GR20160100282A - High-efficiency mass control method for factors able to break and/or inhibit the formation of a geminin-cdt1 complex - Google Patents
High-efficiency mass control method for factors able to break and/or inhibit the formation of a geminin-cdt1 complex Download PDFInfo
- Publication number
- GR20160100282A GR20160100282A GR20160100282A GR20160100282A GR20160100282A GR 20160100282 A GR20160100282 A GR 20160100282A GR 20160100282 A GR20160100282 A GR 20160100282A GR 20160100282 A GR20160100282 A GR 20160100282A GR 20160100282 A GR20160100282 A GR 20160100282A
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- protein
- geminin
- cdt1
- complex
- agent
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 108
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 141
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 139
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 135
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 113
- 102000004064 Geminin Human genes 0.000 claims description 67
- 108090000577 Geminin Proteins 0.000 claims description 67
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 44
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 13
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 claims description 5
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 claims description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002060 fluorescence correlation spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 238000012440 amplified luminescent proximity homogeneous assay Methods 0.000 claims description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003174 enzyme fragment complementation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 abstract description 14
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 12
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 104
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 34
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 32
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 32
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 23
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 21
- 230000009471 action Effects 0.000 description 19
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 16
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 5
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 4
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 230000004668 G2/M phase Effects 0.000 description 3
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007718 nuclear exclusion Effects 0.000 description 3
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 2
- 229940110767 coenzyme Q10 Drugs 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006849 nucleocytoplasmic transport Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000010567 DNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010063113 DNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000004707 G1/S transition Effects 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000886596 Homo sapiens Geminin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 230000027311 M phase Effects 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 238000004741 STD-NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000000114 cell free in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009189 diving Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000000612 dual polarization interferometry Methods 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N europium cryptate Chemical compound [Eu+3].N=1C2=CC=CC=1CN(CC=1N=C(C=CC=1)C=1N=C(C3)C=CC=1)CC(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1C(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1CN3CC1=CC=CC2=N1 GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003574 free electron Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000054910 human GMNN Human genes 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001768 microscale thermophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012660 pharmacological inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 150000003057 platinum Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011867 re-evaluation Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000025053 regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002805 secondary assay Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Μέθοδος μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης για παράγοντες με ικανότητα διάσπασης ή/και αναστολής σχηματισμού ενός συμπλόκου Geminin-Cdt1 A high-throughput mass screening method for agents capable of cleaving and/or inhibiting formation of a Geminin-Cdt1 complex
ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ DESCRIPTION
Τεχνικό Πεδίο Technical Field
Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε μεθόδους αυτοματοποιημένου μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης για την ταυτοποίηση αναστολέων της πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 . Αναφέρεται επίσης σε προσδιορισμούς που εκτελούνται συμπληρωματικά ως προς τον μαζικό έλεγχο υψηλής απόδοσης για τον χαρακτηρισμό των επιλεχθέντων αναστολέων όσον αφορά την ειδικότητα, τον μηχανισμό δράσης τους και την ανασταλτική τους επίδραση στον πολλαπλασιασμό των ανεξέλεγκτα διαιρούμενων κυπάρων όπως των καρκινικών κυττάρων. The present invention relates to automated high-throughput mass screening methods for the identification of inhibitors of the Geminin-Cdt1 protein interaction. It also refers to assays performed in addition to the high-throughput mass screening to characterize the selected inhibitors in terms of their specificity, mechanism of action, and their inhibitory effect on the proliferation of uncontrollably dividing cells such as cancer cells.
Τεχνικό Υπόβαθρο Technical Background
Η ακριβής αντιγραφή του γονιδιώματος είναι ζωτικής σημασίας για το κύτταρο. Πρόκειται για μία αυστηρά ελεγχόμενη διαδικασία που διασφαλίζει ότι ο διπλασιασμός του γενετικού υλικού θα λάβει χώρα μόνο μία φορά σε κάθε κυπαρικό κύκλο. Οι πρωτεΐνες Geminin και Cdt1 συνιστούν δύο κεντρικούς ρυθμιστές του κυπαρικού κύκλου και συμβάλλουν στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας, μέσω της ρύθμισης της αντιγραφής του DMA. Accurate copying of the genome is vital to the cell. This is a tightly controlled process that ensures that the duplication of the genetic material will only take place once in each cell cycle. Geminin and Cdt1 proteins are two central regulators of the cell cycle and contribute to the maintenance of genomic stability through the regulation of DMA replication.
Συγκεκριμένα, η ορθή τοπικά και χρονικά έναρξη της αντιγραφής του γενετικού υλικού διασφαλίζεται μέσω της διαδικασίας αδειοδότησης της αντιγραφής (licensing). Η εν λόγω διαδικασία περιλαμβάνει τη συγκρότηση στις αφετηρίες αντιγραφής ενός πολυπρωτεϊνικού συμπλόκου, το οποίο ονομάζεται προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-Replicative Complex, pre-RC). Ο σχηματισμός του pre-RC ολοκληρώνεται με τη στρατολόγηση στη του MCM2-7, το οποίο έχει δειχθεί in vitro ότι διαθέτει ενεργότητα ελικάσης και υποστηρίζεται ότι προκαλεί ξετύλιγμα της δίκλωνης έλικας του DNA μπροστά από τη διχάλα αντιγραφής. Η προσέλκυση των MCMs πραγματοποιείται μέσω των πρωτεϊνικών υπομονάδων Cdc6 και Cdt1 του προαντιγραφικού συμπλόκου (Blow JJ and Dutta A, Nat Rev Mol Cell Biol. 2005, Vol. 6(6), pp 476-86). In particular, the correct local and temporal initiation of the replication of the genetic material is ensured through the process of licensing the replication (licensing). This process involves the formation of a polyprotein complex at the origins of replication, which is called the pre-replicative complex (pre-RC). Formation of the pre-RC is completed by the recruitment of MCM2-7, which has been shown in vitro to possess helicase activity and is postulated to induce unwinding of the DNA double-stranded helix ahead of the replication fork. The recruitment of MCMs is mediated by the protein subunits Cdc6 and Cdt1 of the pre-transcriptional complex (Blow JJ and Dutta A, Nat Rev Mol Cell Biol. 2005, Vol. 6(6), pp 476-86).
Η αυστηρή ρύθμιση του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 είναι απαραίτητη προκειμένου να αποτραπεί η εκτοπική επενέναρξη της αντιγραφής του DNA. Ένας μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης του Cdt1 στα μετάζωα, βασίζεται στη δράση της πρωτεΐνης Geminin. Η Geminin συνιστά τον φυσικό αναστολέα του Cdt1, καθώς προσδένεται ισχυρά στον τελευταίο αναστέλλοντας έτσι τη συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου (Wohlschlegel JA et al. Science. 2000, Vol. 290(5500), pp 2309-12). Tight regulation of the licensing factor Cdt1 is necessary to prevent ectopic resumption of DNA replication. A mechanism of negative regulation of Cdt1 in metazoans relies on the action of the Geminin protein. Geminin constitutes the natural inhibitor of Cdt1, as it strongly binds to the latter thereby inhibiting the assembly of the pre-replicative complex (Wohlschlegel JA et al. Science. 2000, Vol. 290(5500), pp 2309-12).
Η απορρύθμιση της διαδικασίας αδειοδότησης της αντιγραφής προάγει την γονιδιωματική αστάθεια, η οποία με την σειρά της συμβάλλει στον μοριακό μηχανισμό της καρκινογένεσης. Μάλιστα, διαταραχή των επιπέδων έκφρασης των κέντρίκών ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου Geminin και Cdt1 έχει παρατηρηθεί σε καρκινικές κυτταρικές σειρές καθώς και σε περιπτώσεις καρκίνου στον άνθρωπο. Dysregulation of the replication licensing process promotes genomic instability, which in turn contributes to the molecular mechanism of carcinogenesis. In fact, disruption of the expression levels of the central regulators of the cell cycle Geminin and Cdt1 has been observed in cancer cell lines as well as in cases of human cancer.
Ωστόσο, υπάρχουν ενδείξεις ότι η φαρμακολογικά επαγόμενη γονιδιωματική αστάθεια μέσω του μηχανισμού του αντιγραφικού στρες (replicative stress), μπορεί να αποτελέσει μία ελπιδοφόρα προσέγγιση όσον αφορά την εφαρμογή μίας στοχευμένης και αποτελεσματικής αντικαρκινικής θεραπείας (ανασκόπηση των Dobbelstein and Sorensen, Nat Rev Drug Discov. 2015, Vol. 6, pp 405-23). Ο όρος αντιγραφικό στρες αναφέρεται στην πρόκληση δομικών βλαβών στο DNA και την επακόλουθη ενεργοποίηση του μηχανισμού απόκρισης σε βλάβη στο DNA (DNA Damage Response, DDR). However, there are indications that pharmacologically induced genomic instability through the mechanism of replicative stress (replicative stress), may be a promising approach for the implementation of a targeted and effective anticancer therapy (reviewed by Dobbelstein and Sorensen, Nat Rev Drug Discov. 2015 , Vol. 6, pp. 405-23). The term replicative stress refers to the induction of structural damage to DNA and the subsequent activation of the DNA Damage Response (DDR) mechanism.
Τα περισσότερα από τα ευρέως σήμερα χρησιμοποιούμενα αντικαρκινικά φάρμακα δρουν συμβάλλοντας στη δημιουργία αντιγραφικού στρες μέσω της πρόκλησης βλαβών στην ακεραιότητα του DNA. Παραδείγματα τέτοιων φαρμάκων αποτελούν οι αλκυλιωτικοί παράγοντες, τα σύμπλοκα λευκόχρυσου και τα νουκλεοτιδικά ανάλογα, τα οποία αν και ιδιαίτερα αποτελεσματικά στερούνται υψηλής ειδικότητας. Έτσι, προκύπτει η ανάγκη δημιουργίας ενός εναλλακτικού τρόπου πρόκλησης αντιγραφικού στρες, με υψηλότερη ειδικότητα. Έναν τέτοιον τρόπο θα μπορούσε να αποτελέσει η απορρύθμιση του συστήματος αδειοδότησης μέσω της χρήσης φαρμακολογικών μορίων με στοχευμένη δράση έναντι των παραγόντων αδειοδότησης, και ιδιαίτερα των πρωτεϊνών Geminin και Cdt1 που κατέχουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής. Most of today's widely used anticancer drugs work by contributing to the creation of replicative stress by causing damage to the integrity of DNA. Examples of such drugs are alkylating agents, platinum complexes and nucleotide analogues, which, although highly effective, lack high specificity. Thus, the need arises to create an alternative way of inducing replicative stress, with higher specificity. One such way could be the deregulation of the licensing system through the use of pharmacological molecules with targeted action against the licensing factors, and in particular the Geminin and Cdt1 proteins that play a central role in the regulation of transcriptional licensing.
Η πρόκληση αντ γραφικού στρες μέσω της διαταραχής της ισορροπίας Geminin-Cdt1 μπορεί να προκαλέσει διαφορετική απόκριση μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί ότι η αναστολή της αδειοδότησης μέσω υπερέκφρασης της Geminin προκαλεί στα φυσιολογικά κύπαρα παύση του κυτταρικού κύκλου ενώ επάγει την απόπτωση στα καρκινικά. Επίσης, η αποσιώπηση της Geminin προκαλεί υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος και επαγωγή της απόπτωσης στα καρκινικά κύπαρα αλλά όχι στα φυσιολογικά. Όσον αφορά την απορρύθμιση του Cdt1 , έχει δειχθεί ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης προκαλεί στα καρκινικά κύτταρα υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος και επαγωγή της απόπτωσης, ενώ στην περίπτωση φυσιολογικών κυττάρων δεν προκαλείται υπερδιπλασιασμός του γονιδιώματος αν και παρατηρούνται χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Inducing replicative stress through disruption of the Geminin-Cdt1 balance may induce a differential response between cancer and normal cells. In particular, it has been shown that inhibition of licensing through overexpression of Geminin causes cell cycle arrest in normal cells while inducing apoptosis in cancer cells. Also, Geminin silencing causes genome hyperduplication and induction of apoptosis in cancer cells but not in normal ones. Regarding the deregulation of Cdt1, it has been shown that overexpression of the protein causes in cancer cells genome hyperduplication and induction of apoptosis, while in the case of normal cells genome hyperduplication is not caused although chromosomal abnormalities are observed.
Συμπερασματικά, η διαταραχή της ισορροπίας Geminin-Cdt1 μπορεί να προκαλέσει αντιγραφικό στρες και μάλιστα αυτό μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετική απόκριση μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. Η ρύθμιση αυτής της ισορροπίας και της δράσης των δύο πρωτεϊνών βασίζεται στην μεταξύ τους αλληλεπίδραση. Επομένως, το σύμπλοκο Geminin-Cdt1 συνιστά έναν ελκυστικό και ελπιδοφόρο μόριο-στόχο δεδομένου ότι αναστολείς της πρωτεϊνικής αυτής αλληλεπίδρασης μπορεί να προκαλέσουν διαταραχή της ισορροπίας των δύο πρωτεϊνών και να χρησιμοποιηθούν ως φαρμακολογικά μόρια με επιλεκτική αντικαρκινική δράση. In conclusion, disruption of the Geminin-Cdt1 balance can cause replicative stress and indeed this can lead to a different response between cancer and normal cells. The regulation of this balance and the action of the two proteins is based on the interaction between them. Therefore, the Geminin-Cdt1 complex constitutes an attractive and promising target molecule since inhibitors of this protein interaction may cause a disturbance in the balance of the two proteins and be used as pharmacological molecules with selective anticancer activity.
Μέχρι στιγμής έχουν υπάρξει ορισμένες μελέτες σχετικά με την εύρεση μορίων που αναστέλλουν την αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 . Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί από τους Mizushina V et al. ότι το συνένζυμο Q10 (Biochim Biophys Acta. 2008, Vol. 1780(2), pp 203-13) το γλυκολιπίδιο SQDG του σπανακιού (Biochimie. 2008, Vol. 90(6) pp 947-56) και το ολεϊκό οξύ (C1 8:1) (Int J Mol Med. 2008, Vol. 21(3), pp 281-90) αναστέλλουν την αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών in vitro, μέσω της πρόσδεσής τους στον παράγοντα Cdt1. So far there have been some studies on finding molecules that inhibit the Geminin-Cdt1 interaction. Specifically, it has been shown by Mizushina V et al. that coenzyme Q10 (Biochim Biophys Acta. 2008, Vol. 1780(2), pp 203-13) spinach glycolipid SQDG (Biochimie. 2008, Vol. 90(6) pp 947-56) and oleic acid (C1 8:1) (Int J Mol Med. 2008, Vol. 21(3), pp 281-90) inhibit the interaction of the two proteins in vitro, through their binding to the Cdt1 factor.
Στις παραπάνω μελέτες, η ανασταλτική επίδραση των συγκεκριμένων βιομορίων στην πρωτείνική αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 μελετήθηκε μέσω της μεθόδου ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Πρόκειται για μία μέθοδο που καθιστά δυνατή τη μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, εμφανίζοντας ωστόσο σημαντικούς περιορισμούς όσον αφορά τη συμβατότητά της με αυτοματοποιημένες τεχνικές που εφαρμόζονται σε πρωτόγαλα μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης (high throughput screening}. Οι κυριότεροι περιοριστικοί παράγοντες σχετίζονται με βασικά τεχνικά χαρακτηριστικά της μεθόδου όπως η ετερογένεια και ειδικά τα πολλαπλά στάδια πλύσεων, που είναι απαραίτητα για την απομάκρυνση των μη-ειδικά προσδεδεμένων αντιδραστηρίων. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν την ELISA ιδιαίτερα ασύμφορη ως μέθοδο μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης, όσον αφορά τις παραμέτρους του χρόνου και του κόστους. In the above studies, the inhibitory effect of the specific biomolecules on the Geminin-Cdt1 protein interaction was studied through the ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) method. It is a method that makes it possible to study protein interactions, however showing significant limitations in terms of its compatibility with automated techniques applied in high throughput screening protocols. The main limiting factors are related to basic technical characteristics of the method such as the heterogeneity and especially the multiple washing steps necessary to remove non-specifically bound reagents, these characteristics make ELISA particularly unprofitable as a high-throughput mass screening method, in terms of time and cost parameters.
Δεδομένου ότι το σύμπλοκο Geminin-Cdt1 συνιστά ένα ελκυστικό μόριο-στόχο για την ανακάλυψη φαρμακολογικών μορίων με αντικαρκινική δράση, προκύπτει η ανάγκη για την ανάπτυξη και εφαρμογή μίας μεθόδου υψηλής απόδοσης που να καθιστά δυνατό και αξιόπιστο τον μαζικό έλεγχο διαθέσιμων βιβλιοθηκών συνθετικών χημικών ενώσεων (compound libraries). Κάτι τέτοιο θα συντελούσε σημαντικά στην ανακάλυψη νέων αναστολέων της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 με φαρμακολογικές ιδιότητες (drug-like properties). Οι συνθετικές χημικές ενώσεις (compounds) λόγω των φαρμακολογικών τους ιδιοτήτων είναι δυνατόν μέσω μεθόδων ιατρικής χημείας να εξελιχθούν σε κατάλληλα και αποτελεσματικά φάρμακα για πιθανή πειραματική ή/και κλινική εφαρμογή. Να σημειωθεί ότι, το συνένζυμο Q10, το γλυκολιπίδιο SQDG του σπανακιού και το ολεϊκό οξύ, σε αντίθεση με τις συνθετικές χημικές ενώσεις, στερούνται φαρμακολογικών ιδιοτήτων λόγω της φυσικής τους προέλευσης. Το γεγονός αυτό επισημαίνει την ανάγκη ταυτοποίησης αναστολέων του συμπλόκου Geminin-Cdt1 κυρίως μικρομοριακών, οι οποίοι να έχουν τη δυνατότητα φαρμακολογικής εξέλιξης και βελτιστοποίησης. Given that the Geminin-Cdt1 complex constitutes an attractive target molecule for the discovery of pharmacological molecules with anticancer activity, there is a need for the development and application of a high-throughput method that makes possible and reliable mass screening of available libraries of synthetic chemical compounds (compound libraries). This would significantly contribute to the discovery of new inhibitors of the Geminin-Cdt1 interaction with drug-like properties. Synthetic chemical compounds (compounds) due to their pharmacological properties can be developed into suitable and effective drugs for potential experimental and/or clinical application through medicinal chemistry methods. It should be noted that coenzyme Q10, spinach glycolipid SQDG and oleic acid, unlike synthetic chemical compounds, lack pharmacological properties due to their natural origin. This fact points to the need to identify inhibitors of the Geminin-Cdt1 complex, mainly small molecules, which have the possibility of pharmacological development and optimization.
Όσον «φορά την ανασταλτική επίδραση των παραπάνω μορίων στην αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 , αυτή περιορίζεται μόνο στην αναστολή σχηματισμού του πρωτεϊνικού συμπλόκου, χωρίς να εμφανίζει ικανότητα διάσπασής του. Ωστόσο, στα πλαίσια μίας αποτελεσματικής αντικαρκινικής θεραπείας, η ταυτοποίηση φαρμακολογικών μορίων με ικανότητα διάσπασης του πρωτεϊνικού συμπλόκου Geminin-Cdt1 είναι ιδιαίτερα σημαντική και αναγκαία. Αυτό οφείλεται στο ότι σε έναν ασύγχρονο πληθυσμό καρκινικών κυττάρων -όπως ισχύει σε in vivo συνθήκες- οι δύο πρωτεΐνες θα βρίσκονται σε σύμπλοκο σε σημαντικό ποσοστό αυτών των κυττάρων. As for the inhibitory effect of the above molecules on the Geminin-Cdt1 interaction, it is limited only to inhibiting the formation of the protein complex, without showing the ability to break it down. However, in the context of an effective anticancer treatment, the identification of pharmacological molecules with the ability to break down the Geminin-Cdt1 protein complex is particularly important and necessary. This is because in an asynchronous population of cancer cells - as is the case in vivo conditions - the two proteins will be found in a complex in a significant percentage of these cells.
Μία επιπλέον σημαντική ανάγκη που προκύπτει αναφορικά με τη μελέτη μικρομοριακών αναστολέων της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 είναι η ανάπτυξη και χρήση κατάλληλων κυτταρικών συστημάτων μελέτης (cellular assays) για τον προσδιορισμό της ειδικότητας και του μηχανισμού της δράσης τους ex vivo. Κάτι τέτοιο είναι απαραίτητο διότι είναι πιθανό η in vitro ανασταλτική τους δράση να μην παρατηρείται και ex vivo δεδομένης της περιορισμένης διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης, της ιδιαιτερότητας των ενδοκυττάριων συνθηκών και της μη ειδικής δράσης τους λόγω της αλληλεπίδρασης μεταξύ των διαφορετικών σηματοδοτικών μονοπαπών. Η αναγκαιότητα αυτή ενισχύεται και από το γεγονός ότι ένα από τα μόρια-αναστολείς της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 , το γλυκολιπίδιο SQDG έχει δειχθεί επίσης ότι είναι πολύ ισχυρός αναστολέας της DNA πολυμεράσης ε [Mizushina et al., Biochem J 370:299-305 (2003)]. Ως εκ τούτου, η μη ειδική δράση του συγκεκριμένου αναστολέα ενδέχεται να περιορίζει την αποτελεσματικότητά του ex vivo. Ωστόσο, κανένας από τους αναστολείς Q10, SQDG και ολεϊκό οξύ δεν έχουν μελετηθεί ex vivo. Επομένως, γίνεται αντιληπτό ότι εκτός από την ταυτοποίηση των μικρομοριακών αναστολέων της πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 είναι απαραίτητος και ο ex vivo χαρακτηρισμός τους μέσω κατάλληλων κυτταρικών συστημάτων μελέτης. An additional important need that arises regarding the study of small molecule inhibitors of the Geminin-Cdt1 interaction is the development and use of appropriate cellular study systems (cellular assays) to determine the specificity and mechanism of their action ex vivo. This is necessary because it is possible that their in vitro inhibitory effect is not observed ex vivo given the limited permeability of the cell membrane, the specificity of the intracellular conditions and their non-specific effect due to the interaction between the different signaling monolayers. This necessity is reinforced by the fact that one of the molecules-inhibitors of the Geminin-Cdt1 interaction, the glycolipid SQDG has also been shown to be a very strong inhibitor of DNA polymerase ε [Mizushina et al., Biochem J 370:299-305 ( 2003)]. Therefore, the non-specific activity of this inhibitor may limit its efficacy ex vivo. However, none of the Q10 inhibitors, SQDG and oleic acid have been studied ex vivo. Therefore, it is realized that in addition to the identification of small molecule inhibitors of the Geminin-Cdt1 protein interaction, their ex vivo characterization through appropriate cell study systems is also necessary.
