GR1010362B

GR1010362B - Process of immobilisation of probiotic cells in oats for the production of probiotic-enriched snack products

Info

Publication number: GR1010362B
Application number: GR20210100456A
Authority: GR
Inventors: Παναγιωτης Πανας; Ιωαννης Κουρκουτας
Original assignee: Πανας Π. - Κλαουδατος Α. Οε,; Κουρκουτας, Γιαννης
Priority date: 2021-07-06
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2022-12-21

Abstract

The invention relates to the production of new functional food containing probiotic microorganisms. The high concentration of probiotic cells required for a positive effect is an obstacle for the food industry, limiting the types of food and requiring special know-how for food development. Even when the addition of a high concentration is technologically achieved, this last should remain constant throughout the life of the product. The present invention relates to a process in which oat flakes (in any form) are used as carriers for entrapping or immobilizing cells of probiotic cultures (such as strains of the genus Lactobacillus and Bifidobacterium) in order to enhance their viability and vitality and to add them to snack products (e.g. chocolate) for the production of finished food products. Using this process, food products will be characterized by a high concentration of live lactic acid bacteria cells.

Description

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ DESCRIPTION

ΔΙΕΡΓΑΣΙΑ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΒΡΩΜΗ IMMOBILIZATION PROCESS OF PROBIOTIC CELLS IN OATS

ΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ-ΣΝΑΚ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΩΝ ΜΕ FOR PRODUCTION OF SNACK PRODUCTS ENRICHED WITH

ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΑ PROBIOTICS

ΤΕΧΝΙΚΟ ΠΕΔΙΟ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΕΤΑΙ Η ΕΦΕΥΡΕΣΗ TECHNICAL FIELD TO WHICH THE INVENTION RELETS

Η παρούσα εφεύρεση αφορά σε διεργασία στην οποία νιφάδες βρώμης (σε οποιαδήποτε μορφή) χρησιμοποιούνται ως φορείς εγκλωβισμού ή ακινητοποίησης κυττάρων προβιοτικών καλλιεργειών (όπως στελέχη του γένους Lactobacillus και Bifidobacterium) με σκοπό την ενίσχυση της βιωσιμότητας και ζωτικότητα τους και την προσθήκη τους σε σοκολάτα για την παραγωγή τελικών προϊόντων διατροφής. Με τη χρήση της διεργασίας αυτής, τα προϊόντα διατροφής θα χαρακτηρίζονται από υψηλή συγκέντρωση ζωντανών κυττάρων γαλακτικών βακτηρίων. Η αξία της παρούσας εφεύρεσης στηρίζεται στη δυνατότητα που θα παρέχεται στο τελικό προϊόν να φέρει μεγάλο αριθμό ζωντανών κυττάρων, η βιωσιμότητα των οποίων θα παραμένει σταθερή σε υψηλό ποσοστό κατά τη διάρκεια ζωής του προϊόντος. Κατά αυτόν τον τρόπο θα ικανοποιείται μία συνήθη βασική απαίτηση της κατανάλωσης των προβιοτικών κυττάρων που αφορά τη ημερήσια δόση κατανάλωσης, η οποία τις περισσότερες φορές (εξαρτάται από το στέλεχος) θα πρέπει να ξεπερνά το 1 δις κύτταρα ανά μερίδα ή δόση για να μπορεί να επιφέρει ένα ευεργετικό αποτέλεσμα βάσει των ιδιοτήτων του στελέχους που έχει ακινητοποιηθεί στη βρώμη. The present invention relates to a process in which oat flakes (in any form) are used as carriers for entrapping or immobilizing cells of probiotic cultures (such as strains of the genus Lactobacillus and Bifidobacterium) with the aim of enhancing their viability and vitality and adding them to chocolate for production of finished food products. Using this process, food products will be characterized by a high concentration of live lactic acid bacteria cells. The value of the present invention is based on the possibility provided to the final product to carry a large number of living cells, the viability of which will remain constant at a high rate during the life of the product. In this way, a common basic requirement of the consumption of the probiotic cells regarding the daily consumption dose will be satisfied, which most of the time (depends on the strain) should exceed 1 billion cells per serving or dose to be able to bring about a beneficial effect based on the properties of the strain immobilized in oats.

ΣΤΑΘΜΗ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΑΥΤΗΣ PRIOR ART AND EVALUATION THEREOF

Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται έντονο ενδιαφέρον για την παραγωγή νέων λειτουργικών τροφίμων, που περιέχουν προβιοτικούς μικροοργανισμούς. Ο όρος «προβιοτικοί μικροοργανισμού) αφορά ζωντανούς μικροοργανισμούς, οι οποίοι, όταν χορηγούνται στην κατάλληλη δοσολογία, επιφέρουν θετικό αποτέλεσμα στην υγεία του ξενιστή (FAO/WHO, 2002). Οι περισσότεροι προβιοτικοί μικροοργανισμοί ανήκουν στα γένη Lactobacillus και Bifidobacterium, και χρησιμοποιούνται κυρίως για την παραγωγή ζυμωμένων προϊόντων γάλακτος. In recent years there has been a strong interest in the production of new functional foods containing probiotic microorganisms. The term "microorganism probiotics) refers to live microorganisms, which, when administered in the appropriate dosage, bring about a positive effect on the health of the host (FAO/WHO, 2002). Most probiotic microorganisms belong to the genera Lactobacillus and Bifidobacterium, and are mainly used for the production of fermented milk products.

Παραδοσιακά, τα τρόφιμα που περιείχαν προβιοτικές καλλιέργειες ήταν τα ζυμωμένα τρόφιμα όπως το kefir, το ξινολάχανο και τα ζυμούμενα λαχανικά. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν διάφορα γαλακτοκομικά προϊόντα, όπως το Activia (Danone), το ρόφημα γιαουρτιού της Yakult, το ξινόγαλα της Normejerier, κ.ά. Πιο πρόσφατα, οι προβιοτικοί χυμοί GoodBelly της Danone, οι τσίχλες της Nebraska cultures και τα καλαμάκια για γάλα της αυστραλέζικης Unstraw, αποδεικνύοντας τις έντονες προσπάθειες που γίνονται για την ανάπτυξη και παραγωγή νέων προβιοτικών προϊόντων. Σημαντικό παράγοντα στην επιτυχία αυτών των προϊόντων αποτελεί το προβιοτικό στέλεχος και η συγκέντρωσή του τη στιγμή της κατανάλωσης. Traditionally, foods containing probiotic cultures were fermented foods such as kefir, sauerkraut, and fermented vegetables. Subsequently, various dairy products were developed, such as Activia (Danone), Yakult's yogurt drink, Normejerier's sour milk, etc. More recently, Danone's GoodBelly probiotic juices, Nebraska cultures' chewing gum and Australia's Unstraw milk straws, demonstrating the intense efforts being made to develop and produce new probiotic products. An important factor in the success of these products is the probiotic strain and its concentration at the time of consumption.

Για την εκδήλωση ευεργετικής δράσης, τα προβιοτικά τρόφιμα πρέπει να περιέχουν υψηλό αριθμό ζωντανών κυττάρων, τα προβιοτικά στελέχη πρέπει να χαρακτηρίζονται από ανθεκτικότητα σε όξινες συνθήκες και σε χολικά άλατα, ώστε να μπορούν να επιβιώνουν κατά την πέψη και να επηρεάζουν θετικά τη φυσιολογική εντερική μικροβιακή χλωρίδα ή κάποια γαστρεντερική λειτουργία. Σύμφωνα με τη διεθνή ένωση International Probiotic Association EUROPE, η επαρκής ποσότητα ζωντανών κυττάρων για την εκδήλωση θετικής επίδρασης είναι 10<9>ζωντανά κύτταρα ανά ημερήσια δόση, χωρίς βέβαια να αποκλείονται μικρότερες ποσότητες για συγκεκριμένο προβιοτικό στέλεχος. In order to have a beneficial effect, probiotic foods must contain a high number of living cells, probiotic strains must be characterized by resistance to acidic conditions and bile salts, so that they can survive digestion and positively affect the normal intestinal microbial flora or some gastrointestinal function. According to the international association International Probiotic Association EUROPE, the sufficient amount of live cells for the manifestation of a positive effect is 10<9> live cells per daily dose, without, of course, excluding smaller amounts for a specific probiotic strain.

