FR3153159A1 - Identification de particules virales et de vésicules extracellulaires par des nanopores couplées à une détection optique - Google Patents

Abstract

Identification de particules virales et de vésicules extracellulaires par des nanopores couplées à une détection optique La présente invention concerne une méthode d’identification de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires à l’aide de membranes nanoporeuses couplées à une détection optique. Elle concerne également l’utilisation de cette méthode, en particulier pour identifier des particules virales et des vésicules extracellulaires à partir d'un échantillon biologique. Plus précisément, le transport de particules virales et de vésicules extracellulaires au travers des nanopores permet d'identifier le type de particule, grâce à son interaction spécifique avec le nanopore. Figure pour l'abrégé : aucune

Description

Identification de particules virales et de vésicules extracellulaires par des nanopores couplées à une détection optique

La présente invention concerne une méthode d’identification de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires à l’aide de membranes nanoporeuses couplées à une détection optique.

Elle concerne également l’utilisation de cette méthode, en particulier pour identifier des particules virales et des vésicules extracellulaires à partir d'un échantillon biologique. Plus précisément, le transport de particules virales et de vésicules extracellulaires au travers des nanopores permet d'identifier le type de particule, grâce à son interaction spécifique avec le nanopore.

Actuellement, l'identification rapide et précise des particules virales et des vésicules extracellulaires reste un objectif difficile à atteindre au niveau industriel, clinique mais aussi en recherche académique. Les tests disponibles dans le commerce ne répondent pas entièrement aux spécifications requises dans plusieurs domaines d'application : comme la recherche fondamentale (pour étudier les cycles viraux et les mécanismes de production des vésicules extracellulaires...), ou la bio-ingénierie industrielle (évaluation de la qualité et suivi du rendement de production de vecteurs viraux ou vésiculaires extracellulaires utilisés dans les vaccins ou la thérapie génique), et même dans le diagnostic clinique (par exemple le suivi en direct des niveaux de virus dans les échantillons de patients). Au moment de cette invention, un compromis doit être fait entre des techniques rapides peu précises et trop spécifiques, et donc incapables de détecter plusieurs types viraux (tests antigéniques), et des techniques coûteuses et chronophages (qPCR, ELISA) qui nécessitent des étapes intermédiaires complexes. Même si de multiples améliorations de ces méthodes sont proposées dans la littérature scientifique (J. Eid, M. Mougel, and M. Socol, “Advances in Continuous Microfluidics-Based Technologies for the Study of HIV Infection,”Viruses, vol. 12, no. 9, pp. 1–16, 2020; J. Denget al., “Rapid One-Step Detection of Viral Particles Using an Aptamer-Based Thermophoretic Assay,”J. Am. Chem. Soc., vol. 143, no. 19, pp. 7261–7266, May 2021), leur incapacité à détecter plusieurs types viraux dans un même échantillon reste problématique.

Les systèmes à base de nanopores offrent des capacités de détection à l’échelle de la molécule (ou de la particule) unique et en temps réel. De tels systèmes présentent également un intérêt croissant pour l'étude des propriétés des particules virales (L. Yang and T. Yamamoto, “Quantification of virus particles using nanopore-based resistive-pulse sensing techniques,” Front. Microbiol., vol. 7, pp. 1–7, 2016; A. Arima etal., “Selective detections of single-viruses using solid-state nanopores,” Sci. Rep., vol. 8, no. 1, pp. 1–7, 2018; L. Chazot-Franguiadakis etal., “Optical Quantification by Nanopores of Viruses, Extracellular Vesicles, and Nanoparticles,” Nano Lett., 2022; Z. D. Harms, L. Selzer, A. Zlotnick, and S. C. Jacobson, “Monitoring Assembly of Virus Capsids with Nanofluidic Devices,” ACS Nano, vol. 9, no. 9, pp. 9087–9096, 2015) et des vésicules extracellulaires (L. Chazot-Franguiadakis etal., “Optical Quantification by Nanopores of Viruses, Extracellular Vesicles, and Nanoparticles,” Nano Lett., 2022; S. L. N. Maas, J. De Vrij, and M. L. D. Broekman, “Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing,” J. Vis. Exp., vol. 92, pp. 1–7, Oct. 2014; R. Vogel etal., “A standardized method to determine the concentration of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing,” J. Extracell. Vesicles, vol. 5, no. 1, pp. 1–13, 2016; S. Ryuzaki etal., “Rapid Discrimination of Extracellular Vesicles by Shape Distribution Analysis,” Anal. Chem., vol. 93, no. 18, pp. 7037–7044, 2021). En effet, le faible diamètre et le rapport surface/volume élevé des nanopores permettent une détection fine des caractéristiques virales et des vésicules extracellulaires (A. Arima, M. Tsutsui, T. Washio, Y. Baba, and T. Kawai, “Solid-State Nanopore Platform Integrated with Machine Learning for Digital Diagnosis of Virus Infection,” Anal. Chem., vol. 93, no. 1, pp. 215–227, Jan. 2021).

Pour sonder la particule virale ou la vésicule extracellulaire dans son ensemble, la plupart des méthodes basées sur les nanopores reposent sur la détection de particules par forçage et détection électriques. Ces techniques, connues sous le nom de Resistive Pulse Sensing (RPS), sont basées sur l'analyse des changements de résistance en utilisant une constriction à l'échelle nanométrique. La RPS est une technique polyvalente qui peut être utilisée pour détecter des nanoparticules (M. Platt, G. R. Willmott, and G. U. Lee, “Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores,”Small, vol. 8, no. 15, pp. 2436–2444, Aug. 2012) ou des objets biologiques tels que l'ADN, des bactéries, des protéines, des virus et des vésicules extracellulaires (S. Howorka and Z. Siwy, “Nanopore analytics: Sensing of single molecules,” Chem. Soc. Rev., vol. 38, no. 8, pp. 2360–2384, Jul. 2009; J. A. Oukhaled, L. Bacri, M. Pastoriza-Gallego, J. M. Betton, and J. Pelta, “Sensing proteins through nanopores: Fundamental to applications,” ACS Chem. Biol., vol. 7, no. 12, pp. 1935–1949, Dec. 2012; D. H. Stoloff and M. Wanunu, “Recent trends in nanopores for biotechnology,” Curr. Opin. Biotechnol., vol. 24, no. 4, pp. 699–704, Aug. 2013; G. R. Willmott and B. G. Smith, “Modelling of Resistive Pulse Sensing: Flexible Methods for Submicron Particles,” ANZIAM J., vol. 55, no. 3, pp. 197–213, 2014). Plus précisément, les techniques de RPS utilisent un système composé de deux chambres remplies d’une solution d'électrolyte et reliées par un nanopore. En pratique, une tension est appliquée entre les deux côtés du pore, et les variations de courant ionique sont mesurées. Lorsqu'un objet traverse le pore, les ions de la solution d'électrolyte sont momentanément évacués du pore, ce qui se traduit par une chute du courant ionique, sous forme d'impulsion. Le signal mesuré contient une multitude d'informations représentant la forme (E. C. Yuskoet al., “Real-time shape approximation and fingerprinting of single proteins using a nanopore,”Nat. Nanotechnol., vol. 12, no. 4, pp. 360–367, Dec. 2016), le volume ( H. Yasakiet al., “Substantial Expansion of Detectable Size Range in Ionic Current Sensing through Pores by Using a Microfluidic Bridge Circuit,”J. Am. Chem. Soc., vol. 139, no. 40, pp. 14137–14142, Oct. 2017; A. Arima, M. Tsutsui, and M. Taniguchi, “Volume discrimination of nanoparticles via electrical trapping using nanopores,”J. Nanobiotechnology, vol. 17, no. 1, pp. 1–6, Mar. 2019; R. Vogelet al., “Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor,”Anal. Chem., vol. 83, no. 9, pp. 3499–3506, 2011), la masse (M. Tsutsui, K. Yokota, A. Arima, Y. He, and T. Kawai, “Solid-State Nanopore Time-of-Flight Mass Spectrometer,”ACS Sensors, vol. 4, no. 11, pp. 2974–2979, Nov. 2019) et la charge de surface des particules transportées (A. Sikora, A. G. Shard, and C. Minelli, “Size and ζ-Potential Measurement of Silica Nanoparticles in Serum Using Tunable Resistive Pulse Sensing,”Langmuir, vol. 32, no. 9, pp. 2216–2224, Mar. 2016; A. Arima, M. Tsutsui, and M. Taniguchi, “Discrimination of equi-sized nanoparticles by surface charge state using low-aspect-ratio pore sensors,”Appl. Phys. Lett., vol. 104, no. 16, pp. 1–4, Apr. 2014; N. Arjmandi, W. Van Roy, L. Lagae, and G. Borghs, “Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores,”Anal. Chem., vol. 84, no. 20, pp. 8490–8496, Oct. 2012). La validité du signal de détection est généralement évaluée par comparaison avec plusieurs modèles physiques (I. W. Leong, M. Tsutsui, S. Murayama, Y. He, and M. Taniguchi, “Electroosmosis-Driven Nanofluidic Diodes,”J. Phys. Chem. B, vol. 124, no. 32, pp. 7086–7092, Aug. 2020).

Les applications de la RPS pour étudier les propriétés des particules virales et des vésicules extracellulaires sont nombreuses. En particulier, la RPS a été utilisée pour mesurer : la taille (en connaissant les caractéristiques du pore) (L. Yang and T. Yamamoto, “Quantification of virus particles using nanopore-based resistive-pulse sensing techniques,”Front. Microbiol., vol. 7, pp. 1–7, 2016; R. Vogelet al., “Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor,”Anal. Chem., vol. 83, no. 9, pp. 3499–3506, 2011; Z. D. Harms, D. G. Haywood, A. R. Kneller, L. Selzer, A. Zlotnick, and S. C. Jacobson, “Single-particle electrophoresis in nanochannels,”Anal. Chem., vol. 87, no. 1, pp. 699–705, 2015; W. Anderson, D. Kozak, V. A. Coleman, Å. K. Jämting, and M. Trau, “A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and resolution analysis of polydisperse particle size distributions,”J. Colloid Interface Sci., vol. 405, pp. 322–330, Sep. 2013), potentiel zêta (N. Arjmandi, W. Van Roy, L. Lagae, and G. Borghs, “Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores,”Anal. Chem., vol. 84, no. 20, pp. 8490–8496, Oct. 2012) et la mobilité électrophorétique ( Z. D. Harms, D. G. Haywood, A. R. Kneller, L. Selzer, A. Zlotnick, and S. C. Jacobson, “Single-particle electrophoresis in nanochannels,”Anal. Chem., vol. 87, no. 1, pp. 699–705, 2015) ainsi que la concentration en particules (L. Yang and T. Yamamoto, “Quantification of virus particles using nanopore-based resistive-pulse sensing techniques,”Front. Microbiol., vol. 7, pp. 1–7, 2016; R. W. DeBlois and R. K. Wesley, “Sizes and concentrations of several type C oncornaviruses and bacteriophage T2 by the resistive-pulse technique.,”J. Virol., vol. 23, no. 2, pp. 227–233, 1977). La RPS permet également de sonder qualitativement la mécanique des particules virales ( A. Darvishet al., “Mechanical characterization of HIV-1 with a solid-state nanopore sensor,”Electrophoresis, vol. 40, no. 5, pp. 776–783, Mar. 2019; B. I. Karawdeniyaet al., “Adeno-associated virus characterization for cargo discrimination through nanopore responsiveness,”Nanoscale, vol. 12, no. 46, pp. 23721–23731, Dec. 2020) et la dynamique d'assemblage des capsides virales ( Z. D. Harms, L. Selzer, A. Zlotnick, and S. C. Jacobson, “Monitoring Assembly of Virus Capsids with Nanofluidic Devices,”ACS Nano, vol. 9, no. 9, pp. 9087–9096, 2015). Enfin, l'identification de types viraux, voire de sous-types viraux, par RPS représente un défi important. La capacité de distinguer des particules qui ont des caractéristiques similaires nécessite de détecter des éléments uniques dans le signal électrique pour chaque type de particule. Une stratégie possible, qui a été employée par Alrima eta l., consiste à coupler le système de détection avec des techniques d'analyse de données computationnelles (par exemple Deep Learning) (A. Arimaet al., “Selective detections of single-viruses using solid-state nanopores,”Sci. Rep., vol. 8, no. 1, pp. 1–7, 2018 ; A. Arimaet al., “Digital Pathology Platform for Respiratory Tract Infection Diagnosis via Multiplex Single-Particle Detections,”ACS Sensors, vol. 5, no. 11, pp. 3398–3403, 2020). En utilisant ce type d’analyse, Alrima etal .ont pu construire un modèle de classification, qui est fonction des caractéristiques du signal électrique pour un type de virus donné (A. Arimaet al., “Selective detections of single-viruses using solid-state nanopores,”Sci. Rep., vol. 8, no. 1, pp. 1–7, 2018; A. Arimaet al., “Digital Pathology Platform for Respiratory Tract Infection Diagnosis via Multiplex Single-Particle Detections,”ACS Sensors, vol. 5, no. 11, pp. 3398–3403, 2020).

Néanmoins, globalement la technique RPS présente des inconvénients majeurs. Premièrement, en termes de spécificité de détection puisque tout objet traversant le pore sera détecté (y compris les particules non pertinentes), car il n'y a pas de marquage spécifique d'un type d'objet. Par conséquent, la mesure ne fournit pas d'informations directes sur la nature générale de l'objet. Deuxièmement, la technique RPS repose sur l'utilisation d'un seul nanopore (pas de parallélisation du système), ce qui constitue une contrainte à la fois pour la sensibilité en concentration de la mesure (limite inférieure de concentration de 10⁷particules/mL (R. W. DeBlois and R. K. Wesley, “Sizes and concentrations of several type C oncornaviruses and bacteriophage T2 by the resistive-pulse technique.,”J. Virol., vol. 23, no. 2, pp. 227–233, 1977)) mais aussi pour la durée de vie de l'expérience, le pore pouvant se boucher très rapidement et donc empêcher la mesure (A. Arimaet al., “Selective detections of single-viruses using solid-state nanopores,”Sci. Rep., vol. 8, no. 1, pp. 1–7, 2018). Cette obstruction est irréversible, il faut donc remplacer le nanopore. Dernièrement, la taille du pore doit être proche de celle de la particule à détecter, sinon il n'y aura pas de signal (L. Yang and T. Yamamoto, “Quantification of virus particles using nanopore-based resistive-pulse sensing techniques,”Front. Microbiol., vol. 7, pp. 1–7, 2016). Ceci suggère la nécessité d'adapter le nanopore au diamètre des particules. L'ajustement de la taille des nanopores peut également être réalisé à l'aide de systèmes de Tunable RPS, constitués de nanopores élastomériques et modulables dont il est possible d'ajuster le diamètre des poresin situ. Néanmoins, de tels systèmes sont plus complexes et la limite de détection en taille est élevée (autour de 80 nm, L. Yang and T. Yamamoto, “Quantification of virus particles using nanopore-based resistive-pulse sensing techniques,”Front. Microbiol., vol. 7, pp. 1–7, 2016; R. Vogelet al., “A standardized method to determine the concentration of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing,”J. Extracell. Vesicles, vol. 5, no. 1, pp. 1–13, 2016; R. Vogelet al., “Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor,”Anal. Chem., vol. 83, no. 9, pp. 3499–3506, 2011), alors que certaines particules virales ou vésicules extracellulaires peuvent atteindre 30 nm de diamètre ou moins.

Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis au point une méthode utilisant une membrane nanoporeuse pouvant être fonctionnalisée, combinée à un système de détection optique, permettant d'identifier les particules virales et les vésicules extracellulaires marquées par fluorescence. La force et l'originalité de cette méthode réside dans sa capacité à détecter et identifier une large gamme de particules virales (enveloppées ou non, à ADN ou ARN, et de toutes tailles) et de vésicules extracellulaires directement à partir d'un échantillon biologique, avec une haute sensibilité en concentration. Les particules virales et les vésicules extracellulaires sont détectées dans leur intégralité, c'est-à-dire que la particule entière est détectée, et pas seulement le matériel génétique comme dans les tests PCR (Polymerase Chain Rection), ou une protéine spécifique comme dans les tests ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). La méthode décrite dans la présente invention ne nécessite pas d’étapes intermédiaires de purification ou d’amplification. Par rapport aux méthodes existantes, la méthode objet de la présente invention permet d'identifier des particules virales et des vésicules extracellulaires sans qu'il soit nécessaire que le test soit conçu ou dédié à un type/ sous-type de particules virales ou de vésicules extracellulaires particulier.

De plus, contrairement à la technique RPS, la méthode décrite dans la présente invention présente une spécificité de détection modulable. En effet, dans la méthode RPS, les particules ne sont pas marquées, ce qui constitue un inconvénient majeur lors de l'étude d'échantillons complexes, car tout objet présent en solution (débris cellulaires, ADN, protéines, etc.) sera détecté. Cela perturbe grandement la mesure avec de nombreux signaux parasites. En revanche, la méthode selon la présente invention implique un marquage fluorescent des particules à détecter. Ce marquage est réalisé avant le début de la mesure, et sa spécificité de détection peut être modulée, puisqu'il est possible de marquer une particule virale ou une vésicule extracellulaire précise (grâce à une combinaison anticorps-fluorophore) ou un groupe de particules. Ce marquage représente un premier niveau de détection, permettant de distinguer des groupes de particules du reste des objets biologiques qui font toujours partie d'un échantillon complexe.

Par ailleurs, la technique RPS repose sur l'utilisation d'un seul nanopore, alors que la membrane nanoporeuse décrite dans le cadre de la présente invention présente l'avantage considérable d'avoir un grand nombre de pores en parallèle (environ 10 000 fois plus élevé que le RPS). Avoir un grand nombre de nanopores en parallèle augmente considérablement les statistiques de mesure, ce qui se traduit par une sensibilité de concentration beaucoup plus élevée (limite inférieure de concentration de 10³-10⁵particules/mL). De plus, une parallélisation élevée évite également le phénomène irréversible d’obstruction de nanopores, qui se produit fréquemment avec la technique RPS et empêche la mesure. Enfin, la méthode ne nécessite pas que le nanopore soit de taille proche du diamètre des particules. Par conséquent, pour différents types de particules virales ou de vésicules extracellulaires, le même diamètre de nanopore peut être utilisé.

Avec la méthode selon la présente invention, l’identification des particules virales et des vésicules extracellulaires est plus simple, plus rapide (minutes versus heures pour la qPCR par exemple) et précise.

Les inventeurs de la présente invention ont mis au point une méthode utilisant des membranes nanoporeuses pour accroitre la sensibilité de détection des virus. En mesurant la fréquence de passage à travers la membrane nanoporeuse en fonction d’un paramètre de contrôle (pression, concentration en particules virales ou vésicules extracellulaires, …), il est possible d’extraire les paramètres physico-chimiques d’interaction de la particule virale ou de la vésicule extracellulaire avec le pore. Ces paramètres étant uniques pour un type/sous-type viral (ou de vésicule extracellulaire) donné, leur mesure permet la constitution d’une signature spécifique et d’une base de données permettant l’identification.

Ainsi, la présente invention concerne une méthode d’identification de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires comprenant :

1. le marquage des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires présentes dans un échantillon biologique à l’aide d’un marqueur fluorescent ;
2. le passage dudit échantillon comprenant les particules virales et/ou les vésicules extracellulaires marquées à travers une membrane nanoporeuse ;
3. la mesure du transport desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires à travers lesdites membranes nanoporeuses par détection optique en fonction d’au moins un paramètre de contrôle ; et
4. l’extraction de paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques caractéristiques du transport desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires à partir d’un modèle physique reliant le transport au paramètre de contrôle.

La présente invention concerne également l’utilisation de la méthode selon l’invention pour identifier le type et/ou sous-type viral présent chez un patient, la qualité de la production de vecteurs viraux, ou l’identification de pathologies humaines, végétales ou animales dans des échantillons biologiques dans le cadre d’une veille sanitaire, ou pour l’identification de particules virales dans des échantillons agroalimentaires.

La présente invention concerne aussi l’utilisation de la méthode selon invention pour identifier le type et/ou sous-type de vésicules extracellulaires chez un patient ou la qualité de la production de vecteurs vésiculaires.

Description détaillée

Tel que susmentionné, la présente invention concerne une méthode d’identification de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires comprenant :

a. le marquage des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires présentes dans un échantillon biologique à l’aide d’un marqueur fluorescent ;

b. le passage dudit échantillon comprenant les particules virales et/ou les vésicules extracellulaires marquées à travers une membrane nanoporeuse ;

c. la mesure du transport desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires à travers lesdites membranes nanoporeuses par détection optique en fonction d’au moins un paramètre de contrôle ; et

d. l’extraction de paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques caractéristiques du transport desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires à partir d’un modèle physique reliant le transport au paramètre de contrôle.

Par « identification », on entend le processus d'association aux particules virales et/ou vésicules extracellulaires détectées à leur(s) type(s) et/ou sous-type(s) correspondant(s).

Par « particules virales », on entend des entités biologiques apparentées à la classe des virus. Cela inclut les virus de tous types (enveloppés, non enveloppés, virus à ADN, virus à ARN, …) et comprend également tous les dérivés, c'est-à-dire les virus obtenus par des moyens autres qu'une infection naturelle. On entend par là les virus produits en laboratoire (sous forme complète ou partielle, comme des particules pseudo-virales ou des assemblages de protéines virales), ainsi que les vecteurs viraux et la bioproduction de virus pour les processus de vaccination. Les virus varient en taille (généralement environ 20 à 400 nm de diamètre), en géométrie ainsi qu'en propriétés de surface et mécaniques.

Dans un mode de réalisation selon l’invention, les particules virales sont choisies parmi des particules virales enveloppées ou non, pouvant contenir de l’ADN ou de l’ARN.

Par « type viral », on entend l'espèce du virus telle qu'établie dans la classification officielle (Comité international de taxonomie des virus). Par exemple, le virus de la grippe A (Influenza A) correspond à un type viral.

Par « sous-type viral », on entend le sérotype du virus tel qu'établi dans la classification officielle (Comité international de taxonomie des virus). Par exemple, le virus de la grippe A(H1N1) ou A(H3N2) correspondent tous deux à un sous-type viral du virus de la grippe A (Influenza A).

Par « vésicules extracellulaires », on entend des particules biologiques constituées par une bicouche lipidique qui sont naturellement libérées par presque tous les types cellulaires. Les vésicules extracellulaires sont une classe complexe et hétérogène de nanoparticules biologiques présentes dans de nombreux fluides biologiques, dont par exemple l'urine et le sang. Les vésicules extracellulaires sont de taille très dispersée, allant généralement de 30 à 300 nm de diamètre. La taille, les propriétés morphologiques, mécaniques et biochimiques des vésicules extracellulaires sont très variables. Les vésicules extracellulaires et leurs voies de synthèse sont également utilisées par les tumeurs et les maladies infectieuses pour faciliter leur propagation et échapper au système immunitaire. Dans le cadre de la présente invention, on inclut les vésicules extracellulaires sécrétées naturellement par les cellules, celles produites en laboratoire, ainsi que les vecteurs de macromolécules bioactives.

Dans un mode de réalisation, les vésicules extracellulaires sont choisies parmi des vésicules produites par des cellules saines, cancéreuses, ou parmi des vésicules issues de bio-production non cellulaire.

Par « type de vésicule extracellulaire », on entend une population de vésicules extracellulaires provenant d'une/d’un même lignée/type cellulaire. Les vésicules extracellulaires sont en effet généralement classées en types selon leur origine cellulaire et la présence d'une infection virale ou de tumeurs dans le milieu cellulaire.

Par « sous-type de vésicules extracellulaires », on entend les différentes populations de vésicules extracellulaires que l'on peut trouver au sein d'un même type de vésicules extracellulaires (c'est-à-dire des vésicules extracellulaires issues de la même lignée cellulaire). Le sous-type est défini en fonction de la taille, des propriétés morphologiques, mécaniques et biochimiques.

Par « échantillon biologique », on entend un échantillon issu d’un environnement biologique.

Par « environnement biologique », on entend les conditions et composants spécifiques du milieu dans lequel peuvent être stockées des particules biologiques telles que des particules virales ou des vésicules extracellulaires. Généralement, il s'agit d'un milieu complexe comprenant un tampon, un milieu de culture cellulaire, un surnageant cellulaire, un milieu réel (échantillon d'eau, échantillon agroalimentaire), des échantillons biologiques d'organismes vivants (y compris des échantillons de patients).

L’échantillon biologique peut être par exemple un échantillon prélevé sur un patient, mais aussi un échantillon issu d’un procédé de bioproduction (en laboratoire ou dans une production industrielle), ou encore un échantillon prélevé dans l’environnement et en particulier des eaux fluviales, ou des échantillons agroalimentaires.

Par « marqueur fluorescent » on entend le sens habituel pour un homme du métier. En particulier, les exemples suivants peuvent être cités : marqueurs fluorescents membranaires (de la bicouche lipidique), marqueurs du matériel génétique, marqueurs liés à une protéine, marqueurs se liant à une protéine spécifique, …. Des exemples sont donnés dans le Tableau 5 de la partie expérimentale. On peut citer par exemple :

- YOYO-1 (Molecular Probes) qui est capable de pénétrer dans la capside virale et de marquer le matériel génétique viral,

-SYTO-13 (Molecular Probes) qui est capable de pénétrer à travers l'enveloppe virale et de marquer le matériel génétique viral,

- DiO (Vybrant Cell Labelling, Molecular Probes), qui est une carbocyanine lipophile qui émet une faible fluorescence dans l'eau mais qui est hautement fluorescente et photostable lorsqu'elle est incorporée dans des membranes ou des environnements lipidiques,

- la GFP, fusionnée à la position C-terminale de la protéine structurale Gag.

Le marquage peut être effectué par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple incubation pendant une durée variable entre l’échantillon et le fluorophore choisi, ou incorporation du fluorophore au moment de la bioproduction et permet une détection spécifique.

Par « spécificité de détection », on entend la capacité d'une mesure à détecter avec précision un type de particule particulier, tout en excluant ou en minimisant les interférences provenant d'autres types de particules ou de bruits indésirables. Une mesure spécifique est donc capable de fournir des résultats précis et fiables pour le type de particule spécifique (dans la présente invention, des vésicules extracellulaires ou des particules virales) étudié, sans être influencé de manière significative par d'autres particules ou sources d'erreur (par exemple dans ce cas, la présence de débris cellulaires, bactéries, contamination, …)

Dans le cadre de la présente invention, la spécificité de détection peut être modulée.

Par « niveau de spécificité de détection modulable », on entend que le niveau de spécificité de détection de la mesure peut être modulé. Dans la présente invention, la spécificité de détection est assurée par plusieurs facteurs, notamment la présence de la membrane nanoporeuse qui peut être fonctionnalisée et l'utilisation de marquages fluorescents. L'utilisation d'une membrane nanoporeuse fonctionnalisée avec une taille de pores de l'ordre de quelques dizaines à centaines de nanomètres (par exemple des nanopores de 50 à 400 nm de diamètre) agit comme un filtre et empêche le passage d'éléments indésirables à travers les pores (par exemple des bactéries ou de gros débris cellulaires). De plus, le marquage fluorescent permet de marquer un groupe précis de particules (particules virales et/ou vésicules extracellulaires), avec une précision qui peut être ajustée puisqu'il est également possible d'utiliser un marquage très spécifique comme par exemple une combinaison anticorps-fluorophore pour marquer un type ou sous-type précis de particule virale et/ou de vésicule extracellulaire.

Par « membrane nanoporeuse », on entend des membranes solides organiques ou inorganiques présentant des pores à l'échelle nanométrique.

Dans le cadre de la présente invention, les membranes comprennent plusieurs pores en parallèle, par exemple entre 10⁶et 10⁹pores/cm². Les membranes possèdent des pores avec des diamètres pouvant aller entre 10 et 600 nm.

Dans un mode de réalisation, la membrane nanoporeuse est fonctionnalisée.

Par « membrane nanoporeuse fonctionnalisée », on entend des membranes solides organiques ou inorganiques dont les pores de taille nanométrique sont greffés par des polymères synthétiques.

Par « polymères électrogreffés », on entend des polymères qui contiennent au moins une fonction électroactive permettant le greffage du polymère sur une surface. Plus particulièrement, les polymères électrogreffés sont choisis parmi les « polymères poly(2-alkyl-2-oxazoline) » bien connus dans la technique.

Notamment par « alkyle », on entend une chaîne alkyle comprenant en particulier entre 1 et 4 carbones. La poly (2-méthyl-2-oxazoline), la poly(2-éthyl-2-oxazoline), la poly(2-isopropyl-2-oxazoline) et la poly(2-n-propyl-2-oxazoline) peuvent être citées comme exemples.

En particulier, les polymères selon l'invention comprennent entre 2 et 1000 monomères, plus particulièrement entre 10 et 800.

Dans un mode de réalisation, lesdits les polymères sont liés à des sondes électro actives, en particulier de type diazonium. Ceci permet un greffage électrochimique de ces polymères sur la surface nanoporeuse.

Le procédé d'électrogreffage de polymères sur membrane nanoporeuse fonctionnalisée est tel que décrit dans la demande de brevet WO2022195059A1.

Les membranes nanoporeuses peuvent également être fonctionnalisées par greffage non covalent avec en particulier du Pluronic © ou de la poly(vinylpyrrolidone), de la méthylcellulose, de l’albumine, ou du sérum fœtal bovin.

Par « détection », on entend le processus d'établissement de la présence ou de l'absence de particules virales ou de vésicules extracellulaires dans un échantillon. En particulier, la détection s’opère en temps réel.

Par « détection en temps réel », on entend que le transport de particules (particules virales ou vésicules extracellulaires) à travers les nanopores est observé en temps réel au niveau d'une particule unique.

Dans le cadre de la présente invention, la méthode est capable de détecter un virus et/ou une vésicule extracellulaire dans un échantillon biologique, mais également une mélange virus et/ou de vésicules extracellulaires présents dans un même échantillon.

Tel que susmentionné, la mesure du transport desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires à travers lesdites membranes nanoporeuses s’effectue par détection optique en fonction d’au moins un paramètre de contrôle.

En particulier, la microscopie Zero Mode Waveguide (intensification du champ électromagnétique au voisinage d'un nanopore recouvert d'un film métallique) peut être utilisée. Ce système optique extrêmement sensible, permet de détecter en temps réel et au niveau d’un pore unique le transport de particules uniques fluorescentes.

Par « paramètre de contrôle » on entend un paramètre contrôlable par l’expérimentateur et en particulier la concentration des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires, la pression, la durée des événements de transport, l’intensité des évènements de transport, la trajectoire des évènements de transports, la température, la salinité et le pH.

Dans le cadre de la présente invention, les termes « transport », « translocation » et « passage » sont utilisés indifféremment pour le/la transport/passage/translocation des particules virales/vésicules extracellulaires à travers la membrane nanoporeuse.

Par « intensité des évènements de transport » on entend le profil spatio-temporel de l’intensité lumineuse des évènements. Dans le cas d’un évènement, c’est-à-dire le passage d’une particule virale ou d’une vésicule extracellulaire marquée en fluorescence, l’intensité lumineuse est extraite à partir du signal brut.

Par « trajectoire des évènements de transport » on entend l’évolution des coordonnées spatiales des évènements en fonction du temps de l’intensité des évènements de transports. Une fois un évènement identifié, les coordonnées de son centre, par exemple, peuvent être relevées au cours du temps.

Il s’en suit l’extraction de paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques caractéristiques du transport desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires à partir d’un modèle physique reliant le transport au paramètre de contrôle.

Par « extraction de paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques » on entend le fait de quantifier, les paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques à l’aide d’un modèle physique donnant le transport en fonction d’un ou plusieurs paramètres de contrôle en particulier par ajustement à ce modèle physique. Les paramètres physico-chimiques et/ou dynamique correspondent en particulier à l’affinité, aux taux d’association ou de dissociation des particules virales et/ou vésicules extracellulaires entre elles ou avec la surface du nanopore

Le « modèle physique » ou « modèle d'identification » correspond au modèle de transport utilisé pour extraire des paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques spécifiques grâce à la mesure du transport de particules virales ou de vésicules extracellulaires à travers la membrane nanoporeuse. En particulier un modèle décrivant un phénomène de bouchon de particules dans le nanopore reliant la fréquence de passage des particules à leurs paramètres d’interactions physico-chimiques et/ou dynamiques peut être utilisé.

Par « mesure du transport », on entend les courbes réalisées lors du transport de particules virales ou de vésicules extracellulaires à travers les membranes nanoporeuses. En particulier, ces courbes correspondent aux courbes de fréquence de translocation en fonction de la pression appliquée sur les courbes du système, aux courbes de fréquence de translocation en fonction de la concentration de particules ou vésicules, ainsi qu'aux courbes d'intensité d'événements en fonction du temps.

En particulier, les paramètres physico-chimiques sont extraits de la « mesure de transport » à l'aide de l'ajustement avec le « modèle d'identification ». Ces paramètres de transport constituent la carte d'identité de la particule (particule virale ou vésicule extracellulaire), puisqu'ils permettent de remonter au type ou sous-type associé de la particule grâce à la méthode décrite dans la présente invention.

En particulier, l'utilisation du modèle d'identification permet d'extraire ces paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques spécifiques à une particule. Ces paramètres sont liés à la définition d'un domaine unique pour une particule virale ou un type ou sous-type de particule extracellulaire dans la base de données d'identification.

Par « échantillon de référence », on entend un échantillon biologique de particules virales ou de vésicules extracellulaires d'un type ou sous-type précis et ayant servi à construire la base de données décrite dans le cadre de la présente invention.

En effet, en particulier, les paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires sont comparés à une base de données comprenant la signature spécifique de chaque type ou sous-type viral et/ou de chaque type ou sous-type de vésicule extracellulaire afin d’identifier lesdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires présentes dans l’échantillon.

Plus particulièrement, la signature spécifique de chaque type viral et/ou de chaque type de vésicule extracellulaire permettant l’identification des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires marquées est obtenue en procédant aux étapes a) à d) avec des échantillons comprenant des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires connues.

Par « base de données », on entend une collection structurée de différentes particules virales ou vésicules extracellulaires, où des paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques spécifiques ont été mesurés pour chaque type/sous-type de particule ou vésicule, permettant de construire un domaine distinct pour chaque type ou sous-type précis de particule ou vésicule dans la base de données globale. Les éléments composant cette base de données correspondent à des échantillons de référence d'un type ou sous-type précis de particules virales ou de vésicules extracellulaires pour lesquels des paramètres de transport spécifiques ont été mesurés selon la méthode décrite dans la présente invention.

Tel que susmentionné la présente invention concerne également l’utilisation de la méthode selon l’invention pour identifier le type et/ou sous-type viral présent chez un patient, la qualité de la production de vecteurs viraux, l’identification de pathologies humaines, végétales ou animales dans des échantillons biologiques dans le cadre d’une veille sanitaire, ou pour l’identification de particules virales dans des échantillons agroalimentaires. La présente invention concerne également l’utilisation de la méthode selon l’invention pour identifier le type et/ou sous-type de vésicules extracellulaires chez un patient ou la qualité de la production de vecteurs vésiculaires.

Ainsi, la présente méthode trouve application dans le domaine médical, en particulier dans le domaine clinique ou du diagnostic, dans le domaine de la bioproduction, en particulier dans la fabrication de vaccins et les thérapies géniques, dans le domaine de la veille sanitaire des pathologies humaines, végétales ou animales, ainsi que dans le domaine agroalimentaire pour identifier la présence de particules virales.

L’invention est illustrée par les figures et exemples suivants.

Figures

FIG. 1: Configuration du Zero Mode Waveguide (guide d'ondes en mode zéro) pour la translocation de particules virales ou de vésicules extracellulaires à travers des membranes nanoporeuses fonctionnalisées. La chambre cis est reliée à un contrôleur de pression et contient les particules virales ou les vésicules extracellulaires marquées par fluorescence. Lors de l'application d’une différence de pression, entre les deux chambres les particules sont transportées à travers le nanopore dans la chambre trans. Un laser est dirigé du côté trans et les particules sont illuminées dès qu'elles traversent la région du champ évanescent à l'extrémité du pore. L'effet Zero Mode Waveguide consiste en une amplification du signal fluorescent au voisinage de la couche d'or. Une fois qu'elles ont quitté le nanopore, les particules marquées par fluorescence deviennent floues (elles sortent du focus) et sont blanchies.

FIG. 2: A. Evolution de la fréquence de translocation en fonction de la pression pour les particules de HIV (Gag-GFP) à différentes concentrations. f est la fréquence de translocation divisée par un préfacteur, k. P est la pression appliquée divisée par une pression critique Pc.

B. Évolution de la fréquence de translocation en fonction de la concentration virale pour différents exemples de types viraux. La pression est fixée à 8 mbar. C. Evolution de la fréquence de translocation en fonction de la pression pour les vésicules extracellulaires (cellules HeLa (pas de production de virus)) à différentes concentrations. Pour A., B. et C. Les lignes continues sont des exemples d'ajustements par un modèle d'identification (ici le modèle de bouchon (ou modèle de jamming)). Membrane nanoporeuse avec un diamètre de pores de 200 nm. Les erreurs expérimentales sont l'erreur type de la moyenne, et le nombre de répétition est supérieur à 8 pour chaque série expérimentale.

FIG. 3: A. Évolution de la fréquence de translocation en fonction de la pression pour les particules de HIV (Gag-GFP, 70.10⁵particules/mL) pour différentes conditions expérimentales : membrane nanoporeuse avec un tampon classique (avec 5mM NaCl), membrane nanoporeuse fonctionnalisée (greffée de poly(2-méthyl-2-oxazoline) de degré de polymérisation 387) avec un tampon classique (avec 5mM NaCl) et membrane nanoporeuse avec un tampon contenant plus de sel (avec 150mM NaCl). f est la fréquence de translocation divisée par un préfacteur, k. P est la pression appliquée divisée par une pression critique Pc.

B. Evolution de la fréquence de translocation en fonction de la pression pour les vésicules extracellulaires (cellules HeLa (pas de production de virus), 30.10⁵particules/mL) pour différentes conditions expérimentales : membrane nanoporeuse avec un tampon classique (avec 5mM NaCl) ou un tampon contenant plus de sel (avec 150 mM NaCl). Pour A., B. Les lignes continues sont des exemples d'ajustements par un modèle d'identification (ici le modèle de bouchon). Membrane nanoporeuse avec un diamètre de pores de 200 nm. Les erreurs expérimentales sont l'erreur type de la moyenne, et le nombre de répétition est supérieur à 8 pour chaque série expérimentale.

FIG. 4: Diagramme de Voronoi qui représente plusieurs domaines, chacun associé à un type de particule virale. Une couleur est associée à chaque domaine, dont les bordures sont représentées en noir. Certains points correspondent au siège de chaque domaine viral, c'est-à-dire aux paramètres moyens physico-chimiques qui sont associés à un type viral précis. Un point particulier correspond à un « échantillon inconnu » correctement affecté au domaine de la grippe (Influenza, InfV).

Définitions

Par « échantillon inconnu ou particule inconnue », on entend un « échantillon biologique de particule virale ou de vésicule extracellulaire » où le type ou le sous-type de la particule virale et/ou de la vésicule extracellulaire présente dans l'échantillon n'est pas connu.

Par « spécificité d'identification », on entend la probabilité d'obtenir un test négatif si la particule recherchée n'est pas présente (en d'autres termes, c'est la probabilité d'obtenir un test négatif chez des personnes non malades). En particulier, il peut être donné par la formule suivante : Spécificité = (Vrai Négatif)/(Vrai Négatif + Faux Positif) comme cela sera détaillé dans la partie expérimentale.

Par « sensibilité à la concentration », on entend la limite de détection du système c'est-à-dire la plus petite concentration (de particules virales ou de vésicules extracellulaires) détectable et avec laquelle il est possible de travailler.

Par « sensibilité d’identification », on entend la probabilité que le test attribue correctement la particule inconnue à la bonne zone (en d’autres termes c’est la probabilité que le test soit positif si la maladie est présente). En particulier, elle peut être donnée par la formule suivante : Sensibilité = (Vrai Positif)/(Vrai Positif + Faux Négatif), comme cela sera détaillé dans la partie expérimentale.

Par « précision », on entend la probabilité correspondant au nombre d’échantillons inconnus qui ont été correctement attribués au bon type/sous-type de particules virales ou de vésicules extracellulaires parmi tous les échantillons inconnus qui ont été attribués à ce type/sous-type de particules virales ou de type/sous-type de vésicules extracellulaires (en d'autres termes, cela correspond au nombre d'échantillons qui ont été correctement classés comme positifs parmi tous les positifs.) En particulier, il peut être donné par la formule suivante : Précision=(Vrai Positif)/(Vrai Positif+Faux Positif), comme cela sera détaillé dans la partie expérimentale.

Par « score F1 », on entend la moyenne harmonique de la précision et de la sensibilité d’identification, qui est une mesure de la performance de la capacité de classification du modèle. En particulier, il peut être donné par la formule suivante : score F1= 2 (Précision x Sensibilité)/(Précision + Sensibilité), comme cela sera détaillé dans la partie expérimentale.

Exemples

Exemple de préparation de membrane nanoporeuse selon l'invention

Les membranes nanoporeuses utilisées sont des membranes en polycarbonate track-etched de Whatman Nucleopore (GE Healthcare). Le polycarbonate a été choisi en raison de sa faible interaction avec les protéines. Ces membranes nanoporeuses disponibles dans le commerce sont constituées d'une couche de polycarbonate de 6 à 10 µm d'épaisseur et possèdent des nanopores cylindriques de diamètre et de densité compris respectivement entre 50-400 nm et 1-6 10⁸pores/cm².

Les spécifications des membranes sont résumées dans le Tableau 1.

Diamètre nominal des pores (nm) (+0%,-20%)	50	80	100	200	400
Densité nominale des pores (pores/cm2) ( 15%)	6.108	4.108	4.108	3.108	1.108
Épaisseur nominale (μm) ( 10%)	6	6	6	10	10
Débit d'eau nominal à 10 psi (mL/min/cm2)	0.4	0.6	2.5	10	33

Tableau 1: Spécification des membranes track-etched (source Whatman, GE Healthcare) (“Membrane GE Polycarbonate Track Etch ( PCTE )”,Ge Water Process Technol., pp. 1–2, 2010).

Pour visualiser la translocation des particules virales et des vésicules extracellulaires à travers les nanopores, une couche d'or d'une épaisseur de 50 nm a été déposée sur le dessus de la membrane grâce à un évaporateur en salle blanche. Le processus d'évaporation a été effectué à une pression inférieure à 10^-6Pa et l'or a été déposé à une vitesse de 0,1 nm/s. La vitesse et l'épaisseur du dépôt ont été contrôlées par une balance à quartz. Les membranes recouvertes d'or ont été caractérisées en utilisant à la fois la microscopie électronique à balayage (SEM) et la microscopie à force atomique (AFM) (P. J. Kolbecket al., “Thermally Switchable Nanogate Based on Polymer Phase Transition,”Nano Lett., 2023). Les diamètres mesurés au MEB sont regroupés dans le Tableau 2 (L. Chazot-Franguiadakiset al., “Optical Quantification by Nanopores of Viruses, Extracellular Vesicles, and Nanoparticles,”Nano Lett., 2022; P. J. Kolbecket al., “Thermally Switchable Nanogate Based on Polymer Phase Transition,”Nano Lett., 2023; T. Augeret al., “Zero-mode waveguide detection of flow-driven DNA translocation through nanopores,”Phys. Rev. Lett., vol. 113, no. 2, pp. 1–5, 2014).

Diamètre nominal du pore (nm) (+0%,-20%) (Whatman, GE Healthcare) (avant dépôt d'or)	Diamètre mesuré par SEM (nm) (après dépôt d'or)
50	42±0.5
80	88±0.7
100	90±0.7
200	220±1.8
400	395±15

Tableau 2: Diamètres de pores déterminés par mesures au MEB avec une moyenne sur plus de 200 pores.

Pour augmenter la sensibilité des mesures, il est avantageux de travailler avec des membranes nanoporeuses fonctionnalisées. Par exemple, différents types de polymères ont été utilisés : des poly(2-alkyl-2-oxazolines) de deux types (poly(méthyl-2-oxazolines) et poly(2-n-propyl-2-oxazolines) greffés électrochimiquement. La synthèse de ces polymères (avec différents degrés de polymérisation variant entre 2 et 1000, plus particulièrement entre 10 et 800) et leur greffage sont décrits dans la demande de brevet WO2022195059, qui détaille précisément leur préparation. Brièvement, le greffage de polymère est réalisé au-dessus de la couche d'or de la membrane nanoporeuse par électro-greffage (connexion entre les polymères et la surface d'or via un couplage azoïque).

Exemple de membrane nanoporeuse couplée à un système optique selon l'invention

Montage expérimental

Le montage expérimental consiste en une détection optique et un système de contrôle de la pression pour induire le transport de particules virales et de vésicules extracellulaires à travers une membrane nanoporeuse et a déjà été décrit (L. Chazot-Franguiadakiset al., “Optical Quantification by Nanopores of Viruses, Extracellular Vesicles, and Nanoparticles,”Nano Lett., 2022; T. Augeret al., “Zero-mode waveguide detection of flow-driven DNA translocation through nanopores,”Phys. Rev. Lett., vol. 113, no. 2, pp. 1–5, 2014; T. Augeret al., “Zero-mode waveguide detection of DNA translocation through FIB-organised arrays of engineered nanopores,”Microelectron. Eng., vol. 187–188, pp. 90–94, 2018) (FIG. 1). Plus précisément, le dispositif est constitué de deux chambres séparées par une membrane nanoporeuse. Le système optique est constitué d'un microscope à épifluorescence conventionnel (Axiovert 200, ZEISS), sur lequel est monté un objectif à immersion dans l'eau (ZEISS C-Apochromat, Korr M27). L'objectif est équipé d'une correction chromatique, et a une ouverture numérique de 1,2 et un grossissement de 63×. Le microscope comporte également une boîte à filtres (combinant plusieurs paires de filtres d'émission/excitation et un miroir dichroïque). Le laser (Cobolt blues 50, Cobolt AB) émet à une longueur d'onde de 473 nm et possède une puissance de 50 mW, ce qui le rend adapté aux mesures de fluorescence sur des biomolécules. Le laser suit un chemin optique, et est notamment élargi par un télescope, de sorte que le faisceau soit parallèle à la sortie de l'objectif. Enfin, le microscope est connecté à une caméra EMCDD, (Electron Multiplying Charged Coupled Device (Andor, iXon+)). Typiquement, dans les expériences, une fréquence d'image de 33 Hz est utilisée (avec 512x512 pixels). De plus, la caméra est refroidie à -60°C, ce qui est indispensable pour limiter le bruit thermique. L'ensemble de l'installation, y compris le laser, le trajet lumineux, le microscope à fluorescence, le système à deux chambres et la caméra, est situé sur une table optique stable à coussin d'air.

Le cœur du montage expérimental est constitué de deux chambres reliées par la membrane nanoporeuse fonctionnalisée, comme le montre laFIG. 1:

-La chambre inférieure (chambre trans), est constituée d'un anneau de téflon sur lequel est collée une lame de verre (0,17 mm d'épaisseur). La colle utilisée est toujours une colle silicone biocompatible (Silcomet JS 533 Rouge, Loctite).

-La chambre haute (chambre cis) est constituée d'un bouchon sur lequel se trouve un trou où la membrane nanoporeuse fonctionnalisée est collée. La partie supérieure du bouchon sert de réservoir dans lequel la solution de particule virale ou de vésicule extracellulaire est déposée. La chambre supérieure est également reliée à un contrôleur de pression (MFCS-FLex, Fluigent). Le contrôleur de pression comprend quatre voies dont trois vont de 0 mbar à 1 bar avec une précision de 1 mbar et une voie plus précise de 0 mbar à 69 mbar avec une précision de 0,1 mbar.

L'ensemble des chambres trans et cis est placé au-dessus de l'objectif. Cet ensemble peut être déplacé dans les trois directions de l'espace à l'aide d'un plateau tournant, avec une précision micrométrique dans les deux directions X et Y.

Pour une expérience typique, des particules virales marquées par fluorescence ou des vésicules extracellulaires sont placées dans la chambre cis, et en appliquant une différence de pression entre les deux chambres, elles sont transportées à travers la membrane nanoporeuse fonctionnalisée dans la chambre trans. La membrane nanoporeuse est éclairée par un faisceau laser côté trans, et les particules sont observées en sortie des pores. La détection est basée sur l'effet Zero-Mode Waveguide qui consiste en une amplification du signal de fluorescence au voisinage de la couche d'or ( L. Chazot-Franguiadakiset al., “Optical Quantification by Nanopores of Viruses, Extracellular Vesicles, and Nanoparticles,”Nano Lett., 2022 ; , P. J. Kolbecket al., “Thermally Switchable Nanogate Based on Polymer Phase Transition,”Nano Lett., 2023; T. Augeret al., “Zero-mode waveguide detection of flow-driven DNA translocation through nanopores,”Phys. Rev. Lett., vol. 113, no. 2, pp. 1–5, 2014; T. Auger, “Translocation de biopolymères à travers des pores naturels ou artificiels,” Paris Cité, 2016 ; B. Molcretteet al., “Experimental study of a nanoscale translocation ratchet,”Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 119, no. 30, pp. 1–10, Jul. 2022; N. Klughammer and C. Dekker, “Palladium zero-mode waveguides for optical single-molecule detection with nanopores,”Nanotechnology, vol. 32, no. 18, pp. 1–14, Feb. 2021).

Cet effet permet de travailler à l'échelle de la particule unique. Par conséquent, la présence de la couche d'or est essentielle pour favoriser l'effet Zero Mode Waveguide, mais l'or agit également comme un miroir, bloquant la vue des particules fluorescentes en amont du nanopore, de sorte que les seules particules visibles sont celles qui sortent des pores (FIG. 1). La fluorescence des particules diminue en raison du blanchiment et de la défocalisation lorsque les particules s'éloignent de la membrane. Enfin, le champ de vision sur la membrane nanoporeuse est de 125x125μm²(mesuré à l'aide d'une règle micrométrique Thorlabs R1L3S2P). Pour une densité poreuse comprise entre 1.10⁸et 6.10⁸pores/cm²(selon le diamètre des pores, voir Tableau 1), le nombre de pores est estimé approximativement entre 15 600 (±2 500) et 93 700 (±15 000) pores en parallèle sur le champ d'observation. Ce nombre élevé de pores fournit de bonnes statistiques et donc une grande sensibilité à la concentration pour mesurer la fréquence moyenne de translocation des particules virales et des vésicules extracellulaires. C'est un énorme avantage de la méthode décrite ici par rapport à celle de la technique RPS.

Exemple de préparation d'échantillons de particules virales et de vésicules extracellulaires selon l'invention

Des échantillons de particules virales et de vésicules extracellulaires ont été obtenus grâce à la courtoisie de divers laboratoires de recherche en virologie. Brièvement, des particules virales ont été obtenues par expression cellulaire de protéines virales, processus de transfection de plasmide ou culture de cellules virales. Des vésicules extracellulaires ont été récoltées à partir du milieu de culture de cellules HeLa, NIH3T3 ou 293THEK produisant ou non des particules virales. Des exemples de types et de sous-types de particules virales testés sont résumés dans le Tableau 3, tandis que des exemples de vésicules extracellulaires testées sont résumés dans le Tableau 4.

Type viral	Sous-type viral	Production
Virus adéno-associé (AAV)	AAV-8	Transfection de plasmide
	AAV-9
Adénovirus (AdV)	AdV-5	Infection cellulaire
Virus de l'hépatite B (HBV)	HBV (capside Cp183)	Expression cellulaire des protéines virales
	HBV (non enveloppé complet)	Infection cellulaire
Virus de l'immunodéficience humaine (HIV)	Gag-GFP	Expression cellulaire des protéines virales
	Gag-GFP	Expression cellulaire des protéines virales
	Particule semblable à un virus (VLP, pour Virus Like Particle)	Expression cellulaire de protéines virales
Virus de l'herpès humain (HSV)	HSV-1	Infection cellulaire
Virus de la grippe (InfV)	A(H1N1) humain	Infection cellulaire
	A(H3N2) humain
Virus de la rougeole (MeV)	Vaccin MeV	Production de vaccins
Virus de la leucémie murine (MLV)	MLV complet	Expression cellulaire des protéines virales
	Particule semblable à un virus (VLP)	Expression cellulaire des protéines virales
Sars-Cov-2 (SC2)	Particule semblable à un virus (VLP)	Expression cellulaire de protéines virales
	Particule apparentée au virus (VLP) + protéines d'enveloppe

Tableau 3: Exemples de types viraux et sous-types utilisés dans cette méthode.

Vésicules extracellulaires (EVs) provenant de cellules utilisées pour la production de particules virales	EVs de cellules HeLa utilisées pour la production de HIV (Gag-GFP)	Récolte dans le milieu de culture cellulaire
	EVs de cellules NIH3T3 utilisées pour la production de MLV (VLP)
	EVs de cellules 293THEK utilisées pour la production de SC2 (VLP)
Vésicules extracellulaires (EVs) de cellules non utilisées pour la production de particules virales	EVs de cellules HeLa (pas de production de virus)
	EVs de cellules NIH3T3 (pas de production de virus)
	EVs de cellules 293THEK (pas de production de virus)

Tableau 4: Exemple de types de vésicules extracellulaires (VE) utilisées dans cette méthode.

Globalement, ces échantillons sont des échantillons biologiques complexes prélevés dans un milieu biologique non purifié (par exemple un surnageant cellulaire) sans étapes intermédiaires de purification. Par ailleurs, des tests ont également été réalisés sur de l'eau prélevée dans le Rhône par exemple (les échantillons collectés ont été filtrés à travers des pores de 450 nm avant de réaliser l'expérience).

Conditions expérimentales

Typiquement, les expériences sont réalisées en milieu tamponné (à pH fixe). Le tampon utilisé est un tampon classique, tampon Tris-EDTA : composé de tris(hydroxyméthyl)aminométhane potassium (Tris-KCl) 10 mM, et d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) 1 mM. Une fois mélangé, le pH est ajusté à 7,5 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 M (Sigma Aldrich). Il est ensuite filtré sur une membrane en nylon Whatman (diamètre des pores 0,2 µm), pour éviter la présence d'impuretés. Le tampon est stocké à 4°C.

Marquage par fluorescence

Pour visualiser les particules virales ou les vésicules extracellulaires émergeant de la membrane nanoporeuse fonctionnalisée par ZMW, les particules doivent être marquées par fluorescence. Différentes stratégies sont possibles, selon la cible du marqueur fluorescent. Par exemple, quatre types de marquages ont été utilisés. Ils ciblent respectivement : le matériel génétique (ADN, ARN) à l'intérieur d'une capside virale ou à travers une enveloppe lipidique, l'enveloppe lipidique elle-même, ou sont inhérents à la production de particules, comme le montre le Tableau 5. Les différents marqueurs sont choisis pour avoir des longueurs d'onde d'excitation et d'émission compatibles avec le montage expérimental. De plus, les marqueurs fluorescents utilisés sont des marqueurs passifs qui n'interagissent pas avec les nanopores et n'altèrent pas la translocation des particules virales et des vésicules extracellulaires.

Cible du marquage	Matériel génétique (ADN, ARN) (à travers la capside virale)	Matériel génétique (ADN, ARN) (à travers l'enveloppe lipidique)	Enveloppe lipidique	Marquage inhérent à la production
Marquage fluorescent	YOYO-1 ( )	SYTO-13 ( )	DiO ( )	GFP ( )
Type de particule biologique	Virus non enveloppés	Virus enveloppés	Virus enveloppés + Vésicules extracellulaires	Tous

Tableau 5: Aperçu des différents marquages fluorescents disponibles pour les particules virales et les vésicules extracellulaires.

Marquage YOYO-1

YOYO-1 (Molecular Probes) est capable de pénétrer dans la capside virale et de marquer le matériel génétique viral. Il a été utilisé pour marquer des virus non enveloppés (par exemple AAV, HBV et AdV) (L. Chazot-Franguiadakiset al., “Optical Quantification by Nanopores of Viruses, Extracellular Vesicles, and Nanoparticles,”Nano Lett., 2022). L'objectif est d'obtenir la plus forte émission de fluorescence possible, en saturant les molécules d'ADN avec YOYO-1. Par exemple, le même protocole a été utilisé pour tous les types de particules virales et consiste à ajouter 0,7 μL de YOYO-1 (1 mM) directement à 1 μL de solution virale. La solution est laissée à incuber pendant 10 min à température ambiante, après quoi elle peut être rediluée selon la concentration requise pour l'expérience.

Marquage SYTO-13

SYTO-13 (Molecular Probes) est capable de pénétrer à travers l'enveloppe virale et de marquer le matériel génétique viral. Il a été utilisé pour marquer des particules virales enveloppées (par exemple HIV, HSV, MLV, MeV, SC2,…). Par exemple, le même protocole a été utilisé pour tous les types de particules virales et consiste à ajouter 0,5 μL de SYTO-13 (5 mM) directement à 1 μL de solution virale. La solution est laissée à incuber pendant 10 min à température ambiante, après quoi elle peut être rediluée selon la concentration requise pour l'expérience.

Marquage DiO

Dans les cas où le matériel génétique est inaccessible ou absent, il est possible de marquer par fluorescence l'enveloppe lipidique des particules. Cela se fait à l'aide de DiO (Vybrant Cell Labelling, Molecular Probes), qui est une carbocyanine lipophile qui émet une faible fluorescence dans l'eau mais qui est hautement fluorescente et photostable lorsqu'elle est incorporée dans des membranes ou des environnements lipidiques. Le marquage de vésicules extracellulaires et de particules virales enveloppées (par exemple HIV, MLV, etc.) a déjà été réalisé avec ce type de fluorophore (L. Chazot-Franguiadakiset al., “Optical Quantification by Nanopores of Viruses, Extracellular Vesicles, and Nanoparticles,”Nano Lett., 2022). Par exemple, le protocole utilisé pour marquer les particules virales enveloppées ou vésicules extracellulaires, correspond à un protocole classique de marquage d'enveloppe lipidique et consiste à ajouter 0,5 μL de DiO (0,1 mM) à une solution contenant 1 μL de vésicules ou de virus. L'ensemble de la solution est incubé pendant 15 min à 37°C (dans un bain sec). Cette solution peut ensuite être rediluée en fonction de la concentration requise pour l'expérience.

Marquage GFP

Le fluorophore peut être incorporé directement au moment de la production, comme dans le cas de HIV et de MLV, où le marquage fluorescent est réalisé à l'aide de la GFP, fusionnée à la position C-terminale de la protéine structurale Gag (J. Eid, “Etude du relargage du VIH-1 en temps réel à l’échelle de la cellule unique par la Viro-fluidique,” Montpellier, 2022 ; S. Nydegger, M. Foti, A. Derdowski, P. Spearman, and M. Thali, “HIV-1 egress is gated through late endosomal membranes,”Traffic, vol. 4, no. 12, pp. 902–910, Dec. 2003).

Exemple d'utilisation de système nanoporeux couplé à une détection optique selon l'invention

Pour une expérience typique, des particules virales marquées par fluorescence ou des vésicules extracellulaires sont placées dans la chambre cis, et en appliquant une différence de pression entre les deux chambres, elles sont transportées à travers la membrane dans la chambre trans. Plus précisément, après avoir déposé une goutte d'eau sur l'objectif, la chambre trans (bague Téflon + surface en verre) est placée sur la platine au contact de l'objectif et remplie de 500 µL de tampon Tris-EDTA. La cavité interne du bouchon (chambre cis) est remplie de la solution contenant l'échantillon biologique d'intérêt. La capacité minimale de la chambre est d'environ 1 μL tandis que la capacité maximale de la chambre est d'environ 1000 μL. Les volumes et concentrations exacts utilisés varient selon l'expérience. Le bouchon (chambre cis) est vissé sur le support relié au contrôleur de pression et repose sur la chambre trans. La membrane (côté trans) est éclairée par un faisceau laser, et les particules sont observées en sortie des pores. La détection est basée sur l'effet Zero-Mode Waveguide qui consiste en une amplification du signal de fluorescence au voisinage de la couche d'or.

A cquisition des données

L'acquisition des données et le choix des paramètres sont effectués à l'aide du logiciel Andor Solis, qui est connecté à la caméra. Comme mentionné précédemment, la caméra dispose d'un système de refroidissement intégré, permettant de prendre toutes les mesures à -60°C, réduisant ainsi le bruit thermique. De plus, il est possible de régler la valeur de gain correspondant au taux d'amplification du signal du système, qui est choisi à 300.

Un événement correspond à la translocation complète d'une particule virale ou d'une vésicule extracellulaire à travers un nanopore. Dans les expériences, le but est d'évaluer l'évolution de la fréquence de translocation en fonction de la différence de pression appliquée au système, ou de la concentration d'objets dans le système. Les expériences correspondent à des mesures de particules uniques, basées sur la détection d'événements isolés et leur quantification pendant la période d'acquisition. Les séquences d'images sont acquises avec la caméra, et la résolution, le nombre d'images et l'intervalle de temps entre chaque image sont définis. Typiquement, le mode utilisé est un mode d'affichage en temps réel, avec une résolution d'image de 512 x 512 pixels sur 125 x 125 µm², et une fréquence d'acquisition de 33 Hz. Les séquences sont typiquement de 250 images, correspondant à un film de 7,6 s. Quatre séquences sont exécutées successivement, afin d'augmenter les statistiques. Enfin, la résolution temporelle peut être améliorée en augmentant le binning et en réduisant la zone observée. En adaptant ces paramètres (256x256 pixels sur 62,5x62,5 μm²avec un binning fixé à 2), il est possible d'augmenter la fréquence d'acquisition du système de détection jusqu'à 112 Hz. De plus, il est également possible de suivre l'évolution de l'intensité de chaque événement individuel en fonction du temps.

Fréquence de translocation en fonction de la pression

Une fois l'échantillon biologique chargé dans la chambre cis, une série de films couvrant une gamme de pressions est produite, du minimum (typiquement 20 mbar pour un diamètre de pore de 50 nm et 0,1 mbar pour un diamètre de pore de 400 nm) au maximum (typiquement 80 mbar pour un diamètre de pore de 50 nm et 2 mbar pour un diamètre de pore de 400 nm). Les valeurs des pressions minimale et maximale, ainsi que les intervalles entre chaque mesure, varient selon le diamètre de pore considéré. De plus, typiquement il est recommandé d'attendre 3 min avant d'acquérir le premier point, et généralement 1 min entre chaque nouveau point afin de permettre à la pression de se stabiliser. Pour chaque point, à une pression donnée, 4 films successifs sont réalisés. Pour un même bouchon (chambre cis), deux séquences sur deux zones différentes sont aussi généralement acquises pour augmenter les statistiques.

Fréquence de translocation en fonction de la concentration en particules virales ou vésicules extracellulaires

Pour ce type de mesure, la valeur de la pression est fixe. Initialement, la concentration dans le bouchon (chambre cis) est minimale, puis progressivement augmentée. Plus précisément, pour chaque concentration, 4 films sont réalisés sur une première zone, puis un changement de zone sur la membrane permet de refaire 4 films. Une fois qu'une concentration a été mesurée, un volume de la solution de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires peut être ajoutée dans la chambre cis pour obtenir une nouvelle concentration. Après homogénéisation du contenu du bouchon, on le laisse s'équilibrer pendant 3 min, avant de commencer une nouvelle acquisition. Cette procédure est répétée autant de fois qu'il y a de concentrations différentes.

Intensité de l'événement en fonction du temps

Pour ce type de mesure, la pression et la concentration en particules sont fixes. Chaque intensité d'événement individuel dans les vidéos peut être analysée au fil du temps. Typiquement, l'intensité normalisée de l'événement est exprimée par ,avec I(t) l'intensité de l'événement dans le temps et I_maxl'intensité maximale de l'événement. Il est alors possible d'ajuster la courbe obtenue par un modèle et d'extraire des paramètres sur le signal d'intensité. Par exemple, un ajustement par une exponentielle décroissante( peut être utilisé.

A nalyse d'image

Une fois les mesures effectuées, les données sont analysées en comptant le nombre d'événements film par film. Par exemple, la méthode la plus simple pour détecter et compter des événements dans une séquence d'images est la détection manuelle à l'œil. Pour faciliter la détection des événements, plusieurs opérations sont effectuées sur la séquence à analyser à l'aide du logiciel Image J :

- A partir de la séquence initiale, la fonction Z-project permet de moyenner toutes les images dans le temps, pour obtenir l'intensité moyenne par pixel. Le résultat est une image contenant une valeur de bruit moyenne pour chaque pixel, compte tenu des éléments statiques.

- L'image résultante est ensuite soustraite de la séquence d'images initiale. Cette soustraction élimine les éléments parasites fixes (défauts de membrane, objets collés) lors de l'acquisition, et réduit le bruit.

De plus, il est également possible d'utiliser un programme dédié à la détection automatique d'événements. Un algorithme automatisé pour suivre et quantifier les événements de translocation a été utilisé. Le programme est écrit avec Matlab et utilise en partie des fonctions déjà disponibles dans Matlab. Brièvement, cela consiste à utiliser plusieurs filtres pour traiter l'image (filtre gaussien, filtre de wiener, …) puis à suivre les événements.

Enfin, à partir du nombre d'événements obtenus lors de l'analyse d'image, on calcule la fréquence de translocation correspondante selon la formule suivante :

Avec N, le nombre d'événements, f_acq, la fréquence d'acquisition (f_acq= 33 Hz), σ la densité poreuse (σ = 1-6.10⁸pores/cm², voir Tableau 1), S le champ d'observation (S = 125 × 125 μm²).

La normalisation permet de travailler avec la fréquence de translocation plutôt qu'avec le nombre d'événements ce qui permet de comparer les résultats obtenus entre différentes tailles de pores. En effet, des membranes ayant des diamètres de pores différents n'ont pas la même densité de pores (voir Tableau 1).

Exemple d'analyse de données et de résultats pour l'identification de particules virales et de vésicules extracellulaires selon l'invention

La présente invention concerne l'identification de particules virales et de vésicules extracellulaires sur la base de leur interaction spécifique avec le nanopore lors du transport. En mesurant la fréquence de translocation à travers la membrane nanoporeuse en fonction d'un paramètre de contrôle (pression, concentration en particules), ainsi que l'intensité de l'événement en fonction du temps, il est possible d'extraire des paramètres de transport (ou physico-chimiques) d'une particule donnée (particule virale ou vésicule extracellulaire) en interaction avec le nanopore, grâce au modèle d'identification. Cet ensemble de paramètres étant spécifique à un type de particule donné, sa mesure permet la constitution d'une signature spécifique et donc d'une base de données d'identification.

Construction de la base de données d'identification

La base de données d'identification est constituée par la collecte de mesures expérimentales de transport à partir d'échantillons de référence. Ces données sont ensuite analysées pour extraire, à l'aide d'un modèle physique, des paramètres de transport (ou physico-chimiques) propres à chaque type ou sous-type de vésicules virales et extracellulaires. Typiquement, une fois les paramètres mesurés pour l'ensemble des particules composant la base de données initiale décrite dans la présente invention (voir Tableaux 3 et 4), des domaines spécifiques sont associés à chaque type/sous-type viral (ou type/sous-type de vésicules extracellulaires) au sein d'un espace commun à tous les types viraux (ou types de vésicules extracellulaires). Cette représentation constitue la base de données nécessaire à l'identification des particules inconnues, comme cela sera décrit ultérieurement.

Collecte de mesures de référence

Pour un échantillon de référence correspondant à chaque type/sous-type viral (ou chaque type/sous-type de vésicule extracellulaire), plusieurs mesures expérimentales sont réalisées et seront détaillées ci-après. Pour toutes ces expériences, des membranes nanoporeuses ou des membranes nanoporeuses fonctionnalisées sont utilisées.

-Courbes fréquence de translocation en fonction de la pression à une concentration de particules fixe.

Au moins, quatre courbes sont réalisées, chacune à une concentration fixe de particules virales (ou vésicules extracellulaires) et la plage de pression varie en fonction du diamètre des pores (voir Tableau 6). Par exemple, pour des pores de 200 nm, la pression peut varier de 0 à 8 mbar par pas de 0,2 mbar, puis 0,5 mbar et 1 mbar. Pour chaque courbe, chaque point de pression est mesuré quatre fois de suite. Chaque courbe est également exécutée au minimum 2 fois (sur deux zones d'observation différentes), soit un nombre total de répétitions supérieur à 8 pour chaque point.

Diamètre des pores (nm)	Plage de pression (mbar)
50	0-500
80	0-400
200	0-50
400	0-20

Tableau 6 : Plage de pression généralement utilisée dans les expériences de fréquence de translocation en fonction de la pression.

-Courbe de fréquence de translocation en fonction de la concentration en particules à une pression fixe.

Pour ce type de mesure, la valeur de pression est fixée à une pression importante liée au diamètre des nanopores (par exemple 8 mbar pour des pores de 200 nm ou 2 mbar pour des pores de 400 nm). Initialement, la concentration dans le bouchon (chambre cis) est minimale, puis progressivement augmentée. La gamme de concentration utilisée variait de 10³particules/mL à 10⁹particules/mL selon le type de particules. Pour chaque concentration, 4 films sont réalisés sur une première zone, puis un changement de zone sur la membrane permet de refaire 4 films. Le nombre total de répétitions est donc supérieur à 8 pour chaque point.

Des exemples de courbes de la fréquence de translocation en fonction de la pression et de fréquence de translocation en fonction de la concentration en particules sont donnés pour les particules virales et les vésicules extracellulaires dans laFIG. 2.

Autres conditions expérimentales

Plusieurs essais ont été effectués pour tester des changements dans les conditions expérimentales (y compris le type de milieu ou de membrane). Notamment, des expériences ont été réalisées en changeant le milieu tampon de référence (Tris-EDTA) utilisé (initialement à 5mM de NaCl) en y ajoutant directement du sel, pour aboutir à une solution finale extra-salée à 150 mM de NaCl. Dans ce cas, comme auparavant, le transport de particules virales ou de vésicules extracellulaires à travers des membranes nanoporeuses peut être suivi. Des exemples de courbes de fréquence de translocation en fonction de la pression sont illustrés dans laFIG. 3.

Par ailleurs, des membranes nanoporeuses fonctionnalisées ont également été utilisées, notamment des membranes fonctionnalisées avec de la poly(2-méthyl-2-oxazoline). Les membranes nanoporeuses sont utilisées de la même manière qu'elles soient fonctionnalisées ou non et dans les mêmes conditions expérimentales. Par exemple, des poly(2-méthyl-2-oxazolines) de degré de polymérisation de 387 ont été synthétisés puis greffés sur une membrane nanoporeuse de 200 nm de diamètre de pores. Plus de précisions sur la synthèse, la caractérisation et le greffage de ces polymères sont décrites dans la demande de brevet WO2022195059. Un exemple de transport de particules virales à travers cette membrane nanoporeuse fonctionnalisée est également donné dans laFIG. 3.

Analyse des données : extraction des paramètres

Une fois les données expérimentales des échantillons de référence générées, l'idée est d'extraire un ensemble de paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques spécifiques à chaque type/sous-type viral (ou type/sous-type de vésicule extracellulaire).

Par exemple, pour modéliser les courbes obtenues expérimentalement (fréquence/pression et fréquence/concentration), un modèle physique minimal a été développé. Il est appelé « modèle de bouchon (ou de jamming)». Il décrit l’accumulation de particules à l’intérieur du nanopore observée expérimentalement. Il est basé sur les observations expérimentales suivantes :

- Existence d'une pression critique en dessous de laquelle aucune particule virale ou vésicule extracellulaire ne sort du pore. Cette pression critique (Pc) est supposée être corrélée à l'adhérence de la particule à l'intérieur du pore (pression minimale requise pour empêcher l'attachement des particules à la surface du pore).

- Aux hautes pressions, nous avons observé la présence d'un plateau pour la fréquence (pour les courbes fréquence/pression), qui est dotant plus prononcé que les concentrations en particules virales ou en vésicules extracellulaires sont élevées.

-L'augmentation de la concentration de particules virales ou de vésicules extracellulaires s'accompagne d'une diminution de la fréquence de translocation de particules virales ou de vésicules extracellulaires et d'une saturation plus importante, qui constituait un signe distinctif d'un phénomène de bouchon.

Globalement, ces observations sont cohérentes avec la présence d'un phénomène de bouchon lié au fort confinement des particules virales ou des vésicules extracellulaires sous flux. Le modèle physique proposé décrit le phénomène comme une agrégation sous écoulement. Par conséquent, la durée totale de translocation d'un virus à travers un nanopore peut être décomposée en deux durées, (temps entre l'entrée de deux particules virales ou vésicules extracellulaires consécutives dans le pore) et (temps entre la sortie de deux particules virales ou vésicules extracellulaires consécutives du pore).

-Pour la partie entrée dans le pore, il a été fait l’hypothèse qu'une particule virale ou une vésicule extracellulaire ne peut entrer dans le nanopore que si une autre particule virale ou vésicule extracellulaire qui occupait déjà le pore y a laissé sa place. Cela dépend de la probabilité que le pore soit occupé par une autre particule virale ou une vésicule extracellulaire (probabilité P_particle). Une deuxième hypothèse est que le temps pour amener une particule virale ou une vésicule extracellulaire à l'entrée des pores par advection est négligeable. Ensuite, en supposant que l'équilibre entre les particules virales libres ou vésicules extracellulaires en solution et celles associées au bouchon est donné par l'équilibre de Langmuir, la durée peut être exprimée par :

avec , le taux de dissociation caractéristique auquel la particule virale ou la vésicule extracellulaire se détache du bouchon,, et la constante de dissociation entre la particule virale ou la vésicule extracellulaire et le bouchon.

-Pour la partie sortie dans le pore, la première hypothèse est qu'en régime stationnaire, à l'intérieur du nanopore, la concentration de particules virales ou vésicules extracellulaires, C_n(x, t), peut être décrite comme une compétition entre l'adhésion des particules à la surface des pores et l'advection par le flux. En s'appuyant sur l'équation de conservation de la particule virale ou de la vésicule extracellulaire : ; avec v, la vitesse du flux et , le taux caractéristique auquel une particule virale ou une vésicule extracellulaire adhère au canal central du nanopore, il est possible d'accéder à la concentration de particules virales ou des vésicules extracellulaires dans le nanopore :

avec C, la concentration de particules virales ou vésicules extracellulaires dans la chambre cis (à x=0).

Ensuite, en utilisant la loi de Hagen-Poisseuille dans une géométrie cylindrique (comme celle du pore), il est possible d'introduire le paramètre expérimental de la différence de pression entre les deux chambres ; avec , où R et L sont respectivement le rayon et la longueur du pore, et η, la viscosité de l'eau.

Par conséquent, le temps entre la sortie de deux particules virales ou vésicules extracellulaires consécutives ( ) peut être exprimé comme :

en introduisant un préfacteur et une pression critique .

Enfin, la fréquence de translocation d'une particule virale ou d'une vésicule extracellulaire à travers un nanopore peut s'écrire :

Toutes les données expérimentales (courbes de fréquence/pression et fréquence/concentration) pour différentes particules virales (ou vésicules extracellulaires) ont été ajustées avec succès par ce modèle de bouchon, comme on peut le voir par les lignes continues représentées dans les exemples de laFIG. 2et de laFIG. 3. Plus précisément, pour ajuster les données avec le modèle de bouchon, Matlab a été utilisé. Des scripts d'analyse ont été développés et des outils intégrés tels que Curve Fitting Tool ont également été utilisés.

Typiquement, trois paramètres de transport (ou physico-chimiques) d'intérêt spécifiques à chaque type/sous-type de particule virale ou de vésicule extracellulaire sont extraits (P _c , lié à l'interaction des particules virales ou des vésicules extracellulaires avec la surface des pores et , liés à l'interaction des particules virales ou des vésicules extracellulaires entre elles dans le bouchon). La procédure est la suivante :

-Les courbes fréquence/pression sont ajustées en leurs premiers points (avant l'apparition de la saturation) par la partie suivante du modèle : . Cela permet d'extraire le paramètre de pression critique,P _c . Ce processus est effectué pour toutes les courbes fréquence/pression et leP _c final est obtenu en faisant la moyenne sur tous lesP _c trouvés par ajustement.

-Les courbes fréquence/concentration sont ajustées par l'ensemble du modèle de bouchon (en considérant le terme comme une constante puisque la pression est fixe). Le montage permet d'accéder aux deux paramètres et .

Des exemples de paramètres de transport (ou physico-chimiques) extraits pour différents échantillons de référence de types de particules virales et de vésicules extracellulaires sont donnés dans le Tableau 7. Des expériences similaires ont été menées sur des sous-types.

Type de virus	P c (mbar)		( M)
AAV	0.3 0.05	2	42
AdV-5	0.6 0.1	38	170 20
HBV	0.3 0.05	25	290
HIV (VLP)	0.6 0.1	940	43
HSV-1	1.0 0.2	22	33
InfV	0.7 0.2	970	19
MLV	0.6 0.1	10	110
SC2 (VLP)	1.3 0.2	14	28
MeV	1.2 0.2	2.2 0.5	31
Vésicules extracellulaires (de cellules HeLa)	0.05 0.01

Tableau 7: Exemple de paramètres de transport (ou physico-chimiques) extraits du modèle de bouchon pour différents types viraux et types de vésicules extracellulaires. Pour les types viraux, les résultats ont été moyennés sur les différents sous-types viraux composant un même type viral (qui ont également été moyennés sur les différentes expériences). Les barres d'erreur ont été calculées en utilisant la propagation des erreurs et le processus de jackknifing

Cette étape est essentielle pour la construction de la base de données puisque les paramètres de transport (ou physico-chimiques) collectés sont spécifiques à chaque type/sous-type de particule virale ou de vésicule extracellulaire et permettent donc de construire une signature type/sous-type unique.

De plus, il est également possible de réaliser l'étape d'extraction des paramètres sans utiliser l'ajustement avec un modèle physique (comme le modèle de bouchon mentionné ci-dessus). En fait, il est également possible d'ajuster les données avec d'autres modèles tels que le modèle gaussien suivant :

Les 4 paramètres recueillis par le fit (a, b, c et d) constituent alors les paramètres de transport associés à chaque type/sous-type viral (ou type/sous-type de vésicule extracellulaire).

Représentation de la base de données

A partir des paramètres extraits ci-dessus, une représentation de la base de données est générée en n-D plot. Par exemple, nous avons choisi de créer un tracé 3D avec les paramètres de transport (ou physico-chimiques) extraits du modèle de bouchon. Chaque axe correspond à un paramètre (P _c , , ). L'objectif est alors d'établir un domaine spécifique pour chaque type/sous-type viral (ou type/sous-type de vésicule extracellulaire). Dans ce but, un algorithme de Voronoï est généré. Cet algorithme a été adapté d'un algorithme Matlab existant. Le principe du diagramme de Voronoï est la division d'un cube en domaines (régions adjacentes) à partir d'un ensemble de points appelés "sites". Chaque domaine renferme un site et forme l'ensemble des points du plan plus proche de ce site que de tout autre. Les frontières entre domaines sont construites pour être parfaitement équidistantes des sites les plus proches.