Επιπλέον, οι αναστολείς Q10, SQDG και ολεϊκό οξύ δεν έχουν μελετηθεί ως προς την επίδρασή τους στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. Εντούτοις, κάτι τέτοιο είναι απαραίτητο προκειμένου να διαπιστωθεί τυχόν αντικαρκινική τους δράση καθώς και να προσδιοριστεί η επιλεκτικότητα της δράσης τους μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. In addition, Q10 inhibitors, SQDG and oleic acid have not been studied for their effect on the cell cycle progression of cancer and normal cells. However, this is necessary in order to establish any anti-tumor activity as well as to determine the selectivity of their action between cancerous and normal cells.
Το πρόβλημα που επιλύεται με την παρούσα εφεύρεση αφορά την ανάγκη για την ανάπτυξη και εφαρμογή μίας κατάλληλης μεθόδου μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης για την ταυτοποίηση μικρομοριακών αναστολέων της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1. Επιπλέον αφορά την ανάγκη ανάπτυξης και εφαρμογής κατάλληλων κυτταρικών συστημάτων μελέτης για την ex vivo μελέτη της ειδικότητας, του μηχανισμού και της επιλεκτικότητας της δράσης των αναστολέων αυτών. The problem solved by the present invention concerns the need for the development and application of a suitable high-throughput mass screening method for the identification of small molecule inhibitors of the Geminin-Cdt1 interaction. In addition, it concerns the need to develop and apply suitable cell study systems for the ex vivo study of the specificity, mechanism and selectivity of the action of these inhibitors.
Η λύση που παρέχει η παρούσα εφεύρεση στην μέχρι τώρα έλλειψη φαρμακολογικών αναστολέων της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 που προέρχεται από την έλλειψη κατάλληλων μεθόδων ταυτοποίησής τους είναι μια κατάλληλα προσαρμοσμένη ομοιογενής μέθοδος μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης συνοδευόμενη από μια σειρά από δευτερεύοντες προσδιορισμούς της δραστικότητας και ειδικότητας των αναστολέων. The solution provided by the present invention to the hitherto lack of pharmacological inhibitors of the Geminin-Cdt1 interaction stemming from the lack of suitable methods for their identification is a suitably tailored homogeneous high-throughput mass screening method accompanied by a series of secondary assays of inhibitor potency and specificity .
Οι ομοιογενείς τεχνικές χαρακτηρίζονται από ομοιογένεια (δεν περιλαμβάνουν στάδια πλύσεων) και εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία (υψηλότερη από τις ετερογενείς μεθόδους όπως η κλασική ELISA). Τα χαρακτηριστικά αυτά τις καθιστούν συμβατές με αυτοματοποιημένες ή ημι-αυτοματοπαιημένες τεχνικές και ιδανικές για την εφαρμογή πρωτοκόλλων μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης. Homogeneous techniques are characterized by homogeneity (do not include washing steps) and extremely high sensitivity (higher than heterogeneous methods such as classical ELISA). These characteristics make them compatible with automated or semi-automated techniques and ideal for the implementation of high-throughput mass control protocols.
Περίληψη της Εφεύρεσης Summary of the Invention
Αντικείμενο της παρούσας εφεύρεσης είναι να παρέχει μεθόδους αυτοματοποιημένου μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης για την ταυτοποίηση αναστολέων της πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 , καθώς και συμπληρωματικούς προσδιορισμούς για τον χαρακτηρισμό των επιλεχθέντων αναστολέων ως προς την ειδικότητα, τον μηχανισμό δράσης τους και την ανασταλτική τους επίδραση στον πολλαπλασιασμό των ανεξέλεγκτα διαιρούμενων κυττάρων. Αντικείμενο της παρούσας εφεύρεσης είναι επίσης να παρέχει κιτ για τον προσδιορισμό της ικανότητας ενός παράγοντα να διασπά ή/και να αναστέλλει το σχηματισμό ενός συμπλόκου των πρωτεϊνών Geminin-Cdt1. Οι μέθοδοι και τα κιτ της παρούσας εφεύρεσης είναι ιδιαίτερα χρήσιμα στην ταυτοποίηση παραγόντων που ρυθμίζουν ή/και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των ανεξέλεγκτα διαιρούμενων κυττάρων. The object of the present invention is to provide high-throughput automated mass screening methods for the identification of inhibitors of the Geminin-Cdt1 protein interaction, as well as complementary assays for the characterization of the selected inhibitors in terms of their specificity, their mechanism of action and their inhibitory effect on proliferation of uncontrollably dividing cells. An object of the present invention is also to provide kits for determining the ability of an agent to disrupt and/or inhibit the formation of a complex of Geminin-Cdt1 proteins. The methods and kits of the present invention are particularly useful in identifying factors that regulate and/or inhibit the proliferation of aberrantly dividing cells.
Περιγραφή των Σχεδίων Description of the Plans
Η παρούσα εφεύρεση θα περιγραφεί τώρα με αναφορά σε ορισμένες ενσωματώσεις της που επεξηγούνται στα επισυναπτόμενα σχέδια. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα επισυναπτόμενα σχέδια επεξηγούν προτιμώμενες ενσωματώσεις της εφεύρεσης, επομένως δεν θα πρέπει να θεωρηθούν περιοριστικά του πεδίου της εφεύρεσης. The present invention will now be described with reference to certain embodiments thereof which are illustrated in the accompanying drawings. It should be noted that the attached drawings illustrate preferred embodiments of the invention, therefore they should not be considered as limiting the scope of the invention.
Η Εκ. 1 απεκονίζει τα αποτελέσματα της μελέτης των συνθηκών (συγκέντρωση του πρωτείνικού συμπλόκου, των σφαιριδίων, του DMSO και διάρκεια χρόνου επώασης) για τη βέλτιστη εφαρμογή της μεθόδου AlphaScreen™. Fig. 1 depicts the results of the study of the conditions (concentration of the protein complex, beads, DMSO and length of incubation time) for optimal application of the AlphaScreen™ method.
Η Εικ. 2 απεικονίζει τη στατιστική περιγραφή των αποτελεσμάτων και την αξιολόγηση της αξιοπιστίας του μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης. Fig. 2 illustrates the statistical description of the results and the reliability assessment of the high-throughput mass screening.
Η Εικ. 3 απεικονίζει τον συντακτικό τύπο της συνθετικής χημικής ένωσης AF-615/30368009. Fig. 3 illustrates the structural formula of the synthetic compound AF-615/30368009.
Η Εικ. 4 απεικονίζει τον συντακτικό τύπο της συνθετικής χημικής ένωσης ΑΝ-689/41741104. . Fig. 4 illustrates the structural formula of the synthetic chemical compound AN-689/41741104. .
Η Εικ. 5 απεικονίζει τα αποτελέσματα της in vitro μελέτης της ειδικότητας και της ισχύος της δράσης των συνθετικών χημικών ενώσεων (A) AF-615/30368009 και (Β) ΑΝ-689/41741104, μέσω της τεχνικής συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance, SPR). Fig. 5 illustrates the results of the in vitro study of the specificity and potency of the synthetic chemical compounds (A) AF-615/30368009 and (B) AN-689/41741104, through the Surface Plasmon Resonance technique , SPR).
Η Εικ. 6 απεικονίζει τα αποτελέσματα της ex vivo μελέτης της ειδικότητας της δράσης των συνθετικών χημικών ενώσεων (A) AF-61 5/30368009 και (Β) ΑΝ-689/41741104, μέσω της τεχνικής μεταφοράς φθορίζουσας συντονισμένης ενέργειας κατόπιν φωτολεύκανσης του «δέκτη» (FRET Acceptor Photobleaching). Το σύμβολο «*» αναφέρεται σε τιμή ρ £0.05. Fig. 6 illustrates the results of the ex vivo study of the specificity of the action of the synthetic chemical compounds (A) AF-61 5/30368009 and (B) AN-689/41741104, by means of the fluorescent resonant energy transfer technique following photobleaching of the "receiver » (FRET Acceptor Photobleaching). The '*' symbol refers to a p value of £0.05.
Η Εικ. 7 απεικονίζει τα αποτελέσματα της ex vivo μελέτης του μηχανισμού δράσης των συνθετικών χημικών ενώσεων (A) AF-615/30368009 και (Β) ΑΝ-689/41741104, μέσω της επίδρασής τους στην ενδοκυτταρική κατανομή της εξωγενούς Geminin. Τα σύμβολα «*», «**» και «***» αναφέρονται σε τιμές p ≤0.05, ≤0.005 και ≤0.0005, αντίστοιχα. Fig. 7 illustrates the results of the ex vivo study of the mechanism of action of the synthetic chemical compounds (A) AF-615/30368009 and (B) AN-689/41741104, through their effect on the intracellular distribution of exogenous Geminin. Symbols “*”, “**” and “***” refer to p values ≤0.05, ≤0.005 and ≤0.0005, respectively.
Η Εικ. 8 απεικονίζει τα αποτελέσματα της επίδρασης των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-6 15/30368009 (Β & Ε) και ΑΝ-689/41741104 (Γ & Ζ) στον κυτταρικό κύκλο καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων, μέσω της τεχνικής της κυτταρομετρίας ροής. Fig. 8 illustrates the results of the effect of the synthetic chemical compounds AF-6 15/30368009 (B & E) and AN-689/41741104 (C & Z) on the cell cycle of cancer and normal cells, by flow cytometry technique.
Λεπτομερής Περιγραφή της Εφεύρεσης Detailed Description of the Invention
Για τους σκοπούς της παρούσας εφεύρεσης ο όρος «πρωτεΐνη Geminin» αναφέρεται στην πρωτεΐνη Geminin πλήρους μήκους ή σε ένα τμήμα αυτής που διατηρεί την ικανότητα πρόσδεσης στην πρωτεΐνη Cdt1. Η πρωτεΐνη Geminin της παρούσας εφεύρεσης είναι από οποιοδήποτε θηλαστικό, συμπεριλαμβανομένων ειδικότερα του ανθρώπου, του ποντικού και του αρουραίου για παράδειγμα. For the purposes of the present invention the term "Geminin protein" refers to the full-length Geminin protein or a portion thereof that retains the ability to bind to the Cdt1 protein. The Geminin protein of the present invention is from any mammal, including in particular human, mouse and rat for example.
Για τους σκοπούς της παρούσας εφεύρεσης ο όρος «πρωτεΐνη Geminin πλήρους μήκους» αναφέρεται στην πλήρη αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης Geminin. Η πλήρης αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης Geminin είναι διαθέσιμη στην βάση δεδομένων GenBank. Ο αριθμός πρόσβασης (accession number) για την αμινοξική αλληλουχία του ανθρώπου, του ποντικού και του αρουραίου για παράδειγμα, είναι NP_001 238920 (Homo sapiens), NP_065592 (mus musculus) και NP_001099582 (rattus norvegicus). For the purposes of the present invention the term "full-length Geminin protein" refers to the complete amino acid sequence of the Geminin protein. The complete amino acid sequence of the Geminin protein is available in the GenBank database. The accession number for the amino acid sequence of human, mouse and rat for example is NP_001 238920 (Homo sapiens), NP_065592 (mus musculus) and NP_001099582 (rattus norvegicus).
Για τους σκοπούς της παρούσας εφεύρεσης ο όρος «πρωτεΐνη Cdt1 » αναφέρεται στην πρωτεΐνη Cdt1 πλήρους μήκους, ένα τμήμα αυτής που διατηρεί την ικανότητα πρόσδεσης στην πρωτεΐνη Geminin, ή σε μία μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης Cdt1 που εμφανίζει μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης στην πρωτεΐνη Geminin. Η μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης Cdt1 που εμφανίζει μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης στην πρωτεΐνη Geminin μπορεί να είναι μια σημειακά μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης Cdt1 , ή μια έλλειψη (deletion) η οποία αφαιρεί ορισμένα αμινοξέα από την αλληλουχία της πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη Cdt1 της παρούσας εφεύρεσης είναι από οποιοδήποτε θηλαστικό, συμπεριλαμβανομένων ειδικότερα του ανθρώπου, του ποντικού και του αρουραίου για παράδειγμα. For the purposes of the present invention the term "Cdt1 protein" refers to the full-length Cdt1 protein, a portion thereof that retains the ability to bind to the Geminin protein, or to a mutant form of the Cdt1 protein that exhibits a reduced ability to bind to the Geminin protein. The mutant form of the Cdt1 protein that shows a reduced ability to bind to the Geminin protein can be a point mutant form of the Cdt1 protein, or a deletion that removes some amino acids from the protein sequence. The Cdt1 protein of the present invention is from any mammal, including in particular human, mouse and rat for example.
Για τους σκοπούς της παρούσας εφεύρεσης ο όρος «πρωτεΐνη Cdt1 πλήρους μήκους» αναφέρεται στην πλήρη αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης Cdt1 . Η πλήρης αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης Cdt1 είναι διαθέσιμη στην βάση δεδομένων GenBank. Ο αριθμός πρόσβασης για την αμινοξική αλληλουχία του ανθρώπου, του ποντικού και του αρουραίου για παράδειγμα, είναι ΝΡ_1 12190 (Homo sapiens), ΝΡ_080290 (mus musculus) και ΝΡ_001099662 (rattus norvegicus). For the purposes of the present invention the term "full-length Cdt1 protein" refers to the complete amino acid sequence of the Cdt1 protein. The complete amino acid sequence of the Cdt1 protein is available in the GenBank database. The accession number for the amino acid sequence of human, mouse and rat for example is NP_1 12190 (Homo sapiens), NP_080290 (mus musculus) and NP_001099662 (rattus norvegicus).
Σε μία ενσωμάτωση, η παρούσα εφεύρεση παρέχει την περιγραφή μιας μεθόδου μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης με την χρήση ομοιογενών αυτοματοποιημένων ή ημιαυτοποιημένων τεχνικών και την βελτιστοποίηση των τεχνικών της παραμέτρων με σκοπό τη βέλτιστη εφαρμογή της για τον προσδιορισμό της ικανότητας ενός παράγοντα να διασπά ή/και να αναστέλλει το σχηματισμό ενός συμπλόκου των πρωτεϊνών Geminin-Cdt1. Η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει την παροχή μιας πρωτεΐνης Geminin και μιας πρωτεΐνης Cdt1 σε ένα σύστημα υπό συνθήκες που θα επέτρεπαν, απουσία του παράγοντα, τον σχηματισμό ενός συμπλόκου των πρωτεινών Geminin-Cdt1 , την παροχή ενός παράγοντα στο σύστημα, και τον καθορισμό της ποσότητας του σχηματιζόμενου συμπλόκου, όπου μια μείωση στην ποσότητα του εν λόγω συμπλόκου παρουσία του παράγοντα σε σύγκριση με την απουσία του παράγοντα υποδεικνύει ότι ο εν λόγω παράγοντας διασπά ή/και αναστέλλει τον σχηματισμό ενός συμπλόκου των πρωτεϊνών Geminin-Cdt1. In one embodiment, the present invention provides the description of a high-throughput mass screening method using homogeneous automated or semi-automated techniques and the optimization of its technical parameters for its optimal application in determining the ability of an agent to break down and/or inhibits the formation of a complex of Geminin-Cdt1 proteins. Said method includes providing a Geminin protein and a Cdt1 protein to a system under conditions that would allow, in the absence of the agent, the formation of a Geminin-Cdt1 protein complex, providing an agent to the system, and determining the amount of complex formed, wherein a decrease in the amount of said complex in the presence of the agent compared to the absence of the agent indicates that said agent disrupts and/or inhibits the formation of a complex of Geminin-Cdt1 proteins.
O όρος «ομοιογενής τεχνική» ή «ομοιογενής μέθοδος» αναφέρεται σε έναν προσδιορισμό που δεν απαιτεί ενδιάμεσα βήματα πλυσιμάτων για την απομάκρυνση μη προοδεμένων αντιδραστηρίων, κάτι που καθιστά τον προσδιορισμό ευκολότερο και ταχύτερο. Επίσης μία ομοιογενής τεχνική επιτρέπει την ανίχνευση αλληλεπιδράσεων χαμηλής συγγένειας οι οποίες μπορεί να διασπώνται κατά την πλύση, και είναι πιο επιδεκτική στην αυτοματοποίηση. The term "homogeneous technique" or "homogeneous method" refers to an assay that does not require intermediate washing steps to remove unprogressed reagents, making the assay easier and faster. Also a homogeneous technique allows the detection of low-affinity interactions which may be broken down during washing, and is more amenable to automation.
Οι εν λόγω συνθήκες που θα επέτρεπαν, απουσία του παράγοντα, τον σχηματισμό ενός συμπλόκου των πρωτεϊνών Geminin-Cdt1 είναι κατά κύριο λόγο: α) η χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση της πρωτεΐνης Geminin και της πρωτεΐνης Cdt1 , όπως και οι μεταξύ τους σχετικές συγκεντρώσεις για τις οποίες παρουσιάζεται η επιθυμητή αναλογία σήματος (S, Signal) / θορύβου (Β, Background), β) η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος και κυρίως η επιλογή και ποσότητα του ρυθμιστικού παράγοντα, η ποσότητα του άλατος, η ποσότητα της πρωτεΐνης BSA (αλβουμίνη ορού βωός) που προστίθεται για τον περιορισμό των μη ειδικών πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, γ) η συγκέντρωση των αντιδραστηρίων δέσμευσης πρωτεϊνών (Protein Capture Reagents) όπως σφαιρίδια ή αντισώματα ανάλογα με την περίπτωση, ή άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται κατά την πραγματοποίηση του μαζικού ελέγχου. Επίσης μία άλλη παράμετρος που χρήζει βελτιστοποίησης κατά την πραγματοποίηση του μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης είναι η συγκέντρωση του κάθε παράγοντα που ελέγχεται για την ικανότητά του να αναστέλλει τον σχηματισμό του πρωτεϊνικού συμπλόκου Geminin-Cdt1 , όπως και η συγκέντρωση του διαλύτη στο οποίο είναι διαλυτοποιημένοι οι παράγοντες. The said conditions that would allow, in the absence of the factor, the formation of a Geminin-Cdt1 protein complex are mainly: a) the used concentration of the Geminin protein and the Cdt1 protein, as well as the relative concentrations for which it is presented the desired ratio of signal (S, Signal) / noise (B, Background), b) the composition of the buffer solution and mainly the choice and amount of buffering agent, the amount of salt, the amount of BSA (bovine serum albumin) protein that is added to limit non-specific protein interactions, c) the concentration of protein capture reagents (Protein Capture Reagents) such as beads or antibodies as appropriate, or other reagents used when performing mass screening. Also, another parameter that needs to be optimized when performing high-throughput mass screening is the concentration of each factor tested for its ability to inhibit the formation of the Geminin-Cdt1 protein complex, as well as the concentration of the solvent in which the factors are dissolved .
Σε μία περαιτέρω ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, η πρωτεΐνη Geminin και/ή η πρωτεΐνη Cdt1 έχει ομοιοπολικά προσδεθεί σε έναν πεπτιδικό επίτοπο ή έναν ανιχνεύσιμο ιχνηθέτη. Τα άτομα με συνήθη τεχνική εμπειρία μπορούν να προσδιορίσουν τον κατάλληλο επίτοπο ή ιχνηθέτη για μία δεδομένη εφαρμογή. In a further embodiment of the present invention, the Geminin protein and/or the Cdt1 protein is covalently attached to a peptide epitope or a detectable label. Those of ordinary skill in the art can determine the appropriate epitope or label for a given application.
Οι πιο συνήθεις πεπτιδικοί επίτοποι είναι εκείνοι για τους οποίους υπάρχουν διαθέσιμα αντισώματα τα οποία χρησιμεύουν για την σήμανση του αντίστοιχου επίτοπου. Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν οι επίτοποι myc, FLAG tag και Hemagglutinin (ΗΑ). Υπάρχουν και συστήματα που δεν χρησιμοποιούν αντισώματα, όπως για παράδειγμα η glutathione-S-transferase (GST), η οποία μπορεί να απομονωθεί χρησιμοποιώντας glutathione agarose, η Maltose binding protein tag (το οποίο δεσμεύεται με amylose agarose) και η 6-Histidine tag (που δεσμεύεται από χηλικό νικέλιο ή κοβάλτιο). The most common peptide epitopes are those for which antibodies are available that serve to label the corresponding epitope. Myc, FLAG tag and Hemagglutinin (HA) epitopes belong to this category. There are also systems that do not use antibodies, such as glutathione-S-transferase (GST), which can be isolated using glutathione agarose, the Maltose binding protein tag (which binds to amylose agarose), and the 6-Histidine tag ( bound by a nickel or cobalt chelate).