Η στρατηγική που θα εφαρμοσθεί για την προσθήκη προβιοτικών μικροοργανισμών στα τρόφιμα αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για να επιτευχθεί η αναγκαία υψηλή συγκέντρωση, ειδικά τη στιγμή της κατανάλωσης. Ακόμα και όταν τεχνολογικά επιτευχθεί η προσθήκη υψηλής συγκέντρωσης, αυτή θα πρέπει να παραμείνει σταθερή καθ’ όλη τη διάρκεια του χρόνου ζωής του προϊόντος. Καθώς η συγκεκριμένη απαίτηση δεν είναι εύκολο να επιτευχθεί λόγω της ευαισθησίας των προβιοτικών κυττάρων στις βιομηχανικές πρακτικές, η ποικιλία εμπορικών προϊόντων και η αποτελεσματικότητα τους είναι αρκετά περιορισμένα. Γενικά υπάρχει μία έντονη ερευνητική δραστηριότητα για την ενίσχυση της βιωσιμότητας και σταθερότητας των προβιοτικών κυττάρων με διάφορες τεχνικές. Ανάμεσα τους διακρίνονται η stress adaptation, η προσθήκη διαθρεπτικών συστατικών (micronutrients) και η μικροεγκαψυλίωση με διάφορους περιορισμούς. The strategy to be applied to add probiotic microorganisms to food is a decisive factor to achieve the necessary high concentration, especially at the time of consumption. Even when the addition of a high concentration is technologically achieved, it should remain constant throughout the life of the product. As this requirement is not easy to achieve due to the sensitivity of probiotic cells to industrial practices, the variety of commercial products and their effectiveness are quite limited. In general there is an intense research activity to enhance the viability and stability of probiotic cells by various techniques. Among them are stress adaptation, the addition of micronutrients and microencapsulation with various restrictions.

Καθώς είναι γνωστό πως η ακινητοποίηση συμβάλλει στην επιβίωση των προβιοτικών κυττάρων, αποτελεί μία δυνητική λύση για την παραγωγή νέων λειτουργικών τροφίμων που θα είναι εμπλουτισμένα με ακινητοποιημένα προβιοτικά κύτταρα σε φυσικούς φορείς (Mitropoulou et al., 2013). Ως ακινητοποίηση (immobilization) ορίζεται ο περιορισμός, ο εγκλωβισμός ή/και η προσκόλληση, κυττάρων σε στερεό φορέα. Πράγματι, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η χρήση ακινητοποιημένων καλλιεργειών στην παραγωγή προβιοτικών τροφίμων οδήγησε σε αυξημένη ζωτικότητα των κυττάρων, βελτιωμένα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και αυξημένη αντίσταση σε μικροβιακή προσβολή, με αποτέλεσμα την αύξηση του χρόνου συντήρησης ακόμα και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (Sidira et al., 2014a; 2014b; Mitropoulou et al., 2013). Σε in vitro μελέτες, η ακινητοποίηση σε κομμάτια μήλου και σε αλγινικά είχε επίσης σημαντική θετική επίδραση στην αντοχή κυττάρων του προβιοτικού στελέχους L. casei ATCC 393 σε όξινες συνθήκες που προσομοίασαν το περιβάλλον του στομάχου (χαμηλό pH) και του ανώτερου γαστρεντερικού σωλήνα (χολικά άλατα και παγκρεατικά υγρά) συγκριτικά με τα ελεύθερα κύτταρα (Sidira et al., 2010; Dimitrellou et al., 2019). Επιπλέον, in vivo πειράματα με επίμυες φυλής Wistar έδειξαν αντοχή του παραπάνω στελέχους κατά τη δίοδο διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα (Sidira et al., 2010), παροδική προσκόλληση στον βλεννογόνο του παχέος εντέρου (Saxami et al., 2012, ρύθμιση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας (Sidira et al., 2010) και σημαντικές αντινεοπλασματικές ιδιότητες<7>. As it is known that immobilization contributes to the survival of probiotic cells, it is a potential solution for the production of new functional foods that will be enriched with immobilized probiotic cells in natural carriers (Mitropoulou et al., 2013). Immobilization is defined as the restriction, entrapment and/or adhesion of cells to a solid carrier. Indeed, previous studies showed that the use of immobilized cultures in the production of probiotic foods led to increased cell viability, improved organoleptic characteristics and increased resistance to microbial attack, resulting in increased shelf life even at ambient temperature (Sidira et al., 2014a ; 2014b; Mitropoulou et al., 2013). In in vitro studies, immobilization in apple pieces and in alginates also had a significant positive effect on the resistance of cells of the probiotic strain L. casei ATCC 393 to acidic conditions simulating the environment of the stomach (low pH) and the upper gastrointestinal tract (bile salts and pancreatic fluids) compared to free cells (Sidira et al., 2010; Dimitrellou et al., 2019). In addition, in vivo experiments with Wistar rats showed persistence of the above strain during passage through the gastrointestinal tract (Sidira et al., 2010), transient adherence to the colonic mucosa (Saxami et al., 2012, regulation of intestinal microbial flora (Sidira et al., 2010) and significant antineoplastic properties<7>.

Επομένως, η επιλογή των φορέων ακινητοποίηση ς θεωρείται κρίσιμη παράμετρος. Οι φυσικοί φορείς (ξηρά φρούτα, δημητριακά, ξηροί καρποί) εμφανίζουν μία σειρά από πλεονεκτήματα, καθώς μπορούν να βελτιώσουν τη διατροφική αξία των νέων τροφίμων και πολλές φορές αποτελούν μέρος της συνταγής τους. Therefore, the choice of immobilizers is considered a critical parameter. Natural carriers (dried fruits, cereals, nuts) show a number of advantages, as they can improve the nutritional value of new foods and are often part of their recipe.

Είναι, λοιπόν, σαφές πως η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων στην παραγωγή τροφίμων αποτελεί πρόκληση σήμερα για τη βιομηχανία. It is, therefore, clear that the use of immobilized cells in food production is a challenge for the industry today.

Σε ερευνητικό επίπεδο, πολλές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στην ακινητοποίηση των προβιοτικών βακτηρίων σε φρούτα, δημητριακά και ξηρούς καρπούς, με στόχο τη σταθεροποίηση των κυττάρων και την παραγωγή νέων σταθερών λειτουργικών τροφίμων που θα περιέχουν ζωντανά ακινητοποιημένα προβιοτικά κύτταρα σε υψηλή συγκέντρωση και που θα διατηρούνται ζωντανά τόσο κατά τη διάρκεια αποθήκευσης του προϊόντος όσο και κατά τη βρώση. At the research level, many efforts have focused on the immobilization of probiotic bacteria in fruits, grains and nuts, with the aim of cell stabilization and the production of new stable functional foods that will contain live immobilized probiotic cells in high concentration and that will be kept alive both during storage of the product as well as during eating.

