν τροποποιήσεις από έναν μεγάλο αριθμό αντιδράσεων που περιλαμβάνουν ROS, και ειδικότερα από το υπεροξείδιο του υδρογόνου και τις ρίζες σουπεροξειδίου, υπεροξυλίου και υδροξυλίου, μεταξύ άλλων, τα οποία είναι βιοχημικά συστατικά του οξειδωτικού στρες. Αυτά μπορούν να προκαλέσουν διάφορα είδη οξειδωτικών τροποποιήσεων στις πρωτεΐνες, με πιο σημαντική τον σχηματισμό καρβονυλικών ομάδων σε ορισμένα αμινοξέα της πρωτεϊνικής/πεπτιδικής αλυσίδας (π.χ., λυσίνη, κυστεΐνη, αργινίνη, προλίνη, θρεονίνη). Άλλες μορφές καρβονυλίωσης των αμινοξέων προκύπτουν από την αντίδραση ορισμένων αμινοξέων (ιστιδίνη, κυστεΐνη και λυσίνη) με δραστικά είδη καρβονυλίου (όπως το 4-hydroxy-2-nonenal) που προέρχονται από την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Proteins are among the main targets of oxidative stress, which leads to inhibition of their biological role, especially biochemical reactions catalyzed by enzymes during metabolism. Proteins can undergo modifications by a large number of reactions involving ROS, and in particular by hydrogen peroxide and superoxide, peroxyl and hydroxyl radicals, among others, which are biochemical components of oxidative stress. These can cause various kinds of oxidative modifications to proteins, most notably the formation of carbonyl groups on certain amino acids of the protein/peptide chain (eg, lysine, cysteine, arginine, proline, threonine). Other forms of amino acid carbonylation result from the reaction of certain amino acids (histidine, cysteine, and lysine) with reactive carbonyl species (such as 4-hydroxy-2-nonenal) derived from lipid peroxidation.
Η καρβονυλίωση έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή, κυρίως λόγω της μη αναστρέψιμης, μη επιδιορθώσιμης φύσης της. Η περιεκτικότητα μιας πρωτεΐνης σε καρβονυλομάδες είναι ο πιο ευρέως αναγνωρισμένος αξιόπιστος δείκτης σοβαρής οξειδωτικής βλάβης της πρωτεΐνης. Οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες σημαδεύονται για πρωτεόλυση από το πρωτεόσωμα και την πρωτεάση Lon, αλλά μπορεί να ξεφύγουν από την αποικοδόμηση και να σχηματίσουν συσσωματώματα καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών υψηλού μοριακού βάρους σε ιστούς, τα οποία, εκτός από την συσσώρευση τους με την ηλικία, μπορεί να καταστούν κυτταροτοξικά. Η ύπαρξη καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών έχει συνδεθεί με ένα μεγάλο αριθμό ανθρώπινων ασθενειών και διαταραχών που σχετίζονται με την ηλικία, συμπεριλαμβανομένης της νόσου του Πάρκινσον και του Αλτσχάιμερ, τον καρκίνο, την χρόνια πνευμονική νόσο και την νεφρική ανεπάρκεια, τον διαβήτη και την σήψη, και τις δυσλειτουργίες του σκελετικού μυ. Επιπλέον, κλινικές μελέτες έχουν δείξει αυξημένα επίπεδα πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε ένα μεγάλο εύρος παθολογικών καταστάσεων στον άνθρωπο, π.χ. σε πρωτεΐνες του πλάσματος παιδιών με νεανική ρευματοειδή αρθρίτιδα, σε εκκρίματα της τραχείας από πρόωρα νεογνά που υποβάλλονται σε θεραπεία αερισμού, στο πλάσμα και το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με σοβαρή σήψη και μείζον τραύμα, στον ορό του πλάσματος ανδρών με χρόνια αρτηριακή απόφραξη, σε ασθενείς που πάσχουν από μείζονα θαλασσαιμία ή οξεία παγκρεατίτιδα, στον εγκέφαλο ατόμων με ήπια γνωστική διαταραχή, και σε πρωτεΐνες του πλάσματος σε ασθενείς με νεανικό διαβήτη τύπου 1. Carbonylation has attracted much attention, mainly because of its irreversible, non-repairable nature. The carbonyl group content of a protein is the most widely recognized reliable indicator of severe oxidative damage to the protein. Carbonylated proteins are marked for proteolysis by the proteasome and Lon protease, but may escape degradation and form aggregates of high molecular weight carbonylated proteins in tissues, which, in addition to accumulating with age, may become cytotoxic. The presence of carbonylated proteins has been linked to a large number of age-related human diseases and disorders, including Parkinson's and Alzheimer's disease, cancer, chronic lung disease and kidney failure, diabetes and sepsis, and dysfunctions of skeletal muscle. Furthermore, clinical studies have shown increased levels of protein carbonyls in a wide range of human pathological conditions, e.g. in plasma proteins of children with juvenile rheumatoid arthritis, in tracheal secretions from premature neonates undergoing ventilation therapy, in plasma and bronchoalveolar lavage from patients with severe sepsis and major trauma, in the plasma serum of men with chronic arterial occlusion, in patients who suffer from thalassemia major or acute pancreatitis, in the brain of subjects with mild cognitive impairment, and in plasma proteins in patients with juvenile type 1 diabetes.
Ως εκ τούτου, η ακριβής ποσοτικοποίηση της καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών καθίσταται αναγκαία προϋπόθεση για την εκτίμηση της έκτασης της πρωτεϊνικής οξειδωτικής βλάβης. Επιπλέον, η ποσοτικοποίηση των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών παρέχει ένα νέο διαγνωστικό και ενδεχομένως προ-συμπτωματικό βιοδείκτη για ασθένειες του ανθρώπου, καθώς επίσης και για οποιαδήποτε βιολογική δυσλειτουργία που σχετίζεται με την οξειδωτική βλάβη. Επιπλέον, παρέχουν ένα σημαντικό κλινικό εργαλείο για την αξιολόγηση των παρενεργειών των νέων φαρμάκων και τον καθορισμό της κατάλληλης δόσης τους. Therefore, the accurate quantification of protein carbonylation becomes a necessary condition to assess the extent of protein oxidative damage. In addition, quantification of carbonylated proteins provides a novel diagnostic and potentially pro-symptomatic biomarker for human disease, as well as any biological dysfunction associated with oxidative damage. In addition, they provide an important clinical tool for evaluating the side effects of new drugs and determining their appropriate dosage.
Ο πιο διαδεδομένος τρόπος σήμερα για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων είναι η φωτομετρική ποσοτικοποίηση τους. Ωστόσο, οι μέθοδοι φωτομετρικής ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, όπως γίνονται μέχρι τώρα έχουν σοβαρούς περιορισμούς και οδηγούν σε μη επαναλήψιμα και μη αξιόπιστα αποτελέσματα. The most widespread way today for the quantification of protein carbonyl groups is their photometric quantification. However, the methods of photometric quantification of protein carbonyl groups, as done until now, have serious limitations and lead to non-reproducible and unreliable results.
Η φωτομετρική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων τα τελευταία 30 χρόνια πραγματοποιείται με τη χρήση της τυπικής φωτομετρικής ανάλυσης με 2,4 δινιτροφαινυλυδραζίνη (2,4-dinitrophenylhydrazine, εφεξής καλούμενη δοκιμασία stdDNPH), η οποία είναι η βάση πολλών εμπορικών κιτ που είναι διαθέσιμα σήμερα. Η δοκιμασία stdDNPH βασίζεται στην αντίδραση της 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνης (εφεξής καλούμενη DNPH) με τις καρβονυλομάδες μίας κατακρημνισμένης (ιζηματοποιημένης) πρωτεΐνης ενός δείγματος σε pH κοντά στο 0 και θερμοκρασία δωματίου, και τον επακόλουθο σχηματισμό μιας πρωτεϊνικής καρβονυλ-DNPH υδραζόνης (εφεξής καλούμενη υδραζόνη) που απορροφά στα 370 nm. Για την αφαίρεση του εξίσου απορροφούσας (και παρεμποδίζουσας) περίσσειας του αντιδραστηρίου DNPH που δεν έχει αντιδράσει, η δοκιμασία stdDNPH ακολουθεί μία αρκετά περίπλοκη διαδικασία, καθώς περιλαμβάνει δύο βήματα πλύσης με τριχλωροξικό οξύ (εφεξής καλούμενο TCA), που ακολουθούνται από τρία επιπλέον στάδια πλυσίματος με ένα μίγμα οξικού αιθυλεστέρα και αιθανόλης. Τέλος, το προκύπτον πρωτεϊνικό ίζημα μετά την πλύση διαλυτοποιείται σε ουρία ή γουανιδίνη σε όξινο pH (pH 2 κατά προσέγγιση) και οι καρβονυλομάδες του μετρούνται φωτομετρικά στα 370 nm. Photometric quantification of protein carbonyl groups for the past 30 years has been performed using the standard photometric assay with 2,4-dinitrophenylhydrazine (hereafter stdDNPH assay), which is the basis of many commercial kits available today. The stdDNPH assay is based on the reaction of 2,4-dinitrophenylhydrazine (hereafter referred to as DNPH) with the carbonyl groups of a precipitated (precipitated) protein of a sample at pH close to 0 and room temperature, and the subsequent formation of a protein carbonyl-DNPH hydrazone (hereafter referred to as hydrazone) that absorbs at 370 nm. To remove the equally absorbing (and interfering) excess unreacted DNPH reagent, the stdDNPH assay follows a rather complicated procedure, involving two washing steps with trichloroacetic acid (hereafter referred to as TCA), followed by three additional washing steps with a mixture of ethyl acetate and ethanol. Finally, the resulting protein precipitate after washing is solubilized in urea or guanidine at acidic pH (pH 2 approx.) and its carbonyl groups are measured photometrically at 370 nm.
Αξίζει να σημειωθεί ότι η δοκιμασία stdDNPH, που εκτελείται με τη χρήση φασματοφωτομέτρου, διαφοροποιείται από ορισμένες άλλες δοκιμασίες με βάση το DNPH που επίσης χρησιμοποιούν πρωτεΐνες σε διάλυμα (όχι ως ίζημα) σε ποικίλες ποσότητες, συνθήκες αντίδρασης ή χρόνους επώασης, ως προς το ότι χρησιμοποιούν αρκετά πολύπλοκες και χρονοβόρες διαδικασίες για την απομάκρυνση της περίσσειας του αντιδραστηρίου DNPH (όπως χρωματογραφία υψηλής ανάλυσης (HPLC), χρωματογραφία μοριακής διήθησης, ηλεκτροφόρηση), και συγκλίνουν (με εξαίρεση την HPLC, που είναι αυτοτελής και δίνει ποσοτικά αποτελέσματα) στην μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (Western immunoblotting) για την ευαίσθητη αλλά ημι-ποσοτική ανίχνευση της υδραζόνης που παράγεται κατά την αντίδραση (βλέπε Levine et al. 2000, Determination of carbonyl groups in oxidized proteins, pp. 15-24. Methods in Molecular Biology, vol. 99: Stress Response: Methods and Protocols, Editor: Keyse SM). Επιπλέον, αυτές οι τεχνικές δεν μπορούν να προσαρμοστούν σε μαζικούς ελέγχους υψηλής απόδοσης που απαιτούνται για έναν αριθμό εφαρμογών. It is worth noting that the stdDNPH assay, performed using a spectrophotometer, differs from some other DNPH-based assays that also use proteins in solution (not as a precipitate) in varying amounts, reaction conditions, or incubation times, in that they use quite complex and time-consuming procedures to remove excess DNPH reagent (such as high resolution chromatography (HPLC), molecular filtration chromatography, electrophoresis), and converge (with the exception of HPLC, which is self-contained and gives quantitative results) to the method of immunoblotting ( Western immunoblotting) for the sensitive but semi-quantitative detection of hydrazone produced during the reaction (see Levine et al. 2000, Determination of carbonyl groups in oxidized proteins, pp. 15-24. Methods in Molecular Biology, vol. 99: Stress Response: Methods and Protocols, Editor: Keyse SM). In addition, these techniques cannot be adapted to high-throughput mass screening required for a number of applications.
Τα κύρια μειονεκτήματα της ανάλυσης stdDNPH είναι τα εξής: The main disadvantages of the stdDNPH assay are as follows:
Πρώτον, το DNPH (που χρησιμοποιείται συνήθως στα 10 mΜ) στην δοκιμασία stdDNPH αντιδρά με την πρωτεΐνη σε μορφή ιζήματος (χωρίς νουκλεϊκά οξέα, κ.λπ.). Προκειμένου η δοκιμασία να είναι αποτελεσματική η αντίδραση πρέπει να διαρκέσει τουλάχιστον 1 ώρα (60 min). Δεδομένου όμως ότι ο χρόνος αντίδρασης μεταξύ δύο οργανικών μορίων (στην περίπτωση αυτή του DNPH και των καρβονυλομάδων) είναι βέλτιστος όταν και τα δύο είναι σε διάλυμα, ο χρόνος επώασης των 60 λεπτών της δοκιμασίας stdDNPH μπορεί να μην είναι ο βέλτιστος για την αντίδραση του DNPH (που βρίσκεται σε διάλυμα) με όλες τις ιζηματοποιημένες (δηλαδή μη διαλυτοποιημένες) καρβονυλομάδες μέσα στο ίδιο δείγμα ή μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων πρωτεΐνης. First, DNPH (typically used at 10 mM) in the stdDNPH assay reacts with the precipitated protein (without nucleic acids, etc.). For the test to be effective the reaction must last at least 1 hour (60 min). But since the reaction time between two organic molecules (in this case DNPH and carbonyl groups) is optimal when both are in solution, the 60 min incubation time of the stdDNPH assay may not be optimal for the reaction of DNPH (in solution) with all precipitated (i.e., unsolubilized) carbonyl groups within the same sample or between different protein samples.