Ένας ανιχνεύσιμος ιχνηθέτης είναι μια σύνθεση ανιχνεύσιμη με φασματοσκοπικά, φωτοχημικά, βιοχημικά, ραδιοχημικά, χημικά, ανοσοχημικά, ή οποιαδήποτε άλλα μέσα. Για παράδειγμα, χρήσιμες επισημάνσεις περιλαμβάνουν ενώσεις φωταύγειας όπως η λουσιφεράση και η aequorin, φθοροφόρα όπως η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP, η κυανή CFP και η κίτρινη YFP, η οικογένεια χρωστικών Alexa Fluor (των Molecular Probes), η Rhodamine Green, οι ροδαμίνες Β και 6G, το παράγωγο της ροδαμίνης TMR, οι κυανίνες Cy2, Cy3 και Cy5, το Ευρώπιο (Europium cryptate) και το XL665, αντιδραστήρια πυκνά σε ηλεκτρόνια, και ραδιοϊσότοπα. A detectable tracer is a compound detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, radiochemical, chemical, immunochemical, or any other means. For example, useful labels include luminescent compounds such as luciferase and aequorin, fluorophores such as green fluorescent protein GFP, cyan CFP and yellow YFP, the Alexa Fluor family of dyes (of Molecular Probes), Rhodamine Green, rhodamines B and 6G, the rhodamine derivative TMR, cyanines Cy2, Cy3 and Cy5, Europium cryptate and XL665, electron-dense reagents, and radioisotopes.
Η επικόλληση του επιτόπου ή του ιχνηθέτη μπορεί να επιτευχθεί με ομοιοπολική πρόσδεση του επίτοπου ή ιχνηθέτη στο αμινοτελικό ή καρβοξυλικό άκρο της πρωτεΐνης στόχου. Αυτό επιτυγχάνεται με την εισαγωγή του γονιδίου-στόχου σε ένα φορέα έκφρασης και είναι ειδικός για το κατάλληλο κύτταρο-ξενιστή και που επίσης περιέχει την αλληλουχία του επικολλούμενου επίτοπου (ή πολλαπλά αντίγραφα του ίδιου επιτόπου, ή ακόμα και εν σειρά αντίγραφα διαφορετικών επιτόπων) ή του ανιχνεύσιμου ιχνηθέτη. Έχουν αναπτυχθεί και υπάρχουν διαθέσιμοι φορείς έκφρασης για μία ποικιλία τύπων ξενιστή, συμπεριλαμβανομένου του βακτηρίου Escherichia coli, των ζυμομυκήτων όπως ο Saccharomyces cerevisiae, των εντόμων και των κυπάρων θηλαστικών. Attachment of the epitope or label can be achieved by covalent attachment of the epitope or label to the amino or carboxy terminus of the target protein. This is achieved by inserting the target gene into an expression vector that is specific for the appropriate host cell and that also contains the sequence of the flanking epitope (or multiple copies of the same epitope, or even consecutive copies of different epitopes) or detectable tracer. Expression vectors have been developed and are available for a variety of host types, including the bacterium Escherichia coli, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, insects and mammalian cells.
Η τεχνική πάνω στην οποία βασίζεται η ομοιογενής μέθοδος μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης επιλέγεται από την ομάδα πού αποτελείτάι από τον Ομοιογενή Προσδιορισμό Εγγύτητας Ενισχυμένης Φωταύγειας (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay ή Alphascreen™), Ανάλυση Εγγύτητας Σπινθηρισμού (Scintillation Proximity Assay), Μεταφορά Συντονισμένης Ενέργειας Φθορισμού (Fluorescence Resonance Energy Transfer), Ομοιογενή Ανάλυση Φθορισμού Χρονικής Ευκρίνειας (Homogeneous Time Resolved Fluorescence), Μέθοδο Φθορίζουσας Πόλωσης του Φωτός (Fluorescence Polarization Assay), Φασματοσκοπία Συσχέτισης Φθορισμού (Fluorescence Correlation Spectroscopy), Έλεγχο Συμπληρωματικότητας Ενζυματικών Τμημάτων (Enzyme Fragment Complementation), ή συνδυασμούς αυτών. The technique underlying the high-throughput homogeneous mass screening method is selected from the group consisting of the Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (Alphascreen™), Scintillation Proximity Assay, Fluorescence Coordinated Energy Transfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer), Homogeneous Time Resolved Fluorescence, Fluorescence Polarization Assay, Fluorescence Correlation Spectroscopy, Enzyme Fragment Complementation, or combinations of these.
Σε κάποιες,προτιμώμενες ενσωματώσεις, η τεχνική για τον πρωτογενή μαζικό έλεγχο βασίζεται στην μέθοδό Ομοιογενούς Προσδιορισμού Εγγύτητας Ενισχυμένης Φωταύγειας AlphaScreen™ της Perkin Elmer. Η τεχνική AlphaScreen™ βασίζεται στη χρήση σφαιριδίων «δότη» και σφαιριδίων «δέκτη» επικαλυμμένα με ένα στρώμα υδροπηκτής που παρέχει λειτουργικές ομάδες για βιοσύζευξη. Όταν μια βιολογική αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων (όπως ο σχηματισμός πρωτεϊνικού συμπλόκου) φέρνει τα σφαιρίδια σε εγγύτητα, μια σειρά χημικών αντιδράσεων λαμβάνει χώρα για να παραχθεί ένα κατά πολύ ενισχυμένο σήμα. Κατά την διέγερση με λέιζερ, μέσω ενός φωτοευαισθητοποιητή που υπάρχει στα σφαιρίδια «δότη», το ατμοσφαιρικό οξυγόνο μεταπίπτει στη διεγερμένη κατάσταση του μονήρους οξυγόνου (singlet oxygen). Τα μόρια του μονήρους οξυγόνου διαχέονται και αντιδρούν με μία χημειοφωταυγή ουσία στα σφαιρίδια δέκτη που ενεργοποιεί επιπλέον φθοροφόρα που περιέχονται μέσα στα ίδια σφαιρίδια. Τα φθοροφόρα στη συνέχεια εκπέμπουν φως στα 520 έως 620 nm. Η ανίχνευση σήματος επιτυγχάνεται με τη χρήση plate readers όπως το σύστημα EnVision™ Multilabel Plate Reader, το Fusion-Alpha™ Multilabel Reader, ή το AlphaQuest® HTS Microplate Analyzer. In some preferred embodiments, the technique for primary mass screening is based on Perkin Elmer's AlphaScreen™ Luminescence-Enhanced Homogeneous Proximity Assay method. The AlphaScreen™ technique is based on the use of "donor" beads and "acceptor" beads coated with a hydrogel layer that provides functional groups for bioconjugation. When a biological interaction between the molecules (such as protein complex formation) brings the beads into close proximity, a series of chemical reactions takes place to produce a greatly amplified signal. During laser excitation, through a photosensitizer present in the "donor" beads, atmospheric oxygen transitions to the excited state of singlet oxygen. The singlet oxygen molecules diffuse and react with a chemiluminescent substance in the receiver beads that activates additional fluorophores contained within the same beads. The fluorophores then emit light at 520 to 620 nm. Signal detection is achieved using plate readers such as the EnVision™ Multilabel Plate Reader system, the Fusion-Alpha™ Multilabel Reader, or the AlphaQuest® HTS Microplate Analyzer.
Μία άλλη κατάλληλη μέθοδος ανάλυσης πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων είναι η Ανάλυση Εγγύτητας Σπινθηρισμού (SPA) της οποίας η χρήση σε μαζικούς ελέγχους υψηλής απόδοσης περιγράφεται σε αρκετές αναφορές (για παράδειγμα Zhang SP et al., J Biomol Screen. 2006 Sep; Vol 11(6), pp. 672-7). Στην SPA, η εγγύτητα δύο πρωτεϊνών που είναι σημασμένες με ιχνηθέτες ανιχνεύεται από την επαγωγή ενός σήματος που οφείλεται στην αλληλεπίδραση των ιχνηθετών. Για παράδειγμα η μία πρωτεΐνη μπορεί να έχει σημανθεί με ραδιενεργό ιώδιο<125>\ και η δεύτερη πρωτεΐνη με έναν κατάλληλο αποσβέστη (quencher). Το επαγόμενο σήμα προσμετράται σε έναν μετρητή σπινθηρισμού. Another suitable method for analyzing protein interactions is the Scintillation Proximity Assay (SPA) whose use in high-throughput mass screening is described in several reports (for example Zhang SP et al., J Biomol Screen. 2006 Sep; Vol 11(6), pp. 672-7). In SPA, the proximity of two proteins labeled with probes is detected by the induction of a signal due to the interaction of the probes. For example one protein can be labeled with radioactive iodine<125>\ and the second protein with a suitable quencher. The induced signal is counted in a scintillation counter.
Μία άλλη επίσης κατάλληλη τεχνική είναι η Μεταφορά Συντονισμένης Ενέργειας Φθορισμού, όπου η μεταφορά ενέργειας παρατηρείται ως μια μείωση στην ένταση εκπομπής και τη διάρκεια ζωής φθορισμού από ένα υψηλότερης ενέργειας φθοροφόρο (δότης) σε ένα χαμηλότερης ενέργειας φθοροφόρο (δέκτης). Για να συμβεί αυτή η μεταφορά ενέργειας, το φάσμα εκπομπής του ανιχνευτή δότη πρέπει να επικαλύπτεται σημαντικά με το φάσμα απορρόφησης του ανιχνευτή δέκτη, όπως συμβαίνει για παράδειγμα με τους ιχνηθέτες CFP και YFP. Another also suitable technique is Fluorescence Tuned Energy Transfer, where energy transfer is observed as a decrease in emission intensity and fluorescence lifetime from a higher energy fluorophore (donor) to a lower energy fluorophore (acceptor). For this energy transfer to occur, the emission spectrum of the donor probe must overlap significantly with the absorption spectrum of the acceptor probe, as is the case for example with the CFP and YFP probes.
Η τεχνική της Ομοιογενούς Ανάλυσης Φθορισμού Χρονικής Ευκρίνειας συνδυάζει την τεχνολογία FRET με την χρονική ανάλυση του φθορισμού, που επιτρέπει την απόσβεση του βραχύβιου φθορισμού υποβάθρου. Το σήμα ανιχνεύεται με τη χρήση συσκευών μέτρησης μικροπλακών που είναι σχεδιασμένες για να εκτελούν ομοιογενείς μετρήσεις φθορισμού χρονικής ανάλυσης, όπως τα συστήματα PHERAstar και RUBYstar από την BMG Labtech. The Homogeneous Time-Resolved Fluorescence Analysis technique combines FRET technology with fluorescence time resolution, which allows quenching of short-lived background fluorescence. The signal is detected using microplate counters designed to perform homogeneous time-resolved fluorescence measurements, such as the PHERAstar and RUBYstar systems from BMG Labtech.
Η τεχνική της Φθορίζουσας Πόλωσης του Φωτός βασίζεται στην διέγερση ενός φθοροφόρου με φως το οποίο είναι γραμμικά πολωμένο με πέρασμα μέσα από ένα φίλτρο διέγερσης πόλωσης . Ο πολωμένος φθορισμός μετράται μέσω ενός πολωτή εκπομπής είτε παράλληλα είτε κάθετα προς το επίπεδο πόλωσης του διεγέρτη. Λαμβάνονται δύο μετρήσεις έντασης και χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της πόλωσης φθορισμού. Η χρήση της τεχνικής σε μαζικούς ελέγχους υψηλής απόδοσης περιγράφεται σε αρκετές αναφορές (όπως Wang L. et al. Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program [Internet}. Bethesda (MR)· National Center for Biotechnology Information (US); 2010). The Fluorescent Light Polarization technique is based on the excitation of a fluorophore with light that is linearly polarized by passing through a polarization excitation filter. Polarized fluorescence is measured by means of an emission polarizer either parallel or perpendicular to the plane of excitation polarization. Two intensity measurements are taken and used to calculate the fluorescence bias. The use of the technique in high-throughput mass screening is described in several reports (such as Wang L. et al. Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program [Internet}. Bethesda (MR); National Center for Biotechnology Information (US); 2010).
Η Φασματοσκοπία Συσχέτισης Φθορισμού μετρά την αυθόρμητη διακύμανση της εντάσεως φθορισμού που προκαλείται από τις πολύ μικρές αποκλίσεις σε φυσικές παραμέτρους όπως η θερμική ισορροπία. Για την ανίχνευση των διακυμάνσεων χρησιμοποιείται συνήθως ένας σωλήνας φωτοπολλαπλασιαστή, μία Φωτοδίοδος Χιονοστιβάδας ή ένας ανιχνευτής μονού φωτονίου υπεραγώγιμων νανοκαλωδίων. Fluorescence Correlation Spectroscopy measures the spontaneous variation of fluorescence intensity caused by very small deviations in physical parameters such as thermal equilibrium. A photomultiplier tube, an Avalanche Photodiode, or a superconducting nanowire single-photon detector is typically used to detect the fluctuations.
Σύμφωνα με μία ενσωμάτωση της παρούσας, ο παράγοντας είναι ένα συστατικό μιας βιβλιοθήκης (συλλογής) ενώσεων. Μια βιβλιοθήκη ενώσεων κατάλληλη για τους σκοπούς της παρούσας εφεύρεσης είναι μία μικρομοριακή βιβλιοθήκη ενώσεων ή ένα υποσύνολο αυτής. Μια μικρομοριακή βιβλιοθήκη ενώσεων αποτελείται από οργανικές ενώσεις οι οποίες έχουν μοριακό βάρος που δεν υπερβαίνει τα 800 g / mol (800 Dalton). According to one embodiment of the present, the agent is a component of a library (collection) of compounds. A compound library suitable for the purposes of the present invention is a small molecule compound library or a subset thereof. A micromolecular compound library consists of organic compounds which have a molecular weight not exceeding 800 g/mol (800 Dalton).
Μέθοδοι σύνθεσης βιβλιοθηκών χημικών ενώσεων παρέχονται στην επιστημονική βιβλιογραφία (βλ. για παράδειγμα Thompson LA and Ellman JA. Chem Rev. 1996 Feb 1; Vol 96(1), pp. 555-600, και Rademacher C, Seeberger PH. Handb Exp Pharmacol. 2015 Sep 2; pp 1-17). Επίσης βιβλιοθήκες χημικών ενώσεων διατίθενται στο εμπόριο από εξειδικευμένους παρόχους καθώς και στα κέντρα μοριακού ελέγχου όπως το the Broad Institute (ΜΑ, USA) και το Scripps Research Institute Molecular Screening Center (FL, USA). Methods for synthesizing libraries of chemical compounds are provided in the scientific literature (see for example Thompson LA and Ellman JA. Chem Rev. 1996 Feb 1; Vol 96(1), pp. 555-600, and Rademacher C, Seeberger PH. Handb Exp Pharmacol. 2015 Sep 2; pp 1-17). Compound libraries are also commercially available from specialized providers as well as from molecular screening centers such as the Broad Institute (MA, USA) and the Scripps Research Institute Molecular Screening Center (FL, USA).
Σε κάποιες ενσωματώσεις, το εν λόγω σύστημα μπορεί να είναι ένα σύστημα ελεύθερο κυπάρων. Σε κάποια ενσωμάτωση ή πρωτεΐνη Geminin, η πρωτεΐνη Cdt1 ή αμφότερες παρέχεται ως απομονωμένη πρωτεΐνη. Αρκετές τεχνικές είναι διαθέσιμες για την απομόνωση πρωτεϊνών και περιλαμβάνουν τεχνικές χρωματογραφίας, για παράδειγμα χρωματογραφία συγγένειας που χρησιμοποιείται συχνά και για τον καθαρισμό πρωτεϊνών που φέρουν τον επίτοπο His tag, τεχνικές ηλεκτροφόρησης για παράδειγμα σε πηκτώματα SDS-PAGE, υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), ανοσοκατακρήμνιση (η οποία είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την απομόνωση πρωτεϊνών στις οποίες έχει προσδεθεί ομοιοπολικά ένας πεπτιδικός επίτοπος), κλπ. In some embodiments, said system may be a cell-free system. In some embodiment or Geminin protein, the Cdt1 protein or both is provided as an isolated protein. Several techniques are available for protein isolation and include chromatographic techniques, for example affinity chromatography which is also often used to purify proteins bearing the His tag epitope, electrophoresis techniques for example in SDS-PAGE gels, high performance liquid chromatography (HPLC), immunoprecipitation (which is particularly useful for isolating proteins to which a peptide epitope has been covalently attached), etc.
Σε κάποιες άλλες ενσωματώσεις η πρωτεΐνη Geminin, η πρωτεΐνη Cdt1 ή αμφότερες παρέχεται ως κυτταρικό εκχύλισμα. Σε μία ενσωμάτωση, το κυτταρικό εκχύλισμα είναι από ζυμομύκητες, φυτά, θηλαστικά, ή αμφίβια. Σε μία άλλη ενσωμάτωση, το κυπαρικό εκχύλισμα είναι ένα εκχύλισμα από ευκαρυωτικά δικτυοκύτταρα, π.χ., εκχύλισμα από δικτυοκύτταρα κουνελιού. Σε μία ακόμα ενσωμάτωση, το κυτταρικό εκχύλισμα είναι ένα εκχύλισμα κυτταρικής καλλιέργειας ιστού θηλαστικού, π χ., ένα κυτταροπλασματικό εκχύλισμα (S100) κυπάρων HeLa, το οποίο μπορεί να έχει ή να μην έχει υποστεί διαμόλυνση με φορείς έκφρασης μιας πρωτεΐνης Geminin, μιας πρωτεΐνης Cdt1 , μιας πρωτεΐνης Geminin που έχει ομοιοπολικά προσδεθεί σε έναν πεπτιδικό επίτοπο ή έναν ανιχνεύσιμο ιχνηθέτη, μιας πρωτεΐνης Cdt1 που έχει ομοιοπολικά προσδεθεί σε έναν πεπτιδικό επίτοπο ή έναν ανιχνεύσιμο ιχνηθέτη, ή οποιουδήποτε συνδυασμού αυτών. In some other embodiments the Geminin protein, the Cdt1 protein, or both are provided as a cell extract. In one embodiment, the cell extract is from yeast, plant, mammal, or amphibian. In another embodiment, the cell extract is a eukaryotic reticulocyte extract, e.g., rabbit reticulocyte extract. In a further embodiment, the cell extract is a mammalian tissue cell culture extract, e.g., a cytoplasmic extract (S100) of HeLa cells, which may or may not have been transfected with expression vectors of a Geminin protein, a Cdt1 protein , a Geminin protein covalently attached to a peptide epitope or a detectable tracer, a Cdt1 protein covalently attached to a peptide epitope or a detectable tracer, or any combination thereof.
Σε κάποιες επιπλέον ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, παρέχεται ένας δεύτερος προσδιορισμός (assay) για την ποσοτικοποίηση της ικανότητας διάσπασης ή αναστολής σχηματισμού του συμπλόκου Geminin-Cdt1 από τις επιλεχθείσες συνθετικές χημικές ενώσεις. Πρόκειται για μία διαδικασία ελέγχου της ειδικότητας και της ισχύος της δράσης των επιλεχθεισών συνθετικών χημικών ενώσεων όσον αφορά τη διάσπαση του συμπλόκου Geminin-Cdt1 . In some additional embodiments of the present invention, a second assay is provided to quantify the ability of the selected synthetic compounds to disrupt or inhibit formation of the Geminin-Cdt1 complex. This is a procedure to check the specificity and the potency of the action of the selected synthetic chemical compounds in terms of breaking up the Geminin-Cdt1 complex.
Σε κάποιες ενσωματώσεις ο εν λόγω δεύτερος προσδιορισμός είναι ένας κατάλληλος ελεύθερος κυπάρων in vitro προσδιορισμός. Ο in vitro προσδιορισμός μπορεί να επιλεχθεί, χωρίς να περιορίζεται το εύρος των δυνατών επιλογών, από μια ομάδα που περιλαμβάνει την τεχνική Συντονισμού Επιφανειακών Πλασμονιων, τη Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού με πυρηνικό φαινόμενο Overhauser (Transferred-ΝΟΕ Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy), τη Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού Διαφορικής Μεταφοράς Κορεσμού (Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy), τη Συμβολομετρία Διπλής Πόλωσης, τη Δυναμική Σκέδαση Φωτός, τη Φασματοσκοπία Σχετικού Συσχετισμού Φθορισμού, και τη Θερμοφόρεση Μικροκλίμακας. In some embodiments said second assay is a suitable cell-free in vitro assay. The in vitro assay can be selected, without limiting the range of possible options, from a group that includes the technique of Surface Plasmon Resonance, Overhauser Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Transferred-NOE Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy), Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Dual Polarization Interferometry, Dynamic Light Scattering, Correlation Fluorescence Spectroscopy, and Microscale Thermophoresis.
Σε κάποια ενσωμάτωση ο δεύτερος προσδιορισμός περιλαμβάνει την τεχνική Συντονισμού Επιφανειακών Πλασμονιων. Η τεχνική βασίζεται στην ύπαρξη ενός παροδικού ηλεκτρομαγνητικού πεδίου πάνω σε μια μεταλλική επιφάνεια, πάνω στην οποία έχει προσδεθεί π.χ. μία πρώτη πρωτεΐνη, και στη μέτρηση της μεταβολής του δείκτη διάθλασης του ρυθμιστικού διαλύματος κοντά στην μεταλλική επιφάνεια, λόγω π.χ της πρόσδεσης μιας δεύτερης πρωτεΐνης πάνω στην ακινητοποιημένη πρώτη πρωτεΐνη. Όταν ένα μονοχρωματικό, γραμμικά πολωμένο φως προσπέσει στην επιφάνεια του μεταλλικού αγωγού δημιουργείται ένα ηλεκτρομαγνητικό κύμα που αλληλεπιδρά με το νέφος ελεύθερων ηλεκτρονίων που υπάρχει πάνω στην μεταλλική επιφάνεια, δημιουργώντας κύματα πυκνότητας φορτίου ηλεκτρονίων που ονομάζονται πλασμόνια και μειώνουν την ένταση του ανακλώμενου φωτός. Η τεχνική αυτή είναι αυτοματοποιημένη και δεν απαιτεί την ύπαρξη ομοιοπολικά προοδεμένων ιχνηθετών πάνω στην πρωτεΐνη-στόχο. Το ανακλώμενο φως ανιχνεύεται με κατάλληλες συσκευές όπως π.χ. η Biacore Τ100 ή Τ200 (GE Healthcare). In some embodiment the second determination includes the Surface Plasmon Tuning technique. The technique is based on the existence of a transient electromagnetic field on a metal surface, on which it has been attached e.g. a first protein, and in measuring the change in the refractive index of the buffer near the metal surface, due to e.g. the binding of a second protein on the immobilized first protein. When monochromatic, linearly polarized light strikes the surface of the metal conductor, an electromagnetic wave is created that interacts with the cloud of free electrons on the metal surface, creating electron charge density waves called plasmons that reduce the intensity of the reflected light. This technique is automated and does not require the presence of covalently attached probes on the target protein. The reflected light is detected by suitable devices such as e.g. the Biacore T100 or T200 (GE Healthcare).
Σε κάποιες άλλες ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, ο εν λόγω δεύτερος προσδιορισμός για την ποσοτικοποίηση της ικανότητας διάσπασης ή αναστολής σχηματισμού του συμπλόκου Geminin-Cdt1 από τις επιλεχθείσες συνθετικές χημικές ενώσεις επιτελείται σε ένα κυπαρικό σύστημα. Το κυπαρικό σύστημα μπορεί να περιλαμβάνει κύπαρα θηλαστικού, όπως ανθρώπου, ποντικού, ή αρουραίου, κύτταρα μύκητα, ή βακτηρίου για παράδειγμα. Τα κύτταρα μπορεί να είναι φυσιολογικά, όπως για παράδειγμα μια καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων, κύπαρα αθανατοποιημένα, όπως για παράδειγμα επιθηλιακά κύτταρα από αδενοκαρκίνωμα μαστού (MCF7), ή καρκινικά κύτταρα από όγκο. In some other embodiments of the present invention, said second assay for quantifying the ability to disrupt or inhibit formation of the Geminin-Cdt1 complex by the selected synthetic chemical compounds is performed in a cellular system. The cellular system may include mammalian, such as human, mouse, or rat cells, fungal, or bacterial cells for example. The cells may be normal, such as a culture of primary cells, immortalized cells, such as epithelial cells from breast adenocarcinoma (MCF7), or cancer cells from a tumor.
Σε κάποιες ενσωματώσεις, για την πραγματοποίηση του δεύτερου προσδιορισμού παρέχεται στο κύτταρο εξωγενώς η πρωτεΐνη Geminin, η πρωτεΐνη Cdt1 ή αμφότερες, παρέχοντας στο κύτταρο ένα νουκλεϊκά οξύ που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Geminin, την πρωτεΐνη Cdt1 ή και τις δύο. Σε κάποιες προτιμώμενες ενσωματώσεις, παρέχονται στο κύτταρο δύο φορείς έκφρασης. Ο πρώτος φορέας έκφρασης περιλαμβάνει ένα πολυνουκλεοτίδιο που κωδικοποιεί μια υβριδική πρωτεΐνη στην οποία μία πρωτεΐνη Geminin πλήρους μήκους ή τμήμα αυτής έχει ομοιοπολικά προσδεθεί σε έναν ανιχνεύσιμα ιχνηθέτη. Ο δεύτερος φορέας έκφρασης περιλαμβάνει ένα πολυνουκλεοτίδιο που κωδικοποιεί μια υβριδική πρωτεΐνη πλήρους μήκους, ένα τμήμα αυτής με ικανότητα πρόσδεσης στην πρωτεΐνη Geminin, ή μία μεταλλαγμένη μορφή που εμφανίζει μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης στην πρωτεΐνη Geminin, στην οποία η πρωτεΐνη Cdt1 έχει ομοιοπολικά προσδεθεί σε έναν ανιχνεύσιμο ιχνηθέτη. Η μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης Cdt1 που εμφανίζει μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης στην πρωτεΐνη Geminin μπορεί να είναι μια σημειακά μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης Cdt1 , ή μια έλλειψη (deletion) η οποία αφαιρεί ορισμένα αμινοξέα οπό την αλληλουχία της πρωτεΐνης Cdt1. In some embodiments, to perform the second determination, the Geminin protein, the Cdt1 protein, or both are exogenously provided to the cell by providing the cell with a nucleic acid encoding the Geminin protein, the Cdt1 protein, or both. In some preferred embodiments, two expression vectors are provided to the cell. The first expression vector comprises a polynucleotide encoding a hybrid protein in which a full-length Geminin protein or a fragment thereof has been covalently attached to a detectable label. The second expression vector comprises a polynucleotide encoding a full-length hybrid protein, a portion thereof capable of binding to the Geminin protein, or a mutant form exhibiting a reduced ability to bind the Geminin protein, in which the Cdt1 protein has been covalently attached to a detectable label . The mutant form of the Cdt1 protein that shows reduced ability to bind to the Geminin protein can be a point mutant form of the Cdt1 protein, or a deletion that removes some amino acids from the Cdt1 protein sequence.
Ο πρώτος ή ο δεύτερος ή αμφότεροι οι φορείς έκφρασης μπορεί να επιλεχθούν, χωρίς να περιορίζεται το εύρος των δυνατών επιλογών, από μια ομάδα που περιλαμβάνει βακτηριακούς ή ιικούς φορείς έκφρασης, ή φορείς έκφρασης θηλαστικών, βακιλοϊών ή ζυμομυκήτων ή συνδυασμός αυτών. Κατά προτίμηση οι φορείς έκφρασης είναι φορείς έκφρασης θηλαστικών. The first or second or both expression vectors may be selected, without limiting the range of possible options, from a group comprising bacterial or viral expression vectors, or mammalian, bacillovirus or yeast expression vectors, or a combination thereof. Preferably the expression vectors are mammalian expression vectors.
Τα κατάλληλα κύτταρα μπορούν να διαμολυνθούν παροδικά ή μόνιμα με ένα ή περισσότερα νουκλεϊκά οξέα που εκφράζει μια πρωτεΐνη Geminin, μία πρωτεΐνη Cdt1 ή αμφότερες. Το ή τα νουκλεϊκά οξέα μπορεί να εισαχθούν σε κύτταρα π.χ. χρησιμοποιώντας έναν ιό ως φορέα ή με διαμόλυνση συμπεριλαμβανομένης π.χ. της χημικής διαμόλυνσης (όπως με Λιποφεκταμίνη, Fugene, κλπ), ηλεκτροδιάτρηση (Electroporation), συν-καταβύθιση με φωσφορικό ασβέστιο ή άμεση διάχυση του DNA. Appropriate cells can be transiently or permanently transfected with one or more nucleic acids expressing a Geminin protein, a Cdt1 protein, or both. The nucleic acid(s) can be introduced into cells e.g. using a virus as a vector or by transfection including e.g. of chemical transfection (such as with Lipofectamine, Fugene, etc.), electroporation (Electroporation), co-precipitation with calcium phosphate or direct diffusion of the DNA.
Σε κάποιες ενσωματώσεις ο δεύτερος προσδιορισμός περιλαμβάνει την τεχνική Μεταφοράς Φθορίζουσας Συντονισμένης Ενέργειας ή την τεχνική Μεταφοράς Συντονισμένης Ενέργειας Βιοφωταύγεϊας. Σε μία προτιμώμένη ενσωμάτωση, ο δεύτερος προσδιορισμός περιλαμβάνει την τεχνική μεταφοράς φθορίζουσας συντονισμένης ενέργειας κατόπιν φωτολεύκανσης του «δέκτη» (FRET Acceptor Photobleaching). Η εν λόγω τεχνική καθιστά δυνατή τη μελέτη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων ex vivo και βασίζεται στην καταγραφή της έντασης φθορισμού του «δότη», πριν και μετά τη φωτολεύκανση του δέκτη, η οποία προκαλείται μέσω πολύ έντονης διέγερσης του δέκτη στο κατάλληλο μήκος κύματος απορρόφησης. Η φωτολεύκανση των μορίων του φθορίζοντος μορίου-δέκτη έχει ως αποτέλεσμα να απωλέσουν αυτά την ιδιότητα φθορισμού τους και κατ' επέκταση την ικανότητά τους να απορροφούν την εκπεμπόμενη ενέργεια από τον «δότη». Απουσία φωτολεύκανσης του «δέκτη», παρατηρείται ελάττωση της έντασης φθορισμού του «δότη», λόγω του ότι η ενέργεια που εκπέμπει μεταφέρεται και απορροφάται από τα μόρια του «δέκτη». Ωστόσο, σε περίπτωση φωτολεύκανσης του «δέκτη» και εφόσον παράλληλα υπάρχει φαινόμενο FRET, παρατηρείται φαινομενική αύξηση της έντασης φθορισμού του «δότη», καθότι η ενέργεια του τελευταίου δεν είναι δυνατόν να απορροφηθεί από τα μόρια του «δέκτη». In some embodiments, the second determination comprises the Fluorescent Co-ordinated Energy Transfer technique or the Bioluminescence Co-ordinated Energy Transfer technique. In a preferred embodiment, the second assay involves the FRET Acceptor Photobleaching technique. This technique enables the study of protein interactions ex vivo and is based on the recording of the fluorescence intensity of the "donor", before and after photobleaching of the acceptor, which is caused by very strong excitation of the acceptor at the appropriate absorption wavelength. The photobleaching of the molecules of the fluorescent acceptor molecule causes them to lose their fluorescent property and, by extension, their ability to absorb the energy emitted by the "donor". In the absence of photobleaching of the "acceptor", a decrease in the fluorescence intensity of the "donor" is observed, due to the fact that the energy it emits is transferred and absorbed by the molecules of the "acceptor". However, in case of photobleaching of the "acceptor" and if at the same time there is a FRET effect, an apparent increase in the fluorescence intensity of the "donor" is observed, since the latter's energy cannot be absorbed by the molecules of the "acceptor".
Σε κάποιες ενσωματώσεις, ο πρωτογενής μαζικός έλεγχος επιλογής χημικών ενώσεων με ικανότητα διάσπασης ή/και να αναστολής σχηματισμού ενός συμπλόκου των πρωτεϊνών Geminin-Cdt1 , ο δεύτερος προσδιορισμός για την ποσοτικοποίηση της ικανότητας των επιλεχθέντων παραγόντων να διασπούν ή να αναστέλλουν τον σχηματισμό ενός συμπλόκου Geminin-Cdt1 σε ένα σύστημα που περιλαμβάνει απομονωμένες πρωτεΐνες, κυτταρικά εκχυλίσματα ή συνδυασμό αυτών, και ο δεύτερος προσδιορισμός για την ποσοτικοποίηση της ικανότητας των επιλεχθέντων παραγόντων να διασπούν ή να αναστέλλουν τον σχηματισμό ενός συμπλόκου Geminin-Cdt1 σε ένα κυτταρικό σύστημα, επιτελούνται διαδοχικά: In some embodiments, the primary mass screening selects compounds with the ability to disrupt and/or inhibit formation of a Geminin-Cdt1 complex, the second assay to quantify the ability of the selected agents to disrupt or inhibit the formation of a Geminin-Cdt1 complex Cdt1 in a system comprising isolated proteins, cell extracts, or a combination thereof, and the second assay to quantify the ability of the selected agents to disrupt or inhibit the formation of a Geminin-Cdt1 complex in a cell system, are performed sequentially:
Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται επίσης στη μελέτη της επίδρασης των επιλεχθεισών συνθετικών χημικών ενώσεων στον κυτταρικό κύκλο κυττάρων που διαιρούνται ανεξέλεγκτα όπως τα καρκινικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών κυττάρων και στην επιλεκτική ανασταλτική επίδραση των επιλεχθεισών ενώσεων όσον αφορά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων. The present invention also relates to the study of the effect of selected synthetic chemical compounds on the cell cycle of uncontrollably dividing cells such as cancer cells versus normal cells and the selective inhibitory effect of the selected compounds on the cell cycle progression of cancer cells.
Τα εν λόγω κύτταρα μπορεί να προέρχονται από θηλαστικό, όπως ο άνθρωπος, ο ποντικός, ή ο αρουραίος. Τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι κύτταρα αθανατοποιημένα, όπως για παράδειγμα επιθηλιακά κύτταρα από αδενοκαρκίνωμα μαστού (MCF7), ή κύτταρα από όγκο για παράδειγμα, ή να προέρχονται από μια καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων. Τα φυσιολογικά κύτταρα μπορεί να προέρχονται από μια καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων όπως οι εμβρυϊκοί ινοβλάστες μυός ή από φυσιολογικό ιστό. Said cells may be of mammalian origin, such as human, mouse, or rat. Cancer cells may be immortalized cells, such as for example epithelial cells from breast adenocarcinoma (MCF7), or cells from a tumor for example, or derived from a primary cell culture. Normal cells may be derived from a culture of primary cells such as embryonic muscle fibroblasts or from normal tissue.
Τα κύτταρα καλλιεργούνται παρουσία των επιλεχθεισών συνθετικών χημικών ενώσεων σε ελεγχόμενες ex vivo συνθήκες. Τα καρκινικά και τα φυσιολογικά κύτταρα διαχωρίζονται στη συνέχεια με βάση την ποσότητα του γενετικού τους υλικού με την χρήση τεχνικών όπως η κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο για παράδειγμα. Κύτταρα τα οποία βρίσκονται στην φάση G1 χαρακτηρίζονται από διπλοειδή ποσότητα γενετικού υλικού (2Ν), ενώ κύτταρα της φάσης Μ χαρακτηρίζονται από διπλάσια ποσότητα γενετικού υλικού (4Ν). Κύτταρα της φάσης S εμφανίζουν ενδιάμεσα αντίστοιχα χαρακτηριστικά. Cells are cultured in the presence of the selected synthetic chemicals under controlled ex vivo conditions. Cancer and normal cells are then separated based on the amount of their genetic material using techniques such as flow cytometry after staining with propidium iodide for example. Cells that are in the G1 phase are characterized by a double amount of genetic material (2N), while cells in the M phase are characterized by a double amount of genetic material (4N). S-phase cells display intermediate corresponding characteristics.
Σε κάποιες ενσωματώσεις, ο πρωτογενής μαζικός έλεγχος επιλογής χημικών ενώσεων με ικανότητα διάσπασης ή/και να αναστολής σχηματισμού ενός συμπλόκου των πρωτεϊνών Geminin-Cdt1 , ο δεύτερος προσδιορισμός για την ποσοτικοποίηση της ικανότητας των επιλεχθέντων παραγόντων να διασπούν ή να αναστέλλουν τον σχηματισμό ενός συμπλόκου Geminin-Cdt1 σε ένα σύστημα που περιλαμβάνει απομονωμένες πρωτεΐνες, κυτταρικά εκχυλίσματα ή συνδυασμό αυγών, ο δεύτερος προσδιορισμός για την ποσοτικοποίηση της ικανότητας των επιλεχθέντων παραγόντων να διασπούν ή να αναστέλλουν τον σχηματισμό ενός συμπλόκου Geminin-Cdt1 σε ένα κυτταρικό σύστημα, και ο κυτταρικός προσδιορισμός της ικανότητας των επιλεχθέντων παραγόντων να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων έναντι των φυσιολογικών κυττάρων, επιτελούνται διαδοχικά. In some embodiments, the primary mass screening selects compounds with the ability to disrupt and/or inhibit formation of a Geminin-Cdt1 complex, the second assay to quantify the ability of the selected agents to disrupt or inhibit the formation of a Geminin-Cdt1 complex Cdt1 in a system comprising isolated proteins, cell extracts or egg combination, the second assay to quantify the ability of selected agents to disrupt or inhibit the formation of a Geminin-Cdt1 complex in a cell system, and the cellular assay of the ability of of selected agents to inhibit the proliferation of cancer cells versus normal cells, are performed sequentially.
Σύμφωνα με μια περαιτέρω ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, παρέχεται μία μέθοδος μαζικού ελέγχου για έναν παράγοντα που ρυθμίζει ή/και εμποδίζει τον ανώμαλο κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει μια μέθοδο προσδιορισμού της ικανότητας ενός παράγοντα να διασπά ή/και να αναστέλλει το σχηματισμό ενός συμπλόκου των πρωτεϊνών Geminin-Cdt1 , όπως αυτή περιγράφεται στην παρούσα εφεύρεση. Ο παράγοντας είναι ένα συστατικό μιας βιβλιοθήκης ενώσεων, όπως για παράδειγμα μία μικρομοριακή βιβλιοθήκη ενώσεων ή ένα υποσύνολο αυτής. According to a further embodiment of the present invention, there is provided a method of mass screening for an agent that regulates and/or inhibits abnormal cell proliferation. Said method includes a method for determining the ability of an agent to disrupt and/or inhibit the formation of a Geminin-Cdt1 protein complex, as described in the present invention. The agent is a component of a compound library, such as a small molecule compound library or a subset thereof.
Η ως άνω μέθοδος μαζικού ελέγχου για έναν παράγοντα που ρυθμίζει ή/και εμποδίζει τον ανώμαλο κυτταρικό πολλαπλασιασμό μπορεί επίσης να περιλαμβάνει έναν δεύτερο προσδιορισμό για την ποσοτικοποίηση της ικανότητας των επιλεχθέντων παραγόντων να διασπούν ή να αναστέλλουν τον σχηματισμό ενός συμπλόκου Geminin-Cdt1 σε ένα σύστημα που περιλαμβάνει απομονωμένες πρωτεΐνες, κυτταρικά εκχυλίσματα ή συνδυασμό αυτών, όπως περιγράφεται στην παρούσα εφεύρεση ή/και έναν δεύτερο προσδιορισμό για την ποσοτικοποίηση της ικανότητας των επιλεχθέντων παραγόντων να διασπούν ή να αναστέλλουν τον σχηματισμό ενός συμπλόκου Geminin-Cdt1 σε ένα κυτταρικό σύστημα όπως περιγράφεται στην παρούσα εφεύρεση. Τέλος η μέθοδος μαζικού ελέγχου για έναν παράγοντα που ρυθμίζει ή/και εμποδίζει τον ανώμαλο κυτταρικό πολλαπλασιασμό μπορεί να περιλαμβάνει και έναν κυτταρικό προσδιορισμό της ικανότητας των επιλεχθέντων παραγόντων να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων έναντι των φυσιολογικών κυττάρων όπως ορίζεται στην παρούσα εφεύρεση. The above method of mass screening for an agent that regulates and/or inhibits aberrant cell proliferation may also include a second assay to quantify the ability of the selected agents to disrupt or inhibit the formation of a Geminin-Cdt1 complex in a system that comprises isolated proteins, cell extracts or a combination thereof, as described in the present invention and/or a second assay to quantify the ability of selected agents to disrupt or inhibit the formation of a Geminin-Cdt1 complex in a cell system as described in the present invention . Finally, the mass screening method for an agent that regulates and/or inhibits abnormal cell proliferation may also include a cellular assay of the ability of the selected agents to inhibit the proliferation of cancer cells against normal cells as defined in the present invention.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης κιτ για τον προσδιορισμό της ικανότητας ενός παράγοντα να διασπά ή/και να αναστέλλει το σχηματισμό ενός συμπλόκου των πρωτεϊνών Geminin-Cdt1. Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, το κιτ περιλαμβάνει α) ένα φορέα έκφρασης που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη Geminin πλήρους μήκους ή τμήμα αυτής, όπου η εν λόγω πρωτεΐνη Geminin έχει ομοιοπολικά προσδεθεί σε έναν πεπτιδικό επίτοπο ή έναν ανιχνεύσιμο ιχνηθέτη, β) ένα φορέα έκφρασης που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη Cdt1, όπου η εν λόγω Cdt1 πρωτεΐνη είναι μια πρωτεΐνη πλήρους μήκους, ένα τμήμα αυτής, ή μία μεταλλαγμένη μορφή που εμφανίζει μειωμένη πρόσδεση στην πρωτεΐνη Geminin, και όπου η εν λόγω Cdt1 πρωτεΐνη έχει ομοιοπολικά προσδεθεί σε έναν πεπτιδικό επίτοπο ή έναν ανιχνεύσιμο ιχνηθέτη, και γ) ένα φυλλάδιο οδηγιών. The present invention also provides kits for determining the ability of an agent to disrupt and/or inhibit the formation of a complex of Geminin-Cdt1 proteins. According to the present invention, the kit comprises a) an expression vector encoding a full-length Geminin protein or a fragment thereof, wherein said Geminin protein has been covalently attached to a peptide epitope or a detectable marker, b) an expression vector encoding a Cdt1 protein, wherein said Cdt1 protein is a full-length protein, a fragment thereof, or a mutant form that exhibits reduced binding to the Geminin protein, and wherein said Cdt1 protein is covalently attached to a peptide epitope or a detectable tracer , and c) an instruction booklet.
Ο πρώτος ή ο δεύτερος ή αμφότεροι οι φορείς έκφρασης μπορεί να επιλεχθούν, χωρίς να περιορίζεται το εύρος των δυνατών επιλογών, από μια ομάδα που περιλαμβάνει βακτηριακούς ή ιικούς φορείς έκφρασης, ή φορείς έκφρασης θηλαστικών, βακιλοϊών ή ζυμομυκήτων ή συνδυασμό αυτών. The first or second or both expression vectors may be selected, without limiting the range of possible options, from a group comprising bacterial or viral expression vectors, or mammalian, bacillovirus or yeast expression vectors, or a combination thereof.
Παραδείγματα Examples
Τα επόμενα παραδείγματα δίδονται για λόγους επεξήγησης των διαφόρων ενσωματώσεων της παρούσας εφεύρεσης και δεν νοούνται κατά κανένα τρόπο ως περιορισμοί της παρούσας εφεύρεσης. The following examples are provided for purposes of illustration of the various embodiments of the present invention and are in no way intended as limitations of the present invention.
Παράδειγμα 1 Example 1
Πειραματικός σχεδιασμός της μεθόδου μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης Experimental design of the high-throughput mass screening method
Η εφαρμογή της μεθόδου μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης βασίστηκε στην τεχνολογία AlphaScreen™. Ως μόρια στόχος χρησιμοποιήθηκε ή μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΔDBGeminin και η σημειακά μεταλλαγμένη πρωτεΐνη miniCdt1Y170A. Η πρωτεϊνική μορφή ΔDBGeminin αντιστοιχεί στην αμινοξική περιοχή 28-209 του ορθολόγου της πρωτεΐνης στον άνθρωπο, με άλλα λόγια στερείται των αμινοξικών καταλοίπων 1-27, τα οποία έχει δειχθεί ότι είναι απαραίτητα για την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης (McGarry & Kirschner, Cell. 1998, Vol. 93(6), pp 1043-53). Η απαλοιφή των αμινοξικών καταλοίπων 1-27 πραγματοποιήθηκε για να αποφευχθούν προβλήματα με την σταθερότητα του μορίου. The implementation of the high-throughput mass screening method was based on AlphaScreen™ technology. Either ΔDBGeminin mutant protein and miniCdt1Y170A point mutant protein were used as target molecules. The ΔDBGeminin protein form corresponds to amino acid region 28-209 of the human ortholog of the protein, in other words it lacks amino acid residues 1-27, which have been shown to be essential for protein degradation (McGarry & Kirschner, Cell. 1998, Vol. 93(6), pp 1043-53). Deletion of amino acid residues 1-27 was performed to avoid problems with the stability of the molecule.
Η πρωτεϊνική μορφή miniCdt1Y170A αντιστοιχεί στην αμινοξική περιοχή 158-396 του ορθόλόγου της πρωτεΐνης στον άνθρωπο, που φέρει τη σημειακή μετάλλαξη του καταλοίπου της τυροσίνης (Υ) προς αλανίνη (Α) στη θέση 170. Η πρωτεϊνική μορφή αυτή έχει δειχθεί ότι εμφανίζει μειωμένη συγγένεια πρόσδεσης στη Geminin (Lee C et al. Nature. 2004, Vol. 430(7002) pp 913-7). Δεδομένου ότι το σύμπλοκο Geminin-Cdt1 συνιστά μία πολύ ισχυρή πρωτεϊνική αλληλεπίδραση, οι εφευρέτες επέλεξαν το μεταλλαγμένο σύμπλοκο ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A για να αυξηθεί σημαντικά η πιθανότητα και ευκολία αναγνώρισης ‘ελπιδοφόρων’ συνθετικών χημικών ενώσεων (compound hits) με ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. The miniCdt1Y170A protein form corresponds to amino acid region 158-396 of the human ortholog of the protein, which carries a point mutation of the tyrosine (Y) to alanine (A) residue at position 170. This protein form has been shown to exhibit reduced binding affinity in Geminin (Lee C et al. Nature. 2004, Vol. 430(7002) pp 913-7). Since the Geminin-Cdt1 complex constitutes a very strong protein interaction, the inventors chose the mutant ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A complex to significantly increase the probability and ease of identifying 'promising' synthetic chemical compounds (compound hits) with the ability to disrupt the complex.
Οι πρωτεϊνικές μορφές ΔDBGeminin και miniCdt1Y170A κλωνοποιήθηκαν μέσω καθιερωμένων PCR τεχνικών στους πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης pET22b (Novagen) και pET28a (Novagen) αντίστοιχα. Η έκφραση του πρωτεϊνικού συμπλόκου ΔDBGemininminiCdt1Y170A πραγματοποιήθηκε με χρήση του βακτηριακού στελέχους E.coli, Rosetta 2(DE3) και η απομόνωσή του με την εφαρμογή τεχνικών χρωματογραφίας συγγένειας και μοριακής διήθησης. Η καθαρότητα του απομονωμένου πρωτεϊνικού συμπλόκου κρίθηκε μέσω ανάλυσης SDS-PAGE. ΔDBGeminin and miniCdt1Y170A protein forms were cloned by standard PCR techniques into the plasmid expression vectors pET22b (Novagen) and pET28a (Novagen), respectively. Expression of the ΔDBGemininminiCdt1Y170A protein complex was performed using the bacterial strain E.coli, Rosetta 2(DE3) and its isolation by applying affinity chromatography and molecular filtration techniques. The purity of the isolated protein complex was judged by SDS-PAGE analysis.
Για την πραγματοποίηση του μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης χρησιμοποιήθηκε το προϊόν AlphaScreen™ Histidine (Nickel Chelate) Detection Kit (Cat.No.:6760619M), από την εταιρεία PerkinElmer. Η σήμανση του συμπλόκου ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A με τα σφαιρίδια-δότες και -δέκτες βασίστηκε στο ότι τα σφαιρίδια-δότες έφεραν στην επιφάνειά τους μόρια στρεπταβιδίνης ενώ τα σφαιρίδια-δέκτες έφεραν ιόντα νικελίου. Ως εκ τούτου, η πρόσδεση της ΔDBGeminin στα σφαιρίδια-δότες έγινε μέσω του αμινοτελικού της επιτόπου FLAG tag και της χρήσης κατάλληλου βιοτινυλιωμένου anti-FLAG αντισώματος, ενώ η πρόσδεση της πρωτεΐνης miniCdt1Y170A στα σφαιρίδια-δέκτες πραγματοποιήθηκε μέσω του επιτόπου της ουράς έξι ιστιδινών (6xHis tag), που έφερε στο αμινοτελικό της άκρο. The AlphaScreen™ Histidine (Nickel Chelate) Detection Kit (Cat.No.:6760619M) from PerkinElmer was used to perform the high-throughput mass screening. Labeling of the ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A complex with donor and acceptor beads was based on donor beads carrying streptavidin molecules on their surface while acceptor beads carrying nickel ions. Therefore, tethering of ΔDBGeminin to donor beads was performed via its N-terminal FLAG tag epitope and the use of an appropriate biotinylated anti-FLAG antibody, while tethering of the miniCdt1Y170A protein to acceptor beads was performed via its six-histidine tail epitope (6xHis tag), which he brought to its amino terminus.
Ο υπολογισμός του σήματος πραγματοποιήθηκε με βάση την εξίσωση (S-B)/B, όπου η τιμή S (Signal) αντιστοιχεί στο ποσό της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας παρουσία του πρωτεϊνικού συμπλόκου, των σφαιριδίων και του βιοτινυλιωμένου anti-FLAG αντισώματος ενώ η τιμή Β (Background) αντιστοιχεί στο ποσό της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας παρουσία αποκλειστικά και μόνο των σφαιριδίων. Η τιμή Β (Background) προσδιορίζει το επίπεδο ‘θορύβου’. Οι διαδικασίες διέγερσης των σφαιριδίων-δοτών καθώς και ανίχνευσης της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας από τα σφαιρίδια-δέκτες έγινε με χρήση κατάλληλου εξοπλισμού (Envision reader, PerkinElmer). The signal was calculated based on the equation (S-B)/B, where the value S (Signal) corresponds to the amount of emitted radiation in the presence of the protein complex, the beads and the biotinylated anti-FLAG antibody while the value B (Background) corresponds in the amount of emitted radiation in the presence of only the beads. The value B (Background) determines the 'noise' level. The procedures of stimulating the donor beads as well as detecting the emitted radiation from the receiver beads were done using appropriate equipment (Envision reader, PerkinElmer).
Η παρουσία του πρωτεϊνικού συμπλόκου ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A φέρει τα σφαιρίδια σε γειτνίαση, με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η μεταφορά ενέργειας μέσω του διεγερμένου Ο2και κατ’ επέκταση η ανίχνευση σήματος (S, Signal) μέσω της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας. Η διάσπαση του πρωτεϊνικού συμπλόκου, λόγω της παρουσίας μιας συνθετικής χημικής ένωσης, συνεπάγεται την επαναφορά του Ο2στη θεμελιώδη του κατάσταση, την απώλεια μεταφοράς ενέργειας μεταξύ των δύο τύπου σφαιριδίων και κατ’ επέκταση την ελάττωση ή απουσία σήματος. Επομένως, η ικανότητα των συνθετικών χημικών ενώσεων για διάσπαση του πρωτεϊνικού συμπλόκου Geminin-Cdt1 μπορεί να αξιολογηθεί μέσω της παρατηρούμενης μεταβολής (ελάττωση ή απουσία) του AlphaScreen™ σήματος (S, Signal). The presence of the ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A protein complex brings the globules into proximity, as a result of which energy transfer is possible through the excited O2 and, by extension, the detection of a signal (S, Signal) through the emitted radiation. The disintegration of the protein complex, due to the presence of a synthetic chemical compound, entails the return of O2 to its fundamental state, the loss of energy transfer between the two types of beads and, by extension, the reduction or absence of signal. Therefore, the ability of the synthetic compounds to disrupt the Geminin-Cdt1 protein complex can be assessed by the observed change (decrease or absence) of the AlphaScreen™ signal (S, Signal).
Παράδειγμα 2 Example 2
Επιλογή των κατάλληλων τεχνικών παραμέτρων για τη βέλτιστη εφαρμογή της μεθόδου μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης Selection of the appropriate technical parameters for optimal application of the high-throughput mass screening method
Μελετήθηκαν διαφορετικές τεχνικές παράμετροι με σκοπό την εύρεση των καταλληλότερων, οι οποίες θα εξασφαλίζουν την υψηλή ευαισθησία και αξιοπιστία της μεθόδου μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης, μέσω της τεχνολογίας AlphaScreen™. Different technical parameters were studied in order to find the most suitable ones, which will ensure the high sensitivity and reliability of the high-throughput mass screening method, through the AlphaScreen™ technology.
Αρχικά μελετήθηκε η χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση του συμπλόκου ADBGemininminiCdt1Y170A. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος προκειμένου να διαπιστωθεί ποιά συγκέντρωση παρουσιάζει την επιθυμητή αναλογία σήματος (S, Signal) / θορύβου (Β, Background). Για τον λόγο αυτόν, δοκιμάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις (10nΜ, 25nM, 50nM, 100nM, 200nM, 400nΜ) του συμπλόκου και υπολογίστηκε η αντίστοιχη αύξηση του επιπέδου σήματος (Εικ. 1Α). Οι συγκεντρώσεις των σφαιριδίων και του βιοτινυλιωμένου anti-FLAG αντισώματος διατηρήθηκαν σταθερές. Σε εύρος συγκεντρώσεων 200-400nΜ παρουσιάστηκε αύξηση του σήματος κατά είκοσι τουλάχιστον φορές πάνω από το επίπεδο θορύβου (Εικ. 1Α). Το γράφημα Α της Εικ. 1 αναπαριστά τους μέσους όρους τριπλών ανεξάρτητων μετρήσεων και οι γραμμές σφάλματος την τυπική απόκλιση των μέσων όρων. First, the concentration of the ADBGemininminiCdt1Y170A complex used was studied. A check was made to determine which concentration exhibits the desired signal (S, Signal) / noise (B, Background) ratio. For this reason, different concentrations (10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 200nM, 400nM) of the complex were tested and the corresponding increase in signal level was calculated (Fig. 1A). The concentrations of beads and biotinylated anti-FLAG antibody were kept constant. In the concentration range of 200-400nM there was an increase of the signal by at least twenty times above the noise level (Fig. 1A). Graph A of Fig. 1 represents the means of triplicate independent measurements and the error bars the standard deviation of the means.
Η επόμενη παράμετρος που μελετήθηκε ήταν η χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση των σφαιριδίων. Δοκιμάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις σφαιριδίων (5μg /ml, 10μg /ml, 15μg/m 20μg/ml προκειμένου να βρεθεί ρ κατάλληλη, η οποία να εξασφαλίζει την επιθυμητή αναλογία σήματος (S, Signal)/θορύβου (Β, Background). Οι συγκεντρώσεις του πρωτεϊνικού συμπλόκου και του βιοτινυλιωμένου anti-FLAG αντισώματος διατηρήθηκαν σταθερές. Η συγκέντρωση σφαιριδίων 10μg /ml εμφάνισε αύξηση του σήματος κατά είκοσι περίπου φορές πάνω από το επίπεδο θορύβου (Εικ. 1Β). Το γράφημα Β της Εικ. 1 αναπαριστά τους μέσους όρους τριπλών ανεξάρτητων μετρήσεων και οι γραμμές σφάλματος την τυπική απόκλιση των μέσων όρων. The next parameter studied was the concentration of beads used. Different concentrations of beads (5μg/ml, 10μg/ml, 15μg/m 20μg/ml) were tested in order to find a suitable p that ensures the desired signal (S, Signal)/noise (B, Background) ratio. The protein concentrations complex and the biotinylated anti-FLAG antibody were kept constant. A bead concentration of 10 μg/ml showed an increase in signal approximately twenty-fold above the noise level (Fig. 1B). Graph B of Fig. 1 represents the averages of triplicate independent measurements and the error bars the standard deviation of the means.
Δεδομένου ότι οι συνθετικές χημικές ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν στη διαδικασία μαζικού ελέγχου (screening) ήταν διαλυτοποιημένες σε DMSO, κρίθηκε σκόπιμο να μελετηθεί η επίδραση της χρησιμοποιούμενης συγκέντρωσης DMSO στην αναλογία σήματος (S, Signal)/θορύβου (Β, Background). Ως δείγμα ελέγχου (control) χρησιμοποιήθηκε μηδενική συγκέντρωση DMSO. Δοκιμάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις DMSO (0.2%, 0.5%, 1 %, 2%, 4%) προκειμένου να βρεθεί η κατάλληλη, η οποία δεν θα μεταβάλλει σημαντικά το επίπεδο του σήματος. Οι συγκεντρώσεις του πρωτεϊνικού συμπλόκου, των σφαιριδίων και του βιοτινυλιωμένου anti-FLAG αντισώματος διατηρήθηκαν σταθερές. Η μελέτη έδειξε ότι συγκεντρώσεις DMSO μέχρι και 4% δεν προκαλούν κάποια σημαντική μεταβολή στο επίπεδο του σήματος (Εικ. 1 Γ). Το γράφημα Γ της Εικ. 1 αναπαριστά τους μέσους όρους τριπλών ανεξάρτητων μετρήσεων και οι γραμμές σφάλματος την τυπική απόκλιση των μέσων όρων. Since the synthetic chemical compounds used in the mass screening procedure were dissolved in DMSO, it was considered appropriate to study the effect of the DMSO concentration used on the signal (S, Signal)/noise (B, Background) ratio. A zero concentration of DMSO was used as a control sample. Different concentrations of DMSO (0.2%, 0.5%, 1 %, 2%, 4%) were tested in order to find the appropriate one, which would not significantly change the signal level. The concentrations of protein complex, beads and biotinylated anti-FLAG antibody were kept constant. The study showed that DMSO concentrations up to 4% did not cause any significant change in signal level (Fig. 1C). Graph C of Fig. 1 represents the means of triplicate independent measurements and the error bars the standard deviation of the means.
Επιπλέον, δοκιμάστηκε η σταθερότητα των αντιδραστηρίων αναφορικά με την πάροδο του χρόνου. Δεδομένου ότι η διαδικασία μαζικού ελέγχου μπορεί να διαρκέσει για μεγάλο χρονικό διάστημα, τα αντιδραστήρια (σφαιρίδια, βιοτινυλιωμένο αντίσωμα, πρωτεϊνικά σύμπλοκο) θα χρειαστεί να παράμείνουν για αυτό το χρονικό διάστημα σε μη ιδανικές συνθήκες (θερμοκρασία δωματίου έναντι 4°C, που είναι η συνιστώμενη θερμοκρασία). Για τον λόγο αυτόν δοκιμάστηκε η επίδραση της αύξησης του χρόνου παραμονής (1 hr, 2hrs, 6hrs, 10hrs) των αντιδραστηρίων σε θερμοκρασία δωματίου, προτού πραγματοποιηθεί η ανίχνευση του σήματος (Εικ. 1Δ). Ως δείγμα ελέγχου (control) αναφέρεται ο μηδενικός χρόνος παραμονής των αντιδραστηρίων σε θερμοκρασία δωματίου. Όπως φαίνεται στο γράφημα Δ (Εικ. 1Δ) η πάροδος του χρόνου δεν εμφανίζει αρνητική επίδραση στη σταθερότητα των ανπδραστηρίων καθώς δεν παρατηρείται ελάπωση της αναλογίας σήματος (S, Signal)/θορύβου (Β, Background) ακόμη και μετά την πάροδο χρονικού διαστήματος 10hrs. Το γράφημα Δ της Εικ. 1 αναπαριστά τους μέσους όρους τριπλών ανεξάρτητων μετρήσεων και οι γραμμές σφάλματος την τυπική απόκλιση των μέσων όρων. In addition, the stability of the reagents with respect to time was tested. Since the bulk screening process can take a long time, the reagents (beads, biotinylated antibody, protein complex) will need to remain for this time in sub-optimal conditions (room temperature vs. 4°C, which is the recommended temperature). For this reason, the effect of increasing the dwell time (1 hr, 2hrs, 6hrs, 10hrs) of the reagents at room temperature was tested before the signal was detected (Fig. 1D). A control sample refers to the zero time the reagents stay at room temperature. As can be seen in graph D (Fig. 1D) the passage of time does not show a negative effect on the stability of the reagents as no degradation of the signal (S, Signal)/noise (B, Background) ratio is observed even after a time interval of 10hrs. Graph D of Fig. 1 represents the means of triplicate independent measurements and the error bars the standard deviation of the means.
Κατά την πραγματοποίηση του μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης μέσω της τεχνολογίας AlphaScreen™, οι τελικές συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων ήταν: 300nΜ ADBGeminin-miniCdt1Y170A συμπλόκου, 10μg /ml σφαιριδίων (‘δότες’ και 'δέκτες') και 5ηΜ βιοτινυλιωμένου anti-FLAG αντισώματος (SIGMA, Cat.No.:F-9291). Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε ήταν 25mM Hepes pH 7.4, 100mM NaCI και 0.2% BSA. Η κάθε συνθετική ένωση δοκιμάστηκε σε τελική συγκέντρωση 5μΜ και DMSO 0.4%. Ο τελικός όγκος της αντίδρασης στο κάθε βοθρίο (well) ήταν 25μΙ. Κάθε τρυβλίο επωάστηκε για τουλάχιστον 3hrs σε σκοτεινό μέρος, σε θερμοκρασία δωματίου, πριν να πραγματοποιηθεί η μέτρηση του AlphaScreen™ σήματος με τη χρήση κατάλληλου εξοπλισμού (Envision reader, PerkinElmer). When performing the high-throughput mass screening via AlphaScreen™ technology, the final reagent concentrations were: 300nM ADBGeminin-miniCdt1Y170A complex, 10μg/ml beads ('donors' and 'acceptors') and 5nM biotinylated anti-FLAG antibody (SIGMA, Cat.No.:F-9291). The composition of the buffer used was 25mM Hepes pH 7.4, 100mM NaCl and 0.2% BSA. Each synthetic compound was tested at a final concentration of 5 µM and DMSO 0.4%. The final reaction volume in each well was 25 µl. Each plate was incubated for at least 3hrs in the dark, at room temperature, before measuring the AlphaScreen™ signal using appropriate equipment (Envision reader, PerkinElmer).
Παράδειγμα 3 Example 3
Πρωτογενής μαζικός έλεγχος υψηλής απόδοσης συνθετικών χημικών ενώσεων Primary high-throughput mass screening of synthetic chemical compounds
Με σκοπό την ταυτοποίηση συνθετικών χημικών ενώσεων (chemical compounds) με ικανότητα διάσπασης του πρωτεϊνικού συμπλόκου ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A, πραγματοποιήθηκε μαζικός έλεγχος υψηλής απόδοσης (High Throughput Screening, HTS) βιβλιοθήκης συνθετικών χημικών ενώσεων. Η βιβλιοθήκη αποτελούνταν συνολικά από 23.360 μεμονωμένα δείγματα και ήταν προϊόν της εταιρείας specs (www.specs.net). Ο μαζικός έλεγχος έγινε με τη βοήθεια αυτοματοποιημένων τεχνικών και τη χρήση κατάλληλου εξοπλισμού. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 73 τρυβλία 384 θέσεων (384-well plates). In order to identify chemical compounds capable of cleaving the ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A protein complex, a high-throughput screening (HTS) of a library of synthetic chemical compounds was carried out. The library consisted of a total of 23,360 individual samples and was a product of specs (www.specs.net). Mass screening was done with the help of automated techniques and the use of appropriate equipment. A total of 73 384-well plates were used.
Η ποιοτική αξιολόγηση της διαδικασίας μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δειγμάτων θετικού (positive control) και αρνητικού ελέγχου (negative control). Ως τιμή του δείγματος θετικού ελέγχου (S, Signal) ορίστηκε η τιμή του AlphaScreen™ σήματος, η οποία προέκυπτε από τη συνδυασμένη παρουσία του πρωτεϊνικού συμπλόκου ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A, του βιοτινυλιωμένου antiFLAG αντισώματος, των δύο τύπου σφαιριδίων και του DMSO (έναντι της συνθετικής χημικής ένωσης). Ως τιμή του δείγματος αρνητικού ελέγχου (Β, Background) ορίστηκε η τιμή του AlphaScreen™ σήματος, η οποία προέκυπτε από τη συνδυασμένη παρουσία μόνο του βιοτινυλιωμένου anti-FLAG αντισώματος και των δύο τύπων σφαιριδίων. The qualitative evaluation of the high-throughput mass control procedure was performed using positive control and negative control samples. The value of the positive control sample (S, Signal) was defined as the value of the AlphaScreen™ signal, which resulted from the combined presence of the ΔDBGeminin-miniCdt1Y170A protein complex, the biotinylated antiFLAG antibody, the two types of beads and DMSO (versus the synthetic chemical association). The value of the negative control sample (B, Background) was defined as the value of the AlphaScreen™ signal, which resulted from the combined presence of only the biotinylated anti-FLAG antibody and both types of beads.
Οι συνθετικές χημικές ενώσεις οι οποίες προκάλεσαν ελάττωση της τιμής AlphaScreen™ σήματος ως προς την αντίστοιχη του δείγματος θετικού ελέγχου χαρακτηρίστηκαν ως ‘ελπιδοφόρες συνθετικές χημικές ενώσεις’ (compound hits) για την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου hGeminin-hCdtl . Από το σύνολο των ‘ελπιδοφόρων’ ενώσεων επιλέχθηκαν εκείνες οι οποίες προκάλεσαν μείωση (%) του σήματος υψηλότερη από μία συγκεκριμένη οριακή τιμή, βάσει στατιστικής ανάλυσης. Για κάθε συνθετική χημική ένωση η τιμή (%) του AlphaScreen™ σήματος υπολογίστηκε με βάση την ακόλουθη εξίσωση The synthetic chemical compounds that caused a decrease in the AlphaScreen™ signal value compared to the corresponding positive control sample were characterized as 'promising synthetic chemical compounds' (compound hits) for the ability to break down the hGeminin-hCdtl complex. From the set of 'promising' compounds, those that caused a reduction (%) of the signal higher than a certain threshold value, based on statistical analysis, were selected. For each synthetic compound the value (%) of the AlphaScreen™ signal was calculated based on the following equation
(1) (τιμή AlphaScreen™ σήματος % = (τιμή σήματος για την υπό μελέτη συνθετική χημική ένωση / διάμεσο τιμή σήματος για το σύνολο των συνθετικών χημικών ενώσεων)*100]. (1) (AlphaScreen™ signal value % = (signal value for the synthetic chemical compound under study / median signal value for all synthetic chemical compounds)*100].
Ως όριο επιλογής τέθηκε η ποσοστιαία τιμή 50% και συνολικά 359 συνθετικές χημικές ενώσεις εμφάνισαν τιμή (%) σήματος μικρότερη του 50%. Η Εικ. 2Α παριστάνει την κατανομή του συνόλου των τιμών (%) του AlphaScreen™ σήματος βάσει της εξίσωσης (1), για κάθε μία από τις 23.360 συνθετικές χημικές ενώσεις που μελετήθηκαν. Με μαύρο χρώμα παριστάνονται οι τιμές (<50%) του AlphaScreen™ σήματος των 359 επιλεχθεισών ‘ελπιδοφόρων’ συνθετικών χημικών ενώσεων. Με γκρι χρώμα παριστάνονται οι τιμές (%) του AlphaScreen™ σήματος των υπολοίπων συνθετικών χημικών ενώσεων, που δεν προκάλεσαν ελάττωση >50%. A percentage value of 50% was set as the selection threshold and a total of 359 synthetic chemical compounds showed a signal value (%) of less than 50%. Fig. 2A represents the distribution of the total values (%) of the AlphaScreen™ signal based on equation (1), for each of the 23,360 synthetic compounds studied. The values (<50%) of the AlphaScreen™ signal of the 359 selected 'promising' synthetic chemical compounds are represented in black. In gray are represented the values (%) of the AlphaScreen™ signal of the remaining synthetic chemical compounds, which did not cause >50% reduction.
Η στατιστική αξιολόγηση της αξιοπιστίας των αποτελεσμάτων (Εικ. 2Α) του πρωτογενούς μαζικού ελέγχου των συνθετικών χημικών ενώσεων πραγματοποιήθηκε με ανάλυση της παραμέτρου Ζ. Η τιμή της παραμέτρου Ζ προκύπτει από την εξίσωση The statistical evaluation of the reliability of the results (Fig. 2A) of the primary mass screening of the synthetic chemical compounds was performed by analyzing the parameter Z. The value of the parameter Z is obtained from Eq.
(2) Ζ -1- [(3σc<+>+3σc)/(μc<+>- μc)], όπου σc<+>και σc η τυπική απόκλιση των δειγμάτων θετικού και αρνητικού ελέγχου, αντίστοιχα. Παρομοίως, οι τιμές μc<+>και μσ αντιστοιχούν στους μέσους όρους των δειγμάτων. (2) Z -1- [(3σc<+>+3σc)/(μc<+>- μc)], where σc<+>and σc the standard deviation of positive and negative control samples, respectively. Similarly, μc<+> and μs values correspond to sample means.
Προκειμένου οι κατανομές των δειγμάτων θετικού και αρνητικού ελέγχου να είναι επαρκώς διαχωρισμένες και η τυπική τους, απόκλιση επαρκώς περιορισμένη, έχει θεωρηθεί εμπειρικά ότι η τιμή Ζ' πρέπει να είναι ίση ή μεγαλύτερη του 0.5 (Zhang<'>JH et al., J Biomol Screen. 1999, Vol. 4(2), pp 67-73). Επομένως, μέθοδοι μαζικού ελέγχου οι οποίες χαρακτηρίζονται από τιμή Z’≥ 0.5 θεωρούνται υψηλής ποιότητας και αξιοπιστίας. In order for the distributions of the positive and negative control samples to be sufficiently separated and their standard deviation sufficiently limited, it has been empirically considered that the Z' value should be equal to or greater than 0.5 (Zhang<'>JH et al., J Biomol Screen. 1999, Vol. 4(2), pp 67-73). Therefore, mass control methods characterized by a value of Z'≥ 0.5 are considered of high quality and reliability.
Ο μέσος όρος της τιμής Ζ για το σύνολο των τρυβλίων που μελετήθηκαν (συνολικά 73) κατά την πραγματοποίηση του μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης μέσω της τεχνολογίας AlphaScreen™ ήταν ίσος με 0.6 (Εικ. 2Β). Στην Εικ. 2Β οι μαύρες κουκκίδες αντιστοιχούν στις διακριτές τιμές Ζ των τρυβλίων και η μαύρη συνεχής ευθεία γραμμή αντιστοιχεί στον μέσο όρο των τιμών Ζ’. Ο άξονας χ αναπαριστά τα διαφορετικά τρυβλία, ενώ ο άξονας y τις αντίστοιχες τιμές του παράγοντα Ζ’. Όσον αφορά τη μέση τιμή της αναλογίας σήματος (S, Signal) έναντι ‘θορύβου’ (Β, Background), αυτή ήταν ίση με 42 (S/B=42). Τα αποτελέσματα αυτά είναι ενδεικτικά της υψηλής ποιότητας και αξιοπιστίας του πρωτογενούς μαζικού ελέγχου καθώς και της τεχνολογίας AlphaScreen™, όπως εφαρμόστηκαν για τις ανάγκες της παρούσας εφεύρεσης. The mean Z value for all plates studied (total 73) when performing the high-throughput mass screening through AlphaScreen™ technology was equal to 0.6 (Fig. 2B). In Fig. 2B the black dots correspond to the discrete Z values of the plates and the black continuous straight line corresponds to the average of the Z' values. The x-axis represents the different plates, while the y-axis represents the corresponding values of the Z' factor. Regarding the average value of the ratio of signal (S, Signal) to 'noise' (B, Background), this was equal to 42 (S/B=42). These results are indicative of the high quality and reliability of the primary bulk screening as well as the AlphaScreen™ technology as applied for the purposes of the present invention.
Παράδειγμα 4 Example 4
Επανέλεγχος αξιολόγησης των επιλεχθεισών ‘ελπιδοφόρων’ συνθετικών χημικών ενώσεων Evaluation review of selected 'promising' synthetic chemical compounds
Κάθε πρωτογενής μαζικός έλεγχος συνθετικών χημικών ενώσεων (primary compound screening) έχει ως αποτέλεσμα την ανίχνευση 'μη ειδικών ελπιδοφόρων’ δειγμάτων. Any primary mass screening of synthetic chemical compounds (primary compound screening) results in the detection of 'unspecific promising' samples.
Η ανίχνευση των ‘μη ειδικών’ συνθετικών χημικών ενώσεων σχετίζεται άμεσα με την τεχνολογία (AlphaScreen™) και τον πειραματικό σχεδίασμά, που επιλέγονται για την πραγματοποίηση του μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης. Στις ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης οι οποίες αναφέρονται στη διαδικασία του μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης, ως 'ειδικές ελπιδοφόρες’ συνθετικές χημικές ενώσεις θεωρούνται αυτές που προκαλούν ελάττωση της τιμής (%) του AlphaScreen™ σήματος, αποκλειστικά και μόνο μέσω της διάσπασης του πρωτεϊνικού συμπλόκου ADBGeminin-miniCdt1Y170A. Ως ‘μη ειδικές ελπιδοφόρες’ θεωρούνται αυτές που προκαλούν ελάττωση της τιμής (%) του AlphaScreen™ σήματος, μέσω οποιουδήποτε άλλου τυχαίου μηχανισμού. The detection of 'non-specific' synthetic chemical compounds is directly related to the technology (AlphaScreen™) and experimental design, chosen to perform the high-throughput mass screening. In the embodiments of the present invention that refer to the high-throughput mass screening process, as 'specific promising' synthetic chemical compounds are considered those that cause a decrease in the value (%) of the AlphaScreen™ signal, solely and exclusively through the cleavage of the protein complex ADBGeminin- miniCdt1Y170A. As 'non-specific hopefuls' are considered those that cause a decrease in the value (%) of the AlphaScreen™ signal, through any other random mechanism.
Με βάση τον πειραματικό σχεδίασμά της μεθόδου του πρωτογενούς μαζικού ελέγχου μέσω της τεχνολογίας AlphaScreen™ οι κυριότεροι μηχανισμοί μη ειδικής ελάττωσης του σήματος, θεωρητικά, θα ήταν: Based on the experimental design of the primary mass screening method using AlphaScreen™ technology the main mechanisms of non-specific signal reduction, theoretically, would be:
(α) ο ανταγωνισμός μεταξύ του επιτόπου της ουράς έξι ιστιδινών (6xHis-tag) της πρωτεΐνης miniCdt1Y170A και συνθετικών χημικών ενώσεων των οποίων η δομή είναι παρόμοια με την αντίστοιχη του ιμιδαζολίου, για την πρόσδεση στα συζευγμένα με ιόντα νικελίου σφαιρίδια-δέκτες, (a) the competition between the six-histidine tail epitope (6xHis-tag) of the miniCdt1Y170A protein and synthetic compounds whose structure is similar to that of imidazole, for binding to nickel ion-coupled acceptor beads;
(β) ο ανταγωνισμός μεταξύ του επιτόπου FLAG tag της πρωτεΐνης ADBGeminin και συνθετικών χημικών ενώσεων των οποίων η δομή είναι παρόμοια με την αντίστοιχη της βιοτίνης, για την πρόσδεση στα συζευγμένα με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια-δότες, (γ) η αναστολή της διάχυσης της διεγερμένης μορφής του Ο2από συνθετικές χημικές ενώσεις με ανάλογη δράση. (b) the competition between the FLAG tag epitope of the ADBGeminin protein and synthetic chemical compounds whose structure is similar to that of biotin, for binding to the streptavidin-conjugated donor beads, (c) the inhibition of the diffusion of the excited form of O2 by synthetic chemical compounds with similar action.
Προκειμένου λοιπόν να είναι εφικτός ο διαχωρισμός των ‘ελπιδοφόρων’ συνθετικών χημικών ενώσεων του πρωτογενούς μαζικού ελέγχου σε ‘μη ειδικές’ και ‘ειδικές’, εφαρμόσθηκε ένα δευτερογενές σύστημα μελέτης, το προϊόν AlphaScreen™ Biotinylated-HIS6 (Cat.No.:6760303M), από την εταιρεία PerkinElmer. Το συγκεκριμένο σύστημα μελέτης περιελάμβανε τη χρήση ενός βιοτυνιλιωμένου πεπτιδίου με επίτοπο ουράς έξι ιστιδινών. Η ανίχνευση του AlphaScreen™ σήματος ήταν δυνατή μέσω της πρόσδεσης του πεπτιδίου στα συζευγμένα με ιόντα νικελίου σφαιρίδια-δέκτες και στα συζευγμένα με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια-δότες. Οι τελικές συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων ήταν: 20nM πεπτιδίου Biotinylated-HIS6 και 10μg /ml σφαιριδίων {«δότες» και «δέκτες»). Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε ήταν 25mM Hepes pH 7.4, 100mΜ NaCI και 0.2% BSA. Η κάθε συνθετική ένωση δοκιμάστηκε σε τελική συγκέντρωση 5μΜ και DMSO 0.4%. Ο τελικός όγκος της αντίδρασης στο κάθε βοθρίο (well) ήταν 25μl. Κάθε τρυβλίο επωάστηκε για τουλάχιστον 3hrs σε σκοτεινό μέρος, σε θερμοκρασία δωματίου, πριν να πραγματοποιηθεί η μέτρηση του AlphaScreen™ σήματος με τη χρήση κατάλληλου εξοπλισμού (Envision reader, PerkinElmer). Therefore, in order to be able to separate the 'promising' synthetic chemical compounds of the primary mass screening into 'non-specific' and 'specific', a secondary study system, the product AlphaScreen™ Biotinylated-HIS6 (Cat.No.:6760303M), was applied. by PerkinElmer Company. The particular study system involved the use of a biotinylated peptide with a six histidine tail epitope. Detection of the AlphaScreen™ signal was possible through binding of the peptide to nickel ion-conjugated acceptor beads and streptavidin-conjugated donor beads. Final reagent concentrations were: 20nM Biotinylated-HIS6 peptide and 10μg/ml beads {'donors' and 'acceptors'). The composition of the buffer solution used was 25 mM Hepes pH 7.4, 100 mM NaCl and 0.2% BSA. Each synthetic compound was tested at a final concentration of 5 µM and DMSO 0.4%. The final volume of the reaction in each well was 25μl. Each plate was incubated for at least 3hrs in the dark at room temperature before measurement of the AlphaScreen™ signal using appropriate equipment (Envision reader, PerkinElmer).
Για κάθε μία από τις επιλεχθείσες 'ελπιδοφόρες’ συνθετικές χημικές ενώσεις του πρωτογενούς μαζικού ελέγχου (Εικ. 2Α, μαύρες κουκκίδες) υπολογίστηκε, εις τριπλούν, η τιμή (%) του AlphaScreen™ σήματος παρουσία του πεπτιδίου και παρουσία του πρώτεϊνικού συμπλόκου ADBGeminin-miniCdt1Y170A, αντίστοιχα. Οι ενώσεις ταξινομήθηκαν κατά φθίνουσα σειρά με βάση την τιμή του πηλίκου της ακόλουθης εξίσωσης For each of the selected 'promising' synthetic compounds of the primary mass control (Fig. 2A, black dots) the value (%) of the AlphaScreen™ signal in the presence of the peptide and in the presence of the ADBGeminin-miniCdt1Y170A protein complex was calculated, in triplicate; respectively. Compounds were ranked in descending order based on the quotient value of the following equation
(3) [τιμή (%) AlphaScreen™ σήματος παρουσία πεπτιδίου / τιμή (%) AlphaScreen™ σήματος παρουσία πρώτεϊνικού συμπλόκου ADBGeminin-miniCdtl Y170Α], (3) [value (%) AlphaScreen™ signal in the presence of peptide / value (%) AlphaScreen™ signal in the presence of ADBGeminin-miniCdtl Y170A protein complex],
Ως % τιμής AlphaScreen™ σήματος 100% ορίστηκε η τιμή του σήματος απουσία της εκάστοτε συνθετικής χημικής ένωσης. Θεωρητικά, οι συνθετικές χημικές ενώσεις οι οποίες χαρακτηρίζονται ως ‘ειδικές’ αναμένεται να προκαλούν ελάττωση της τιμής του σήματος αποκλειστικά και μόνο παρουσία του πρώτεϊνικού συμπλόκου. Αντιθέτως, δεν θα πρέπει να επιφέρουν ελάπωση της τιμής του σήματος παρουσία του πεπτιδίου. Επομένως, όσο υψηλότερη είναι η τιμή του πηλίκου (3), τόσο υψηλότερη αναμένεται να είναι και η ειδικότητα της δράσης της συνθετικής χημικής ένωσης. As % of AlphaScreen™ signal value 100% was defined as the signal value in the absence of the respective synthetic chemical compound. Theoretically, the synthetic chemical compounds which are characterized as 'specific' are expected to cause a decrease in the signal value solely in the presence of the protein complex. In contrast, they should not degrade the signal value in the presence of the peptide. Therefore, the higher the value of the quotient (3), the higher the specificity of action of the synthetic chemical compound is expected to be.
Με βάση τον συγκεκριμένο τρόπο ταξινόμησης, από τις 359 ‘ελπιδοφόρες’ συνθετικές χημικές ενώσεις του πρωτογενούς μαζικού ελέγχου επιλέχθηκαν κατά τον επανέλεγχο αξιολόγησης οι ενώσεις AF-6 15/30368009 (Εικ. 3) και ΑΝ-689/41741104 (Εικ. 4) ως αυτές με την υψηλότερη ειδικότητα δράσης, όσον αφορά τη διάσπαση του συμπλόκου hGeminin-hCdt1 Η τιμή του πηλίκου της εξίσωσης (3) για τις ενώσεις AF-615/30368009 και ΑΝ-689/41741 104 ήταν 4.3 και 2.98, αντίστοιχα. Based on the specific classification method, from the 359 'promising' synthetic chemical compounds of the primary mass screening, the compounds AF-6 15/30368009 (Fig. 3) and AN-689/41741104 (Fig. 4) were selected during the re-evaluation as those with the highest specificity of action, regarding the cleavage of the hGeminin-hCdt1 complex. The quotient value of equation (3) for compounds AF-615/30368009 and AN-689/41741 104 were 4.3 and 2.98, respectively.
Παράδειγμα 5 Example 5
In vitro έλεγχος της ειδικότητας και της ισχύος της δράσης των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-61 5/30368009 και ΑΝ-689/41741104 In vitro testing of the specificity and potency of the synthetic chemical compounds AF-61 5/30368009 and AN-689/41741104
Εφαρμόστηκε η τεχνική συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων, με σκοπό την ποσοτική μελέτη της ικανότητας των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-615/30368009 και ΑΝ-689/41 741104 να αναστέλλουν την πρόσδεση της Geminin στην πρωτεΐνη miniCdtl , που αντιστοιχεί στην αμινοξική περιοχή 158-396 του ορθολόγου της πρωτεΐνης Cdt1 στον άνθρωπο, μέσω του υπολογισμού της σταθερός αναστολής (ΚΙ). The surface plasmon resonance technique was applied, in order to quantitatively study the ability of the synthetic chemical compounds AF-615/30368009 and AN-689/41 741104 to inhibit the binding of Geminin to the miniCdtl protein, corresponding to the amino acid region 158-396 of the orthologue of Cdt1 protein in humans, by calculating the inhibition constant (KI).
Με χρήση εμπορικού αναλυτή Biacore T 100, σε θερμοκρασία 25°C πραγματοποιήθηκε ακινητοποίηση περίπου 6.000RU της πρωτεΐνης miniCdtl πάνω σε κατάλληλη επιφάνεια CM5 Chip (Biacore) σε pH 5.5, μέσω της αμινικής ομάδας των καταλοίπων λυσίνης της πρωτεΐνης. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε ταυτόχρονη έγχυση κατά μήκος της επιφάνειας CM5 Chip ενός εύρους συγκεντρώσεων της πρωτεΐνες Geminin και των συνθετικών χημικών ενώσεων, παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος σύστασης 20mM Hepes pH 7.5, 200mM NaCI και Tween20 0.01%. Ο ρυθμός ροής της έγχυσης ήταν 30μl/min. Η πρωτεΐνη Geminin χρησιμοποιήθηκε σε συγκεντρώσεις 12, 36, 107, 322, 966 ηΜ και οι συνθετικές χημικές ενώσεις σε συγκεντρώσεις 10μΜ, 100μΜ και 1000μΜ. Η έγχυση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε παρουσία 20% DMSO, προκειμένου να διασφαλισθεί η υψηλή διαλυτότητα των συνθετικών χημικών ενώσεων. Using a commercial Biacore T 100 analyzer, at a temperature of 25°C, about 6,000RU of the miniCdtl protein was immobilized on a suitable CM5 Chip surface (Biacore) at pH 5.5, through the amino group of the lysine residues of the protein. A range of concentrations of Geminin protein and synthetic compounds were then co-injected across the CM5 Chip surface in the presence of 20mM Hepes pH 7.5 buffer, 200mM NaCl and 0.01% Tween20. The infusion flow rate was 30 µl/min. Geminin protein was used at concentrations of 12, 36, 107, 322, 966 nM and the synthetic compounds at concentrations of 10 µM, 100 µM and 1000 µM. The injection of the samples was carried out in the presence of 20% DMSO, in order to ensure the high solubility of the synthetic chemical compounds.
Όπως προκύπτει από τις καμπύλες πρόσδεσης (Εικ. 5), οι συνθετικές χημικές ενώσεις AF-6 15/30368009 και ΑΝ-689/41741 104 χρησιμοποιούμενες στη συγκέντρωση των 1000μΜ προκαλούν ελάττωση των επιπέδων πρόσδεσης της Geminin στην πρωτεΐνη miniCdt1. Στα γραφήματα τής Εικ. 5 ο άξονας χ ανα<'>παριστά τις διαφορετικές συγκεντρώσεις της Geminin (nM), ενώ ο άξονας y τα επίπεδα πρόσδεσης σε μονάδες μεταβολής (RU, Response Units). Με βάση την τιμή της σταθερός αναστολής (ΚΙ) η συνθετική χημική ένωση AF-61 5/30368009 με ΚΙ=0.75±0.19ιπΜ (Εικ. 5Α) φαίνεται να εμφανίζει ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση in vitro έναντι της συνθετικής χημικής ένωσης ΑΝ-689/41741 104 με KI=1.21±0.32mM (Εικ. 5Β). Τα αποτελέσματα της Εικ. 5 υποδεικνύουν την ειδικότητα της in vitro ανασταλτικής επίδρασης των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-615/30368009 και ΑΝ-689/41741104 στην πρωτεϊνική αλληλεπίδραση Geminin-miniCdt1 . As can be seen from the binding curves (Fig. 5), the synthetic chemical compounds AF-6 15/30368009 and AN-689/41741 104 used at the concentration of 1000 µM cause a decrease in the binding levels of Geminin to the miniCdt1 protein. In the graphs of Fig. 5 the x-axis represents the different concentrations of Geminin (nM), while the y-axis the binding levels in response units (RU). Based on the value of constant inhibition (CI) the synthetic chemical compound AF-61 5/30368009 with CI=0.75±0.19mM (Fig. 5A) seems to show a stronger inhibitory effect in vitro than the synthetic chemical compound AN-689/41741 104 with KI=1.21±0.32mM (Fig. 5B). The results of Fig. 5 indicate the specificity of the in vitro inhibitory effect of the synthetic chemical compounds AF-615/30368009 and AN-689/41741104 on the Geminin-miniCdt1 protein interaction.
Παράδειγμα 6 Example 6
Ex vivo μελέτη της ειδικότητας των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-61 5/30368009 και ΑΝ-689/41741 104, μέσω της τεχνικής μεταφοράς φθορίζουσας συντονισμένης ενέργειας Ex vivo study of the specificity of the synthetic chemical compounds AF-61 5/30368009 and AN-689/41741 104, through the technique of fluorescent resonant energy transfer
Αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε ένα κυτταρικό σύστημα μελέτης χρησιμοποιώντας επιθηλιακά κύτταρα από αδενοκαρκίνωμα μαστού (MCF7), με σκοπό την ex vivo μελέτη της ικανότητας των επιλεχθεισών συνθετικών χημικών ενώσεων να προκαλούν αναστολή σχηματισμού ή/και διάσπαση του εξωγενούς συμπλόκου Geminin-Cdt1. A cellular study system was developed and implemented using epithelial cells from breast adenocarcinoma (MCF7), in order to ex vivo study the ability of selected synthetic chemical compounds to induce inhibition of formation and/or dissociation of the exogenous Geminin-Cdt1 complex.
Επιστρώθηκε κατάλληλος αριθμός κυττάρων σε γυάλινες καλυπτρίδες και τα κύτταρα αφέθηκαν στην καλλιέργεια, προκειμένου να προσκολληθούν. Στη συνέχεια συνδιαμολύνθηκαν παροδικά με τους πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης pcDNA3.1 -EGFR και pdiHcRed-N1 που περιείχαν την κωδική αλληλουχία για την σύνθεση των πρωτεϊνών Cdt1-GFP και Geminin-dhcRed αντίστοιχα, όπου dhcRed είναι κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη. Τρεις με πέντε ώρες μετά τη συν-διαμόλυνση, το θρεπτικό μέσο αφαιρέθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο θρεπτικό μέσο, το οποίο περιείχε την εκάστοτε συνθετική χημική ένωση. Οι ενώσεις AF-61 5/30368009 και ΑΝ-689/41741 104 χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 100μΜ και 25μΜ αντίστοιχα. Η διαφορά στη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση οφείλεται στη διαφορετική τους κυτταροτοξικότητα. An appropriate number of cells were plated on glass coverslips and the cells were left in culture to adhere. They were then transiently co-transfected with pcDNA3.1 -EGFR and pdiHcRed-N1 expression plasmid vectors containing the coding sequence for the synthesis of Cdt1-GFP and Geminin-dhcRed proteins respectively, where dhcRed is a red fluorescent protein. Three to five hours after co-transfection, the medium was removed and replaced with fresh medium containing the respective synthetic chemical compound. Compounds AF-61 5/30368009 and AN-689/41741 104 were used at a concentration of 100 µM and 25 µM respectively. The difference in the concentration used is due to their different cytotoxicity.
Μετά από 24ωρη επώαση των κυττάρων παρουσία των συνθετικών χημικών ενώσεων, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με κρύο διάλυμα 1Χ PBS (2 φορές) και ακολούθησε μονιμοποίηση των κυττάρων με επώαση σε διάλυμα 4% παραφορμαλδεΰδης (PFA), για 10 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου. Έπειτα, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με διάλυμα 1Χ PBS (2 φορές) και τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες πάνω σε Mowiol και φυλάχθηκαν στους 4°C, σε σκοτεινό μέρος, για 16-18 ώρες. After a 24-hour incubation of the cells in the presence of the synthetic compounds, the coverslips were washed with cold 1X PBS solution (2 times) followed by fixation of the cells by incubation in a 4% paraformaldehyde (PFA) solution, for 10 minutes, at room temperature. Coverslips were then washed with 1X PBS solution (2x) and mounted on slides on Mowiol and stored at 4°C, in the dark, for 16-18 hours.
Η καλλιέργεια των MCF7 κυπάρων πραγματοποιήθηκε σε συνθήκες 37°C και 5% CO2 και ως θρεπτικό μέσο χρησιμοποιήθηκε DMEM (Gibco Cat. No. :41966-029) εμπλουτισμένο με 20% κατ’ όγκο εμβρυϊκό ορό βοός (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco Cat.No.:10106-169). To θρεπτικό μέσο περιείχε επίσης πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη ως αντιβιοτικά (P/S, Gibco Cat.No.:15140-122), σε τελική συγκέντρωση 1%. The culture of MCF7 cells was carried out in conditions of 37°C and 5% CO2 and DMEM (Gibco Cat. No. :41966-029) enriched with 20% by volume fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco) was used as the nutrient medium. Cat.No.:10106-169). The medium also contained penicillin and streptomycin as antibiotics (P/S, Gibco Cat.No.:15140-122), at a final concentration of 1%.
Στα μονιμοποιημένα MCF7 καρκινικά κύτταρα, όπως προέκυψαν από την παραπάνω διαδικασία, εφαρμόστηκε η τεχνική μεταφοράς φθορίζουσας συντονισμένης ενέργειας κατόπιν φωτολεύκανσης του δέκτη. Για την ποσοτικοποίηση της απόδοσης (Ε) του φαινομένου FRET χρησιμοποιήθηκε η εξίσωση: In the fixed MCF7 cancer cells, as obtained from the above procedure, the fluorescent resonant energy transfer technique was applied after photobleaching of the receiver. To quantify the efficiency (E) of the FRET effect, the equation was used:
(4) E=(Dpost - Dpre)/Dpost, όπου Dpre και Dpost είναι η τιμή της έντασης φθορισμού του 'δότη’ πριν και μετά τη φωτολεύκανση του ‘δέκτη’, αντίστοιχα. (4) E=(Dpost - Dpre)/Dpost, where Dpre and Dpost are the fluorescence intensity value of the 'donor' before and after photobleaching of the 'acceptor', respectively.
Για τις ανάγκες της παρούσας εφεύρεσης, η ανασταλτική επίδραση των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-61 5/30368009 και ΑΝ-689/41741104 στο εξωγενές σύμπλοκο Geminin-Cdt1 μελετήθηκε μέσω της ποσοστιαίας (%) μεταβολής της απόδοσης (Ε) του φαινομένου FRET. Ως δείγματα αρνητικού ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν δύο συνθήκες διαμόλυνσης. Η μία συνθήκη αφορούσε τη συν-διαμόλυνση κυττάρων τα οποία δεν είχαν υποστεί επώαση με κάποια συνθετική χημική ένωση, ούτε με DMSO (control) και η δεύτερη αφορούσε τη συν-διαμόλυνση κυττάρων τα οποία είχαν υποστεί επώαση μόνο με DMSO. For the purposes of the present invention, the inhibitory effect of the synthetic chemical compounds AF-61 5/30368009 and AN-689/41741104 on the exogenous Geminin-Cdt1 complex was studied through the percentage (%) change in the efficiency (E) of the FRET effect. Two transfection conditions were used as negative control samples. One condition concerned the co-transfection of cells that had not undergone incubation with any synthetic chemical compound, nor with DMSO (control) and the second concerned the co-transfection of cells that had undergone incubation only with DMSO.
Για την εφαρμογή της τεχνικής μεταφοράς φθορίζουσας συντονισμένης ενέργειας κατόπιν φωτολεύκανσης του «δέκτη», χρησιμοποιήθηκε συνεστιακό (confocal) μικροσκόπιο Leica TCS SP5. Η καταγραφή των εικόνων πραγματοποιήθηκε με καταδυτικό αντικειμενικό φακό λαδιού 63x1.4 ΝΑ, ταχύτητα σάρωσης 400Ηζ (και προς τις δύο κατευθύνσεις), διάμετρο pinhole 95.55μπι και ανάλυση εικόνας στα 512x512 εικονοστοιχεία. Η διέγερση του «δότη» (Cdt1-GFP) και του δέκτη’ (Geminin-dhcRed) πραγματοποιήθηκε με laser μήκους κύματος 488nm και 561 nm, αντίστοιχα (5-7% της μέγιστης έντασης). Ο «δέκτης» (Geminin-dhcRed) υπέστη τρεις διαδοχικές φωτολευκάνσεις της ίδιας διάρκειας με το 100% της έντασης του laser μήκους κύματος 561nm. Το φάσμα ανίχνευσης της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας του «δότη» (Cdt1-GFP) ορίστηκε στα 500-550nm. Η επιλογή των παραπάνω παραμέτρων πραγματοποιήθηκε μέσω της εφαρμογής FRET ΑΒ του λογισμικού Leica Microsystems LASAF. A Leica TCS SP5 confocal microscope was used for the application of the fluorescent resonant energy transfer technique after photobleaching of the "receiver". The images were recorded with a 63x1.4 NA diving oil objective lens, 400Hz scanning speed (in both directions), 95.55μm pinhole diameter and 512x512 pixel image resolution. The excitation of the "donor" (Cdt1-GFP) and the acceptor (Geminin-dhcRed) was performed with a laser of wavelength 488nm and 561 nm, respectively (5-7% of the maximum intensity). The "receiver" (Geminin-dhcRed) underwent three consecutive photobleachings of the same duration with 100% intensity of the 561nm wavelength laser. The emission spectrum of the donor (Cdt1-GFP) was set at 500-550nm. The selection of the above parameters was performed through the FRET AB application of the Leica Microsystems LASAF software.
Η Εικ. 6 αναπαριστά τα διαγράμματα πλαισίου και απολήξεων (box plots) για το σύνολο των τιμών της απόδοσης (Ε) του φαινομένου FRET ανά πειραματική συνθήκη, όπως αυτή δηλώνεται στο υπόμνημα του διαγράμματος. Η μαύρη συνεχής ευθεία γραμμή εντός του κάθε διαγράμματος πλαισίου απολήξεων αντιστοιχεί στη διάμεσο τιμή του συνόλου. Για κάθε διάγραμμα πλαισίου απολήξεων της εκάστοτε πειραματικής συνθήκης, η απόδοση (Ε) του φαινομένου FRET υπολογίστηκε σε τουλάχιστον 40 θετικώς συνδιαμολυσμένα κύτταρα. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων (Εικ. 6) έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών Cdt1-GFP & Geminin-dhcRed προκάλεσε αύξηση του ποσοστού (%) απόδοσης (Ε) του φαινομένου FRET, τουλάχιστον κατά τρεις φορές σε σύγκριση με το επίπεδο θορύβου, που αντιστοιχεί στη συν-διαμόλυνση με GFP & dhcRed. Το αποτέλεσμα αυτό αποτελεί ισχυρή ένδειξη για την ειδικότητα και την ευαισθησία του συγκεκριμένου κυτταρικού συστήματος μελέτης, όσον αφορά την ex vivo ανίχνευση και μελέτη της πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1. Επιπλέον, υποδεικνύει την καταλληλότητα του εν λόγω κυτταρικού συστήματος μελέτης όσον αφορά τον ex vivo προσδιορισμό της ειδικότητας της δράσης των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-61 5/30368009 και ΑΝ-689/41741104. Fig. 6 represents the box plots for the total values of the efficiency (E) of the FRET effect per experimental condition, as indicated in the legend of the diagram. The solid black straight line within each boxplot of terminations corresponds to the median value of the ensemble. For each boxplot of results of each experimental condition, the efficiency (E) of the FRET effect was calculated in at least 40 positively co-transfected cells. Analysis of the results (Fig. 6) showed that the interaction between Cdt1-GFP & Geminin-dhcRed proteins caused an increase in the percentage (%) efficiency (E) of the FRET effect, at least three times compared to the noise level, which corresponds to co-transfection with GFP & dhcRed. This result is a strong indication of the specificity and sensitivity of the specific study cell system, in terms of ex vivo detection and study of Geminin-Cdt1 protein interaction. Furthermore, it indicates the suitability of said study cell system for ex vivo determination of the specificity of action of the synthetic chemical compounds AF-61 5/30368009 and AN-689/41741104.
Η συνθετική χημική ένωση ΑΝ-689/41 741 104 (Εικ. 6Β) προκάλεσε στατιστικώς σημαντική μείωση του (Ε). Η μείωση αυτή υποδεικνύει αναστολή σχηματισμού ή/και διάσπαση του εξωγενούς συμπλόκου Geminin-Cdt1 και κατ’ επέκταση αποτελεί ισχυρή ένδειξη για την ειδικότητα της δράσης της ex vivo. Δεδομένου ότι ο πληθυσμός τών MCF7 καρκινικών κυττάρων ήταν ασύγχρονος, η ελάττωση της απόδοσης (Ε) λόγω αναστολής σχηματισμού του συμπλόκου αναμένεται σε κύτταρα που βρίσκονται κατά το στάδιο G1/S, ενώ αντίστοιχα η ελάττωση της απόδοσης (Ε) λόγω διάσπασης του συμπλόκου αναμένεται σε κύτταρα που βρίσκονται κατά τις φάσεις S, G2 και Μ του κυτταρικού κύκλου. Η συνθετική χημική ένωση AF-615/30368009 (Εικ. 6Α) προκάλεσε επίσης ελάττωση του (Ε), η οποία δεν ήταν στατιστικώς σημαντική. The synthetic chemical compound AN-689/41 741 104 (Fig. 6B) caused a statistically significant decrease in (E). This reduction indicates inhibition of formation and/or dissociation of the exogenous Geminin-Cdt1 complex and, by extension, is a strong indication for the specificity of its action ex vivo. Since the MCF7 tumor cell population was asynchronous, the decrease in efficiency (E) due to inhibition of complex formation is expected in cells in G1/S phase, whereas the decrease in efficiency (E) due to dissociation of the complex is expected in cells that are during the S, G2 and M phases of the cell cycle. The synthetic compound AF-615/30368009 (Fig. 6A) also caused a decrease in (E), which was not statistically significant.
Παράδειγμα 7 Example 7
Ex vivo μελέτη του μηχανισμού δράσης των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-615/30368009 και ΑΝ-689/41 741104, μέσω παρατήρησης της ενδοκυτταρικής κατανομής της εξωγενούς Geminin Ex vivo study of the mechanism of action of the synthetic chemical compounds AF-615/30368009 and AN-689/41 741104, by observing the intracellular distribution of exogenous Geminin
Αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε ένα κυτταρικό σύστημα μελέτης χρησιμοποιώντας επιθηλιακά κύτταρα από αδενοκαρκινωμα μαστού (MCF7), με σκοπό την ex vivo μελέτη του μηχανισμού μέσω του οποίου η ανασταλτική επίδραση των επιλεχθεισών συνθετικών χημικών ενώσεων επηρεάζει τη λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1. A cellular study system was developed and implemented using epithelial cells from mammary adenocarcinoma (MCF7), in order to ex vivo study the mechanism by which the inhibitory effect of selected synthetic chemical compounds affects the functional significance of the Geminin-Cdt1 interaction.
Είναι γνωστό ότι ο πυρηνικός εντοπισμός της Geminin είναι απαραίτητος για την εκδήλωση της δράσης της, όσον αφορά τη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Yoshida Κ et al. Genes Cells. 2005, Vol. 10(1) pp 63-73). Επίσης, έχει δειχθεί ότι η άμεση αλληλεπίδραση του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 με την πρωτεΐνη Geminin προκαλεί μετατόπιση της τελευταίας στον πυρήνα, προτεϊνοντας έτσι έναν επιπλέον μηχανισμό ρύθμισης του αναστολέα της αδειοδότησης Geminin, μέσω χρονικά ελεγχόμενης πυρηνοκυπαροπλασματικής μεταφοράς (Dimaki Μ et al. J Biol Chem. 2013, Vol. 288(33) pp 23953-63). It is known that the nuclear localization of Geminin is necessary for the manifestation of its action, regarding the regulation of cell proliferation (Yoshida K et al. Genes Cells. 2005, Vol. 10(1) pp 63-73). It has also been shown that the direct interaction of the licensing factor Cdt1 with the Geminin protein causes translocation of the latter to the nucleus, thus suggesting an additional mechanism of regulation of the inhibitor of Geminin licensing, through time-controlled nucleocytoplasmic transport (Dimaki M et al. J Biol Chem. 2013, Vol. 288(33) pp 23953-63).
Προκειμένου λοιπόν να προσδιοριστεί ο μηχανισμός δράσης των συνθετικών χημικών ενώσεων AF-61 5/30368009 και ΑΝ-689/41741104, μελετήθηκε ex vivo η επίδρασή τους στο μηχανισμό πυρηνοκυτταροπλασματικής μεταφοράς της Geminin.] Therefore, in order to determine the mechanism of action of the synthetic chemical compounds AF-61 5/30368009 and AN-689/41741104, their effect on the nucleocytoplasmic transport mechanism of Geminin was studied ex vivo.]
Για τις ανάγκες του πειράματος αυτού, χρησιμοποιήθηκε η πρωτεΐνη Geminin πλήρους μήκους του ανθρώπου και η πρωτεΐνη Cdt1<DEL>που αντιστοιχεί στο ορθόλογο της πρωτεΐνης στον άνθρωπο το οποίο στερείται των αμινοξικών καταλοίπων 170-190. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης έχουν δείξει ότι η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη CdtIDEL αλληλεπιδρά ασθενέστερα με τη Geminin, σε σύγκριση με την 'αγρίου τύπου’ πρωτεΐνη (Ballabeni A et al. EMBO J. 2004, Vol. 23(15), pp 3122-32). For the purposes of this experiment, the full-length human Geminin protein and the Cdt1<DEL> protein corresponding to the human ortholog of the protein lacking amino acid residues 170-190 were used. Immunoprecipitation experiments have shown that the mutant CdtIDEL protein interacts more weakly with Geminin, compared to the 'wild-type' protein (Ballabeni A et al. EMBO J. 2004, Vol. 23(15), pp 3122-32).
Για την εφαρμογή του κυτταρικού συστήματος μελέτης, επιστρώθηκε κατάλληλος αριθμός κυττάρων σε γυάλινες καλυπτρίδες και τα κύτταρα αφέθηκαν στην καλλιέργεια, προκειμένου να προσκολληθούν. Στη συνέχεια συν-διαμολύνθηκαν παροδικά με τους πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης pcDNA3.1-EGFP και pdiHcRed-N1 που περιείχαν τις πρωτεΐνες Geminin-GFP και Cdt1<DEL>-dhcRed αντίστοιχα. 3-5 ώρες μετά τη συνδιαμόλυνση, το θρεπτικό μέσο αφαιρέθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο θρεπτικό μέσο, το οποίο περιείχε την εκάστοτε συνθετική χημική ένωση. Οι ενώσεις AF-615/30368009 και ΑΝ-689/41741 104 χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 100μΜ και 25μΜ αντίστοιχα. Η διαφορά στη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση οφείλεται στη διαφορετικό τους κυτταροτοξικότητα. Μετά από 24ωρη επώαση των κυττάρων παρομσία των συνθετικών χημικών ενώσεων, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με κρύο διάλυμα 1Χ PBS (2 φορές) και ακολούθησε μονιμοποίηση των κυττάρων με επώαση σε διάλυμα 4% παραφορμαλδεΰδης (PFA), για 10 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου. Έπειτα, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με διάλυμα 1Χ PBS (2 φορές), τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες πάνω σε mounting medium που περιέχει τη χρωστική DAPI (βάφει μόνο τους πυρήνες) και παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο φθορισμού. To apply the study cell system, an appropriate number of cells were plated on glass coverslips and the cells were left in culture to adhere. They were then transiently co-transfected with the plasmid expression vectors pcDNA3.1-EGFP and pdiHcRed-N1 containing Geminin-GFP and Cdt1<DEL>-dhcRed proteins respectively. 3-5 hours after co-transfection, the medium was removed and replaced with fresh medium containing the respective synthetic chemical compound. Compounds AF-615/30368009 and AN-689/41741 104 were used at a concentration of 100 µM and 25 µM respectively. The difference in the concentration used is due to their different cytotoxicity. After a 24-hour incubation of the cells in the presence of the synthetic compounds, the coverslips were washed with cold 1X PBS solution (2 times) followed by fixation of the cells by incubation in a 4% paraformaldehyde (PFA) solution, for 10 minutes, at room temperature. Coverslips were then washed with 1X PBS solution (2x), mounted on slides on mounting medium containing DAPI dye (stains only nuclei), and observed under a fluorescence microscope.
Η καλλιέργεια των ΜCF7 κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε συνθήκες 37°C και 5% CO2 και ως θρεπτικό μέσο χρησιμοποιήθηκε DMEM (Gibco Cat.No.:41 966-029) εμπλουτισμένο με 20% κατ’ όγκο εμβρυϊκό ορό βοός (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco Cat.No.:10106-169). To θρεπτικό μέσο περιείχε επίσης πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη ως αντιβιοτικά (P/S, Gibco Cat.No.:15140-122), σε τελική συγκέντρωση 1%. The culture of MCF7 cells was carried out at 37°C and 5% CO2 and DMEM (Gibco Cat.No.:41 966-029) enriched with 20% by volume Fetal Bovine Serum (FBS) was used as the nutrient medium. Gibco Cat.No.:10106-169). The medium also contained penicillin and streptomycin as antibiotics (P/S, Gibco Cat.No.:15140-122), at a final concentration of 1%.
Ο πειραματικός σχεδιασμός περιελάμβανε την παροδική συν-διαμόλυνση MCF7 καρκινικών κυττάρων με Geminin-GFP & dhcRed και Geminin-GFP & Cdt1DEL-dhcRed. Η συν-διαμόλυνση Geminin-GFP & dhcRed χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός μάρτυρας του κυτταρικού συστήματος μελέτης, προκειμένου να διαπιστωθεί ότι είναι δυνατή η ανίχνευση της μεταβολής της ενδοκυτταρικής κατανομής της Geminin-GFP παρουσία CdtI DEL-dhcRed. Η μελέτη της ενδοκυπαρικής κατανομής της Geminin πραγματοποιήθηκε μέσω της παρατήρησης του αυτοφθορισμού του GFP μορίου. Για την ποσοτικοποίηση της ενδοκυτταρικής κατανομής της εξωγενούς Geminin-GFP μετρήθηκαν τουλάχιστον 100 θεπκώς συν-διαμολυσμένα κύτταρα από διαφορετικά οπτικά πεδία, για κάθε συνθήκη. Η κατηγοριοποίηση έγινε με βάση τον εντοπισμό του σήματος του GFP μορίου και περιελάμβανε τρεις ομάδες: αμιγώς πυρηνική κατανομή (πυρηνικός εντοπισμός), αμιγώς κυτταροπλασματική κατανομή (πυρηνικός αποκλεισμός) και ομοιογενής κατανομή (ομοιογενής εντοπισμός) σε ολόκληρο το κύτταρο (πυρήνας και κυτταρόπλασμα). Τα γραφήματα της Εικ. 7 αναπαριστούν τους μέσους όρους των μετρήσεων (εκφρασμένοι ως %) από τρία τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα και οι γραμμές σφάλματος το τυπικό σφάλμα των μέσων όρων. Ο άξονας χ αναπαριστά τις δύο διαφορετικές συνθήκες παροδικής συν-διαμόλυνσης που δοκιμάστηκαν, ενώ ο άξονας y το ποσοστό (%) των συν-διαμολυσμένων κυττάρων. The experimental design involved the transient co-transfection of MCF7 cancer cells with Geminin-GFP & dhcRed and Geminin-GFP & Cdt1DEL-dhcRed. Geminin-GFP & dhcRed co-transfection was used as an internal control of the study cell system, in order to establish that it is possible to detect the change in the intracellular distribution of Geminin-GFP in the presence of CdtI DEL-dhcRed. The study of the intracellular distribution of Geminin was performed by observing the autofluorescence of the GFP molecule. To quantify the intracellular distribution of exogenous Geminin-GFP, at least 100 well co-transfected cells from different fields of view were counted for each condition. Categorization was based on localization of the GFP molecule signal and included three groups: purely nuclear distribution (nuclear localization), purely cytoplasmic distribution (nuclear exclusion), and homogeneous distribution (homogeneous localization) throughout the cell (nucleus and cytoplasm). The graphs in Fig. 7 represent the means of measurements (expressed as %) from at least three independent experiments and the error bars the standard error of the means. The x-axis represents the two different transient co-transfection conditions tested, while the y-axis the percentage (%) of co-transfected cells.
Τα κύτταρα τα οποία είχαν συν-διαμολυνθεί με Geminin-GFP & dhcRed εμφάνισαν υψηλότερο ποσοστό πυρηνικού αποκλεισμού της Geminin έναντι των αντίστοιχων κυττάρων τα οποία είχαν συν-διαμολυνθεί με Geminin-GFP & CdtIDEL-dhcRed (Εικ. 7). Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει την καταλληλότητα και την ευαισθησία του συγκεκριμένου κυτταρικού συστηματος μελέτης, όσον αφορά την ανίχνευση της ενδοκυτταρικής κατανομής της Geminin-GFP. Cells co-transfected with Geminin-GFP & dhcRed showed a higher rate of nuclear exclusion of Geminin than the corresponding cells co-transfected with Geminin-GFP & CdtIDEL-dhcRed (Fig. 7). This observation indicates the suitability and sensitivity of the specific study cell system, regarding the detection of the intracellular distribution of Geminin-GFP.
Για τη μελέτη της επίδρασης των συνθετικών χημικών ενώσεων στην ενδοκυτταρική κατανομή της Geminin-GFP, ως δείγματα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν συν-διαμολυσμένα κύτταρα τα οποία δεν είχαν υποστεί επώαση με κάποια συνθετική χημική ένωση, ούτε με DMSO (control) και κύτταρα τα οποία είχαν υποστεί επώαση μόνο με DMSO. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα (Εικ. 7Α), η συνθετική χημική ένωση AF-615/30368009 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων με πυρηνικό εντοπισμό της Geminin, στην περίπτωση της συν-διαμόλυνσης Geminin-GFP & dhcRed. Μια πιθανή ερμηνεία της συγκεκριμένης παρατήρησης είναι ότι ο τρόπος δράσης της ένωσης μιμείται τον αντίστοιχο της πρωτεΐνης Cdt1, όσον αφορά την ικανότητά της να προκαλεί μετατόπιση της Geminin στον πυρήνα. Στα κύτταρα τα οποία είχαν συν-διαμολυνθεί με Geminin-GFP & CdtI DEL-dhcRed, η ένωση AF-615/30368009 δεν προκάλεσε ανιχνεύσιμη μεταβολή στην ενδοκυτταρική κατανομή της Geminin. Το γεγονός αυτό πιθανόν να οφείλεται στο ότι η δράση της δεν είναι τόσο ισχυρή ώστε να αντισταθμίσει αποτελεσματικά την εξωγενή παρουσία της πρωτεΐνης Cdt1. Η συνθετική χημική ένωση ΑΝ-689/41741104 (Εικ. 7Β) προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων με πυρηνικό αποκλεισμό της Geminin, και στις δύο συνθήκες συν-διαμόλυνσης Geminin-GFP & dhcRed και Geminin-GFP & CdtI DEL-dhcRed. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει την ειδικότητα και την ικανότητά της να επηρεάζει ex vivo την πρωτεϊνική αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 καθώς και τον διαφορετικό μηχανισμό δράσης της, σε σύγκριση με την ένωση AF-615/30368009. To study the effect of synthetic chemical compounds on the intracellular distribution of Geminin-GFP, co-transfected cells that had not been incubated with any synthetic chemical compound, nor with DMSO (control) and cells that had been incubated were used as control samples with DMSO only. According to the results (Fig. 7A), the synthetic chemical compound AF-615/30368009 caused a statistically significant increase in the percentage of cells with nuclear localization of Geminin, in the case of Geminin-GFP & dhcRed co-transfection. One possible interpretation of this observation is that the compound's mode of action mimics that of the Cdt1 protein in terms of its ability to induce translocation of Geminin to the nucleus. In cells co-transfected with Geminin-GFP & CdtI DEL-dhcRed, AF-615/30368009 did not cause a detectable change in the intracellular distribution of Geminin. This fact is probably due to the fact that its action is not so strong as to effectively compensate for the exogenous presence of the Cdt1 protein. The synthetic compound AN-689/41741104 (Fig. 7B) caused a statistically significant increase in the percentage of cells with nuclear exclusion of Geminin, in both Geminin-GFP & dhcRed and Geminin-GFP & CdtI DEL-dhcRed co-transfection conditions. This observation indicates its specificity and ability to affect Geminin-Cdt1 protein interaction ex vivo as well as its different mechanism of action, compared to compound AF-615/30368009.
Παράδειγμα 8 Example 8
Επίδραση των συνθετικών χημικών ενώσεων AF -615/30366003 και ΑΝ-689/41741104 στον κυτταρικό κύκλο καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων Effect of the synthetic chemical compounds AF-615/30366003 and AN-689/41741104 on the cell cycle of cancer and normal cells
Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες Geminin και Cdt1 συνιστούν βασικούς ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, μελετήθηκε η επίδραση των συνθετικών χημικών ενώσεων στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. Πραγματοποιήθηκε χρώση του γενετικού υλικού των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο και εφαρμόστηκε η τεχνική της κυτταρομετρίας ροής για τον διαχωρισμό τους, με βάση την ποσότητα του γενετικού τους υλικού . Since Geminin and Cdt1 proteins are key regulators of the cell cycle, the effect of synthetic chemical compounds on the cell cycle progression of cancer and normal cells was studied. The genetic material of the cells was stained with propidium iodide and the flow cytometry technique was applied to separate them, based on the amount of their genetic material.
Ως καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν MCF7 κύπαρα και ως φυσιολογικά χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή κύτταρα και συγκεκριμένα εμβρυϊκοί ινοβλάστες μυός (Mouse Embryonic Fibroblasts, MEFs). MCF7 cells were used as cancer cells and primary cells, namely mouse embryonic fibroblasts (MEFs), were used as normal cells.
Τα κύτταρα επωάστηκαν με την εκάστοτε συνθετική χημική ένωση και καλλιεργήθηκαν για 23hrs σε τρυβλίο διαμέτρου 100mm, μέχρι 80-90% κάλυψης της επιφάνειας του τρυβλίου. Οι συνθετικές χημικές ενώσεις AF-6 15/30368009 και ΑΝ-689/41741104 χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 100μΜ και 25μΜ αντίστοιχα, λόγω της διαφορετικής κυτταροτοξικότητάς τους. Ως δείγμα αρνητικού ελέγχου (control) χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία είχαν υποστεί επώαση μόνο με DMSO. Την επόμενη μέρα της επώασης, πραγματοποιήθηκε αραίωση των κυττάρων με χρήση θρυψίνης. Μετά το στάδιο της φυγοκέντρησης, το ίζημα αναδιαλύθηκε σε 1Χ PBS και φυγοκεντρήθηκε στα 800rpm για 5 λεπτά. Εν συνεχεία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 70% παγωμένη (4°C) αιθανόλη και φυλάχθηκαν για τουλάχιστον 16hrs στους -20°C. Μετά τη μονιμοποίηση, πραγματοποιήθηκαν πλύσεις με 1Χ PBS (2 φορές) και ακολούθησε προσθήκη 2μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (propidium iodide) και 100μg /ml RNase Α. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε κυτταρομετρητή ροής της εταιρείας Becton Dickinson και τα δεδομένα αναλύθηκαν μέσω του λογισμικού WinMDi 2.8. The cells were incubated with each synthetic chemical compound and cultured for 23hrs in a 100mm diameter plate, until 80-90% coverage of the plate surface. The synthetic chemical compounds AF-6 15/30368009 and AN-689/41741104 were used at a concentration of 100μM and 25μM, respectively, due to their different cytotoxicity. Cells incubated only with DMSO were used as a negative control sample. The next day of incubation, cell dilution was performed using trypsin. After the centrifugation step, the pellet was resuspended in 1X PBS and centrifuged at 800 rpm for 5 min. Then, cells were fixed in 70% ice-cold (4°C) ethanol and stored for at least 16hrs at -20°C. After fixation, washes were performed with 1X PBS (2 times) followed by addition of 2μg/ml propidium iodide and 100μg/ml RNase A. Experiments were performed on a Becton Dickinson flow cytometer and data were analyzed using WinMDi software 2.8.
Η καλλιέργεια των MEFs κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε συνθήκες 37°C και 5 % C02 και χρησιμοποιήθηκε ως θρεπτικό μέσο DMEM (Gibco) εμπλουτισμένο με 10% κατ’όγκο εμβρυϊκό ορό βοός (Fetal Bovine Serum, FBS) και 2mM τελική συγκέντρωση γλουταμίνης (Gibco, Cat.No.:25030-024). Το θρεπτικό μέσο περιείχε επίσης πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη ως αντιβιοτικά (P/S, Gibco Cat.No.:15140-122) σε τελική συγκέντρωση 1%. MEFs cells were cultured at 37°C and 5% CO2 and DMEM (Gibco) supplemented with 10% by volume Fetal Bovine Serum (FBS) and 2mM final concentration of glutamine (Gibco, Cat) was used as a medium. .No.:25030-024). The medium also contained penicillin and streptomycin as antibiotics (P/S, Gibco Cat.No.:15140-122) at a final concentration of 1%.
Τα διαγράμματα που παρουσιάζονται στην Εικ. 8 είναι αντιπροσωπευτικά από δύο τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα. Ο άξονας χ αναπαριστά την ένταση του φθορισμού του ιωδιούχου προπιδίου και κατ’ αναλογία την ποσότητα του γενετικού υλικού των κυττάρων, ενώ ο άξονας y τον αριθμό των συμβάντων που αντιστοιχούν σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. The plots shown in Fig. 8 are representative of at least two independent experiments. The x-axis represents the intensity of propidium iodide fluorescence and correspondingly the amount of genetic material of the cells, while the y-axis represents the number of events corresponding to each phase of the cell cycle.
Τα αποτελέσματα (Εικ. 8) έδειξαν ότι η επώαση των MCF7 καρκινικών κυττάρων με τη συνθετική χημική ένωση AF-615/30368009 (Εικ. 8Β) προκάλεσε σημαντική αύξηση του ποσοστού (%) των κυττάρων των φάσεων G0/G1 και S σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου (Εικ. 8Α). Επίσης, ο πληθυσμός των κυττάρων που αντιστοιχεί στη φάση G2/M του κυτταρικού κύκλου ήταν εξαιρετικά περιορισμένος σε σύγκριση με το control (Εικ. 8Α). Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η συνθετική χημική ένωση AF-615/30368009 προκαλεί αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων MCF7, κατά το στάδιο μετάβασης G1/S. Η συνθετική χημική ένωση ΑΝ-689/41741104 προκάλεσε ελάττωση του ποσοστού- (%) των κυττάρων της φάσης G0/G1 , χωρίς ωστόσο να προκαλέσει αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, όπως υποδεικνύεται και από το σημαντικό ποσοστό (%) των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση G2/M (Εικ. 8Γ). The results (Fig. 8) showed that incubation of MCF7 cancer cells with the synthetic chemical compound AF-615/30368009 (Fig. 8B) caused a significant increase in the percentage (%) of G0/G1 and S phase cells compared to the control sample (Fig. 8A). Also, the population of cells corresponding to the G2/M phase of the cell cycle was extremely limited compared to the control (Fig. 8A). The specific results indicate that the synthetic chemical compound AF-615/30368009 causes inhibition of the cell cycle progression of MCF7 cancer cells, during the G1/S transition stage. The synthetic chemical compound AN-689/41741104 caused a decrease in the percentage- (%) of cells in the G0/G1 phase, without, however, causing inhibition of cell cycle progression, as indicated by the significant percentage (%) of cells in in G2/M phase (Fig. 8C).
Προκειμένου να διαπιστωθεί η επιλεκτικότητα της δράσης των συνθετικών χημικών ενώσεων μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων, μελετήθηκε η επίδρασή τους στον κυτταρικό κύκλο πρωτογενών κυττάρων (MEFs). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ένωση AF -615/30368009 (Εικ. 8Ε) δεν προκάλεσε σημαντική μεταβολή του ποσοστού των κυττάρων των φάσεων G0/G1 και S, παρά μόνο ήπια ελάττωση του αντίστοιχου ποσοστού της φάσης G2/M σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου (Εικ. 8Δ). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η ένωση AF-61 5/30368009 δεν προκαλεί στα φυσιολογικά κύτταρα αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, τόσο έντονη όπως παρατηρήθηκε στην περίπτωση των MCF7 καρκινικών κυττάρων (Εικ. 8Β). Η συγκεκριμένη παρατήρηση είναι εξαιρετικής σημασίας, καθώς προτείνει την επιλεκτική δράση της συγκεκριμένης συνθετικής χημικής ένωσης σε καρκινικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών (πρωτογενών). Η συνθετική χημική ένωση ΑΝ-689/41741104 (Εικ. 8ΣΤ) δεν προκάλεσε σημαντική μεταβολή του προτύπου κατανομής του κυτταρικού πληθυσμού σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου (Εικ. 8Δ). In order to establish the selectivity of the action of the synthetic chemical compounds between cancer and normal cells, their effect on the cell cycle of primary cells (MEFs) was studied. The results showed that compound AF -615/30368009 (Fig. 8E) did not cause a significant change in the percentage of G0/G1 and S phase cells, but only a slight decrease in the corresponding percentage of G2/M phase compared to the control sample. (Fig. 8D). These results indicate that compound AF-61 5/30368009 does not cause cell cycle progression inhibition in normal cells, as pronounced as observed in the case of MCF7 cancer cells (Fig. 8B). This particular observation is of great importance, as it suggests the selective action of the specific synthetic chemical compound on cancer cells against normal (primary) cells. The synthetic chemical compound AN-689/41741104 (Fig. 8F) did not cause a significant change in the distribution pattern of the cell population compared to the control sample (Fig. 8D).
Συμπερασματικά, η παρούσα εφεύρεση είναι η πρώτη που περιγράφει την εφαρμογή ενός μαζικού ελέγχου υψηλής απόδοσης (High Throughput Screening), με σκοπό την ταυτοποίηση ειδικών συνθετικών χημικών ενώσεων με ικανότητα διάσπασης του πρωτεϊνικού συμπλόκου Geminin-Cdt1 . Επίσης είναι η πρώτη που αναφέρεται στην ανάπτυξη και εφαρμογή κατάλληλων κυτταρικών συστημάτων μελέτης για την ειδικότητα και τον μηχανισμό δράσης συνθετικών χημικών ενώσεων που στοχεύουν στο σύμπλοκο Geminin-Cdt1. Επιπλέον, είναι η πρώτη που αναφέρεται στην επιλεκτική δράση ενός μικρομοριακού αναστολέα της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 , έναντι των καρκινικών κυττάρων. Η παρατήρηση ότι η ένωση AF-615/30368009 αναστέλλει επιλεκτικά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων, προτείνει πιθανή μελλοντική της χρήση για τη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου και άλλων ασθενειών που χαρακτηρίζονται από δυσλειτουργία των μηχανισμών ελέγχου της κυτταρικής διαίρεσης. Η συνθετική χημική ένωση· AΝ-689/41741104 δεν φθίνετε» να επηρρεάζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων, γεγόνος που ενδέχεται να σχετίζεται με τον διαφορετικό μηχανισμό δράσης της, όπως διαπιστώθηκε κατά την μελέτη της ενδοκυτταρικής κατανομής της εξωγενούς Geminin. In conclusion, the present invention is the first to describe the application of a high-throughput mass control (High Throughput Screening), in order to identify specific synthetic chemical compounds with the ability to break down the Geminin-Cdt1 protein complex. It is also the first to report on the development and application of appropriate cellular study systems for the specificity and mechanism of action of synthetic chemical compounds targeting the Geminin-Cdt1 complex. In addition, it is the first to report the selective action of a small molecule inhibitor of the Geminin-Cdt1 interaction, against cancer cells. The observation that AF-615/30368009 selectively inhibits the cell cycle progression of cancer cells suggests its potential future use in the treatment of cancer and other diseases characterized by dysfunction of cell division control mechanisms. The synthetic chemical compound; AN-689/41741104 does not decrease' affects the progression of the cell cycle of cancer cells, a fact that may be related to its different mechanism of action, as found during the study of the intracellular distribution of exogenous Geminin.
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20160100282A GR20160100282A (en) | 2016-05-23 | 2016-05-23 | High-efficiency mass control method for factors able to break and/or inhibit the formation of a geminin-cdt1 complex |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20160100282A GR20160100282A (en) | 2016-05-23 | 2016-05-23 | High-efficiency mass control method for factors able to break and/or inhibit the formation of a geminin-cdt1 complex |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR1009201B GR1009201B (en) | 2018-01-23 |
| GR20160100282A true GR20160100282A (en) | 2018-02-05 |
Family
ID=61274892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20160100282A GR20160100282A (en) | 2016-05-23 | 2016-05-23 | High-efficiency mass control method for factors able to break and/or inhibit the formation of a geminin-cdt1 complex |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| GR (1) | GR20160100282A (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008096397A (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Japan Health Science Foundation | Method for screening anti-carcinogenic substance |
-
2016
- 2016-05-23 GR GR20160100282A patent/GR20160100282A/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008096397A (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Japan Health Science Foundation | Method for screening anti-carcinogenic substance |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR1009201B (en) | 2018-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| van der Linden et al. | A turquoise fluorescence lifetime-based biosensor for quantitative imaging of intracellular calcium | |
| DeLuca et al. | Temporal changes in Hec1 phosphorylation control kinetochore–microtubule attachment stability during mitosis | |
| Outeiro et al. | Formation of toxic oligomeric α-synuclein species in living cells | |
| Donthamsetti et al. | Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) to characterize agonist‐induced arrestin recruitment to modified and unmodified G protein‐coupled receptors | |
| US10794898B2 (en) | High-throughput, high-precision methods for detecting protein structural changes in living cells | |
| Solvie et al. | MYC multimers shield stalled replication forks from RNA polymerase | |
| JP2006518853A (en) | Protein fragment complementation assays for high-throughput and high-content screening | |
| US9429566B2 (en) | Assay for inhibitors of CIP/KIP protein degradation | |
| Huo et al. | The MFN1 and MFN2 mitofusins promote clustering between mitochondria and peroxisomes | |
| Wolf et al. | GDAP1 loss of function inhibits the mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex by altering the actin cytoskeleton | |
| Zhang et al. | Autophagic flux detection: significance and methods involved | |
| Wan et al. | A FRET-based method for monitoring structural transitions in protein self-organization | |
| Hattori et al. | Split luciferase complementation for analysis of intracellular signaling | |
| Shi et al. | Sensitive imaging of Endoplasmic reticulum (ER) autophagy with an acidity-reporting ER-Tracker | |
| Huang et al. | A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation | |
| Garbouchian et al. | KAP is the neuronal organelle adaptor for Kinesin-2 KIF3AB and KIF3AC | |
| US10067143B2 (en) | Ubiquitination assay | |
| US10024865B2 (en) | Ubiquitination assay | |
| GR20160100282A (en) | High-efficiency mass control method for factors able to break and/or inhibit the formation of a geminin-cdt1 complex | |
| Shen et al. | Genetically encoded ratiometric indicators for potassium ion | |
| WO2022245922A1 (en) | Poly-adp ribose (par) tracker optimized split-protein reassembly par detection reagents | |
| ES2739525T3 (en) | Methods to detect interactions in eukaryotic cells using microtubule structures and dynamics | |
| JP2012127694A (en) | Detection method of intracellular ubiquitination | |
| Xiong et al. | Development of a novel immunoassay to detect interactions with the transactivation domain of p53: application to screening of new drugs | |
| Sheng et al. | Imaging specific newly synthesized proteins within cells by fluorescence resonance energy transfer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PG | Patent granted |
Effective date: 20180330 |