Κομμάτια μήλου (Dimitrellou et al., 2019; Bosnea et al., 2017; Kopsahelis et al., 2007; Kourkoutas et al., 2006a; 2006b; 2005), αχλαδιού (Kopsahelis et al., 2007), σταφίδας (Nikolaou et al., 2020; Bosnea et al. 2017), κυδωνιού (Koukoutas et al., 2005), ιπποφαούς ( Hippophae rhamnoides L.) (Terpou et al., 2019), cranberry (Nikolaou et al., 2020), φράουλας και μπανάνας (Sidira et al., 2013; Dimitrellou et al., 2012) έχουν προταθεί ως φορείς ακινητοποίηση ς του στελέχους L. casei ATCC 393, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus και άλλων γαλακτικών βακτηρίων. Τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei ATCC 393 (σε υγρή ή λυοφιλιωμένη μορφή) χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια ως πρόσθετη καλλιέργεια στην παραγωγή ζυμωμένου γάλακτος (Kourkoutas et al. 2006b; 2005), τυριού τύπου φέτα (Kourkoutas et al. 2006a), γιαουρτιού (Dimitrellou et al., 2019; Bosnea et al., 2017; Sidira et al., 2013; Dimitrelou et al., 2012) και παγωμένου γιαουρτιού (frozen yogurt) (Terpou et al., 2019), ενώ τα θερμικά αποξηραμένα ακινητοποιημένα κύτταρα Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus δοκιμάστηκαν για γαλακτική ζύμωση τυρογάλακτος (Kopsahelis et al., 2007). Pieces of apple (Dimitrellou et al., 2019; Bosnea et al., 2017; Kopsahelis et al., 2007; Kourkoutas et al., 2006a; 2006b; 2005), pear (Kopsahelis et al., 2007), raisin (Nikolaou et al. al., 2020; Bosnea et al. 2017), quince (Koukoutas et al., 2005), sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) (Terpou et al., 2019), cranberry (Nikolaou et al., 2020), strawberry and banana (Sidira et al., 2013; Dimitrellou et al., 2012) have been proposed as immobilization vectors of the strain L. casei ATCC 393, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and other lactic acid bacteria. Immobilized L. casei ATCC 393 cells (in liquid or freeze-dried form) were then used as an additional culture in the production of fermented milk (Kourkoutas et al. 2006b; 2005), feta cheese (Kourkoutas et al. 2006a), yogurt (Dimitrellou et al. al., 2019; Bosnea et al., 2017; Sidira et al., 2013; Dimitrelou et al., 2012) and frozen yogurt (Terpou et al., 2019), while heat-dried immobilized Lactobacillus delbrueckii cells subsp. bulgaricus were tested for lactic fermentation of curd (Kopsahelis et al., 2007).

Παρομοίως, στην εργασία των Bosnea et al. (2009) μελετήθηκε η επίδραση της αποθήκευσης σε συνθήκες ψύξης και κατάψυξης των λυοφυλιωμένων ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei ATCC 393 σε κόκκους σιταριού στην κυτταρική επιβίωση και στην ζυμωτική ικανότητα. Στη συνέχεια, η επιβίωση των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei ATCC 393 σε κόκκους σιταριού επιβεβαιώθηκε κατά την ωρίμανση παραδοσιακών ζυμωμένων λουκάνικών, αλλά και μετά από ήπια θερμική επεξεργασία των προϊόντων (Sidira et al., 2014a), ενώ η ακινητοποιημένη προβιοτική καλλιέργεια δρα ως προστατευτική ασπίδα έναντι της αλλοίωσης, με αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του χρόνου συντήρησης (Sidira et al., 2014b). Παράλληλα, τα ακινητοποιημένα κύτταρα σε κόκκους σιταριού δοκιμάστηκαν ως πρόσθετη καλλιέργεια σε γιαούρτι και παρέμειναν ζωντανά σε επίπεδα 7 log cfu/g μετά από 60 ημέρες στους 4°C (Bosnea et al., 2017). Επιπλέον, οι νιφάδες βρώμης (Sidira et al., 2013) αποτέλεσαν αποτελεσματικούς φορείς ακινητοποίησης κυττάρων L. casei ATCC 393 και τα ακινητοποιημένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε επίπεδα > 6 logcfu/g μετά από 30 ημέρες σε γιαούρτι σε θερμοκρασία ψύξης (Sidira et al., 2013). Ακινητοποιημένα κύτταρα προβιοτικών στελεχών σε νιφάδες βρώμης έχουν, επίσης, χρησιμοποιηθεί ως συστατικά για παραγωγή μπάρας δημητριακών και μπισκότου (Nelios et al., 2020). Όμως, η κυτταρική επιβίωση σε επίπεδα > 7 logcfu/g για διάστημα μεγαλύτερο των 15 ημερών ήταν εφικτή μόνο σε θερμοκρασία ψυγείου (4-6°C) και όχι σε θερμοκρασία δωματίου. Similarly, in the work of Bosnea et al. (2009) studied the effect of refrigerated and frozen storage of freeze-dried immobilized L. casei ATCC 393 cells in wheat grains on cell survival and fermentation capacity. Subsequently, the survival of immobilized L. casei ATCC 393 cells in wheat grains was confirmed during the ripening of traditional fermented sausages, but also after mild heat treatment of the products (Sidira et al., 2014a), while the immobilized probiotic culture acts as a protective shield against spoilage, resulting in a significant increase in shelf life (Sidira et al., 2014b). In parallel, immobilized cells in wheat grains were tested as an additional culture in yogurt and remained viable at levels of 7 log cfu/g after 60 days at 4°C (Bosnea et al., 2017). In addition, oat flakes (Sidira et al., 2013) were effective carriers of L. casei ATCC 393 cell immobilization and immobilized cells were detected at levels > 6 logcfu/g after 30 days in yogurt at refrigeration temperature (Sidira et al., 2013). Immobilized cells of probiotic strains in oat flakes have also been used as ingredients for cereal bar and cookie production (Nelios et al., 2020). However, cell survival at levels > 7 logcfu/g for more than 15 days was only possible at refrigerator temperature (4-6°C) and not at room temperature.

Πρεβιοτικά υποστρώματα, όπως τα απολιγνινοποιημένα πίτουρα σίτου (delignified wheat bran) και πίτουρα ζυθοποίων (brewer’s spent grains) έχουν, επίσης, χρησιμοποιηθεί ως φορείς ακινητοποίησης κυττάρων Lactobacillus plantarum ATCC 14917 (Mantzourani et al., 2019), kefir και L. casei (Plessas et al., 2007), με σκοπό την παραγωγή συμβιωτικού χυμού ροδιού μετά από ζύμωση (Mantzourani et al., 2019) ή προζυμιού για παραγωγή ψωμιού (Plessas et al., 2007). Prebiotic substrates, such as delignified wheat bran and brewer's spent grains, have also been used as carriers to immobilize Lactobacillus plantarum ATCC 14917 cells (Mantzourani et al., 2019), kefir and L. casei (Plessas et al., 2007), in order to produce symbiotic pomegranate juice after fermentation (Mantzourani et al., 2019) or sourdough for bread production (Plessas et al., 2007).