Δεύτερον, η δοκιμασία stdDNPH περιλαμβάνει πολλά στάδια πλύσης, δηλαδή τα προαναφερθέντα δύο βήματα πλύσης TCA, που ακολουθούνται από τρία επιπλέον στάδια πλυσίματος με οξικό αιθυλεστέρα-αιθανόλη, και αυτό οδηγεί σε μία σημαντική απώλεια της αρχικής πρωτεΐνης. Ο εφευρέτης εκτιμά ότι αυτή η απώλεια είναι μεγαλύτερη από το 50% της αρχικής πρωτεΐνης, και εξηγείται από την παρατήρηση ότι η υψηλή συγκέντρωση DNPH (10 mΜ) που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία stdDNPH μειώνει την αποτελεσματικότητα του σταδίου κατακρήμνισης πρωτεΐνης με TCA κατά ένα 30 - 50%. Κατά συνέπεια, αυτό οδηγεί σε υψηλή απώλεια πρωτεΐνης και εξηγεί γιατί η δοκιμασία stdDNPH πρέπει να εφαρμόζεται σε δείγματα υψηλής συγκέντρωσης πρωτεΐνης. Αυτό με τη σειρά του, οδηγεί σε μειωμένη λειτουργική ευαισθησία της δοκιμασίας. Αυτή η απώλεια απαιτεί την εκ νέου ποσοτικοποίηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη στο δείγμα, αυξάνοντας έτσι τον χρόνο εκτέλεσης της δοκιμασίας και εισάγοντας στατιστική διακύμανση στην τελική μέτρηση. Κατά συνέπεια, η δοκιμασία stdDNPH έχει το σημαντικό μειονέκτημα και περιορισμό ότι απαιτεί πολύ μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης στο δείγμα (> 2 mg), και, ως εκ τούτου, δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε δείγματα με πολύ χαμηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια του βήματος πλύσης με TCA οι πρωτεΐνες που είναι διαλυτές σε οξύ χάνονται και, ως εκ τούτου, δεν λαμβάνονται υπόψη στην τελική μέτρηση. Second, the stdDNPH assay involves several washing steps, namely the aforementioned two TCA washing steps, followed by three additional ethyl acetate-ethanol washing steps, and this results in a significant loss of the original protein. The inventor estimates that this loss is greater than 50% of the original protein, and is explained by the observation that the high concentration of DNPH (10 mM) used in the stdDNPH assay reduces the efficiency of the TCA protein precipitation step by a factor of 30 - 50 %. Consequently, this leads to a high loss of protein and explains why the stdDNPH assay should be applied to samples of high protein concentration. This, in turn, leads to reduced functional sensitivity of the assay. This loss requires requantification of the protein content of the sample, thereby increasing the assay run time and introducing statistical variation to the final measurement. Consequently, the stdDNPH assay has the major drawback and limitation that it requires very large amounts of protein in the sample (> 2 mg), and therefore cannot be applied to samples with very low protein concentration. Additionally, during the TCA washing step acid-soluble proteins are lost and therefore not accounted for in the final count.
Τρίτον, η δοκιμασία stdDNPH δεν έχει ελεγχθεί εκτενώς ως προς την αποτελεσματικότητά της στο να απομακρύνει όλα τα μόρια DNPH που δεν έχουν αντιδράσει, παρόλο που είναι γνωστό ότι ακόμα και ελάχιστα υπολείμματα αυτού του αντιδραστηρίου μπορούν να προκαλέσουν παρεμβολές. Ο εφευρέτης έχει βρει ότι η δοκιμασία stdDNPH δεν μπορεί να απομακρύνει τελείως το ελεύθερο DNPH ακόμη και αν αυξηθεί ο αριθμός των πλύσεων με οξικό αιθυλεστέρα-αιθανόλη. Αυξάνοντας τον αριθμό των πλύσεων αυξάνεται και η απώλεια πρωτεΐνης με κάθε επιπλέον βήμα πλύσης, και αυτό συμβάλλει στην υψηλή στατιστική διακύμανση του προσδιορισμού των καρβονυλομάδων με τη δοκιμασία stdDNPH. Σε σύγκριση με τη διαδικασία του πλυσίματος του ελεύθερου DNPH που χρησιμοποιείται στην παρούσα εφεύρεση, η δοκιμασία stdDNPH οδηγεί σε υπερεκτίμηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων κατά τουλάχιστον 30%. Επομένως, η αναποτελεσματικότητα της δοκιμασίας stdDNPH στο να αφαιρεί εντελώς το ελεύθερο DNPH την καθιστά αναξιόπιστη στην αναπαραγωγή του αποτελέσματος για το ίδιο δείγμα πρωτεΐνης από τον ίδιο ερευνητή και μεταξύ διαφορετικών ερευνητών. Third, the stdDNPH assay has not been extensively tested for its effectiveness in removing all unreacted DNPH molecules, although it is known that even minute residues of this reagent can cause interference. The inventor has found that the stdDNPH assay cannot completely remove free DNPH even if the number of ethyl acetate-ethanol washes is increased. Increasing the number of washes also increases the loss of protein with each additional wash step, and this contributes to the high statistical variation of the determination of carbonyl groups with the stdDNPH assay. Compared to the free DNPH washing procedure used in the present invention, the stdDNPH assay results in an overestimation of protein carbonyl groups by at least 30%. Therefore, the ineffectiveness of the stdDNPH assay to completely remove free DNPH makes it unreliable in reproducing the result for the same protein sample by the same investigator and between different investigators.
Τέταρτον, είναι γνωστό ότι η υδραζόνη που παράγεται και μετράται σε όξινο pH (0 έως 2,3) με την δοκιμασία stdDNPH είναι ασταθής, δεδομένου ότι υδρολύεται (όπως έχει δειχθεί στο Fields R & Dixon ΗΒ. Biochem. J. 1971; Vol 121: pp 587-589). Αυτός ο παράγοντας αστάθειας σε συνδυασμό με την αναποτελεσματική απομάκρυνση του ελεύθερου DNPH αυξάνει περαιτέρω την αναξιοπιστία και τη στατιστική διακύμανση της δοκιμασίας stdDNPH. Fourth, the hydrazone produced and measured at acidic pH (0 to 2.3) by the stdDNPH assay is known to be unstable in that it hydrolyzes (as shown in Fields R & Dixon UK. Biochem. J. 1971; Vol 121 : pp 587-589). This instability factor combined with inefficient removal of free DNPH further increases the unreliability and statistical variation of the stdDNPH assay.
Τέλος, ο προσδιορισμός stdDNPH δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε δείγματα που περιέχουν DNA (i) επειδή αυτό προσδένεται ισχυρά στο αντιδραστήριο DNPH, (ii) λόγω της κατακρήμνισής του (μαζί με το προοδεμένο DNPH) στο όξινο pH της δοκιμασίας stdDNPH, και (iii) λόγω της επακόλουθης επαναδιαλυτοποίησης του ιζήματος που περιέχει DNA (και πρωτεΐνες) στο όξινο ρυθμιστικό διάλυμα ουρίας που χρησιμοποιείται για την διαλυτοποίηση. Αυτό οδηγεί σε αυξημένη απορρόφηση που οφείλεται στην απορρόφηση του DNPH που έχει προσδεθεί στο DNA, η οποία οδηγεί σε υπερεκτίμηση της περιεκτικότητας του δείγματος σε πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες. Έτσι, η δοκιμασία αυτή απαιτεί μια προ-επεξεργασία που να απομακρύνει το DNA του δείγματος, η οποία γίνεται συνήθως με κατακρήμνιση του DNA με θειική στρεπτομυκίνη (εφεξής καλούμενη SS). Ωστόσο, αυτό το βήμα δεν εξαλείφει τελείως τις παρεμβολές από το DNA επειδή η απομάκρυνσή του δεν είναι 100% αποτελεσματική (είναι περίπου 50% αποτελεσματική), και αυτό αυξάνει την υπερεκτίμηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που μετρώνται με τη δοκιμασία stdDNPH. Finally, the stdDNPH assay cannot be applied to samples containing DNA (i) because it binds strongly to the DNPH reagent, (ii) because of its precipitation (along with the precursor DNPH) at the acidic pH of the stdDNPH assay, and (iii) due to the subsequent re-solubilization of the pellet containing DNA (and proteins) in the acidic urea buffer used for solubilization. This leads to an increased absorbance due to the absorption of DNPH bound to DNA, which leads to an overestimation of the protein carbonyl group content of the sample. Thus, this assay requires a pretreatment to remove DNA from the sample, which is usually done by precipitating the DNA with streptomycin sulfate (hereafter referred to as SS). However, this step does not completely eliminate DNA interference because its removal is not 100% efficient (it is about 50% efficient), and this increases the overestimation of protein carbonyl groups measured by the stdDNPH assay.
Συνεπώς, υπάρχει η ανάγκη για μια νέα φωτομετρική δοκιμασία για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που να είναι πιο αποτελεσματική από αυτές που είναι ήδη γνωστές στην τεχνική, με άλλα λόγια Therefore, there is a need for a new photometric assay for the quantification of protein carbonyl groups that is more efficient than those already known in the art, in other words
- Να είναι αποτελεσματική για όλες τις διαφορετικές πρωτεΐνες και να μην περιορίζεται σε πρωτεΐνες σε μορφή ιζήματος, - To be effective for all different proteins and not limited to precipitated proteins,
- Να εφαρμόζεται αποτελεσματικά σε οποιαδήποτε ποσότητα δείγματος πρωτεΐνης, και να μπορεί να εφαρμόζεται ακόμη και σε δείγματα με πολύ χαμηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης, ακόμη και σε 1 μg, ακόμα και παρουσία DNA, - To be effectively applied to any amount of protein sample, and to be able to be applied even to samples with a very low protein concentration, even at 1 µg, even in the presence of DNA,
- Να μπορεί να είναι ακριβής και με πολύ μικρή ή καθόλου στατιστική διακύμανση, - Can be accurate and with very little or no statistical variation,
- Να μην παρουσιάζει την (τουλάχιστον κατά ~30%) υπερεκτίμηση του περιεχομένου σε πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες που είναι εγγενής ατέλεια της δοκιμασίας stdDNPH στο όξινο pH, εκτελώντας την μέτρηση σε ουδέτερο pH με το ίδιο αντιδραστήριο. - Not exhibit the (at least ~30%) overestimation of protein carbonyl group content inherent in the stdDNPH assay at acidic pH by performing the measurement at neutral pH with the same reagent.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ SUMMARY OF THE INVENTION
Αντικείμενο της παρούσας εφεύρεσης είναι να παρέχει νέους φωτομετρικούς προσδιορισμούς και κιτ για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα ή περισσότερα δείγματα. Η παρούσα εφεύρεση περιγράφει μια αποτελεσματική λύση σε όλα τα προβλήματα που αναλύθηκαν παραπάνω, με την παρουσίαση μιας νέας και εφευρετικής φωτομετρικής δοκιμασίας ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, της φωτομετρικής μεθόδου με DNPH σε ουδέτερο pH (εφεξής καλούμενη μέθοδος ntrDNPH). Η δοκιμασία δεν είναι μόνο αποτελεσματική, αλλά είναι επίσης ιδιαίτερα εύκολη στην εκτέλεσή της ακόμα και σε δείγματα με πολύ χαμηλές ποσότητες πρωτεΐνης, και με αντιδραστήρια χαμηλού κόστους και σε μικρούς αριθμούς και ποσότητες. It is an object of the present invention to provide new photometric assays and kits for the quantification of protein carbonyl groups in one or more samples. The present invention describes an effective solution to all the problems analyzed above, by presenting a new and inventive photometric test for the quantification of protein carbonyl groups, the photometric method with DNPH at neutral pH (hereinafter ntrDNPH method). The assay is not only efficient, but also extremely easy to perform even on samples with very low amounts of protein, and with low-cost reagents and in small numbers and quantities.
Σε προτιμώμενες ενσωματώσεις της εφεύρεσης, το δείγμα της πρωτεΐνης υποβάλλεται σε επεξεργασία με έναν αποδιατακτικό παράγοντα, ο οποίος διατηρεί την πρωτεΐνη σε διάλυμα καθ' όλη τη διαδικασία, και στη συνέχεια αντιδρά με το DNPH. Στη συνέχεια, το pH του δείγματος ρυθμίζεται σε μία τιμή εντός της περιοχής από pH 5 έως 7 με την προσθήκη ενός ή περισσοτέρων ρυθμιστικών παραγόντων, το δείγμα πλένεται με έναν ή περισσότερους μη αναμίξιμους με το νερό οργανικούς διαλύτες για την απομάκρυνση του μη αντιδράσαντος ελεύθερου DNPH με την προαιρετική παρουσία ενός ανιονικού απορρυπαντικού που διαλυτοποιεί την πρωτεΐνη. Τέλος, η υδραζόνη που παράγεται κατά την αντίδραση ποσοτικοποιείται φασματοφωτομετρικά. In preferred embodiments of the invention, the protein sample is treated with a denaturing agent, which keeps the protein in solution throughout the process, and then reacted with DNPH. The pH of the sample is then adjusted to a value within the range of pH 5 to 7 by the addition of one or more buffering agents, the sample is washed with one or more water-immiscible organic solvents to remove unreacted free DNPH with the optional presence of an anionic detergent that solubilizes the protein. Finally, the hydrazone produced during the reaction is quantified spectrophotometrically.
Η μέθοδος αυτή προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα, δηλαδή: This method offers several advantages, namely:
Α) Απομακρύνει με 100% αποδοτικότητα το DNPH που δεν αντέδρασε, καθώς αποφεύγει τα αναποτελεσματικά βήματα απομάκρυνσης του DNPH που πραγματοποιούνται στο όξινο pH της δοκιμασίας stdDNPH (-50% αποτελεσματική καταβύθιση της πρωτεΐνης με TCA, και αναποτελεσματική πλύση με οξικό αιθυλεστέρα-αιθανόλη) και προκαλούν παρεμπόδιση της δοκιμασίας κατά 30% (βλέπε συγκρίσεις μεταξύ των δύο δοκιμασιών στο Παράδειγμα 5 και Εικ. 1). Τα βήματα αυτά η ntrDNPH τα αντικαθιστά με μια άλλη πιο αποτελεσματική διαδικασία πλύσης σε ουδέτερο pH. A) It removes unreacted DNPH with 100% efficiency, as it avoids the inefficient DNPH removal steps performed at the acidic pH of the stdDNPH assay (-50% efficient protein precipitation with TCA, and inefficient ethyl acetate-ethanol washing) and inhibit the assay by 30% (see comparisons between the two assays in Example 5 and Fig. 1). ntrDNPH replaces these steps with another more efficient washing process at neutral pH.
Β) Δεν απαιτεί την απομάκρυνση των νουκλεϊκών οξέων που μπορεί να υπάρχουν στο δείγμα της πρωτεΐνης. Αυτό συμβαίνει επειδή τα νουκλεϊκά οξέα κλασματοποιούνται από το διάλυμα κατά την αντίδραση της πρωτεΐνης με DNPH στο όξινο pH του διαλύματος DNPH. Τα νουκλεϊκά οξέα παραμένουν εκτός διαλύματος κατά τη διάρκεια του σταδίου πλύσεως (παρά το γεγονός ότι το pH ανυψώνεται σε σχεδόν ουδέτερες τιμές (pH 5 έως 7) κατά τη διάρκεια του σταδίου πλύσης) και απομακρύνονται ως ίζημα από το δείγμα σε αυτό το στάδιο μετά από φυγοκέντρηση. B) It does not require the removal of nucleic acids that may be present in the protein sample. This is because the nucleic acids are fractionated from the solution upon reaction of the protein with DNPH at the acidic pH of the DNPH solution. Nucleic acids remain out of solution during the washing step (despite the fact that the pH is raised to near neutral values (pH 5 to 7) during the washing step) and are removed as a precipitate from the sample at this step after centrifugation.
