GR1009998B - A sandwich immunoessay device using sheep anti-goat igg to immunologically detect goat's milk in sheep's milk - Google Patents
A sandwich immunoessay device using sheep anti-goat igg to immunologically detect goat's milk in sheep's milk Download PDFInfo
- Publication number
- GR1009998B GR1009998B GR20110100425A GR20110100425A GR1009998B GR 1009998 B GR1009998 B GR 1009998B GR 20110100425 A GR20110100425 A GR 20110100425A GR 20110100425 A GR20110100425 A GR 20110100425A GR 1009998 B GR1009998 B GR 1009998B
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- sheep
- milk
- goat
- goat igg
- antibody
- Prior art date
Links
- 241001494479 Pecora Species 0.000 title claims abstract description 103
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 title claims abstract description 38
- 235000020254 sheep milk Nutrition 0.000 title claims abstract description 30
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims abstract description 84
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 23
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 22
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims abstract description 20
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 15
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 13
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 claims description 13
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 13
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 12
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 claims 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 16
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 14
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 151
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 60
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 4
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 3
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 4-(4-aminophenyl)-2,2,6,6-tetramethylcyclohex-3-en-1-amine Chemical compound CC1(C)C(N)C(C)(C)CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 2
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003370 dye binding method Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 235000016046 other dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 235000020246 buffalo milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012125 lateral flow test Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
ΕΝΑ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΝΟΣΟΜΕΘΟΔΟΥ ΤΥΠΟΥ ΣΑΝΤΟΥΙΤΣ ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙ ΠΟΛΥΚΛΩΝΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΕΝΑΝΤΙ ΓΙΔΙΝΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΠΑΡΑΓΟΜΕΝΑ ΣΕ ΠΡΟΒΑΤΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΓΙΔΙΝΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΜΕΣΑ ΣΤΟ ΠΡΟΒΕΙΟ ΓΑΛΑ A SANDWICH IMMUNE SYSTEM USING SHEEP-PRODUCED ANTI-GOAT POLYCLONAL ANTIBODIES FOR THE DETECTION OF GOAT MILK IN SHEEP MILK
ΤΕΧΝΙΚΟ ΠΕΔΙΟ TECHNICAL FIELD
Η εφεύρεση σχετίζεται με τεχνικές ανοσομεθόδων τύπου σάντουιτς, χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα έναντι γίδινων ανοσοσφαιρινών παραγόμενα σε πρόβατο, για την ανοσολογική ανίχνευση γίδινου γάλακτος σε πρόβειο και ειδικότερα γίδινων ανοσοσφαιρινών σε δείγματα γάλακτος. Πιο συγκεκριμένα, η εφεύρεση παρέχει τις διαδικασίες για την υψηλής ευαισθησίας ανίχνευση γίδινων ανοσοσφαιρινών σε συστήματα τα οποία χρησιμοποιούνται σε παρακλίνια-διαγνωστική-εξέταση (point-of-care) και επί-τόπου εξέταση (on-site). The invention relates to sandwich immunomethod techniques, using polyclonal antibodies against goat immunoglobulins produced in sheep, for the immunological detection of goat milk in sheep and in particular goat immunoglobulins in milk samples. More specifically, the invention provides the procedures for the highly sensitive detection of goat immunoglobulins in systems used in point-of-care and on-site testing.
ΣΤΑΘΜΗ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΑΥΤΗΣ STATE OF THE PRIOR ART AND EVALUATION THEREOF
Το γάλα, το τυρί και άλλα γαλακτοκομικά προϊόντα καταναλώνονται παγκοσμίως και έχουν σπουδαία εμπορική σημασία μέσα στην βιομηχανία τροφίμων. Το γάλα από το οποίο φτιάχνονται τέτοια προϊόντα, λαμβάνεται από ένα μεγάλο αριθμό ειδών ζώων, όπως η αγελάδα, το πρόβατο, η γίδα και το βουβάλι. Παρόλο ότι το τυρί που παράγεται από το αγελαδινό γάλα κυριαρχεί στην αγορά στις περισσότερες χώρες, ένα σημαντικό μερίδιο της αγοράς αποτελείται από τυρί που προέρχεται από γάλα άλλων ειδών ζώων. Πιο συγκεκριμένα, στις μεσογειακές χώρες παράγονται μέχρι και σήμερα υψηλής ποιότητας παραδοσιακά τυριά τα οποία δημιουργούνται από γίδινο, πρόβειο και βουβαλίσιο γάλα (π.χ. φέτα, ροκφόρ και μοτσαρέλα). Η σύνθεση του γάλακτος από τα ξεχωριστά είδη ζώων επιδρά στις χαρακτηριστικές αρωματικές και αισθητικές ιδιότητες του κάθε τυριού. Η νοθεία του γάλακτος, είτε χρησιμοποιείται άμεσα στην ανθρώπινη κατανάλωση, είτε χρησιμοποιείται στη δημιουργία του τυριού, έχει ως αποτέλεσμα ένα κατώτερο τελικό προϊόν σε ποιότητα από αυτό που προσδοκεί ο καταναλωτής. Milk, cheese and other dairy products are consumed worldwide and are of great commercial importance within the food industry. The milk from which such products are made is obtained from a large number of species of animals, such as cow, sheep, goat and buffalo. Although cheese produced from cow's milk dominates the market in most countries, a significant share of the market is made up of cheese derived from the milk of other animal species. More specifically, high-quality traditional cheeses made from goat, sheep and buffalo milk (e.g. feta, Roquefort and mozzarella) are still produced in the Mediterranean countries. The composition of the milk from the individual species of animals affects the characteristic aromatic and aesthetic properties of each cheese. The adulteration of milk, whether it is used directly for human consumption or used in the creation of cheese, results in a lower end product in quality than what the consumer expects.
Η αυξημένη τιμή, καθώς και η διακύμανση στην εποχική διαθεσιμότητα του πρόβειου και γίδινου γάλακτος, δημιουργεί μία επικερδή πρακτική για αυτούς που φτιάχνουν τυριά, νοθεύοντας το πιο ακριβό γάλα με γίδινο ή αγελαδινό ώστε να μειωθεί το κόστος παραγωγής και να αυξηθούν τα περιθώρια κέρδους. The increased price, as well as the variation in seasonal availability of sheep's and goat's milk, creates a profitable practice for cheesemakers to adulterate the more expensive goat's or cow's milk to reduce production costs and increase profit margins.
Οι βιομηχανίες τροφίμων αναγκάζονται να δηλώνουν τα είδη ζώων προέλευσης του γάλακτος για την παραγωγή του τυριού ή άλλων γαλακτοκομικών προϊόντων. Επομένως, για νομικούς λόγους και για την προστασία και εμπιστοσύνη του καταναλωτή, τα τυριά θα πρέπει να αυθεντικά και με σωστές ετικέτες. Μέχρι σήμερα, όλο και περισσότερες μέθοδοι χρησιμοποιούν γενετικές τις διαφορές μεταξύ των ειδών ζώων μέσω ανάλυσης του γενετικού υλικού (DNA) ή ανοσομεθόδων. Food industries are forced to declare the species of animals from which the milk is derived for the production of cheese or other dairy products. Therefore, for legal reasons and for the protection and trust of the consumer, the cheeses should be authentic and with correct labels. To date, more and more methods use genetic differences between animal species through analysis of genetic material (DNA) or immunological methods.
Η αναλύσεις του γενετικού υλικού είναι επίπονες και απαιτούν πολύπλοκο εξοπλισμό και σημαντικό χρόνο και κόστος. Έτσι, έχουν περιορισμένη αξία στη συνηθισμένη εξέταση του γάλακτος. Όσον αφορά τις ανοσομεθόδους, τα εμπορικά διαθέσιμα κιτς (ή πακέτα δοκιμών) (kits) χρησιμοποιούν πολυκλωνικά αντισώματα έναντι γίδινων ανοσοσφαιρινών G (IgG) παραγόμενα σε κουνέλι, τα οποία λόγω των ισχυρών διασταυρούμενων αντιδράσεων με τις πρόβειες ανοσοσφαιρίνες G (πάνω από 80%), χρησιμεύουν και ως άριστα αντισώματα δέσμευσης με τα πρωτογενή πρόβεια αντισώματα. Επομένως, τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε κουνέλι δεν είναι κατάλληλα για ανοσομεθόδους τύπου σάντουιτς όπως η ενζυμοσύνδετη ανοσοπροσροφητική μέθοδος (ELISA) ή ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής (Lateral Flow), αφού οδηγούν σε προϊόντα με φτωχές ικανότητες ανίχνευσης των γίδινων IgG, συγκεντρώσεων που αντιστοιχούν σε 1-20% νοθεία πρόβειου γάλακτος με γίδινο. Εάν το δείγμα έχει υψηλότερη συγκέντρωση γίδινου γάλακτος, απαιτείται επιπρόσθετη αραίωση του, όπως και καινούρια σειρά μετρήσεων. Analyzes of genetic material are laborious and require complex equipment and considerable time and cost. Thus, they are of limited value in the routine examination of milk. Regarding immunoassays, commercially available kits (or test packages) (kits) use polyclonal antibodies against goat immunoglobulin G (IgG) produced in rabbit, which due to strong cross-reactions with sheep immunoglobulin G (over 80%), they also serve as excellent binding antibodies with primary sheep antibodies. Therefore, anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in rabbit are not suitable for sandwich immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or lateral flow immunochromatography, since they lead to products with poor detection abilities of goat IgG, concentrations corresponding to in 1-20% adulteration of sheep milk with goat. If the sample has a higher concentration of goat's milk, additional dilution is required, as well as a new series of measurements.
Αυτή η αναφορά περιγράφει την ανάπτυξη μίας ELISA τύπου σάντουιτς έναντι γίδινων IgG η οποία είναι εξαιρετικά ευαίσθητη κάνοντας την πιο κατάλληλη για την ανίχνευση του γίδινου γάλακτος στο πρόβειο γάλα και στο τυρί όπως η φέτα. This report describes the development of an anti-goat IgG sandwich ELISA that is highly sensitive making it more suitable for the detection of goat milk in sheep's milk and cheese such as feta.
ΣΥΝΟΨΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ SUMMARY OF THE INVENTION
Στην παρούσα εφεύρεση βρέθηκε ότι χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι γίδινων ανοσοσφαιρινών G παραγόμενα σε πρόβατο (sheep anti-goat IgG), σε τεχνικές ανοσομεθόδου τύπου σάντουιτς όπως η ELISA και η ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής, η νοθεία του πρόβειου γάλακτος με γίδινο μπορεί να ανιχνευθεί σε πολύ χαμηλά επίπεδα όπως 0,5% και σε πολύ υψηλά επίπεδα όπως 40% (Σχήμα 4) όπως βρέθηκε σε δείγματα γάλακτος. In the present invention it has been found that by using sheep anti-goat IgG antibodies in sandwich immunoassay techniques such as ELISA and lateral flow immunochromatography, adulteration of sheep milk with goat can be detected at very low levels such as 0.5% and at very high levels such as 40% (Figure 4) as found in milk samples.
Σε αντίθεση με τα μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία είναι αρκετά ευαίσθητα στην απώλεια των επιτόπων μέσω της χημικής επεξεργασίας με τα αντιγόνα, τα αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο αναγνωρίζουν πολλαπλούς επίτοπους σε κάθε μία γίδινη ανοσοσφαιρίνη δίνοντας καλύτερα αποτελέσματα στις ανοσομεθόδους τύπου σάντουιτς. In contrast to monoclonal antibodies which are quite sensitive to loss of epitopes through chemical treatment with antigens, anti-goat IgG antibodies produced in sheep recognize multiple epitopes on each goat immunoglobulin giving better results in sandwich immunoassays.
Βρέθηκε ότι τα αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο έχουν μηδενικές διασταυρούμενες αντιδράσεις με ανοσοσφαιρίνες προβάτου ή αγελάδας. Anti-goat IgG antibodies produced in sheep have been found to have zero cross-reactions with sheep or cow immunoglobulins.
Συμφώνως, η εφεύρεση παρέχει από μία άποψη μία μεθοδολογία για την ανίχνευση γίδινων IgG σε υγρά δείγματα, η οποία περιλαμβάνει: Accordingly, the invention provides in one aspect a methodology for detecting goat IgG in liquid samples, comprising:
(α) τη δέσμευση του προς μελέτη δείγματος με (i) τα καθηλωμένα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο και (ϋ) των ίδιων αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο στη σεσημασμένη μορφή και (β) την ανίχνευση εάν η δέσμευση αυτών των αντισωμάτων στις γίδινες IgG του δείγματος αυξάνεται με την παρουσία του δείγματος. (a) binding the sample to be studied with (i) the immobilized anti-goat IgG antibodies produced in sheep and (d) the same anti-goat IgG antibodies produced in sheep in the labeled form and (b) detecting whether their binding of antibodies to goat IgG in the sample increases with the presence of the sample.
Στη μέθοδο ELISA αυτής της εφεύρεσης ο ρυθμός αύξησης της οπτικής απορρόφησης είναι σχετικός με το αντιδρών διάλυμα μέσα στο οποίο οι γίδινες ανοσοσφαιρίνες που έχουν προστεθεί και έχουν αντιδράσει με τα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο. Τα επίπεδα νοθείας του πρόβειου γάλακτος με γίδινο, αντιπροσωπευτικά συγκεντρώσεων γίδινων IgG στο δείγμα του γάλακτος, μπορούν να προσδιορισθούν χρησιμοποιώντας μία καμπύλη βαθμονόμησης η οποία έχει γίνει προηγουμένως από τον ρυθμό αύξησης του αντιδρώντων διαλυμάτων στα οποία γνωστές συγκεντρώσεις γίδινων IgG έχουν προστεθεί. In the ELISA method of this invention the rate of increase in optical absorbance is relative to the reaction solution in which the goat immunoglobulins have been added and reacted with the anti-goat IgG antibodies produced in sheep. Adulteration levels of sheep milk with goat, representative of concentrations of goat IgG in the milk sample, can be determined using a calibration curve previously made from the rate of increase of reactant solutions to which known concentrations of goat IgG have been added.
Ωστόσο, προκειμένου να υπάρξει μεγαλύτερη ευκολία όσον αφορά την επί-τόπου εξέταση, όπως για παράδειγμα την εξέταση “στην άκρη του δρόμου εξέταση” (roadside testing), η μεθοδολογία της εφεύρεσης μπορεί να πάρει τη μορφή της ανοσοχρωματογραφίας πλευρικής ροής σε τεστ πορώδους ταινίας. Και σε αυτή την περίπτωση, το καθηλωμένο αντιδραστήριο για την ανίχνευση των γίδινων IgG μπορούν να είναι τα καθηλωμένα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο. However, in order to facilitate on-site testing, such as roadside testing, the methodology of the invention may take the form of lateral flow immunochromatography in a porous tape test. And in this case, the immobilized reagent for the detection of goat IgG can be the immobilized anti-goat IgG antibodies produced in sheep.
Μία ταινία δοκιμής ή επιφάνεια, για τη χρησιμοποίηση της σε ένα αναλυτικό σύστημα πλευρικής ροής, προκειμένου να επιτευχθεί η ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής, περιλαμβάνει: (i) μία δοκιμαστική ταινία ή επιφάνεια που περιλαμβάνει ένα ξηρό πορώδες υλικό το οποίο έχει καθηλωμένη πάνω του μία ζώνη ανίχνευσης του αναλύτη, (αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο), και (ii) συνδεδεμένη ή ενοποιημένη με τη δοκιμαστική ταινία ή επιφάνεια που παρέχει την ζώνη ανίχνευσης του αναλύτη, μία ξεχωριστή σεσημασμένη ζώνη απελευθέρωσης, η οποία έχει την ικανότητα να απελευθερώνεται σε μορφή υγρού υποχωρώντας από αυτή (αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο σε σεσημασμένη μορφή). A test strip or surface for use in a lateral flow analytical system to achieve lateral flow immunochromatography comprises: (i) a test strip or surface comprising a dry porous material having a detection zone affixed thereto; of the analyte, (anti-goat IgG antibodies produced in sheep), and (ii) attached or integrated with the test strip or surface providing the detection zone of the analyte, a separate labeled release zone, which is capable of being released in the form fluid receding from it (anti-goat IgG antibodies produced in sheep in labeled form).
Εν κατακλείδι, η εφεύρεση παρέχει ένα σύστημα ανσομεθόδου τύπου σάντουιτς το οποίο χρησιμοποιεί πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που ανιχνεύει ανοσολογικά το γίδινο γάλα σε πρόβειο και ειδικότερα τις γίδινες ανοσοσφαι ρίνες σε δείγματα γάλακτος. In conclusion, the invention provides a sandwich immunoassay system which utilizes anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep which immunologically detects goat milk in sheep and in particular goat immunoglobulins in milk samples.
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ ΚΑΙ ΜΕΣΑ ΕΠΙΛΥΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ADVANTAGES OF THE INVENTION AND REMEDIES
Η χρήση της μεθόδου που περιγράφεται, δηλαδή ενός συστήματος ανοσομεθόδου τύπου σάντουιτς το οποίο χρησιμοποιεί πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που ανιχνεύει ανοσολογικά το γίδινο γάλα σε πρόβειο, ξεπερνά πάρα πολλά μειονεκτήματα των άλλων εμπορικά διαθέσιμων μεθόδων που χρησιμοποιούνται. The use of the described method, i.e. a sandwich immunoassay system using polyclonal anti-goat IgG antibodies produced in sheep that immunologically detects goat milk in sheep, overcomes many of the disadvantages of other commercially available methods in use.
Οι μέθοδοι ανάλύσης του γενετικού υλικού που χρησιμοποιούν γενετικές τις διαφορές μεταξύ των ειδών ζώων μέσω διαφορετικών τμημάτων γενετικού υλικού είναι επίπονες και απαιτούν πολύπλοκο εξοπλισμό (ειδική συσκευή thermocycler για PCR και RT-PCR). Επί προσθέτως, οι μέθοδοι αυτοί απαιτούν σημαντικό χρόνο και όσον αφορά το κόστος ανά προς ανάλυση δείγμα, είναι πολλαπλάσιο σε σχέση με την ανοσομέθόδο. Επομένως, έχουν περιορισμένη αξία στη συνηθισμένη εξέταση του γάλακτος. Genetic material analysis methods that use genetic differences between animal species through different parts of genetic material are laborious and require complex equipment (special thermocycler device for PCR and RT-PCR). In addition, these methods require considerable time and in terms of cost per sample to be analyzed, it is many times higher than the immuno method. They are therefore of limited value in the routine examination of milk.
Όσον αφορά τις ανοσομεθόδους, τα εμπορικά διαθέσιμα κιτς χρησιμοποιούν πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε κουνέλι, τα οποία λόγω των ιδιαίτερα πολύ ισχυρών διασταυρούμενων αντιδράσεων με τις πρόβειες IgG (περισσότερο από 80%), εξυπηρετούν και ως άριστα αντισώματα δέσμευσης με τις βασικές πρόβειες IgG. Επομένως, τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε κουνέλι, δεν είναι κατάλληλα για τις ανοσομεθόδους τύπου σάντουιτς όπως η ELISA και η ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής, οδηγώντας σε προϊόντα με μικρή ικανότητα ανίχνευσης των γίδινων IgG σε αυτά τα τεστ, σε συγκέντρωση η οποία θα αντιστοιχεί σε 1-20% νοθεία πρόβειου γάλακτος με γίδινο. In terms of immunoassays, commercially available kits use polyclonal anti-goat IgG antibodies produced in rabbit, which due to their particularly very strong cross-reactivity with sheep IgG (more than 80%), also serve as excellent binding antibodies with the basic sheep IgG. Therefore, anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in rabbit are not suitable for sandwich immunoassays such as ELISA and lateral flow immunochromatography, leading to products with little ability to detect goat IgG in these tests at a concentration that would corresponds to 1-20% adulteration of sheep's milk with goat's milk.
Εάν το δείγμα έχει υψηλότερη συγκέντρωση γίδινου γάλακτος, αυτό απαιτεί μία επιπρόσθετη αραίωση καθώς και ένα επιπλέον σύνολο αντιδράσεων και μετρήσεων. Με τη χρήση του συστήματος ανοσομεθόδου τύπου σάντουιτς το οποίο χρησιμοποιεί πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που ανιχνεύει ανοσολογικά το γίδινο γάλα σε πρόβειο, η μέθοδος αυτή ανιχνεύει από 0,5 έως 40% νοθεία πρόβειου γάλακτος με γίδινο, αφού οι διασταυρούμενες αντιδράσεις με τις πρόβειες ή αγελαδινές IgG του γάλακτος είναι μηδενικές στα τεστ ELISA και ανοσοχρωματογραφίας πλευρικής ροής. Ως αποτέλεσμα, το χαμηλότερο όριο ανίχνευσης (LOD) γίνεται χαμηλότερο και η χαμηλότερη ποσότητα γίδινου γάλακτος που μπορεί να διακριθεί σε σχέση με την απουσία αυτού είναι 0,5%. Επί προσθέτως, αφού η μέθοδος έχει και πολύ υψηλό όριο ανίχνευσης, εάν υπάρχει ένα δείγμα με πολύ υψηλή νοθεία, δεν υπάρχει ανάγκη για επιπρόσθετη αραίωση του, ούτε επιπλέον σύνολο αντιδράσεων και μετρήσεων. If the sample has a higher concentration of goat milk, this requires an additional dilution as well as an additional set of reactions and measurements. Using the sandwich immunoassay system that uses polyclonal anti-goat IgG antibodies produced in sheep that immunologically detects goat's milk in sheep, this method detects from 0.5 to 40% adulteration of sheep's milk with goat's milk, since the cross-reactions with sheep or cow milk IgG are null in ELISA and lateral flow immunochromatography tests. As a result, the lower limit of detection (LOD) becomes lower and the lowest amount of goat milk that can be distinguished from its absence is 0.5%. In addition, since the method has a very high detection limit, if there is a sample with a very high adulteration, there is no need for additional dilution, nor an additional set of reactions and measurements.
Ακόμη, σε αντίθεση με τα μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία είναι αρκετά ευαίσθητα στην απώλεια των επιτόπων μέσω της χημικής επεξεργασίας με τα αντιγόνα, τα αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο αναγνωρίζουν πολλαπλούς επίτοπους σε κάθε μία γίδινη ανοσοσφαιρίνη δίνοντας καλύτερα αποτελέσματα στις ανοσομεθόδους τύπου σάντουιτς. Αυτά μπορούν να βοηθήσουν στην ενίσχυση του σήματος της πρωτεΐνης στόχου σε χαμηλή συγκέντρωση, καθώς στην πρωτεΐνη στόχο δεσμεύονται περισσότερα μόρια αντισωμάτων στους πολλαπλούς επίτοπους. Οι πολλαπλοί επίτοποι γενικά παρέχουν πολύ πιο ισχυρή ανίχνευση. Also, unlike monoclonal antibodies, which are quite sensitive to loss of epitopes through chemical treatment of the antigens, anti-goat IgG antibodies produced in sheep recognize multiple epitopes on each goat immunoglobulin giving better results in sandwich immunoassays. These can help amplify the signal of the target protein at low concentration, as more antibody molecules bind to the multiple epitopes on the target protein. Multiple epitopes generally provide much more robust detection.
ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Σχ. 1: Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του καθηλωμένου αντισώματος χρησιμοποιώντας την κατάλληλη άμεση ELISA για τα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG. Οι μικρόπλακες καλύφθηκαν με τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο σε διάφορες συγκεντρώσεις. Η αραίωση των αντιδραστηρίων ήταν: πολυκλωνικά αντισώματα ανίχνευσης έναντι των πρόβειων IgG συζευγμένα με υπεροξειδάση (HRP), 1/10000. Τα σημεία δεδομένων αποτελούν τα μέσο όρο ± τυπική απόκλιση (SD), για αριθμό δειγμάτων η=8. Fig. 1: Determination of immobilized antibody concentration using the appropriate direct ELISA for anti-goat IgG antibodies. Microplates were coated with sheep anti-goat IgG polyclonal antibodies at various concentrations. Dilution of reagents was: peroxidase (HRP)-conjugated anti-sheep IgG polyclonal detection antibodies, 1/10000. Data points are the mean ± standard deviation (SD), for number of samples n=8.
Σχ. 2: Ανίχνευση των γίδινων IgG χρησιμοποιώντας την κατάλληλη σάντουιτς ELISA για τις γίδινες IgG. Οι μικρόπλακες καλύφθηκαν με τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο σε συγκέντρωση 3pg/ml. Οι αραιώσεις των αντιδραστηρίων ήταν: πρότυπες γίδινες IgG σε διάφορες συγκεντρώσεις και πολυκλωνικά αντισώματα ανίχνευσης έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο συζευγμένα με υπεροξειδάση, 1/10000. Τα σημεία δεδομένων αποτελούν τα μέσο όρο ± τυπική απόκλιση (SD), για αριθμό δειγμάτων n=8. Fig. 2: Detection of goat IgG using the appropriate sandwich ELISA for goat IgG. Microplates were coated with sheep anti-goat IgG polyclonal antibodies at a concentration of 3 pg/ml. Reagent dilutions were: standard goat IgG at various concentrations and peroxidase-conjugated anti-goat IgG polyclonal detection antibodies produced in sheep, 1/10000. Data points are means ± standard deviation (SD), for sample number n=8.
Σχ. 3: Ανίχνευση των πρότυπων γίδινων IgG αντιπροσωπευτικών νοθείας πρόβειου γάλακτος με γίδινο χρησιμοποιώντας την κατάλληλη σάντουιτς ELISA για τις γίδινες IgG. Οι μικρόπλακες καλύφθηκαν με τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο σε συγκέντρωση 3μg/ml. Οι αραιώσεις των αντιδραστηρίων ήταν: πρότυπες γίδινες IgG σε διάφορες συγκεντρώσεις και πολυκλωνικά αντισώματα ανίχνευσης έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο συζευγμένα με υπεροξειδάση, 1/10000. Τα σημεία δεδομένων αποτελούν τα μέσο όρο ± τυπική απόκλιση (SD), για αριθμό δειγμάτων n=8. Fig. 3: Detection of goat IgG standards representative of sheep milk adulteration with goat using the appropriate sandwich ELISA for goat IgG. Microplates were coated with sheep anti-goat IgG polyclonal antibodies at a concentration of 3 µg/ml. Reagent dilutions were: standard goat IgG at various concentrations and peroxidase-conjugated anti-goat IgG polyclonal detection antibodies produced in sheep, 1/10000. Data points are means ± standard deviation (SD), for sample number n=8.
Σχ. 4: Ανίχνευση του γίδινου γάλακτος σε νοθευμένα δείγματα πρόβειου γάλακτος χρησιμοποιώντας την κατάλληλη σάντουιτς ELISA για τις γίδινες IgG. Οι μικρόπλακες καλύφθηκαν με τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο σε συγκέντρωση 3μg/ml. Οι αραιώσεις των αντιδραστηρίων ήταν: γάλα 1/400 και πολυκλωνικά αντισώματα ανίχνευσης έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο συζευγμένα με υπεροξειδάση, 1/10000. Τα σημεία δεδομένων αποτελούν τα μέσο όρο ± τυπική απόκλιση (SD), για αριθμό δειγμάτων n=8. Fig. 4: Detection of goat milk in adulterated sheep milk samples using the appropriate sandwich ELISA for goat IgG. Microplates were coated with sheep anti-goat IgG polyclonal antibodies at a concentration of 3 µg/ml. Reagent dilutions were: milk 1/400 and peroxidase-conjugated anti-goat IgG polyclonal detection antibodies produced in sheep, 1/10000. Data points are means ± standard deviation (SD), for sample number n=8.
Σχ. 5: Διάγραμμα το οποίο απεικονίζει μία ταινία πλευρικής ροής που χρησιμοποιείται για την επίτευξη του τεστ ανοσοχρωματογραφίας πλευρικής ροής σύμφωνα με την εφεύρεση, στην οποία: (1) είναι μία πορώδης δοκιμαστική μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης ενοποιημένη πάνω σε ένα υπόστρωμα υποστήριξης, (2) είναι μία ζώνη ανίχνευσης του αναλύτη που παρουσιάζονται τα καθηλωμένα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο, (3) είναι μία ζώνη ελέγχου (control) που παρουσιάζονται τα καθηλωμένα αντισώματα έναντι των πρόβειων IgG παραγόμενα σε κουνέλι, τα οποία δεσμεύουν τα σεσημασμένα αντισώματα, (4) είναι ένα σεσημασμένο επίθεμα απελευθέρωσης το οποίο απελευθερώνει σεσημασμένα με μπλε χρώση ή χρυσό πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο υποχωρώντας σε μορφή υγρού σε αυτό από το επίθεμα υποδοχής του δείγματος (5) και τέλος (6) είναι ένα απορροφητικό επίθεμα. Fig. 5: Diagram illustrating a lateral flow strip used to achieve the lateral flow immunochromatography test according to the invention, in which: (1) is a porous cellulose nitrate test membrane integrated onto a support substrate, (2) is a detection zone of the analyte showing immobilized anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep, (3) is a control zone showing immobilized anti-sheep IgG antibodies produced in rabbit, which bind the labeled antibodies, (4) is a labeled release pad which releases blue- or gold-labeled anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep by leaching into it from the sample receiving pad (5) and finally (6) is an absorbent pad .
ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ DISCLOSURE AND DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Αντισώματα Antibodies
Στην παρούσα εφεύρεση, ο όρος "αντίσωμα” αναφέρεται σε ένα αντίσωμα το οποίο είτε αναγνωρίζει όλο το μόριο του αντιγόνου είτε μόνο κομμάτια αυτού (όπως η Fab και η Fc περιοχές, διότι το αντιγόνο σε αυτή την εφεύρεση είναι ανοσοσφαιρίνη) και μπορεί να χρησιμοποιηθεί στις μεθόδους της εφεύρεσης. In the present invention, the term "antibody" refers to an antibody that either recognizes the entire antigen molecule or only parts thereof (such as the Fab and Fc regions, because the antigen in this invention is an immunoglobulin) and can be used in methods of the invention.
Όπως αναφέρεται και πιο πάνω, ένα κατάλληλο αντίσωμα για χρήση σε μία μεθοδολογία της εφεύρεσης θα είναι ικανό για να δεσμεύεται ειδικά στις γίδινες IgG. Επιθυμητά, το καθηλωμένο αντίσωμα όπως δείχνεται στα παραδείγματα πιο κάτω, παρουσιάζει μηδενικές διασταυρούμενες αντιδράσεις με IgG προβάτου ή αγελάδας στην μέθοδο της ELISA και της ανοσοχρωματογραφίας πλευρικής ροής. Πιο συγκεκριμένα, οι γίδινες και οι πρόβειες IgG έχουν πάρα πολλούς κοινούς επίτοπους και τα εμπορικά διαθέσιμα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων ανοσοσφαιρινών G παραγόμενα σε κουνέλι, τα οποία λόγω των ισχυρών διασταυρούμενων αντιδράσεων με τις πρόβειες ανοσοσφαι ρίνες G (πάνω από 80%), μπορούν να χρησιμεύσουν και ως άριστα αντισώματα δέσμευσης με τα πρωτογενή πρόβεια αντισώματα. Επομένως, τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε κουνέλι δεν είναι κατάλληλα για ανοσομεθόδους τύπου σάντουιτς όπως η ενζυμοσύνδετη ανοσοπροσροφητική μέθοδος ELISA ή ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής Lateral Flow που χρησιμοποιούνται για την ανοσολογική ανίχνευση του γίδινου γάλακτος μέσα στο πρόβειο. Περισσότερο επιθυμητά, ένα τέτοιο αντίσωμα (που χρησιμοποιείται στην εφεύρεση), είναι ικανό να ανιχνεύει σε τέτοιου είδους δοκιμές, συγκεντρώσεις γίδινων IgG που αντιστοιχούν σε 0,5 έως 40% νοθεία πρόβειου γάλακτος με γίδινο. As mentioned above, a suitable antibody for use in a methodology of the invention will be capable of binding specifically to goat IgG. Desirably, the immobilized antibody as shown in the examples below shows zero cross-reactions with sheep or cow IgG in ELISA and lateral flow immunochromatography. In particular, goat and sheep IgG share many common epitopes, and commercially available polyclonal anti-goat immunoglobulin G antibodies produced in rabbit, which due to strong cross-reactions with sheep immunoglobulin G (over 80%), can to also serve as excellent binding antibodies with primary sheep antibodies. Therefore, anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in rabbit are not suitable for sandwich immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assay ELISA or lateral flow immunochromatography used for immunodetection of goat milk in sheep. More desirably, such an antibody (used in the invention), is capable of detecting in such assays, concentrations of goat IgG corresponding to 0.5 to 40% adulteration of sheep milk with goat.
Σε αντίθεση με τα μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία είναι αρκετά ευαίσθητα στην απώλεια των επιτόπων μέσω της χημικής επεξεργασίας με τα αντιγόνα, τα πολυκλωνικά αναγνωρίζουν πολλαπλούς επίτοπους σε κάθε μία γίδινη ανοσοσφαιρίνη δίνοντας καλύτερα αποτελέσματα στις ανοσομεθόδους. Αυτά μπορούν να βοηθήσουν στην ενίσχυση του σήματος της πρωτεΐνης στόχου σε χαμηλή συγκέντρωση, καθώς στην πρωτεΐνη στόχο δεσμεύονται περισσότερα μόρια αντισωμάτων στους πολλαπλούς επίτοπους. Οι πολλαπλοί επίτοποι γενικά παρέχουν πολύ πιο ισχυρή ανίχνευση. Τα πολυκλωνικά αντισώματα αναγνωρίζουν πρωτεΐνες υψηλής ομολογίας με την πρωτεΐνη ανοσογόνο ή με πρωτεΐνες αντίστοιχης κατηγορίας, σε δείγματα ιστού από είδη διαφορετικά από αυτό που χρησιμοποιείται το ανοσογόνο. Τα πολυκλωνικά αντισώματα πολλές φορές χρησιμοποιούνται όταν η φύση του αντιγόνου σε μη δοκιμασμένα είδη ζώων δεν είναι γνωστή. Αυτό επίσης δημιουργεί την ανάγκη για τον έλεγχο της αλληλουχίας του ανοσογόνου όσον αφορά τις διασταυρούμενες αντιδράσεις. Unlike monoclonal antibodies, which are quite sensitive to the loss of epitopes through chemical treatment with antigens, polyclonals recognize multiple epitopes in each goat immunoglobulin giving better results in immunoassays. These can help amplify the signal of the target protein at low concentration, as more antibody molecules bind to the multiple epitopes on the target protein. Multiple epitopes generally provide much more robust detection. Polyclonal antibodies recognize proteins with high homology to the immunogen protein, or proteins of the same class, in tissue samples from species other than the one used for the immunogen. Polyclonal antibodies are often used when the nature of the antigen in untested animal species is not known. This also creates the need to control the sequence of the immunogen for cross-reactivity.
Τα πολυκλωνικά αντισώματα μπορούν να παραχθούν για παράδειγμα παρέχοντας τις γίδινες IgG ως αντιγόνο με τη χρήση μίας μεθόδου χορήγησης όπως η ενδοπεριτοναϊκή, ενδοφλέβια και υποδόρια ένεση, στην περιοχή του κάθε ζώου που μπορούν να παραχθούν τα αντισώματα. Στα πλαίσια της χορήγησης, το πλήρες ανοσοενισχυτικό Freud’s (Freund's complete adjuvant, FCA) ή το μη πλήρες (Freund's incomplete adjuvant, FIA), μπορούν να χορηγηθούν επίσης με σκοπό να αυξηθεί η ικανότητα του ζώου για την παραγωγή αντισωμάτων. Polyclonal antibodies can be produced for example by providing goat IgG as antigen using a method of administration such as intraperitoneal, intravenous and subcutaneous injection, to the area of each animal to which the antibodies can be produced. In the context of administration, Freud's complete adjuvant (Freund's complete adjuvant, FCA) or incomplete (Freund's incomplete adjuvant, FIA) can also be administered in order to increase the animal's ability to produce antibodies.
Το αντιγόνο μπορεί να χορηγηθεί μόνο μία φορά, αλλά συνήθως χορηγείται κάθε 2 έως 6 εβδομάδες για 2 έως 10 φορές στο σύνολο. Τα ζώα στα οποία παράγονται τα πολυκλωνικά αντισώματα μπορούν να είναι πίθηκοι, κουνέλια, σκύλοι, ινδικά χοιρίδια, ποντίκια, αρουραίοι, πρόβατα, γίδες και κοτόπουλα. The antigen can be given only once, but is usually given every 2 to 6 weeks for a total of 2 to 10 times. The animals in which the polyclonal antibodies are produced can be monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens.
Σε αυτή την εφεύρεση, έγινε η υπόθεση ότι το κατάλληλο πολυκλωνικά αντίσωμα μπορεί να παραχθεί χρησιμοποιώντας γίδινες IgG ως ανοσογόνο και ο ξενιστήςφορέας το πρόβατο (ώστε να παραχθούν αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο). Ο τίτλος του αντισώματος έναντι του αντιγόνου της παρούσας εφεύρεσης μπορεί να μετρηθεί με μία μέθοδο υγρής φάσης (για παράδειγμα η μέθοδος στην οποία το σεσημασμένο αντιγόνο της παρούσας εφεύρεσης αντιδρά με τον αντιορό και τότε η δραστικότητα της σεσημασμένης δέσμευσης μετρείται) ή μία μέθοδο στέρεας φάσης (για παράδειγμα η μέθοδος στην οποία το αντιγόνο της παρούσας εφεύρεσης έχει καθηλωθεί στα εσωτερικά τοιχώματα κάθε κελιού μίας μικρόπλακας 96 κελιών, και ένα διάλυμα έχοντας τον αντιορό διαλυμένο κατάλληλα προστίθεται σε αυτά, το αντίσωμα δεσμεύεται με το αντιγόνο, το διάλυμα κάθε κελιού εκπλένεται και η ποσότητα του δεσμευμένου αντισώματος στα εσωτερικά των κελιών μετρείται). In this invention, it was hypothesized that the appropriate polyclonal antibody can be produced using goat IgG as the immunogen and the host vector sheep (so as to produce antibodies against goat IgG produced in sheep). The antibody titer against the antigen of the present invention can be measured by a liquid phase method (for example the method in which the labeled antigen of the present invention reacts with the antiserum and then the activity of the labeled binding is measured) or a solid phase method ( for example, the method in which the antigen of the present invention is immobilized on the inner walls of each cell of a 96-cell microplate, and a solution having the antiserum appropriately dissolved is added to them, the antibody binds to the antigen, the solution of each cell is washed, and the amount of bound antibody to the inside of cells is measured).
Ο διαχωρισμός και ο καθαρισμός των πολυκλωνικών αντισωμάτων της παρούσας εφεύρεσης πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με γνωστή μέθοδο διαχωρισμού και καθαρισμού ανοσοσφαι ρινών. Αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει την αφαλάτωση, την κατακρήμνιση με αλκοόλη, την κατακρήμνιση ισοηλεκτρικού σημείου, την ηλεκτροφόρηση, την απορρόφηση και εκρόφηση με ιονανταλλάκτη (π.χ. DEAE), την υπερφυγοκέντρηση, τη μοριακή διήθηση και τέλος τον ειδικό καθαρισμό αντισωμάτων, με συλλογή των αντισωμάτων μόνο με χρωματογραφία συγγένειας με δεσμευμένα τα αντιγόνα σε στερεή φάση ή σε ένα ενεργό προσροφητικό υλικό όπως πρωτεΐνη Α ή G, και έπειτα τη διάσπαση του δεσμών και την παραλαβή των αντισωμάτων. Αυτές οι τεχνικές μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνες τους ή με κατάλληλο συνδυασμό. Separation and purification of the polyclonal antibodies of the present invention were performed according to a known method of isolation and purification of immunoglobulins. This method includes desalting, alcohol precipitation, isoelectric point precipitation, electrophoresis, absorption and desorption with an ion exchanger (e.g. DEAE), ultracentrifugation, molecular filtration and finally specific antibody purification, with collection of of antibodies only by affinity chromatography with the antigens bound to a solid phase or an active adsorbent such as protein A or G, and then cleavage of the bonds and recovery of the antibodies. These techniques can be used alone or in appropriate combination.
Ένα αντίσωμα για χρήση στη μέθοδο της εφεύρεσης μπορεί να σημανθεί άμεσα ή έμμεσα, π.χ. με τρόπους όπως αυτούς των σεσημασμένων δεύτερων αντισωμάτων. Κατάλληλο μέσο σήμανσης για αυτό το σκοπό είναι κάθε συμβατικό μέσο σήμανσης που χρησιμοποιείται στις ανοσομεθόδους συμπεριλαμβανομένων των ραδιενεργών, φθοριζόντων, ξεχωριστών σωματιδίων όπως ο κολλοειδής χρυσός ή τα ελαστικά σφαιρίδια, και ενζυμικών όπως η υπεροξειδάση “horseradish” (αναφερόμενη από εδώ και στο εξής “HRP”) μέσων, καθώς και η βιοτινη. An antibody for use in the method of the invention may be labeled directly or indirectly, e.g. in ways like those of labeled second antibodies. A suitable label for this purpose is any conventional label used in immunoassays including radioactive, fluorescent, discrete particles such as colloidal gold or rubber beads, and enzymes such as “horseradish” peroxidase (hereafter referred to as “HRP ”) media, as well as biotin.
Οι διασταυρούμενες αντιδράσεις μεταξύ του αντισώματος και του αντιγόνου της παρούσας εφεύρεσης μπορούν να μετρηθούν με μέθοδο στερεός φάσης (π.χ. η μέθοδος στην οποία οι γίδινες IgG (το αντιγόνο της παρούσας εφεύρεσης), οι πρόβειες IgG και οι αγελαδινές IgG έχουν καθηλωθεί σε μικρόπλακα πολυστυρολίου 96 θέσεων στα εσωτερικά τοιχώματα των κελιών, έπειτα ένα προστίθεται ένα διάλυμα περιέχοντας αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο συζευγμένα με HRP (αντίσωμα της παρούσας εφεύρεσης) διαλυμένα κατάλληλα, το διάλυμα κάθε κελιού εκπλένεται για την αποφυγή αυτών που δεν δεσμεύτηκαν και η ποσότητα του συζευγμένου με την HRP αντισώματος στα τοιχώματα των κελιών μετρείται). Cross-reactions between the antibody and the antigen of the present invention can be measured by a solid phase method (e.g., the method in which goat IgG (the antigen of the present invention), sheep IgG and cow IgG are immobilized on a microplate of 96-site polystyrene on the inner walls of the cells, then a solution containing anti-goat IgG antibodies produced in sheep conjugated with HRP (antibody of the present invention) diluted appropriately, the solution of each cell is washed to avoid those that were not bound and the amount of of HRP-conjugated antibody to cell walls is measured).
Μέθοδοι τύπου σάντουιτς Sandwich methods
Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, η μέθοδος της εφεύρεσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε οποιαδήποτε μορφή η οποία έγκειται στα πλαίσια της ανοσομεθόδου τύπου σάντουιτς. Τα αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο μπορούν να απαντώνται και σε ένα διάλυμα διαφορετικό από αυτό των σεσημασμένων. Εναλλακτικά και κατά προτίμηση, τα αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο μπορούν να δεσμευτούν σε ένα στερεό υπόστρωμα, π.χ. στερεό υπόστρωμα αποτελούμενο από νιτρική κυτταρίνη ή πλαστικό, π.χ. πλαστική επιφάνεια κελιών ή στερεά σφαιρίδια, π.χ. πλαστικά ή γυάλινα σφαιρίδια. Η μέθοδος της εφεύρεσης έτσι μπορεί π.χ. συμμορφωθεί με το συμβατικό τύπο σάντουιτς της ELISA χρησιμοποιώντας είτε άμεσα είτε έμμεσα (συζευγμένη μορφή) τα αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο. Σε αυτή την περίπτωση, τα αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο μπορούν να καθηλωθούν στα κελιά μίας μικρόπλακας (πολυστυρολίου) ή στερεά σφαιρίδια. Παρόλα αυτά, εναλλακτικά τα αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο μπορούν να καθηλωθούν σε μία πορώδη δοκιμαστική ταινία ή φύλλο ώστε να πραγματοποιηθεί η επί-τόπου εξέταση της νοθείας του πρόβειου γάλακτος με γίδινο χρησιμοποιώντας τη ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής, π.χ. δοκιμαστική ταινία ή φύλλο αποτελούμενα από νιτρική κυτταρίνη. Μία τέτοια δοκιμαστική ταινία ή φύλλο μπορεί να είναι, π.χ. στη μορφή της νιτρικής κυτταρίνης δεσμευμένη σε ένα υπόστωμα υποστήριξης, π.χ. πλαστικό φύλλο ή κάρτα. Η ELISA και η ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής σύμφωνα με την εφεύρεση αναλύονται αμέσως πιο κάτω και διευκρινίζονται με χαρακτηριστικά παραδείγματα. As mentioned above, the method of the invention can be used in any form that falls within the framework of the sandwich immunomethod. Anti-goat IgG antibodies produced in sheep can also be found in a solution different from that of the labeled ones. Alternatively and preferably, anti-goat IgG antibodies produced in sheep can be bound to a solid support, e.g. solid substrate consisting of cellulose nitrate or plastic, e.g. plastic cell surface or solid pellets, e.g. plastic or glass beads. The method of the invention can thus e.g. conform to the conventional sandwich type ELISA using either directly or indirectly (conjugated form) anti-goat IgG antibodies produced in sheep. In this case, anti-goat IgG antibodies produced in sheep can be immobilized on the cells of a microplate (polystyrene) or solid beads. However, alternatively goat anti-goat IgG antibodies produced in sheep can be immobilized on a porous test strip or sheet to perform on-site testing of goat milk adulteration using lateral flow immunochromatography, e.g. test tape or sheet consisting of cellulose nitrate. Such a test strip or sheet may be, e.g. in the form of cellulose nitrate bound to a supporting substrate, e.g. plastic sheet or card. ELISA and lateral flow immunochromatography according to the invention are discussed immediately below and illustrated by typical examples.
Μέθοδος ELISA ELISA method
Στην παρούσα εφεύρεση, η ειδική δέσμευση του αντισώματος τις γίδινες IgG μπορεί να έγκειται στην εύκολη ανίχνευση του γίδινου γάλακτος μέσα στο πρόβειο και να χρησιμοποιηθεί κατά προτίμηση σε μορφή κιτ ή άλλων μέσων ανίχνευσης καθώς και σε μία μέθοδο ανίχνευσης της νοθείας του πρόβειου γάλακτος με γίδινο, όπως περιγράφεται στη συνέχεια. In the present invention, the specific binding of the goat IgG antibody can lie in the easy detection of goat milk in the sheep and preferably be used in the form of a kit or other detection means as well as in a method of detecting the adulteration of sheep milk with goat, as described below.
Ένα επιθυμητό κιτ μπορεί να χρησιμοποιηθεί με ELISA ή με μία μέθοδο ανίχνευσης που χρησιμοποιεί κολλοειδή χρυσό ή έγχρωμα ελαστικά σφαιρίδια και όταν χρησιμοποιηθεί η ELISA τύπου σάντουιτς, το κιτ περιλαμβάνει πρότυπα διαλύματα με συγκεντρώσεις γίδινων IgG έναντι των καθηλωμένων αντισωμάτων, ένα σεσημασμένο δεύτερο αντίσωμα, ένα διάλυμα ρυθμιστικού διαλύματος και ένα διάλυμα ανίχνευσης. A desired kit can be used with an ELISA or a detection method using colloidal gold or colored rubber beads, and when sandwich ELISA is used, the kit includes standard solutions with concentrations of goat IgG against immobilized antibodies, a labeled second antibody, a solution buffer and a detection solution.
Επιπλέον, η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με μία μέθοδο ανίχνευσης γίδινων IgG, η οποία περιέχει τη χρησιμοποίηση του αντισώματος ή των μέσων ανίχνευσης που περιγράφηκαν πιο πάνω. Αυτή η μέθοδος ανίχνευσης δεν έχει ιδιαίτερους περιορισμούς, αφού χρησιμοποιεί την συνηθισμένη αντίδραση αντιγόνουαντισώματος και υπάρχουν πολλά παραδείγματα τέτοιων μεθόδων. Ανάμεσα σε αυτές τις μεθόδους, οι ELISA που χρησιμοποιούν τη β-γαλακτοζιδάση, τη γλυκοζιδάση, την αλκαλική φωσφατάση, την υπεροξειδάση, τη μηλική δεϋδρογονάση, ή η ανοσοχρωματογραφία που χρησιμοποιεί τον κολλοειδή χρυσό, προτιμούνται ιδιαίτερα από θέμα ευαισθησίας και χρήσης. Furthermore, the present invention relates to a method of detecting goat IgG, which comprises the use of the antibody or detection means described above. This detection method has no particular limitations, since it uses the usual antigen-antibody reaction and there are many examples of such methods. Among these methods, ELISAs using β-galactosidase, glycosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, or immunochromatography using colloidal gold are particularly preferred in terms of sensitivity and utility.
Η μέθοδος ανίχνευσης της τυπικής ELISA περιλαμβάνει την ELISA τύπου σάντουιτς. Για παράδειγμα, οι γίδινες IgG μπορούν να ανιχνευτούν με ELISA τύπου σάντουιτς χρησιμοποιώντας τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο της παρούσας εφεύρεσης όπως περιγράφεται πιο κάτω. The standard ELISA detection method includes sandwich ELISA. For example, goat IgG can be detected by a sandwich ELISA using the goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep of the present invention as described below.
(1) Τα πολυκλωνικά αντισώματα της παρούσας εφεύρεσης καθηλώνονται πάνω σε ένα υπόστρωμα υποστήριξης. Το υπόστρωμα υποστήριξης που χρησιμοποιείται είναι κατά προτίμηση μία μικρόπλακα 96, 48 ή 192 κελιών. Το αντίσωμα μπορεί να καθηλωθεί στο στέρεο υπόστρωμα υποστήριξης με την εισαγωγή ενός ρυθμιστικού διαλύματος το οποίο περιέχει το αντίσωμα για την καθήλωση, ακολουθούμενο από επώαση. Η συγκέντρωση του αντισώματος στο ρυθμιστικό διάλυμα είναι συνήθως από 1 μg/ml έως 10μg/ml. Το ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να είναι ένα γνωστό διάλυμα, εξαρτώμενο από τα μέσα ανίχνευσης. (1) The polyclonal antibodies of the present invention are immobilized on a support substrate. The support substrate used is preferably a 96, 48 or 192 cell microplate. The antibody can be immobilized on the solid support substrate by introducing a buffer containing the antibody for immobilization, followed by incubation. The concentration of antibody in the buffer is usually from 1 µg/ml to 10 µg/ml. The buffer can be a known solution, depending on the detection means.
(2) Με σκοπό την αποφυγή μη ειδικών προσροφήσεων πρωτεϊνών πάνω στην επιφάνεια του στερεού υποστρώματος υποστήριξης, η επιφάνεια της στέρεας φάσης που δεν προσροφήθηκε το αντίσωμα μπλοκάρεται με μία πρωτεΐνη ή κάποιο παράγοντα μη συγγενικό με το αντίσωμα. Ως παράγοντας μπλοκαρίσματος, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η αλβουμίνη ορού βοός (BSA), αποβουτυρωμένο γάλα, εμπορικά διαθέσιμα διαλύματα όπως το Block Ace (sigma) κ.α. Το στάδιο του μπλοκαρίσματος πραγματοποιείται έπειτα από προσθήκη του παράγοντα μπλοκαρίσματος στο υπόστρωμα υποστήριξης, επώαση αυτού π.χ. στους 4°C για 12-16 ώρες (κατά τη διάρκεια της νύχταςovernight), και έκπλυση με υγρό πλύσης. Το υγρό πλύσης δεν έχει περιορισμούς και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για παράδειγμα το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα όπως στο (1) πιο πάνω. (2) In order to avoid non-specific adsorption of proteins on the surface of the solid support substrate, the surface of the solid phase not adsorbed by the antibody is blocked with a protein or some agent unrelated to the antibody. As a blocking agent, bovine serum albumin (BSA), skimmed milk, commercially available solutions such as Block Ace (sigma), etc. can be used. The blocking step is performed after adding the blocking agent to the support substrate, incubating it e.g. at 4°C for 12-16 hours (overnight), and washing with washing liquid. The washing liquid is not limited and can be used for example the same buffer as in (1) above.
(3) Πρότυπα διαλύματα από γίδινες IgG σε διάφορες συγκεντρώσεις προετοιμάζονται. Οι συγκεντρώσεις αυτές επίσης δεν έχουν περιορισμούς. (3) Standard solutions of goat IgG at various concentrations are prepared. These concentrations also have no limitations.
(4) Το μίγμα του βήματος (3) αντιδρά με το αντίσωμα του υποστρώματος της στερεός φάσης που επετεύχθη στο βήμα (2) πιο πάνω. Από την αντίδραση του αντιγόνου-αντισώματος μεταξύ των γίδινων IgG και των καθηλωμένων αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο, προκαλείται δέσμευση των γίδινων IgG έμμεσα με το υπόστρωμα στερεός φάσης. Η αντίδραση πραγματοποιείται για παράδειγμα στους 25°C για περίπου 30 λεπτά. (4) The mixture of step (3) is reacted with the solid phase substrate antibody obtained in step (2) above. The antigen-antibody reaction between the goat IgG and the immobilized anti-goat IgG antibodies produced in sheep results in binding of the goat IgG indirectly to the solid phase substrate. The reaction is carried out for example at 25°C for about 30 minutes.
(5) Τα συζευγμένα με HRP αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο είναι διαλυμένα για παράδειγμα 10000 φορές δημιουργώντας ένα διάλυμα δευτέρου αντισώματος. (5) HRP-conjugated anti-goat IgG antibodies produced in sheep are diluted for example 10000 times to create a secondary antibody solution.
(6) Τα καθηλωμένα στη στερεά φάση αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο και οι γίδινες IgG του βήματος (4) εκπλένονται με υγρό πλύσης και έπειτα το διάλυμα δευτέρου αντισώματος (5) προστίθεται και αντιδρά αφήνοντας το για παράδειγμα στους 25°C για 30 λεπτά. Μετά αντίδραση τερματίζεται, το υπόστρωμα εκπλένεται με υγρό πλύσης και τα ενζυμικά συνδεδεμένα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που δεν δεσμεύτηκαν στα ενωμένα με τη στερεά φάση αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο και τις γίδινες IgG, απομακρύνονται. Με την ανίχνευση της ποσότητας του ενωμένου στη στερεά φάση συμπλόκου αντίσωμα / αντιγόνου / συζευγμένο με HRP αντίσωμα, η ποσότητα των γίδινων IgG στο δείγμα προσδιορίζεται από μία προηγούμενα έτοιμη καμπύλη βαθμονόμησης. (7) Ένα διάλυμα από χρωμογόνο υπόστρωμα για την αντίδραση του δεσμευμένου σεσημασμένου με το ένζυμο συμπλόκου προστίθεται για την ανίχνευση της απορρόφησης του διαλύματος αντίδρασης, μέσω του οποίου η ποσότητα των γίδινων IgG μπορούν να υπολογισθούν από την καμπύλη βαθμονόμησης. Όταν χρησιμοποιείται η υπεροξειδάση ως ένζυμο σήμανσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα διάλυμα χρωμογόνου υποστρώματος που περιέχει για παράδειγμα υπεροξείδιο του υδρογόνου και 3’,3’,5’,5’-τετραμέθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ) ή οφαινυλένοδιαμίνη (OPD). Συνήθως, το διάλυμα του χρωμογόνου υποστρώματος προστίθεται στο δείγμα, έπειτα το μίγμα αντιδρά για περίπου 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και τέλος προστίθεται θειικό οξύ για τον τερματισμό της ενζυμικής αντίδρασης. Όταν χρησιμοποιείται η 3<,>,3<,>,5’,5<,>-τετραμέθυλοβενζιδίνη, η απορρόφηση του διαλύματος αντίδρασης μετριέται στα 450nm. Όταν χρησιμοποιείται η ο-φαινυλένοδιαμίνη, η απορρόφηση του διαλύματος αντίδρασης μετριέται στα 492nm. Για την αντιστάθμιση της τιμής του υπόβαθρου (background), μετριέται ταυτόχρονα η απορρόφηση στα 630nm. (6) The immobilized anti-goat IgG antibodies produced in sheep and the goat IgG of step (4) are washed with washing liquid and then the second antibody solution (5) is added and reacted by leaving for example at 25°C for 30 minutes. After reaction is terminated, the substrate is washed with washing fluid and enzyme-linked anti-goat IgG antibodies produced in sheep that did not bind to the solid phase bound anti-goat IgG antibodies produced in sheep and goat IgG are removed. By detecting the amount of antibody/antigen/HRP-conjugated antibody complex bound to the solid phase, the amount of goat IgG in the sample is determined from a previously prepared calibration curve. (7) A solution of chromogenic substrate for the reaction of the bound enzyme-labeled complex is added to detect the absorbance of the reaction solution, whereby the amount of goat IgG can be calculated from the calibration curve. When peroxidase is used as the labeling enzyme, a chromogenic substrate solution containing, for example, hydrogen peroxide and 3',3',5',5'-tetramethylbenzidine (TMB) or ophenylenediamine (OPD) can be used. Typically, the chromogenic substrate solution is added to the sample, then the mixture is reacted for about 10 minutes at room temperature, and finally sulfuric acid is added to terminate the enzyme reaction. When 3<,>,3<,>,5',5<,>-tetramethylbenzidine is used, the absorbance of the reaction solution is measured at 450 nm. When o-phenylenediamine is used, the absorbance of the reaction solution is measured at 492 nm. To compensate for the background value, the absorbance at 630nm is measured at the same time.
Όταν για παράδειγμα χρησιμοποιείται η αλκαλική φωσφατάση ως σεσημασμένο ένζυμο, χρησιμοποιείται ως χρωμογόνο υπόστρωμα το π-νιτροφαινυλ-φωσφορικό οξύ, ως διάλυμα τερματισμού της ενζυμικής αντίδρασης το καυστικό νάτριο και η απορρόφηση του διαλύματος αντίδρασης μετριέται στα 415nm. When, for example, alkaline phosphatase is used as a labeled enzyme, p-nitrophenyl-phosphoric acid is used as a chromogenic substrate, sodium caustic is used as a termination solution for the enzyme reaction, and the absorbance of the reaction solution is measured at 415 nm.
Ο ρυθμός αύξησης της απορρόφησης είναι σχετικός με το διάλυμα αντίδρασης στο οποίο προστέθηκαν οι γίδινες IgG και αντέδρασαν. Το ποσοστό (%) της νοθείας του πρόβειου γάλακτος με γίδινο γάλα, αντιπροσωπευτικό της συγκέντρωσης των γίδινων IgG στο δείγμα του γάλακτος, μπορεί να προσδιορισθεί χρησιμοποιώντας μία προηγούμενα έτοιμη καμπύλη βαθμονόμησης από το ρυθμό αύξησης διαλυμάτων αντίδρασης γνωστών συγκεντρώσεων γίδινων IgG τα οποία προστέθηκαν. The rate of increase in absorbance is relative to the reaction solution in which the goat IgGs were added and reacted. The percentage (%) of sheep milk adulteration with goat milk, representative of the concentration of goat IgG in the milk sample, can be determined using a previously prepared calibration curve from the rate of increase of reaction solutions of known concentrations of goat IgG added.
Μέθοδος πλευρικής ροής Lateral flow method
Τα τεστ ανοσοχρωματογραφίας πλευρικής ροής σύμφωνα με την εφεύρεση μπορούν να επιτευχθούν χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε γνωστή μορφή συστήματος πλευρικής ροής και στηριζόμενα στην ανοσολογική ανίχνευση του γίδινου γάλακτος μέσα στο πρόβειο γάλα με τη χρήση μίας ανοσομεθόδου τύπου σάντουιτς. Lateral flow immunochromatography tests according to the invention can be achieved using any known form of lateral flow system and based on the immunological detection of goat's milk in sheep's milk using a sandwich immunoassay.
Ένα κοινό χαρακτηριστικό των συστημάτων πλευρικής ροής για την ανίχνευση του αναλύτη, είναι παροχή μίας δοκιμαστικής ταινίας ή φύλλο αποτελούμενα από πορώδες υλικό όπως η νιτρική κυτταρίνη, μέσω της οποίας ένα υγρό δείγμα μπορεί να υποχωρήσει ώστε να φθάσει σε μία ή περισσότερες χωροταξικά ξεχωριστές ζώνες ανίχνευσης του αναλύτη. Κάθε τέτοια ζώνη αντιπροσωπεύει ένα καθηλωμένο ειδικά δεσμευμένο διάλυμα. A common feature of lateral flow systems for analyte detection is the provision of a test strip or sheet of porous material such as cellulose nitrate through which a liquid sample can pass to reach one or more spatially distinct detection zones of the analyte. analyst. Each such band represents a fixed specifically bound solution.
Επίσης, από την εφεύρεση παρέχεται η δοκιμαστική ταινία ή φύλλο για την επίτευξη της ανοσοχρωματογραφίας πλευρικής ροής σύμφωνα με την εφεύρεση έχοντας τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: Also, the invention provides the test strip or sheet for achieving lateral flow immunochromatography according to the invention having the following characteristics:
(1) μία ταινία ή φύλλο αποτελούμενα από πορώδες υλικό, κατά προτίμηση νιτρική κυτταρίνη, έχοντας καθηλωμένη πάνω τους μία ζώνη ανίχνευσης του αναλύτη, (αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο, τα οποία περιγράφηκαν πιο πάνω) και (1) a film or sheet consisting of a porous material, preferably cellulose nitrate, having fixed thereon a detection zone of the analyte, (antibodies against goat IgG produced in sheep, which were described above) and
(2) Συνδεδεμένη ή ενοποιημένη με τη δοκιμαστική ταινία ή επιφάνεια που παρέχει τη ζώνη ανίχνευσης του αναλύτη, μία ξεχωριστή σεσημασμένη ζώνη απελευθέρωσης, η οποία έχει την ικανότητα να απελευθερώνεται σε μορφή υγρού υποχωρώντας από αυτή. Μία τέτοια ζώνη μπορεί να είναι τα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο σε σεσημασμένα με κολλοειδή χρυσό ή έγχρωμα ελαστικά σφαιρίδια. (2) Attached to or integrated with the test strip or surface providing the analyte detection zone, a separate marked release zone, which has the ability to be released in liquid form by retreating therefrom. One such band may be anti-goat IgG antibodies produced in sheep on colloidal gold-labeled or colored rubber beads.
Ο παραδειγματισμός περιγράφει με περισσότερες λεπτομέρειες την ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής σύμφωνα με την εφεύρεση η οποία χρησιμοποιεί τα καθηλωμένα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο, και ειδικότερα των αντισωμάτων που είναι ικανά να δεσμεύουν τις γίδινες IgG (σε δείγματα γάλακτος) και οι οποίες έχουν με τη σειρά τους δεσμευτεί με τα σεσημασμένα αντισώματα στην ζώνη απελευθέρωσης. Αν και ενδείκνυται (κατά προτίμηση) η χρήση των συζευγμένων αντισωμάτων με σωματίδια χρυσού, χρησιμοποιούνται επίσης και άλλα μόρια σήμανσης, π.χ. έγχρωμα πλαστικά σφαιρίδια. The exemplification describes in more detail the lateral flow immunochromatography according to the invention which uses the immobilized anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep, and in particular the antibodies which are capable of binding goat IgG (in milk samples) and which have in turn bind to the labeled antibodies in the release zone. Although the use of antibodies conjugated with gold particles is indicated (preferably), other labeling molecules are also used, e.g. colored plastic beads.
Εκτός από τη ζώνη ανίχνευσης του αναλύτη όπως περιγράφηκε πιο πάνω, μία δοκιμαστική ταινία ή φύλλο για δοκιμές πλευρικής ροής σύμφωνα με την εφεύρεση μπορεί επίσης να έχει μία ή περισσότερες επιπρόσθετες αντίστοιχες ζώνες για την ανίχνευση μίας ή περισσοτέρων συγκεντρώσεων από γίδινες IgG. In addition to the analyte detection zone as described above, a test strip or sheet for lateral flow tests according to the invention may also have one or more additional corresponding zones for the detection of one or more concentrations of goat IgG.
Για ένα σύστημα πλευρικής ροής, θα ήταν προτιμητέο η σεσημασμένη ζώνη απελευθέρωσης να είναι πλησιέστερα της ζώνης (ή ζώνες) ανίχνευσης του αναλύτη, λαμβάνοντας υπόψη την κατεύθυνση της ροής του υγρού. Η ζώνη αυτή μπορεί να είναι στη μορφή επιθέματος, π.χ. ένα επίθεμα αποτελούμενο από ίνες γυαλιού, ενοποιημένο σε μία ταινία ή φύλλο που παρέχει τη ζώνη (ή ζώνες) ανίχνευσης του αναλύτη. Μέθοδοι που παρέχουν σε μία τέτοια ταινία ή φύλλο μία ενσωματωμένη σεσημασμένη ζώνη απελευθέρωσης είναι ήδη πολύ γνωστές. Για παράδειγμα, μία περιοχή από μία ταινία νιτρικής κυτταρίνης μπορεί να γυαλίζει, π.χ. από την εναπόθεση υγρής ζάχαρης ή διάλυμα κυτταρίνης και η λεία περιοχή να έρχεται σε επαφή με το σεσημασμένο αντιδραστήριο. For a lateral flow system, it would be preferable for the marked release zone to be closer to the analyte detection zone (or zones), taking into account the direction of liquid flow. This zone can be in the form of a patch, e.g. a pad consisting of glass fibers, consolidated into a tape or sheet that provides the zone (or zones) of detection of the analyte. Methods of providing such a tape or sheet with an integrally labeled release zone are already well known. For example, an area of a cellulose nitrate film can be glossed, e.g. from the deposit of liquid sugar or cellulose solution and the smooth area is in contact with the labeled reagent.
Μία ταινία ή φύλλο για χρήση στη μέθοδο πλευρικής ροής της εφεύρεσης μπορεί επίσης να περιλαμβάνει μέλος ή επίθεμα που υποδοχής του δείγματος, πλησίον της σεσημασμένης ζώνης απελευθέρωσης. Ένα τέτοιο μέλος ή επίθεμα που υποδοχής του δείγματος μπορεί να είναι φτιαγμένο από οποιοδήποτε σπογγώδες υλικό, ικανό να προσροφά το υγρό γρήγορα. A tape or sheet for use in the lateral flow method of the invention may also include a sample receiving member or pad adjacent the marked release zone. Such a sample receiving member or pad may be made of any spongy material capable of rapidly adsorbing liquid.
Τυπικά, μία τέτοια ταινία ή φύλλο θα έχει, πέρα από την ζώνη (ή ζώνες) ανίχνευσης του αναλύτη, κατά τη διεύθυνση της προβλεπόμενης ροής του υγρού και κατά μήκος της ταινίας, δηλαδή περιφερικά της ζώνης (ή ζώνες) ανίχνευσης του αναλύτη, μία επιπλέον ζώνη ανίχνευσης, αποτελούμενη από καθηλωμένο ειδικό αντιδραστήριο δέσμευσης το οποίο παρέχει την ζώνη ελέγχου. Typically, such a strip or sheet will have, beyond the zone (or zones) of analyte detection, in the direction of intended liquid flow and across the strip, i.e. peripheral to the zone (or zones) of analyte detection, an additional detection zone, consisting of an immobilized specific binding reagent which provides the control zone.
Οι λειτουργίες της ζώνης ελέγχου είναι να δείχνει ότι το υγρό του δείγματος έχει διασχίσει την προηγηθείσα ζώνη (ή ζώνες) ανίχνευσης του διαλύτη, σε συνθήκες κατάλληλες για την ανίχνευση του. Για παράδειγμα, όπου παρέχεται από την σεσημασμένη ζώνη απελευθέρωσης το σεσημασμένο αντίσωμα, η ζώνη ελέγχου παρέχει ένα καθηλωμένο αντίσωμα που είναι ικανό να δεσμεύει το σεσημασμένο αντίσωμα. The functions of the control zone are to indicate that the sample liquid has crossed the previous detection zone (or zones) of the solvent, under conditions suitable for its detection. For example, where the labeled release zone provides the labeled antibody, the control zone provides an immobilized antibody capable of binding the labeled antibody.
Περιφερικά της ζώνης ανίχνευσης και στην κατεύθυνση της προβλεπόμενης ροής, μία ταινία ή φύλλο της εφεύρεσης μπορεί να περιλαμβάνει επιπροσθέτως ένα απορροφητικό επίθεμα. Peripheral to the detection zone and in the direction of intended flow, a tape or sheet of the invention may additionally comprise an absorbent pad.
Παράδειγμα 1 Example 1
Παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG σε πρόβατο Preparation of polyclonal antibodies against goat IgG in sheep
(Παραγωγή των γίδινων IgG, πρόβειων IgG και αγελαδινών IgG) (Production of goat IgG, sheep IgG and cow IgG)
Δείγματα αίματος συλλέχθηκαν από πέντε κλινικά υγιής κατσίκες, πρόβατα και αγελάδες χρησιμοποιώντας αποστειρωμένες σύριγγες μίας χρήσης (1 ,2 - 40 mm), καθορίσθηκαν έπειτα από φυγοκέντρηση (1000 g, 15 λεπτά) και διαλύθηκαν 1 :1 με 10 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου pH 7,2 το οποίο περιείχε 150 mM χλωριούχο νάτριο (phosphate buffer saline, PBS pH 7,2). Έπειτα ίσοι όγκοι από κάθε διαλυμένο ορό και κορεσμένο θειικό αμμώνιο αναμίχθηκαν με αργή προσθήκη του διαλύματος κορεσμένου θειικού αμμωνίου με ήπια ανάδευση. Μετά από φυγοκέντρηση (1000 g for 20 λεπτά), τα ιζήματα πλύθηκαν δύο φορές με 50% διαλύματος κορεσμένου θειικού αμμωνίου και τα τελικά ιζήματα διαλυτοποιήθηκαν σε PBS pH 7,2 ακολουθούμενα από διάλυση 12-16 ωρών έναντι του PBS pH 7,2. Έπειτα οι γίδινες IgG, οι πρόβειες IgG και οι αγελαδινές IgG καθορίσθηκαν με χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιώντας προπακεταρισμένη έτοιμη προς χρήση στήλη, HiTrap Protein G HP, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Pharmasia). Blood samples were collected from five clinically healthy goats, sheep and cows using sterile disposable syringes (1.2 - 40 mm), fixed after centrifugation (1000 g, 15 min) and diluted 1:1 with 10 mM sodium phosphate pH buffer. 7.2 which contained 150 mM sodium chloride (phosphate buffer saline, PBS pH 7.2). Then equal volumes of each diluted serum and saturated ammonium sulfate were mixed by slowly adding the saturated ammonium sulfate solution with gentle stirring. After centrifugation (1000 g for 20 min), the pellets were washed twice with 50% saturated ammonium sulfate solution and the final pellets were solubilized in PBS pH 7.2 followed by a 12-16 h elution against PBS pH 7.2. Goat IgG, sheep IgG and cow IgG were then determined by affinity chromatography using a prepackaged ready-to-use column, HiTrap Protein G HP, according to the manufacturer's instructions (Pharmasia).
Η συγκέντρωση των IgG ποσοτικοποιήθηκε με την “coomassie dye binding” μέθοδο (Bradford, 1976), χρησιμοποιώντας αλβουμίνη ορού βοός (Sigma) ως πρότυπο. Η τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε διαλύματος ρυθμίσθηκε στα 5 mg/ml. IgG concentration was quantified by the coomassie dye binding method (Bradford, 1976), using bovine serum albumin (Sigma) as a standard. The final protein concentration of each solution was adjusted to 5 mg/ml.
(Προετοιμασία της ένεσης) (Preparing the injection)
Μία πλαστική σύριγγα μίας χρήσης (1 ml) ενώθηκε με μία βελόνα 20 G x 25 mm και φορτώθηκε με τις παρασκευασμένες γίδινες IgG, γαλακτοποιημένες από το ανοσοενισχυτικό Freund’s Complete Adjuvant (FCA) (Sigma) για την πρωταρχική ανοσοποίηση και από το ανοσοενισχυτικό Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) (Sigma) για τις αναμνηστικές ανοσοποιήσεις. Ο λόγος του όγκου των γίδινων IgG με το ανοσοενισχυτικό ήταν 1 :1 και η τελική συγκέντρωση των γίδινων IgG ήταν 0,1 mg/ml για την ένεση των πρωταρχικών ενέσεων και 0,05 mg/ml για τις αναμνηστικές ενέσεις σε τελικό όγκο 1ml. A disposable plastic syringe (1 ml) was attached to a 20 G x 25 mm needle and loaded with the prepared goat IgG emulsified with Freund's Complete Adjuvant (FCA) (Sigma) for primary immunization and Freund's Incomplete Adjuvant (FIA) (Sigma) for booster immunizations. The volume ratio of goat IgG to adjuvant was 1:1 and the final concentration of goat IgG was 0.1 mg/ml for the injection of the primary injections and 0.05 mg/ml for the booster injections in a final volume of 1 ml.