Στην ίδια λογική, ξηροί καρποί και συγκεκριμένα το αμύγδαλο, το φιστίκι (peanuts), το φιστίκι Αιγίνης ( Pistachio ) αλλά και μπισκότα (cookies) έχουν αξιολογηθεί ως πιθανοί φορείς ακινητοποίησης κυττάρων L. casei ATCC 393 (Nikolaou et al., 2020; Santarmaki et al., 2018; 2012; Kandylis et al., 2013). Μετά την ακινητοποίηση εξετάστηκε η δυνατότητα θερμικής ξήρανσης (Santarmaki et al., 2012) και λυοφιλίωσης (Kandylis et al., 2013), ενώ τα ακινητοποιημένα κύτταρα δοκιμάστηκαν στην πορεία στην παραγωγή προβιοτικού παγωτού (Santarmaki et al., 2014) και μπισκότου (Nelios et al., 2020). Τέλος, διάφορες φυτικές ίνες [ίνες μήλου, ίνες βρώμης, βρώμη, ίνες cranberry, ίνες μαύρου φραγκοστάφυλλου (blackcurrent), ίνες λιναριού, δεξτρίνες σίτου, πολυδεξτρόζη και ινουλίνη) έχουν χρησιμοποιηθεί ως φορείς κυττάρων Lactobacillus rhamnosus σε χυμό μήλου και δημητριακά πρωινού με επικάλυψη σοκολάτας, με στόχο την προστασία της κυτταρικής βιωσιμότητας και σταθερότητας κατά τη λυοφιλίωση, αποθήκευση και σχηματισμό των τελικών προϊόντων (Saarela et al. 2006). In the same logic, nuts, specifically almonds, peanuts, pistachios, and cookies have been evaluated as possible carriers of L. casei ATCC 393 cell immobilization (Nikolaou et al., 2020; Santarmaki et al., 2018; 2012; Kandylis et al., 2013). After immobilization, the possibility of thermal drying (Santarmaki et al., 2012) and lyophilization (Kandylis et al., 2013) was examined, while the immobilized cells were tested along the way in the production of probiotic ice cream (Santarmaki et al., 2014) and cookies (Nelios et al., 2020). Finally, various plant fibers [apple fiber, oat fiber, oats, cranberry fiber, blackcurrant fiber, flax fiber, wheat dextrins, polydextrose, and inulin) have been used as carriers of Lactobacillus rhamnosus cells in apple juice and chocolate-coated breakfast cereals. , aiming to protect cell viability and stability during lyophilization, storage and formulation of the final products (Saarela et al. 2006).

Η ακινητοποίηση στις παραπάνω εργασίες διεξάγεται κατά κύριο λόγο με την εμβάπτιση του στερεού υποστρώματος ακινητοποίηση ς π.χ. της βρώμης ή του ξηρού καρπού, σε θρεπτικό υπόστρωμα υγρής ανεπτυγμένης καλλιέργειας υψηλής συγκέντρωσης (> 9 logcfu/mL) με το μίγμα να αφήνεται σε ηρεμία (χωρίς ανάδευση) στους 37°C για 48 h (Sidira et al., 2013). Στη συνέχεια αποχύνεται το υγρό και διαχωρίζεται από την βρώμη η οποία στη συνέχεια ξεπλένεται με παστεριωμένο γάλα. Αν και η συγκεκριμένη πρακτική έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε ερευνητικό επίπεδο, σε βιομηχανικό μειονεκτεί από το γεγονός πως η πολύωρη επώαση στους 37°C αυξάνει τον κίνδυνο της ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών ή άλλων επιμολύνσεων που ενδέχεται να εισέρχονται στην καλλιέργεια με το στερεό υπόστρωμα. The immobilization in the above operations is mainly carried out by dipping the solid immobilization substrate, e.g. oat or nut, in highly concentrated (> 9 logcfu/mL) liquid culture medium with the mixture left to rest (without agitation) at 37°C for 48 h (Sidira et al., 2013). The liquid is then poured off and separated from the oats which are then washed with pasteurized milk. Although this practice has been widely used at the research level, it is industrially disadvantaged by the fact that prolonged incubation at 37°C increases the risk of the growth of pathogenic microorganisms or other contaminations that may enter the culture with the solid substrate.

Προϊόντα σοκολάτας που περιέχουν προβιοτικούς μικροοργανισμούς υπάρχουν ήδη στην αγορά. Ωστόσο τα προϊόντα αυτά περιέχουν είτε μικροοργανισμούς οι οποίοι είναι ανθεκτικοί είτε έχουν εγκαψυλιωθεί σε προστατευτικό περίβλημα, μία διαδικασία η οποία έχει υψηλό σχετικά κόστος. Η χρήση των ακινητοποιημένων προβιοτικών κυττάρων για την παραγωγή σοκολάτας δίνει τη δυνατότητα αξιοποίησης και πιο ευαίσθητων προβιοτικών στελεχών που σύμφωνα με την υπάρχουσα τεχνολογική στάθμη δε θα μπορούσαν να διατηρήσουν υψηλά επίπεδα βιωσιμότητας όταν αποθηκεύονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ή κατά την πέψη. Chocolate products containing probiotic microorganisms are already on the market. However, these products either contain microorganisms that are resistant or have been encapsulated in a protective casing, a process that has a relatively high cost. The use of immobilized probiotic cells for the production of chocolate enables the utilization of more sensitive probiotic strains that, according to the existing technological level, could not maintain high levels of viability when stored at ambient temperature or during digestion.

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ ADVANTAGES OF THE INVENTION

Αποτέλεσμα της παρούσας εφευρέσεως αποτελεί η παραγωγή σοκολάτας η οποία θα φέρει υψηλή συγκέντρωση ακινητοποιημένων σε βρώμη προβιοτικών κυττάρων (>1 εκ. ανά g) τα οποία θα παραμένουν ζωντανά σε υψηλή συγκέντρωση στο χρόνο ζωής του προϊόντος και η οποία δύναται να χρησιμοποιηθεί ως συμπλήρωμα διατροφής, ως τελικό προϊόν ή και ως συστατικό για την παραγωγή άλλων προϊόντων διατροφής όπως π.χ. μπάρες δημητριακών τα οποία θα φέρουν ζωντανά προβιοτικά κύτταρα σε υψηλή συγκέντρωση. Η συγκεκριμένη εφεύρεση μπορεί να δώσει τη δυνατότητα σε θερμοευαίσθητα στελέχη προβιοτικών μικροοργανισμών που η χρήση τους έχει περιοριστεί λόγω της ευαισθησίας που παρουσιάζουν στη θερμοκρασία αποθήκευσης ή κατά της πέψης, να βρουν εμπορικές διεξόδους και να φτάσουν στο ράφι του καταναλωτή με προϊόντα καθημερινής κατανάλωσης όπως μπάρες δημητριακών, μπισκότα ή/και σοκολάτες. Επίσης, μπορεί να δώσει την ευκαιρία σε παραγωγούς τροφίμων να παράξουν προβιοτικά τρόφιμα αντικαθιστώντας στις συνταγές τους τη κοινή σοκολάτα με σοκολάτα που θα περιέχει ακινητοποιημένα προβιοτικά κύτταρα σε βρώμη. The result of the present invention is the production of chocolate which will have a high concentration of probiotic cells immobilized in oats (>1 cm. per g) which will remain alive in a high concentration during the life of the product and which can be used as a food supplement, as a final product or as an ingredient for the production of other food products such as e.g. cereal bars which will carry live probiotic cells in high concentration. This particular invention may enable heat-sensitive strains of probiotic microorganisms whose use has been limited due to their sensitivity to storage temperature or to digestion to find commercial outlets and reach the consumer's shelf in everyday products such as cereal bars , cookies and/or chocolates. It may also provide an opportunity for food manufacturers to produce probiotic foods by replacing common chocolate in their recipes with chocolate containing immobilized probiotic cells in oats.

Η συγκεκριμένη εφεύρεση στηρίζεται α) στη βελτίωση της διαδικασίας ακινητοποίησης σε βρώμη, τόσο μειώνοντας το χρόνο επώασης αλλά και χρησιμοποιώντας ως υγρή φάση διάλυμα αλάτων και όχι θρεπτικό υπόστρωμα, μειώνοντας έτσι σημαντικά τις πιθανότητες ανάπτυξης αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών, και β) στη χρήση των ακινητοποιημένων κυττάρων για την παραγωγή σοκολάτας με βρώμη εμπλουτισμένη με ζωντανά προβιοτικά κύτταρα. The specific invention is based a) on the improvement of the immobilization process in oats, both by reducing the incubation time and also by using as a liquid phase a solution of salts and not a nutrient substrate, thus significantly reducing the chances of the development of pathogenic and pathogenic microorganisms, and b) on the use of the immobilized cells to produce oat chocolate enriched with live probiotic cells.

ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ DISCLOSURE OF THE INVENTION

Η συγκεκριμένη εφεύρεση αφορά στην παρασκευή σοκολάτας που περιέχει λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα εμπορικών προβιοτικών καλλιεργειών του είδους Lactobacillus σε νιφάδες βρώμης σε επίπεδα τουλάχιστον 7 logcfu/g. Αντικείμενο επίσης της παρούσας εφεύρεσης αποτελεί η ακινητοποίηση των προβιοτικών κυττάρων σε βρώμη χρησιμοποιώντας ένα υδατικό μείγμα αλάτων. The specific invention relates to the preparation of chocolate containing freeze-dried immobilized cells of commercial probiotic cultures of the species Lactobacillus in oat flakes at levels of at least 7 logcfu/g. Another object of the present invention is the immobilization of probiotic cells in oats using an aqueous mixture of salts.

Η παρούσα εφεύρεση δεν αφορά στον τρόπο παραγωγής της πρώτης ύλης της σοκολάτας, αλλά τη χρήση αυτής για την παραγωγή τελικού προϊόντος. Επομένως, για την παρασκευή της σοκολάτας μπορεί να χρησιμοποιηθεί έτοιμη σκόνη σοκολάτας ή ακόμα και σοκολάτα έτοιμη προς κατανάλωση, η οποία μπορεί να τηχθεί για να προστεθούν επιπλέον συστατικά και στη συνέχεια να επαναχρησιμοποιηθεί για την παραγωγή προϊόντων. The present invention does not concern the method of production of the raw material of the chocolate, but its use for the production of the final product. Therefore, ready-made chocolate powder or even ready-to-eat chocolate can be used to make chocolate, which can be melted to add additional ingredients and then reused to make products.

Ένας πιθανός τρόπος παραγωγής θα μπορούσε να είναι ο ακόλουθος: A possible way of production could be the following:

1. Παραγωγή ακινητοποιημένων προβιοτικών κυττάρων σε βρώμη 1. Production of immobilized probiotic cells in oats

2. Λυοφιλίωση ακινητοποιημένων κυττάρων 2. Lyophilization of immobilized cells

3. Τήξη πλάκας κουβερτούρας, σοκολάτας ή σκόνη κουβερτούρας 3. Melt couverture bar, chocolate or couverture powder

4. Προσθήκη των ακινητοποιημένων προβιοτικών στελεχών σε βρώμη σε τηγμένη κουβερτούρα 4. Addition of immobilized probiotic strains to rolled oats

5. Ψύξη προϊόντος 5. Product cooling

6. Συσκευασία 6. Packaging

Αναλυτικότερα: In more detail:

Παραγωγή ακινητοποιημενών προβιοτικών κυττάρων σε βρώμη Production of immobilized probiotic cells in oats

Για την ακινητοποίηση των κυττάρων σε νιφάδες βρώμης χρησιμοποιείται διάλυμα αλάτων με την εξής σύσταση: α) CaCl2σε τελική συγκέντρωση 0.06 - 0.24 g/L με προτιμότερη την 0.12 g/L, β) KC1 0.05-0.2 g/L με προτιμότερη την 0.105 g/L, γ) NaHCO30.025-0.10 g/L, με προτιμότερη την 0.05 g/L και δ) NaCl 1.1-4.5 g/L, με προτιμότερη την 2.25 g/L και pH 7.40±0.20 (διάλυμα ακινητοποιησης). Στο παραπάνω διάλυμα προστίθενται ανά λίτρο διαλύματος 7-8 g λυοφιλιωμένα κύτταρα προβιοτικής καλλιέργειας και 1-4 kg βρώμης. Το μίγμα αφήνεται σε ηρεμία για 10-30 min με προτίμηση τα 20 min σε θερμοκρασία δωματίου (18-22°C) και στη συνέχεια, απομονώνεται η υγρή βρώμη αποχύνοντας την περίσσεια υγρού. Μετά την ακινητοποίηση, ο αριθμός των υγρών ακινητοποιημένων κυττάρων κυμαίνεται 8.70-8.80 logcfu/g. For the immobilization of the cells in oat flakes, a salt solution with the following composition is used: a) CaCl2 in a final concentration of 0.06 - 0.24 g/L, preferably 0.12 g/L, b) KC1 0.05-0.2 g/L, preferably 0.105 g/L L, c) NaHCO30.025-0.10 g/L, preferably 0.05 g/L and d) NaCl 1.1-4.5 g/L, preferably 2.25 g/L and pH 7.40±0.20 (immobilization solution). 7-8 g of freeze-dried probiotic culture cells and 1-4 kg of oats are added to the above solution per liter of solution. The mixture is left to rest for 10-30 min preferably 20 min at room temperature (18-22°C) and then the liquid oats are isolated by pouring off the excess liquid. After immobilization, the number of liquid immobilized cells ranges from 8.70-8.80 logcfu/g.

Λυοφιλίωση ακινητοποιημένων κυττάρων Lyophilization of immobilized cells

Στη συνέχεια τα υγρά ακινητοποιημένα κύτταρα ψύχονται στους -80°C για 20 h και ακολουθεί λυοφιλίωση υπό πίεση 30-35 Pa και θερμοκρασία συμπυκνωτή -101°C για 48 h. The liquid immobilized cells are then cooled to -80°C for 20 h followed by lyophilization under a pressure of 30-35 Pa and a condenser temperature of -101°C for 48 h.

Μετά τη λυοφιλίωση, ο αριθμός των λυοφιλιωμένων ακινητοποιη μένων κυττάρων είναι 8.60-8.80 logcfu/g. After lyophilization, the number of lyophilized immobilized cells is 8.60-8.80 logcfu/g.

Τή£η πλάκας κουβερτούρας, σοκολάτας ή σκόνη κουβερτούρας The couverture bar, chocolate or couverture powder

Η βασική πρώτη ύλη για την παραγωγή σοκολάτας τήκεται στους 35-45°C σε κατάλληλο μπεν μαρί ή σε θερμαινόμενη εστία έως ότου ρευστοποιηθεί. Ο χρόνος επεξεργασίας εξαρτάται από την ποσότητα της σοκολάτας και την κατάσταση της δηλαδή εάν είναι σε μορφή μπάρας ή σκόνης. Στο στάδιο αυτό δύναται να προστίθενται και άλλα συστατικά για τη βελτίωση της γεύσης της σοκολάτας όπως σκόνη γάλακτος, βούτυρο, σάκχαρα, μέλι και άλλα συστατικά διατροφής. The basic raw material for the production of chocolate is melted at 35-45°C in a suitable bain-marie or on a heated stove until it liquefies. The processing time depends on the amount of chocolate and its condition, i.e. if it is in bar or powder form. At this stage, other ingredients can be added to improve the taste of the chocolate, such as milk powder, butter, sugars, honey and other food ingredients.

Προσθήκη των ακινητοποιη μένων προβιοτικών κυττάρων Addition of immobilized probiotic cells

Για κάθε προϊόν σοκολάτας, προστίθενται ικανή ποσότητα βρώμης ώστε η συγκέντρωση των ακινητοποιημένων κυττάρων στο τελικό προϊόν να ξεπερνά τα 7 logcfu/g. Η τελική ποσότητα εξαρτάται από την αποτελεσματικότητα της ακινητοποιησης η οποία επιδιώκεται να φθάνει τα 9 log cfu/g. Κατά αυτόν τον τρόπο στη σοκολάτα μπορεί να προστίθεται βρώμη που να φθάνει το 5-50% στο τελικό προϊόν με στόχο να λαμβάνονται περισσότερα από 1 δις κύτταρα ανά μερίδα των 50-100 g. For each chocolate product, sufficient oats are added so that the concentration of immobilized cells in the final product exceeds 7 logcfu/g. The final quantity depends on the efficiency of the immobilization which is sought to reach 9 log cfu/g. In this way oats can be added to the chocolate reaching 5-50% of the final product with the aim of obtaining more than 1 billion cells per 50-100g portion.