Γ) Μετρά την απορρόφηση της υδραζόνης που παράγεται κατά την αντίδραση σε κατάλληλο μήκος κύματος και σε pH που κυμαίνεται από 5 έως ουδέτερο, αντί του όξινου pH που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία stdDNPH. Αυτό προσφέρει ένα διπλό πλεονέκτημα. Πρώτον, διευκολύνει την απομάκρυνση του μη-ειδικά προοδεμένου DNPH από την πρωτεΐνη του δείγματος, διότι σε αυτό το pH το μόριο DNPH δεν είναι πλέον φορτισμένο και μπορεί να πλυθεί από το μίγμα των μη αναμίξιμων με το νερό οργανικών διαλυτών της παρούσας εφεύρεσης. Δεύτερον, έχει ως αποτέλεσμα τη σταθερότητα του προϊόντος της αντίδρασης για τουλάχιστον 2 ημέρες στο σκοτάδι σε ουδέτερο pH (ενώ το ίδιο προϊόν που παράγεται κατά την δοκιμασία stdDNPH είναι ασταθές στο όξινο pH της δοκιμασίας). Έτσι, οι μετρήσεις της απορρόφησης των πρωτεϊνών του δείγματος από τη δοκιμασία ntrDNPH μπορεί να καθυστερήσει για αρκετή ώρα ώστε να προσαρμόζεται ακόμα και σε χρονικά περιορισμένο χρονοδιάγραμμα του ερευνητή. C) It measures the absorbance of the hydrazone produced in the reaction at an appropriate wavelength and at a pH ranging from 5 to neutral, instead of the acidic pH used in the stdDNPH assay. This offers a double advantage. First, it facilitates the removal of non-specifically bound DNPH from the sample protein because at this pH the DNPH molecule is no longer charged and can be washed away by the mixture of water-immiscible organic solvents of the present invention. Second, it results in the stability of the reaction product for at least 2 days in the dark at neutral pH (whereas the same product produced in the stdDNPH assay is unstable at the acidic pH of the assay). Thus, measurements of sample protein absorbance by the ntrDNPH assay can be delayed long enough to accommodate even the researcher's time-constrained schedule.
Δ) Μπορεί να εφαρμοστεί σε δείγματα με ελάχιστη ποσότητα πρωτεΐνης (1 μg), 2000 φορές χαμηλότερη από εκείνη της δοκιμασίας stdDNPH, κάτι το οποίο δίνει μία αθροιστική ευαισθησία της δοκιμασίας ntrDNPH 2600 φορές μεγαλύτερη από εκείνη της δοκιμασίας stdDNPH, όταν συνυπολογίζεται η αναποτελεσματική (κατά τουλάχιστον 30%) απομάκρυνση του ελεύθερου DNPH στην stdDNPH. Αυτή η υψηλή ευαισθησία και ελάχιστη ποσότητα πρωτεΐνης της δοκιμασίας ntrDNPH επεκτείνει την δυνατότητα εφαρμογής της σε οποιοδήποτε βιολογικό δείγμα. D) It can be applied to samples with a minimal amount of protein (1 µg), 2000 times lower than that of the stdDNPH assay, which gives a cumulative sensitivity of the ntrDNPH assay 2600 times greater than that of the stdDNPH assay, when the inefficient (by at least 30%) removal of free DNPH to stdDNPH. This high sensitivity and minimal amount of protein of the ntrDNPH assay extends its applicability to any biological sample.
Ε) Χρησιμοποιεί 10 φορές χαμηλότερη συγκέντρωση του αντιδραστηρίου DNPH σε σύγκριση με την δοκιμασία stdDNPH, και αυτό μειώνει πολύ σημαντικά το κόστος της εμπορικής εφαρμογής της παρούσας εφεύρεσης. E) It uses a 10-fold lower concentration of the DNPH reagent compared to the stdDNPH assay, and this greatly reduces the cost of commercial application of the present invention.
ΣΤ) Εφαρμόζεται σε δείγματα των πρωτεϊνών τόσο σε ίζημα όσο και σε διάλυμα έναντι των ιζημάτων πρωτεΐνης που χρησιμοποιούνται στην δοκιμασία stdDNPH. Αυτό προσφέρει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα: (ί) επεκτείνει την εφαρμογή της μεθόδου με την μέγιστη δυνατή αποτελεσματικότητα για όλα τα είδη των πρωτεϊνών, επειδή στο αντιδραστήριο DNPH δίνεται η δυνατότητα να ασκήσει υψηλότερη δραστικότητα με τις καρβονυλομάδες των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών που βρίσκονται σε διάλυμα έναντι των λιγότερο προσβάσιμων καρβονυλομάδων στο πρωτεϊνικό ίζημα όπως γίνεται με την δοκιμασία stdDNPH, (ii) δεν απαιτείται εκ νέου ποσοτικοποίηση του δείγματος πρωτεΐνης μετά την αντίδραση με το DNPH (όπως απαιτείται από τη δοκιμασία stdDNPH) επειδή η πρωτεΐνη παραμένει διαλυτή και ανακτάται πλήρως κατά την απομάκρυνση της περίσσειας DNPH και της μέτρησης της περιεκτικότητας σε καρβονυλομάδες. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση του χρόνου εκτέλεσης της δοκιμασίας, και εξαλείφει το στατιστικό σφάλμα, αφού δεν απαιτείται εκ νέου προσδιορισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης, και (iii) μειώνει το χρόνο αντίδρασης με το DNPH στα 30 λεπτά (έναντι των τουλάχιστον 60 λεπτών που απαιτούνται με την δοκιμασία stdDNPH). F) Applied to samples of the proteins both in precipitate and in solution against the protein precipitates used in the stdDNPH assay. This offers the following advantages: (i) it extends the application of the method with maximum efficiency for all kinds of proteins, because the DNPH reagent is enabled to exert a higher activity with the carbonyl groups of disordered proteins in solution than with less of accessible carbonyl groups in the protein pellet as done by the stdDNPH assay, (ii) no requantification of the protein sample is required after reaction with DNPH (as required by the stdDNPH assay) because the protein remains soluble and is fully recovered upon removal of the excess DNPH and the measurement of the content of carbonyl groups. This results in a significant reduction in assay run time, and eliminates statistical error, since no re-determination of protein concentration is required, and (iii) reduces the reaction time with DNPH to 30 minutes (compared to at least 60 minutes required by the stdDNPH assay).
Η αποκαλυπτόμενη εφεύρεση παρέχει επίσης μία μέθοδο για την φωτομετρική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε συγκεκριμένα υποκυτταρικά πρωτεϊνικά κλάσματα, όπως το κυτταροπλασματικό/υδατικό, λιπιδικό/μεμβρανικό, και/ή το κλάσμα χρωμοσωμικών πρωτεϊνών (ιστόνες). Η μέθοδος αυτή ξεπερνά τα εγγενή προβλήματα των χρησιμοποιούμενων σήμερα μεθοδολογιών κλασματοποίησης πρωτεϊνών που εστιάζουν στην απομόνωση μόνο του κυπαροπλασματικού πρωτεϊνικού κλάσματος με παραλλαγές της διαδικασίας κατακρήμνισης/πλύσης πρωτεϊνών με τριχλωροξικό οξύ (εφεξής καλούμενο TCA), η οποία, ωστόσο, απομακρύνει το κλάσμα των πρωτεϊνών των διαλυτών σε οξέα (acid soluble proteins) και ως εκ τούτου, οι καρβονυλομάδες τους δεν λαμβάνονται υπόψη. Επιπλέον, οι υπάρχουσες μεθοδολογίες δεν περιλαμβάνουν όλες τυποποιημένα πρωτόκολλα για την αφαίρεση των νουκλεϊκών οξέων που επίσης περιέχουν καρβονυλομάδες, ούτε για την εξουδετέρωση των σουλφενικών ομάδων της κυστεΐνης, που παρεμβάλλονται στην ανάλυση. Σε αντίθεση, η τυποποιημένη μέθοδος κλασματοποίησης πρωτεϊνών η οποία παρουσιάζεται εδώ, απομονώνει πρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών των διαλυτών σε οξέα) με κατακρήμνιση, μέσω προεπεξεργασίας του δείγματος με το απορρυπαντικό δεοξυχολικό νάτριο (εφεξής καλούμενο DOC) σε συνδυασμό με TCA, συνοδευόμενη από εκχύλιση με μίγμα μεθανόλης (εφεξής καλούμενη MeOH) και χλωροφόρμιου (εφεξής καλούμενου CHCI3). Ταυτόχρονα, αφαιρεί από τα πρωτεϊνικά κλάσματα πιθανούς παράγοντες που παρεμποδίζουν την φωτομετρική μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που αποκαλύπτεται στην παρούσα εφεύρεση. The disclosed invention also provides a method for the photometric quantification of protein carbonyl groups in specific subcellular protein fractions, such as the cytoplasmic/aqueous, lipid/membrane, and/or chromosomal protein (histones) fraction. This method overcomes the inherent problems of currently used protein fractionation methodologies that focus on isolating only the cytoplasmic protein fraction with variations of the protein precipitation/washing procedure with trichloroacetic acid (hereafter TCA), which, however, removes the protein fraction of acid soluble proteins and therefore their carbonyl groups are not taken into account. Furthermore, existing methodologies do not all include standardized protocols for removing nucleic acids that also contain carbonyl groups, nor for neutralizing cysteine sulfenic groups, which interfere with analysis. In contrast, the standard protein fractionation method presented here isolates proteins (including acid-soluble proteins) by precipitation, by pretreatment of the sample with the detergent sodium deoxycholate (hereafter DOC) combined with TCA, followed by extraction with mixture of methanol (hereafter MeOH) and chloroform (hereafter CHCl3). At the same time, it removes from the protein fractions possible factors that interfere with the photometric method for the quantitative determination of protein carbonyl groups disclosed in the present invention.
Παρέχονται επίσης κιτ για την εκτέλεση των μεθόδων. Kits for performing the methods are also provided.
Επιπλέον περιγράφονται μέθοδοι για τον προσδιορισμό του επιπέδου κυτταρικής οξείδωσης. Μία μέθοδος περιλαμβάνει: την παροχή ενός δείγματος που περιλαμβάνει ένα κυπαρικό εκχύλισμα, ομογενοποιημένο ιστό ή βιολογικό υγρό, ποσοτικοποίηση της ποσότητας των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο δείγμα, όπως περιγράφεται σε οποιαδήποτε σχετική ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, και σύγκριση της ποσότητας των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο δείγμα προς την ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που υπάρχουν σε ένα πρότυπο δείγμα. In addition, methods for determining the level of cellular oxidation are described. A method includes: providing a sample comprising a cell extract, tissue homogenate, or biological fluid, quantifying the amount of protein carbonyl groups in the sample, as described in any related embodiment of the present invention, and comparing the amount of protein carbonyl groups in the sample to amount of protein carbonyl groups present in a standard sample.
Επίσης περιγράφονται μέθοδοι για την επιλογή υποψήφιων φαρμάκων που ελαπώνουν το επίπεδο οξείδωσης των κυττάρων. Τέτοιες μέθοδοι είναι χρήσιμες, για παράδειγμα, στην αξιολόγηση της ικανότητας ενός νέου φαρμακευτικού προϊόντος να μειώνει το επίπεδο οξείδωσης σε ένα ή περισσότερα κύτταρα που υφίστανται οξειδωτικό στρες ή στην ταυτοποίηση νέων υποψήφιων φαρμάκων για τη θεραπεία των παθολογικών καταστάσεων που προκαλούνται ή επιδεινώνονται από το οξειδωτικό στρες. Μία τέτοια μέθοδος περιλαμβάνει: την επαφή ενός ή περισσοτέρων κυπάρων που έχουν ένα επίπεδο κυπαρικής οξείδωσης με μία ένωση, ποσοτικοποίηση της παρουσίας καρβονυλομάδων όπως περιγράφεται σε οποιαδήποτε από τις σχετικές ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, αξιολογώντας έτσι το επίπεδο οξείδωσης των κυττάρων, και σύγκριση του επιπέδου οξείδωσης των κυττάρων που έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση με το επίπεδο οξείδωσης κυττάρων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση. Μια ελάττωση στο επίπεδο οξείδωσης στα κύτταρα που έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση, σε σύγκριση με το επίπεδο οξείδωσης κυττάρων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση, είναι ενδεικτική της ικανότητας της ένωσης να ελαπώνει το επίπεδο οξείδωσης στα κύτταρα. Also described are methods for selecting drug candidates that decrease the level of cell oxidation. Such methods are useful, for example, in evaluating the ability of a new drug product to reduce the level of oxidation in one or more cells undergoing oxidative stress or in identifying new drug candidates for the treatment of pathological conditions caused or aggravated by oxidative stress. . Such a method includes: contacting one or more cells having a cellular oxidation level with a compound, quantifying the presence of carbonyl groups as described in any of the related embodiments of the present invention, thereby assessing the oxidation level of the cells, and comparing the oxidation level of cells exposed to the compound to the oxidation level of cells not exposed to the compound. A decrease in the level of oxidation in cells that have been contacted with the compound, compared to the level of oxidation in cells that have not been contacted with the compound, is indicative of the ability of the compound to decrease the level of oxidation in the cells.
Ακόμη περαιτέρω οφέλη, πλεονεκτήματα και χρήσεις της εφεύρεσης θα γίνουν προφανείς στους έμπειρους στην τεχνική αυτή από την λεπτομερή περιγραφή που ακολουθεί. Still further benefits, advantages and uses of the invention will become apparent to those skilled in the art from the detailed description that follows.
ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΣΧΕΔΙΩΝ DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Η παρούσα εφεύρεση θα περιγράφει τώρα με αναφορά στο συνοδευτικό σχέδιο στο οποίο: The present invention will now be described with reference to the accompanying drawing in which:
Η Εικ. 1 δείχνει μια συγκριτική αξιολόγηση της ικανότητας των δοκιμασιών stdDNPH και ntrDNPH να μετρούν με ακρίβεια τα επίπεδα της υδραζόνης που παράγεται κατά την αντίδραση. Οι γραμμές σφάλματος ορίζουν το τυπικό σφάλμα (SD). Fig. 1 shows a comparative evaluation of the ability of the stdDNPH and ntrDNPH assays to accurately measure the levels of hydrazone produced during the reaction. Error bars define the standard error (SD).
ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Συνεπώς, η παρούσα εφεύρεση κατευθύνεται σε μεθόδους και κιτ για την ανίχνευση ή/και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα ή περισσότερα δείγματα. Επίσης κατευθύνεται σε μεθόδους και κιτ για τον προσδιορισμό του οξειδωτικού επιπέδου ενός κυττάρου, ιστού ή βιολογικού υγρού, καθώς και για την ταυτοποίηση ενώσεων που μπορούν να μειώσουν το εν λόγω επίπεδο οξείδωσης. Accordingly, the present invention is directed to methods and kits for the detection and/or quantification of protein carbonyl groups in one or more samples. It is also directed to methods and kits for determining the oxidation level of a cell, tissue or biological fluid, as well as for identifying compounds that can reduce said oxidation level.