Un cube (comprenant l'ensemble de la base de données de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires) est donc obtenu et découpé en plusieurs domaines. Chaque domaine est associé à un sous-type ou à un type de particule virale (ou vésicule extracellulaire). Pour plus de lisibilité, les axes ont été normalisés par les valeurs maximales et minimales des paramètres de transport (ou physico-chimiques). Un exemple de diagramme de Voronoï est représenté pour les différents types viraux sur laFIG. 4. Les valeurs des paramètres de transport (ou physico-chimiques) correspondent aux paramètres moyens qui ont été mesurés pour les différents sous-types associés à un même type viral. Les points rouges correspondent au site de chaque domaine viral, c'est-à-dire les paramètres moyens qui sont associés à un type viral précis. Un diagramme de Voronoï contenant tous les sous-types de virus a également été réalisé.

Globalement, cette représentation constitue la base de données d'identification nécessaire à l'identification des particules inconnues, comme cela sera décrit ultérieurement.

De plus, d'autres types de représentation que le diagramme de Voronoï peuvent être utilisées, comme par exemple l'algorithme des k plus proches voisins ou la machine à vecteurs de support (SVM) comme modèle d'apprentissage supervisé.

Test du processus d'identification

1- "Échantillon inconnu"

Une fois la base de données d'identification établie, l'étape suivante consiste à créer un protocole d'identification d'un « échantillon inconnu », c'est-à-dire un échantillon contenant potentiellement des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires de type et/ou sous-type inconnu. La première étape de ce protocole consiste à mesurer les paramètres de transport (physico-chimiques) associés à l'échantillon de la même manière que lors de la création de la base de données d'identification (voir section Collecte des mesures de référence). Cependant, dans le cas d'un échantillon inconnu, une seule courbe fréquence/pression et une seule courbe fréquence/concentration sont réalisées afin de limiter le temps d'expérimentation et de traitement. L'étape suivante consiste à extraire les paramètres de transport (ou physico-chimiques) (par ajustement par un modèle d'identification) puis à représenter ces nouveaux paramètres dans la base de données d'identification (par exemple dans le diagramme de Voronoï). Un exemple "d'échantillon de particules virales inconnues" est représenté par une étoile sur laFIG. 4. Une mesure similaire peut être effectuée pour les vésicules extracellulaires.

Pour savoir dans quel domaine se trouve « l'échantillon inconnu », et quelle est sa proximité avec les différents domaines voisins (ce qui est susceptible de donner une indication sur l'erreur de la mesure), on mesure les distances entre « l'échantillon inconnu » et tous les sites du domaine. La plus petite distance est associée au domaine dans lequel se trouve l'échantillon et est donc identifiée comme le type/sous-type associé au domaine.

2- Mesure de la robustesse de l'identification

Grâce aux tests réalisés avec les « échantillons inconnus », il est possible de fournir des critères d'évaluation de la robustesse du procédé décrit dans la présente invention. Par exemple, quatre « échantillons de particules virales inconnues » ont été testés pour chaque sous-type viral. Le résultat de l'identification est donné dans le Tableau 8.

	AAV8	AAV9	AdV-5	VHB (complet non enveloppé)	VIH (Gag-GFP)	VIH (VLP)	HSV-1	InfV A(H1N1)	InfV A(H3N2)	MeV	MLV complet	SC2 (VLP)	SC2 (VLP +Env)
Sortie ("Expérience")	AAV8	100	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	AAV9	0	100	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	AdV-5	0	0	100	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	VHB (complet non développé)	0	0	0	100	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	VIH (Gag-GFP)	0	0	0	0	100	0	0	0	0	0	0	0	0
	VIH (VLP)	0	0	0	0	0	100	0	0	0	0	0	0	0
	HSV-1	0	0	0	0	0	0	75	0	0	0	0	0	0
	InfV A(H1N1)	0	0	0	0	0	0	0	100	0	0	0	0	0
	InfV A(H3N2)	0	0	0	0	0	0	25	0	100	0	0	25	0
	MeV	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100	0	0	0
	MLV complet	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100	0	0
	SC2 (VLP)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	75	0
	SC2 (VLP+Env)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100

Tableau 8: Matrice de confusion pour des « échantillons viraux inconnus » pour évaluer le processus d'identification. Les données sont généralement distribuées selon un processus classique (3/4 pour la construction de la base de données d'identification et 1/4 pour les tests). L'entrée (« vérité de référence » ou « vérité terrain ») correspond au sous-type réel de la particule virale tandis que la sortie ("expérience") correspond au résultat du processus d'identification développé dans cette invention. Les résultats sont donnés en pourcentages. Quatre « échantillons de particules virales inconnues » ont été testés pour chaque sous-type viral.

A partir de ces résultats, il est alors possible de calculer la spécificité d'identification, la sensibilité d'identification et la précision de la méthode (voir Tableau 9). La spécificité d'identification est la probabilité d'obtenir un test négatif si la particule virale recherchée n'est pas présente (en d'autres termes c'est la probabilité d'obtenir un test négatif chez des personnes non malades). La sensibilité d'identification est la probabilité que le test attribue correctement la particule virale "inconnue" au bon domaine (en d'autres termes c'est la probabilité que le test soit positif si la maladie est présente). La précision est la probabilité correspondant au nombre d'échantillons qui ont été correctement affectés au bon sous-type parmi tous les échantillons qui ont été affectés à ce sous-type.

	Virus A	Autres virus
Virus A	Vrai positif (TP)	Faux positif (FP)
Autres virus	Faux négatif (FN)	Vrai négatif (TN)

Tableau 9: Matrice de confusion des résultats possibles lors de la mesure de la validité intrinsèque d'un test.

Sur la base du Tableau 9, la spécificité d'identification, la sensibilité d'identification et la précision d'une méthode peuvent être exprimées comme suit :

Pour l'exemple mentionné ci-dessus (test d'échantillon inconnu pour chaque sous-type viral) et avec le procédé décrit dans la présente invention, la spécificité d'identification a été trouvée à 98%, la sensibilité d'identification à 95% et la précision à 98%.

De plus, la moyenne harmonique de précision et de sensibilité d'identification donne un score appelé F1-score qui est une mesure de la performance de la capacité de classification du modèle. Le score F1 est exprimé comme suit :

Pour l'exemple mentionné ci-dessus (test d'échantillon inconnu pour chaque sous-type viral) et avec la méthode décrite dans la présente invention, le F1-score atteint 96 %.

3- Echantillon comprenant un m élange de plusieurs types de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires

Des échantillons complexes correspondant à des mélanges de différents types/sous-types de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires présents à différentes concentrations ont été testés.

Par exemple, un échantillon contenant des particules virales (HIV Gag-GFP) et des vésicules extracellulaires (EVs de cellules HeLa utilisées pour la production de HIV Gag-GFP, marquées par fluorescence à l'aide de DiO) a été préparé selon le protocole décrit ci-dessus. Les concentrations de particules virales (1.10¹¹particules/mL) et de vésicules extracellulaires (2.10¹⁰particules/mL) ont d’abord été quantifiées. Ensuite, la mesure de la fréquence de passage en fonction de la pression et de la concentration en particules virales a permis d’extraire les paramètres de transport (issus de l’ajustement par le modèle de bouchon) spécifique à la particule virale. Enfin, le type viral a été identifié à l'aide de la base de données. Le résultat de l’identification correspond bien au type viral majoritaire (HIV Gag-GFP) et montre la capacité d’identifier un type viral dans un mélange comprenant des vésicules extracellulaires.

Par ailleurs, un échantillon contenant deux types de virus, AAV-8 (marqué par fluorescence à l'aide de YOYO-1) et InfV A(H1N1) humain (marqué par fluorescence à l'aide de DiO), avec un rapport de concentration de 1:100 a également été testé. La méthode développée ci-dessus (transport de particules virales à travers les nanopores/mesure des paramètres de transport/utilisation de la base de données d'identification) a été utilisée pour identifier le type viral prédominant. Le résultat de l’identification correspond bien au type viral majoritaire InfV A(H1N1) humain et montre la capacité d’identifier un type viral dans un mélange comprenant d’autres types viraux.

Il convient de noter que les rapports de concentration, évoqués ci-dessus, sont pertinents dans le cas de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires dans les échantillons de patients. En effet, en cas de co-infection, il existe une différence de concentration significative entre les différents types de virus (généralement un facteur supérieur à 1:1000). Ceci est également valable dans le cas de la bioproduction de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires, où la présence de particules indésirables est faible par rapport à la quantité de particules cibles produites.

Claims (10)

1. Méthode d’identification de particules virales et/ou de vésicules extracellulaires comprenant :

   1. le marquage des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires présentes dans un échantillon biologique à l’aide d’un marqueur fluorescent ;
   2. le passage dudit échantillon comprenant les particules virales et/ou les vésicules extracellulaires marquées à travers une membrane nanoporeuse ;
   3. la mesure du transport desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires à travers lesdites membranes nanoporeuses par détection optique en fonction d’au moins un paramètre de contrôle ; et
   4. l’extraction de paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques caractéristiques du transport desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires à partir d’un modèle physique reliant le transport au paramètre de contrôle.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle les paramètres physico-chimiques et/ou dynamiques desdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires sont comparés à une base de données comprenant la signature spécifique de chaque type ou sous-type viral et/ou de chaque type ou sous-type de vésicule extracellulaire afin d’identifier lesdites particules virales et/ou vésicules extracellulaires présentes dans l’échantillon.
3. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit au moins un paramètre de contrôle est choisi parmi la concentration des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires, la pression, la durée des évènements de transport, l’intensité des évènements de transport, la trajectoire des évènements de transports, la température, la salinité et le pH.
4. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la signature spécifique de chaque type viral et/ou de chaque type de vésicule extracellulaire permettant l’identification des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires marquées est obtenue en procédant aux étapes a) à d) avec des échantillons comprenant des particules virales et/ou des vésicules extracellulaires connues.
5. Méthode selon l’une quelconques des revendications précédentes, dans laquelle la membrane nanoporeuse est fonctionnalisée, en particulier par des polymères synthétiques, par exemple par des poly-2-alkyl-2-oxazolines ou par greffage non covalent, en particulier avec du Pluronic ©, de la poly(vinylpyrrolidone), de la méthylcellulose, de l’albumine, ou du sérum fœtal bovin.
6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle les polymères sont liés à des sondes électro actives, en particulier de type diazonium.
7. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les particules virales sont choisies parmi des particules virales enveloppées ou non, à ADN ou à ARN.
8. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle les vésicules extracellulaires sont choisies parmi des vésicules produites par des cellules saines, cancéreuses, ou parmi des vésicules issues de bio-production non cellulaire.
9. Utilisation de la méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 pour identifier le type et/ou sous-type viral présent chez un patient, la qualité de la production de vecteurs viraux ou l’identification de pathologies humaines, végétales ou animales dans des échantillons biologiques dans le cadre d’une veille sanitaire, ou pour l’identification de particules virales dans des échantillons agroalimentaires.
10. Utilisation de la méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 et 8 pour identifier le type et/ou sous-type de vésicules extracellulaires chez un patient ou la qualité de la production de vecteurs vésiculaires.