Στο μείγμα δύναται να προστίθενται και άλλα συστατικά όπως ξηροί καρποί και ξηρά φρούτα ή άλλα δημητριακά. Other ingredients such as nuts and dried fruits or other cereals may be added to the mixture.

Το μείγμα στη συνέχεια αναδεύεται για αρκετή ώρα ώστε να διασφαλιστεί η ισομερής κατανομή της βρώμης και επομένως των ακινητοποιημένων κυττάρων στη μάζα της σοκολάτας. The mixture is then stirred long enough to ensure an isomeric distribution of the oats and thus the immobilized cells in the chocolate mass.

Ψύ£η προϊόντος Product cooling

Στη συνέχεια το μείγμα σοκολάτας - ακινητοποιημένων προβιοτικών κυττάρων σε βρώμη προστίθενται σε κατάλληλα καλούπια διάφορων μεγεθών με σκοπό την παραγωγή προϊόντων σοκολάτας. Στη συνέχεια τα προϊόντα αφήνονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ή ψύχονται για τη στερεοποίηση της σοκολάτας. The mixture of chocolate - immobilized probiotic cells in oats is then added to suitable molds of various sizes in order to produce chocolate products. The products are then left at room temperature or cooled to solidify the chocolate.

Συσκευασία Packing

Οι σοκολάτες απομακρύνονται στη συνέχεια από τα καλούπια και συσκευάζονται σε κατάλληλα για τρόφιμα υλικά. The chocolates are then removed from the molds and packed in food grade materials.

Το προϊόν που παράγεται από την παραπάνω διαδικασία περιέχει στο εσωτερικό του νιφάδες βρώμης, στην επιφάνεια των οποίων βρίσκονται ακινητοποιημένα κύτταρα προβιοτικών στελεχών. The product produced by the above process contains inside oat flakes, on the surface of which there are immobilized cells of probiotic strains.

Μετά την παρασκευή τους τα προϊόντα μπορούν να αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου (18-22°C) ή/και συντήρησης (2-8°C). Με την παραπάνω διαδικασία επιτυγχάνεται η παραγωγή προϊόντων τα οποία φέρουν 7-8 log cfu/g προϊόντος τα οποία παραμένουν σχετικά σταθερά έως και 60 ημέρες μετά την παραγωγή τους σε θερμοκρασία συντήρησης (2-8 °C). Ο Πίνακας 1 περιλαμβάνει τις τιμές των ζωντανών κυττάρων όπως αυτά μετρούνται σε προϊόντα σοκολάτας που έχουν αποθηκευτεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ή συντήρησης έως και 60 ημέρες. Τα προϊόντα παρήχθησαν χρησιμοποιώντας βρώμη σε τελική συγκέντρωση έως και 17% και στην οποία είχαν ακινητοποιηθεί 8.5 logcfu/g. Τα αποτελέσματα του παρακάτω πίνακα είναι ενδεικτικά. Ανάλογα με τη σύσταση της σοκολάτας μπορεί να επιτευχθεί με την ίδια διαδικασία μεγαλύτερη βιωσιμότητα κυττάρων και για μεγαλύτερο χρόνο αποθήκευσης σε θερμοκρασίας περιβάλλοντος ή σε θερμοκρασία συντήρησης. After preparation, the products can be stored at room temperature (18-22°C) and/or preservation (2-8°C). With the above process, the production of products is achieved which carry 7-8 log cfu/g of product which remain relatively stable up to 60 days after their production at storage temperature (2-8 °C). Table 1 includes live cell values as measured in chocolate products stored at ambient temperature or storage for up to 60 days. The products were produced using oats at a final concentration of up to 17% and in which 8.5 logcfu/g were immobilized. The results of the table below are indicative. Depending on the composition of the chocolate, greater cell viability can be achieved with the same process and for a longer storage time at ambient temperature or at storage temperature.

Πίνακας 1. Κυτταρικά επίπεδα (logcfu/g) των εμπορικών προβιοτικών καλλιεργειών του είδους Lactobacillus plantarum σε προϊόντα σοκολάτας και φυσικοχημικές παράμετροι (τιμές ενεργότητας νερού (aw και % υγρασία) των προϊόντων μετά από 15, 30 και 60 ημέρες αποθήκευσης σε θερμοκρασία δωματίου (18-25°C) και σε θερμοκρασίες ψύξης (6-8°C). Table 1. Cell levels (logcfu/g) of commercial probiotic cultures of Lactobacillus plantarum species in chocolate products and physicochemical parameters (water activity values (aw and % moisture)) of the products after 15, 30 and 60 days of storage at room temperature (18 -25°C) and at refrigeration temperatures (6-8°C).

Βιομηχανική εφαρμοστικότητα Industrial applicability

Η παρούσα εφεύρεση προσφέρει διεργασία για την παραγωγή σοκολάτας ή προϊόντος σοκολάτας, το οποίο θα φέρει ακινητοποιημένα κύτταρα προβιοτικών στελεχών σε βρώμη. Η παρούσα εφεύρεση μπορεί να αξιοποιηθεί για την ακινητοποίηση προβιοτικών στελεχών (π.χ. γένους Lactobacillus , Bifidobacterium) που επιφέρουν ευεργετικά οφέλη στον άνθρωπο, αλλά η χρήση τους περιορίζεται λόγω υψηλής θνησιμότητας σε συνθήκες αποθήκευσης περιβάλλοντος ή/και συντήρησης. The present invention provides a process for the production of chocolate or chocolate product, which will carry immobilized cells of probiotic strains in oats. The present invention can be utilized for the immobilization of probiotic strains (e.g. genus Lactobacillus , Bifidobacterium) that bring beneficial benefits to humans, but their use is limited due to high mortality in environmental storage and/or preservation conditions.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ BIBLIOGRAPHY

Bosnea, A. L., Kourkoutas, Y., Albanaki, N., Tzia, C., Koutinas A., & Kanellaki, M. (2009). Functionality of freeze-dried L. casei cells immobilized on wheat grains. LWT -Food Science and Technology, 42, 1696-1702. Bosnea, A. L., Kourkoutas, Y., Albanaki, N., Tzia, C., Koutinas A., & Kanellaki, M. (2009). Functionality of freeze-dried L. casei cells immobilized on wheat grains. LWT - Food Science and Technology, 42, 1696-1702.

Bosnea, L., Moschakis, T., Biliaderis, C. (2017). Microencapsulated cells of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei in biopolymer complex coacervates and their function in a yogurt matrix. Food & Function, 9, 554-562. Bosnea, L., Moschakis, T., Biliaderis, C. (2017). Microencapsulated cells of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei in biopolymer complex coacervates and their function in a yogurt matrix. Food & Function, 9, 554-562.

Dimitrellou, D., Kandylis, P., & Kourkoutas, Y. (2019). Assessment of Freeze-Dried Immobilized Lactobacillus casei as Probiotic Adjunct Culture in Yogurts. Foods 8(9):374. Dimitrellou, D., Kandylis, P., & Kourkoutas, Y. (2019). Assessment of Freeze-Dried Immobilized Lactobacillus casei as Probiotic Adjunct Culture in Yogurts. Foods 8(9):374.

Dimitrellou, D., Sidira, M., Saxami, S., Santarmaki, S., Kanellaki, M., Galanis, A., & Kourkoutas, Y. (2012). Probiotic yoghurt production using immobilized Lactobacillus casei on prebiotic supports. 6th Central European Congress on Food (CEFood-2012), Novi Sad, Serbia, 23-26 May 2012 (p. 428). Dimitrellou, D., Sidira, M., Saxami, S., Santarmaki, S., Kanellaki, M., Galanis, A., & Kourkoutas, Y. (2012). Probiotic yogurt production using immobilized Lactobacillus casei on prebiotic supports. 6th Central European Congress on Food (CEFood-2012), Novi Sad, Serbia, 23-26 May 2012 (p. 428).

FAO/WHO. (2002). Food and Agriculture Organization of United Nation and World Health Organization Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, London, FAO. FAO/WHO. (2002). Food and Agriculture Organization of the United Nation and World Health Organization Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, London, FAO.

Kandylis, P., Santarmaki, V., Panas, P., Mixalopoulos, I, & Kourkoutas, Y. (2013). Freeze-dried immobilized Lactobacillus casei on dried nuts and pastry products as starter culture for probiotic foods. 35th Annual Conference, Hellenic Association for Biological Sciences, Nafplio, Greece, 23-25 May 2013 (pp. 124-125). Kandylis, P., Santarmaki, V., Panas, P., Mixalopoulos, I, & Kourkoutas, Y. (2013). Freeze-dried immobilized Lactobacillus casei on dried nuts and pastry products as starter culture for probiotic foods. 35th Annual Conference, Hellenic Association for Biological Sciences, Nafplio, Greece, 23-25 May 2013 (pp. 124-125).

Kopsahelis, N., Panas, P., Kourkoutas, Y., & Koutinas, A. (2007). Evaluation of the thermally dried immobilized cells of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus on apple pieces as a potent starter culture. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 9829-9836. Kopsahelis, N., Panas, P., Kourkoutas, Y., & Koutinas, A. (2007). Evaluation of the thermally dried immobilized cells of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus on apple pieces as a potent starter culture. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 9829-9836.

Kourkoutas, Y., Xolias, V., Kallis, M., Bezirtzoglou, E., & Kanellaki, M. (2005). Lactobacillus casei cell immobilization on fruit pieces for probiotic additive, fermented milk and lactic acid production. Process Biochemistry, 40, 411-416. Kourkoutas, Y., Xolias, V., Kallis, M., Bezirtzoglou, E., & Kanellaki, M. (2005). Lactobacillus casei cell immobilization on fruit pieces for probiotic additive, fermented milk and lactic acid production. Process Biochemistry, 40, 411-416.

Kourkoutas, Y., Bosnea, L., Taboukos, S., Baras, C., Lambrou, D., & Kanellaki, M. (2006). Probiotic cheese production using Lactobacillus casei cells immobilized on fruit pieces. Journal of Dairy Science, 89, 1439-1451. Kourkoutas, Y., Bosnea, L., Taboukos, S., Baras, C., Lambrou, D., & Kanellaki, M. (2006). Probiotic cheese production using Lactobacillus casei cells immobilized on fruit pieces. Journal of Dairy Science, 89, 1439-1451.

Matzourani, I, Chondrou, P., Bontsidis, C., Karolidou, K., Terpou, A., Alexopoulos, A., Bezirtzoglou, E., Galanis, A., & Plessas, S. (2019). Assessment of the probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from kefir grains: evaluation of adhesion and antiproliferative properties in in vitro experimental systems. Annals of Microbiology, 69(7). Matzourani, I, Chondrou, P., Bontsidis, C., Karolidou, K., Terpou, A., Alexopoulos, A., Bezirtzoglou, E., Galanis, A., & Plessas, S. (2019). Assessment of the probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from kefir grains: evaluation of adhesion and antiproliferative properties in in vitro experimental systems. Annals of Microbiology, 69(7).

Mitropoulou, G., Nedovic, V., Goyal, A., & Kourkoutas, Y. (2013). Immobilization technologies in probiotic food production. J Nutr Metabol, http://dx.doi.org/10.1155/2013/716861. Mitropoulou, G., Nedovic, V., Goyal, A., & Kourkoutas, Y. (2013). Immobilization technologies in probiotic food production. J Nutr Metabol, http://dx.doi.org/10.1155/2013/716861.

Nelios, G., Nikolaou, A., Panas, P., & Kourkoutas, Y. (2020) Developing Novel Functional Foods with Immobilized Probiotic Cultures on Prebiotics. International Congress on Biotechnology and Food Sciences, Food Nutr: Current Res, ISSN: 2638 -1095, 23-24 September 2020, 3(S1) (p. 20). Nelios, G., Nikolaou, A., Panas, P., & Kourkoutas, Y. (2020) Developing Novel Functional Foods with Immobilized Probiotic Cultures on Prebiotics. International Congress on Biotechnology and Food Sciences, Food Nutr: Current Res, ISSN: 2638 -1095, 23-24 September 2020, 3(S1) (p. 20).

Nikolaou, A., Nelios, G., Panas, P., & Kourkoutas, Y. (2020). Development of functional food ingredients containing immobilized probiotics. 11th International Conference on Biotechnology and Food Science. Nikolaou, A., Nelios, G., Panas, P., & Kourkoutas, Y. (2020). Development of functional food ingredients containing immobilized probiotics. 11th International Conference on Biotechnology and Food Science.

Plessas, S., Bekatorou, A., Koutinas, A., Soupioni, M., Banat, I, & Marchant, R. (2007). Use of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized on orange peel as biocatalyst for alcoholic fermentation. Bioresour Technol, 98(4):860-5. Plessas, S., Bekatorou, A., Koutinas, A., Soupioni, M., Banat, I, & Marchant, R. (2007). Use of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized on orange peel as biocatalyst for alcoholic fermentation. Bioresour Technol, 98(4):860-5.

Saarela, M., Virkajarvi, I, Nohynek L., Vaari, A., & Matto, J. (2006). Fibres as carriers for Lactobacillus rhamnosus during freeze-drying and storage in apple juice and chocolate-coated breakfast cereals. International Journal of Food Microbiology, 112(2): 171-8. Saarela, M., Virkajarvi, I, Nohynek L., Vaari, A., & Matto, J. (2006). Fibers as carriers for Lactobacillus rhamnosus during freeze-drying and storage in apple juice and chocolate-coated breakfast cereals. International Journal of Food Microbiology, 112(2): 171-8.

Santarmaki, V., Prapa I, Mitropoulou, G., Yanni, A., Kostomitsopoulos N., Karathanos, T. V., & Kourkoutas, Y. (2018). Prebiotic natural immobilization supports as effective protective delivery systems of functional cultures. 40th International Congress of the Society for Microbial Ecology and Diseases-SOMED Congress, Budapest, Hungary, 18-19 June 2018 (p. 26). Santarmaki, V., Prapa I, Mitropoulou, G., Yanni, A., Kostomitsopoulos N., Karathanos, T. V., & Kourkoutas, Y. (2018). Prebiotic natural immobilization supports as effective protective delivery systems of functional cultures. 40th International Congress of the Society for Microbial Ecology and Diseases-SOMED Congress, Budapest, Hungary, 18-19 June 2018 (p. 26).

Santarmaki, V., Nikolaou, A., Galanis, A., Panas, P., Michalopoulos, I, & Kourkoutas, Y. (2014). Probiotic ice cream production using free or immobilized Lactobacillus casei on dry nuts and pastry products. 3rd International ISEKI Food Conference, Athens, Greece, 21-23 May 2014 (p. 258). Santarmaki, V., Nikolaou, A., Galanis, A., Panas, P., Michalopoulos, I, & Kourkoutas, Y. (2014). Probiotic ice cream production using free or immobilized Lactobacillus casei on dry nuts and pastry products. 3rd International ISEKI Food Conference, Athens, Greece, 21-23 May 2014 (p. 258).

Santarmaki, V., Vatikioti, N. P., Triantafilli, O., Sidira, M., Panas, P., Mixalopoulos, I, & Kourkoutas, Y. (2012). Thermally-dried immobilized Lactobacillus casei on dried nuts and pastry products as starter culture for probiotic foods. 5th International Conference on Industrial Bioprocesses (IFIB-2012), Taipei, Taiwan, 7-10 October 2012 (p. 317). Santarmaki, V., Vatikioti, N. P., Triantafilli, O., Sidira, M., Panas, P., Mixalopoulos, I, & Kourkoutas, Y. (2012). Thermally-dried immobilized Lactobacillus casei on dried nuts and pastry products as starter culture for probiotic foods. 5th International Conference on Industrial Bioprocesses (IFIB-2012), Taipei, Taiwan, 7-10 October 2012 (p. 317).