Σύμφωνα με μία εφαρμογή, παρέχεται μία μέθοδος για την ανίχνευση ή/και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα ή περισσότερα δείγματα που περιέχουν πρωτεΐνη και χρησιμοποιεί την ένωση 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνη (DNPH) για την σήμανση των καρβονυλομάδων, όπου η εν λόγω μέθοδος χαρακτηρίζεται από το ότι το μη αντιδράσαν DNPH απομακρύνεται με πλύση του δείγματος με έναν ή περισσότερους μη αναμίξιμους με το νερό οργανικούς διαλύτες και φυγοκέντρηση. Η φυγοκέντρηση επίσης απομακρύνει τυχόν νουκλεϊκά οξέα που υπήρχαν στο δείγμα της πρωτεΐνης και είχαν κατακρημνιστεί στο όξινο pH του μίγματος αντίδρασης. To pH του δείγματος διατηρείται μέσα στην περιοχή από pH 5 έως 7 καθ' όλη τη διάρκεια της πλύσης. To pH μπορεί να ρυθμίζεται σε μια τιμή εντός της περιοχής από 5 έως 7 με την προσθήκη ενός ή περισσότερων ρυθμιστικών παραγόντων, για την προστασία της υδραζόνης που παράγεται κατά την αντίδραση από όξινη υδρόλυση. Στα κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, ένα ρυθμιστικό διάλυμα Tris pH 5-7, ένα φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5-7, κατά προτίμηση ένα ρυθμιστικό διάλυμα Tris pH 5-7. Η εν λόγω πλύση δεν περιλαμβάνει κάποιο στάδιο κατακρήμνισης της πρωτεΐνης, δηλαδή η πρωτεΐνη στο δείγμα παραμένει σε διάλυμα καθ' όλη το στάδιο πλύσης. According to one embodiment, a method is provided for detecting and/or quantifying protein carbonyl groups in one or more protein-containing samples and using the compound 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) to label the carbonyl groups, wherein said method is characterized in that unreacted DNPH is removed by washing the sample with one or more water-immiscible organic solvents and centrifugation. Centrifugation also removes any nucleic acids that were present in the protein sample and had precipitated in the acidic pH of the reaction mixture. The pH of the sample is maintained within the range of pH 5 to 7 throughout the wash. The pH can be adjusted to a value within the range of 5 to 7 by the addition of one or more buffering agents to protect the hydrazone produced in the reaction from acid hydrolysis. Suitable buffers include, but are not limited to, a Tris buffer pH 5-7, a phosphate buffer pH 5-7, preferably a Tris buffer pH 5-7. Said washing does not include any protein precipitation step, i.e. the protein in the sample remains in solution throughout the washing step.
Το αντιδραστήριο DNPH είναι εμπορικώς διαθέσιμο, όμως μπορεί επίσης να παρασκευαστεί χρησιμοποιώντας κοινές τεχνικές συνθετικής χημείας, για παράδειγμα με την αντίδραση της θειικής υδραζίνης με 2,4-δινιτροχλωροβενζένιο. The DNPH reagent is commercially available, but can also be prepared using common synthetic chemistry techniques, for example by reacting hydrazine sulfate with 2,4-dinitrochlorobenzene.
Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, ο μη αναμίξιμος με το νερό οργανικός διαλύτης επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει το βενζόλιο, τολουόλιο, εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα, οξικό ισοβουτυλεστέρα, οξικό βουτύλιο ή ένα συνδυασμό αυτών. Σε μία περισσότερο προτιμώμενη ενσωμάτωση, ο μη αναμίξιμος με το νερό οργανικός διαλύτης περιλαμβάνει ένα μίγμα οξικού αιθυλεστέρα και εξανίου. Ένα κατάλληλο μίγμα οξικού αιθυλεστέρα και εξανίου είναι, μεταξύ άλλων, ένα μίγμα από πέντε όγκους οξικού αιθυλεστέρα και δύο όγκους εξανίου (5:2 ν:ν). In a preferred embodiment, the water-immiscible organic solvent is selected from the group consisting of benzene, toluene, hexane, ethyl acetate, isobutyl acetate, butyl acetate, or a combination thereof. In a more preferred embodiment, the water-immiscible organic solvent comprises a mixture of ethyl acetate and hexane. A suitable mixture of ethyl acetate and hexane is, among others, a mixture of five volumes of ethyl acetate and two volumes of hexane (5:2 v:v).
Σε μία άλλη ενσωμάτωση, το δείγμα στο στάδιο πλύσεως περιλαμβάνει ένα ανιονικό απορρυπαντικό για την διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών. Το εν λόγω ανιονικό απορρυπαντικό είναι παρόν σε ποσότητα επαρκή ώστε να εμποδίσει την κατακρήμνιση της πρωτεΐνης από το διάλυμα καθ' όλη τη διάρκεια του σταδίου πλύσης. Στα κατάλληλα ανιονικό απορρυπαντικά για την διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών περιλαμβάνονται, αλλά δεν περιορίζονται σε αυτά, το sodium dodecyl sulfate (εφεξής καλούμενο SDS), sodium lauryl sulfate (εφεξής καλούμενο SLS) και το δεοξυχολικό νάτριο, κατά προτίμηση το sodium dodecyl sulfate. In another embodiment, the sample in the washing step includes an anionic detergent to solubilize the proteins. Said anionic detergent is present in an amount sufficient to prevent protein precipitation from solution throughout the washing step. Suitable anionic detergents for solubilizing proteins include, but are not limited to, sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as SDS), sodium lauryl sulfate (hereinafter referred to as SLS) and sodium deoxycholate, preferably sodium dodecyl sulfate.
Σε μια ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, το δείγμα που περιέχει πρωτεΐνη περιλαμβάνει έναν παράγοντα οξειδοαναγωγής (redox) για την εξουδετέρωση των σουλφενικών ομάδων, όταν αυτές είναι παρούσες. Στους κατάλληλους παράγοντες οξειδοαναγωγής περιλαμβάνονται, χωρίς να περιορίζονται σε αυτούς, η διθειοθρεϊτόλη (εφεξής καλούμενη DTT), β-μερκαπτοαιθανόλη, ασκορβικό οξύ και η ανηγμένη γλουταθειόνη, και κατά προτίμηση η διθειοθρεϊτόλη. Ο παράγοντας οξειδοαναγωγής βρίσκεται στο διάλυμα σε ποσότητα επαρκή για την εξουδετέρωση των σουλφενικών ομάδων. Στις περιπτώσεις όπου το επιλεγμένο μέσο οξειδοαναγωγής είναι η διθειοθρεϊτόλη, η αποτελεσματική συγκέντρωση διθειοθρεϊτόλης κυμαίνεται μεταξύ 15 και 50 mΜ, κατά προτίμηση 25 mΜ. In one embodiment of the present invention, the protein-containing sample includes a redox agent to neutralize sulfenic groups, when present. Suitable redox agents include, but are not limited to, dithiothreitol (hereinafter referred to as DTT), β-mercaptoethanol, ascorbic acid and reduced glutathione, and preferably dithiothreitol. The redox agent is present in the solution in an amount sufficient to neutralize the sulfenic groups. In cases where the selected redox agent is dithiothreitol, the effective concentration of dithiothreitol is between 15 and 50 mM, preferably 25 mM.
Σύμφωνα με μία ενσωμάτωση, η σημασμένη υδραζόνη που παράγεται κατά την αντίδραση ανιχνεύεται φασματοφωτομετρικά. Η απορρόφηση της υδραζόνης αυτής μετράται σε ένα μήκος κύματος που κυμαίνεται από 360 nm έως 370 nm, κατά προτίμηση 360 mm. Σε μία περαιτέρω προτιμώμενη ενσωμάτωση, η περιεκτικότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων προσδιορίζεται με τη χρήση του συντελεστή απόσβεσης της απορρόφησης του DNPH. According to one embodiment, the labeled hydrazone produced during the reaction is detected spectrophotometrically. The absorbance of this hydrazone is measured at a wavelength ranging from 360 nm to 370 nm, preferably 360 mm. In a further preferred embodiment, the content of protein carbonyl groups is determined using the absorbance extinction coefficient of DNPH.
Οι μέθοδοι της παρούσας εφεύρεσης μπορούν να προσαρμοστούν σε μια μορφή στερεού υποστρώματος. Στα κατάλληλα στερεά υποστρώματα περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, τα σφαιρίδια, μαγνητικά σφαιρίδια, λεπτά υμένια (thin films), νανοσωλήνες άνθρακα, μικροσωλήνες, φίλτρα, πήγματα (gel), πλάκες (plates), μικροπλάκες (microplates) και οι ηλεκτρονικοί αισθητήρες (sensor chips). The methods of the present invention can be adapted to a solid substrate form. Suitable solid substrates include, without limitation, beads, magnetic beads, thin films, carbon nanotubes, microtubes, filters, gels, plates, microplates, and sensor chips. ).
Σε μία ενσωμάτωση, η ανίχνευση και /ή ποσοτικοποίηση της σημασμένης υδραζόνης που παράγεται κατά την αντίδραση πραγματοποιείται φωτομετρικώς με την χρήση ενός κοινού φασματοφωτόμετρου. Σε μία άλλη ενσωμάτωση, χρησιμοποιείται ένα φασματοφωτόμετρο μικροπλακών για την ταυτόχρονη μέτρηση πολλαπλών δειγμάτων. In one embodiment, detection and/or quantification of the labeled hydrazone produced during the reaction is performed photometrically using a common spectrophotometer. In another embodiment, a microplate spectrophotometer is used to measure multiple samples simultaneously.
Η ποσότητα της πρωτεΐνης που υπάρχει στο δείγμα μπορεί να είναι τόσο χαμηλή όσο 1 μg και τόσο υψηλή όσο 1,500 μg. Ο χρόνος αντίδρασης του DNPH με τις καρβονυλομάδες της αποδιαταγμένης πρωτεΐνης στο δείγμα μπορεί να ποικίλει σε μεγάλο βαθμό χωρίς να μειώνεται η ευαισθησία της μεθόδου. Ο προτιμώμενος χρόνος αντίδρασης DNPH με τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες του δείγματος είναι για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Εναλλακτικά, και προκειμένου να μειωθεί ο χρόνος αντίδρασης, το δείγμα μπορεί να επωαστεί με DNPH στους 37°C. The amount of protein present in the sample can be as low as 1 µg and as high as 1,500 µg. The reaction time of DNPH with the carbonyl groups of the disordered protein in the sample can be varied widely without reducing the sensitivity of the method. The preferred reaction time of DNPH with the protein carbonyl groups of the sample is for 30 minutes at room temperature in the dark. Alternatively, and in order to reduce the reaction time, the sample can be incubated with DNPH at 37°C.
Στα κατάλληλα δείγματα που περιέχουν πρωτεΐνη για την παρούσα εφεύρεση περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, δείγμα καθαρής (απομονωμένης) πρωτεΐνης, ακατέργαστο κυτταρικό εκχύλισμα, δείγμα ομογενοποιημένου ιστού, βιολογικό υγρό ή υποκυτταρικό κλάσμα πρωτεΐνης. Το εν λόγω βιολογικό δείγμα μπορεί να επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει, χωρίς να περιορίζεται σε, σάλιο, πλήρες αίμα, πλάσμα, ορό, υγρό δακρύων, υδατοειδές υγρό, υαλοειδές υγρό του οφθαλμού, λεμφικό υγρό, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, αρθρικό υγρό, ούρα, πτύελα, σπέρμα, βλέννη, κολπικό έκπλυμα, αμνιακό υγρό, αδενικό υγρό, ιδρώτα και μυελό των οστών. Το υποκυτταρικό κλάσμα μπορεί να περιλαμβάνει το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών, το κυτταροπλασματικό πρωτεϊνικό κλάσμα, το μεμβρανικό κλάσμα, ή έναν συνδυασμό αυτών. Το αντιοξειδωτικό λιπίδιο butylhydroxyanisol (εφεξής καλούμενο ΒΗΑ) μπορεί να προστεθεί στο δείγμα πριν από την επεξεργασία για την αποφευχθεί η τεχνητή οξείδωση της απομονωμένης πρωτεΐνης. Suitable protein-containing samples for the present invention include, without limitation, a pure (isolated) protein sample, crude cell extract, tissue homogenate sample, biological fluid, or subcellular protein fraction. Said biological sample may be selected from the group including, but not limited to, saliva, whole blood, plasma, serum, tear fluid, aqueous humor, vitreous fluid of the eye, lymphatic fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine, sputum, semen, mucus, vaginal lavage, amniotic fluid, glandular fluid, sweat and bone marrow. The subcellular fraction may include the acid-soluble fraction of histones, the cytoplasmic protein fraction, the membrane fraction, or a combination thereof. The antioxidant lipid butylhydroxyanisol (hereafter referred to as BHA) can be added to the sample before processing to avoid artificial oxidation of the isolated protein.
Το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών μπορεί να απομονωθεί από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού με οποιοδήποτε κατάλληλη τεχνική, συμπεριλαμβανομένης οποιοσδήποτε τεχνικής η οποία είναι ή μπορεί να γίνει γνωστή στο μέλλον σε ένα άτομο έμπειρο στην τέχνη. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών απομονώνεται από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού με την τεχνική της κατακρήμνισης με θειική στρεπτομυκίνη. Σε αυτή την ενσωμάτωση, η προσθήκη θειικής στρεπτομυκίνης στο δείγμα πρωτεΐνης έχει ως αποτέλεσμα την κατακρήμνιση του διαλυτού σε οξύ κλάσματος των ιστονών και οποιωνδήποτε νουκλεϊκών οξέων που υπάρχουν στα κύτταρα. Μετά τη φυγοκέντρηση, το προκύπτον ίζημα επαναδιαλύεται σε ένα αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα, προκειμένου να επωαστεί με 25 mM DTT για να εξουδετερωθούν τυχόν παρεμβάλλουσες σουλφενικές ομάδες. Όπως χρησιμοποιείται σε αυτή την εφεύρεση, ο όρος "αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα” αναφέρεται σε ένα διάλυμα που κατασκευάζεται από μία ασθενή βάση και από ένα από τα άλατά της, και το οποίο διάλυμα έχει μία τιμή pH που κυμαίνεται μεταξύ 8 και 10. Στα κατάλληλα αλκαλικά ρυθμιστικά διαλύματα περιλαμβάνονται, χωρίς να περιορίζονται σε, το ρυθμιστικό διάλυμα βορικού νατρίου, ρυθμιστικό διάλυμα υδροξειδίου του αμμωνίου-χλωριούχου αμμωνίου, ρυθμιστικό διάλυμα γλυκίνης/υδροξείδιου του νατρίου (εφεξής καλούμενο NaOH), ρυθμιστικό διάλυμα διαιθυλαμίνης/HCI, κατά προτίμηση το ρυθμιστικό διάλυμα βορικού νατρίου. Στη συνέχεια γίνεται επεξεργασία του διαλυτοποιήματος με ένα ισχυρό οξύ σε μία αποτελεσματική συγκέντρωση που κατακρημνίζει τα νουκλεϊκά οξέα. Στα κατάλληλα ισχυρά οξέα περιλαμβάνονται ανάμεσα σε άλλα το υδροχλωρικό οξύ (HCI), υδροϊωδικό οξύ (HI), υδροβρωμικό οξύ (ΗΒΓ), υπερχλωρικό οξύ (HCIO4), χλωρικό οξύ (HCIΟ3), νιτρικό οξύ (ΗΝΟ3) και θειικό οξύ (H2SO4), κατά προτίμηση το H2SO4. Τα νουκλεϊκά οξέα μπορούν στη συνέχεια να απομακρυνθούν ως ίζημα μετά από φυγοκέντρηση. Το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών (που υπάρχει στο απαλλαγμένο από νουκλεϊκά οξέα υπερκείμενο) ανακτάται στη συνέχεια μετά από επώαση με DOC και TCA. Αλλα μικρά μόρια μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθούν αντί του DOC. Άλλα κατάλληλα μόρια περιλαμβάνουν μικρά ανιονικά ή κατιονικά μόρια, όπως τα ανιονικά χολικά άλατα. Η προσθήκη του DOC και του TCA ιδανικά εκτελείται διαδοχικά, δηλαδή, πρώτα προστίθεται το DOC, ακολουθούμενο από μια σύντομη επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, μετά προστίθεται το TCA και ακολουθεί μια σύντομη επώαση σε ένα λουτρό πάγου-νερού. Στη συνέχεια, το δείγμα φυγοκεντρείται και η πρωτεΐνη ανακτάται ως ίζημα. Η προσθήκη του DΟC είναι απαραίτητη όταν είναι επιθυμητή η ποσοτική κατακρήμνιση πρωτεϊνών από δείγματα με χαμηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ή από δείγματα με άγνωστη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη. Για δείγματα με υψηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης (δηλαδή 500 μg ανά ml), το στάδιο της προσθήκης του DOC μπορεί να παραληφθεί και το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών ανακτάται ως ίζημα μετά από μια σύντομη επώαση σε ένα λουτρό πάγου-ύδατος με TCA μόνο και φυγοκέντρηση. The acid-soluble fraction of histones can be isolated from a total cell extract or homogenized tissue sample by any suitable technique, including any technique that is or may become known in the future to a person skilled in the art. In a preferred embodiment, the acid-soluble fraction of histones is isolated from a total cell extract or homogenized tissue sample by the streptomycin sulfate precipitation technique. In this embodiment, the addition of streptomycin sulfate to the protein sample results in the precipitation of the acid-soluble fraction of the histones and any nucleic acids present in the cells. After centrifugation, the resulting pellet is redissolved in an alkaline buffer to be incubated with 25 mM DTT to neutralize any interfering sulfenic groups. As used in this invention, the term "alkaline buffer" refers to a solution made of a weak base and one of its salts, and which solution has a pH value ranging between 8 and 10. In suitable alkaline buffers include, but are not limited to, sodium borate buffer, ammonium hydroxide-ammonium chloride buffer, glycine/sodium hydroxide buffer (hereafter referred to as NaOH), diethylamine/HCl buffer, preferably sodium borate buffer The solution is then treated with a strong acid at an effective concentration that precipitates the nucleic acids. Suitable strong acids include but are not limited to hydrochloric acid (HCI), hydroiodic acid (HI), hydrobromic acid (HBG), perchloric acid (HCIO4), chloric acid (HCIO3), nitric acid (HNO3) and sulfuric acid (H2SO4), preferably H2SO4. uric acids can then be removed as a precipitate after centrifugation. The acid-soluble fraction of histones (present in the nucleic acid-free supernatant) is then recovered after incubation with DOC and TCA. Other small molecules may also be used instead of DOC. Other suitable molecules include small anionic or cationic molecules, such as anionic bile salts. The addition of DOC and TCA is ideally performed sequentially, i.e., DOC is added first, followed by a short incubation at room temperature, then TCA is added, followed by a short incubation in an ice-water bath. The sample is then centrifuged and the protein is recovered as a precipitate. The addition of DOC is necessary when quantitative protein precipitation is desired from samples with low protein content or from samples with unknown protein content. For samples with a high protein concentration (ie, 500 μg per ml), the DOC addition step can be omitted and the acid-soluble fraction of histones recovered as a pellet after a brief incubation in an ice-water bath with TCA alone and centrifugation .
