GR1009872B - Πολλαπλη μεθοδος για τον ποσοτικο προσδιορισμο του μοτιβου εκφρασης των εναλλακτικων μεταγραφων του υποδοχεα των ανδρογονων σε ενα δειγμα - Google Patents
Πολλαπλη μεθοδος για τον ποσοτικο προσδιορισμο του μοτιβου εκφρασης των εναλλακτικων μεταγραφων του υποδοχεα των ανδρογονων σε ενα δειγμα Download PDFInfo
- Publication number
- GR1009872B GR1009872B GR20190100343A GR20190100343A GR1009872B GR 1009872 B GR1009872 B GR 1009872B GR 20190100343 A GR20190100343 A GR 20190100343A GR 20190100343 A GR20190100343 A GR 20190100343A GR 1009872 B GR1009872 B GR 1009872B
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- total
- primer
- sample
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 106
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 102000001307 androgen receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 226
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 47
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108091008721 AR-V7 Proteins 0.000 claims description 124
- 108091008715 AR-FL Proteins 0.000 claims description 114
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 95
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 59
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 58
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 57
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 57
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 20
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 19
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 9
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 8
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 claims description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 102100024375 Gamma-glutamylaminecyclotransferase Human genes 0.000 claims description 4
- 101710201613 Gamma-glutamylaminecyclotransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005266 circulating tumour cell Anatomy 0.000 claims 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 abstract description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 13
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 abstract description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003098 androgen Substances 0.000 abstract description 6
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 abstract description 6
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 abstract description 4
- 108091092259 cell-free RNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 23
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 22
- 101150029129 AR gene Proteins 0.000 description 18
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 7
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 7
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 6
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 6
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- -1 AR-567es Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GZOSMCIZMLWJML-VJLLXTKPSA-N abiraterone Chemical compound C([C@H]1[C@H]2[C@@H]([C@]3(CC[C@H](O)CC3=CC2)C)CC[C@@]11C)C=C1C1=CC=CN=C1 GZOSMCIZMLWJML-VJLLXTKPSA-N 0.000 description 5
- 229960000853 abiraterone Drugs 0.000 description 5
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 5
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 5
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 5
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 5
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 229960004671 enzalutamide Drugs 0.000 description 4
- WXCXUHSOUPDCQV-UHFFFAOYSA-N enzalutamide Chemical compound C1=C(F)C(C(=O)NC)=CC=C1N1C(C)(C)C(=O)N(C=2C=C(C(C#N)=CC=2)C(F)(F)F)C1=S WXCXUHSOUPDCQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical class C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 4
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 2
- 208000003837 Second Primary Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 206010068168 androgenetic alopecia Diseases 0.000 description 2
- 201000002996 androgenic alopecia Diseases 0.000 description 2
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N finasteride Chemical compound N([C@@H]1CC2)C(=O)C=C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)NC(C)(C)C)[C@@]2(C)CC1 DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N 0.000 description 2
- 229960004039 finasteride Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229940125697 hormonal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 210000002487 multivesicular body Anatomy 0.000 description 2
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 2
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000000058 Anaplasia Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010061819 Disease recurrence Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010050017 Lung cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027452 Metastases to bone Diseases 0.000 description 1
- 239000012661 PARP inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 239000012828 PI3K inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229940121906 Poly ADP ribose polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 101150049278 US20 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009167 androgen deprivation therapy Methods 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- BMQGVNUXMIRLCK-OAGWZNDDSA-N cabazitaxel Chemical compound O([C@H]1[C@@H]2[C@]3(OC(C)=O)CO[C@@H]3C[C@@H]([C@]2(C(=O)[C@H](OC)C2=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=3C=CC=CC=3)C[C@]1(O)C2(C)C)C)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 BMQGVNUXMIRLCK-OAGWZNDDSA-N 0.000 description 1
- 229960001573 cabazitaxel Drugs 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000009104 chemotherapy regimen Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000594 epithelial cell of lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004920 epithelial cell of skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical class [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 1
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- HCWPIIXVSYCSAN-OIOBTWANSA-N radium-223 Chemical compound [223Ra] HCWPIIXVSYCSAN-OIOBTWANSA-N 0.000 description 1
- 229960005562 radium-223 Drugs 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009094 second-line therapy Methods 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε μία μέθοδο για την ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό των εναλλακτικών μεταγραφών του υποδοχέα των ανδρογόνων (AR) σε ένα δείγμα όπως είναι ένα δείγμα RNA που απομονώνεται από κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (Circulating Tumor Cells, CTCs) ή που προέρχεται από εξωκυτταρικά κυστίδια πλάσματος ή από εξωκυττάριο RNA (cell free RNA) περιφερικού αίματος ασθενών με συμπαγείς όγκους. Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται περαιτέρω με μια μέθοδο ποσοτικού προσδιορισμού του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των εναλλακτικών μεταγραφών του υποδοχέα των ανδρογόνων με σκοπό την ταυτοποίηση ενός ασθενούς με βελτιωμένη ανταπόκριση στις νέες ορμονοθεραπείες όπως είναι ο αναστολέας της βιοσύνθεσης ανδρογόνων και / ή τα αντι-ανδρογονικά σκευάσματα ή η χημειοθεραπεία.
Description
Πολλαπλή μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό του μοτίβου έκφρασης των εναλλακτικών μεταγραφών του υποδοχέα των ανδρογύνων σε ένα δείγμα
ΤΕΧΝΙΚΟ ΠΕΔΙΟ
Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε μία μέθοδο για την ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό των εναλλακτικών μεταγράφώνωτου υποδοχέα των ανδρογόνων (AR) σε ένα δείγμα όπως είναι ένα δείγμα RNA που απομονώνεται από κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα (Circulating Tumor Cells, CTCs) ή που προέρχεται από εξωκυτταρικά κυστίδια πλάσματος ή από εξωκυττάριο RNA (cell free RNA, cfRNA) περιφερικού αίματος ασθενών με συμπαγείς όγκους. Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται περαιτέρω με μια μέθοδο ποσοτικού προσδιορισμού του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των εναλλακτικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων με σκοπό την ταυτοποίηση ενός ασθενούς με βελτιωμένη ανταπόκριση στις νέες ορμονοθεραπείες όπως είναι ο αναστολέας της βιοσύνθεσης ανδρογόνων και / ή τα αντι-ανδρογονικά σκευάσματα ή η χημειοθεραπεία.
ΥΠΟΒΑΘΡΟ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ
Ο καρκίνος του προστάτη (PCa) είναι η τρίτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες στις ΗΠΑ το 2017. Στις περισσότερες περιπτώσεις του υποτροπιάζοντος καρκίνου του προστάτη, μετά την αρχική ανταπόκριση στη θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, τα καρκινικά κύτταρα καθίστανται ανθεκτικά στον ευνουχισμό, δείχνοντας αυξανόμενες τιμές PSA, παρά τα χαμηλά επίπεδα τεστοστερόνης ορού (<50ng / dL). Οι ταξάνες είναι τα μοναδικά σχήματα χημειοθεραπείας που έχουν δείξει στατιστικά σημαντική βελτίωση στη διάμεση συνολική επιβίωση των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (mCRPC) όπου η δοκεταξάλη είναι η πρώτη ταξάνη που εγκρίθηκε από το 2004 (μελέτη ΤΑΧ327) και η καμπαζιταξάλη, είναι η δεύτερη ταξάνη από το 2010 εγκεκριμένη ως θεραπεία δεύτερης γραμμής μετά την αποτυχία της δοκεταξάλης (μελέτη TROPIC). Από το 2011, στην εποχή της θεραπείας του μεταστατικού καρκίνου του προστάτη, έχουν εγκριθεί περισσότερα θεραπευτικά σχήματα. Οι νέοι ορμονικοί παράγοντες, το ράδιο 223 και οι PARP αναστολείς είναι μερικές από αυτές τις επιλογές που βελτιώνουν την ολική επιβίωση, ενώ περισσότερα θεραπευτικά σχήματα μελετούνται σήμερα όπως οι ανοσοθεραπείες ή οι αναστολείς του ΡΙ3Κ, δίνοντας στους ογκολόγους πολλές επιλογές σε κάθε γραμμή θεραπείας ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Η μελλοντική ανάπτυξη φαρμάκων και η διαχείριση ασθενών με ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά αν υπάρχουν διαθέσιμοι βιοδείκτες που συνδέονται με συναφή αποτελέσματα. Αυτοί οι βιοδείκτες πρέπει να είναι εύκολα μετρήσιμοι και αναπαραγώγιμοι, να συνδέονται με τα σχετικά κλινικά αποτελέσματα και να παρουσιάζουν κλινική χρησιμότητα. Ο τομέας της ανάπτυξης βιοδεικτών στον ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη εξελίσσεται ταχέως και οι πρόσφατες δοκιμές ενσωματώνουν την ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων, της απεικόνισης και των βιολογικών δεικτών που αναφέρονται σε κάθε ασθενή.
Η σηματοδότηση του υποδοχέα των ανδρογόνων υποστηρίζει την ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και διάφοροι μηχανισμοί της επανενεργοποίησής τους έχουν περιγράφει (Hu et al. , Prostate, 2011<.>71 : 1656-67, De Bono et al., N. Engl. , 2011 , 364: 1995-2005, Tran et αϊ., Science 2009, 324, 787-790). To εναλλακτικό μάτισμα του AR-mRNA αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό μηχανισμό επανενεργοποίησής και εμπλέκεται στην εξέλιξη του ευνουχοάντοχου καρκίνου του προστάτη. Η αμπιρατερόνη (ΑΑ), ένας αναστολέας της βιοσύνθεσης των ανδρογόνων και η ενζαλουταμίδη, μια νέα γενιά αντι-ανδρογόνων που στοχεύει άμεσα τον υποδοχέα των ανδρογόνων σε τρία διαφορετικά εξωκυττάρια και ενδοκυττάρια στάδια της οδού σηματοδότησης του υποδοχέα των ανδρογόνων, μπορεί να παρεμποδίσει τους μηχανισμούς ενεργοποίησης του υποδοχέα των ανδρογόνων. Η περικοπή του υποδοχέα των ανδρογόνων στο καρβοξυτελικό άκρο οδηγεί στην έκφραση διαφορετικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων με διαφορετικές βιολογικές ιδιότητες. Τα εναλλακτικά μετάγραφα AR-V7 και AR-567es που δε διαθέτουν την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη, είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένα και συμβάλλουν στην επανενεργοποίηση της σηματοδότησης του υποδοχέα των ανδρογόνων σε όγκους ανθεκτικούς στον ευνουχισμό. Το εναλλακτικό μετάγραφο AR-V7 κωδικοποιείται από το μάτισμα των εξονίων 1/2/3/CE3 , ενώ το εναλλακτικό μετάγραφο AR-567es αποτελείται από το μάτισμα των εξονίων 1/2/3/4/8. Η ανίχνευση του mRNA των AR-567es και / ή AR-V7 σε οστικές μεταστάσεις ευνουχοάντοχου καρκίνου προστάτη έχει συσχετιστεί με υψηλό βαθμό πυρηνικής ανοσοχρώσης του υποδοχέα των ανδρογόνων, διαταραχή της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου και μικρή επιβίωση (Hornberg et al., PLoS One 2011, 6: e19059) . Στα CWR-22Rv1 κύτταρα μετά την αγωγή με ενζαλουταμίδη, η έκφραση των εναλλακτικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων μπορεί να προάγει την ανάπτυξη, ενώ η επιλεκτική αποσιώπηση της έκφρασης του AR-V7 αναστέλλει την καρκινική ανάπτυξη που είναι ανεξάρτητη από τα ανδρογόνα και αποκαθιστά την ανταπόκριση στα ανδρογόνα και τα αντιανδρογόνα. Ουσιαστικά, τα ενεργά εναλλακτικά μετάγραφα του υποδοχέα των ανδρογόνων μπορούν να συμβάλλουν στην ανάπτυξη ευνουχοάντοχου καρκίνου προστάτη μέσω του διμερισμού των εναλλακτικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων.
Η υγρή βιοψία, βασίζεται σε διαδοχικές και ελάχιστα επεμβατικές εξετάσεις αίματος και δίνει την δυνατότητα λήψης βιολογικών πληροφοριών του όγκου σε πραγματικό χρόνο, με τη χρήση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων, του κυκλοφορούντος καρκινικού DNA (ctDNA), των κυκλοφορούντων miRNAs και των εξωκυτταρικών κυστιδίων (EVs), όπως είναι τα εξωσώματα. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια που εκκρίνονται από τα ζωντανά κύτταρα στον εξωκυττάριο χώρο ή στην κυκλοφορία του αίματος περιέχουν νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες, λιπίδια και μεταβολίτες και έτσι αποτελούν μια πιθανή πηγή πολύτιμων βιολογικών δεικτών. Η καταμέτρηση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα, με τη χρήση του συστήματος CellSearch<®>(Menarini, Ιταλία), εξακολουθεί να είναι η μόνη δοκιμασία που έχει πάρει έγκριση από το Διεθνή Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων για ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, πέρα από την καταμέτρηση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων, ο μοριακός χαρακτηρισμός τους είναι πολλά υποσχόμενος, ώστε να κατανοηθεί η βιολογία του υπολειπόμενου ή υποτροπιάζοντος καρκίνου του προστάτη μετά τη χορήγηση τοπικής θεραπείας.
Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι ένα πάνελ βιοδεικτών που περιλαμβάνει τον αριθμό των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων και τα επίπεδα της LDH (Lactate Dehydrogenase) αποτελούν υποκατάστατο για την πρόβλεψη της επιβίωσης ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη σε κλινική δοκιμή χορήγησης αμπιρατερόνης μαζί με πρεδνιζόνη έναντι μόνο πρεδνιζόνης. Η ταυτοποίηση προβλεπτικών και προγνωστικών βιοδεικτών όπως το AR-V7 σε κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα αποτελεί μια ισχυρή νέα προσέγγιση στη θεραπευτική αντιμετώπιση ασθενών με καρκίνο του προστάτη καθώς υπάρχει η δυνατότητα να παρακολουθήσουμε την ανταπόκριση στη θεραπεία σε πραγματικό χρόνο και να καθορίσουμε την ιδανική επιλογή και την αλληλουχία του θεραπευτικού σχήματος. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια που εκκρίνονται από τα ζωντανά κύτταρα στον εξωκυπάριο χώρο ή στην κυκλοφορία του αίματος περιέχουν νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες, λιπίδια και μεταβολίτες και οπότε αποτελούν μια πιθανή πηγή πολύτιμων βιολογικών δεικτών.
Οι ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη που είναι θετικοί στο AR-V7 εάν υποβληθούν σε θεραπεία με ενζαλουταμίδη ή αμπιρατερόνη έχουν μηδενικά ποσοστά απόκρισης στο PSA, μικρότερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη του PSA, κλινική ή ακτινογραφική επιβίωση χωρίς εξέλιξη και συνολική επιβίωση σε σύγκριση με τους ασθενείς που είναι αρνητικοί στο AR-V7 και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυτούς τους δύο ορμονικούς παράγοντες. Οι ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη και θετικό AR-V7 στα κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα, παρουσιάζουν αντίσταση στις νέες ορμονοθεραπείες αμπιρατερόνη και ενζαλουταμίδη, αλλά έχουν καλή ανταπόκριση στις ταξάνες. Αυτό υποδηλώνει ότι ο έλεγχος της έκφρασης του AR-V7 στα κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα είναι συμφέρουσα επιλογή από πλευράς κόστους όσον αφορά την επιλογή της θεραπείας. Οι ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη και θετικό AR-V7 στα κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να επωφεληθούν από την πρώιμη χρήση της χημειοθεραπείας, καθώς η απόκριση της νόσου στη θεραπεία με ταξάνη είναι ανεξάρτητη από την κατάσταση του AR-V7 και είναι ευεργετική για ασθενείς με θετικό AR-V7 σε σύγκριση με τις νέες ορμονικές θεραπείες. Η απόκριση στις ταξάνες είναι ανεξάρτητη από την έκφραση του AR-V7 και έχει πρόσφατα αποδειχθεί απο μία άλλη ερευνητική ομάδα ότι οι ασθενείς παρότι είναι θετικοί στο AR-V7 ανταποκρίνονται στις νέες ορμονικές θεραπείες. Αυτή η ασυμφωνία στη βιβλιογραφία θα μπορούσε να οφείλεται κυρίως στις διαφορετικές μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των εναλλακτικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων στα κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα και στο γεγονός ότι λόγω του μικρού αριθμού των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων περιορίζεται η ποσότητα του δείγματος για ανάλυση ή πιθανώς το θετικό ποσοστό του AR-V7 σε κάθε δείγμα ή ο συνδυασμός όλων αυτών των παραγόντων.
Ωστόσο, μέχρι σήμερα, κανένα από τα δημοσιευθέντα έγγραφα δεν έχει δείξει την ποσοτικοποίηση του μοτίβου έκφρασης του υποδοχέα των ανδρογόνων με βάση τον απόλυτο αριθμό αντιγράφων προκειμένου να εξασφαλιστούν χρήσιμες κλινικές πληροφορίες σχετικά με τη θεραπευτική επιλογή. Ο απόλυτος αριθμός αντιγράφων του AR-V7 θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί ορισμένοι ασθενείς θετικοί στο AR-V7 ανταποκρίνονται στις νέες ορμονοθεραπείες. Μια τιμή κατώφλι του λόγου του απόλυτου αριθμού αντιγράφων του AR-V7 ως προς τον απόλυτο αριθμό αντιγράφων του AR και τον συνολικό αριθμό των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να διακρίνει τους ασθενείς που ανταποκρίνονται απο αυτούς που δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία.
US 2011/0110926 A1 αποκαλύπτει συνθέσεις και μεθόδους χρήσιμες για τη διάγνωση και πρόγνωση ασθενειών ή διαταραχών που σχετίζονται με ανδρογόνα σε ένα υποκείμενο. JPW020091 54259 αναφέρεται στον εκκινητή ο οποίος είναι χρήσιμος για την πρόβλεψη του θεραπευτικού αποτελέσματος της φιναστερίδης σε ένα άτομο που πάσχει από ανδρογενετική αλωπεκία ή την πρόβλεψη του θεραπευτικού αποτελέσματος της φιναστερίδης στην ανδρογενετική αλωπεκία. US201 7275673 (Α1 ) παρέχει μεθόδους και συνθέσεις οι οποίες μπορούν να αξιολογήσουν την πρόβλεψη επίδρασης των AR-V σε άνδρες με ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη που υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία με ταξάνη. US20 17285035 αποκαλύπτει μια μέθοδο πρόβλεψης de novo ανθεκτικότητας στοχευόμενης θεραπείας του ανδρογονικού υποδοχέα σε έναν ασθενή με καρκίνο του προστάτη που βασίζεται σε άμεση ανάλυση με τη χρήση χρώσης ανοσοφθορισμού και μορφολογικό χαρακτηρισμό των εμπύρηνων κυττάρων σε δείγμα αίματος.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ
Αυτή η εφαρμογή παρουσιάζει μια νέα πολλαπλή δοκιμασία RT-qPCR για την ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των εναλλακτικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων (AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total) σε δείγματα υγρής βιοψίας όπως τα κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα (CTCs), το εξωκυττάριο RNA και τα εξωκυτταρικά κυστίδια προερχόμενα από το πλάσμα σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη.
Η μέθοδος της παρούσας εφεύρεσης περιλαμβάνει τα εξής στάδια
i. υποβολή του δείγματος υγρής βιοψίας σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το RNA που υπάρχει στο δείγμα ως εκμαγείο για τη σύνθεση μιας αντίστοιχης αλληλουχίας cDNA,
ii. σχηματισμό ενός μείγματος αντίδρασης που περιλαμβάνει το δείγμα, αντιδραστήρια ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων, ένα ζεύγος εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητών για να δημιουργηθεί ένα αμπλικόνιο για κάθε cDNA μετάγραφο, ένας μεμονωμένος ανιχνευτής υδρόλυσης ή ζεύγος ανιχνευτών για την ανίχνευση ενός αμπλικονίου για κάθε στόχο cDNA μεταγράψου, όπου τα εν λόγω cDNA μετάγραφα είναι τα AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA.
Σύμφωνα με μία προτιμώμενη υλοποίηση, η μέθοδος περαιτέρω περιλαμβάνει το βήμα προσδιορισμού του απόλυτου αριθμού αντιγράφων του mRNA των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR- total σε ένα δείγμα.
ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΕΙΚΟΝΩΝ
Σχήμα 1: Α) Απεικονίζει τις θέσεις υβριδισμού των εκκινητών και τα ζεύγη ανιχνευτών υβριδισμού για κάθε mRNA μετάγραφο του υποδοχέα των ανδρογόνων. Οι αλληλουχίες των εμπρόσθιων και ανάστροφων εκκινητών και των ανιχνευτών υβριδισμού παρουσιάζονται και η συρραφή εξονίου-εξονίου απεικονίζεται με μια εμπρόσθια κάθετη γραμμή, Β) Απεικονίζει τις θέσεις υβριδισμού των εκκινητών και του ανιχνευτή υδρόλυσης για κάθε mRNA αλληλουχία μεταγραφής του υποδοχέα των ανδρογόνων. Οι αλληλουχίες των εμπρόσθιων και ανάστροφων εκκινητών και των ανιχνευτών υβριδισμού παρουσιάζονται και η συρραφή εξονίου-εξονίου απεικονίζεται με μια εμπρόσθια κάθετη γραμμή
Σχήμα 2: Αναλυτική επικύρωση της πολλαπλής RT-qPCR μεθοδολογίας των AR-FL, AR-V7, AR-567 και AR- total χρησιμοποιώντας ανιχνευτές υβριδισμού (εις τριπλούν) Α) Καμπύλες βαθμονόμησης RT-qPCR (αντίγραφα / μL) Β) γραμμικότητα, Γ) αναλυτική ειδικότητα.
Σχήμα 3: Αναλυτική επικύρωση της πολλαπλής RT-qPCR για τα AR-FL, AR-V7, AR-567 και AR-ολικό με τη χρήση ανιχνευτών υδρόλυσης (εις τριπλούν) Α) Καμπύλες βαθμονόμησης RT-qPCR (αντίγραφα / μL) Β) γραμμικότητα
Σχήμα 4: Απόλυτοι αριθμοί αντιγράφων/δείγμα των AR-FL, AR-V7, AR-567es, όπως υπολογίζεται από την πολλαπλή RT-qPCR μεθοδολογία σε εξωκυτταρικά κυστίδια προερχόμενα από πλάσμα υγιών αιμοδοτών (n=10) και ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (n=52).
Σχήμα 5: Σχετικά ποσοστά έκφρασης των εναλλακτικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων σε εξωκυτταρικά κυστίδια απομονωμένα από πλάσμα ασθενών.
ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ
ΟΡΙΣΜΟΙ
Οι όροι που χρησιμοποιούνται σε αυτήν την εφεύρεση γενικά αναμένεται να προσκολληθούν σε τυπικούς ορισμούς γενικά αποδεκτούς από αυτούς που έχουν συνηθισμένη εξειδίκευση στην τεχνική της μοριακής βιολογίας. Μερικοί όροι, όπως απαριθμούνται παρακάτω, έχουν περαιτέρω οριστεί εντός του πεδίου της παρούσας εφεύρεσης.
"Τουλάχιστον ένα" όπως χρησιμοποιείται εδώ σημαίνει ένα ή περισσότερα, δηλ. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 κλπ.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, "τα εναλλακτικά μετάγραφα του υποδοχέα ανδρογόνου (AR-Vs)" σημαίνουν εναλλακτικά μετάγραφα του υποδοχέα ανδρογόνου που κωδικοποιούν μια κομμένη πρωτεΐνη AR που στερείται την C-τερματική περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη αλλά διατηρεί την διενεργοποιημένη Ν-τερματική περιοχή (Dehm, SM , et al. (2008) Cancer Research 68, 5469-5477, Hu, R., et al (2009) Cancer Res 69, 16-22). Αν και αυτά τα AR-Vs αδυνατούν να συνδέσουν προσδέτη, είναι συστατικά ενεργά και ικανά να προάγουν την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, "αλληλουχία στόχος" σημαίνει μια αλληλουχία που ανιχνεύεται, ενισχύεται, ενισχύεται και ανιχνεύεται ή είναι συμπληρωματική των αλληλουχιών που παρέχονται εδώ ή αλλιώς έχει τουλάχιστον ένα ιντρόνιο στην φυσική του κατάσταση, δηλ. ως γενωμικό DNA ή επιπλέον χρωμοσωμικό DNA. Ενώ ο όρος στόχος αλληλουχία αναφέρεται μερικές φορές ως μονόκλωνο, αυτοί που διαθέτουν εξειδίκευση θα αναγνωρίσουν ότι η αλληλουχία στόχος μπορεί να είναι δίκλωνη. Συγκεκριμένα, σύμφωνα με αυτό το κείμενο, η "αλληλουχία στόχος" αναφέρεται στο τμήμα της αλληλουχίας των AR-total, AR-567es, AR-V7 και AR-FL, το οποίο ενισχύεται όταν ένα ζεύγος εκκινητών συνδέεται με την επιθυμητή αλληλουχία. Ειδικότερα, η " αλληλουχία του AR-ολικό" αναφέρεται στο τμήμα της αλληλουχίας mRNA του AR- total, και / ή "η αλληλουχία AR-FL" αναφέρεται στο τμήμα της mRNA αλληλουχίας του AR-FL και / ή "AR- V7 αλληλουχία "αναφέρεται στο τμήμα της mRNA αλληλουχίας του AR-V7 και / ή" αλληλουχία AR-567es "αναφέρεται στο τμήμα της mRNA αλληλουχίας του AR-567es.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος "εκκινητής" αναφέρεται σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο το οποίο, παραγόμενο συνθετικά, είναι ικανό να δρα ως σημείο έναρξης της σύνθεσης νουκλεϊκού οξέος όταν τοποθετείται κάτω από συνθήκες στις οποίες η σύνθεση ενός προϊόντος επέκτασης εκκινητή που είναι συμπληρωματικό σε ένα κλώνο νουκλεϊνικού οξέος επάγεται, δηλαδή παρουσία νουκλεοτιδίων και ενός παράγοντα πολυμερισμού όπως είναι η DNA πολυμεράση, η αντίστροφη μεταγραφάση ή τα παρόμοια και σε κατάλληλη θερμοκρασία και pH. Ο εκκινητής είναι κατά προτίμηση μονόκλωνος για μέγιστη απόδοση, αλλά μπορεί εναλλακτικά να είναι δίκλωνος. Εάν είναι διπλής έλικας, ο εκκινητής πρώτα υποβάλλεται σε επεξεργασία για να διαχωριστούν οι κλώνοι πριν χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή προϊόντων επέκτασης. Ο εκκινητής πρέπει να είναι επαρκής για να προκαλέσει την σύνθεση των προϊόντων επέκτασης παρουσία των παραγόντων πολυμερισμού. Τα ακριβή μήκη των εκκινητών θα εξαρτηθούν από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της θερμοκρασίας και της πηγής του εκκινητή. Για παράδειγμα, ανάλογα με την πολυπλοκότητα της αλληλουχίας στόχου, ένας εκκινητής τυπικά περιέχει 15 έως 25 ή περισσότερα νουκλεοτίδια, αν και μπορεί να περιέχει λιγότερα νουκλεοτίδια. Τα μικρά μόρια εκκινητών γενικά απαιτούν ψυχρότερες θερμοκρασίες για να σχηματίσουν αρκετά σταθερά υβριδικά σύμπλοκα με ένα εκμαγείο. Συγκεκριμένα, οι εκκινητές, οι οποίοι χρησιμοποιούνται εδώ, είναι κατά προτίμηση σχεδιασμένοι κατά τρόπον ώστε να αποφεύγεται η ενίσχυση γενωμικού DNA ή cDNA προκειμένου να αποφευχθεί η μη ειδική ενίσχυση του μολυσματικού γενωμικού DNA στο δείγμα.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος "ανιχνευτής" αναφέρεται σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο ικανό να συνδέεται με ένα νουκλεϊκό οξύ της συμπληρωματικής αλληλουχίας μέσω ενός ή περισσοτέρων τύπων χημικών δεσμών, συνήθως μέσω συμπληρωματικού συνδυασμού βάσεων συνήθως μέσω σχηματισμού δεσμού υδρογόνου. Ένας ανιχνευτής μπορεί να είναι μονόκλωνος ή εν μέρει μόνο και μερικώς δίκλωνος. Η διάταξη του ανιχνευτή υπαγορεύεται από τη δομή, τη σύνθεση και τις ιδιότητες της αλληλουχίας στόχου. Οι ανιχνευτές μπορεί να είναι άμεσα επισημασμένοι ή έμμεσα επισημασμένοι όπως με βιοτίνη στην οποία μπορεί αργότερα να συνδεθεί ένα σύμπλεγμα στρεπταβιδίνης.
Το στάδιο "αντίστροφης μεταγραφής" στη μέθοδο της εφεύρεσης συμπεριλαμβάνεται προκειμένου να μετατραπεί η αλληλουχία RNA σε cDNA. Αυτή η διαδικασία, που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφή, συμβαίνει κάτω από την κατεύθυνση ενός εξαρτώμενου από το RNA ενζύμου DNA πολυμεράσης που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση. Η διαδικασία περαιτέρω απαιτεί ρυθμιστικά διαλύματα και αντιδραστήρια, όπως dNTPs, για την αντίστροφη μεταγραφή. Τα κιτ αντίστροφης μεταγραφής είναι εμπορικά διαθέσιμα και διαθέτουν ικανότητα για να εκτελέσουν αυτή τη διαδικασία. Τα αντιδραστήρια ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην εφεύρεση περιλαμβάνουν αντιδραστήρια τα οποία είναι γνωστά και μπορεί να περιλαμβάνουν, αλλά δεν περιορίζονται σε αυτά, ένα ένζυμο με δραστικότητα πολυμεράσης π.χ. θερμοσταθερές πολυμεράσες όπως η Taqπολυμεράση (και, εάν είναι αναγκαίο, δραστικότητα αντίστροφης μεταγραφής, π.χ. όταν χρησιμοποιείται το mRNA), συμπαράγοντες ενζύμων όπως το μαγνήσιο ή μαγγάνιο, άλατα και τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs).
Ο όρος "συνθήκες ενίσχυσης" ορίζεται γενικά ως συνθήκες, οι οποίες προάγουν την υβριδοποίηση αλληλουχιών εκκινητή σε αλληλουχία στόχο και επακόλουθη επέκταση της αλληλουχίας εκκινητή. Είναι γνωστό ότι αυτή η υβριδοποίηση εξαρτάται από αρκετές παραμέτρους, όπως θερμοκρασία, ιοντική ισχύ, μήκος αλληλουχίας, συμπληρωματικότητα και περιεχόμενο G: C των αλληλουχιών. Για παράδειγμα, η μείωση της θερμοκρασίας στο περιβάλλον των συμπληρωματικών αλληλουχιών νουκλεϊνικών οξέων προωθεί την υβριδοποίηση. Για οποιοδήποτε δεδομένο σύνολο αλληλουχιών, η θερμοκρασία τήγματος ή το Tm μπορεί να εκτιμηθεί με οποιαδήποτε από τις γνωστές μεθόδους. Τυπικά, οι διαγνωστικές εφαρμογές χρησιμοποιούν θερμοκρασίες υβριδοποίησης, οι οποίες είναι κοντά (δηλαδή εντός των 10 ° C) της θερμοκρασίας τήγματος. Η ιονική ισχύς ή η συγκέντρωση "άλατος" επηρεάζει επίσης τη θερμοκρασία τήγματος, αφού τα μικρά κατιόντα τείνουν να σταθεροποιούν το σχηματισμό των διπλών με την αναίρεση του αρνητικού φορτίου στη ραχοκοκαλιά του φωσφοδιεστέρα. Οι τυπικές συγκεντρώσεις άλατος εξαρτώνται από τη φύση και το σθένος του κατιόντος κάτι που είναι κατανοητό από αυτούς που διαθέτουν εξειδίκευση. Ομοίως, η υψηλή περιεκτικότητα σε G: C και το αυξημένο μήκος αλληλουχίας είναι επίσης γνωστό ότι σταθεροποιούν τον σχηματισμό διπλής όψης επειδή οι συνδυασμοί G: C περιλαμβάνουν 3 δεσμούς υδρογόνου όπου τα ζεύγη Α: Τ έχουν μόλις δύο και επειδή οι μακρύτερες αλληλουχίες έχουν περισσότερους δεσμούς υδρογόνου που συγκρατούν τις αλληλουχίες μαζί. Έτσι, ένα υψηλό περιεχόμενο G: C και μεγαλύτερα μήκη αλληλουχίας επηρεάζουν τις συνθήκες υβριδισμού αυξάνοντας τη θερμοκρασία τήξης. Μόλις επιλεγούν αλληλουχίες για μια δεδομένη διαγνωστική εφαρμογή, η περιεκτικότητα και το μήκος G: C θα είναι γνωστές και μπορούν να ληφθούν υπόψη για τον ακριβή προσδιορισμό των συνθηκών υβριδισμού που θα συμπεριληφθούν. Δεδομένου ότι η ιονική ισχύς συνήθως βελτιστοποιείται για την καλύτερη απόδοση της ενζυματικής δραστηριότητας, η μόνη παράμετρος που μένει να μεταβληθεί είναι η θερμοκρασία. Γενικά, η θερμοκρασία υβριδοποίησης επιλέγεται πλησίον ή στο Tm των εκκινητών ή ανιχνευτών. Έτσι, η λήψη κατάλληλων συνθηκών υβριδισμού για έναν συγκεκριμένο εκκινητή, ανιχνευτή, ή εκκινητή εξαρτάται από τη συνηθισμένη ικανότητα κάποιου που ασκεί την τεχνική αυτή. Το προϊόν ενίσχυσης που παράγεται ως ανωτέρω μπορεί να ανιχνευθεί κατά τη διάρκεια ή μετά την ενίσχυση της αλληλουχίας στόχου χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε κατάλληλη μέθοδο και έναν ανιχνευτή που χαρακτηρίζεται με περισσότερες λεπτομέρειες παρακάτω.