Saxami, G., Ypsilantis, P., Sidira, M., Simopoulos, C., Kourkoutas, Y., & Galanis, A. (2012). Distinct adhesion of probiotic strain Lactobacillus casei ATCC 393 to rat intestinal mucosa. Anaerobe, 18, 417-420. Saxami, G., Ypsilantis, P., Sidira, M., Simopoulos, C., Kourkoutas, Y., & Galanis, A. (2012). Distinct adhesion of probiotic strain Lactobacillus casei ATCC 393 to rat intestinal mucosa. Anaerobe, 18, 417-420.

Sidira, M., Saxami, G., Dimitrellou. D., Santarmaki, V., Galanis, A., & Kourkoutas, Y. (2013). Monitoring survival of Lactobacillus casei ATCC 393 in probiotic yogurts using an efficient molecular tool. Journal of Dairy Science, 96, 3369-3377. Sidira, M., Saxami, G., Dimitrellou. D., Santarmaki, V., Galanis, A., & Kourkoutas, Y. (2013). Monitoring survival of Lactobacillus casei ATCC 393 in probiotic yogurts using an efficient molecular tool. Journal of Dairy Science, 96, 3369-3377.

Sidira, M., Karapetsas, A., Galanis, A., Kanellaki, M., & Kourkoutas, Y. (2014a). Effective survival of immobilized Lactobacillus casei during ripening and heat treatment of probiotic dry-fermented sausages and investigation of microbial dynamics. Meat Science, 96, 948-955. Sidira, M., Karapetsas, A., Galanis, A., Kanellaki, M., & Kourkoutas, Y. (2014a). Effective survival of immobilized Lactobacillus casei during ripening and heat treatment of probiotic dry-fermented sausages and investigation of microbial dynamics. Meat Science, 96, 948-955.

Sidira, M., Galanis, A., Nikolaou, A., Kanellaki, M., & Kourkoutas, Y. (2014b). Evaluation of Lactobacillus casei ATCC 393 protective effect against spoilage of probiotic dry-fermented sausages. Food Control, 42, 315-320. Sidira, M., Galanis, A., Nikolaou, A., Kanellaki, M., & Kourkoutas, Y. (2014b). Evaluation of Lactobacillus casei ATCC 393 protective effect against spoilage of probiotic dry-fermented sausages. Food Control, 42, 315-320.

Sidira, M., Galanis, A., Ypsilantis, P., Karapetsas, A., Progaki, Z., Simopoulos, C., & Kourkoutas, Y. (2010). Effect of probiotic-fermented milk administration on gastrointestinal survival of Lactobacillus casei ATCC 393 and modulation of intestinal microbial flora. J Mol Microbiol Biotechnol, 19, 224-230. Sidira, M., Galanis, A., Ypsilantis, P., Karapetsas, A., Progaki, Z., Simopoulos, C., & Kourkoutas, Y. (2010). Effect of probiotic-fermented milk administration on gastrointestinal survival of Lactobacillus casei ATCC 393 and modulation of intestinal microbial flora. J Mol Microbiol Biotechnol, 19, 224-230.

Terpou, A., Papadaki, A., Lappa, I, Kachrimanidou, V., Bosnea, L., & Kopsahelis, N. (2019). Probiotics in food systems: Significance and emerging strategies towards improved viability and delivery of enhanced beneficial value nutrients, 11(7), 1591. Tiptiri-Kourpeti, A., Spyridopoulou, K., Santarmaki, V., Aindelis, G., Tompoulidou, E., Lamprianidou, E. E., Saxami, G., Ypsilantis, P., Lampri, E. S., Simopoulos, C., Kotsianidis, I, Galanis, A., Kourkoutas, Y., Dimitrellou, D., & Chlichlia, K. (2016). Lactobacillus casei exerts anti-proliferative effects accompanied by apoptotic cell death and up-regulation of TRAIL in colon carcinoma cells. PLoS ONE, 11(2), e0147960, doi : 10.1371/joumal. pone.0147960. Terpou, A., Papadaki, A., Lappa, I, Kachrimanidou, V., Bosnea, L., & Kopsahelis, N. (2019). Probiotics in food systems: Significance and emerging strategies towards improved viability and delivery of enhanced beneficial value nutrients, 11(7), 1591. Tiptiri-Kourpeti, A., Spyridopoulou, K., Santarmaki, V., Aindelis, G., Tompoulidou , E., Lamprianidou, E. E., Saxami, G., Ypsilantis, P., Lampri, E. S., Simopoulos, C., Kotsianidis, I, Galanis, A., Kourkoutas, Y., Dimitrellou, D., & Chlichlia, K. (2016). Lactobacillus casei exerts anti-proliferative effects accompanied by apoptotic cell death and up-regulation of TRAIL in colon carcinoma cells. PLoS ONE, 11(2), e0147960, doi : 10.1371/joumal. pone.0147960.

Claims

1. Production process which achieves the immobilization, entrapment or attachment of cells of edible microbial strains to whole or cut and/or ground oat flakes in concentrations greater than 1 million live cells per gram for use in the production of products diet with the following procedure:

I) Cells of the microbial strains (dry or wet) are dissolved in an aqueous salt solution with the following composition: a) CaCl2 in a final concentration of 0.06 - 0.24 g/L with 0.12 g/L preferred, b) KC1 0.05-0.2 g/L with preferably 0.105 g/L, c) NaHCO30.025-0.10 g/L with preferred 0.05 g/L and d) NaCl 1.1-4.5 g/L with preferred 2.25 g/L

II) Oat flakes (whole, chopped or ground) are added to the above solution and kept for 10-30 minutes at a temperature of 0-40°C and preferably at a temperature of 4-20°C III) At the end of the process the aqueous part of the mixture discarded and the remainder dried by lyophilization, spray or hot air until the water activity is reduced below 0.65 and preferably below 0.1.

2. Process for the production of chocolate characterized by a high concentration of edible microbial strains (greater than or equal to 1 cm / gram of product), resulting from the use of oats produced according to claim 1 as a basic ingredient. The process follows the following steps:

I) The basic raw material for chocolate production (chocolate powder, slab or flakes and/or couverture), melts at 35-45°C. The processing time depends on the amount of chocolate and its condition, i.e. if it is in bar or powder form.

II) Addition of oats, in which cells of the microbial strains according to claim 1 have been immobilized, in a sufficient amount so that the concentration of the immobilized cells in the final product exceeds 7 logcfu/g. In this way oats can be added to the chocolate reaching 5-50% of the final product with the aim of obtaining more than 1 billion cells per 50-100g portion.

III) Other ingredients such as nuts and dried fruits or other cereals may be added to the mixture.

IV) The mixture is then stirred for some time by mechanical or non-mechanical means, transferred to molds and cooled to temperatures below 25 °C until the solidification of the final product. V) The chocolates are then removed from the molds and packed in food grade materials.

3. The process for the immobilization of edible microbial strains according to claim 1 by which living cells from one or more strains a) of the genus Lactobacillus, such as Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnoses, Lactobacillus reuteri, will be immobilized , Lactobacillus paracasei, of the genus Bifidobacterium, such as Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, b) of the genus Streptococcus, such as Streptococcus thermophiles, c) of the genus Bacillus, such as Bacillus coagulans or and d) of the genus Pediodococcus or combinations of all of the above.

4. Chocolate product produced according to claim 2 and which will contain live cells of strains a) of the genus Lactobacillus, such as Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnoses, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus paracasei, of the genus Bifidobacterium , such as Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, b) of the genus Streptococcus, such as Streptococcus thermophiles, c) of the genus Bacillus, such as Bacillus coagulans or and d) of the genus Pediodococcus or combinations of all of the above in a content greater than or equal to 7 logcfu per gram of final product.