Το κυτταροπλασματικό πρωτεϊνικό κλάσμα μπορεί να απομονωθεί από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού με οποιοδήποτε κατάλληλη τεχνική, συμπεριλαμβανομένης οποιοσδήποτε τεχνικής η οποία είναι ή μπορεί να γίνει γνωστή στο μέλλον σε ένα άτομο έμπειρο στην τέχνη. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση το κυτταροπλασματικό πρωτεϊνικό κλάσμα απομονώνεται από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού διά της κατακρήμνισης με DOC και TCA, μετά την απομάκρυνση του διαλυτού σε οξύ κλάσματος των ιστονών και οποιωνδήποτε νουκλεϊκών οξέων που υπάρχουν στο δείγμα (όπου η εν λόγω απομάκρυνση επιτυγχάνεται με θειική στρεπτομυκίνη όπως περιγράφεται εδώ ή με οποιαδήποτε άλλη κατάλληλη μέθοδο). Αλλα μικρά μόρια μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθούν αντί του DOC. Άλλα κατάλληλα μόρια περιλαμβάνουν μικρά ανιονικά ή κατιονικά μόρια, όπως τα ανιονικά χολικά άλατα. Η προσθήκη του DOC και του TCA ιδανικά εκτελείται διαδοχικά, δηλαδή, πρώτα προστίθεται το DOC, ακολουθούμενο από μια σύντομο επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, μετά προστίθεται το TCA και ακολουθεί μια σύντομη επώαση σε ένα λουτρό πάγου-νερού. Στη συνέχεια, το δείγμα φυγοκεντρείται και η πρωτεΐνη ανακτάται ως ίζημα. Η προσθήκη του DOC είναι απαραίτητη όταν είναι επιθυμητή η ποσοτική κατακρήμνιση πρωτεϊνών από δείγματα με χαμηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ή από δείγματα με άγνωστη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη. Για δείγματα με υψηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης (δηλαδή 500 μg ανά ml), το στάδιο της προσθήκης του DOC μπορεί να παραληφθεί και το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών ανακτάται ως ίζημα μετά από μια σύντομη επώαση σε ένα λουτρό πάγου-ύδατος με TCA μόνο και φυγοκέντρηση. The cytoplasmic protein fraction can be isolated from a total cell extract or homogenized tissue sample by any suitable technique, including any technique which is or may become known in the future to a person skilled in the art. In a preferred embodiment the cytoplasmic protein fraction is isolated from a total cell extract or tissue homogenate sample by DOC and TCA precipitation, after removal of the acid-soluble fraction of histones and any nucleic acids present in the sample (where said removal is achieved with streptomycin sulfate as described herein or by any other suitable method). Other small molecules may also be used instead of DOC. Other suitable molecules include small anionic or cationic molecules, such as anionic bile salts. The addition of DOC and TCA is ideally performed sequentially, i.e., DOC is added first, followed by a short incubation at room temperature, then TCA is added, followed by a short incubation in an ice-water bath. The sample is then centrifuged and the protein is recovered as a precipitate. The addition of DOC is necessary when quantitative protein precipitation is desired from samples with low protein content or from samples with unknown protein content. For samples with a high protein concentration (ie, 500 μg per ml), the DOC addition step can be omitted and the acid-soluble fraction of histones recovered as a pellet after a brief incubation in an ice-water bath with TCA alone and centrifugation .
Το μεμβρανικό πρωτεϊνικό κλάσμα μπορεί να απομονωθεί από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού με οποιοδήποτε κατάλληλη τεχνική, συμπεριλαμβανομένης οποιοσδήποτε τεχνικής η οποία είναι ή μπορεί να γίνει γνωστή στο μέλλον σε ένα άτομο έμπειρο στην τέχνη. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση το μεμβρανικό πρωτεϊνικό κλάσμα απομονώνεται από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού μετά την απομάκρυνση του διαλυτού σε οξύ κλάσματος των ιστονών και των οποιωνδήποτε νουκλεϊκών οξέων που υπάρχουν στο δείγμα (όπου η εν λόγω απομάκρυνση επιτυγχάνεται με θειική στρεπτομυκίνη όπως περιγράφεται εδώ ή με οποιαδήποτε άλλη κατάλληλη μέθοδο) και την απομάκρυνση του κυτταροπλασματικού πρωτεϊνικού κλάσματος (όπως περιγράφεται εδώ ή με οποιαδήποτε άλλη κατάλληλη μέθοδο), μέσω εκχύλισης με μεθανόλη και χλωροφόρμιο. Το κυτταροπλασματικό πρωτεϊνικό κλάσμα σχηματίζει ένα ίζημα στη μεσαία ζώνη μεταξύ της άνω υδατικής φάσης και της κατώτερης οργανικής φάσης, και μπορεί να απομονωθεί και να καθαριστεί περαιτέρω όπως περιγράφεται εδώ ή χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε κατάλληλη τεχνική που είναι γνωστή στην τέχνη. The membrane protein fraction can be isolated from a total cell extract or homogenized tissue sample by any suitable technique, including any technique which is or may become known in the future to a person skilled in the art. In a preferred embodiment the membrane protein fraction is isolated from a total cell extract or tissue homogenate sample after removal of the acid-soluble fraction of histones and any nucleic acids present in the sample (where said removal is accomplished with streptomycin sulfate as described herein or by any other suitable method) and removing the cytoplasmic protein fraction (as described herein or by any other suitable method), by extraction with methanol and chloroform. The cytoplasmic protein fraction forms a precipitate in the middle zone between the upper aqueous phase and the lower organic phase, and can be isolated and further purified as described herein or using any suitable technique known in the art.
Οι μέθοδοι που περιγράφονται στην παρούσα εφεύρεση έχουν πολλές εφαρμογές στον βιοϊατρικό και κτηνιατρικό τομέα, καθώς και στη βιομηχανία τροφίμων και γεωργίας. The methods described in the present invention have many applications in the biomedical and veterinary fields, as well as in the food and agricultural industries.
Σε μία ενσωμάτωση, παρέχεται μία μέθοδος για τον προσδιορισμό του επιπέδου οξείδωσης ενός κυττάρου, ιστού ή βιολογικού υγρού, προκειμένου να εκτιμηθεί εάν το κύτταρο, ο ιστός ή το βιολογικό υγρό υφίσταται οξειδωτικό στρες. Η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει το βήμα της ανίχνευσης ή/και του ποσοτικού προσδιορισμού των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων όπως περιγράφεται στην παρούσα εφεύρεση, όπου το δείγμα που περιέχει πρωτεΐνη περιλαμβάνει ένα κυτταρικό εκχύλισμα, ένα υποκυτταρικό κλάσμα πρωτεΐνης ή ένα δείγμα ομογενοποιημένου ιστού. Η ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο εν λόγω δείγμα μπορεί στη συνέχεια να συγκριθεί με την ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που υπάρχουν σε ένα πρότυπο δείγμα. Ένα κατάλληλο πρότυπο δείγμα μπορεί να είναι, χωρίς δεν περιορίζεται σε, ένα κυτταρικό εκχύλισμα ή ένα δείγμα ομογενοποιημένου ιστού που δεν έχει εκτεθεί σε οξειδωτικό στρες. Μία ποσότητα πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων μεγαλύτερη από εκείνη που υπάρχει στο πρότυπο δείγμα είναι ενδεικτική της παρουσίας οξειδωτικού στρες στο κύπαρο ή τον ιστό. Η ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο εξεταζόμενο δείγμα μπορεί επίσης να συγκριθεί με την ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που υπάρχουν σε ένα θετικό δείγμα ελέγχου. Στα κατάλληλα θετικά δείγματα ελέγχου περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, ένα κυτταρικό εκχύλισμα, ένα δείγμα ομογενοποιημένου ιστού ή ένα βιολογικό υγρό που έχει εκτεθεί σε έναν ισχυρό οξειδωτικό παράγοντα, όπως, για παράδειγμα, το υπεροξείδιο του υδρογόνου. In one embodiment, a method is provided for determining the oxidation level of a cell, tissue or biological fluid in order to assess whether the cell, tissue or biological fluid is undergoing oxidative stress. Said method includes the step of detecting and/or quantifying protein carbonyl groups as described in the present invention, wherein the protein-containing sample comprises a cell extract, a subcellular protein fraction, or a tissue homogenate sample. The amount of protein carbonyl groups in said sample can then be compared to the amount of protein carbonyl groups present in a standard sample. A suitable reference sample may be, but is not limited to, a cell extract or homogenized tissue sample that has not been exposed to oxidative stress. An amount of protein carbonyl groups greater than that present in the standard sample is indicative of the presence of oxidative stress in the cell or tissue. The amount of protein carbonyl groups in the test sample can also be compared to the amount of protein carbonyl groups present in a positive control sample. Suitable positive control samples include, without limitation, a cell extract, a tissue homogenate sample, or a biological fluid that has been exposed to a strong oxidizing agent, such as, for example, hydrogen peroxide.
Επίσης παρέχεται μία μέθοδος για την επιλογή ενώσεων που ελαττώνουν το επίπεδο οξείδωσης ενός κυττάρου, όπου η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει την επαφή ενός ή περισσοτέρων κυττάρων τα οποία έχουν ένα επίπεδο κυτταρικής οξείδωσης με μία ένωση, ποσοτικοποίηση της παρουσίας πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων όπως περιγράφεται σε οποιαδήποτε από τις σχετικές ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, αξιολογώντας έτσι το επίπεδο οξείδωσης των κυττάρων, και σύγκριση του επιπέδου οξείδωσης των κυττάρων που έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση με το επίπεδο οξείδωσης κυττάρων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση. Μια ελάττωση στο επίπεδο οξείδωσης στα κύτταρα που έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση, σε σύγκριση με το επίπεδο οξείδωσης κυπάρων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση, είναι ενδεικτική της ικανότητας της ένωσης να ελαττώνει το επίπεδο οξείδωσης στα κύτταρα. Η εν λόγω ένωση μπορεί να περιλαμβάνει μία μεμονωμένη ένωση, ένα μίγμα ενώσεων, ή μια βιβλιοθήκη ενώσεων. Μία βιβλιοθήκη ενώσεων μπορεί να περιλαμβάνει υδατάνθρακες, μονοσακχαρίτες, ολιγοσακχαρίτες, πολυσακχαρίτες, αμινοξέα, πεπτίδια, ολιγοπεπτίδια, πολυπεπτίδια, πρωτεΐνες, νουκλεοζίτες, νουκλεοτίδια, ολιγονουκλεοτίδια, πολυνουκλεοτίδια, λιπίδια, γλυκοπεπτίδια, γλυκοπρωτεΐνες, πρωτεογλυκάνες, φυσικές ενώσεις, συνθετικά ανάλογα ή παράγωγα αυτών, και τα παρόμοια. Also provided is a method for selecting compounds that reduce the oxidation level of a cell, said method comprising contacting one or more cells having a cellular oxidation level with a compound, quantifying the presence of protein carbonyl groups as described in any of related embodiments of the present invention, thereby assessing the oxidation level of the cells, and comparing the oxidation level of cells that have been contacted with the compound to the oxidation level of cells that have not been contacted with the compound. A decrease in the level of oxidation in cells contacted with the compound, compared to the level of oxidation in cells not contacted with the compound, is indicative of the ability of the compound to reduce the level of oxidation in the cells. Said compound may comprise a single compound, a mixture of compounds, or a library of compounds. A library of compounds may include carbohydrates, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, amino acids, peptides, oligopeptides, polypeptides, proteins, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, lipids, glycopeptides, glycoproteins, proteoglycans, natural compounds, synthetic analogs or derivatives thereof, and the like.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης κιτ για την εκτέλεση των μεθόδων που αποκαλύπτονται εδώ. Σε μία ενσωμάτωση, παρέχεται ένα κιτ για τη φωτομετρική ανίχνευση ή/και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα δείγμα, όπου το εν λόγω κιτ περιλαμβάνει α) το αντιδραστήριο DNPH που παρέχεται είτε ως στερεό είτε διαλυμένο σε έναν κατάλληλο υδατικό διαλύτη, β) ένα διάλυμα διαλυτοποίησης πρωτεΐνης που περιλαμβάνει μία ισχυρή βάση και έναν παράγοντα αποδιάταξης πρωτεϊνών, και γ) έναν ή περισσότερους μη αναμίξιμους με το νερό οργανικούς διαλύτες. Ο προτιμώμενος υδατικός διαλύτης για το DNPH είναι ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει ένα ισχυρό οξύ όπως HCI, HI, HBr, HCIO4, HCIO3, ΗΝΟ3ή H2SΟ4, κατά προτίμηση HCI ή H2SO4. Μία κατάλληλη ισχυρή βάση είναι NaOH, KOH, LiOH, RbOH, CsOH, κατά προτίμηση NaOH. Ο παράγοντας αποδιάταξης πρωτεϊνών μπορεί να επιλέγεται από μία ομάδα που περιλαμβάνει, αλλά δεν περιορίζεται σε, ουρία και υδροχλωρική γουανιδίνη, κατά προτίμηση ουρία. Ο ένας ή περισσότεροι μη αναμίξιμοι με το νερό οργανικούς διαλύτες επιλέγονται από την ομάδα που περιλαμβάνει, χωρίς να περιορίζεται σε, βενζόλιο, τολουόλιο, εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα, οξικό ισοβουτυλεστέρα, οξικό βουτύλιο ή ένα συνδυασμό αυτών. The present invention also provides kits for performing the methods disclosed herein. In one embodiment, a kit is provided for the photometric detection and/or quantification of protein carbonyl groups in a sample, wherein said kit comprises a) the DNPH reagent provided either as a solid or dissolved in a suitable aqueous solvent, b) a protein solubilizing solution comprising a strong base and a protein disrupting agent, and c) one or more water-immiscible organic solvents. The preferred aqueous solvent for DNPH is an aqueous solution containing a strong acid such as HCl, HI, HBr, HCIO 4 , HCIO 3 , HNO 3 or H 2 SO 4 , preferably HCl or H 2 SO 4 . A suitable strong base is NaOH, KOH, LiOH, RbOH, CsOH, preferably NaOH. The proteolytic agent may be selected from a group including, but not limited to, urea and guanidine hydrochloride, preferably urea. The one or more water-immiscible organic solvents are selected from the group including, but not limited to, benzene, toluene, hexane, ethyl acetate, isobutyl acetate, butyl acetate, or a combination thereof.