(Ανοσοποίηση του προβάτου) (Sheep Immunization)
Για την πρωταρχική ανοσοποίηση, κάθε ένα από τα έξι οκτώ-μηνών πρόβατα (≈40 kg) έλαβαν 5 x 0.2 ml εμβόλια (0,1 mg/ml από τις παρασκευασμένες γίδινες IgG) σε κάθε ένα από πίσω άκρα και σε τρία σημεία στα πλευρά. Τα πρόβατα ήταν θρεμμένα με τακτική εμπορική δίαιτα. Μετά από δύο μήνες, μία μικρή ποσότητα δείγματος αίματος των 5 ml πάρθηκε και κάθε πρόβατο δέχθηκε για πρώτη φορά αναμνηστικό εμβόλιο, χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία με την πρώτη φορά, εκτός από το γεγονός ότι η συγκέντρωση των γίδινων IgG μειώθηκε κατά τον παράγοντα 2. Όπως η πρώτη αναμνηστική ένεση, οι επόμενες δύο έγιναν κάθε μήνα. Δύο εβδομάδες μετά από κάθε ένεση ένας όγκος αίματος από 250ml αφαιρούνταν το σύνολο του αντιορού συλλέγονταν. For primary immunization, each of six eight-month-old sheep (≈40 kg) received 5 x 0.2 ml vaccines (0.1 mg/ml of prepared goat IgG) on each hind limb and three sites on the flanks . The sheep were fed a regular commercial diet. After two months, a small amount of blood sample of 5 ml was taken and each sheep received a booster vaccine for the first time, using the same procedure as the first time, except that the concentration of goat IgG was reduced by a factor of 2. As the first booster injection, the next two were done every month. Two weeks after each injection a blood volume of 250ml was removed and the total antiserum was collected.
(Επιβεβαίωση του τίτλου των αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο, έναντι των γίδινων IgG με έμμεση ELISA) (Confirmation of anti-goat IgG antibody titer produced in sheep, anti-goat IgG by indirect ELISA)
(1) Οι προπαρασκευασμένες γίδινες IgG διαλύθηκαν σε ένα διάλυμα σύλληψης 3 μg/mL με 10 mΜ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου pH 7,2 το οποίο περιείχε 150 mM χλωριούχο νάτριο και προστέθηκε σε όγκο 100μl/κελί σε κάθε κελί από μία μικρόπλακα 96-κελιών και έπειτα καθηλώθηκαν στο στέρεο υπόστρωμα στους 4°C overnight. Το υγρό από κάθε κελί αφαιρέθηκε με αναρρόφηση, μετά διάλυμα PBS pH 7,5 το οποίο περιείχε 2% BSA προστέθηκε σε όγκο 300μl/κελί και κάθε κελί μπλοκαρίστηκε στους 4°C overnight ακολουθούμενο από την αφαίρεση του διαλύματος μπλοκαρίσματος επίσης με αναρρόφηση. (1) Prepared goat IgG was dissolved in a capture solution of 3 μg/mL with 10 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 containing 150 mM sodium chloride and added in a volume of 100 μl/cell to each cell of a 96-cell microplate and then fixed to the solid substrate at 4°C overnight. Fluid from each cell was removed by aspiration, then PBS solution pH 7.5 containing 2% BSA was added to a volume of 300μl/cell and each cell was blocked at 4°C overnight followed by removal of the blocking solution also by aspiration.
(2) Τα δείγματα του ορού των ανοσοποιημένων προβάτων διαλύθηκαν κατάλληλα σε PBS pH 7,5. Οι αραιώσεις των διαλυμάτων του κάθε προτύπου προστέθηκε σε όγκο 100μl/κελί μέσα στην πλάκα στην οποία οι παρασκευασμένες γίδινες IgG είχαν καθηλωθεί (1) και η μικρόπλακα επωάσθηκε στους 25°C για 60 λεπτά. (2) The serum samples of the immunized sheep were properly dissolved in PBS pH 7.5. Dilutions of the solutions of each standard were added in a volume of 100µl/cell into the plate to which the prepared goat IgG had been immobilized (1) and the microplate was incubated at 25°C for 60 minutes.
(3) Σεσημασμένα με HRP αντισώματα έναντι των πρόβειων IgG (Sigma) αραιώθηκαν 10000 φορές με PBS pH 7,5 το οποίο περιείχε 0,05% Tween 20 (PBS-Tween pH 7,5) για την προετοιμασία του διαλύματος του αντισώματος ανίχνευσης. (3) HRP-labeled anti-sheep IgG antibodies (Sigma) were diluted 10000-fold with PBS pH 7.5 containing 0.05% Tween 20 (PBS-Tween pH 7.5) to prepare the detection antibody solution.
(4) Τα κελιά που έλαβε χώρα η αντίδραση (2) πλύθηκαν τρεις φορές με PBS-Tween pH 7,5 και έπειτα το διάλυμα του αντισώματος ανίχνευσης (3) προστέθηκε σε όγκο 100μl/κεΛί στην πλάκα και αντέδρασε στους 25°C για 30 λεπτά. (4) The cells that underwent the reaction (2) were washed three times with PBS-Tween pH 7.5, and then the detection antibody solution (3) was added in a volume of 100μl/cell to the plate and reacted at 25°C for 30 minutes.
(5) Κάθε κελί μετά την αντίδραση (4) όπως πιο πάνω, πλύθηκε τρεις φορές με PBS-Tween pH 7,5 και 10ΟμΙ από το διάλυμα υποστρώματος ΤΜΒ (0.1 Ν διάλυμα οξικού νατρίου (pH 5.5) στο οποίο 100 μg/ml από 3’,3’,5’,5’-τετραμέθυλοβενζιδίνη και 0.006% από υπεροξείδιο του υδρογόνου έχουν προστεθεί) προστέθηκαν σε κάθε κελί και ακολούθησε επώαση στους 25oC για 10 λεπτά. Μετά 100μl/κελί από 1 Ν θειικό οξύ προστέθηκαν σε κάθε κελί για τον τερματισμό της χρωμογόνου αντίδρασης και η απορρόφηση στα 450nm μετρήθηκε με ειδικό φωτόμετρο μικροπλακών. (5) Each cell after the reaction (4) as above, was washed three times with PBS-Tween pH 7.5 and 10μL of the TMB substrate solution (0.1 N sodium acetate solution (pH 5.5) in which 100 μg/ml of 3',3',5',5'-tetramethylbenzidine and 0.006% of hydrogen peroxide have been added) were added to each cell followed by incubation at 25oC for 10 minutes. Then 100μl/cell of 1N sulfuric acid was added to each cell to terminate the chromogenic reaction and the absorbance at 450nm was measured with a special microplate photometer.
(Καθαρισμός των αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο) (Purification of anti-goat IgG antibodies produced in sheep)
Έπειτα από τη σάρωση με τη στέρεα φάση του του τίτλου των δειγμάτων του αντιορού που συλλέχθηκε έναντι των γίδινων IgG, επιλέχθηκε ο κατάλληλος ορός συλλογής των ανοσοποιημένων προβάτων και σε αυτό το δείγμα απενεργοποιήθηκε το συμπλήρωμα με θέρμανση για 45 λεπτά στους 60°C. Ο αντιορός κατακρημνίσθηκε με 50% κορεσμένο θειικό αμμώνιο. Μετά από τη διάλυση του σε PBS pH 7,5 και ρυθμιστικό διάλυμα Tris-φωσφορικών (40 Tris και 25 mM φωσφορικά, pH 8,2), τα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο καθορίσθηκαν χρωματογραφία ανοσοσυγγένειας σε ενεργοποιημένη με CNBr Sepharose 4Β σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Pharmasia) σε στήλη χρησιμοποιώντας τις γίδινες ανοσοσφαι ρίνες συζευγμένες με τα σφαιρίδια της ενεργοποιημένης με CNBr Sepharose 4Β. After solid phase screening of the titer of the antiserum samples collected against the goat IgG, the appropriate pooled sera of the immunized sheep was selected and complement was inactivated in this sample by heating for 45 min at 60°C. The antiserum was precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. After solubilization in PBS pH 7.5 and Tris-phosphate buffer (40 Tris and 25 mM phosphate, pH 8.2), sheep-derived anti-goat IgG antibodies were determined by immunoaffinity chromatography on CNBr-activated Sepharose 4B according to according to the manufacturer's instructions (Pharmasia) on a column using goat immunoglobulins coupled to CNBr-activated Sepharose 4B beads.
Η συγκέντρωση των αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο ποσοτικοποιήθηκε με την “coomassie dye binding” μέθοδο (Bradford, 1976), χρησιμοποιώντας αλβουμίνη ορού βοός (Sigma) ως πρότυπο. Η τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε διαλύματος ρυθμίσθηκε στο 1 mg/ml. The concentration of anti-goat IgG antibodies produced in sheep was quantified by the coomassie dye binding method (Bradford, 1976), using bovine serum albumin (Sigma) as a standard. The final protein concentration of each solution was adjusted to 1 mg/ml.
Παράδειγμα 2 Example 2
Προετοιμασία της σύζευξης μεταξύ της HRP και των πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο Preparation of the conjugate between HRP and anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep
Τα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που παράχθηκαν στο Παράδειγμα 1 σημάνθηκαν με την HRP χρησιμοποιώντας τη γλουταραλδεϋδη σύμφωνα με τη διαδικασία των δύο βημάτων του Avrameas και Ternynck (Avrameas and Ternynck, 1971). The sheep anti-goat IgG antibodies produced in Example 1 were labeled with HRP using glutaraldehyde according to the two-step procedure of Avrameas and Ternynck (Avrameas and Ternynck, 1971).
Παράδειγμα 3 Example 3
Προετοιμασία της σύζευξης μεταξύ των κυανού χρώματος πλαστικών σφαιριδίων και των πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο Preparation of the conjugate between the blue plastic beads and polyclonal anti-goat IgG antibodies produced in sheep
Τα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που παράχθηκαν στο Παράδειγμα 1 συζεύχθηκαν με κυανού χρώματος πλαστικά σφαιρίδια χρησιμοποιώντας το κιτ σύζευξης Latex-in-a-Box™ από την Bioassays Works σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. The sheep anti-goat IgG antibodies produced in Example 1 were conjugated to blue plastic beads using the Latex-in-a-Box™ Conjugation Kit from Bioassays Works according to the manufacturer's instructions.
Παράδειγμα 4 Example 4
Προετοιμασία της σύζευξης μεταξύ του κολλοειδή χρυσού και των πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο Preparation of the conjugate between colloidal gold and anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep
Τα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που παράχθηκαν στο Παράδειγμα 1 σταθεροποιήθηκαν με τον κολλοειδή χρυσό ο οποίος παράχθηκε χρησιμοποιώντας τις μεθόδους των Frens (1973) και Roth (1982a, b). The sheep anti-goat IgG antibodies produced in Example 1 were immobilized on colloidal gold which was produced using the methods of Frens (1973) and Roth (1982a,b).
Παράδειγμα 5 Example 5
Προσδιορισμός της συγκέντρωσης των επιστρωμένων αντισωμάτων με άμεση ELISA Determination of the concentration of coated antibodies by direct ELISA
(1) Τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που παράχθηκαν στο Παράδειγμα 1 , αραιώθηκαν σε διαλύματα επίστρωσης αντισώματος των 0,25, 0,5, 1 , 2, 3, 4 και 5 μg/ml σε PBS pH 7,5 και προστέθηκαν σε όγκο 100μl/κελί σε κάθε κελί από μία μικρόπλακα 96-κελιών και έπειτα καθηλώθηκαν στο στέρεο υπόστρωμα στους 4°C overnight. Το υγρό από κάθε κελί αφαιρέθηκε με αναρρόφηση, μετά διάλυμα PBS pH 7,5 το οποίο περιείχε 2% BSA προστέθηκε σε όγκο 300μl/κελί και κάθε κελί μπλοκαρίστηκε στους 4°C overnight ακολουθούμενο από την αφαίρεση του διαλύματος μπλοκαρίσματος επίσης με αναρρόφηση. (1) The sheep anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in Example 1 were diluted in antibody coating solutions of 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4 and 5 µg/ml in PBS pH 7; 5 and added in a volume of 100μl/cell to each cell of a 96-cell microplate and then fixed to the solid substrate at 4°C overnight. Fluid from each cell was removed by aspiration, then PBS solution pH 7.5 containing 2% BSA was added to a volume of 300μl/cell and each cell was blocked at 4°C overnight followed by removal of the blocking solution also by aspiration.
(2) Σεσημασμένα με HRP αντισώματα έναντι των πρόβειων IgG (Sigma) αραιώθηκαν 10000 φορές με PBS-Tween pH 7,5 για την προετοιμασία του διαλύματος του αντισώματος ανίχνευσης. (2) HRP-labeled anti-sheep IgG antibodies (Sigma) were diluted 10000-fold with PBS-Tween pH 7.5 to prepare the detection antibody solution.
(3) Τα επιστρωμένα κελιά (1) πλύθηκαν τρεις φορές με PBS-Tween pH 7,5 και έπειτα το διάλυμα του αντισώματος ανίχνευσης (2) προστέθηκε σε όγκο 100μl/κελί στην πλάκα και αντέδρασε στους 25°C για 30 λεπτά. (3) The plated cells (1) were washed three times with PBS-Tween pH 7.5, and then the detection antibody solution (2) was added in a volume of 100μl/cell to the plate and reacted at 25°C for 30 minutes.
(4) Κάθε κελί μετά την αντίδραση (3) όπως πιο πάνω, πλύθηκε τρεις φορές με PBS-Tween pH 7,5 και 100μl από το διάλυμα υποστρώματος ΤΜΒ προστέθηκαν σε κάθε κελί και ακολούθησε επώαση στους 25oC για 10 λεπτά. Μετά 100μl/κελί από 1 Ν θειικό οξύ προστέθηκαν σε κάθε κελί για τον τερματισμό της χρωμογόνου αντίδρασης και η απορρόφηση στα 450nm μετρήθηκε με ειδικό φωτόμετρο μικροπλακών. (4) Each cell after the reaction (3) as above, was washed three times with PBS-Tween pH 7.5 and 100μl of the TMB substrate solution was added to each cell followed by incubation at 25oC for 10 minutes. Then 100μl/cell of 1N sulfuric acid was added to each cell to terminate the chromogenic reaction and the absorbance at 450nm was measured with a special microplate photometer.
Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της συγκέντρωσης του επιστρωμένου αντισώματος σε αυτό το παράδειγμα φαίνονται στο Σχ. 1. Παρατηρήθηκε μία τυπική καμπύλη κορεσμού για τις διάφορες συγκεντρώσεις των καθηλωμένων στην μικρόπλακα πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο, με τον κορεσμό όλων θέσεων δέσμευσης να πετυχαίνεται στα 3 μg/ml. The results of determining the concentration of the coated antibody in this example are shown in Fig. 1. A typical saturation curve was observed for the various concentrations of the microplate immobilized anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep, with saturation of all binding sites being achieved. at 3 µg/ml.
Παράδειγμα 6 Example 6
Σαφήνεια της ύπαρξης διασταυρούμενων αντιδράσεων των αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο με άμεση ELISA Clarity of cross-reactivity of anti-goat IgG antibodies produced in sheep by direct ELISA
(1) Οι γίδινες IgG, οι πρόβειες IgG και οι αγελαδινές IgG που παρήχθησαν στο Παράδειγμα 1, αραιώθηκαν σε διαλύματα επίστρωσης των 3 μg/ml σε PBS pH 7,5 και προστέθηκαν σε όγκο 100μl/κελί σε κάθε κελί από μία μικρόπλακα 96-κελιών και έπειτα καθηλώθηκαν στο στέρεο υπόστρωμα στους 4°C overnight. Το υγρό από κάθε κελί αφαιρέθηκε με αναρρόφηση, μετά διάλυμα PBS pH 7,5 το οποίο περιείχε 2% BSA προστέθηκε σε όγκο 300μl/κελί και κάθε κελί μπλοκαρίστηκε στους 4°C overnight ακολουθούμενο από την αφαίρεση του διαλύματος μπλοκαρίσματος επίσης με αναρρόφηση. (1) The goat IgG, sheep IgG, and cow IgG produced in Example 1 were diluted to 3 µg/ml plating solutions in PBS pH 7.5 and added in a volume of 100 µl/cell to each cell of a 96-well microplate. cells and then fixed to the solid substrate at 4°C overnight. Fluid from each cell was removed by aspiration, then PBS solution pH 7.5 containing 2% BSA was added to a volume of 300μl/cell and each cell was blocked at 4°C overnight followed by removal of the blocking solution also by aspiration.
(2) Τα σεσημασμένα με HRP αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο (Παράδειγμα 2) αραιώθηκαν 20000 φορές με PBS-Tween pH 7,5 για την προετοιμασία του διαλύματος του αντισώματος ανίχνευσης. (2) HRP-labeled anti-goat IgG antibodies produced in sheep (Example 2) were diluted 20000 times with PBS-Tween pH 7.5 to prepare the detection antibody solution.
(3) Τα επιστρωμένα κελιά (1) πλύθηκαν τρεις φορές με PBS-Tween pH 7,5 και έπειτα το διάλυμα του αντισώματος ανίχνευσης (2) προστέθηκε σε όγκο 100μl/κελί στην πλάκα και αντέδρασε στους 25°C για 30 λεπτά. (3) The plated cells (1) were washed three times with PBS-Tween pH 7.5, and then the detection antibody solution (2) was added in a volume of 100μl/cell to the plate and reacted at 25°C for 30 minutes.
(4) Κάθε κελί μετά την αντίδραση (3) όπως πιο πάνω, πλύθηκε τρεις φορές με PBS-Tween pH 7,5 και 100μl από το διάλυμα υποστρώματος ΤΜΒ προστέθηκαν σε κάθε κελί και ακολούθησε επώαση στους 25oC για 10 λεπτά. Μετά 100μl/κελί από 1 Ν θειικό οξύ προστέθηκαν σε κάθε κελί για τον τερματισμό της χρωμογόνου αντίδρασης και η απορρόφηση στα 450nm μετρήθηκε με ειδικό φωτόμετρο μικροπλακών. (4) Each cell after the reaction (3) as above, was washed three times with PBS-Tween pH 7.5 and 100μl of the TMB substrate solution was added to each cell followed by incubation at 25oC for 10 minutes. Then 100μl/cell of 1N sulfuric acid was added to each cell to terminate the chromogenic reaction and the absorbance at 450nm was measured with a special microplate photometer.
Η ανάλυση των διασταυρούμενων αντιδράσεων των αντισωμάτων έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο με τις πρόβειες και αγελαδινές IgG έδειξε ότι τα συζευγμένα IgG έχουν μηδενικές διασταυρούμενες αντιδράσεις στην κατάλληλη αραίωση. Analysis of the cross-reactivity of anti-goat IgG antibodies produced in sheep with sheep and cow IgG showed that the conjugated IgGs have zero cross-reactivity at the appropriate dilution.
Παράδειγμα 7 Example 7
Ανίχνευση των γίδινων IgG με ELISA τύπου σάντουιτς Detection of goat IgG by sandwich ELISA
(1) Τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που παράχθηκαν στο Παράδειγμα 1 , αραιώθηκαν στα 3 pg/ml σε PBS pH 7,5 και προστέθηκαν σε όγκο 100μl/κελί σε κάθε κελί από μία μικρόπλακα 96-κελιών και έπειτα καθηλώθηκαν στο στέρεο υπόστρωμα στους 4°C overnight. Το υγρό από κάθε κελί αφαιρέθηκε με αναρρόφηση, μετά διάλυμα PBS pH 7,5 το οποίο περιείχε 2% BSA προστέθηκε σε όγκο 300μl/κελί και κάθε κελί μπλοκαρίστηκε στους 4°C overnight ακολουθούμενο από την αφαίρεση του διαλύματος μπλοκαρίσματος επίσης με αναρρόφηση. (1) The sheep anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in Example 1 were diluted to 3 pg/ml in PBS pH 7.5 and added in a volume of 100μl/cell to each cell of a 96-cell microplate and then fixed on the solid substrate at 4°C overnight. Fluid from each cell was removed by aspiration, then PBS solution pH 7.5 containing 2% BSA was added to a volume of 300μl/cell and each cell was blocked at 4°C overnight followed by removal of the blocking solution also by aspiration.
(2) Πρότυπα διαλύματα γίδινων IgG με συγκέντρωση 0,015, 0,03, 0,06, 0,12, 0,48, 0,72, 0,96, 1 ,2 και 1 ,44 pg/ml ετοιμάσθηκαν σε PBS pH 7,5. Τα διαλύματα των αραιώσεων κάθε προτύπου προστέθηκαν σε όγκο 100μl/κελί μέσα στη μικρόπλακα στην οποία τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο (1), είχαν επιστρωθεί στο στέρεο υπόστρωμα και έπειτα η μικρόπλακα επωάσθηκε στους 25°C για 30 λεπτά. (2) Goat IgG standard solutions with a concentration of 0.015, 0.03, 0.06, 0.12, 0.48, 0.72, 0.96, 1.2 and 1.44 pg/ml were prepared in PBS pH 7 ,5. The solutions of the dilutions of each standard were added in a volume of 100μl/cell into the microplate in which the polyclonal anti-goat IgG antibodies produced in sheep (1), had been coated on the solid support, and then the microplate was incubated at 25°C for 30 minutes.
(3) Τα σεσημασμένα με HRP αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο τα οποία παράχθηκαν στο Παράδειγμα 2, αραιώθηκαν 10000 με PBS-Tween pH 7,5, για την προετοιμασία του διαλύματος του αντισώματος ανίχνευσης. (4) Τα κελιά που έλαβε χώρα η αντίδραση (2) πλύθηκαν τρεις φορές με PBS-Tween pH 7,5 και έπειτα το διάλυμα του αντισώματος ανίχνευσης (3) προστέθηκε σε όγκο 100μl/κελί στην πλάκα και αντέδρασε στους 25°C για 30 λεπτά. (3) The HRP-labeled sheep-derived anti-goat IgG antibodies produced in Example 2 were diluted 10,000 with PBS-Tween pH 7.5, to prepare the detection antibody solution. (4) The cells subjected to the reaction (2) were washed three times with PBS-Tween pH 7.5, and then the detection antibody solution (3) was added in a volume of 100μl/cell to the plate and reacted at 25°C for 30 minutes.
(5) Κάθε κελί μετά την αντίδραση (4) όπως πιο πάνω, πλύθηκε τρεις φορές με PBS-Tween pH 7,5 και 100μl από το διάλυμα υποστρώματος ΤΜΒ προστέθηκαν σε κάθε κελί και ακολούθησε επώαση στους 25oC για 10 λεπτά. Μετά 100μl/κελί από 1 Ν θειικό οξύ προστέθηκαν σε κάθε κελί για τον τερματισμό της χρωμογόνου αντίδρασης και η απορρόφηση στα 450nm μετρήθηκε με ειδικό φωτόμετρο μικροπλακών. (5) Each cell after the reaction (4) as above, was washed three times with PBS-Tween pH 7.5 and 100μl of the TMB substrate solution was added to each cell followed by incubation at 25oC for 10 minutes. Then 100μl/cell of 1N sulfuric acid was added to each cell to terminate the chromogenic reaction and the absorbance at 450nm was measured with a special microplate photometer.
Τα αποτελέσματα της ανίχνευσης των γίδινων IgG σε αυτό το παράδειγμα δείχνονται στο Σχ. 2. The results of goat IgG detection in this example are shown in Fig. 2.
Παράδειγμα 8 Example 8
Προσδιορισμός της συγκέντρωσης των IgG σε γίδινο γάλα με ELISA τύπου σάντουιτς Determination of IgG concentration in goat milk by sandwich ELISA
Ένας συνολικός αριθμός από 100 δειγμάτων ακατέργαστου γίδινου γάλακτος συλλέχθηκε από κάθε γεωγραφική περιοχή της Ελλάδας και κατάλληλα διαλύματα από αυτά τα δείγματα ετοιμάσθηκαν σε PBS-Tween pH 7,5. Έπειτα η συγκέντρωση των IgG στα διαλύματα του γίδινου γάλακτος προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο της ELISA τύπου σάντουιτς του Παραδείγματος 7. Μετέπειτα ο μέσος όρος της συγκέντρωσης των IgG στο γίδινο γάλα υπολογίσθηκε. A total number of 100 raw goat milk samples were collected from each geographical region of Greece and appropriate solutions of these samples were prepared in PBS-Tween pH 7.5. Then the concentration of IgG in the goat milk solutions was determined by the sandwich ELISA method of Example 7. Then the average concentration of IgG in the goat milk was calculated.
Παράδειγμα 9 Example 9
Ανίχνευση 0,5-40% νοθείας του πρόβειου γάλακτος με γίδινο γάλα με ELISA τύπου σάντουιτς Detection of 0.5-40% adulteration of sheep's milk with goat's milk by sandwich ELISA
(1) Τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που παράχθηκαν στο Παράδειγμα 1 , αραιώθηκαν στα 3 μg/ml σε PBS pH 7,5 και προστέθηκαν σε όγκο 100μl/κελί σε κάθε κελί από μία μικρόπλακα 96-κελιών και έπειτα καθηλώθηκαν στο στέρεο υπόστρωμα στους 4°C overnight. Το υγρό από κάθε κελί αφαιρέθηκε με αναρρόφηση, μετά διάλυμα PBS pH 7,5 το οποίο περιείχε 2% BSA προστέθηκε σε όγκο 300μl/κελί και κάθε κελί μπλοκαρίστηκε στους 4°C overnight ακολουθούμενο από την αφαίρεση του διαλύματος μπλοκαρίσματος επίσης με αναρρόφηση. (1) The sheep anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in Example 1 were diluted to 3 µg/ml in PBS pH 7.5 and added in a volume of 100 µl/cell to each cell of a 96-cell microplate and then fixed on the solid substrate at 4°C overnight. Fluid from each cell was removed by aspiration, then PBS solution pH 7.5 containing 2% BSA was added to a volume of 300μl/cell and each cell was blocked at 4°C overnight followed by removal of the blocking solution also by aspiration.
(2) Πρότυπα διαλύματα γίδινων IgG αντιπροσωπευτικά των ποσοστών 0,5, 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35 και 40% νοθείας του πρόβειου γάλακτος με γίδινο γάλα (σε PBS-Tween pH 7,5) καθώς και νοθευμένα δείγματα (στο εργαστήριο) του πρόβειου γάλακτος με γίδινο γάλα 0,5, 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40% ετοιμάσθηκαν αραιώθηκαν 200 φορές με PBS-Tween pH 7,5. Τα διαλύματα των αραιώσεων κάθε προτύπου και δείγματος του γάλακτος προστέθηκαν σε όγκο 100μl/κελί μέσα στη μικρόπλακα στην οποία τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο (1), είχαν επιστρωθεί στο στέρεο υπόστρωμα και έπειτα η μικρόπλακα επωάσθηκε στους 25°C για 30 λεπτά. (2) Goat IgG standard solutions representative of 0.5, 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40% adulteration of sheep milk with goat milk (in PBS-Tween pH 7.5) as well as adulterated samples (in the laboratory) of sheep's milk with goat's milk 0.5, 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40% were prepared diluted 200 times with PBS-Tween pH 7.5. The solutions of the dilutions of each standard and milk sample were added in a volume of 100μl/cell into the microplate in which polyclonal anti-goat IgG antibodies produced in sheep (1), had been coated on the solid support and then the microplate was incubated at 25°C for 30 minutes.
Έπειτα από αυτό το στάδιο, ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία του Παραδείγματος 7. Η μέθοδος αυτού του παραδείγματος (Παράδειγμα 9), μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό της σύστασης (σε γάλα) του τυριού, το οποίο φτιάχνεται από πρόβειο και γίδινο γάλα, κατόπιν της κατάλληλης εκχύλισης. After this stage, the same procedure of Example 7 was followed. The method of this example (Example 9) can be used to calculate the composition (in milk) of cheese, which is made from sheep's and goat's milk, after the of suitable extraction.
Η πρότυπη καμπύλη και τα αποτελέσματα της ανίχνευσης της νοθείας του πρόβειου γάλακτος με γίδινο γάλα από 0,5-40% δείχνεται στο Σχ. 3 και Σχ. 4. The standard curve and detection results of sheep milk adulteration with goat milk from 0.5-40% are shown in Fig. 3 and Fig. 4.
Παράδειγμα 10 Example 10
Ανίχνευση της νοθείας του πρόβειου γάλακτος με γίδινο γάλα με ανοσοχρωματογραφία πλευρικής ροής Detection of sheep's milk adulteration with goat's milk by lateral flow immunochromatography
(Ακινητοποίηση των αντιδραστηρίων) (Immobilization of reagents)
Το μηχάνημα ψεκασμού Biojet (ΧΥΖ3000) (Irvine, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε ώστε να ψεκασθούν δύο ζώνες (Σχ. 5 (2) και (3)) στις ταινίες νιτρικής κυτταρίνης (Millipore) (25X300 mm) (Σχ. 5 (1)). Τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο που παράχθηκαν στο Παράδειγμα 1 (0.5 mg/ml) ψεκάσθηκαν στη βάση (Σχ. 5 (2)) ως ζώνη ανίχνευσης (1 ml ανά 1 mm γραμμής), ενώ 1 mg/ml αντισωμάτων έναντι των πρόβειων IgG παραγόμενα σε κουνέλι (Sigma) ψεκάσθηκαν στην θέση πιο πάνω (Σχ. 5 (3)) ως ζώνη ελέγχου (1 ml ανά 1 mm γραμμής). Η μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης ξηράθηκε για 2 ώρες στους 37°C, μπλοκαρίσθηκε με 1% BSA για 30 λεπτά και επαναξηράθηκε για 3 ώρες στους 37°C. Τέλος, οι ταινίες αποθηκεύτηκαν υπό συνθήκες ξήρανσης σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι τη χρήση τους. Τα συζευγμένα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο με κυανού χρώματος πλαστικά σφαιρίδια (Παράδειγμα 3) ή με κολλοειδή χρυσό (Παράδειγμα 4) (αντιδραστήρια ανίχνευσης), ψεκάσθηκαν πάνω σε ένα φίλτρο με ίνες γυαλιού (Σχ. The Biojet sprayer (XYZ3000) (Irvine, CA, USA) was used to spray two zones (Fig. 5 (2) and (3)) on cellulose nitrate strips (Millipore) (25X300 mm) (Fig. 5 (1) ). The sheep anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in Example 1 (0.5 mg/ml) were sprayed onto the base (Fig. 5 (2)) as a detection zone (1 ml per 1 mm line), while 1 mg/ml antibodies anti-sheep IgG produced in rabbit (Sigma) was injected at the site above (Fig. 5 (3)) as a control zone (1 ml per 1 mm line). The cellulose nitrate membrane was dried for 2 h at 37°C, blocked with 1% BSA for 30 min and re-dried for 3 h at 37°C. Finally, the films were stored under drying conditions at room temperature until use. Conjugated anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep with blue plastic beads (Example 3) or colloidal gold (Example 4) (detection reagents), were sprayed onto a glass fiber filter (Fig.
5 (4)) σε κατάλληλη συγκέντρωση με το μηχάνημα ψεκασμού Airjet (ΧΥΖ3000) (Irvine, CA, USA) και έπειτα ξηράθηκαν για 3 ώρες στους 37°C. Ο όγκος ψεκασμού υπολογίσθηκε επίσης 1 ml ανά 1 mm γραμμής. 5 (4)) at an appropriate concentration with the Airjet atomizer (XYZ3000) (Irvine, CA, USA) and then dried for 3 h at 37°C. The spray volume was also calculated as 1 ml per 1 mm of line.
(Ανάπτυξη ενός βήματος ταινίας) (One step film development)
Η ενός βήματος ταινία συντάσσεται από τρία επιθέματα (του δείγματος (Σχ. 5 (5)), του σεσημασμένου (Σχ. 5 (4)), και του απορροφητικού (Σχ. 5 (6)) επιθέματος) και μία μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης (Σχ. 5 (1)). Αυτά, κολλούνταν πάνω σε ένα συγκολλητικο πλαστικο υποστρωμα. Επι προσθετως, η μεμβρανη νιτρικης κυτταρινης που περιεχει το αντιδραστηριο ανιχνευσης (Σχ.5(2)) και ελεγχου (Σχ. The one-step tape is composed of three pads (the sample (Fig. 5 (5)), the labeled (Fig. 5 (4)), and the absorbent (Fig. 5 (6)) pad) and a cellulose nitrate membrane ( Fig. 5 (1)). These were glued onto an adhesive plastic substrate. In addition, the cellulose nitrate membrane containing the detection reagent (Fig. 5(2)) and control (Fig.
5 (3)), κολλούνταν στο κέντρο του υποστρώματος. Το σεσημασμένο επίθεμα απελευθέρωσης (Σχ. 5 (4)) που περιέχει τα σεσημασμένα με κυανού χρώματος πλαστικά σφαιρίδια ή τον κολλοειδή χρυσό IgG κολλούνταν 2 mm πάνω από τη διάβαση της νιτρικής κυτταρίνης. Το επίθεμα υποδοχής του δείγματος (ίνες γυαλιού) (Σχ. 5 (5)) επίσης κολλούνταν 4 mm πάνω από τη διάβαση του σεσημασμένου επιθέματος απελευθέρωσης (Σχ. 5 (4)). Το απορροφητικό επίθεμα (Σχ. 5 (6)) κολλούνταν στην άλλη πλευρά του υποστρώματος. Το όλο σύστημα κοβόταν σε λεπτές λωρίδες και διαιρούνταν σε μεμονωμένες ταινίες (5X60 mm) με έναν ειδικό κόφτη. 5 (3)), was glued to the center of the substrate. The labeled release pad (Fig. 5 (4)) containing the blue-labeled plastic beads or IgG colloidal gold was stuck 2 mm above the cellulose nitrate passage. The sample receiving pad (glass fibers) (Fig. 5 (5)) was also glued 4 mm above the passage of the marked release pad (Fig. 5 (4)). The absorbent pad (Fig. 5 (6)) was glued to the other side of the substrate. The whole system was cut into thin strips and divided into individual strips (5X60 mm) with a special cutter.
(Ανάλυση δειγμάτων γάλακτος) (Analysis of milk samples)
Τα δείγματα του πρόβειου γάλακτος που περιέχουν γίδινο γάλα ή οι διαφορετικές συγκεντρώσεις πρότυπων γίδινων IgG οι οποίες παράχθηκαν στο Παράδειγμα 1 , αραιώθηκαν με PBS-Tween pH 7,5. Διακόσια μΙ από κάθε δείγμα προστέθηκαν σε κάθε ενός-βήματος ταινία. Ως αρνητικά δείγματα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν δείγματα πρόβειου γάλακτος νοθευμένα με γίδινο γάλα <1%. Μετά από 5 λεπτά, τα αποτελέσματα της ταινίας προσδιορίσθηκαν ως θετικά ή αρνητικά οπτικά. Η περιοχή ελέγχου (ο) και δοκιμής (t) στην ταινία προέρχεται από τα αντισώματα έναντι των πρόβειων IgG παραγόμενα σε κουνέλι και τα αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο ξεχωριστά. Τα συζευγμένα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των γίδινων IgG παραγόμενα σε πρόβατο με κυανού χρώματος πλαστικά σφαιρίδια ή με κολλοειδή χρυσό, τείνουν να αντιδράσουν με τις γίδινες IgG. Όταν αυτά εισέλθουν στο θετικό δείγμα, η ζώνη δοκιμής και η ζώνη ελέγχου γίνονται κόκκινες ξεχωριστά, ενώ ένα αρνητικό δείγμα έχει ως αποτέλεσμα να είναι κόκκινη μόνο η ζώνη ελέγχου. Η δοκιμή είναι μη έγκυρη όταν δεν εμφανίζεται καμία κόκκινη γραμμή. The sheep milk samples containing goat milk or the different concentrations of goat IgG standards produced in Example 1 were diluted with PBS-Tween pH 7.5. Two hundred µL of each sample was added to each one-step strip. Sheep milk samples adulterated with <1% goat milk were used as negative control samples. After 5 min, film results were determined as positive or negative visually. The control (o) and test (t) region in the strip are from the rabbit anti-sheep IgG antibodies and the sheep anti-goat IgG antibodies separately. Conjugated anti-goat IgG polyclonal antibodies produced in sheep with blue plastic beads or with colloidal gold tend to react with goat IgG. When these enter the positive sample, the test zone and control zone turn red separately, while a negative sample results in only the control zone being red. The test is invalid when no red line appears.
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΕΣ ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΦΕΥΡΕΣΗ BIBLIOGRAPHY REFERRING TO THE INVENTION
Avrameas, S. and Ternynck, Τ. Peroxidase labeled antibody and Fab conjugates with enhanced intracellular penetration. Immunochemistry 1971 , 8: 1175-1179. Avrameas, S. and Ternynck, T. Peroxidase labeled antibody and Fab conjugates with enhanced intracellular penetration. Immunochemistry 1971, 8: 1175-1179.
Bradford Μ. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976, 72: 248-254. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976, 72: 248-254.
Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions. Nature (London) Phy. Sci. 1973, 241 :20. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions. Nature (London) Phy. Sci. 1973, 241 :20.
Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227: 680-685. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227: 680-685.
Roth, J. The protein A-gold (pAG) techniqueda qualitative and quantitative approach for antigen localization on thin sections. In: Bullock, G.R., Petrusz, P. (Eds.), Techniques in Immunocytochemistry, vol. 1. Academic Press, London 1982a, pp. 107e133. Roth, J. The protein A-gold (pAG) technique and qualitative and quantitative approach for antigen localization on thin sections. In: Bullock, G.R., Petrusz, P. (Eds.), Techniques in Immunocytochemistry, vol. 1. Academic Press, London 1982a, pp. 107e133.
Roth, J. The preparation of protein A-gold complexes with 3 nm and 15 nm gold particles and their use in labeling multiple antigens on ultrathin sections. Histochemical Jοurnal 1982b, 14: 791e801. Roth, J. The preparation of protein A-gold complexes with 3 nm and 15 nm gold particles and their use in labeling multiple antigens on ultrathin sections. Histochemical Journal 1982b, 14: 791e801.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20110100425A GR1009998B (en) | 2011-07-21 | 2011-07-21 | A sandwich immunoessay device using sheep anti-goat igg to immunologically detect goat's milk in sheep's milk |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20110100425A GR1009998B (en) | 2011-07-21 | 2011-07-21 | A sandwich immunoessay device using sheep anti-goat igg to immunologically detect goat's milk in sheep's milk |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR20110100425A GR20110100425A (en) | 2013-02-25 |
| GR1009998B true GR1009998B (en) | 2021-05-12 |
Family
ID=47747879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20110100425A GR1009998B (en) | 2011-07-21 | 2011-07-21 | A sandwich immunoessay device using sheep anti-goat igg to immunologically detect goat's milk in sheep's milk |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| GR (1) | GR1009998B (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR61204B (en) * | 1976-07-09 | 1978-10-06 | Agronomique Inst Nat Rech | Immunserum containing specific antibodies of proteins of milk and process controlling milk and cheese |
| ES2017031A6 (en) * | 1989-07-28 | 1990-12-16 | Univ Zaragoza | Rapid immunoenzymatic method for detecting the presence of milk of a different type in ewe's milk |
| ES2027899A6 (en) * | 1991-01-24 | 1992-06-16 | Univ Madrid Complutense | Detection of goat's milk in milk mixtures and in matured sheep's milk cheese utilising polyclonal antibodies and an indirect ELISA |
| ES2120888B1 (en) * | 1996-06-06 | 1999-05-16 | Univ Zaragoza | QUANTITATIVE IMMUNOENZYMATIC METHOD TO DETECT THE ADULTERATION OF SHEEP'S MILK WITH MILK OF ANOTHER SPECIES. |
-
2011
- 2011-07-21 GR GR20110100425A patent/GR1009998B/en active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR61204B (en) * | 1976-07-09 | 1978-10-06 | Agronomique Inst Nat Rech | Immunserum containing specific antibodies of proteins of milk and process controlling milk and cheese |
| ES2017031A6 (en) * | 1989-07-28 | 1990-12-16 | Univ Zaragoza | Rapid immunoenzymatic method for detecting the presence of milk of a different type in ewe's milk |
| ES2027899A6 (en) * | 1991-01-24 | 1992-06-16 | Univ Madrid Complutense | Detection of goat's milk in milk mixtures and in matured sheep's milk cheese utilising polyclonal antibodies and an indirect ELISA |
| ES2120888B1 (en) * | 1996-06-06 | 1999-05-16 | Univ Zaragoza | QUANTITATIVE IMMUNOENZYMATIC METHOD TO DETECT THE ADULTERATION OF SHEEP'S MILK WITH MILK OF ANOTHER SPECIES. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR20110100425A (en) | 2013-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9903865B2 (en) | Assay, immunochromatographic test strip, and assay reagent kit for measuring an analyte, using a hematocrit correction | |
| US10422790B2 (en) | Immunochromatographic test strip and detection method using immunochromatography for detecting target in red blood cell-containing sample | |
| US6686170B1 (en) | Assay devices with mobile control reagents | |
| WO2012043746A1 (en) | Test strip for immunochromatography, and process for production thereof | |
| KR102099370B1 (en) | Detection kit for influenza a virus | |
| US9726672B2 (en) | Anti-VLA-4 related assays | |
| US20230341398A1 (en) | SARS-CoV-2 DETECTION KIT AND SARS-CoV-2 DETECTION METHOD | |
| US11275085B2 (en) | Immunochromatographic test strip for detecting object in red blood cell-containing sample and immunochromatography using the test strip | |
| JP6399632B2 (en) | Immunochromatographic test strip for detecting an object in a red blood cell-containing sample, and immunochromatography using the test strip | |
| JP5955843B2 (en) | Conjugates used in immunoassay methods | |
| JP5723484B2 (en) | Immunochromatographic test strip and detection method using immunochromatography for detecting an object in a sample containing red blood cells | |
| CN115184620B (en) | Quantum dot fluorescence detection test strip and kit for PLA2R antibody and application of quantum dot fluorescence detection test strip and kit | |
| US20040014157A1 (en) | Use of dual conjugated labels in the elimination of serum interference in immunochromatographic assays | |
| JP2013205335A (en) | Immunochromatographic test tool using avidin-biotin linkage labeling reagent, and use thereof | |
| EP3306319B1 (en) | Test object detection method, and immunoassay instrument and monoclonal antibody for same | |
| GR1009998B (en) | A sandwich immunoessay device using sheep anti-goat igg to immunologically detect goat's milk in sheep's milk | |
| CA2005204C (en) | Solid phase immunoassay with lyophilised conjugate | |
| JP2020052028A (en) | Immunochromatography test piece | |
| TW202242410A (en) | Immunoassay of mycoplasma pneumoniae and immunoassay tool | |
| JP2020125994A (en) | Immunochromatographic specimen | |
| CN104651318A (en) | Method and reagent for detecting relevant fusion gene of prostate cancer | |
| JPS61225655A (en) | Measurement of isolated type thyroxin in blood |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PG | Patent granted |
Effective date: 20210614 |