Οι όροι "πολυνουκλεοτίδιο" και "ολιγονουκλεοτίδιο" χρησιμοποιούνται εναλλακτικά. Το "ολιγονουκλεοτίδιο" είναι ένας όρος που χρησιμοποιείται μερικές φορές για να περιγράφει ένα μικρότερο πολυνουκλεοτίδιο.
Οι όροι "υβριδοποιημένος" και "υβριδισμός" αναφέρονται στις αλληλεπιδράσεις ζεύγους βάσης μεταξύ δύο νουκλεϊνικών οξέων που έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό διπλής όψης. Δεν απαιτείται από τα δύο νουκλεϊκά οξέα να έχουν 100% συμπληρωματικότητα καθ 'όλο το μήκος τους για να επιτευχθεί υβριδισμός.
Οι "βιοδείκτες ή βιολογικοί δείκτες καρκίνου" μπορούν να είναι DNA, mRNA, πρωτεΐνες, μεταβολίτες ή διεργασίες όπως η απόπτωση, η αγγειογένεση ή ο πολλαπλασιασμός. Οι δείκτες παράγονται είτε από τον ίδιο τον όγκο είτε από άλλους ιστούς, σε απόκριση της παρουσίας καρκίνου ή άλλων συναφών συνθηκών, όπως φλεγμονή. Τέτοιοι βιοδείκτες μπορούν να βρεθούν σε μια ποικιλία υγρών, ιστών και κυτταρικών σειρών. Ο ορισμός του βιολογικού δείκτη του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (NCI) είναι: 'Ένα βιολογικό μόριο που βρίσκεται στο αίμα, άλλα σωματικά υγρά ή ιστούς, το οποίο είναι αποτέλεσμα μιας φυσιολογικής ή μη φυσιολογικής διαδικασίας ή μιας κατάστασης ή ασθένειας. Ένας βιοδείκτης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διαπιστωθεί πόσο καλά το σώμα ανταποκρίνεται σε μια θεραπεία για μια ασθένεια ή μια κατάσταση. Επίσης ονομάζεται μοριακός δείκτης και μόριο υπογραφής. Φυσικά, ένας καρκινικός βιοδείκτης αναφέρεται σε οποιοδήποτε βιοδείκτη που ταιριάζει στον προαναφερθέντα ορισμό αλλά μόνο για τον καρκίνο και καμία άλλη ασθένεια. Ο βιοδείκτης θα πρέπει να είναι σε θέση να μετράται εύκολα, αξιόπιστα και οικονομικά με τη χρήση μιας ανάλυσης με υψηλή αναλυτική ευαισθησία και ειδικότητα. Ένας από τους πιο γνωστούς βιολογικούς δείκτες καρκίνου είναι το ειδικό προστατικό αντιγόνο ή το PSA και τα αυξημένα επίπεδα PSA στους άντρες τείνουν να σηματοδοτούν τον καρκίνο του προστάτη. Πράγματι, οι καρκινικοί βιοδείκτες είναι κάτι περισσότερο από ένα σήμα της νόσου και έχουν πολλούς ρόλους στον αγώνα έναντι του καρκίνου. Ο όρος «βιοδείκτης» όπως χρησιμοποιείται εδώ σημαίνει οποιοδήποτε από τους δείκτες AR- FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό.
Ο όρος "εξωτερικό πρότυπο" όπως χρησιμοποιείται στο παρόν σημαίνει ένα συνθετικό πολυνουκλεοτίδιο που αντιπροσωπεύει ένα ειδικό cDNA μετάγραφο σε γνωστή ποσότητα(ες) ή συγκέντρωση(εις) που ελέγχονται ξεχωριστά από το δείγμα δοκιμής, δηλαδή με παρεμβολή ή παρέκταση σε μία πρότυπη καμπύλη.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, το "κατώφλι κύκλου" (Cq) αναφέρεται σε τιμές κύκλου ποσοτικοποίησης που υπολογίζονται από το αρχείο μετρήσεων φθορισμού της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου. To "Cq" αναφέρεται στον αριθμό των κύκλων που απαιτούνται για το σήμα PCR να φτάσει στο σημαντικό όριο. Η υπολογιζόμενη τιμή Cq είναι ανάλογη του λογαρίθμου του αριθμού των αντιγράφων στόχων που υπάρχουν στο δείγμα. Η ποσοτικοποίηση του Cq πραγματοποιείται με οποιαδήποτε μέθοδο για την ποσοτική ενίσχυση PCR σε πραγματικό χρόνο όπως περιγράφεται [Bustin SA. Απόλυτη ποσοτικοποίηση του mRNA χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο. J Mol Endocrinol 2000, 25: 169-193].
Η "αναπαραγωγιμότητα" είναι η μέτρηση του βαθμού επαναληψιμότητας μιας αναλυτικής μεθόδου υπό κανονική λειτουργία και εκφράζεται κανονικά ως το ποσοστό σχετικής τυπικής απόκλισης για στατιστικά σημαντικό αριθμό δειγμάτων. Τα δύο πιο κοινά μέτρα ακρίβειας είναι η "επαναληψιμότητα" και η "αναπαραγωγικότητα". Αυτές είναι η έκφραση δύο ακραίων μετρήσεων ακρίβειας που μπορούν να ληφθούν. Η επαναληψιμότητα (η μικρότερη αναμενόμενη ακρίβεια) θα δώσει μια ιδέα για το είδος της μεταβλητότητας που αναμένεται όταν μια μέθοδος εκτελείται από έναν μόνο αναλυτή σε ένα κομμάτι εξοπλισμού σε σύντομο χρονικό διάστημα. Εάν ένα δείγμα αναλύεται από ένα αριθμό εργαστηρίων για συγκριτικούς σκοπούς, τότε ένα πιο σημαντικό μέτρο ακρίβειας για χρήση είναι η αναπαραγωγιμότητα (αυτό είναι το μεγαλύτερο μέτρο ακρίβειας).
Το "όριο ανίχνευσης" (Limit of Detection, LoD) είναι η χαμηλότερη συγκέντρωση βιολογικού δείκτη που πιθανόν να διακριθεί αξιόπιστα από το όριο του τυφλού (Limit of Blank, LoB) και στην οποία είναι εφικτή η ανίχνευση. To LoD προσδιορίζεται με τη χρησιμοποίηση τόσο των μετρούμενων επαναλήψεων LoB όσο και των δοκιμασιών ενός δείγματος που είναι γνωστό ότι περιέχει χαμηλή συγκέντρωση βιοδείκτη.
Το "όριο ποσοτικοποίησης" (Limit of Quantification, LoQ) αναφέρεται στη χαμηλότερη συγκέντρωση στην οποία ο βιοδείκτης μπορεί όχι μόνο να ανιχνευθεί αξιόπιστα, αλλά κατά την οποία πληρούνται ορισμένοι προκαθορισμένοι στόχοι για συστηματικό σφάλμα και ανακρίβεια. To LoQ ορίζεται ως τριπλάσιο του LoD.
"Γ ραμμικότητα" είναι η ικανότητα της μεθόδου να προκαλεί αποτελέσματα δοκιμών τα οποία είναι άμεσα ανάλογα προς τη συγκέντρωση βιοδεικτών εντός μιας δεδομένης περιοχής. Η γραμμικότητα αναφέρεται γενικά ως η διακύμανση της κλίσης της γραμμής παλινδρόμησης. Παραδοσιακά η γραμμικότητα θεωρήθηκε ως επιθυμητή ιδιότητα των μεθόδων, καθώς μόνο γραμμικές καμπύλες θα μπορούσαν εύκολα να ερμηνευτούν. Με την άμεση διαθεσιμότητα υπολογιστικής ισχύος αυτό δεν έχει πλέον μεγάλη σημασία και οι μη γραμμικές βαθμονομήσεις μπορούν να αντιμετωπιστούν εύκολα.
Το "ψευδώς αρνητικό" αναφέρεται σε αποτέλεσμα δοκιμής που υποδεικνύει ότι το δείγμα, το οποίο είναι θετικό στον εν λόγω βιοδείκτη, προσδιορίζεται ως αρνητικό από την μέθοδο. Στο πλαίσιο αυτής της εφαρμογής, το "ψευδώς αρνητικό" αναφέρεται σε αποτέλεσμα δοκιμής που είναι λανθασμένο επειδή η μέθοδος απέτυχε να προσδιορίσει την έκφραση οποιοσδήποτε από τους βιοδείκτες AR-V7, AR-567es, AR-FL και AR-ολικό σε ένα δείγμα από ένα υποκείμενο.
"Ψευδώς θετικά" αναφέρεται σε ένα αποτέλεσμα δοκιμής που υποδεικνύει ένα δείγμα, το οποίο είναι αρνητικό στον εν λόγω βιοδείκτη, προσδιορίζεται ως θετικό από την μέθοδο. Στο πλαίσιο αυτής της εφαρμογής, το "ψευδώς θετικό" αναφέρεται σε ένα αποτέλεσμα δοκιμής που είναι λανθασμένο επειδή η μέθοδος υποδεικνύει την έκφραση οποιοσδήποτε από τους δείκτες AR-V7, AR-567es, AR-FL και AR- total σε ένα δείγμα, ενώ δεν υπάρχει.
"Υγιής" αναφέρεται σε ένα άτομο που έχει καλή υγεία. Ένα τέτοιο άτομο καταδεικνύει την απουσία οποιοσδήποτε κακοήθους ή μη κακοήθους νόσου. Στο πλαίσιο αυτής της εφαρμογής, ένα "υγιές άτομο" είναι μόνο υγιές στο ότι έχει απουσία κακοήθους ή μη κακοήθους νόσου.
Ένα "κακοήθες" νεόπλασμα είναι γενικά ελάχιστα διαφοροποιημένο (αναπλάσια), έχει χαρακτηριστικά ταχείας ανάπτυξης συνοδευόμενη από προοδευτική διήθηση, εισβολή και καταστροφή του περιβάλλοντος ιστού. Επιπλέον, ένα κακοήθες νεόπλασμα έχει την ικανότητα να δημιουργήσει μεταστάσεις σε απομακρυσμένες περιοχές. Ο όρος «μετάσταση» αναφέρεται στην εξάπλωση ή τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων από τον πρωτογενή (αρχικό) όγκο σε άλλο όργανο ή ιστό και τυπικά αναγνωρίζεται από την παρουσία ενός «δευτερογενούς όγκου» ή μιας «δευτερογενούς κυτταρικής μάζας» του ιστικού τύπου του αρχικού (αρχικού) όγκου και όχι εκείνου του οργάνου ή του ιστού στον οποίο βρίσκεται ο δευτερογενής (μεταστατικός) όγκος. Για παράδειγμα, ένα καρκίνωμα του πνεύμονα που έχει μεταναστεύσει στο οστό λέγεται ότι είναι μεταστατικός καρκίνος του πνεύμονα και αποτελείται από καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από επιθηλιακά πνευμονικά κύτταρα που αναπτύσσονται σε οστικό ιστό.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, η έκφραση «κλινική έκβαση» ή «έκβαση» προορίζεται να εκφράζεται με όρους διαφορετικών τελικών σημείων όπως η επιβίωση χωρίς νόσο (DFS), η επιβίωση χωρίς υποτροπή (RFS), η χρονική περίοδος επανάληψης (TR) , η επιβίωση ειδική του καρκίνου (CSS) ή ολική επιβίωση (OS), σύμφωνα με τις συστάσεις των Punt CJ, Buyse Μ, Kohne CH, Hohenberger P, Labianca R, Schmoll HJ, et al. Τελικά σημεία στις δοκιμές επικουρικής θεραπείας: Συστηματική ανασκόπηση της βιβλιογραφίας στον καρκίνο του παχέος εντέρου και προτεινόμενοι ορισμοί για τις μελλοντικές δοκιμές. J. Natl. Cancer Inst. 2007<.>13: 998-1003.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, η έκφραση "επιβίωση χωρίς υποτροπή" ή "επιβίωση χωρίς επανεμφάνιση" (RFS) ορίζεται ως ο χρόνος σε οποιοδήποτε γεγονός, ανεξάρτητα από την αιτία αυτού του γεγονότος, εκτός από οποιονδήποτε δεύτερο κύριο καρκίνο. Η επανεμφάνιση ή θάνατος από τον ίδιο καρκίνο και όλοι οι θάνατοι που σχετίζονται με τη θεραπεία ή θάνατοι από άλλες αιτίες είναι γεγονότα. Δεύτερο πρωτογενές από τους ίδιους καρκίνους και άλλους πρωτοπαθείς καρκίνους αγνοείται και η απώλεια της παρακολούθησης λογοκρίνεται.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, η έκφραση "επιβίωση χωρίς νόσο" (DFS) ορίζεται ως ο χρόνος σε οποιοδήποτε γεγονός, ανεξάρτητα από την αιτία αυτού του γεγονότος. Περιλαμβάνονται όλα τα γεγονότα, εκτός από την απώλεια παρακολούθησης η οποία λογοκρίνεται.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, η "Συνολική Επιβίωση" (OS) ορίζεται ως ο χρόνος μέχρι τον θάνατο, ανεξάρτητα από την αιτία, είτε ο θάνατος οφειλόταν στον καρκίνο είτε όχι. Η τοπική υποτροπή, οι απομακρυσμένες μεταστάσεις, οι δεύτεροι πρωτογενείς καρκίνοι και οι δεύτεροι άλλοι πρωτογενείς καρκίνοι αγνοούνται. Η απώλεια της παρακολούθησης λογοκρίνεται.
Το "υποκείμενο" όπως χρησιμοποιείται στο παρόν περιλαμβάνει ανθρώπους, μη ανθρώπινα πρωτεύοντα όπως χιμπαντζήδες και άλλους πιθήκους και είδη πιθήκων, ζώα εκμετάλλευσης όπως βοοειδή, πρόβατα, χοίρους, κατσίκες και άλογα, κατοικίδια θηλαστικά όπως σκύλους και γάτες, εργαστηριακά ζώα συμπεριλαμβανομένων τρωκτικών, , αρουραίοι και ινδικά χοιρίδια και τα παρόμοια. Ο όρος δεν δηλώνει μια συγκεκριμένη ηλικία ή φύλο. Έτσι, τα ενήλικα και τα νεογέννητα άτομα, καθώς και τα έμβρυα, άνδρες ή γυναίκες, καλύπτονται από τον όρο. Σε προτιμώμενες εφαρμογές, το υποκείμενο είναι θηλαστικό, συμπεριλαμβανομένων ανθρώπων και μη ανθρώπινων θηλαστικών. Στην πλέον προτιμώμενη προσωποποίηση, το άτομο είναι άνθρωπος.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ένα «βιολογικό δείγμα» περιλαμβάνει μια ποικιλία τύπων δειγμάτων που λαμβάνονται από οποιοδήποτε άτομο που έχει ή δεν έχει κακοήθες νεόπλασμα. Ένα τυπικό υποκείμενο είναι ένας άνθρωπος. Για παράδειγμα, τα βιολογικά δείγματα περιλαμβάνουν δείγματα που λαμβάνονται από ένα ιστό ή υγρό αίματος που συλλέγονται από ένα άτομο που υπάρχει υποψία ότι έχει κακοήθες νεόπλασμα.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTC) είναι κύτταρα που έχουν εισχωρήσει στο αγγειακό σύστημα από έναν πρωτογενή όγκο και κυκλοφορούν στην κυκλοφορία του αίματος. Τα CTC αποτελούν επομένως σπόρους για την επακόλουθη δημιουργία επιπρόσθετων όγκων (μετάσταση) σε ζωτικά απομακρυσμένα όργανα, ενεργοποιώντας έναν μηχανισμό που είναι υπεύθυνος για τη συντριπτική πλειοψηφία των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος εξωσώματα είναι εξωκυτταρικά κυστίδια που απελευθερώνονται από τα κύτταρα κατά τη σύντηξη ενός ενδιάμεσου ενδοκυτταρικού διαμερίσματος, του πολυκυστιδιακού σώματος (MVB), με τη μεμβράνη πλάσματος. Αυτό απελευθερώνει ενδοκυτταρικά κυστίδια (ILVs) στο εξωκυττάριο περιβάλλον και τα κυστίδια που απελευθερώνονται είναι αυτά που γνωρίζουμε ως εξωσώματα. Υπάρχουν επίσης και άλλοι τύποι μικροκυστιδίων, συμπεριλαμβανομένων των αποπτωτικών σωμάτων και των εξωσωμάτων, τα οποία προέρχονται από κύτταρα που υφίστανται απόπτωση και απόρριψη μεμβράνης πλάσματος, αντίστοιχα. Αν και τα αποπτωτικά σώματα και τα εξωσώματα έχουν περίπου το ίδιο μέγεθος (τυπικά 40-100 nm) και όλα περιέχουν επίσης «gulps» του κυτοσολίου, είναι διαφορετικά είδη κυστιδίων και οι διαφορές μεταξύ τους είναι πρωταρχικής σημασίας αλλά πολύ συχνά παραβλέπονται.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μια βελτιωμένη μέθοδο για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των εναλλακτικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων σε ένα δείγμα, όπως είναι ένα απομονωμένο δείγμα RNA από κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα ή δείγμα εξωκυττάριου RNA απομονωμένο από πλάσμα ή εξωκυτταρικά κυστίδια προερχόμενα από πλάσμα περιφερικού αίματος ασθενών με συμπαγείς όγκους. Το αντικείμενο επιτυγχάνεται πλήρως ή μερικώς με μία μέθοδο σύμφωνα με την αξίωση 1. Οι ενσωματώσεις και περαιτέρω λεπτομέρειες της εφεύρεσης ορίζονται από τις προσαρτημένες εξαρτημένες αξιώσεις και τις εικόνες.
Συγκεκριμένα, η εφεύρεση παρέχει μια ίη vitro μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των mRNA εναλλακτικών μεταγράφουν του υποδοχέα των ανδρογόνων σε ένα βιολογικό δείγμα, όπου η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει τα στάδια:
i. υποβολή του δείγματος υγρής βιοψίας σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το RNA που υπάρχει στο δείγμα ως εκμαγείο για τη σύνθεση μιας αντίστοιχης αλληλουχίας cDNA,
ii. σχηματισμό ενός μείγματος αντίδρασης που περιλαμβάνει το δείγμα, αντιδραστήρια ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων, ένα ζεύγος εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητών για να δημιουργηθεί ένα αμπλικόνιο για κάθε cDNA μετάγραφο, ένας μεμονωμένος ανιχνευτής υδρόλυσης ή ζεύγος ανιχνευτών για την ανίχνευση ενός αμπλικονίου για κάθε στόχο cDNA μεταγράψου, όπου τα εν λόγω cDNA μετάγραφα είναι τα AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA
Σύμφωνα με μια προτιμώμενη ενσωμάτωση, η μέθοδος περαιτέρω περιλαμβάνει το στάδιο προσδιορισμού του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA σε ένα δείγμα.
Το βιολογικό δείγμα μπορεί για παράδειγμα να προέρχεται από αίμα, CTC, πλάσμα / ορό, εξωσώματα, φρέσκο κατεψυγμένο ιστό, μυελό των οστών και ούρα. Κατά προτίμηση, το βιολογικό δείγμα είναι δείγμα υγρής βιοψίας.
FI μέθοδος βασίζεται στον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA σε ένα δείγμα. Αυτή η δοκιμασία μπορεί να περιλαμβάνει μια μελλοντική ανάλυση της mRNA έκφρασης των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total, όπως ένα απομονωμένο δείγμα RNA από κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα (CTCs) RNA, EVs και εξωσώματα ασθενών με καρκίνο.
Το στάδιο απομόνωσης των CTCs θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί με μεθόδους γνωστές στο εξειδικευμένο άτομο, όπως π.χ. διαφορετική μικρορευστότητα και διήθηση με συσκευές μεγέθους, φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας, θετική και αρνητική ανοσομαγνητική επιλογή, συστήματα ανάλυσης μεμονωμένων κυττάρων ή συστήματα απομόνωσης CTC in vivo όπως το σύστημα συλλογής κυττάρων (Gilupi, GmbH) ή συστήματα λευκαφαίρεσης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η απομόνωση των CTC δεν περιορίζεται στις αναφερόμενες μεθόδους
Συγκεκριμένα, η αλληλουχία στη μέθοδο που περιγράφεται εδώ είναι οποιαδήποτε από τα mRNA μεταγραφήματα AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total του γονιδίου AR, τα οποία μπορούν να ανιχνευθούν μετά από αντίστροφη μεταγραφή του RNA που υπάρχει στο δείγμα χρησιμοποιώντας, για παράδειγμα, ένα εμπορικά διαθέσιμο cDNA κιτ. Πιο συγκεκριμένα, το "ζεύγος εκκινητών", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται ειδικά σε μία από τις αλληλουχίες μεταγραφή ματος AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total του γονιδίου AR. Έτσι, το "ζεύγος εκκινητών AR-FL", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται ειδικά με την αλληλουχία μεταγραφής AR-FL-mRNA του γονιδίου AR. Το "ζεύγος εκκινητών AR-V7", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται ειδικά με αλληλουχία μεταγραφής AR-V7-mRNA του γονιδίου AR. Το "ζεύγος εκκινητών AR-567es", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται ειδικά με την αλληλουχία μεταγραφής AR-567es-mRNA του γονιδίου AR. Το "AR-ολικό ζεύγος εκκινητών", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται ειδικά με την αλληλουχία μεταγραφής AR-total-mRNA του γονιδίου AR.
Η ποσοτικοποίηση των mRNA- μεταγράφουν των εναλλακτικών μεταγράφων του AR μπορεί να χρησιμοποιηθεί, για παράδειγμα, σε οποιοδήποτε τύπο κακοήθους νεοπλασματικής νόσου προκειμένου να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση του γονιδίου AR. Κατά προτίμηση, η κακοήθης νεοπλασματική ασθένεια είναι ο καρκίνος, όπως ο καρκίνος του μαστού ή ο καρκίνος του προστάτη.
Η μέθοδος σύμφωνα με την εφεύρεση ενισχύει και ανιχνεύει ξεχωριστά κάθε mRNA μετάγραφο AR, αποφεύγοντας την ενίσχυση γενωμικού DNA. Η μέθοδος περιλαμβάνει μια πολλαπλή RT-qPCR, χρησιμοποιώντας τέσσερα ζεύγη εκκινητών και ανιχνευτές υδρόλυσης ή ζεύγη ανιχνευτών υβριδισμού. Τόσο ζεύγος εκκινητών όσο και το ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού ή μεμονωμένου ανιχνευτή υδρόλυσης μπορεί να περιλαμβάνει τουλάχιστον μία θέση συρραφής εξονίων. Κατά προτίμηση, η περιοχή συρραφής εξονίων μπορεί να περιλαμβάνει μόνο μία βάση σε οποιαδήποτε θέση του εξωνίου με αποτέλεσμα οι εκκινητές να δεσμεύονται μόνο σε αλληλουχία χωρίς ιντρόνια υπό τις χρησιμοποιούμενες συνθήκες. Η μέθοδος χρησιμοποιεί ένα ζεύγος εκκινητών που θα δεσμεύεται μόνο σε μια αλληλουχία στην οποία τα ιντρόνια έχουν αποματιστεί, π.χ. mRNA, cDNA. Επιπλέον, τα ζεύγη ανιχνευτών υδρολύσεως ή ζευγών ανιχνευτών υβριδισμού είναι μέρος του μίγματος αντιδράσεως ενισχύσεως και υβριδοποιούνται με την πρόσφατα συντιθέμενη αλληλουχία στόχο υπό επιλεγμένες συνθήκες, υπό την προϋπόθεση ότι αυτή η αλληλουχία στόχος υπάρχει στο δείγμα δοκιμής.
Ειδικότερα, κάθε ζεύγος εκκινητών αποτελείται από αλληλουχίες εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητή. Ο εμπρόσθιος εκκινητής είναι ο εκκινητής που εκτείνεται στην ίδια κατεύθυνση με τον κλώνο κωδικοποίησης του νουκλεϊκού οξέος στόχου. Ο εμπρόσθιος εκκινητής AR-FL έχει σχεδιαστεί ώστε να υβριδοποιείται στην εσωτερική περιοχή του εξονίου 7 της αλληλουχίας AR-FL mRNA. Ο εμπρόσθιος εκκινητής AR-FL είναι συμπληρωματικός προς το 3'-άκρο. Αντιστρόφως, ο ανάστροφος εκκινητής AR-FL είναι ο εκκινητής που επεκτείνεται στην ίδια κατεύθυνση με τον μη κωδικοποιημένο κλώνο του νουκλεϊκού οξέος στόχου. Ο ανάστροφος εκκινητής AR-FL έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται στην εσωτερική περιοχή του εξονίου 8 της αλληλουχίας AR-FL mRNA. Κατά συνέπεια, ο AR-FL εκκινητής συμβαδίζει με τα 3'-άκρα αντικριστά.
Επιπλέον, ο εκκινητής AR-V7 έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται μεταξύ του εξονίου 3 και του κρυπτικού εξονίου 3b της αλληλουχίας του εναλλακτικού μεταγράψου AR-V7 mRNA. Ο ανάστροφος εκκινητής AR-V7 έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται στην εσωτερική περιοχή του κρυπτικού εξονίου 3b της αλληλουχίας του εναλλακτικού μεταγράψου AR-V7 mRNA. Ο εμπρόσθιος εκκινητής AR-567es έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται στην εσωτερική περιοχή του εξονίου 4 του εναλλακτικού μεταγράψου AR-567es mRNA. Ο ανάστροφος εκκινητής AR-567es έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται στην εσωτερική περιοχή του εξονίου 8 του εναλλακτικού μεταγράψου AR-567es mRNA. Ο εμπρόσθιος εκκινητής AR-ολικό έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται στην εσωτερική περιοχή του εξονίου 1 της αλληλουχίας mRNA του AR- total. Ο ανάστροφος εκκινητής AR-ολικό έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται μεταξύ των εξονίων 1 και 2 της αλληλουχίας AR-ολικό mRNA.
Συγκεκριμένα, η αλληλουχία AR-FL είναι το mRNA μετάγραφο της αλληλουχίας AR-FL-mRNA (SEQ ID NO: 1). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η αλληλουχία DNA του AR-FL (SEQ ID NO: 1) που παρατίθεται στον προσαρτημένο κατάλογο αλληλουχιών αντιστοιχεί στην μεταγραφή μένη mRNA αλληλουχία της εν λόγω πρωτεΐνης. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση ο εκκινητής AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CATCCTGCTC-3' (SEQ ID NO: 5), προτιμότερα ο εμπρόσθιος εκκινητής AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TCCCACATCCTGCTCAAGAC-3' (SEQ ID NO: 6). Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση ο ανάστροφος εκκινητής AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAAAGTCCAC-3' (αλληλουχία αρ. 7), πιο προτιμότερα ο ανάστροφος εκκινητής AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TTCCGGAAAGTCCACGCT-3' (SEQ ID NO: 8).
Η αλληλουχία AR-V7 είναι το mRNA-μετάγραφο της αλληλουχίας AR-V7-mRNA (SEQ ID NO: 2). Σε μια προτιμώμενη ενσωμάτωση ο εμπρόσθιος εκκινητής AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TGGGAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 9), πιο προτιμότερα ο εκκινητής AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'AGGGATGACTCTGGGAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 10). Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση ο ανάστροφος εκκινητής AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TCCAGACTAT-3 ' (SEQ ID NO: 11), πιο προτιμότερα ο ανάστροφος εκκινητής AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CAGGTTT CT CCAGACT AT CCACT Α-3' (SEQ ID NO: 12).
Η αλληλουχία AR-567es είναι το mRNA-μετάγραφο της mRNA αλληλουχίας AR-567es (SEQ ID NO: 3). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η αλληλουχία DNA του AR-567es (SEQ ID NO: 3) που παρατίθεται στον προσαρτημένο κατάλογο αλληλουχιών αντιστοιχεί στην μεταγραφημένη mRNA αλληλουχία της εν λόγω πρωτεΐνης. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση ο εμπρόσθιος εκκινητής AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAGACAGCTT-3' (SEQ ID NO: 13), πιο προτιμότερα ο εμπρόσθιος εκκινητής AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GGAGAGAGACAGCTTGTACACGT -3' (SEQ ID NO: 14). Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, ο ανάστροφος εκκινητής AR -567es περιλαμβάνει την αλληλουχία GAAAGTCCAC-3' (SEQ ID NO: 15), προτιμότερα ο ανάστροφος εκκινητής AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TTCCGGAAAGTCCACGCT-3' (SEQ ID NO: 16), δηλαδή ο ανάστροφος εκκινητής AR-FL είναι κοινός με τον ανάστροφο εκκινητή AR-567es.
Η αλληλουχία του AR-total είναι το mRNA μετάγραφο της mRNA αλληλουχίας AR-ολικό (SEQ ID NO: 4). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η αλληλουχία DNA για το AR-ολικό (SEQ ID NO: 4) που παρατίθεται στον προσαρτημένο κατάλογο αλληλουχιών αντιστοιχεί στην μεταγραφημένη mRNA αλληλουχία της εν λόγω πρωτεΐνης. Σε μια προτιμώμενη ενσωμάτωση ο εμπρόσθιος εκκινητής του AR-total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAGTGCCCTA-3 ' (SEQ ID NO: 17), προτιμότερα ο εμπρόσθιος εκκινητής του AR- total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AGCAGAGTGCCCTATCCCA-3' (SEQ ID NO: 18). Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση ανάστροφος εκκινητής του AR-total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CTGGCAGTCT-3 ' (SEQ ID NO: 19), προτιμότερα ανάστροφος εκκινητής του AR-total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TCCCTGGCAGTCTCCAAAC-3' (SEQ ID NO: 20).
Η εφεύρεση περαιτέρω αποκαλύπτει αλληλουχίες των ειδικών ανιχνευτών, όπως είναι οι ανιχνευτές υβριδισμού, ανιχνευτές υδρόλυσης (TaqMan) ή τα μοριακά Beacon, ή ανιχνευτές τύπου SCORPION, για ανίχνευση/ποσοτικοποίηση της ενίσχυσης του προϊόντος PCR, εξασφαλίζοντας την εξειδίκευση της μεθόδου. Επιπλέον, οι ανιχνευτές είναι κατά προτίμηση επισημασμένοι. Η επισήμανση μπορεί να είναι είτε άμεσα ανιχνεύσιμη για παράδειγμα με φθορίζοντα στοιχεία και παρόμοια με αυτά είτε έμμεσα ανιχνεύσιμη μέσω ειδικής σύνδεσης με νουκλεϊκά οξέα. Προτεινόμενες επισημάνσεις άμεσου τύπου είναι φθορίζουσες χρωστικές, όπως SYBR Green I, FAM, HEX, VIC, fluorescein LC Red 610, LC Red640, LC Red670, LC Red 705, καθώς και άλλες γνωστές φθορίζουσες χρωστικές.
Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, αυτή η εφεύρεση χρησιμοποιεί ένα διαφορετικό ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού για την ανίχνευση συγκεκριμένα κάθε αλληλουχίας στόχου. Επομένως, δύο ειδικά σχεδιασμένα, ειδικά ολιγονουκλεοτίδια της ίδιας αλληλουχίας επισημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές δρουν σε αλληλουχία για να ποσοτικοποιήσουν το επίπεδο της ειδικής mRNA αλληλουχίας. Το πρώτο ολιγονουκλεοτίδιο φέρει φθορισμοφόρο δότη στο 3 'άκρο του ενώ το δεύτερο ολιγονουκλεοτίδιο φέρει φθορισμοφόρο δέκτη στο 5' άκρο του. Πιο συγκεκριμένα, το πρώτο ολιγονουκλεοτίδιο που φέρει φθορισμοφόρο δότη στο 3 'άκρο του ονομάζεται δότης, ενώ το δεύτερο ολιγονουκλεοτίδιο που φέρει φθορισμοφόρο δέκτη στο 5' άκρο του ονομάζεται δέκτης. Οι αλληλουχίες των δύο ολιγονουκλεοτιδίων επιλέγονται έτσι ώστε να υβριδοποιούνται προς το στόχο/ενισχυμένο mRNA τμήμα σε μια συνεχόμενη διάταξη έτσι ώστε το φθορισμοφόρο δότης του πρώτου ολιγονουκλεοτιδίου να βρίσκεται σε στενή εγγύτητα με το φθορισμφόρο δέκτη του δεύτερου ολιγονουκλεοτιδίου. Εάν τα δύο ολιγονουκλεοτίδιο δεν βρίσκονται σε στενή επαφή, η διέγερση από μια φωτεινή πηγή θα οδηγήσει σε διέγερση του φθορισμοφόρου δότη και εκπομπή φωτός σε μήκος κύματος που είναι ειδικό για το μόριο του δότη. Όταν τα δύο φθορισμοφόρο βρίσκονται σε άμεση γειτνίαση με την διέγερση του φθορισμοφόρου δότη, προκύπτει η μεταφορά ενέργειας στο φθορισμοφόρο δέκτη. Αυτή η μεταφορά ενέργειας, που αναφέρεται ως FRET (μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού), έχει ως αποτέλεσμα την εκπομπή φωτός σε ένα μήκος κύματος που είναι ειδικό για το φθορισμοφόρο δέκτη. Μετρώντας τα σήματα που εκπέμπονται στο μήκος κύματος του φθορισμοφόρου δότη και δέκτη, μπορεί να προσδιοριστεί η ποσότητα του FRET. Καθώς το εκμαγείο / ενισχυμένη αλληλουχία στόχος είναι υπεύθυνη για τη βέλτιστη τοποθέτηση των ολιγονουκλεοτιδίων η αύξηση στην ποσότητα του μετρούμενου φθορισμού στο μήκος κύματος εκπομπής του δέκτη είναι ανάλογη με την αύξηση της ποσότητας του παραγόμενου προϊόντος PCR.
Ο εκπεμπόμενος φθορισμός εξαρτάται από τον υβριδισμό αμφοτέρων των ολιγονουκλεοτιδίων και έτσι η μέτρηση φθορισμού πραγματοποιείται στο στάδιο επέκτασης του κύκλου PCR. Επιπλέον, οι φθορισμοφόροι ανιχνευτές θα πρέπει να είναι μεταξύ 20-30 βάσεων σε μήκος χωρίς το σχηματιασμό βρόχου-κορμού ή άλλη δευτερογενή δομή. Ένα σημαντικό σημείο είναι ότι η θερμοκρασία ανόπτησης των ανιχνευτών υβριδοποίησης πρέπει να είναι 5-10°C πάνω από εκείνη της θερμοκρασίας ανόπτησης των εμπρόσθιων και ανάστροφων εκκινητών. Επιπλέον, δεν πρέπει να υπάρχει επικάλυψη αλληλουχίας μεταξύ οποιωνδήποτε εκκινητών. Επιπλέον, είναι πολύ σημαντικό να σημειωθεί ότι σε περίπτωση πολλαπλών αναλύσεων PCR, κάθε σύνολο ανιχνευτών υβριδισμού έχει διαφορετικές εκπομπές μήκους κύματος (λem) για κάθε ομάδα γονιδίων, ενώ η δοκιμή φασματικής διόρθωσης εκτελείται χρησιμοποιώντας καθαρά φάσματα των χρωστικών έτσι ώστε η φασματική επικάλυψη μεταξύ των χρωμάτων να διορθώνεται.
Ειδικότερα, κάθε "ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να ανιχνεύει ειδικά μόνο μία από τις αλληλουχίες του γονιδίου AR των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR- total mRNA μεταγράφων. Σε μια προτιμώμενη ενσωμάτωση, το "ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού AR-FL", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται και να ανιχνεύει ειδικά μόνο το προϊόν ενίσχυσης AR-FL PCR. Το "ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού AR-V7", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται και να ανιχνεύει ειδικά μόνο το προϊόν ενίσχυσης PCR AR-V7. Το "ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού AR-567es", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται και να ανιχνεύει ειδικά μόνο το προϊόν ενίσχυσης PCR AR-567es. Το "ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού AR-total", το οποίο χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανό να υβριδοποιείται και να ανιχνεύει ειδικά μόνο το προϊόν ενίσχυσης PCR AR-ολικό.
Κάθε ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού περιλαμβάνει έναν ανιχνευτή δότη 3'-φλουορεσκεΐνης (FL) και έναν ανιχνευτή δέκτη 5'-LC που έχει διαφορετικό μήκος κύματος εκπομπής για κάθε ομάδα γονιδίων. Τα μήκη κύματος εκπομπής του αντίστοιχου ανιχνευτή δέκτη είναι: AR-FL στα 610 nm, AR-V7 στα 640 nm, ARV-567 στα 670 nm, AR-ολικό στα 705 nm. Η διέγερση από τη φωτεινή πηγή LED (δίοδος εκπομπής φωτός) οδηγεί στη διέγερση των τεσσάρων δοτών φθορισμοφόρων και στην εκπομπή φωτός σε ένα μήκος κύματος ειδικό για τα μόρια του δότη. Όταν κάθε φθορισμοφόρο δότης και δέκτης βρίσκονται σε άμεση γειτνίαση με τη διέγερση του φθορισμοφόρου δότη, προκύπτει μεταφορά ενέργειας στο φθοροφόρο δέκτη. Αυτή η μεταφορά ενέργειας οδηγεί σε εκπομπή φωτός στα συγκεκριμένα μήκη κύματος: 610nm (AR-FL), 640nm (AR-V7), 670nm (AR-567es), 705nm (AR-ολικό). Μετρώντας τα σήματα που εκπέμπονται στο μήκος κύματος του φθορισμοφόρου δότη και δέκτη, η ποσότητα των γονιδίων AR-FL, AR-V7, AR-567es, AR-total μπορεί να προσδιοριστεί από τις αντίστοιχες καμπύλες βαθμονόμησης μετά από την εφαρφογή φασματικής διόρθωσης.
Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR-FL έχει σχεδιαστεί ώστε να υβριδοποιείται στην εσωτερική περιοχή του εξονίου 7, ενώ ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-FL έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται μεταξύ των εξονίων 7 και 8. Επιπλέον, ο δότης και δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-V7 έχουν σχεδιάστει ώστε να υβριδοποιούνται στην εσωτερική περιοχή του κρυπτικού εξονίου 3. Ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR-567es έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται στην εσωτερική περιοχή του εξονίου 4, ενώ ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού του AR-567es έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται μεταξύ των εξονίων 4 και 8. Επιπλέον, ο δότης και δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-ολικό έχουν σχεδιαστεί ώστε να υβριδοποιούνται στην εσωτερική περιοχή του εξονίου 1.
Κατά προτίμηση, ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CTCACCAAGC-3' (SEQ ID NO: 21), προτιμότερα ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-Τ ACCAGCT CACCAAGCT CCT GGA- FL-3' (SEQ ID NO: 22). Κατά προτίμηση, ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TGCAGCCTATTGC-3' (SEQ ID NO: 23), προτιμότερα ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-LC610-TCCGTGCAGCCTATTGCGAG-PH-3’ (SEQ ID NO: 24).
Κατά προτίμηση, ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-AATTGCAAGC-3’ (SEQ ID NO: 25), προτιμότερα ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-TTGGCAATTGCAAGCATCTCAAA-FL-3’ (SEQ ID NO: 26). Κατά προτίμηση, ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GACCCTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 27), προτιμότερα ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- LC640-TGACCAGACCCTGAAGAAAGGCT-PH-3‘ (SEQ ID NO: 28).
Κατά προτίμηση, ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CAGGCAAGGC-3’ (SEQ ID NO: 29), προτιμότερα ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CAATCAGGCAAGGCCTTGGC-FL-3’ (SEQ ID NO: 30). Κατά προτίμηση, ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GACCACGTGT-3’ (SEQ ID NO: 31), προτιμότερα ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- LC670-CACTTGACCACGTGTACAAGCTGTCT-PH-3‘ (SEQ ID NO: 32).
Κατά προτίμηση, ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR- total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GTGTCAAAAG-3’ (SEQ ID NO: 33), προτιμότερα ο δότης ανιχνευτής υβριδισμού AR- total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CTTGTGTCAAAAGCGAAATGGGC-FL-3’ (SEQ ID NO: 34). Κατά προτίμηση, ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR- total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-TGGATAGCTA-3’ (SEQ ID NO: 35), προτιμότερα ο δέκτης ανιχνευτής υβριδισμού AR-ολικό περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-LC705-CCTGGATGGATAGCTACTCCGGAC-PH-3’ (SEQ ID NO: 36).
Σε μια άλλη προτιμώμενη ενσωμάτωση, αυτή η εφεύρεση χρησιμοποιεί έναν ανιχνευτή υδρόλυσης (TaqMan) για την ανίχνευση συγκεκριμένα κάθε αλληλουχίας στόχου. Κάθε "ανιχνευτής υδρόλυσης", ο οποίος χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανός να ανιχνεύει συγκεκριμένα οποιαδήποτε από τις αλληλουχίες των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA-μεταγραφημάτων του γονιδίου AR. Σύμφωνα με αυτή την προτιμώμενη ενσωμάτωση, ο "ανιχνευτής υδρόλυσης AR-FL", ο οποίος χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανός να υβριδοποιείται και να ανιχνεύει ειδικά το προϊόν ενίσχυσης PCR AR-FL. Ο "ανιχνευτής υδρόλυσης AR-V7", ο οποίος χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανός να υβριδοποιείται και να ανιχνεύει ειδικά το προϊόν ενίσχυσης PCR AR-V7. Ο "ανιχνευτής υδρόλυσης AR-567es", ο οποίος χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανός να υβριδοποιείται και να ανιχνεύει ειδικά το προϊόν ενίσχυσης PCR AR -567es. Ο " ανιχνευτής υδρόλυσης AR- total ", ο οποίος χρησιμοποιείται στη μέθοδο, είναι ικανός να υβριδοποιείται και να ανιχνεύει ειδικά το προϊόν ενισχύσεως PCR AR-ολικό.
Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, ο ανιχνευτής υδρόλυσης έχει σχεδιαστεί ώστε να υβριδοποιείται σε μια εσωτερική περιοχή μέσα στο στόχο του αμπλικόνιου. Ειδικά, ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-FL που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μέθοδο έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται προς την περιοχή σύνδεσης των εξονίων 7 και 8 της αλληλουχίας AR-FL-mRNA. Ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-V7 που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μέθοδο έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται σε μια εσωτερική περιοχή σύνδεσης του κρυπτικού εξονίου 3 της αλληλουχίας AR-V7-mRNA. Ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-567es που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μέθοδο έχει σχεδιαστεί ώστε να υβριδοποιείται προς την εσωτερική περιοχή σύνδεσης των εξονίων 4 και 8 της αλληλουχίας mRNA AR-567es. Ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-ολικό ο οποίος χρησιμοποιείται σε αυτή τη μέθοδο έχει σχεδιαστεί ώστε να υβριδοποιείται σε μια εσωτερική περιοχή του εξονίου 1 της αλληλουχίας AR-ολικό mRNA. Κάθε ανιχνευτής υδρόλυσης είναι τυπικά ένα ολιγονουκλεοτίδιο 20-30 bp με μια φθορίζουσα χρωστική αναφοράς (δηλ. 6-φλουορεσκεΐνη, FAM) προσαρτημένη ομοιοπολικά στο 5' άκρο και ένα αποσβέστη μαύρης τρύπας-1 (BHQ-1 ή BHQ-2). Κάθε ανιχνευτής υδρολύσεως έχει διαφορετική φθορίζουσα χρωστική αναφοράς. Ειδικότερα, ο ανιχνευτής υδρολύσεως AR-FL είναι συζευγμένος με χρωστική HEX, ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-V7 συζευγνύεται με τη χρωστική FAM, ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-567es συζευγνύεται με τη χρωστική ΤΕΧ615 και ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-total είναι συζευγμένος με χρωστική CY5.
Ο αποσβέστης μαύρης τρύπας-1 (BHQ-1) ταξινομείται ως σκοτεινός αποσβέστης (ένα μη φθορίζον χρωμοφόρο) και χρησιμοποιείται ευρέως ως τμήμα του 3' άκρου του αποσβέστη σε μια ποικιλία ανιχνευτών ανίχνευσης φθορισμού. Ο ανιχνευτής υδρόλυσης προστίθεται απευθείας στο μίγμα PCR και οι συνθήκες είναι ουσιαστικά ταυτόσημες με εκείνες που καθορίζονται για μια τυποποιημένη PCR. Κατά τη διάρκεια της φάσης επέκτασης του κύκλου PCR, η Taq DNA πολυμεράση διασπά τον ανιχνευτή υδρόλυσης μόνο όταν υβριδοποιείται προς τον στόχο, διαχωρίζοντας τη χρωστική αναφοράς από την χρωστική του αποσβέστη. Μία αύξηση της έντασης φθορισμού στα 518 nm (όταν η FAM είναι η χρώση αναφοράς) (λόγω της απελευθέρωσης της επίδρασης απόσβέσης στη χρώση αναφοράς) είναι το αποτέλεσμα υδρόλυσης του ανιχνευτή υδρόλυσης και είναι ποσοτική για την αρχική ποσότητα του εκμαγείου. Οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι αποδιάταξης, ανόπτησης και επέκτασης οδηγούν σε εκθετική ενίσχυση του προϊόντος PCR και σε ένταση φθορισμού.
Κατά προτίμηση, ο ανιχνευτής υδρολύσεως AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CCGTGCAGCCTATT-3 ' (SEQ ID NO: 37), προτιμότερα ο ανιχνευτής υδρολύσεως AR-FL περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-Η EX-CT CCT GGACT CCGTGCAGCCT ATT -BHQ1-3' (SEQ ID NO: 38). Κατά προτίμηση, ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CCCTCTAGAGCCC-3' (SEQ ID NO: 39), προτιμότερα ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-V7 περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-FAM-CCCTCT AG AGCCCT CATTTT G ΑΑΤ GAG - B HQ 1 -3' (SEQ ID NO: 40). Κατά προτίμηση, ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AATCAGGCAAGGCC-3 ' (SEQ ID NO: 41), προτιμότερα ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-567es περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-ΤΕΧ615-AATCAGGCAAGGCCTTGGCCCA -BHQ2-3' (SEQ ID NO: 42). Κατά προτίμηση, ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CCTGGATGGATAGC-3' (SEQ ID NO: 43), προτιμότερα ο ανιχνευτής υδρόλυσης AR-total περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CY5-CCTGGAT GGAT AGCT ACT CCGGACC -BHQ2-3' (SEQ ID NO: 44).
Ο απόλυτος αριθμός αντιγράφων AR-FL, AR-V7, AR-567es, AR-ολικό μπορεί να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας μια καμπύλη βαθμονόμησης που δημιουργείται χρησιμοποιώντας διαδοχικές αραιώσεις κάθε συνθετικού προτύπου AR εις τριπλούν σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 10<5>αντίγραφα/μL έως 10 αντίγραφα/μL. Κάθε καμπύλη βαθμονόμησης δείχνει τη γραμμικότητα σε ολόκληρο το εύρος ποσοτικοποίησης και τη λογαριθμική-γραμμική σχέση από τους συντελεστές συσχέτισης.
Σε μία περαιτέρω άποψη η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης μια μέθοδο για:
i. την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα υποκείμενο, και / ή
ii. αξιολόγηση της έκβασης της θεραπείας της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα υποκείμενο και / ή
iii. την εκτίμηση της υποτροπής της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα υποκείμενο,
όπου η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει την ποσοτικοποίηση των αντιγράφων AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA του γονιδίου AR σε ένα δείγμα σύμφωνα με την in vitro μέθοδο όπως περιγράφεται εδώ.
Κατά προτίμηση, το υποκείμενο είναι ένας άνθρωπος, ο οποίος πάσχει από μια κακοήθη νεοπλασματική ασθένεια.
Η in vitro μέθοδος όπως περιγράφεται εδώ μπορεί πλεονεκτικά να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA-μεταγραφημάτων σε ένα δείγμα RNA για:
ί. την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα, και / ή
ii. αξιολόγηση της έκβασης της θεραπείας της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα και / ή
iii. την εκτίμηση της υποτροπής της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα,
όπου η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει την ποσοτικοποίηση των αντιγράφων AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR- total mRNA του γονιδίου AR σε ένα δείγμα σύμφωνα με την in vitro μέθοδο όπως περιγράφεται εδώ.
όπου το εν λόγω δείγμα μπορεί να είναι ένα βιολογικό δείγμα το οποίο μπορεί να προέλθει από έναν οργανισμό. Εποφελώς, ο οργανισμός μπορεί είναι ένα θηλαστικό όπως ένας άνθρωπος, ο οποίος πάσχει από μια κακοήθη νεοπλασματική ασθένεια.
Η κακοήθης νεοπλασματική ασθένεια μπορεί να επιλεγεί από μια ομάδα καρκίνων που αποτελείται από προστάτη, τριπλά αρνητικό καρκίνο μαστό ή άλλο τύπο καρκίνου. Η in vitro μέθοδος όπως περιγράφεται εδώ χρησιμοποιείται εποφελώς όταν ο οργανισμός πάσχει από καρκίνο.
Όταν προβλέπεται η αποτελεσματικότητα της θεραπείας κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα, η μέθοδος περιλαμβάνει τα στάδια:
α. διεξαγωγή της in vitro μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA μεταγράφων του AR γονιδίου σε ένα δείγμα όπως περιγράφεται,
β. προσδιορισμός του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA-μεταγραφών του AR γονιδίου στο δείγμα.
Το δείγμα λαμβάνεται εποφελώς από έναν ανθρώπινο οργανισμό που πάσχει από κακοήθη νεοπλασματική ασθένεια και χωρίς να λάβει θεραπεία. Έτσι, η πρόβλεψη συνδέεται με τον απόλυτο αριθμό αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA- μεταγραφών στο εν λόγω δείγμα που έχει ληφθεί πριν από τη θεραπεία και μπορεί να υποδεικνύει εάν ο οργανισμός είναι πιθανό να ανταποκρίνονται θετικά στη θεραπευτική αγωγή και μπορεί επομένως να χρησιμοποιηθεί κλινικά για να ληφθούν θεραπευτικές αποφάσεις επιλέγοντας την καταλληλότερη θεραπευτική στρατηγική.
Κατά την αξιολόγηση της έκβασης της θεραπείας της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα κατά τη διάρκεια της θεραπείας, η μέθοδος περιλαμβάνει τα στάδια:
α. διεξαγωγή της in vitro μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR- total μεταγράφων mRNA του γονιδίου AR σε ένα δείγμα όπως περιγράφεται εδώ,
β. προσδιορισμός του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR- total μεταγράφων mRNA του γονιδίου AR στο δείγμα,
γ. επαναλαμβάνοντας τα παραπάνω στάδια σε ένα ή περισσότερα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια και μετά τη θεραπεία του εν λόγω αθρώπινου οργανισμού, όπου μια μεταβολή στον απόλυτο αριθμό αντιγράφων των αντιγράφων AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR- total mRNA στο δείγμα με την πάροδο του χρόνου υποδεικνύει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας.
Το δείγμα λαμβάνεται από έναν ανθρώπινο οργανισμό που πάσχει από κακοήθη νεοπλασματική νόσο πριν και μετά τη θεραπεία. Έτσι, μια ένδειξη αποτελεσματικής θεραπείας είναι μια σχετική μείωση στον απόλυτο αριθμό αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA- μεταγραφών στο δείγμα σε σχέση με ένα προηγούμενο δείγμα που ελήφθη από τον ίδιο οργανισμό πριν τη θεραπευτική αγωγή.
Κατά την εκτίμηση της υποτροπής της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα κατά τη διάρκεια και μετά τη θεραπεία, η μέθοδος περιλαμβάνει τα στάδια:
α. διεξαγωγή της in vitro μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA-μεταγράφων του γονιδίου AR σε ένα δείγμα όπως περιγράφεται εδώ,
β. προσδιορισμός του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA-μεταγράφων του γονιδίου AR στο δείγμα,
γ. επαναλαμβάνοντας τα παραπάνω στάδια σε ένα ή περισσότερα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια και μετά την αγωγή του εν λόγω υποκειμένου και όπου μια μεταβολή της σχετικής ποσότητας των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA-μεταγραφών στο δείγμα με την πάροδο του χρόνου υποδεικνύει κίνδυνο επανεμφάνισης.
Έτσι, μια ένδειξη επανεμφάνισης νόσου είναι μια σχετική αύξηση της ποσότητας των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA-μεταγράφων στα εν λόγω δείγματα που ταυτοποιούν την κακοήθη νεοπλασματική ασθένεια κατά τη διάρκεια της θεραπείας, δηλ. την ποσότητα των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό μεταγράφων mRNA πριν και μετά από μια πορεία θεραπείας.
FI εφεύρεση αναφέρεται επίσης σε ένα κιτ για τον προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA-μεταγραφών σε ένα δείγμα. Το κιτ για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό των αντιγράφων AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA σε ένα δείγμα μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για:
ποσοτικοποίηση της έκφρασης των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total mRNA-μεταγραφών του AR γονιδίου σε ένα δείγμα, και / ή
ii. την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα, και / ή
iii. την αξιολόγηση της έκβασης της θεραπείας της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα και / ή
iν. την αξιολόγηση της επανάληψης κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα.
Κατά προτίμηση, το κιτ μπορεί να περιλαμβάνει:
1. Έναν εμπρόσθιο AR-FL εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CATCCTGCTC-3' (SEQ ID NO: 5), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TCCCACATCCTGCTCAAGAC-3' (SEQ ID NO: 6),
2. Έναν ανάστροφο AR-FL εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAAAGTCCAC-3' (SEQ ID NO: 7), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-ΤΤ CCGGAAAGT CCACGCT -3' (SEQ ID NO: 8),
3. Έναν εμπρόσθιο AR-V7 εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TGGGAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 9), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AGGGATGACTCTGGGAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 10),
4. Έναν ανάστροφο AR-V7 εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TCCAGACTAT-3' (SEQ ID NO: 11), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CAGGTTT CT CCAGACT AT CCACT Α-3' (SEQ ID NO: 12),
5. Έναν εμπρόσθιο AR-567es εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAGACAGCTT-3' (SEQ ID NO: 13), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GGAGAGAGACAGCTTGTACACGT -3' (SEQ ID NO: 14),
6. Έναν ανάστροφο AR-567es εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία (SEQ ID NO: 15), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-ΤΤ CCGGAAAGT CCACGCT -3 ' (SEQ ID NO: 16),
7. Έναν εμπρόσθιο AR-total εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAGTGCCCTA-3 ' (SEQ ID NO: 17), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AGCAGAGTGCCCTATCCCA-3' (SEQ ID NO: 18),
8. Έναν ανάστροφο AR εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CTGGCAGTCT-3 ' (SEQ ID NO: 19), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TCCCTGGCAGTCTCCAAAC-3' (SEQ ID NO: 20),
9. Έναν δότη AR-FL ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CTCACCAAGC-3' (SEQ ID NO: 21), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-Τ ACCAGCT CACCAAGCT CCT GGA- FL-3' (SEQ ID NO: 22), 10. Έναν δέκτη AR-FL ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TGCAGCCTATTGC-3' (SEQ ID NO: 23), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-LC610-TCCGTGCAGCCTATTGCGAG-PH 3' (SEQ ID NO: 24), 11 . Έναν δότη AR-V7 ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AATTGCAAGC-3' (SEQ ID NO: 25), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5' -TTG G C ΑΑΤΤ G C AAG CAT CT C AAA- F L-3 ' (SEQ ID NO: 26), 12. Έναν δέκτη AR-V7 ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GACCCTGAAG-3' (SEQ ID NO: 27), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'- LC640-T GACCAGACCCT GAAGAAAGGCT - PH-3' (SEQ ID NO: 28),
13. Έναν δότη AR-567es ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CAGGCAAGGC-3' (SEQ ID NO: 29), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CAATCAGGCAAGGCCTTGGC-FL-3' (SEQ ID NO: 30),
14. Έναν δέκτη AR-567es ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GACCACGTGT-3' (SEQ ID NO: 31), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'- LC670-CACTT GACCACGT GT ACAAGCT GTCT-P Η- 3' (SEQ ID NO: 32),
15. Έναν δότη AR-total ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GTGTCAAAAG-3' (SEQ ID NO: 33), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CTTGTGTCAAAAGCGAAATGGGC-FL-3' (SEQ ID NO: 34), 16. Έναν δέκτη AR-total ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TGGATAGCTA-3 ' (SEQ ID NO: 35), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-LC705-CCTGGATGGATAGCTACTCCGGAC-PH-3' (SEQ ID NO: 36),
17. Έναν ανιχνευτή AR-FL υδρόλυσης που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CCGTGCAGCCTATT-3' (SEQ ID NO: 37), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-FI EX-CT CCT GGACT CCGTGCAGCCT ATT -BHQ1 -3' (SEQ ID NO: 38),
- Έναν ανιχνευτή AR-V7 υδρόλυσης που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CCCTCTAGAGCCC-3' (SEQ ID NO: 39), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-FAM-CCCTCTAGAGCCCTCATTTTGAATGAG-BHQ1-3' (SEQ ID NO: 40),
- Έναν ανιχνευτή AR-567es υδρόλυσης που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AATCAGGCAAGGCC-3' (SEQ ID NO: 41), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-ΤΕΧ615-AATCAGGCAAGGCCTTGGCCCA -BHQ2-3' (SEQ ID NO: 42),
- Έναν ανιχνευτή AR-total υδρόλυσης που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CCTGGATGGATAGC-3' (SEQ ID NO: 43), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CY5-CCTGGATGGATAGCTACTCCGGACC-BHQ2-3' (SEQ ID NO: 44).
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ
Παράδειγμα 1 : Σχεδιασμός εκκινητών και ανιχνευτών
Οι in-silico εκκινητές και τα ζεύγη ανιχνευτών υβριδισμού σχεδιάστηκαν με τη χρήση του λογισμικού Primer Premier 5.0 (Premier Biosoft, CA, USA) για: a) AR-FL, b) AR-V7, c) AR-567es και d) AR-total (ως εσωτερικός έλεγχος καθώς ενισχύει μια κοινή περιοχή των AR-FL, AR-V7 και AR-567es). Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές σχεδιάστηκαν προσεκτικά ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός διμερών εκκινητών, οι λανθασμένες θέσεις εκκίνησης, ο σχηματισμός δομών φουρκέτας και η υβριδοποίηση στο γενωμικό DNA, ενώ ενισχύονται ειδικά μόνο τα εναλλακτικά μετάγραφα AR σύμφωνα με το εργαλείο αναζήτησης ακολουθίας ομοιότητας BLAST (NCBI , ΝΙΗ) (Σχήμα 1 A, Β). Κάθε σύνολο ανιχνευτών υβριδισμού περιελάμβανε έναν ανιχνευτή δότη 3'-φλουορεσκείνης (FL) και έναν ανιχνευτή δέκτη 5'-LC που έχει διαφορετικό μήκος κύματος για κάθε ομάδα γονιδίων: AR-FL (λem: 610 nm), AR-V7 (λem: 640 nm), AR-567es (λem: 670 nm) και AR-total (λem: 705 nm) (Σχήμα 1Α). Εφαρμόστηκε φασματική διόρθωση για να διορθωθεί η φασματική επικάλυψη μεταξύ των φθορισμοφόρων μορίων. Συγκεκριμένα, συμπεριλήφθηκαν επίσης ανιχνευτές υδρόλυσης για κάθε mRNA μετάγραφο (Σχήμα 1Β). Η Β2Μ (βήτα-2 μικροσφαιρίνη) χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Οι αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.
Πίνακας 1. Ακολουθίες εκκινητών και ανιχνευτών υβριδισμού ή υδρόλυσης για τα AR-FL, AR- total, AR-V7 και AR-567es
Αμπλικόνιο Γονίδιο Αλληλουχία (5'-3') Tm(°C) Μέγεθος
(bp)
Εξωτερικοί βαθμονομητές ποσοτικού προσδιορισμού: Τα θραύσματα συνθετικών γονιδίων συντέθηκαν ως gBIock από την εταιρεία Integrated DNA Technologies, Inc. Οι αλληλουχίες για κάθε εναλλακτικό μετάγραφο AR που δοκιμάστηκε σχεδιάστηκαν έτσι ώστε κάθε εναλλακτικό μετάγραφο AR να αντιπροσωπεύεται από ένα μοναδικό gBIock. Τα λυοφιλοποιημένα g Blocks αναδιαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA σε μία τελική συγκέντρωση αποθέματος 10 ng / μL και αραιώθηκαν περαιτέρω σε συγκεντρώσεις εργασίας όπως απαιτείται. Η συγκέντρωση DNA κάθε θραύσματος συνθετικού γονιδίου μετατράπηκε σε αντίγραφα / μL με τη χρήση του αριθμού Avogadro και του μοριακού βάρους κάθε θραύσματος συνθετικού γονιδίου AR, το οποίο πολλαπλασιάστηκε με το μέσο μοριακό βάρος ενός ζεύγους νουκλεϊνικών οξέων. Αυτά τα θραύσματα συνθετικών γονιδίων χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω ως βαθμονομητές εξωτερικής ποσοτικοποίησης για την πολλαπλή δοκιμασία RT-qPCR.
Κλινικά δείγματα: Αναλύσαμε 57 δείγματα περιφερικού αίματος (20m L) από ασθενείς με μεταστατικό ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη και 10 δείγματα περιφερικού αίματος από υγιείς δότες. Τα πρώτα 5 ml δεν χρησιμοποιήθηκαν, για να αποφευχθεί μόλυνση από επιθηλιακά κύτταρα του δέρματος. Η ανάλυση των CTC διεξήχθη με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας με τη χρήση του αντιδραστηρίου Ficol-Paque ΤΜ PLUS (GE Healthcare, Bio-Sciences ΑΒ).
Ανάλυση εξωκυτταρικών κυστιδίων: Το πλάσμα απομονώθηκε από περιφερικό αίμα με φυγοκέντρηση στα 530 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Μόλις απομονωθήκαν, τα δείγματα πλάσματος φυγοκεντρήθηκαν και πάλι στα 2.000 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Τα δείγματα αποψυγμένου πλάσματος φυγοκεντρήθηκαν στα 16,000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθούν όλα τα κυτταρικά υπολείμματα. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια απομονώθηκαν από 2mL πλάσματος μεσω δέσμευσης-συγγένειας με τη χρήση στήλης-σπιν (κιτ exoRNeasy Maxi, QIAGEN®, Γερμανία). Τα εξωκυτταρικά κυστίδια δεσμεύτηκαν σε μεμβράνη ανεξάρτητα από το μέγεθος ή την κυτταρική τους προέλευση και λυματοποιήθηκαν στη στήλη. To RNA απομονώθηκε με προσθήκη 700 μL QIAzol στη στήλη και το προϊόν λύσης συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση. Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ exoRNeasy Maxi (QIAGEN®). Όλα τα στάδια προετοιμασίας και χειρισμού RNA πραγματοποιήθηκαν σε καθορισμένη περιοχή σε αποροφητήρα με ελασματοειδή ροή, υπό συνθήκες απουσίας RNAse. Πραγματοποιήθηκε ανασύσταση του απομονωμένου total RNA σε 14 μL με νερό ελεύθερου νουκλεασών. Η cDNA σύνθεση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ RNA-προς-cDNA υψηλής ικανότητας (Applied Biosystems, USA). 1 μL cDNA χρησιμοποιήθηκε για την επόμενη ποσοτικοποίηση των εναλλακτικών μεταγράφων AR των εξωκυτταρικών κυστιδίων, χρησιμοποιώντας την πολλαπλή RT-qPCR.
Παράδειγμα 2: Αναλυτική επικύρωση της πολλαπλής δοκιμασίας RT-qPCR με βάση τους ανιχνευτές υβριδισμού
Παράδειγμα 2α: Πολλαπλή RT-qPCR νια την ανίχνευση του μοτίβου έκφρασης των εναλλακτικών μεταγράφων του ανδρονόνικου υποδοχέα με βάση τους ανιχνευτές υβριδισμού
Οι αντιδράσεις πολλαπλής RT-qPCR πραγματοποιήθηκαν στο LightCycler 2.0 (Roche, Γερμανία). Οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων και οι συνθήκες κυκλοποίησης βελτιστοποιήθηκαν λεπτομερώς με τη χρήση ενός μίγματος των ανωτέρω περιγραφέντων συνθετικών γονιδιακών θραυσμάτων που περιείχαν 10<2>αντίγραφα / μL από το καθένα μετάγραφο AR-FL, AR-V7, AR567es και AR-ολικό (διατηρούνται σε ισομοιρασμένα κλάσματα στους -80°C). Το μίγμα της αντίδρασης ενίσχυσης (συνολικός όγκος 10 μL) περιέχει 1 μL ρυθμιστικού διαλύματος σύνθεσης PCR (5Χ, Promega), 2μL MgCI2 (25mM, Promega), 0.15μL dNTPs (10mΜ, ThermoFisher Scientific), 0.8μL BSA (10μg / μL), 0,15μL DNA πολυμεράσης θερμής εκκίνησης (5 U/μL, Promega), 0,2μL ενός μίγματος που περιέχει όλους τους εκκινητές (10μΜ από το καθένα), 0,33μL ενός μίγματος που περιέχει όλους τους διπλούς ανιχνευτές υβριδισμού (3 μΜ από το καθένα) και DEPC-νερό. Οι συνθήκες κυκλοποίησης της αντίδρασης PCR είναι: 95°C / 2 λεπτά, 45 κύκλοι των 95°C / 20 s, επέκτασης στους 59° C / 20s και επέκταση στους 72° C/20 s.
Παράδειγμα 2β: Αναλυτική ευαισθησία
Η αναλυτική ευαισθησία της μεθοδολογίας προσδιορίστηκε για κάθε μεμονωμένο AR μεταγράφημα στόχο χρησιμοποιώντας μια καμπύλη βαθμονόμησης που δημιουργείται με τη χρήση διαδοχικών αραιώσεων κάθε συνθετικού προτύπου AR εις τριπλούν σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 10<6>αντίγραφα / μL έως 10 αντίγραφα/μL (Σχήμα 2Α). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν γραμμικότητα σε ολόκληρη την περιοχή ποσοτικοποίησης και οι συντελεστές συσχέτισης ήταν μεγαλύτεροι από 0,99 σε όλες τις περιπτώσεις, υποδεικνύοντας μια ακριβή λογαριθμική-γραμμική σχέση (Σχήμα 2Β). Το όριο ανίχνευσης (LoD) σε όλες τις περιπτώσεις ήταν 3 αντίγραφα/μL και το όριο ποσοτικοποίησης (LoQ) 9 αντίγραφα/μL.
Παράδειγμα 2γ: Αναλυτική ειδικότητα
Η αναλυτική ειδικότητα της μεθοδολογίας ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο σε ξεχωριστές αντιδράσεις κάθε μεμονωμένο AR συνθετικό πρότυπο (5χ10<4>αντίγραφα / μL) (AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό) παρουσία όλων των εκκινητών και ανιχνευτών που χρησιμοποιείται στην πολλαπλή RT-qPCR. Όπως φαίνεται στην Σχήμα 2Γ, κάθε ζεύγος εκκινητών και διπλό ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού ενισχύεται ειδικά μόνο το μεμονωμένο μεταγραφή μα-στόχος AR στο αντίστοιχο μήκος κύματος.
Παράδειγμα 2δ: Αναπαρανωνικότητα
Η αναπαραγωγιμότητα εντός του προσδιορισμού της πολλαπλής RT-qPCR αξιολογήθηκε με την εις τριπλούν ανάλυση δείγματος που περιέχει γνωστό αριθμό αντιγράφων από κάθε μεταγράφημα-στόχο του AR (AR-FL, AR-567es, AR-V7 και AR-ολικό) εκφραζόμενη ως CVs% (συντελεστής διακύμανσης). Η επαναληψιμότητα μεταξύ των προσδιορισμών ελέγχθηκε με ανάλυση των ίδιων δειγμάτων σε τέσσερις διαφορετικές ημέρες, εκφραζόμενη ως CVs% (Πίνακας 2).
Πίνακας 2. Μεθοδολογία πολλαπλής RT-qPCR για τα εναλλακτικά μετάγραφα AR: επαναληψιμότητα εντός και εκτός προσδιορισμού.
Παράδειγμα 2ε: Διαγνωστική ειδικότητα
Η ειδικότητα της μεθοδολογίας ελέγχθηκε σε κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα και εξωκυτταρικά κυστίδια εξετάστηκε χρησιμοποιώντας περιφερικό αίμα από 10 άντρες υγιούς αιμοδότες. Όλα τα δείγματα υγιών αιμοδοτών βρέθηκαν να είναι θετικά στη Β2Μ και για την έκφραση των AR-FL και AR- total μεταγράφουν όπως αναμενόταν, αλλά κανένα από αυτά δεν ήταν θετικό για τα AR-V7 ή AR-567es.
Παράδειγμα 3: Αναλυτική επικύρωση της πολλαπλής μεθοδολογίας RT-qPCR βασισμένης σε ανιχνευτές υδρόλυσης
Παράδειγμα 3α: Πολλαπλή RT-qPCR για την ανίχνευση του μοτίβου έκφρασης των εναλλακτικών μεταγραφών του ανδρογόνικου υποδοχέα με βάση τους ανιχνευτές υδρόλυσης
Η πολλαπλή αντίδραση RT-qPCR πραγματοποιήθηκε στο COBAS Ζ 480 (Roche, Γερμανία). Οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων και οι συνθήκες κυκλοποίησης βελτιστοποιήθηκαν λεπτομερώς χρησιμοποιώντας ένα μίγμα των ανωτέρω περιγραφέντων θραυσμάτων συνθετικού γονιδίου που περιείχαν 10<2>αντίγραφα / μL από κάθε AR-FL, AR-V7, AR567es και AR-ολικό (διατηρούνται σε ισομοιρασμένα κλάσματα στους -80 ° C). Το μίγμα της αντίδρασης ενίσχυσης (συνολικός όγκος 10 μL) περιέχει 1 μL του Ρυθμιστικού διαλύματος σύνθεσης PCR (5Χ, Promega), 2,4 μλ MgCI2(25mM, Promega), 0,2μL dNTPs (10mM, ThermoFisher Scientific) / μL, Promega), 0,3 μL μίγματος που περιέχει όλους τους εκκινητές (10 μΜ για κάθε ένα), 0,83 μL ενός μίγματος που περιέχει όλους τους διπλούς ανιχνευτές υβριδισμού (3 μΜ για το καθένα) και DEPC-H20 (προστιθέμενο μέχρι τον τον τελικό όγκο). Οι συνθήκες κυκλοποίησης αντίδρασης PCR ήταν: 95 ° C / 2 λεπτά, 45 κύκλοι των 95 ° C / 10 s, ανόπτηση και ενίσχυση στους 59 ° C / 40s.
Παράδειγμα 3b: Αναλυτική ευαισθησία
Η αναλυτική ευαισθησία της μεθοδολογίας προσδιορίστηκε για κάθε μεμονωμένο μεταγράφημα στόχο AR χρησιμοποιώντας μια καμπύλη βαθμονόμησης που δημιουργείται με τη χρήση διαδοχικών αραιώσεων κάθε συνθετικού προτύπου AR εις τριπλούν σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 10<6>αντίγραφα / μL έως 10 αντίγραφα / μL (Σχήμα 3Α). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν γραμμικότητα σε ολόκληρη την περιοχή ποσοτικοποίησης και οι συντελεστές συσχέτισης ήταν μεγαλύτεροι από 0,99 σε όλες τις περιπτώσεις, υποδεικνύοντας μια ακριβή λογαριθμική-γραμμική σχέση (Σχήμα 2Β). Το όριο ανίχνευσης (LoD) σε όλες τις περιπτώσεις ήταν 3 αντίγραφα / μL και το όριο ποσοτικοποίησης (LoQ) 9 αντίγραφα / μL.
Παράδειγμα 3γ: Αναλυτική ειδικότητα
Η αναλυτική ειδικότητα της μεθοδολογίας ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο σε ξεχωριστές αντιδράσεις κάθε μεμονωμένο AR συνθετικό πρότυπο (5χ10<4>αντίγραφα / μL) (AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό) παρουσία όλων των εκκινητών και ανιχνευτών που χρησιμοποιείται στην πολλαπλή RT-qPCR. Κάθε ζεύγος εκκινητών και ανιχνευτών υδρόλυσης ενισχύεται ειδικά μόνο το μεμονωμένο μεταγραφημα-στόχος AR στο αντίστοιχο μήκος κύματος (Σχήμα 3Γ).
Παράδειγμα 3δ: Αναπαραγωγικότητα
Η επαναληψιμότητα εντός του προσδιορισμού της πολλαπλής RT-qPCR αξιολογήθηκε με την εις τριπλούν ανάλυση δείγματος που περιέχει γνωστό αριθμό αντιγράφων από κάθε μεταγράφημα-στόχο του AR (AR-FL, AR-567es, AR-V7 και AR-ολικό) εκφραζόμενη ως CVs% (Πίνακας 3). Η αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των προσδιορισμών ελέγχθηκε με ανάλυση των ίδιων δειγμάτων σε τέσσερις διαφορετικές ημέρες, εκφραζόμενη ως CVs% (Πίνακας 4).
Πίνακας 3. Μεθοδολογία πολλαπλής RT-qPCR για τα εναλλακτικά μετάγραφα AR: επαναληψιμότητα εντός προσδιορισμού (η=3)
Πίνακας 4. Μεθοδολογία πολλαπλής RT-qPCR για τα εναλλακτικά μετάγραφα AR: επαναληψιμότητα μεταφύ των προσδιορισμών (η=4)
Παράδειγμα 3ε: Διαγνωστική ειδικότητα
Η ειδικότητα της μεθοδολογίας ελέγχθηκε σε κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα και εξωκυτταρικά κυστίδια εξετάστηκε χρησιμοποιώντας περιφερικό αίμα από 10 άντρες υγιούς αιμοδότες. Όλα τα δείγματα υγιών αιμοδοτών βρέθηκαν να είναι θετικά στη Β2Μ και για την έκφραση των AR-FL και AR- total μεταγράφων όπως αναμενόταν, αλλά κανένα από αυτά δεν ήταν θετικό για τα AR-V7 ή AR-567es.
Παράδειγμα 4: Ποσοτικός προσδιορισμός των εναλλακτικών μεταγραφών του ανδρογονικού υποδοχέα σε κυκλοφορούντο καρκινικά κύτταρα
Ελέγξαμε 57 δείγματα περιφερικού αίμαος που απομονώθηκαν από ασθενείς με μεταστατικό ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη. Τα μετάγραφα AR-FL ανιχνεύθηκαν σε 55/57 (96,5%), AR-V7 σε 8/57 (14,0%), AR-567es σε 2/57 (3,5%) και το AR-ολικό σε 53/57 (92,9%) των δειγμάτων αυτών. Παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη ετερογένεια στην έκφραση των εναλλακτικών μεταγράφων του ανδρογονικού υποδοχέα σε κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα μεμονωμένων ασθενών. Ο απόλυτος αριθμός αντιγράφων του AR-FL κυμαινόταν από 1-350 αντίγραφα, ο απόλυτος αριθμός αντιγράφων του AR-V7 κυμαινόταν από 1 έως 9 αντίγραφα, ο απόλυτος αριθμός αντιγράφων του AR567es κυμαινόταν από 1-4 αντίγραφα, ενώ ο απόλυτος αριθμός των αντιγράφων του AR- total κυμαινόταν σε 1 -3x10<3>αντίγραφα.
Παράδειγμα 5: Ποσοτικοποίηση των εναλλακτικών μεταγραφών του ανδρογονικού υποδοχέα σε εξωκυτταρικά κυστίδια προερχόμενα από πλάσμα
Όλα τα δείγματα cDNA που προέρχονται από εξωκυτταρικά κυστίδια από πλάσμα (2mL) ήταν εξαιρετικής ποιότητας RNA καθώς αυτό πιστοποιήθηκε με τη δοκιμασία RT-qPCR για τη Β2Μ. To AR-FL βρέθηκε να εκφράζεται σε 40/52 (76,9%), το AR-V7 σε 4/52 (7,7%), το AR-567es σε 2/52 (3,8%) και το AR-ολικό σε 39/52 (75,0%) δείγματα. Στους υγιείς αιμοδότες, το AR-FL βρέθηκε να εκφράζεται σε 6/10 (60,0%) και το AR-ολικό συνολικά σε 8/10 (80,0%) δείγματα, αλλά κανένα από αυτά τα δείγματα δεν ήταν θετικά για το AR-V7 ή και το AR-567es. Τα επίπεδα έκφρασης του AR-FL στα απομονωμένα εξωκυτταρικά κυστίδια από το πλάσμα των ασθενών με μεταστατικό ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη δεν διέφεραν σημαντικά από αυτά των υγιών αιμοδοτών (Ρ = 0,162). Αυτό αναμενόταν επειδή το AR-FL εκφράζεται επίσης σε υγιείς άντρες. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των AR-V7 ή AR-567es στα απομονωμένα εξωκυτταρικά κυστίδια από το πλάσμα των ασθενών με μεταστατικό ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά από εκείνα που ποσοτικοποιήθηκαν σε υγιείς αιμοδότες (δοκιμασία Marm-Whitney Ρ = 0,312, Ρ = 0,567) (Σχήμα 4) . Αυτό θα μπορούσε ενδεχομένως να εξηγηθεί από την πολύ χαμηλή θετικότητα που ανιχνεύθηκε στα εξωκυτταρικά κυστίδια για αυτούς τους δείκτες. Σε κάθε μεμονωμένο ασθενή, το ποσοστό της έκφρασης των εναλλακτικών μεταγράφων του ανδρογονικού υποδοχέα των εξωκυτταρικών κυστιδίων ήταν πολύ διαφορετικό (Σχήμα 5).
ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ
Claims (19)
1. Μία in vitro μέθοδος για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης των AR εναλλακτικών μεταγράφουν σε ένα δείγμα RNA, όπου η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει τα στάδια:
i. υποβολή του δείγματος υγρής βιοψίας σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το RNA που υπάρχει στο δείγμα ως εκμαγείο για τη σύνθεση μιας αντίστοιχης αλληλουχίας cDNA,
ii. σχηματισμό ενός μείγματος αντίδρασης που περιλαμβάνει το δείγμα, αντιδραστήρια ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων, ένα ζεύγος εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητών για να δημιουργηθεί ένα αμπλικόνιο για κάθε cDNA μετάγραφο, ένας μεμονωμένος ανιχνευτής υδρόλυσης ή ζεύγος ανιχνευτών για την ανίχνευση ενός αμπλικονίου για κάθε στόχο cDNA μετάγραφου, όπου τα εν λόγω cDNA μετάγραφα είναι τα AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικό mRNA
όπου το ζεύγος εκκινητών του AR-FL περιλαμβάνει έναν εμπρόσθιο AR-FL εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CATCCTGCTC-3' (SEQ ID NO: 5), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-Τ CCCACAT CCT GCT CAAGAC-3' (SEQ ID NO: 6) και έναν ανάστροφο AR-FL εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAAAGTCCAC-3' (SEQ ID NO: 7), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-ΤΤ CCGGAAAGT CCACGCT -3' (SEQ ID NO: 8),
όπου το ζεύγος εκκινητών του AR-V7 περιλαμβάνει έναν εμπρόσθιο AR-V7 εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'- TGGGAGAAAA -3' (SEQ ID NO: 9), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AGGGATGACTCTGGGAGAAAA -3' (SEQ ID NO: 10) και έναν ανάστροφο AR-V7 εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'- TCCAGACTAT -3' (SEQ ID NO: 11), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CAGGTTT CT CCAG ACT AT CCACT A -3' (SEQ ID NO: 12),
όπου το ζεύγος εκκινητών του AR-567es περιλαμβάνει έναν εμπρόσθιο AR-567es εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'- GAGACAGCTT -3' (SEQ ID NO: 13), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GGAGAGAGACAGCTTGTACACGT -3' (SEQ ID NO: 14) και έναν ανάστροφο AR-567es εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAAAGTCCAC -3' (SEQ ID NO: 15), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'- ΤΤ CCGGAAAGT CCACGCT -3' (SEQ ID NO: 16),
όπου το ζεύγος εκκινητών του AR-total περιλαμβάνει έναν εμπρόσθιο AR-total εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'- GAGTGCCCTA -3' (SEQ ID NO: 17), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AGCAGAGT GCCCT AT CCCA -3' (SEQ ID NO: 18) και έναν ανάστροφο AR-total εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'- CTGGCAGTCT -3' (SEQ ID NO: 19), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TCCCT GGCAGT CT CCAAAC -3' (SEQ ID NO: 20),
2. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1, περαιτέρω περιλαμβάνει το στάδιο προσδιορισμού του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικού mRNA σε ένα δείγμα.
3. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1 ή 2, όπου ο ανιχνευτής είναι ένας ανιχνευτής υδρόλυσης.
4. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1 ή 2, όπου το ζεύγος ανιχνευτών είναι ένα ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού.
5. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 4, όπου το ζεύγος AR-FL ανιχνευτών υβριδισμού περιλαμβάνει έναν δότη AR-FL ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CTCACCAAGC-3' (SEQ ID NO: 21), που κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TACCAGCTCACCAAGCTCCTGGA-FL-3’ (SEQ ID NO: 22), και έναν δέκτη AR-FL ανιχνευτή υβριδισμού ο οποίος περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TGCAGCCTATTGC-3 '(αλληλουχία αρ. 23), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-LC610-TCCGTGCAGCCTATTGCGAG-PH 3' (SEQ ID NO: 24).
6. Η μέθοδος σύμφωνα με τις αξιώσεις 4 ή 5, όπου το ζεύγος AR-V7 ανιχνευτών υβριδισμού περιλαμβάνει έναν δότη AR-V7 ανιχνευτή υβριδισμού AR-FL που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-AATTGCAAGC-3’ (SEQ ID NO: 25), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-TTGGCAATTGCAAGCATCTCAAA-FL-3’ (SEQ ID NO: 26), και έναν δέκτη AR-V7 ανιχνευτή υβριδισμού ο οποίος περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GACCCTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 27), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- LC640-Τ GACCAGACCCT GAAGAAAGGCT - ΡΗ-3’ (SEQ ID NO: 28).
7. Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 4 έως 6, όπου το ζεύγος AR-567es ανιχνευτών υβριδισμού περιλαμβάνει έναν δότη AR-567es ανιχνευτή υβριδισμού AR-567es που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CAGGCAAGGC-3’ (SEQ ID NO: 29), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CAATCAGGCAAGGCCTTGGC-FL-3’ (SEQ ID NO: 30), και έναν δέκτη AR-567es ανιχνευτή υβριδισμού ο οποίος περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GACCACGTGT-3’ (SEQ ID NO: 31), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-LC670-CACTT GACCACGT GT ACAAGCT GT CT -Ρ Η-3’ (SEQ ID NO: 32).
8. Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 4 έως 7, όπου το ζεύγος AR-total ανιχνευτών υβριδισμού περιλαμβάνει έναν δότη AR-total ανιχνευτή υβριδισμού AR-total που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GTGTCAAAAG-3’ (SEQ ID NO: 33), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CTTGTGTCAAAAGCGAAATGGGC-FL-3’ (SEQ ID NO: 34), και έναν δέκτη AR-total ανιχνευτή υβριδισμού ο οποίος περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-TGGATAGCTA-3’ (SEQ ID NO: 35), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-LC705- CCTGGATGGATAGCTACTCCGGAC-PH-3’ (SEQ ID NO: 36).
9. Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3, όπου ο AR-FL ανιχνευτής υδρόλυσης περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CCGTGCAGCCTATT-3' (SEQ ID NO: 37), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-ΗΕΧ-CT CCT GGACT CCGT GCAGCCT ATT - BHQ1-3' (SEQ ID NO: 38).
10. FI μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3 και 9, όπου ο AR-V7 ανιχνευτής υδρόλυσης περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CCCTCTAGAGCCC-3’ (SEQ ID NO: 39), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-FAM-CCCTCTAGAGCCCTCATTTTGAATGAG-BHQ1-3’ (SEQ ID NO: 40).
11 . Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3 και 9 έως 10, όπου ο AR-567es ανιχνευτής υδρόλυσης περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-AATCAGGCAAGGCC-3’ (SEQ ID NO: 41), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- AATCAGGCAAGGCCTTGGCCCA -3’ (SEQ ID NO: 42).
12. Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3 και 9 έως 11, όπου ο AR-total ανιχνευτής υδρόλυσης περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CCTGGATGGATAGC-3’ (SEQ ID NO: 43), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- CCT GGATGGAT AGCT ACT CCGGACC -3’ (SEQ ID NO: 44).
13. Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 12, όπου το βιολογικό δείγμα προέρχεται από έναν ανθρώπινο οργανισμό.
14. Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 13, όπου το βιολογικό δείγμα μπορεί να είναι είναι αίμα, CTCs, πλάσμα/ορός, εξωσώματα, φρέσκο ιστό, μυελό των οστών και ούρα.
15. Μία μέθοδος για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας μίας κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα, αξιολογώντας την έκβαση της θεραπείας μιας κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα, εκτιμώντας την υποτροπή της κακοήθους νεοπλασματικής νόσου σε ένα δείγμα, όπου η μέθοδος περιλαμβάνει το στάδιο προσδιορισμού του απόλυτου αριθμού αντιγράφων των AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-ολικού mRNA σε ένα δείγμα που λαμβάνεται από ανθρώπινο οργανισμό.
16. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 15, περιλαμβάνει τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης των εναλλακτικών μεταγράφων AR-FL, AR-V7, AR-567es και AR-total σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 14.
17. H μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 15 ή 16, όπου η κακοήθης νεοπλασματική ασθένεια είναι καρκίνος.
18. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 17, όπου ο καρκίνος μπορεί να είναι καρκίνο του προστάτη ή μαστού.
19. Ένα κιτ για τον ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης των εναλλακτικών μεταγράφων του υποδοχέα των ανδρογόνων σε ένα δείγμα RNA, όπου το εν λόγω κιτ περιλαμβάνει:
α) αντιδραστήρια ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων,
β) ένα σετ εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητών, το οποίο υβριδοποιείται στο AR-FL mRNA, όπου το εν λόγω ζεύγος AR-FL εκκινητών περιλαμβάνει έναν AR-FL εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CATCCTGCTC-3' (SEQ ID NO: 5), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-Τ CCCACAT CCT GCT CAAGAC-3' (SEQ ID NO: 6) και ένας ανάστροφο AR-FL εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAAAGTCCAC-3' (SEQ ID NO: 7), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TTCCGGAAAGTCCACGCT-3' (SEQ ID NO: 8),
γ) ένα ζεύγος εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητών, το οποίο υβριδοποιείται στο AR-V7 mRNA, όπου το εν λόγω ζεύγος AR-V7 εκκινητών περιλαμβάνει έναν AR-V7 εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TGGGAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 9), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-AGGGATGACTCTGGGAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 10) και έναν ανάστροφο AR-V7 εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-TCCAGACTAT-3' (SEQ ID NO: 11), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CAGGTTT CT CCAGACT AT CCACT Α-3' (SEQ ID NO: 12),
δ) ένα ζεύγος εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητών, το οποίο υβριδοποιείται στο AR-567es mRNA, όπου το εν λόγω ζεύγος AR-567es εκκινητών περιλαμβάνει έναν εμπρόσθιο AR-567es εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAGACAGCTT-3' (SEQ ID NO: 13), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GGAGAGAGACAGCTTGTACACGT -3' (SEQ ID NO: 14) και έναν ανάστροφο AR-567es εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-GAAAGTCCAC-3' (SEQ ID NO: 15), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-ΤΤ CCGGAAAGT CCACGCT -3' (SEQ ID NO: 16),
ε) ένα ζεύγος εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητών, το οποίο υβριδοποιείται στο AR-total mRNA, όπου το εν λόγω ζεύγος AR-total εκκινητών περιλαμβάνει έναν εμπρόσθιο εκκινητή AR-ολικού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GAGTGCCCTA-3’ (SEQ ID NO: 17), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-AGCAGAGTGCCCTATCCCA-3’ (SEQ ID NO: 18) και έναν ανάστροφο AR-total εκκινητή που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CTGGCAGTCT-3’ (SEQ ID NO: 19), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-TCCCTGGCAGTCTCCAAAC-3’ (SEQ ID NO: 20).
ζ) ανιχνευτές υβριδισμού για τον υβριδισμό σε κάθε AR-mRNA μετάγραφο, περιλαμβάνοντας:
• ένα ζεύγος ανιχνευτών AR-FL υβριδισμού, που περιλαμβάνει έναν δότη AR-FL ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CTCACCAAGC-3' (SEQ ID NO: 21), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-Τ ACCAGCT CACCAAGCT CCT GGA-FL-3' (SEQ ID NO: 22) και έναν δέκτη AR-FL ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-TGCAGCCTATTGC-3’ (SEQ ID NO: 23) και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-LC610-TCCGTGCAGCCTATTGCGAG-PH-3' (SEQ ID NO: 24),
• ένα ζεύγος ανιχνευτών AR-V7 υβριδισμού, που περιλαμβάνει έναν δότη AR-V7 ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-AATTGCAAGC-3’ (SEQ ID NO: 25), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- TTGGCAATTGCAAGCATCTCAAA-FL-3’ (SEQ ID NO: 26) και έναν δέκτη ΑR-V7ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GACCCTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 27) και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- LC640-T GACCAGACCCT GAAGAAAGGCT - ΡΗ-3’ (SEQ ID NO: 28),
ένα ζεύγος ανιχνευτών AR-567es υβριδισμού, που περιλαμβάνει έναν δότη AR-567es ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CAGGCAAGGC-3’ (SEQ ID NO: 29), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- CAATCAGGCAAGGCCTTGGC-FL-3’ (SEQ ID NO: 30) και έναν δέκτη AR-567es ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GACCACGTGT-3’ (SEQ ID NO: 31), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- LC670-
CACTT GACCACGT GT ACAAGCT GT CT-PH- 3’ (SEQ ID NO: 32),
ένα ζεύγος ανιχνευτών AR-total υβριδισμού, που περιλαμβάνει έναν δότη AR-ολικού ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-GTGTCAAAAG-3’ (SEQ ID NO: 33), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- CTTGTGTCAAAAGCGAAATGGGC-FL-3’ (SEQ ID NO: 34) και έναν δέκτη AR-total ανιχνευτή υβριδισμού που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-TGGATAGCTA-3’ (SEQ ID NO: 35), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-LC705-CCTGGATGGATAGCTACTCCGGAC-PH-3’ (SEQ ID NO: 36),
ή ανιχνευτές υδρόλυσης για την υβριδοποίηση του κάθε mRNA μεταγράψου του AR, περιλαμβάνοντας:
• Έναν ανιχνευτή AR-FL υδρολύσεως που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-CCGTGCAGCCTATT-3' (SEQ ID NO: 37), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5'-FI EX-CT CCT GGACT CCGT GCAGCCT ATT -BHQ 1 -3' (SEQ ID NO: 38)
• Έναν ανιχνευτή AR-V7 υδρολύσεως που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CCCTCTAGAGCCC-3’ (SEQ ID NO: 39), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- FAM-CCCT CT AGAGCCCT CATTTT GAAT GAG-BHQ 1 -3’ (SEQ ID NO: 40)
· Έναν ανιχνευτή AR56es υδρολύσεως που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-AATCAGGCAAGGCC-3’ (SEQ ID NO: 41), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- ΤΕΧ615-AATCAGGCAAGGCCTTGGCCCA -BHQ2-3’ (SEQ ID NO: 42)
· Έναν ανιχνευτή AR-total υδρολύσεως που περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’-CCTGGATGGATAGC-3’ (SEQ ID NO: 43), και κατά προτίμηση περιλαμβάνει την αλληλουχία 5’- CY5-CCTGGATGGAT AGCT ACT CCGGACC -BHQ2-3’ (SEQ ID NO: 44).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20190100343A GR1009872B (el) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | Πολλαπλη μεθοδος για τον ποσοτικο προσδιορισμο του μοτιβου εκφρασης των εναλλακτικων μεταγραφων του υποδοχεα των ανδρογονων σε ενα δειγμα |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20190100343A GR1009872B (el) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | Πολλαπλη μεθοδος για τον ποσοτικο προσδιορισμο του μοτιβου εκφρασης των εναλλακτικων μεταγραφων του υποδοχεα των ανδρογονων σε ενα δειγμα |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR1009872B true GR1009872B (el) | 2020-11-12 |
Family
ID=69646018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20190100343A GR1009872B (el) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | Πολλαπλη μεθοδος για τον ποσοτικο προσδιορισμο του μοτιβου εκφρασης των εναλλακτικων μεταγραφων του υποδοχεα των ανδρογονων σε ενα δειγμα |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| GR (1) | GR1009872B (el) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140271631A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Janssen Pharmaceuticals, NV | Assay for predictive biomarkers |
| US20170275673A1 (en) * | 2014-08-25 | 2017-09-28 | The Johns Hopkins University | Methods and compositions related to prostate cancer therapeutics |
-
2019
- 2019-08-08 GR GR20190100343A patent/GR1009872B/el active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140271631A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Janssen Pharmaceuticals, NV | Assay for predictive biomarkers |
| US20170275673A1 (en) * | 2014-08-25 | 2017-09-28 | The Johns Hopkins University | Methods and compositions related to prostate cancer therapeutics |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ALIX-PANABIÈRES CATHERINE; PANTEL KLAUS: "Abstracts from the 11th International Symposium on Minimal Residual Disease, 3–5 May 2018, Montpellier, France", PLOS BIOLOGY, RAPID SCIENCE PUBLISHERS, DORDRECHT, vol. 35, no. 3, 14 July 2018 (2018-07-14), Dordrecht, pages 167 - 217, XP036553771, ISSN: 0262-0898, DOI: 10.1007/s10585-018-9911-0 * |
| ARETI D. STRATI, MARTHA ZAVRIDOU, EVANGELOS BOURNAKIS, SOPHIA MASTORAKI, EVI S. LIANIDOU: "Expression pattern of androgen receptor (AR), splice variant 7 (AR-V7) and splice variant 567 (AR-567) in circulating tumor cells and paired plasma-derived exosomes in metastatic castration resistant prostate cancer", PROCEEDINGS OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH ANNUAL MEETING 2019, CANCER RESEARCH, vol. 79, 3 April 2019 (2019-04-03), pages Abstract Nr. 2290, XP055705677 * |
| ARETI STRATI, ZAVRIDOU MARTHA, BOURNAKIS EVANGELOS, MASTORAKI SOPHIA, LIANIDOU EVI: "Expression pattern of androgen receptors, AR-V7 and AR-567es , in circulating tumor cells and paired plasma-derived extracellular vesicles in metastatic castration resistant prostate cancer", ANALYST, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, UK, vol. 144, no. 22, 4 November 2019 (2019-11-04), UK, pages 6671 - 6680, XP055705673, ISSN: 0003-2654, DOI: 10.1039/C9AN00999J * |
| XICHUN LIU, ELISA LEDET, DONGYING LI, ARY DOTIWALA, ALLIE STEINBERGER, ALLISON FEIBUS, JIANZHUO LI, YANFENG QI, JONATHAN SILBERSTE: "A Whole Blood Assay for AR-V7 and AR v567es in Patients with Prostate Cancer", JOURNAL OF UROLOGY, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, BALTIMORE, MD, US, vol. 196, no. 6, 1 December 2016 (2016-12-01), BALTIMORE, MD, US, pages 1758 - 1763, XP055689970, ISSN: 0022-5347, DOI: 10.1016/j.juro.2016.06.095 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220073995A1 (en) | Method for quantification of pd-l1 expression | |
| US11279979B2 (en) | Method of determining PIK3CA mutational status in a sample | |
| JP4808365B2 (ja) | Ｐｃｒ法 | |
| Aerts et al. | A real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT–PCR) to detect breast carcinoma cells in peripheral blood | |
| US8039218B2 (en) | Detection of cancer cells in body fluids | |
| USRE44596E1 (en) | Method for the detection of cancer | |
| EP3303618B1 (en) | Methods of prostate cancer prognosis | |
| Miyamae et al. | Mutation detection of epidermal growth factor receptor and KRAS genes using the smart amplification process version 2 from formalin-fixed, paraffin-embedded lung cancer tissue | |
| Färkkilä et al. | FOXL2 402C> G mutation can be identified in the circulating tumor DNA of patients with adult-type granulosa cell tumor | |
| Zeka et al. | Circulating microRNA biomarkers for metastatic disease in neuroblastoma patients | |
| US20130143753A1 (en) | Methods for predicting outcome of breast cancer, and/or risk of relapse, response or survival of a patient suffering therefrom | |
| JP4968577B2 (ja) | サイトケラチン１９（ＣＫ１９）ｍＲＮＡの迅速測定法、並びにそのためのプライマー及びプローブ | |
| KR20160022017A (ko) | 재발 난소암 진단 또는 난소암 재발 예측용 mirna 마커 및 그 용도 | |
| CA2580473C (en) | Detection of cancer cells in body fluids | |
| EP3368684B1 (en) | Biomarker for breast cancer | |
| KR102600344B1 (ko) | Kras 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| Tran et al. | Short tandem repeat polymorphism and cancer risk: influence of laboratory analysis on epidemiologic findings | |
| GR1009872B (el) | Πολλαπλη μεθοδος για τον ποσοτικο προσδιορισμο του μοτιβου εκφρασης των εναλλακτικων μεταγραφων του υποδοχεα των ανδρογονων σε ενα δειγμα | |
| US20050037373A1 (en) | Assay for bcr/abl gene rearrangement | |
| KR102357260B1 (ko) | 마이크로rna를 이용한 당뇨병성 신경병증의 예측 및 진단 방법 및 이를 위한 키트 | |
| Salmoiraghi et al. | Development of new tools for molecular diagnosis of hematologic malignancies | |
| KR20210120737A (ko) | Pik3ca 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| WO2023180478A1 (en) | Method for detecting microsatellite instability in cancer patient | |
| AU2012201082A1 (en) | Detection of Cancer Cells in Body Fluids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PG | Patent granted |
Effective date: 20201215 |