Σε μία προτιμώμενη πραγματοποίηση, ο ένας ή περισσότεροι μη αναμίξιμοι με το νερό οργανικοί διαλύτες περιλαμβάνουν οξικό αιθυλεστέρα και εξάνιο (που παρέχονται είτε ως ένα μείγμα είτε ως μεμονωμένα διαλύματα). In a preferred embodiment, the one or more water-immiscible organic solvents include ethyl acetate and hexane (provided either as a mixture or as individual solutions).
Σε μία άλλη ενσωμάτωση το κιτ περιλαμβάνει περαιτέρω έναν ή περισσότερους ρυθμιστικούς παράγοντες που διατηρούν το pH εντός του εύρους από 5 έως 7. Στους κατάλληλους ρυθμιστικούς παράγοντες περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, ένα Tris/φωσφορικό/κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5-7, ένα Tris ρυθμιστικό διάλυμα pH 5-7, ένα φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5-7, ένα φωσφορικό/κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5-7, ένα ρυθμιστικό διάλυμα υδροχλωρικής τριαιθανολαμίνης/NaOH pH 6,8 έως 7, κατά προτίμηση ένα Tris/φωσφορικό/κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5-7. In another embodiment the kit further comprises one or more buffering agents that maintain the pH within the range of 5 to 7. Suitable buffering agents include, but are not limited to, a Tris/phosphate/citrate buffer pH 5-7, a Tris buffer solution pH 5-7, a phosphate buffer pH 5-7, a phosphate/citrate buffer pH 5-7, a triethanolamine hydrochloride/NaOH buffer pH 6.8 to 7, preferably a Tris/phosphate/citrate buffer pH 5-7.
Σε μία άλλη ακόμη ενσωμάτωση το κιτ περιλαμβάνει ένα διάλυμα ενός απορρυπαντικού για την διαλυτοποίηση πρωτεϊνών. Στα κατάλληλα ανιονικά απορρυπαντικά για την διαλυτοποίηση πρωτεϊνών περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, το SDS, SLS και το δεοξυχολικό νάτριο, κατά προτίμηση το SDS. In yet another embodiment the kit includes a solution of a detergent for solubilizing proteins. Suitable anionic detergents for solubilizing proteins include, but are not limited to, SDS, SLS, and sodium deoxycholate, preferably SDS.
Σε ακόμη άλλη ενσωμάτωση το κιτ μπορεί περαιτέρω να περιλαμβάνει ένα φυλλάδιο οδηγιών. In yet another embodiment the kit may further include an instruction booklet.
Τα κιτ της παρούσας εφεύρεσης μπορούν να προσαρμοστούν για χρήση είτε σε κοινό φασματοφωτόμετρο ή σε φασματοφωτόμετρο μικροπλακών ή σε άλλες μορφές στερεού υποστρώματος. Στα κατάλληλα στερεά υποστρώματα περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, τα σφαιρίδια, μαγνητικά σφαιρίδια, λεπτά υμένια (thin films), νανοσωλήνες άνθρακα, μικροσωλήνες, φίλτρα, πήγματα (gel), πλάκες (plates), μικροπλάκες (microplates) και οι ηλεκτρονικοί αισθητήρες (sensor chips). The kits of the present invention can be adapted for use in either a common spectrophotometer or a microplate spectrophotometer or other forms of solid support. Suitable solid substrates include, without limitation, beads, magnetic beads, thin films, carbon nanotubes, microtubes, filters, gels, plates, microplates, and sensor chips. ).
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ EXAMPLES
Κατωτέρω γίνεται πιο λεπτομερής περιγραφή της παρούσας εφεύρεσης με αναφορά σε παραδείγματα. Θα γίνει προφανές σε ένα άτομο που έχει συνήθη εμπειρία στην τεχνική ότι αυτά τα παραδείγματα χρησιμοποιούνται μόνο για επεξηγηματικούς σκοπούς και δεν πρέπει να θεωρηθούν ότι περιορίζουν ή ότι αλλάζουν το πεδίο εφαρμογής της παρούσας εφεύρεσης. Below is a more detailed description of the present invention with reference to examples. It will be apparent to a person of ordinary skill in the art that these examples are used for illustrative purposes only and should not be construed as limiting or altering the scope of the present invention.
Παράδειγμα 1 Example 1
Προετοιμασία του κλάσματος των ιστονών για την δοκιμασία ntrDNPH Preparation of the histone fraction for the ntrDNPH assay
Διαυγή δείγματα κυττάρων ή ομογενοποιημένου ιστού (σε ένα χαμηλής ιοντικής ισχύος ρυθμιστικό διάλυμα με ουδέτερο pH, όπως 50 mM φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, pH 7,0), επωάστηκαν σε 1% SS για 30 λεπτά σε λουτρό πάγου-ύδατος, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση σε 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Το προκύπτον ίζημα (που περιλαμβάνει DNA και χρωμοσωμικές πρωτεΐνες) πλένεται με 1% SS. Το υπερκείμενο που προκύπτει μπορεί να υποστεί περαιτέρω επεξεργασία, όπως εξηγείται στο Παράδειγμα 2, ώστε να απομονωθεί το κυπαροπλασματικό/υδατικό πρωτεϊνικό κλάσμα του δείγματος, ή όπως στο παράδειγμα 2 [για την απομόνωση του κυτταροπλασματικού/υδατικού κλάσματος και του λιπιδικού/μεμβρανικού πρωτεϊνικού κλάσματος ξεχωριστά ή ως ένα μίγμα (βλέπε σημείωση στο Παράδειγμα 2)]. Clear cell or tissue homogenate samples (in a low ionic strength buffer with a neutral pH, such as 50 mM phosphate buffer, pH 7.0), were incubated in 1% SS for 30 min in an ice-water bath, followed by centrifugation in 16,000 g for 10 min at 4°C. The resulting pellet (comprising DNA and chromosomal proteins) is washed with 1% SS. The resulting supernatant can be further processed as explained in Example 2 to isolate the cytoplasmic/aqueous protein fraction of the sample, or as in example 2 [to isolate the cytoplasmic/aqueous fraction and the lipid/membrane protein fraction separately or as a mixture (see note to Example 2)].
Το ίζημα που περιέχει DNA και χρωμοσωμική πρωτεΐνη επαναδιαλυτοποιείται/ διασπείρεται σε 50 mM ρυθμιστικού διαλύματος βορικού νατρίου (pH 9), που περιέχει 25 mM DTT (για την εξουδετέρωση τυχόν παρεμβαλόμενων σουλφενικών ομάδων), και επωάζεται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι χρωμοσωμικές πρωτεΐνες (ιστόνες) που υπάρχουν στο προκύπτον εναιώρημα DTT-πρωτεΐνης, απομονώνονται ως ακολούθως: Το εναιώρημα DTT-πρωτεΐνης επωάζεται σε 0,2 Μ H2SΟ4για 30 λεπτά σε λουτρό πάγου-ύδατος, και φυγοκεντρείται στα 16.000 g για 10 min στους 4°C. Το προκύπτον ίζημα που περιέχει το DNA απορρίπτεται και οι διαλυτές σε οξύ ιστόνες στο προκύπτον υπερκείμενο επωάζονται σε 0,02% DOC για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια κατακρημνίζονται με 33% TCA (μετά από επώαση για 30 λεπτά σε λουτρό πάγου-νερού λουτρό) και φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. The pellet containing DNA and chromosomal protein is redissolved/dispersed in 50 mM sodium borate buffer (pH 9), containing 25 mM DTT (to neutralize any interfering sulfenic groups), and incubated for 30 min at room temperature. Chromosomal proteins (histones) present in the resulting DTT-protein suspension are isolated as follows: The DTT-protein suspension is incubated in 0.2 M H2SO4 for 30 min in an ice-water bath, and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4° C. The resulting pellet containing the DNA is discarded, and the acid-soluble histones in the resulting supernatant are incubated in 0.02% DOC for 10 min at room temperature. They are then precipitated with 33% TCA (after incubation for 30 min in an ice-water bath) and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C.
Το ίζημα των ιστονών πλένεται στη συνέχεια μία φορά με 33% παγωμένο TCA (σε 0.134 Μ H2SO4), και φυγοκεντρείται στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Το ίζημα στη συνέχεια πλένεται τρεις φορές με 100% ακετόνη (παγωμένη στους -20°C), όπου κάθε πλύση ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Στη συνέχεια, η οργανική φάση της ακετόνης από την τρίτη πλύση απορρίπτεται, και το ίζημα των ιστονών ξηραίνεται. Για τη δοκιμασία ntrDNPH, το ίζημα επαναιωρείται σε έναν ελάχιστο όγκο 50 mΜ NaOH που περιέχει 4 Μ ουρία. The histone pellet is then washed once with 33% ice-cold TCA (in 0.134 M H2SO4), and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C. The pellet is then washed three times with 100% acetone (frozen at -20°C), where each wash is followed by centrifugation at 16,000 g for 10 min at 4°C. The acetone organic phase from the third wash is then discarded, and the histone precipitate is dried. For the ntrDNPH assay, the pellet is resuspended in a minimum volume of 50 mM NaOH containing 4 M urea.
Παοάδεινυα 2 Problem 2
Απομόνωση του κυτταροπλασματικού/υδατικού και μεμβρανικού πρωτεϊνικού κλάσματος Isolation of the cytoplasmic/aqueous and membrane protein fraction
Για την απομόνωση του κυτταροπλασματικού/υδατικού και μεμβρανικού πρωτεϊνικού κλάσματος που υπάρχει στο υπερκείμενο που προκύπτει στο Παράδειγμα 1 μετά την επώαση με SS (ή στον ορό του αίματος ή το πλάσμα, ή οποιαδήποτε άλλο βιολογικό υγρό που έχει υποστεί επεξεργασία με SS), το υπερκείμενο επωάζεται σε 0,02% DOC για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια σε 10% TCA σε ένα λουτρό πάγουνερού για 20 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση σε 16000 g για 10 λεπτά στους 4°C συλλέγεται το προκύπτον ακατέργαστο ίζημα που περιέχει το κυτταροπλασματικό/υδατικό πρωτεϊνικό κλάσμα. To isolate the cytoplasmic/aqueous and membrane protein fraction present in the supernatant obtained in Example 1 after incubation with SS (or in blood serum or plasma, or any other biological fluid treated with SS), the supernatant incubated in 0.02% DOC for 10 min at room temperature, then in 10% TCA in an ice-water bath for 20 min. After centrifugation at 16000 g for 10 min at 4°C the resulting crude pellet containing the cytoplasmic/aqueous protein fraction is collected.
Το υπερκείμενο περιέχει λιπίδια και λιπίδια/μεμβρανικές πρωτεΐνες. Οι μεμβράνες δεν διαλυτοποιούνται σε 0,02% DOC, καθώς το αντιδραστήριο αυτό χρησιμοποιείται σε συγκέντρωση πολύ μικρότερη από την κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση, και μαζί με το γεγονός ότι οι ενσωματωμένες μεμβρανικές πρωτεΐνες ως ιδιαίτερα υδρόφοβες είναι θαμμένες μέσα στην λιπιδική διπλοστοιβάδα, δεν είναι προσβάσιμες στο TCA και δεν καθιζάνουν. Το υπερκείμενο στη συνέχεια εκχυλίζεται με έναν ίσο όγκο CHCI3:MeOH (2:1 ν/ν), μια επεξεργασία που προκαλεί απολιπιδίωση, διαλυτοποίηση των μεμβρανών και απελευθέρωση των πρωτεϊνών τους. Στη συνέχεια η υδατική ανώτερη φάση (μαζί με τη μεσαία στοιβάδα λιπιδίων/μεμβρανικών πρωτεϊνών) επανεκχυλίζεται με 2⁄3 του όγκου χλωροφόρμιο και η μεσαία στοιβάδα λιπιδίων/μεμβρανικών πρωτεϊνών συλλέγεται. The supernatant contains lipids and lipids/membrane proteins. Membranes are not solubilized in 0.02% DOC, as this reagent is used at a concentration much lower than the critical micellar concentration, and together with the fact that the integral membrane proteins being highly hydrophobic are buried within the lipid bilayer, they are not accessible to the TCA and do not precipitate. The supernatant is then extracted with an equal volume of CHCl3:MeOH (2:1 v/v), a treatment that causes delipidation, solubilization of the membranes and release of their proteins. The aqueous upper phase (along with the lipid/membrane protein midlayer) is then back-extracted with 2⁄3 volume chloroform, and the lipid/membrane protein midlayer is collected.
Σημείωση: Εάν η παραπάνω κατακρήμνιση της πρωτεΐνης με DOC-TCA και η εκχύλιση των λιπιδίων/μεμβρανικών πρωτεϊνών με χλωροφόρμιο συνδυαστούν σε ένα μόνο στάδιο, το προκύπτον πρωτεϊνικό ίζημα θα είναι ένα μίγμα του κυτταροπλασματικού/υδατικού και του μεμβρανικού πρωτεϊνικού κλάσματος. Αυτή η διαδικασία μπορεί να ακολουθηθεί σε περίπτωση που δεν υπάρχει πειραματική ανάγκη να απομονωθούν αυτά τα πρωτεϊνικό κλάσματα για χωριστή ανάλυση. Note: If the above DOC-TCA protein precipitation and chloroform extraction of lipids/membrane proteins are combined in a single step, the resulting protein pellet will be a mixture of the cytoplasmic/aqueous and membrane protein fractions. This procedure can be followed when there is no experimental need to isolate these protein fractions for separate analysis.
Το προκύπτον ίζημα λιπιδίων/μεμβρανικών πρωτεϊνών και το ήδη συλλεχθέν κυτταροπλασματικό/ υδατικό πρωτεϊνικό ίζημα πλένονται το καθένα μία φορά με παγωμένο 10% TCA (με στροβιλισμό και φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C). Στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές με 100% ακετόνη (παγωμένη στους -20°C), όπου κάθε πλύση διευκολύνεται με μηχανική διασπορά, και φυγοκεντρούνται στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4ºC. Η περίσσεια ακετόνης στα πρωτεϊνικά ιζήματα απομακρύνεται με απορροφητικό χαρτί. The resulting lipid/membrane protein pellet and the previously collected cytoplasmic/aqueous protein pellet are each washed once with ice-cold 10% TCA (by vortexing and centrifugation at 16,000 g for 10 min at 4°C). They are then washed three times with 100% acetone (frozen at -20°C), where each wash is facilitated by mechanical dispersion, and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C. Excess acetone in the protein precipitates is removed with absorbent paper.
Το λιπιδικό/μεμβρανικό και το κυτταροπλασματικό/υδατικό πρωτεϊνικό ίζημα που προκύπτουν στο Παράδειγμα 2 ρυθμίζονται σε 64 ιπΜ ρυθμιστικού διαλύματος βορικού νατρίου (pH 9) και σε 25 mM DTT, και επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, επωάζονται σε 0,02% DOC για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια σε 10% TCA σε ένα λουτρό πάγου-νερού για 20 λεπτά, και φυγοκεντρούνται στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Τα προκύπτοντα πρωτεϊνικά ιζήματα πλένονται μια φορά με παγωμένο 10% TCA, φυγοκεντρούνται στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C, και στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές με 100% ακετόνη (παγωμένη στους -20°C), όπου κάθε πλύση ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Στη συνέχεια, η οργανική φάση της ακετόνης από την τρίτη πλύση απορρίπτεται, τα ιζήματα ξηραίνονται και διαλυτοποιούνται για άμεση χρήση με την δοκιμασία ntrDNPH. Εναλλακτικά, τα ξηρά ιζήματα μπορούν να φυλαχθούν για μεταγενέστερη χρήση στους -80°C για τουλάχιστον ένα μήνα. Για τη δοκιμασία ntrDNPH, τα ιζήματα επαναιωρούνται το καθένα σε έναν ελάχιστο όγκο 50 mM NaOH που περιέχει 4 Μ ουρία. Τα πρωτεϊνικά ιζήματα από τα δείγματα λιπώδους ιστού (βλέπε Παράδειγμα 3) μπορεί να μην διαλυτοποιηθούν πλήρως στα 50 mM NaOH/4 Μ ουρία, λόγω της παρουσίας των λιπιδίων/μεμβρανικών (υδρόφοβων) πρωτεϊνών. Τα ιζήματα αυτά μπορούν να απομονωθούν περαιτέρω μετά από πλύση με νερό και διαλυτοποίηση σε 50 mM NaOH/4 Μ ουρία που περιέχει 50 έως 200 mM SDS. The lipid/membrane and cytoplasmic/aqueous protein pellet resulting in Example 2 is adjusted to 64 mM sodium borate buffer (pH 9) and 25 mM DTT, and incubated for 30 minutes at room temperature. They are then incubated in 0.02% DOC for 30 min at room temperature, then in 10% TCA in an ice-water bath for 20 min, and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C. The resulting protein pellets are washed once with ice-cold 10% TCA, centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C, and then washed three times with 100% acetone (ice-cold at -20°C), where each wash is followed by centrifugation at 16,000 g for 10 min at 4°C. The acetone organic phase from the third wash is then discarded, the precipitates are dried and solubilized for immediate use with the ntrDNPH assay. Alternatively, dried sediments can be stored for later use at -80°C for at least one month. For the ntrDNPH assay, the pellets are each resuspended in a minimal volume of 50 mM NaOH containing 4 M urea. Protein precipitates from adipose tissue samples (see Example 3) may not be completely solubilized in 50 mM NaOH/4 M urea due to the presence of lipids/membrane (hydrophobic) proteins. These precipitates can be further isolated after washing with water and solubilization in 50 mM NaOH/4 M urea containing 50 to 200 mM SDS.
Παράδειγμα 3 Example 3
Προετοιμασία του λιπώδους ιστού για την δοκιμασία ntrDNPH Preparation of adipose tissue for the ntrDNPH assay
Ανθρώπινος λιπώδης ιστός ομογενοποιείται σε 3,5 όγκους 10 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος pH 7,0 (ή σε άλλο ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλής ιονικής ισχύος ή ακόμη και σε ddH2Ο). Ο ομογενοποιημένος λιπώδης ιστός δεν φυγοκεντρείται (και το DNA του δεν κατακρημνίζεται με επεξεργασία σε SS), αν προορίζεται να αναλυθεί με τη δοκιμασία ntrDNPH. Στη συνέχεια επωάζεται σε 10% TCA και εκχυλίζεται με ίσο όγκο CHCΙ3:MeOH (2:1) για να απομονωθούν, με φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 5 λεπτά στους 4°C, τα ακόλουθα κλάσματα: (i) το λιπιδικό κλάσμα, που εκχυλίζεται στην κάτω οργανική φάση του CHCI3και συνδυάζεται με μια δεύτερη φάση CHCI3από μια δεύτερη εκχύλιση με 1,5 όγκο δείγματος CHCI3. Το υγρό ίζημα ξηραίνεται εν κενώ μέχρι να επιτευχθεί ένα σταθερό βάρος το οποίο καταγράφεται, και στη συνέχεια το ίζημα αποθηκεύεται στους -20°C για περαιτέρω ανάλυση, (ii) Η μεσαία ζώνη που περιέχει το συνολικό πρωτεϊνικό κλάσμα, το οποίο πλένεται με TCA/ακετόνη και επωάζεται με DTT όπως στο Παράδειγμα 2. Human adipose tissue is homogenized in 3.5 volumes of 10 mM phosphate buffer pH 7.0 (or other low ionic strength buffer or even ddH 2 O). The adipose tissue homogenate is not centrifuged (and its DNA is not precipitated by treatment in SS) if it is to be analyzed by the ntrDNPH assay. It is then incubated in 10% TCA and extracted with an equal volume of CHCl3:MeOH (2:1) to isolate, by centrifugation at 16,000 g for 5 min at 4°C, the following fractions: (i) the lipid fraction, extracted in the bottom organic phase of CHCl3 and combined with a second CHCl3 phase from a second extraction with 1.5 sample volume of CHCl3. The liquid pellet is vacuum dried until a constant weight is reached which is recorded, and then the pellet is stored at -20°C for further analysis, (ii) The middle zone containing the total protein fraction, which is washed with TCA/ acetone and incubated with DTT as in Example 2.
Παράδειγμα 4 Example 4
Προετοιμασία των δειγμάτων πρωτεΐνης για τη δοκιμασία ntrDNPH Preparation of protein samples for the ntrDNPH assay
Όταν το δείγμα πρωτεΐνης περιλαμβάνει ένα ίζημα από τα Παραδείγματα 1, 2, ή 3 που επαναδιαλυτοποιείται σε 50 mM NaOH/4 Μ ουρία, το δείγμα πρωτεΐνης είναι έτοιμο προς ανάλυση με την δοκιμασία ntrDNPH. Όταν το δείγμα πρωτεΐνης περιλαμβάνει μία καθαρισμένη πρωτεΐνη, ένα ακατέργαστο ολικό κυτταρικό εκχύλισμα, δείγμα ομογενοποιημένου ιστού ή βιολογικού υγρού, το δείγμα πρώτα φέρεται σε μια τελική συγκέντρωση 50 mM NaOH/4 Μ ουρία. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες και επειδή η δοκιμασία ntrDNPH μπορεί να αναλύσει δείγματα πρωτεΐνης σε συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο τα 1-2,5 μg, πρέπει να χρησιμοποιηθούν εξαιρετικά ευαίσθητες διαδικασίες για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης στα εν λόγω δείγματα. Τέτοιες μέθοδοι έχουν εφευρεθεί από τον ίδιο εφευρέτη (βλέπε αναφορά: Georgiou CD et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 2008; Vol 391, pp. 391-403, και την τροποποιημένη εκδοχή της: Grintzalis Κ et al., Analytical Biochemistry 2015; Vol 480, pp. 28-30). Η αρχή των δύο αυτών μεθόδων στηρίζεται στην αποτελεσματική πρόσδεση της ιοντικά ουδέτερης μορφής του αντιδραστηρίου Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) (που σχηματίζεται σε pH 0,4) στις πρωτεΐνες (με συνδυασμό υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και ετεροπολικών δεσμών με βασικά αμινοξέα), αντί των όξινων μορφών CBB που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες εκδοχές της μεθόδου. When the protein sample includes a precipitate from Examples 1, 2, or 3 that is redissolved in 50 mM NaOH/4 M urea, the protein sample is ready for analysis by the ntrDNPH assay. When the protein sample comprises a purified protein, a crude total cell extract, homogenized tissue sample, or biological fluid, the sample is first brought to a final concentration of 50 mM NaOH/4 M urea. To quantify protein content, and because the ntrDNPH assay can analyze protein samples at a concentration as low as 1-2.5 µg, highly sensitive procedures must be used to determine the protein in said samples. Such methods have been invented by the same inventor (see reference: Georgiou CD et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 2008; Vol 391, pp. 391-403, and its modified version: Grintzalis K et al., Analytical Biochemistry 2015; Vol 480, pp. 28-30). The principle of these two methods is based on the effective binding of the ionically neutral form of the reagent Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) (formed at pH 0.4) to proteins (by a combination of hydrophobic interactions and heteropolar bonds with basic amino acids), instead of the acid forms of CBB used in previous versions of the method.
Παράδειγμα 5 Example 5
Διαδικασία για την δοκιμασία ntrDNPH Procedure for the ntrDNPH assay
Για την προετοιμασία του μείγματος ανάλυσης του δείγματος (εφεξής καλούμενο S), λαμβάνεται μία ποσότητα δείγματος πρωτεΐνης (τόσο χαμηλά όσο 1 μg και τόσο υψηλή όσο 1.500 μg) από το στοκ δείγματος πρωτεΐνης που είχε αρχικά διαλυθεί σε 50 mΜ NaOH/4 Μ ουρία, και αναμιγνύεται με DNPH (σε τελική συγκέντρωση που κυμαίνεται από 1 έως 2,6 mM), ουρία (σε τελική συγκέντρωση που κυμαίνεται από 3,33 Μ έως 4,17 Μ) και 0,67 Μ HCI. Για την παρασκευή του τυφλού δείγματος της δοκιμασίας (εφεξής καλούμενο SB), η ίδια ακριβώς ποσότητα δείγματος πρωτεΐνης αναμιγνύεται μόνο με τα αντιδραστήρια ουρίας και HCI, και παραλείπεται το αντιδραστήριο DNPH. Για την παρασκευή του τυφλού δείγματος του αντιδραστηρίου DNPH (εφεξής καλούμενο RB), το δείγμα πρωτεΐνης παραλείπεται από το προαναφερθέν μίγμα αντιδραστηρίων, και αντικαθίσταται από NaOH και Ουρία, διατηρώντας παράλληλα τα αντιδραστήρια DNPH και HCI. Για την παρασκευή του αντιδραστηρίου μηδενισμού του φασματοφωτόμετρου (εφεξής καλούμενο RZ), το δείγμα πρωτεΐνης παραλείπεται από το προαναφερθέν μίγμα αντιδραστηρίων, και αντικαθίσταται από NaOH και Ουρία, διατηρώντας παράλληλα το αντιδραστήριο HCI. Στη συνέχεια, τα προκύπτοντα μίγματα S, SB, RB και RZ επωάζονται για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Τυχόν νουκλεϊκά οξέα που υπάρχουν στο δείγμα της πρωτεϊνής κατακρημνίζονται κατά την διάρκεια αυτού του βήματος στο όξινο pH του μίγματος αντίδρασης. To prepare the sample assay mixture (hereafter referred to as S), an amount of protein sample (as low as 1 μg and as high as 1,500 μg) is taken from the protein sample stock initially dissolved in 50 mM NaOH/4 M urea, and mixed with DNPH (at a final concentration ranging from 1 to 2.6 mM), urea (at a final concentration ranging from 3.33 M to 4.17 M), and 0.67 M HCl. To prepare the assay blank (hereafter referred to as SB), the exact same amount of protein sample is mixed with only the urea and HCl reagents, and the DNPH reagent is omitted. To prepare the DNPH reagent blank (hereafter referred to as RB), the protein sample is omitted from the aforementioned reagent mixture, and replaced by NaOH and Urea, while retaining the DNPH and HCI reagents. To prepare the spectrophotometer zeroing reagent (hereafter referred to as RZ), the protein sample is omitted from the aforementioned reagent mixture, and replaced by NaOH and Urea, while retaining the HCI reagent. The resulting mixtures of S, SB, RB and RZ are then incubated for 30 min in the dark at room temperature. Any nucleic acids present in the protein sample are precipitated during this step at the acidic pH of the reaction mixture.
Έπειτα, τα μίγματα S, SB, RB και RZ φέρονται σε τελική συγκέντρωση 0.32 Μ Tris/15 mM SDS/οξικό οξύ, σε ένα τελικό εύρος pH από 6,5 έως 7,0. Το εύρος τελικής συγκέντρωσης που εφαρμόζεται για το οξικό οξύ μπορεί να είναι από 0,3 Μ έως 0,45 Μ, και απαιτεί κατάλληλη προσαρμογή στην τελική συγκέντρωση του αντιδραστηρίου Tris για τη διατήρηση του pH του διαλύματος κατά τον τελικό ποσοτικό προσδιορισμό εντός της περιοχής από 6,5 έως 7,0. The S, SB, RB, and RZ mixtures are then brought to a final concentration of 0.32 M Tris/15 mM SDS/acetic acid, in a final pH range of 6.5 to 7.0. The final concentration range applicable for acetic acid can be from 0.3 M to 0.45 M, and requires appropriate adjustment of the final concentration of Tris reagent to maintain the pH of the solution during the final quantification within the range of 6.5 to 7.0.
Το μη αντιδρών (ελεύθερο) DNPH και κάθε πρόσμιξη του αντιδραστηρίου που απορροφά στα 360 nm στα μίγματα των S, SB, RB και RZ απομακρύνονται με τρεις πλύσεις με ένα ίσο όγκο οξικού αιθυλεστέρα-εξανίου (5:2 ν:ν), με περιδίνηση και επακόλουθη φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και το κάτω διαυγές υδατικό κλάσμα συλλέγεται. Η φυγοκέντρηση αυτή απομακρύνει και τα κατακρημνισμένα νουκλεϊκά οξέα που τυχόν υπήρχαν στα μίγματα S και SB. Unreacted (free) DNPH and any admixture of reagent absorbing at 360 nm in the mixtures of S, SB, RB, and RZ are removed by washing three times with an equal volume of ethyl acetate-hexane (5:2 v:v), by vortexing and subsequent centrifugation at 16,000 g for 3 min at room temperature, and the lower clear aqueous fraction collected. This centrifugation also removes the precipitated nucleic acids that may have been present in the S and SB mixtures.
Τέλος, η απορρόφηση (εφεξής καλούμενη Α) του πλυμένου υδατικού κλάσματος S (εφεξής καλούμενη As) μετράται στα 360 nm και διορθώνεται για την Α των πλυμένων υδατικών κλασμάτων SB και RB (εφεξής καλούμενες ASBκαι ARB, αντίστοιχα), έχοντας προηγουμένως μηδενίσει το φασματοφωτόμετρο με την απορρόφηση του υδατικού κλάσματος RZ. Η καθαρή απορρόφηση του προκύπτοντος υδατικού κλάσματος S (netAs = As- ASB- ARB) μετατρέπεται σε nmoles καρβονυλομάδων ανά mg πρωτεΐνης, με τη χρήση του συντελεστή μοριακής απόσβεσης του DNPH που είναι 22,000 Μ<-1>cm<-1>στα 360 nm, και της προκαθορισμένης συγκέντρωσης του αρχικού πρωτεϊνικού δείγματος. Finally, the absorbance (hereafter A) of the washed aqueous fraction S (hereafter As) is measured at 360 nm and corrected for the A of the washed aqueous fractions SB and RB (hereafter ASB and ARB, respectively), having previously zeroed the spectrophotometer with the absorption of the aqueous fraction RZ. The net absorbance of the resulting aqueous fraction S (netAs = As- ASB- ARB) is converted to nmoles of carbonyl groups per mg of protein, using the molar extinction coefficient of DNPH which is 22,000 M<-1>cm<-1> at 360 nm , and the predetermined concentration of the original protein sample.
Παράδειγμα 6 Example 6
Συγκριτική αξιολόγηση της ικανότητας των δοκιμασιών stdDNPH και ntrDNPH να μετρούν με ακρίβεια την υδραζόνη που παράγεται κατά την αντίδραση Comparative evaluation of the ability of stdDNPH and ntrDNPH assays to accurately measure hydrazone produced during the reaction
Η υδραζόνη που σχηματίζεται κατά την αντίδραση του DNPH με την τεχνητά οξειδωμένη πρωτεΐνη ελέγχου BSA (εφεξής καλούμενη ox-BSA), μετράται στα 370 και 360 nm, αντίστοιχα, και εκφράζεται ως nmoles καρβονυλομάδων ανά mg ox-BSA μετά την απομάκρυνση του παρεμποδίζοντος μη αντιδράσαντος DNPH από τα αντίστοιχα διαλύματα των δύο δοκιμασιών. Η Εικ. 1 δείχνει τα δεδομένα από τα συνήθως χρησιμοποιούμενα με την δοκιμασία stdDNPH τρία στάδια πλύσεως με αιθανόλη:οξικό αιθυλεστέρα 1:1 ν/ν (μετά από δύο βήματα κατακρήμνισης της πρωτεΐνης με TCA) σε όξινο pH, και επίσης πρόσθετα δεδομένα μετά την αύξηση του αριθμού τους σε έξι. Η Εικ. 1 συγκρίνει αυτά τα δεδομένα με εκείνα που ελήφθησαν με την δοκιμασία ntrDNPH με την εφαρμογή ίσου αριθμού βημάτων πλύσης (με οξικό αιθυλεστέρα:εξάνιο 5:2 ν:ν) σε ουδέτερο pH. Επιπλέον, η Εικ. 1 δείχνει στοιχεία (βλέπε γκρι καμπύλη) επί της πρωτεΐνης ιζήματος που προκύπτει από το τρίτο στάδιο πλύσης της δοκιμασίας stdDNPH, τα οποία ελήφθησαν μετά τη πλύση αυτού του ιζήματος σύμφωνα με το πρωτόκολλο της δοκιμασίας ntrDNPH (χρησιμοποιώντας τέσσερα βήματα πλύσης με οξικό αιθυλεστέρα :εξάνιο). The hydrazone formed upon the reaction of DNPH with the artificially oxidized control protein BSA (hereafter referred to as ox-BSA) is measured at 370 and 360 nm, respectively, and expressed as nmoles of carbonyl groups per mg of ox-BSA after removal of interfering unreacted DNPH from the respective solutions of the two tests. Fig. 1 shows the data from the three washing steps commonly used with the stdDNPH assay with 1:1 v/v ethanol:ethyl acetate (after two TCA protein precipitation steps) at acidic pH, and also additional data after increasing their number to six. Fig. 1 compares these data with those obtained with the ntrDNPH assay by applying an equal number of washing steps (with ethyl acetate:hexane 5:2 v:v) at neutral pH. In addition, Fig. 1 shows data (see gray curve) on the precipitate protein resulting from the third washing step of the stdDNPH assay, obtained after washing this precipitate according to the ntrDNPH assay protocol (using four washing steps with ethyl acetate :hexane).
Εν κατακλείδι, όταν το πρωτεϊνικό ίζημα που λαμβάνεται μετά την τρίτη πλύση (με ΕtOΗ:οξικό αιθυλεστέρα) της δοκιμασίας stdDNPH, ακολούθως πλένεται μόνο μία φορά με οξικό αιθυλεστέρα:εξάνιο (που χρησιμοποιείται από τη διαδικασία πλύσης της δοκιμασίας ntrDNPH), υπάρχει μια μείωση περίπου 30% (καλύτερη απόδοση πλύσης) στο επίπεδο των καρβονυλομάδων στο δείγμα (που περικλείεται από το οβάλ σχήμα στην Εικ. 1). Δύο πρόσθετα βήματα πλύσης απαιτούνται από την δοκιμασία ntrDNPH για την πλήρη απομάκρυνση του μη αντιδράσαντος DNPH από το διάλυμα πλύσεως του DNPH. Οι γραμμές σφάλματος στην Εικ. 1 παριστάνουν την τυπική απόκλιση (SD). In conclusion, when the protein pellet obtained after the third wash (with EtOH:ethyl acetate) of the stdDNPH assay is then washed only once with ethyl acetate:hexane (used by the wash procedure of the ntrDNPH assay), there is a reduction of approx. 30% (best washing performance) at the level of carbonyl groups in the sample (enclosed by the oval shape in Fig. 1). Two additional washing steps are required by the ntrDNPH assay to completely remove unreacted DNPH from the DNPH wash solution. Error bars in Fig. 1 represent standard deviation (SD).
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20160100568A GR20160100568A (en) | 2016-11-04 | 2016-11-04 | Method for the photometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20160100568A GR20160100568A (en) | 2016-11-04 | 2016-11-04 | Method for the photometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR20160100568A true GR20160100568A (en) | 2018-08-29 |
Family
ID=59078100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20160100568A GR20160100568A (en) | 2016-11-04 | 2016-11-04 | Method for the photometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| GR (1) | GR20160100568A (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006039456A1 (en) * | 2004-09-29 | 2006-04-13 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Isotope labeled dinitrophenylhydrazines and methods for use |
-
2016
- 2016-11-04 GR GR20160100568A patent/GR20160100568A/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006039456A1 (en) * | 2004-09-29 | 2006-04-13 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Isotope labeled dinitrophenylhydrazines and methods for use |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
|---|
| "METHODS IN ENZYMOLOGY", vol. 186, 1 January 1990, ACADEMIC PRESS, US, ISSN: 0076-6879, article RODNEY L. LEVINE, GARLAND DONITA, OLIVER CYNTHIA N., AMICI ADOLFO, CLIMENT ISABEL, LENZ ANKE-G., AHN BONG-WHAN, SHALTIEL SHMUEL, S: "[49] Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins", pages: 464 - 478, XP055392904, DOI: 10.1016/0076-6879(90)86141-H * |
| DATABASE MEDLINE [online] US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US; 1 September 2012 (2012-09-01), ZAITSEVA O V ET AL: "[Modification of spectrophotometric method for determination of protein carbonyl groups].", XP002772534 * |
| KEYSE, STEPHEN M. (ED.): "Stress response : methods and protocols IN: Methods in molecular biology; ISSN 1064-3745; Vol. 99", vol. 99, 1 January 2000, HUMANA PRESS, US, ISBN: 0-89603-611-1, article LEVINE R L; WEHR N; WILLIAMS J A; STADTMAN E R; SHACTER E: "Determination of carbonyl groups in oxidized proteins", pages: 15 - 24, XP009195043, DOI: 10.1385/1-59259-054-3:15 * |
| KRONBAUER MAIKEL; METZ VINICIA GARZELA; ROVERSI KARINE; DIAS VERONICA TIRONI; DE DAVID ANTONIAZZI CAREN TATIANE; DA SILVA BARCELOS: "Influence of magnesium supplementation on movement side effects related to typical antipsychotic treatment in rats", BEHAVIOURAL BRAIN RESEARCH., ELSEVIER, AMSTERDAM., NL, vol. 320, 2 November 2016 (2016-11-02), NL, pages 400 - 411, XP029882728, ISSN: 0166-4328, DOI: 10.1016/j.bbr.2016.10.049 * |
| LEVINE R L ET AL: "Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins.", METHODS IN ENZYMOLOGY, ACADEMIC PRESS, US, vol. 233, 1 January 1994 (1994-01-01), US, pages 346 - 357, XP002772532, ISSN: 0076-6879, DOI: 10.1016/S0076-6879(94)33040-9 * |
| LUO SHEN ET AL: "Protein carbonylation: avoiding pitfalls in the 2,4-dinitrophenylhydrazine assay.", REDOX REPORT : COMMUNICATIONS IN FREE RADICAL RESEARCH 2009, vol. 14, no. 4, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 159 - 166, XP002772535, ISSN: 1743-2928, DOI: 10.1179/135100009X392601 * |
| MESQUITA CRISTINA S.; OLIVEIRA RAQUEL; BENTO F�TIMA; GERALDO DULCE; RODRIGUES JO�O V.; MARCOS JO�O C.: "Simplified 2,4-dinitrophenylhydrazine spectrophotometric assay for quantification of carbonyls in oxidized proteins", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 458, 1 January 1900 (1900-01-01), AMSTERDAM, NL, pages 69 - 71, XP028849194, ISSN: 0003-2697, DOI: 10.1016/j.ab.2014.04.034 * |
| OSCAR L. BRADY, GLADYS V. ELSMIE: "The use of 2:4-dinitrophenylhydrazine as a reagent for aldehydes and ketones", THE ANALYST, vol. 51, no. 599, 1 January 1926 (1926-01-01), pages 77, XP055392557, ISSN: 0003-2654, DOI: 10.1039/an9265100077 * |
| REZNICK A Z; PACKER L: "Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for carbonyl assay.", METHODS IN ENZYMOLOGY, ACADEMIC PRESS, US, vol. 233, 1 January 1994 (1994-01-01), US, pages 357 - 363, XP008149095, ISSN: 0076-6879, DOI: 10.1016/S0076-6879(94)33041-7 * |
| SOGLIA FRANCESCA; PETRACCI MASSIMILIANO; ERTBJERG PER: "Novel DNPH-based method for determination of protein carbonylation in muscle and meat", FOOD CHEMISTRY, ELSEVIER LTD., NL, vol. 197, 10 November 2015 (2015-11-10), NL, pages 670 - 675, XP029312200, ISSN: 0308-8146, DOI: 10.1016/j.foodchem.2015.11.038 * |
| WEBER DANIELA ET AL: "Determination of protein carbonyls in plasma, cell extracts, tissue homogenates, isolated proteins: Focus on sample preparation and derivatization conditions.", REDOX BIOLOGY : AN OFFICIAL JOURNAL OF THE SOCIETY FOR FREE RADICAL BIOLOGY AND MEDICINE, AN OFFICIAL JOURNAL OF THE SOCIETY FOR FREE RADICAL RESEARCH-EUROPE, AN AFFILIATE JOURNAL OF THE INTERNATIONAL SOCIETY FOR FREE RADICAL RESEARCH (SFRRI), ELSEVI, vol. 5, 1 August 2015 (2015-08-01), NL, pages 367 - 380, XP002772536, ISSN: 2213-2317, DOI: 10.1016/j.redox.2015.06.005 * |
| XP 0275003947 * |
| XP 029498906 * |
| YAN L J ET AL: "Spectrophotometric method for determination of carbonyls in oxidatively modified apolipoprotein B of human low-density lipoproteins.", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 228, no. 2, 1 July 1995 (1995-07-01), AMSTERDAM, NL, pages 349 - 351, XP002772533, ISSN: 0003-2697, DOI: 10.1006/abio.1995.1362 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Furdui et al. | Chemical approaches to detect and analyze protein sulfenic acids | |
| Hawkins et al. | Quantification of protein modification by oxidants | |
| Qu et al. | Validated quantitation of underivatized amino acids in human blood samples by volatile ion-pair reversed-phase liquid chromatography coupled to isotope dilution tandem mass spectrometry | |
| Fremout et al. | Tryptic peptide analysis of protein binders in works of art by liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| Martyniuk et al. | DIGE and iTRAQ as biomarker discovery tools in aquatic toxicology | |
| Papafilippou et al. | Protein corona fingerprinting to differentiate sepsis from non-infectious systemic inflammation | |
| Zhang et al. | Simultaneous determination of arginine and seven metabolites in plasma by reversed-phase liquid chromatography with a time-controlled ortho-phthaldialdehyde precolumn derivatization | |
| JP2011167208A (en) | Mass spectrometry method for simultaneous detection of metabolic enzyme activity and metabolite level | |
| Mueller et al. | Validation of an ESI-MS/MS screening method for acylcarnitine profiling in urine specimens of neonates, children, adolescents and adults | |
| JP2017506073A (en) | Quantitative evaluation method of composition and density of DNA-protein complex | |
| EP2977760A1 (en) | Biomarker for diagnosing liver cancer | |
| US20210311059A1 (en) | Methods of isolating barrel-like proteases and identifying peptides processed thereby | |
| EP3137907A2 (en) | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of kawasaki disease | |
| EP2444814B9 (en) | Biomarker for mental disorders including cognitive disorders, and method using said biomarker to detect mental disorders including cognitive disorders | |
| JP2021530549A (en) | Identification of post-translational modifications in proteins by single molecule sequencing | |
| Zhao | A simple, rapid and reliable high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of creatinine and uric acid in plasma and urine | |
| JP2011519021A (en) | Compounds and methods for labeling and affinity selection of protein molecules | |
| Wang et al. | Mass spectrometry for protein quantification in biomarker discovery | |
| RU2748540C1 (en) | Method for detecting sars-cov-2 virus by mass spectrometry | |
| Fedorova | Diversity of protein carbonylation pathways: Direct oxidation, glycoxidation, and modifications by lipid peroxidation products | |
| US20140147874A1 (en) | Biomarkers of cardiac ischemia | |
| US8435757B2 (en) | Mass spectrometric endopeptidase assay | |
| CA2901551A1 (en) | Methods and compositions for diagnosing preeclampsia | |
| GR20160100568A (en) | Method for the photometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins | |
| GR20160100569A (en) | Method for the flurometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins |