FR3135892A1 - treatment of acute respiratory distress syndrome (ARDS) in a patient - Google Patents
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
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- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
Abstract
Traitement d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient L’invention concerne ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient.Treatment of acute respiratory distress syndrome (ARDS) in a patient The invention relates to ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) or a pharmaceutical composition containing it for use in a method of treating or preventing respiratory distress syndrome acute (ARDS) in a patient.
Description
L’invention concerne une méthode de traitement ou de prévention d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient avec ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) ou une composition pharmaceutique en contenant.The invention relates to a method of treating or preventing acute respiratory distress syndrome (ARDS) in a patient with ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) or a pharmaceutical composition containing same.
Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est un œdème pulmonaire dit « lésionnel », c’est à dire entraîné par une hausse de la perméabilité capillaire pulmonaire survenant à la suite d’une agression directe ou indirecte de la membrane alvéolo-capillaire, associé à une inflammation pulmonaire intense et une hypoxémie sévère.Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a so-called “lesional” pulmonary edema, i.e. caused by an increase in pulmonary capillary permeability occurring following a direct or indirect attack on the alveolar-capillary membrane, associated with intense pulmonary inflammation and severe hypoxemia.
Le SDRA est défini par l'association de quatre critères : détresse respiratoire depuis moins d'une semaine, opacités pulmonaires bilatérales sur la radiographie thoracique ou la tomodensitométrie (TDM), pas d'argument pour une cause cardiaque d'œdème pulmonaire, et hypoxémie avec rapport PaO2/FIO2< 300 mmHg pour une pression télé-expiratoire positive réglée à 5 cmH2O ou plus avec 3 stades de gravité définis en fonction de l’hypoxémie.ARDS is defined by the association of four criteria: respiratory distress for less than a week, bilateral pulmonary opacities on chest X-ray or computed tomography (CT), no evidence for a cardiac cause of pulmonary edema, and hypoxemia. with PaO 2 /FIO 2 ratio < 300 mmHg for positive end-tidal pressure set at 5 cmH 2 O or more with 3 stages of severity defined according to hypoxemia.
Le SDRA est causé par une atteinte de la membrane alvéolo-capillaire, dont la capacité d'échanges gazeux chute radicalement. Ceci entraîne également un défaut de compliance pulmonaire. Cette manifestation peut apparaître dans un grand nombre de situations pathologiques avec des mécanismes différents. Il est caractérisé par une inflammation du parenchyme pulmonaire qui mène à des anomalies d'échanges de gaz avec une libération en parallèle de médiateurs inflammatoires du parenchyme pulmonaire qui causent une inflammation et une hypoxémie. Souvent une défaillance multiviscérale résulte rapidement de cet état.ARDS is caused by damage to the alveolar-capillary membrane, whose gas exchange capacity drops radically. This also leads to a lack of pulmonary compliance. This manifestation can appear in a large number of pathological situations with different mechanisms. It is characterized by inflammation of the lung parenchyma which leads to gas exchange abnormalities with a parallel release of inflammatory mediators from the lung parenchyma which cause inflammation and hypoxemia. Often multiorgan failure quickly results from this condition.
Son traitement, à la fois étiologique et symptomatique, ne permet une survie que dans la moitié des cas pour les SDRA dits « sévères ». Son pronostic reste donc encore très sombre et il peut laisser des séquelles importantes.Its treatment, both etiological and symptomatic, only allows survival in half of the cases for so-called “severe” ARDS. Its prognosis therefore still remains very poor and it can leave significant after-effects.
Les causes peuvent être pulmonaires ou extra-pulmonaires. Les causes pulmonaires comprennent les pneumopathies bactérienne, virale, fongique, les embolies, les infiltrations, les traumatismes thoraciques, les aspirations trachéo-bronchiques ou gastriques, la ventilation mécanique, les inhalations, les noyades, les phénomènes d’ischémie-reperfusion.The causes can be pulmonary or extra-pulmonary. Pulmonary causes include bacterial, viral, fungal pneumonia, embolisms, infiltrations, chest trauma, tracheobronchial or gastric aspiration, mechanical ventilation, inhalations, drowning, and ischemia-reperfusion phenomena.
Les causes extra-pulmonaire comprennent les chocs, le sepsis (ou septicémie), les polytraumatismes, l’exposition à des agents toxiques, les transfusions, les shunts cardiopulmonaires, la pancréatite, les intoxications médicamenteuses, les brulures graves, les éclampsies, l’exposition à des produits de contraste et l’acidocétose.Extrapulmonary causes include shock, sepsis (or septicemia), multiple trauma, exposure to toxic agents, transfusions, cardiopulmonary shunts, pancreatitis, drug poisoning, severe burns, eclampsia, exposure to contrast media and ketoacidosis.
L’éthylisme chronique, le tabagisme actif et passif, constituent des facteurs environnementaux augmentant le risque de développer un SDRA en cas d’agression pulmonaire, via des effets sensibilisateurs de l’épithélium, de l’endothélium et des autres cellules immunitaires de la membrane alvéolocapillaire. La présence d’un sepsis, d’une maladie pulmonaire chronique et d’un pH plasmatique abaissé ont également été montrés comme des facteurs précipitants la survenue de SDRA.Chronic alcoholism, active and passive smoking, constitute environmental factors increasing the risk of developing ARDS in the event of pulmonary attack, via sensitizing effects of the epithelium, endothelium and other immune cells of the membrane alveolocapillary. The presence of sepsis, chronic lung disease, and lowered plasma pH have also been shown to precipitate the occurrence of ARDS.
Le 31 décembre 2019, l'Organisation mondiale de la santé (OMS) a été informée d'un groupe de cas de pneumonie de cause inconnue détectés dans la ville de Wuhan, province du Hubei, Chine. Le 12 janvier 2020, il a été annoncé qu'un nouveau coronavirus avait été identifié Ce virus a été appelé SARS-CoV-2 et la maladie associée « COronaVIrus Disease 2019 » (COVID-19). Depuis, l'agent étiologique SARS-CoV-2 s'est répandu dans le monde entier.On December 31, 2019, the World Health Organization (WHO) was informed of a cluster of pneumonia cases of unknown cause detected in Wuhan City, Hubei Province, China. On January 12, 2020, it was announced that a new coronavirus had been identified. This virus was named SARS-CoV-2 and the associated disease “COronaVIrus Disease 2019” (COVID-19). Since then, the etiological agent SARS-CoV-2 has spread throughout the world.
L'infection par le SARS-CoV-2 présente un large spectre clinique allant d'une maladie inapparente, à des formes respiratoires qui vont d’un simple essoufflement jusqu’au SDRA. Les formes respiratoires symptomatiques présentent une fièvre, une toux nouvelle et continue, un essoufflement, une fatigue, une perte d'appétit, une anosmie et une agueusie. Le délai d'apparition du SDRA lié au COVID-19 se situe entre 8 et 12 jours après l’apparition des symptômes.SARS-CoV-2 infection presents a broad clinical spectrum ranging from an inapparent illness to respiratory forms ranging from simple shortness of breath to ARDS. Symptomatic respiratory forms present with fever, new and continuous cough, shortness of breath, fatigue, loss of appetite, anosmia and ageusia. The time to onset of ARDS linked to COVID-19 is between 8 and 12 days after the onset of symptoms.
L’aggravation respiratoire observée lors de la deuxième semaine d’évolution de la maladie est la principale cause d’hospitalisation et de mortalité. Sur le plan thérapeutique, l’arme principale demeure l’assistance respiratoire. Cependant ce SDRA est plus lié à une réponse inflammatoire très intense secondaire à l’agression virale qu’au virus lui-même. Il existe donc un rationnel fort à tenter de moduler cette réponse afin de limiter les dommages induits au niveau pulmonaire. L’effet positif de la dexamethasone prouve la pertinence de cette approche, mais l’effet reste modeste.Respiratory worsening observed during the second week of disease progression is the main cause of hospitalization and mortality. Therapeutically, the main weapon remains respiratory assistance. However, this ARDS is more linked to a very intense inflammatory response secondary to the viral attack than to the virus itself. There is therefore a strong rationale for trying to modulate this response in order to limit the damage induced at the pulmonary level. The positive effect of dexamethasone proves the relevance of this approach, but the effect remains modest.
La Demanderesse a mis en évidence une solution thérapeutique anti-inflammatoire spécifique du SDRA, éventuellement guidée par des biomarqueurs périphériques compagnons, qui permet de changer le pronostic des patients atteints de SDRA, notamment chez les patients atteints de la COVID-19.The Applicant has demonstrated a specific anti-inflammatory therapeutic solution for ARDS, possibly guided by companion peripheral biomarkers, which makes it possible to change the prognosis of patients with ARDS, particularly in patients with COVID-19.
Ainsi, la présente invention, qui trouve application dans le domaine du traitement des insuffisances respiratoires, concerne ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) ou une composition pharmaceutique en contenant pour son utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient.Thus, the present invention, which finds application in the field of treatment of respiratory insufficiency, relates to ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) or a pharmaceutical composition containing it for its use in a method of treatment or prevention of a respiratory syndrome. acute respiratory distress (ARDS) in a patient.
DéfinitionsDefinitions
L’ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule), également connu sous la dénomination « endocan », est une glycoprotéine codée par un gène unique non polymorphe appelé esm1. Ce gène s’exprime spécifiquement au niveau des cellules endothéliales, et aboutit à la sécrétion d’un protéoglycane de 50 kDa, circulant librement dans le sang. L’ESM-1 est tout particulièrement surexprimé par les cellules endothéliales qui forment le bourgeon vasculaire ou « endothelial tip cells » dans la néoangiogenèse. L’ESM-1 circulante baisse par le biais d’un processus proteolytique induit par le neutrophile activé, générant une forme clivée circulante de 14 kDa. La séquence en acides aminés de l’ESM-1 humain est SEQ ID NO : 1.ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule), also known as “endocan”, is a glycoprotein encoded by a unique non-polymorphic gene called esm1. This gene is expressed specifically in endothelial cells, and results in the secretion of a 50 kDa proteoglycan, circulating freely in the blood. ESM-1 is particularly overexpressed by endothelial cells which form the vascular bud or “endothelial tip cells” in neoangiogenesis. Circulating ESM-1 declines through a proteolytic process induced by the activated neutrophil, generating a circulating cleaved form of 14 kDa. The amino acid sequence of human ESM-1 is SEQ ID NO: 1.
Le terme « composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par une agence règlementaire fédérale ou d’État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, destinée à être utilisé chez les animaux et chez l’homme. Par exemple, un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l’état de la technique. Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.The term “pharmaceutical composition” designates a composition comprising a pharmaceutically acceptable vehicle. The term “pharmaceutically acceptable” means approved by a federal or state regulatory agency or listed in the United States or European Pharmacopoeia, or other generally recognized pharmacopoeia, for use in animals and humans. For example, a pharmaceutically acceptable carrier may be a diluent, adjuvant, excipient or vehicle with which the therapeutic agent is administered. These vehicles can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil , sesame oil, etc. Water is a preferred vehicle when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid vehicles, particularly for injectable solutions. Pharmaceutically acceptable excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerol, propylene glycol, l water, ethanol and the like. When the pharmaceutical composition is suitable for oral administration, the tablets or capsules may be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable excipients such as binding agents (e.g. pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose); fillers (e.g. lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate); lubricants (for example, magnesium stearate, talc or silica); disintegrants (e.g. potato starch or sodium starch glycolate); or wetting agents (e.g., sodium lauryl sulfate). The tablets can be coated by methods well known in the state of the art. Liquid preparations for oral administration may take the form of, for example, solutions, syrups or suspensions, or may be presented as a dry product to be reconstituted with water or other suitable vehicle before use. Such liquid preparations can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable carriers such as suspending agents (e.g. sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifying agents (for example, lecithin or acacia); non-aqueous carriers (e.g. almond oil, oil esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils); and preservatives (e.g. methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid). Pharmaceutical compositions may also contain buffer salts, flavorings, colors and sweeteners, as appropriate. The composition according to the invention is preferably a pharmaceutical composition.
Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou souhaitable sur les symptômes d’une pathologie ou d'un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique.The term "treat" or "treatment" encompasses any beneficial or desirable effect on the symptoms of a pathology or condition, and may even include a minimal reduction in one or more measurable markers of the pathology or condition. pathological state. Treatment may, for example, involve either reducing or improving symptoms of the disease or condition or delaying the progression of the disease or condition.
Le terme « prévenir » ou « prévention » englobe tout effet bénéfique ou souhaitable permettant d’empêcher la survenue, de diminuer la survenue ou de retarder la survenue des symptômes d’une pathologie ou d'un état pathologique.The term “prevent” or “prevention” encompasses any beneficial or desirable effect making it possible to prevent the occurrence, to reduce the occurrence or to delay the occurrence of the symptoms of a pathology or pathological condition.
Le terme « patient » désigne un mammifère humain ou non humain (tel qu'un chat, un chien, un cheval ou un primate). De préférence, le patient est un être humain, homme ou femme.The term “patient” means a human or non-human mammal (such as a cat, dog, horse or primate). Preferably, the patient is a human being, male or female.
Indication thérapeutiqueTherapeutic indication
La présente demande concerne l’ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) ou une composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient.The present application concerns ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) or a pharmaceutical composition containing it for use in a method of treating or preventing acute respiratory distress syndrome (ARDS) in a patient.
Le SDRA peut être d’origine pulmonaire (agression directe de la membrane alvéolo-capillaire) ou extra-pulmonaire (agression indirecte de la membrane alvéolo-capillaire).ARDS can be of pulmonary origin (direct attack on the alveolo-capillary membrane) or extra-pulmonary (indirect attack on the alveolo-capillary membrane).
Le SDRA d’origine pulmonaire peut être associé à une pneumopathie, une embolie, une infiltration et/ou un traumatisme. En particulier, le SDRA d’origine pulmonaire peut être associé à :
- une pneumonie (bactérienne, virale ou fongale),
- une aspiration gastrique,
- une noyade,
- un traumatisme thoracique sévère,
- une contusion pulmonaire,
- un œdème pulmonaire de reperfusion, par exemple après une transplantation de poumon,
- une embolie graisseuse, et/ou
- une inhalation de gaz et/ou de fumée toxique.ARDS of pulmonary origin may be associated with pneumonia, embolism, infiltration and/or trauma. In particular, ARDS of pulmonary origin may be associated with:
- pneumonia (bacterial, viral or fungal),
- gastric aspiration,
- drowning,
- severe chest trauma,
- pulmonary contusion,
- reperfusion pulmonary edema, for example after lung transplantation,
- a fat embolism, and/or
- inhalation of toxic gas and/or smoke.
Le SDRA est d’origine non-pulmonaire peut être associé à un choc, un sepsis (ou septicémie), un polytraumatisme, un agent toxique, une éclampsie, une exposition à un produit de contraste et/ou une acidocétose. En particulier, le SDRA d’origine non-pulmonaire peut être associé à :
- un sepsis sévère,
- une secousse,
- des transfusions multiples, incluant le syndrome respiratoire aigu post-transfusionnel (TRALI),
- un traumatisme sévère non-thoracique,
- une pancréatite,
- une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD), et/ou
- une overdose de drogue, par exemple une overdose aux opiacés, une overdose au paraldehyde.ARDS is of non-pulmonary origin and can be associated with shock, sepsis (or septicemia), polytrauma, toxic agent, eclampsia, exposure to a contrast medium and/or ketoacidosis. In particular, ARDS of non-pulmonary origin can be associated with:
- severe sepsis,
- a jolt,
- multiple transfusions, including post-transfusion acute respiratory syndrome (TRALI),
- severe non-thoracic trauma,
- pancreatitis,
- disseminated intravascular coagulation (DIC), and/or
- a drug overdose, for example an opiate overdose, a paraldehyde overdose.
Dans un mode de réalisation particulier, le SDRA est associé à une pathologie choisie parmi (i) une infection respiratoire d’origine bactérienne ou virale, telle que la COVID-19, (ii) une dysplasie bronchopulmonaire, (iii) une septicémie, et (iv) un polytraumatisme.In a particular embodiment, ARDS is associated with a pathology chosen from (i) a respiratory infection of bacterial or viral origin, such as COVID-19, (ii) bronchopulmonary dysplasia, (iii) sepsis, and (iv) multiple trauma.
Dans un mode de réalisation particulier, le SDRA est associé à un sepsis.In a particular embodiment, ARDS is associated with sepsis.
Il découle de ce qui précède que, dans un mode de réalisation particulier, le patient traité présente une pneumopathie, une embolie, une infiltration et/ou un traumatisme. En particulier, le patient traité présente:
- une pneumonie (bactérienne, virale ou fongale),
- une aspiration gastrique,
- une noyade,
- un traumatisme thoracique sévère,
- une contusion pulmonaire,
- un œdème pulmonaire de reperfusion, par exemple après avoir subi une transplantation de poumon,
- une embolie graisseuse, et/ou
- une inhalation de gaz et/ou de fumée toxique.It follows from the above that, in a particular embodiment, the patient treated presents pneumonia, embolism, infiltration and/or trauma. In particular, the treated patient presents:
- pneumonia (bacterial, viral or fungal),
- gastric aspiration,
- drowning,
- severe chest trauma,
- pulmonary contusion,
- reperfusion pulmonary edema, for example after undergoing a lung transplant,
- a fat embolism, and/or
- inhalation of toxic gas and/or smoke.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le patient présente un choc, un sepsis (ou septicémie), un polytraumatisme, une exposition à un agent toxique, une éclampsie, une exposition à un produit de contraste et/ou une acidocétose. En particulier, le patient présente :
- un sepsis sévère,
- une secousse,
- des transfusions multiples, incluant le syndrome respiratoire aigu post-transfusionnel (TRALI),
- un traumatisme sévère non-thoracique,
- une pancréatite,
- une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD), et/ou
- une overdose de drogue, par exemple une overdose aux opiacés, une overdose au paraldehyde.In another particular embodiment, the patient presents shock, sepsis (or septicemia), polytrauma, exposure to a toxic agent, eclampsia, exposure to a contrast product and/or ketoacidosis. In particular, the patient presents:
- severe sepsis,
- a jolt,
- multiple transfusions, including post-transfusion acute respiratory syndrome (TRALI),
- severe non-thoracic trauma,
- pancreatitis,
- disseminated intravascular coagulation (DIC), and/or
- a drug overdose, for example an opiate overdose, a paraldehyde overdose.
Dans un mode de réalisation particulier, le patient présente un sepsis.In a particular embodiment, the patient presents sepsis.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le patient est atteint d’une pathologie choisie parmi (i) une infection respiratoire d’origine bactérienne ou virale, telle que la COVID-19, (ii) une dysplasie bronchopulmonaire, (iii) une septicémie, et (iv) un polytraumatisme nécessitant une prise en charge du patient en réanimation.In another particular embodiment, the patient suffers from a pathology chosen from (i) a respiratory infection of bacterial or viral origin, such as COVID-19, (ii) bronchopulmonary dysplasia, (iii) septicemia , and (iv) multiple trauma requiring patient care in intensive care.
Le traitement selon l’invention offre l’avantage de limiter la réaction inflammatoire pulmonaire sans impacter la réponse anti-virale ou anti-bactérienne qui se produit au niveau du ganglion lymphatique afférent, contrairement aux corticostéroïdes qui ont une action immunomodulatrice et profibrosante en particulier la dexaméthasone. Ceci est particulièrement avantageux lorsque le SDRA est associé à une infection virale ou bactérienne. En particulier, dans le cas de la COVID-19, l’ESM-1 permet de limiter la réaction inflammatoire induite par SARS-CoV-2 tout en laissant le temps à l’immunité anti-virale de s’installer, ce qui constitue une approche thérapeutique particulièrement avantageuse. Ainsi, le mode d’action anti-inflammatoire de l’ESM-1 permet d’éviter deux écueils inhérents aux corticoïdes : l’immunosuppression et la fibrose pulmonaire interstitielle.The treatment according to the invention offers the advantage of limiting the pulmonary inflammatory reaction without impacting the anti-viral or anti-bacterial response which occurs at the level of the afferent lymph node, unlike corticosteroids which have an immunomodulatory and profibrosis action in particular the dexamethasone. This is particularly advantageous when ARDS is associated with a viral or bacterial infection. In particular, in the case of COVID-19, ESM-1 makes it possible to limit the inflammatory reaction induced by SARS-CoV-2 while allowing time for anti-viral immunity to take hold, which constitutes a particularly advantageous therapeutic approach. Thus, the anti-inflammatory mode of action of ESM-1 makes it possible to avoid two pitfalls inherent to corticosteroids: immunosuppression and interstitial pulmonary fibrosis.
Dans le cadre de la présente invention, l’ESM-1 est sous forme de protéoglycane, c’est-à-dire que l’ESM-1 comprend une chaine de glycosaminoglycane (GAG) au niveau de la serine 137 [1]. La chaine GAG de l’ESM-1 se caractérise par une succession de sucres [2].In the context of the present invention, ESM-1 is in the form of proteoglycan, that is to say that ESM-1 comprises a glycosaminoglycan (GAG) chain at serine 137 [1]. The GAG chain of ESM-1 is characterized by a succession of sugars [2].
L’ESM-1 peut être d’origine plasmatique, c’est-à-dire un ESM-1 purifié à partir du sang d’un ou de plusieurs individu(s), par exemple purifié à partir de sang humain. On parlera alors d’ESM plasmatique.The ESM-1 can be of plasma origin, that is to say an ESM-1 purified from the blood of one or more individual(s), for example purified from human blood. We will then speak of plasma ESM.
L’ESM-1 peut être d’origine recombinante, c’est-à-dire un ESM-1 produit de façon recombinante dans une cellule capable de produire l’ESM-1 sous forme glycosylée. On parlera alors d’ESM recombinant. Etant donné que l’ESM-1 doit être utilisé sous forme glycosylée dans le cadre de la présente invention, on privilégiera une cellule eucaryote à une cellule procaryote, car cette dernière n’est généralement pas capable de produire des protéines eucaryotes glycosylées. Des lignées cellulaires capables de produire des glycoprotéines sont largement décrites dans la littérature. On peut citer par exemple les cellules HEK, telle que la lignée cellulaire HEK-293, et CHO. HEK et CHO sont largement utilisée pour produire des glycoprotéines utilisées en thérapie et peuvent être utilisées pour produire l’ESM-1 recombinant.ESM-1 may be of recombinant origin, that is to say an ESM-1 produced recombinantly in a cell capable of producing ESM-1 in glycosylated form. We will then speak of recombinant ESM. Given that ESM-1 must be used in glycosylated form in the context of the present invention, preference will be given to a eukaryotic cell over a prokaryotic cell, because the latter is generally not capable of producing glycosylated eukaryotic proteins. Cell lines capable of producing glycoproteins are widely described in the literature. Examples include HEK cells, such as the HEK-293 cell line, and CHO. HEK and CHO are widely used to produce glycoproteins used in therapy and can be used to produce recombinant ESM-1.
L’ESM-1 est de préférence formulé pour une administration parentérale. Le terme « administré par voie parentérale », tel qu'utilisé ici, désigne des modes d'administration autres que l'administration entérale, généralement par injection, et comprend, sans limitation, l’administration intravasculaire, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle, intrathapsale, intracapsulaire, intraorbitaire, intratumorale, intracardiaque, intradermique, intra-péritonéale, par injection, perfusion transtrachéale, sous-cutanée, intra-articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale et intrasternale. L’administration intravasculaire (intraveineuse ou intra-artérielle), intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire est préférée dans le cadre de la présente invention. L’administration par voie intraveineuse est particulièrement préférée dans le cadre de la présente invention, par exemple par perfusion intraveineuse. Par exemple, l’ESM-1 ou la composition en contenant peut être administré par voie intraveineuse en perfusion continue.ESM-1 is preferably formulated for parenteral administration. The term "parenterally administered", as used herein, refers to modes of administration other than enteral administration, generally by injection, and includes, without limitation, intravascular, intravenous, intramuscular, intra-arterial administration , intrathapsal, intracapsular, intraorbital, intratumoral, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, by injection, transtracheal, subcutaneous, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal and intrasternal infusion. Intravascular (intravenous or intra-arterial), intraperitoneal, subcutaneous or intramuscular administration is preferred in the context of the present invention. Intravenous administration is particularly preferred in the context of the present invention, for example by intravenous infusion. For example, ESM-1 or the composition containing it can be administered intravenously by continuous infusion.
De préférence, l’ESM-1 est administrée au patient par voie parentérale, telle que par voie intraveineuse, par voie intramusculaire ou par voie sous-cutanée.Preferably, ESM-1 is administered to the patient parenterally, such as intravenously, intramuscularly, or subcutaneously.
L’ESM-1 ou la composition pharmaceutique en contenant peut être utilisé en monothérapie ou en association avec un médicament dont l’intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée. Par exemple l’ESM-1 peut être administré au patient en association avec une corticothérapie, par exemple en association avec de la dexamethasone, un anticorps monoclonal anti-cytokine et/ou anti-récepteur à cytokine.ESM-1 or the pharmaceutical composition containing it can be used as monotherapy or in combination with a drug whose therapeutic interest is recognized in the pathology considered. For example, ESM-1 can be administered to the patient in combination with corticosteroid therapy, for example in combination with dexamethasone, an anti-cytokine and/or anti-cytokine receptor monoclonal antibody.
L’ESM-1 ou la composition en contenant est administré au patient à une dose efficace permettant le traitement ou la prévention du SDRA. La dose d’ESM-1 administrée au patient variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris, sans limitation, la voie d'administration, le type et la gravité de la pathologie traitée, l’état du patient, la corpulence du patient, l'âge du patient, etc. La personne du métier peut facilement déterminer, sur la base de ses connaissances dans ce domaine, la plage posologique requise en fonction de ces facteurs et d'autres. La dose appropriée peut également être déterminée avec des modèles animaux ou avec des essais cliniques.ESM-1 or the composition containing it is administered to the patient at an effective dose for the treatment or prevention of ARDS. The dose of ESM-1 administered to the patient will vary depending on several factors, including, without limitation, the route of administration, the type and severity of the condition being treated, the condition of the patient, the body size of the patient, the age of the patient, etc. Those skilled in the art can easily determine, based on their knowledge in this field, the dosage range required based on these and other factors. The appropriate dose can also be determined with animal models or with clinical trials.
Dans le cadre de l’invention, l’ESM-1 peut être administrée au patient à une dose allant de 250 µg/jour à 2000 µg/jour, par exemple à une dose allant de 500 µg/jour à 1000 µg/jour, de préférence à une dose d’environ 600 µg/jour. L’ESM-1 peut être administrée en 1 seule fois, en continue (ex. en perfusion continue) ou avec des doses répétées. Par exemple, l’ESM-1 peut être administrée au patient avec une dose de charge allant de 50 µg à 500 µg, de préférence une dose d’environ 150 µg, puis une dose allant de 50 µg à 250 µg, de préférence une dose d’environ 75 µg, toutes les 4 heures.In the context of the invention, ESM-1 can be administered to the patient at a dose ranging from 250 µg/day to 2000 µg/day, for example at a dose ranging from 500 µg/day to 1000 µg/day, preferably at a dose of around 600 mcg/day. ESM-1 can be administered once, continuously (e.g. by continuous infusion) or with repeated doses. For example, ESM-1 can be administered to the patient with a loading dose ranging from 50 µg to 500 µg, preferably a dose of approximately 150 µg, then a dose ranging from 50 µg to 250 µg, preferably a dose of approximately 75 mcg, every 4 hours.
La durée du traitement peut varier en fonction des besoins, de quelques heures à plusieurs jours, par exemple jusqu’à ce que le SDRA disparaisse ou jusqu’à ce que le risque de développer un SDRA disparaisse. Dans un mode de réalisation particulier, l’ESM-1 est administrée au patient pendant une durée allant de 5 jours à 10 jours.The duration of treatment can vary depending on needs, from a few hours to several days, for example until the ARDS disappears or until the risk of developing ARDS disappears. In a particular embodiment, ESM-1 is administered to the patient for a period ranging from 5 days to 10 days.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’ESM-1 ou la composition en contenant est administré, par exemple par voie intraveineuse, de préférence en perfusion continue, à une dose adaptée pour maintenir chez le patient une concentration plasmatique en ESM-1 supérieure à 5 ng/mL de plasma, par exemple supérieure à 6 ng/mL de plasma, par exemple supérieure à 7 ng/mL de plasma, par exemple supérieure à 8 ng/mL de plasma, par exemple supérieure à 9 ng/mL de plasma, par exemple supérieure à 10 ng/mL de plasma, par exemple supérieure à 11 ng/mL de plasma, supérieure à 12 ng/mL de plasma, supérieure à 13 ng/mL de plasma, supérieure à 14 ng/mL de plasma, par exemple supérieure à 15 ng/mL de plasma, supérieure à 20 ng/mL de plasma, supérieure à 25 ng/mL de plasma, supérieure à 30 ng/mL de plasma, supérieure à 35 ng/mL de plasma, supérieure à 40 ng/mL de plasma, supérieure à 45 ng/mL de plasma, supérieure à 50 ng/mL de plasma.In a particularly preferred embodiment, ESM-1 or the composition containing it is administered, for example intravenously, preferably by continuous infusion, at a dose adapted to maintain a higher plasma concentration of ESM-1 in the patient. at 5 ng/mL of plasma, for example greater than 6 ng/mL of plasma, for example greater than 7 ng/mL of plasma, for example greater than 8 ng/mL of plasma, for example greater than 9 ng/mL of plasma, for example greater than 10 ng/mL plasma, for example greater than 11 ng/mL plasma, greater than 12 ng/mL plasma, greater than 13 ng/mL plasma, greater than 14 ng/mL plasma , for example greater than 15 ng/mL of plasma, greater than 20 ng/mL of plasma, greater than 25 ng/mL of plasma, greater than 30 ng/mL of plasma, greater than 35 ng/mL of plasma, greater than 40 ng/mL plasma, greater than 45 ng/mL plasma, greater than 50 ng/mL plasma.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’ESM-1 ou la composition en contenant est administré, par exemple par voie intraveineuse, de préférence en perfusion continue, à une dose adaptée pour maintenir chez le patient une concentration plasmatique en ESM-1 comprise entre 5 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, tel que comprise entre 6 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, tel que comprise entre 7 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, tel que comprise entre 8 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, tel que comprise entre 9 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, tel que comprise entre 10 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, tel que comprise entre 11 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 12 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 12 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 13 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 14 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 15 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 20 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 25 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 30 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 35 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma, comprise entre 40 ng/mL de plasma et 50 ng/mL de plasma.In a particularly preferred embodiment, ESM-1 or the composition containing it is administered, for example intravenously, preferably by continuous infusion, at a dose adapted to maintain in the patient a plasma concentration of ESM-1 comprised between 5 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, such as between 6 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, such as between 7 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma , such as between 8 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, such as between 9 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, such as between 10 ng/mL of plasma and 50 ng /mL of plasma, such as between 11 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, between 12 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, between 12 ng/mL of plasma and 50 ng /mL of plasma, between 13 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, between 14 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, between 15 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, between 20 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, between 25 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, between 30 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma , between 35 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma, between 40 ng/mL of plasma and 50 ng/mL of plasma.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’ESM-1 ou la composition en contenant est administré, par exemple par voie intraveineuse, de préférence en perfusion continue, à une dose adaptée pour maintenir chez le patient une concentration plasmatique en ESM-1 comprise entre 10 ng/mL de plasma et 20 ng/mL de plasmaIn a particularly preferred embodiment, ESM-1 or the composition containing it is administered, for example intravenously, preferably by continuous infusion, at a dose adapted to maintain in the patient a plasma concentration of ESM-1 comprised between 10 ng/mL of plasma and 20 ng/mL of plasma
En effet, il a été démontré de façon surprenante que le traitement de SDRA selon l’invention était sensiblement plus efficace lorsque la concentration plasmatique en ESM-1 chez le patient traité dépasse les taux physiologiques.Indeed, it was surprisingly demonstrated that the ARDS treatment according to the invention was significantly more effective when the plasma concentration of ESM-1 in the treated patient exceeds physiological levels.
Avantageusement, le traitement selon l’invention a une ou plusieurs des propriétés suivantes :
- il permet de diminuer le nombre de leucocytes, le nombre de neutrophiles et/ou le nombre de macrophages recrutés au niveau alvéolaire
- il entraine une amélioration des paramètres de l’oxygénation sanguine
- il limite les altérations histologiques pulmonaires.
Advantageously, the treatment according to the invention has one or more of the following properties:
- it reduces the number of leukocytes, the number of neutrophils and/or the number of macrophages recruited at the alveolar level
- it leads to an improvement in blood oxygenation parameters
- it limits pulmonary histological alterations.
En traitant le SDRA ou en prévenant sa survenue, le traitement selon l’invention permet notamment de réduire la durée du séjour du patient à l’hôpital, par exemple en réanimation, et/ou la mortalité.By treating ARDS or preventing its occurrence, the treatment according to the invention makes it possible in particular to reduce the duration of the patient's stay in hospital, for example in intensive care, and/or mortality.
Test compagnonCompanion test
La Demanderesse a montré que l’ESM-1 est un excellent biomarqueur capable d’informer sur l’état inflammatoire du poumon profond. Le profil pulmonaire associé à ESM-1 a été largement étudié dans le cadre des pneumonies nosocomiales et du sepsis sur près de 2500 patients de réanimation de par le monde [3]. Il a été montré qu’une élévation précoce des taux sanguins d’ESM-1 prédit la survenue quelques jours plus tard d’une pneumonie post-opératoire ou acquise sous ventilation mécanique. Mais un retard d’élévation d’ESM-1 dans le cadre des états septiques graves prédit aussi la survenue d’un SDRA 1-3 jours plus tard [4-8]. Plus les taux sont bas, plus la valeur prédictive positive (PPV) est élevée, au point que des taux sanguins d’ESM-1 inférieurs à 2,5 ng/mL de sang sont associés à une PPV de 100%, c’est-à-dire qu’à ce niveau d’ESM-1, on est sûr qu’un SDRA surviendra chez le patient [6]. Ces données cliniques montrent qu’à la fois des valeurs seuils diagnostiques et le profil cinétique d’ESM-1 contribuent à préciser l’état inflammatoire du poumon profond.The Applicant has shown that ESM-1 is an excellent biomarker capable of providing information on the inflammatory state of the deep lung. The pulmonary profile associated with ESM-1 has been widely studied in the context of nosocomial pneumonia and sepsis in nearly 2500 intensive care patients around the world [3]. It has been shown that an early elevation in blood levels of ESM-1 predicts the occurrence of post-operative or mechanically ventilated pneumonia a few days later. But a delay in ESM-1 elevation in severe septic states also predicts the occurrence of ARDS 1-3 days later [4-8]. The lower the levels, the higher the positive predictive value (PPV), to the point that blood ESM-1 levels below 2.5 ng/mL of blood are associated with a PPV of 100%, i.e. that is to say that at this level of ESM-1, we are sure that ARDS will occur in the patient [6]. These clinical data show that both diagnostic threshold values and the kinetic profile of ESM-1 contribute to clarifying the inflammatory state of the deep lung.
Ainsi, dans un mode de réalisation tout particulier, la méthode selon l’invention comprend les étapes consistant à :
(a) mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon de sang du patient,
(b) administrer au patient l’ESM-1 ou la composition en contenant lorsque la quantité d’ESM-1 mesurée à l’étape (a) est inférieure à une valeur de référence.Thus, in a very particular embodiment, the method according to the invention comprises the steps consisting of:
(a) measuring the amount of ESM-1 in a blood sample of the patient,
(b) administering the ESM-1 or the composition containing it to the patient when the quantity of ESM-1 measured in step (a) is less than a reference value.
L'échantillon de sang dans lequel la quantité d’ESM-1 est mesurée peut être le sang total, le sérum ou le plasma.The blood sample in which the amount of ESM-1 is measured can be whole blood, serum or plasma.
L’étape a) ne se limite pas à une méthode particulière pour mesurer la quantité d’ESM-1 dans l’échantillon de sang. La quantité d’ESM-1 dans un échantillon de sang peut être mesurée par n’importe quelle méthode permettant de mesurer la quantité d’une protéine dans un échantillon de sang. Il peut par exemple s’agir d’une méthode de détection directe ou indirecte.Step a) is not limited to a particular method for measuring the amount of ESM-1 in the blood sample. The amount of ESM-1 in a blood sample can be measured by any method that measures the amount of a protein in a blood sample. For example, it can be a direct or indirect detection method.
Une fois que l'échantillon sanguin du patient est préparé, la concentration d'ESM-1 peut être mesurée par n'importe quel procédé connu dans l'art. Par exemple, la concentration d'ESM-1 peut être mesurée en utilisant des techniques électrophorétiques et immunodiagnostiques standard, y compris des dosages immunologiques tels que des dosages de type compétition, réaction directe ou sandwich. De tels tests comprennent, mais sans s'y limiter, les Western Blot, les tests d'agglutination, les dosages immunoenzymatiques, tel que l’ELISA, les dosages de type biotine/avidine, les radio-immunoessais, l’immunoélectrophorèse, l’immunoprécipitation, la chromatographie liquide haute performance (FIPLC), la chromatographie d'exclusion stérique, l’affinité en phase solide, etc.Once the patient's blood sample is prepared, the concentration of ESM-1 can be measured by any method known in the art. For example, the concentration of ESM-1 can be measured using standard electrophoretic and immunodiagnostic techniques, including immunoassays such as competition, direct reaction, or sandwich assays. Such tests include, but are not limited to, Western blots, agglutination tests, enzyme immunoassays, such as ELISA, biotin/avidin assays, radioimmunoassays, immunoelectrophoresis, immunoprecipitation, high performance liquid chromatography (FIPLC), size exclusion chromatography, solid phase affinity, etc.
Dans un mode de réalisation particulier, de tels procédés comprennent la mise en contact de l'échantillon de sang avec un partenaire de liaison capable d'interagir sélectivement avec l’ESM-1 présent dans l'échantillon de sang. Le partenaire de liaison peut être généralement un anticorps qui peut être polyclonal ou monoclonal, de préférence monoclonal. Des anticorps polyclonaux dirigés contre l’ESM-1 peuvent être produits selon des procédés connus en administrant l'antigène ou l'épitope approprié à un animal hôte choisi, par exemple, parmi les porcs, les vaches, les chevaux, les lapins, les chèvres, les moutons et les souris, entre autres. Divers adjuvants connus dans l'art peuvent être utilisés pour augmenter la production d'anticorps. Bien que les anticorps utiles dans la mise en pratique de l'invention puissent être polyclonaux, les anticorps monoclonaux sont préférés. Les anticorps monoclonaux contre l’ESM-1 peuvent être préparés et isolés en utilisant toute technique qui permet la production d'anticorps par des lignées cellulaires continues en culture. Les techniques de production et d'isolement comprennent, mais sans s'y limiter, la technique d'hybridome. En variante, les techniques décrites pour la production d'anticorps monocaténaires (voir par exemple le brevet US n°4 946 778) peuvent être adaptées pour produire des anticorps monocaténaires anti-ESM-1. Les anticorps utiles dans la mise en pratique de la présente invention comprennent également des fragments anti-ESM-1 comprenant, mais sans s'y limiter, des fragments F(ab') 2, qui peuvent être générés par digestion à la pepsine d'une molécule d'anticorps intacte, et des fragments Fab, qui peuvent être générés par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab') 2. En variante, des bibliothèques d'expression Fab et/ou scFv peuvent être construites pour permettre une identification rapide de fragments ayant la spécificité souhaitée pour l’ESM-1. Par exemple, la présentation sur phage d'anticorps peut être utilisée.In a particular embodiment, such methods include contacting the blood sample with a binding partner capable of selectively interacting with ESM-1 present in the blood sample. The binding partner may generally be an antibody which may be polyclonal or monoclonal, preferably monoclonal. Polyclonal antibodies directed against ESM-1 can be produced according to known methods by administering the appropriate antigen or epitope to a host animal selected from, for example, pigs, cows, horses, rabbits, goats, sheep and mice, among others. Various adjuvants known in the art can be used to increase antibody production. Although antibodies useful in practicing the invention may be polyclonal, monoclonal antibodies are preferred. Monoclonal antibodies against ESM-1 can be prepared and isolated using any technique that allows production of antibodies by continuous cell lines in culture. Production and isolation techniques include, but are not limited to, the hybridoma technique. Alternatively, the techniques described for the production of single-chain antibodies (see for example US Patent No. 4,946,778) can be adapted to produce anti-ESM-1 single-chain antibodies. Antibodies useful in practicing the present invention also include anti-ESM-1 fragments including, but not limited to, F(ab') 2 fragments, which can be generated by pepsin digestion of an intact antibody molecule, and Fab fragments, which can be generated by reduction of the disulfide bonds of the F(ab') 2 fragments. Alternatively, Fab and/or scFv expression libraries can be constructed to allow identification rapid detection of fragments with the desired specificity for ESM-1. For example, phage display of antibodies can be used.
Plusieurs techniques permettant de mesurer la quantité d’ESM-1 sont décrites dans la littérature. Par exemple, l'utilisation d'anticorps monoclonaux pour détecter la protéine ESM-1 est décrite dans la demande de brevet français publiée sous le n°2775691 et dans la référence [1]. Ces anticorps monoclonaux ont été préparés par immunisation de souris avec un antigène constitué de la séquence allant de l'acide aminé en position 79 jusqu'à l'acide aminé en position 184 de la protéine ESM-1 qui a été fusionnée à la protéine GST (glutathione-S-transferase). Trois familles d'anticorps monoclonaux avaient été caractérisées, ces familles d'anticorps se fixant respectivement sur les déterminants antigéniques AgD1 79P-99C (anticorps MEP 01, MEP 06 et MEP 21), AgD2 119 S139V (anticorps MEP 08 et MEP13) et AgD3 159G-184R (anticorps MEP 04, MEP 14 et MEP19).Several techniques for measuring the quantity of ESM-1 are described in the literature. For example, the use of monoclonal antibodies to detect the ESM-1 protein is described in the French patent application published under number 2775691 and in reference [1]. These monoclonal antibodies were prepared by immunizing mice with an antigen consisting of the sequence from the amino acid at position 79 to the amino acid at position 184 of the ESM-1 protein which was fused to the GST protein. (glutathione-S-transferase). Three families of monoclonal antibodies had been characterized, these families of antibodies binding respectively to the antigenic determinants AgD1 79P-99C (antibodies MEP 01, MEP 06 and MEP 21), AgD2 119 S139V (antibodies MEP 08 and MEP13) and AgD3 159G-184R (MEP 04, MEP 14 and MEP19 antibodies).
La référence [1] décrit la mise au point d'un test immunoenzymatique du type sandwich mettant en œuvre les anticorps monoclonaux MEP 19 et MEP 21 pour mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon. Ce test a permis aux auteurs de montrer une forte production de protéine ESM-1 dans le sérum de patients hospitalisés pour un choc septique. Le test de détection utilisant les anticorps MEP 19 et MEP 21 permet de détecter une concentration de protéine ESM-1 supérieure à 4 nanogrammes (ng) par millilitre de plasma.Reference [1] describes the development of a sandwich-type enzyme immunoassay using the monoclonal antibodies MEP 19 and MEP 21 to measure the quantity of ESM-1 in a sample. This test allowed the authors to show a high production of ESM-1 protein in the serum of patients hospitalized for septic shock. The detection test using the MEP 19 and MEP 21 antibodies can detect a concentration of ESM-1 protein greater than 4 nanograms (ng) per milliliter of plasma.
Un autre test permettant de mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon est décrit dans la demande de brevet internationale publiée sous le numéro WO0239123. Cette demande de brevet décrit notamment une trousse de détection comprenant un premier anticorps se fixant spécifiquement sur la région N-terminale comprise entre l'acide aminé en position 1 et l'acide aminé en position 78 de la séquence en acides aminés de la protéine ESM-1, et un second anticorps se fixant spécifiquement sur la région C terminale comprise entre l'acide aminé en position 79 et l'acide aminé en position 184 de la séquence en acides aminés de la protéine ESM-1.Another test for measuring the quantity of ESM-1 in a sample is described in the international patent application published under number WO0239123. This patent application describes in particular a detection kit comprising a first antibody which binds specifically to the N-terminal region between the amino acid in position 1 and the amino acid in position 78 of the amino acid sequence of the ESM protein. -1, and a second antibody specifically binding to the C terminal region between the amino acid at position 79 and the amino acid at position 184 of the amino acid sequence of the ESM-1 protein.
Un test permettant de mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon est également commercialisé par la société Biothélis sous la référence EndoMark® H1A (EMH1A). Ce test est un immunoessai de type sandwich qui permet de mesurer la quantité d’ESM-1 dans le plasma humain.A test making it possible to measure the quantity of ESM-1 in a sample is also marketed by the company Biothélis under the reference EndoMark® H1A (EMH1A). This test is a sandwich-type immunoassay that measures the quantity of ESM-1 in human plasma.
Dans le cadre de la présente invention, la quantité d’ESM-1 mesurée est généralement exprimée en ng/mL de plasma. Cette valeur peut alors être comparée à une valeur de référence.In the context of the present invention, the quantity of ESM-1 measured is generally expressed in ng/mL of plasma. This value can then be compared to a reference value.
La comparaison de la quantité d'ESM-1 avec une valeur de référence indique si ledit patient présente un risque de développer un SDRA. Typiquement, une quantité inférieure à la valeur de référence prédit la survenue d’une SDRA chez le patient. Dans le cadre de la présente invention, de préférence, la valeur de référence va de 2,5 ng/mL de sang à 5 ng/mL de sang, de préférence la valeur de référence est égale à 5 ng/mL de sang.Comparing the amount of ESM-1 with a reference value indicates whether said patient is at risk of developing ARDS. Typically, an amount below the reference value predicts the occurrence of ARDS in the patient. In the context of the present invention, preferably, the reference value ranges from 2.5 ng/mL of blood to 5 ng/mL of blood, preferably the reference value is equal to 5 ng/mL of blood.
La mesure de la quantité d’ESM-1 dans un échantillon de sang du patient et la comparaison à la valeur de référence permet également de déterminer la quantité d’ESM-1 administrée au patient, par exemple une quantité suffisante pour restaurer une quantité d’ESM-1 supérieure à la valeur de référence.Measuring the amount of ESM-1 in a patient's blood sample and comparing it to the reference value also makes it possible to determine the amount of ESM-1 administered to the patient, for example an amount sufficient to restore an amount of 'ESM-1 greater than the reference value.
Ainsi, les étapes (a) et (b) peuvent être répétées plusieurs fois si nécessaire jusqu’à ce que la quantité d’ESM-1 mesurée à l’étape a) soit supérieure à la valeur de référence. Les étapes (a) et (b) peuvent également être répétées plusieurs fois jusqu’à ce que la quantité d’ESM-1 mesurée à l’étape a) se maintienne à un niveau supérieur à la valeur de référence.Thus, steps (a) and (b) can be repeated several times if necessary until the quantity of ESM-1 measured in step a) is greater than the reference value. Steps (a) and (b) can also be repeated several times until the quantity of ESM-1 measured in step a) remains at a level above the reference value.
Dans un mode de réalisation particulier, les étapes (a) et (b) sont répétées pendant 5 jours à 10 jours, par exemple tous les jours pendant 5 jours à 10 jours. Cela permet de suivre la quantité d’ESM-1 chez le patient au cours du temps et d’ajuster la quantité d’ESM-1 qui est administrée au patient pendant la période considérée.
In a particular embodiment, steps (a) and (b) are repeated for 5 days to 10 days, for example every day for 5 days to 10 days. This makes it possible to monitor the amount of ESM-1 in the patient over time and adjust the amount of ESM-1 that is administered to the patient during the period in question.
Exemple 1 : effet de l’ESM-1 murin glycosylé dans un modèle de SDRA chez la souris déficiente en ESM-1 (endocan)Example 1: effect of glycosylated murine ESM-1 in a model of ARDS in mice deficient in ESM-1 (endocan)
L’objectif de ce travail était d’étudier spécifiquement l’effet anti-inflammatoire de l’endocan, en s’affranchissant des interférences causées par l’endocan endogène. Par ailleurs, l’effet préemptif et/ou thérapeutique propre de l’endocan sur l’hypoxémie secondaire à un tableau de SDRA, n’ont encore jamais été investigués. Dans ce but, nous avons comparé d’une part les caractéristiques de l’atteinte inflammatoire pulmonaire et d’autre part la sévérité de l’hypoxémie et de la dysfonction pulmonaire dans un modèle d’agression pulmonaire aigue chez la souris déficiente en endocan (Esm1-/-) et la souris sauvage (WT). Secondairement, nous avons validé ces résultats en évaluant l’effet d’une administration continue d’endocan dans un même modèle identique d’agression pulmonaire chez la souris déficiente (Esm1-/-).The objective of this work was to specifically study the anti-inflammatory effect of endocan, avoiding the interference caused by endogenous endocan. Furthermore, the preemptive and/or therapeutic effect of endocan on hypoxemia secondary to ARDS has never been investigated. For this purpose, we compared on the one hand the characteristics of the pulmonary inflammatory attack and on the other hand the severity of hypoxemia and pulmonary dysfunction in a model of acute pulmonary attack in mice deficient in endocan ( Esm1 -/- ) and wild-type mice (WT). Secondarily, we validated these results by evaluating the effect of continuous administration of endocan in the same identical model of pulmonary insult in deficient mice (Esm1 -/- ).
1.1. Matériels et méthodesMaterials and methods
1.11.1 Production et purification de l’endocan murinProduction and purification of murine endocan
L’endocan recombinant murin glycosylé a été produit, puis purifié, dans des cellules CHO transfectées comme précédemment décrit [9]. Les cellules CHO ont été mises en cultures en suspension dans un milieu sans sérum (serum-free CHO media (Gibco, Waltham, Massachusetts, USA)) et placées dans des bioréacteurs (réf. CL1000 bioreactors (réf. Z688029, Integra Biosciences, Cergy, France)) afin d’obtenir un surnageant cellulaire riche en endocan murin glycosylé. Après recueil du surnageant, l’endocan recombinant a été purifié sur une colonne échangeuse d’ions (HiTrap Q FF (réf. 17-5156-01, GE healthcare, USA)), puis sur une colonne d’affinité coatée par l’anticorps anti endocan murin MEP14, comme précédemment décrit [9]. L’endocan murin a ensuite été concentré par centrifugation en utilisant une membrane semi-perméable (Amicon® Ultra Centrifugal Filters). Une détermination de la concentration finale en endocan a été réalisée avec un kit ELISA spécifique de dosage d’endocan (réf. LIK-1101, DIYEK EndoMark M1, Biothelis, France). Chaque lot d’endocan produit a finalement été contrôlé par la technique de Western Blot pour s’assurer de la présence exclusive de la forme glycosylée, et un dosage de LPS par un test spécifique (LAL test (réf. 50-650U, Lonza, Switzerland)) a été réalisé sur chaque lot pour garantir de l’absence de LPS.The glycosylated murine recombinant endocan was produced, then purified, in transfected CHO cells as previously described [9]. CHO cells were cultured in suspension in serum-free medium (serum-free CHO media (Gibco, Waltham, Massachusetts, USA)) and placed in bioreactors (ref. CL1000 bioreactors (ref. Z688029, Integra Biosciences, Cergy , France)) in order to obtain a cellular supernatant rich in glycosylated murine endocan. After collecting the supernatant, the recombinant endocan was purified on an ion exchange column (HiTrap Q FF (ref. 17-5156-01, GE healthcare, USA)), then on an affinity column coated with anti-murine endocan MEP14 antibody, as previously described [9]. The murine endocan was then concentrated by centrifugation using a semi-permeable membrane (Amicon® Ultra Centrifugal Filters). A determination of the final endocan concentration was carried out with a specific endocan assay ELISA kit (ref. LIK-1101, DIYEK EndoMark M1, Biothelis, France). Each batch of endocan produced was finally controlled by the Western Blot technique to ensure the exclusive presence of the glycosylated form, and a dosage of LPS by a specific test (LAL test (ref. 50-650U, Lonza, Switzerland)) was carried out on each batch to guarantee the absence of LPS.
1.21.2 Animaux et aspect éthiquesAnimals and ethical aspects
Nous avons eu recours à des souris mâles C57Bl/6 Esm1-/- et WT littermate, âgées de 7 – 11 semaines et en reproductions dans notre animalerie. Le protocole de l’étude a été approuvé par la commission d’éthique locale et toutes les expérimentations animales ont suivi les règles de bonnes pratiques éthiques (n° APAFIS#6059).We used male C57Bl/6 Esm1-/- and WT littermate mice, aged 7 – 11 weeks and breeding in our animal facility. The study protocol was approved by the local ethics committee and all animal experiments followed the rules of good ethical practice (no. APAFIS#6059).
1.31.3 Obtention des souris Esm1-/-Obtaining Esm1-/- mice
Pour obtenir les lignées C57Bl/6 Esm1-/-, nous avons inséré des loci de reconnaissance loxP autours des exons 1 et 2 du gène murin Esm1 (Ensembl ID ENSMUSG00000042379), puis, en collaboration avec l’Institut Clinique de la Souris (Strasbourg, France), nous avons transfecté par électroporation un fragment d’ADNc porteur d’une cassette de résistance à la néomycine encadrée par des loci loxP dans des cellules souches embryoniques murines. Nous avons alors obtenu par recombinaison homologue un remplacement des exons 1 et 2 du gène Esm1 par le fragment porteur du gène de résistance à la néomycine. Nous avons ensuite sélectionné les cellules souches embryonnaires transfectée par culture dans du milieu contenant du G418, puis nous avons vérifié la délétion par technique Southern blot. Pour finir, nous avons injecté les cellules embryonnaires déficientes Esm1-/- dans des blastocystes secondairement placés dans l’utérus de souris femelles pseudo gestantes. Nous avons ensuite croisé la progéniture obtenue pour obtenir des lignées de souris déficientes homozygote en exon 1 et 2 du gène Esm1. Enfin, nous avons croisé ces souris avec d’autres souris porteuses d’une délétion Cre pour éliminer le gène de résistance à la néomycine. Pour vérifier la délétion Esm1-/-, un génotypage a été réalisé après extraction d’ADN à partir d’un prélèvement biologique, et une PCR a été réalisée avec le kit REDExtract-N-Amp™ Tissue PCR kit (réf. 254-457-8, Sigma-Aldrich, USA avec les amorces suivantes : 1f (SEQ ID NO : 2 : ATGTCTATGTCAGTCTCCTC) et 1r (SEQ ID NO : 3 : CTCTTGCCAGCCTCTCTTGT) pour générer un fragment de 310 paires de bases pour l’allèle sauvage et 1f et 2r (SEQ ID NO : 4 : CTCCAAAATCCAGAAACCC) pour générer un fragment de 442 paires de bases pour l’allèles KO. Les échantillons ont ensuite été analysés sur gel d’agarose.To obtain the C57Bl/6 Esm1-/- lines, we inserted loxP recognition loci around exons 1 and 2 of the murine Esm1 gene (Ensembl ID ENSMUSG00000042379), then, in collaboration with the Institut Clinique de la Souris (Strasbourg , France), we transfected by electroporation a cDNA fragment carrying a neomycin resistance cassette framed by loxP loci into murine embryonic stem cells. We then obtained by homologous recombination a replacement of exons 1 and 2 of the Esm1 gene with the fragment carrying the neomycin resistance gene. We then selected the transfected embryonic stem cells by culture in medium containing G418, then we verified the deletion by Southern blot technique. Finally, we injected Esm1-/--deficient embryonic cells into blastocysts secondarily placed in the uterus of pseudo-pregnant female mice. We then crossed the resulting offspring to obtain lines of mice homozygously deficient in exon 1 and 2 of the Esm1 gene. Finally, we crossed these mice with other mice carrying a Cre deletion to eliminate the neomycin resistance gene. To verify the Esm1-/- deletion, genotyping was carried out after extraction of DNA from a biological sample, and a PCR was carried out with the REDExtract-N-Amp™ Tissue PCR kit (ref. 254- 457-8, Sigma-Aldrich, USA with the following primers: 1f (SEQ ID NO: 2: ATGTCTATGTCAGTCTCCTC) and 1r (SEQ ID NO: 3: CTCTTGCCAGCCTCTCTTGT) to generate a 310 base pair fragment for the wild allele and 1f and 2r (SEQ ID NO: 4: CTCCAAAATCCAGAAAACCC) to generate a 442 base pair fragment for the KO allele. The samples were then analyzed on agarose gel.
1.41.4 Protocoles expérimentauxExperimental protocols
Les deux protocoles expérimentaux utilisés pour cette étude sont décrits
1.51.5 Préparation des osmopompes et implantation sous cutanéePreparation of osmopumps and subcutaneous implantation
Nous avons eu recours à des osmopompes permettant une administration continue de la solution chargée durant 3 jours, à un débit fixe de 1 µL.h-1. Chaque osmopompe de 100 µL a été remplie soit avec 200 µg d'endocan recombinant murin glycosylé (100 µl de solution d'endocan à une concentration finale de 2 mg.mL-1), soit par 100 µL de PBS. Les osmopompes ont ensuite été immergées dans du PBS pour une durée maximale de 4 heures avant leur implantation en sous cutanée. Après avoir anesthésié les souris conformément au protocole défini plus loin, nous avons réalisé une désinfection cutanée puis nous avons implanté les osmopompes en sous cutané. L'anesthésie générale a alors été antagonisée par injection intrapéritonéale de 5 mg.kg-1d'atipamezole.We used osmopumps allowing continuous administration of the loaded solution for 3 days, at a fixed flow rate of 1 µL.h -1 . Each 100 µL osmopump was filled either with 200 µg of glycosylated murine recombinant endocan (100 µl of endocan solution at a final concentration of 2 mg.mL -1 ), or with 100 µL of PBS. The osmopumps were then immersed in PBS for a maximum period of 4 hours before their subcutaneous implantation. After anesthetizing the mice in accordance with the protocol defined below, we carried out skin disinfection and then implanted the osmopumps subcutaneously. General anesthesia was then antagonized by intraperitoneal injection of 5 mg.kg -1 of atipamezole.
1.61.6 Préparation et administration du LPS pour le modèle d'agression pulmonairePreparation and administration of LPS for lung insult model
Le LPS utilisé dans notre protocole (E. Coli O111 : B4, Sigma-Aldrich, USA) a été préparé en conditions stériles. Pour chaque souris, 10 mg.kg-1de LPS ont été dilués dans du PBS pour obtenir un volume final de 50 µL. Pour le protocole d'agression aigue pulmonaire induite par le LPS, les souris ont été placées sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale de 75 mg.kg-1de kétamine et de 0,5 mg.kg-1demedetomidine, puis, la solution contenant le LPS a été administrée par instillation intratrachéale. L'anesthésie générale a ensuite été antagonisée comme précédemment décrit.The LPS used in our protocol (E. Coli O111: B4, Sigma-Aldrich, USA) was prepared under sterile conditions. For each mouse, 10 mg.kg -1 of LPS was diluted in PBS to obtain a final volume of 50 µL. For the LPS-induced acute pulmonary insult protocol, the mice were placed under general anesthesia by intraperitoneal injection of 75 mg.kg -1 of ketamine and 0.5 mg.kg -1 of demedetomidine, then, the solution containing LPS was administered by intratracheal instillation. General anesthesia was then antagonized as previously described.
1.71.7 Évaluation clinique quotidienne et mesure non invasive de l'oxymétrieDaily clinical assessment and non-invasive measurement of oximetry
Dans chaque protocole, un examen clinique quotidien des souris a été réalisé afin d’évaluer la viabilité de la souris et de mesurer son poids. Un enregistrement continu non invasif de l'oxymétrie transcutanée, du rythme cardiaque ainsi que de la fréquence respiratoire a été réalisé sur souris vigile quotidiennement par le dispositif MouseOx® Plus device (Starr Life Sciences Corp, USA). Toutes les données obtenues ont été moyennées sur une durée d'enregistrement continue durant entre 5 et 10 minutes.In each protocol, a daily clinical examination of the mice was carried out to assess the viability of the mouse and measure its weight. Continuous non-invasive recording of transcutaneous oximetry, heart rate and respiratory rate was carried out on vigilant mice daily using the MouseOx® Plus device (Starr Life Sciences Corp, USA). All data obtained were averaged over a continuous recording duration lasting between 5 and 10 minutes.
1.81.8 Prélèvement biologiques et bio-conservationBiological sampling and bio-preservation
Immédiatement après le sacrifice de la souris, des prélèvements sanguins et des lavages broncho-alvéolaires (LBA) ont été réalisés et les poumons ont été prélevées. Les prélèvements sanguins ont été réalisés par section des gros vaisseaux thoraciques et stockés dans des aliquotes placés à température ambiante jusqu'à coagulation complète. Au décours, les aliquotes de sang coagulés ont été centrifugés à 1500g pendant 5 minutes à température ambiante. Le sérum et le culot de centrifugation ont alors été séparés et le sérum a été conservé à -20°C. Les LBA ont été réalisés uniquement sur le poumon droit après ligature soigneuse de la bronche souche du poumon gauche, par deux lavages successifs de 500 µL de PBS stérile, puis stockés immédiatement dans des aliquots placés dans de la glace. Les LBA ont alors été centrifugés à 1500g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant et le culot de centrifugation ont été séparés et le surnageant conservé à -20°C. Le culot de centrifugation a été suspendu à nouveau dans 1 mL de PBS et homogénéisé. Les cellules re-suspendues ont été comptées manuellement sur cellule de Thoma. 100 000 cellules ont alors été étalées sur une lame de verre grâce à un Shandon Cytospin 4 (Thermo electron corporation, USA), puis colorées par une coloration de May-Grünwald Giemsa. Le poumon gauche a été placé dans une solution d'Antigenfix® (réf. 2545826, MM FRANCE, France) pendant 4 heures, rincé par deux bains successifs de PBS, puis progressivement déshydraté par immersion successive dans des bains d’alcool ayant une concentration croissante. Les pièces de poumons ont ensuite été placées dans un bain de Diasolv® (réf. 2545839, MM FRANCE, France) pendant 30 minutes puis inclues en paraffine pendant toute une nuit.Immediately after mouse sacrifice, blood samples and bronchoalveolar washings (BAL) were performed and lungs were removed. Blood samples were taken by sectioning the large thoracic vessels and stored in aliquots placed at room temperature until complete coagulation. Subsequently, the aliquots of clotted blood were centrifuged at 1500 g for 5 minutes at room temperature. The serum and the pellet were then separated and the serum was stored at -20°C. BALs were performed only on the right lung after careful ligation of the main bronchus of the left lung, by two successive washes of 500 µL of sterile PBS, then stored immediately in aliquots placed on ice. The BALs were then centrifuged at 1500 g for 10 minutes at 4°C. The supernatant and the centrifugation pellet were separated and the supernatant stored at -20°C. The centrifugation pellet was resuspended in 1 mL of PBS and homogenized. The resuspended cells were counted manually on a Thoma cell. 100,000 cells were then spread on a glass slide using a Shandon Cytospin 4 (Thermo electron corporation, USA), then stained with a May-Grünwald Giemsa stain. The left lung was placed in a solution of Antigenfix® (ref. 2545826, MM FRANCE, France) for 4 hours, rinsed with two successive baths of PBS, then gradually dehydrated by successive immersion in alcohol baths having a concentration increasing. The lung pieces were then placed in a Diasolv® bath (ref. 2545839, MM FRANCE, France) for 30 minutes then embedded in paraffin overnight.
1.91.9 Comptage des cellules inflammatoire et examen histologiqueInflammatory cell counting and histological examination
Pour chaque spot cellulaire de LBA préparé par Cytospin, un minimum de 200 cellules ont été manuellement comptées par un opérateur en aveugle du groupe expérimental de la souris étudiée. Chaque leucocyte visualisé a été catégorisé en tant que polynucléaire neutrophile, macrophage/monocyte, ou lymphocyte. Les proportions respectives et les nombres absolus de chaque type cellulaire ont été calculés. Les poumons inclus en paraffine ont été préparés pour l’analyse histologique à l’aide d’un microtome de façon à obtenir des coupes de 5 µm d’épaisseur. Les lames ont ensuite été colorées et examinées par un anatomopathologiste entrainé et en aveugle du groupe expérimental de la souris, de manière à déterminer le score Lung Injury Scoring System (LISS) comme décrit par [10].For each BAL cell spot prepared by Cytospin, a minimum of 200 cells were manually counted by a blinded operator from the experimental group of the mouse studied. Each visualized leukocyte was categorized as a neutrophil, macrophage/monocyte, or lymphocyte. The respective proportions and absolute numbers of each cell type were calculated. The paraffin-embedded lungs were prepared for histological analysis using a microtome to obtain 5 µm thick sections. The slides were then stained and examined by a trained pathologist blinded to the mouse experimental group, to determine the Lung Injury Scoring System (LISS) score as described by [10].
1.101.10 Détermination de la concentration en protéines totale, en mMPO, en mTNFα et en endocan dans les échantillonsDetermination of total protein, mMPO, mTNFα and endocan concentration in samples
Les échantillons de sérum et de LBA ont été décongelés puis homogénéisés par agitation. La concentration en protéines des LBA a été déterminée par le kit Pierce™ BCA Protein Assay (réf. 23227, Thermo Fisher Scientific, USA). La concentration des LBA en mMPO a été déterminée par le kit mMPO DuoSet ELISA kit (réf. DY3667, R&D Systems, USA). La concentration des LBA en mTNFα a été déterminée par le kit mTNFα DuoSet ELISA (réf. DY410, R&D Systems, USA). Le dosage des taux sériques en endocan a été réalisé par le kit DIYEK M1 ELISA kit (réf. LIK-1101, Biothelis, France).The serum and BAL samples were thawed and then homogenized by shaking. The protein concentration of BAL was determined by the Pierce™ BCA Protein Assay kit (cat. no. 23227, Thermo Fisher Scientific, USA). The concentration of BAL in mMPO was determined by the mMPO DuoSet ELISA kit (ref. DY3667, R&D Systems, USA). The mTNFα concentration of BAL was determined using the mTNFα DuoSet ELISA kit (ref. DY410, R&D Systems, USA). The determination of serum levels in endocan was carried out using the DIYEK M1 ELISA kit (ref. LIK-1101, Biothelis, France).
1.111.11 StatistiquesStatistics
Toutes les analyses statistiques ont été réalisé avec le logiciel SPPS® 26 software (IBM, USA) pour Windows et tous les graphiques présentés avec le logiciel GraphPad Prism 6.0 software. La normalité des variables quantitatives n’a pas été retenue du fait des faibles effectifs. Un test de Mann–Whitney a été utilisé pour comparer la distribution des variables quantitatives non appariées. Pour le premier protocole, l’évaluation de l’effet du groupe expérimental de chaque souris sur les paramètres inflammatoires et l’évolution de l’oxymétrie, a été testé à l’aide d’un modèle mixe linéaire sur l’ensemble de la période étudiée de J0 à J10 en utilisant une approximation de Satterwaite. La variable « Groupe » a été considérée comme un effet fixe et la variable « Temps » comme un effet variable. Nous avons évalué l’effet du groupe expérimental de la même manière pour l’évolution de l’oxymétrie dans le second protocole. Les distributions des évaluations répétées dans le temps d’une même variable quantitative ont été testées par un test de Kruskal-Wallis. Tous les tests ont été réalisés en bilatéral avec un risque alpha fixé à 0.05.All statistical analyzes were carried out with SPPS® 26 software (IBM, USA) for Windows and all graphs presented with GraphPad Prism 6.0 software. The normality of the quantitative variables was not retained due to the low numbers. A Mann–Whitney test was used to compare the distribution of unpaired quantitative variables. For the first protocol, the evaluation of the effect of the experimental group of each mouse on the inflammatory parameters and the evolution of oximetry, was tested using a linear mixed model over the entire period studied from D0 to D10 using a Satterwaite approximation. The “Group” variable was considered as a fixed effect and the “Time” variable as a variable effect. We evaluated the effect of the experimental group in the same way for the evolution of oximetry in the second protocol. The distributions of repeated evaluations over time of the same quantitative variable were tested using a Kruskal-Wallis test. All tests were carried out bilaterally with an alpha risk set at 0.05.
2.2. RésultatsResults
2.12.1 L’endocan endogène murin diminue la sévérité de l’inflammation aigue pulmonaire et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire.Murine endogenous endocan reduces the severity of acute pulmonary inflammation and improves pulmonary physiological dysfunction.
Dans notre premier modèle d’inflammation aigue pulmonaire induite par le LPS, nous avons mis en évidence que le taux sérique d’endocan variait en fonction du temps (p < 0.001) (Figure 2A). Les taux sériques médian d’endocan murin étaient de 2.59 ng.mL-1[2.39; 2.78] à J0, 0.42 [0.35; 0.68] à H12 et 2.28 [1.94; 2.57] à J10.In our first model of acute pulmonary inflammation induced by LPS, we demonstrated that the serum endocan level varied over time (p < 0.001) (Figure 2A). Median serum levels of murine endocan were 2.59 ng.mL -1 [2.39; 2.78] to D0, 0.42 [0.35; 0.68] to H12 and 2.28 [1.94; 2.57] at D10.
Nous avons observé sur l’ensemble de la période allant de J0 à J10, que les phénomènes de diapédèse leucocytaire étaient moins importants chez les souris WT que chez les souris Esm1-/-(p < 0.001) (Figure 2B). Le recrutement leucocytaire était moins important chez les souris WT à J1, J2, J4 et J5 que chez les souris Esm1-/-(respectivement à J1: 450x103cellules [340; 465] vs 775 x103cellules [700; 1500] p < 0.001, à J2: 940 x103cellules [870; 1140] vs 1440x103cellules [1130; 1850] p = 0.011, à J4: 1365x103cellules [985; 2180] vs 2280x103cellules [1520; 3010] p = 0.03 et à J5: 945x103cellules [690; 1160] vs 2270x103cellules [2090; 3300] p = 0.004) (Figure 2B). Le taux maximal de recrutement de leucocytes se situait à J3 pour les souris WT et J4 pour les souris Esm1-/-.We observed over the entire period from D0 to D10 that leukocyte diapedesis phenomena were less significant in WT mice than in Esm1 -/- mice (p < 0.001) (Figure 2B). Leukocyte recruitment was less significant in WT mice on D1, D2, D4 and D5 than in Esm1 -/- mice (respectively on D1: 450x10 3 cells [340; 465] vs 775 x10 3 cells [700; 1500] p < 0.001, on D2: 940 x10 3 cells [870; 1140] vs 1440x10 3 cells [1130; 1850] p = 0.011, on D4: 1365x10 3 cells [985; 2180] vs 2280x10 3 cells [1520; 3010] p = 0.03 and on D5: 945x10 3 cells [690; 1160] vs 2270x10 3 cells [2090; 3300] p = 0.004) (Figure 2B). The maximum leukocyte recruitment rate was on D3 for WT mice and D4 for Esm1 -/- mice.
Sur la même période, des résultats comparables étaient trouvés pour les polynucléaires neutrophiles avec une diminution du nombre de neutrophiles retrouvés chez les souris WT versus les souris Esm1-/-(p < 0.001) (Figure 2C). Le recrutement alvéolaire en neutrophile était moins important chez les souris WT versus Esm1-/-à J1, J2, J4 et J5 (respectivement à J1: 335x103cellules [278; 406] vs 696 x103cellules [602; 1425] p = 0.003, à J2: 853x103cellules [689; 950] vs 1117x103cellules [1029; 1756] p = 0.007, à J4: 577x103cellules [195; 1765] vs 1932x103cellules [1251; 2153] p = 0.02 et à J5: 365x103cellules [198; 646] vs 1636x103cellules [1407; 1698] p = 0.01) (Figure 2C). Le recrutement maximal des neutrophiles était observé à J3 pour les souris WT contre J4 pour les souris Esm1-/-.Over the same period, comparable results were found for polymorphonuclear neutrophils with a decrease in the number of neutrophils found in WT mice versus Esm1 -/- mice (p < 0.001) (Figure 2C). Alveolar recruitment of neutrophils was less significant in WT versus Esm1 -/- mice on D1, D2, D4 and D5 (respectively on D1: 335x10 3 cells [278; 406] vs 696 x10 3 cells [602; 1425] p = 0.003, on D2: 853x10 3 cells [689; 950] vs 1117x10 3 cells [1029; 1756] p = 0.007, on D4: 577x10 3 cells [195; 1765] vs 1932x10 3 cells [1251; 2153] p = 0.02 and at D5: 365x10 3 cells [198; 646] vs 1636x10 3 cells [1407; 1698] p = 0.01) (Figure 2C). Maximum recruitment of neutrophils was observed on D3 for WT mice versus D4 for Esm1 -/- mice.
Sur l’ensemble de la période, nous n’avons pas mis en évidence de différence entre les groupes concernant le recrutement de macrophage (p = 0.57) (Figure 2D). Le recrutement maximal en macrophage était observé à J5 chez les souris WT (687x103cellules.mL-1[620; 940]) contre J6 chez les souris Esm1-/-(536x103cellules.mL-1[358; 753]).Over the entire period, we did not demonstrate any difference between the groups regarding macrophage recruitment (p = 0.57) (Figure 2D). Maximum macrophage recruitment was observed on D5 in WT mice (687x10 3 cells.mL -1 [620; 940]) compared to D6 in Esm1 -/- mice (536x10 3 cells.mL -1 [358; 753]) .
Sur la période allant de J0 à J10, les concentrations de mMPO dans les LBA étaient moins importante chez les souris WT que chez les souris Esm1-/-(p < 0.001) (Figure 2E). A J5 et J6, les concentrations de mMPO dans les LBA étaient plus faible chez les souris WT comparées aux souris Esm1-/-(respectivement 547 µg.mL-1[441; 1110] vs 1437 µg.mL-1[1200; 1657] p = 0.015, et 211 µg.mL-1[191; 417] vs 796 µg.mL-1[512; 1070] p < 0.001). Les concentrations maximales de mMPO étaient observées à J4 pour les souris WT (1153 µg.mL-1[772; 1815]) versus J5 pour les souris Esm1-/- (1437 µg.mL-1[1200; 1657]).Over the period from D0 to D10, the concentrations of mMPO in the BAL were lower in WT mice than in Esm1 -/- mice (p < 0.001) (Figure 2E). On D5 and D6, the concentrations of mMPO in the BAL were lower in WT mice compared to Esm1 -/- mice (respectively 547 µg.mL -1 [441; 1110] vs 1437 µg.mL -1 [1200; 1657 ] p = 0.015, and 211 µg.mL -1 [191; 417] vs 796 µg.mL -1 [512; 1070] p < 0.001). Maximum concentrations of mMPO were observed on D4 for WT mice (1153 µg.mL -1 [772; 1815]) versus D5 for Esm1-/- mice (1437 µg.mL -1 [1200; 1657]).
Nous n’avons pas mis en évidence de différence entre les groupes concernant les concentrations alvéolaire en mTNFα, ou les concentrations de protéine dans le LBA (Figure 2F and 2G).We did not demonstrate any difference between the groups regarding alveolar mTNFα concentrations, or protein concentrations in the BAL (Figure 2F and 2G).
A l’aide du dispositif de mesure non invasif de l’oxymétrie et en considérant l’ensemble de la période entre J0 à J10, nous avons mis en évidence une amélioration significative de la fonction physiologique pulmonaire en faveur des souris WT (p < 0.001) (Figure 2H). Nous avons également observé des chiffres plus élevés de SpO2chez les souris WT à J4 et J5, comparés aux souris Esm1-/-(respectivement pour le groupe WT et Esm1-/-: 84% [63; 92] vs 74% [71; 78], p = 0.035 et 81% [61; 85] vs 69% [64; 70], p = 0.017) (Figure 2H). Nous n’avons pas mis en évidence de différence concernant les fréquences cardiaque et respiratoire sur la période entre J0 et J10 (respectivement p = 0.539 and p = 0.075).Using the non-invasive oximetry measuring device and considering the entire period between D0 to D10, we demonstrated a significant improvement in physiological pulmonary function in favor of WT mice (p < 0.001 ) (Figure 2H). We also observed higher SpO 2 figures in WT mice on D4 and D5, compared to Esm1 -/- mice (respectively for the WT and Esm1 -/- group: 84% [63; 92] vs 74% [ 71; 78], p = 0.035 and 81% [61; 85] vs 69% [64; 70], p = 0.017) (Figure 2H). We did not demonstrate any difference in heart and respiratory rates over the period between D0 and D10 (respectively p = 0.539 and p = 0.075).
2.22.2 L’administration d’endocan chez des souris Esm1Administration of endocan in Esm1 mice -/--/- au décours d’un stimulus inflammatoire diminue l’inflammation pulmonaire et améliore la dysfonction physiologique pulmonairefollowing an inflammatory stimulus reduces pulmonary inflammation and improves pulmonary physiological dysfunction
Le second protocole a examiné les effets biologiques d’une administration continue et sous cutanée d’endocan recombinant murin, 5 jours après l’administration intratrachéale de LPS. Au moment de l’administration intratrachéale de LPS (D0), les taux sériques d’endocan observés chez les souris Esm1-/-traitées par endocan murin, étaient de 67.8 ng.mL-1[45.9; 85.3].The second protocol examined the biological effects of continuous, subcutaneous administration of murine recombinant endocan, 5 days after intratracheal administration of LPS. At the time of intratracheal administration of LPS (D0), serum endocan levels observed in Esm1 -/- mice treated with murine endocan were 67.8 ng.mL -1 [45.9; 85.3].
A J5, on observait chez les souris Esm1-/-traitées par endocan une diminution significative du recrutement leucocytaire total, du recrutement en polynucléaires neutrophiles, ainsi que du recrutement en macrophages comparées aux souris Esm1-/-traitées par PBS (respectivement, 865x103cellules.mL-1[640; 1130] vs 2130x103cellules [1540; 2550], p = 0.012 pour les leucocytes totaux, 638x103cellules.mL-1[476; 855] vs 1489x103cellules [1285; 2146] p = 0.012 pour les neutrophiles, et 164x103cellules.mL-1[141; 255] vs 404x103cellules [354; 610] p = 0.018 pour les macrophages) (Figure 3A, 3B, and 3C). Les concentrations en protéines dans les LBA étaient moins importantes dans le groupe traité par endocan (965 µg.mL-1[690; 1040] vs 1417µg.mL-1[1306; 1655], p = 0.05) (Figure 3F).On D5, a significant decrease in total leukocyte recruitment, neutrophil recruitment, and macrophage recruitment was observed in Esm1 -/- mice treated with endocan compared to Esm1 -/- mice treated with PBS (respectively, 865x10 3 cells.mL -1 [640; 1130] vs 2130x10 3 cells [1540; 2550], p = 0.012 for total leukocytes, 638x10 3 cells.mL -1 [476; 855] vs 1489x10 3 cells [1285; 2146] p = 0.012 for neutrophils, and 164x10 3 cells.mL -1 [141; 255] vs 404x10 3 cells [354; 610] p = 0.018 for macrophages) (Figure 3A, 3B, and 3C). Protein concentrations in BAL were lower in the endocan-treated group (965 µg.mL -1 [690; 1040] vs 1417 µg.mL -1 [1306; 1655], p = 0.05) (Figure 3F).
Nous n’avons pas mis en évidence de différence concernant les concentrations en mMPO et mTNFα entre les différents groupes (respectivement pour le groupe traité par endocan et le groupe traité par PBS 1275 µg.mL-1[774; 1930] vs 1840 µg.mL-1[1390; 2890] p = 0.145, et 207 pg.mL-1[178; 373] vs 348 pg.mL-1[183; 631] p = 0.388) (Figure 3D and 3E).We did not demonstrate any difference in the concentrations of mMPO and mTNFα between the different groups (respectively for the group treated with endocan and the group treated with PBS 1275 µg.mL -1 [774; 1930] vs 1840 µg. mL -1 [1390; 2890] p = 0.145, and 207 pg.mL -1 [178; 373] vs 348 pg.mL -1 [183; 631] p = 0.388) (Figure 3D and 3E).
L’évaluation de la dysfonction physiologique pulmonaire est représentée sur la Figure 3G. Sur l’ensemble de la période s’étalant de J0 à J5, les souris traitées par endocan avaient des valeurs de SpO2plus élevées comparées aux souris traitées par PBS (p < 0.001). Concernant la SpO2, nous avons observé une différence significative à J4 et J5 en faveur du groupe traité par endocan (84% [76; 89] vs 67% [65; 78], p = 0.023 à J4, et 78% [73; 90] vs 69% [63; 73], p = 0.02 à J5). Sur la même période, aucune différence n’était mise en évidence pour la fréquence cardiaque ou la fréquence respiratoire (respectivement p = 0.771 et p = 0.522).Assessment of pulmonary physiological dysfunction is shown in Figure 3G. Over the entire period spanning from D0 to D5, mice treated with endocan had higher SpO 2 values compared to mice treated with PBS (p < 0.001). Concerning SpO 2 , we observed a significant difference on D4 and D5 in favor of the group treated with endocan (84% [76; 89] vs 67% [65; 78], p = 0.023 on D4, and 78% [73 ; 90] vs 69% [63; 73], p = 0.02 on D5). Over the same period, no difference was demonstrated for heart rate or respiratory rate (respectively p = 0.771 and p = 0.522).
2.32.3 La supplémentation en endocan de souris Esm1Endocan supplementation of Esm1 mice -/--/- diminue les altérations histologiques induite par l’inflammation aigue pulmonairereduces histological alterations induced by acute pulmonary inflammation
Dans le premier protocole, nous n’avons pas mis en évidence de différence de valeur de LISS entre le WT et Esm1-/-(respectivement 0.578 [0.541; 0.680] vs 0.756 [0.530; 0.772], p = 0.699) (
3.3. DiscussionDiscussion
Les tableaux de SDRA sont des entités syndromiques graves secondaires à une atteinte alvéolaire diffuse (DAD). Cette atteinte alvéolaire peut être la conséquence d’un recrutement non contrôlé des polynucléaires neutrophiles du compartiment sanguin vers le compartiment alvéolaire. (2) L’endocan, un protéoglycane excrété par l’endothélium pulmonaire surexprimé en condition inflammatoire, pourrait, en se liant à l’intégrine leucocytaire LFA-1 entrainant une limitation des mécanismes de diapédèse leucocytaire, avoir un rôle anti-migratoire sur les neutrophiles. [11]ARDS tables are serious syndromic entities secondary to diffuse alveolar damage (DAD). This alveolar damage may be the consequence of uncontrolled recruitment of neutrophils from the blood compartment to the alveolar compartment. (2) Endocan, a proteoglycan excreted by the pulmonary endothelium overexpressed in inflammatory conditions, could, by binding to the leukocyte integrin LFA-1 leading to a limitation of leukocyte diapedesis mechanisms, have an anti-migratory role on neutrophils. [11]
Pour permettre de pouvoir comparer nos résultats avec les données déjà disponibles, nous avons recueilli tous les paramètres inflammatoires ainsi que réalisé les examens histologiques selon les recommandations internationales de l’American Thoracic Society traitant des mesures validées pour l’étude des inflammations aigues pulmonaires dans des modèle animaux [10]). Pour étudier spécifiquement les effets de l’endocan, toutes les souris C57Bl/6 utilisées dans cette étude étaient identiques en terme d’âge, de poids et de conditions d’élevage. La seule condition qui différait était la présence ou non d’endocan. Pour étudier de manière spécifique les effets d’une administration continue d’endocan, nous avons choisi d’avoir recours à des osmopompes sous cutanées permettant une administration de traitement continue et à débit constant sur une durée totale de 3 jours. Nous avons ensuite sacrifié les souris à J5, au regard des résultats acquis lors du premier protocole réalisé. Pour l’administration d’endocan, nous avons eu recours uniquement à la forme glycosylée de l’endocan murin. Pour s’assurer de la pureté de la forme glycosylée et de l’absence de contaminant, des étapes de qualification ont été réalisé de manière systématique comme décrit précédemment.To enable us to compare our results with the data already available, we collected all the inflammatory parameters as well as carried out the histological examinations according to the international recommendations of the American Thoracic Society dealing with validated measurements for the study of acute pulmonary inflammations in animal model [10]). To specifically study the effects of endocan, all C57Bl/6 mice used in this study were identical in terms of age, weight and rearing conditions. The only condition that differed was the presence or absence of endocan. To specifically study the effects of continuous administration of endocan, we chose to use subcutaneous osmopumps allowing continuous administration of treatment at a constant flow rate over a total duration of 3 days. We then sacrificed the mice on D5, based on the results acquired during the first protocol carried out. For the administration of endocan, we used only the glycosylated form of murine endocan. To ensure the purity of the glycosylated form and the absence of contaminants, qualification steps were carried out systematically as described previously.
Les résultats du premier protocole ont mis en évidence que la présence d’endocan endogène (souris WT) diminue la sévérité de l’atteinte inflammatoire pulmonaire induite par le LPS, et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire (SpO2supérieur dans le groupe WT) (
Dans notre second protocole, l’administration continue d’endocan glycosylé murin chez des souris Esm1-/-au décours d’une instillation intra-trachéale de LPS, a d’une part diminué les paramètres de l’inflammation pulmonaire et d’autre part amélioré la dysfonction physiologique pulmonaire. Nous avons vérifié par des dosages sériques que lors de l’administration continue d’endocan il existait bien de l’endocan circulant. Les résultats montrent des taux circulants d’endocan murin glycosylé se situant entre 60 et 70 ng/ml. Sur l’ensemble de la période entre J0 et J5, le traitement par endocan a entrainé une diminution significative du nombre de leucocytes, du nombre de neutrophiles et de macrophages recrutés au niveau alvéolaire, mais aussi a entrainé une amélioration des paramètres de l’oxygénation sanguine (
Au total, toutes ces valeurs confirment que la présence d’endocan (endogène ou exogène) peut, en réponse à un stimulus inflammatoire, non seulement diminuer l’importance de l’inflammation aigue pulmonaire mais aussi améliorer la défaillance physiologique pulmonaire. Par ailleurs, nous avons observé un effet dose avec une réponse plus importante si la concentration sérique en endocan dépasse les taux physiologiques (second protocole).In total, all these values confirm that the presence of endocan (endogenous or exogenous) can, in response to an inflammatory stimulus, not only reduce the importance of acute pulmonary inflammation but also improve physiological pulmonary failure. Furthermore, we observed a dose effect with a greater response if the serum concentration of endocan exceeds physiological levels (second protocol).
Grâce à l’administration continue d’endocan, nous avons pu restaurer des taux circulant important d’endocan permettant d’étudier et de mettre en évidence son action physiologique propre.Thanks to the continuous administration of endocan, we were able to restore high circulating levels of endocan allowing us to study and demonstrate its specific physiological action.
Cette étude montre pour la première fois l’efficacité de l’endocan glycosylé dans un modèle d’inflammation aigue pulmonaire induite par LPS.This study shows for the first time the effectiveness of glycosylated endocan in a model of acute pulmonary inflammation induced by LPS.
Nous avons étudié l’effet de la forme endogène de l’endocan ainsi que l’effet d’une administration continue d’endocan permettant d’obtenir des concentrations sériques supra physiologiques. Des expérimentations préliminaires avaient montré que des taux sériques élevés en endocan ne pouvaient être atteint et maintenus pendant plusieurs heures au décours d’une injection intra-péritonéale unique en endocan (données non publiées). De façon à mieux étudier l’effet de l’administration d’endocan, une administration par perfusion continue semble donc à privilégier.We studied the effect of the endogenous form of endocan as well as the effect of continuous administration of endocan to obtain supraphysiological serum concentrations. Preliminary experiments had shown that high serum levels of endocan could not be achieved and maintained for several hours following a single intraperitoneal injection of endocan (unpublished data). In order to better study the effect of endocan administration, administration by continuous infusion therefore seems to be preferred.
En conclusion, les résultats ont montré qu’au décours d’un stimulus inflammatoire aigu pulmonaire par instillation intra-trachéale de LPS chez la souris C56Bl/6, la perfusion continue d’endocan chez des souris Esm1-/-permet de diminuer significativement l’inflammation pulmonaire et améliorer la dysfonction physiologique pulmonaire.In conclusion, the results showed that following an acute pulmonary inflammatory stimulus by intratracheal instillation of LPS in C56Bl/6 mice, the continuous infusion of endocan in Esm1 -/- mice significantly reduces the pulmonary inflammation and improve pulmonary physiological dysfunction.
Ces résultats confirment que l’endocan glycosylé constitue une solution thérapeutique efficace pour traiter les SDRA.These results confirm that glycosylated endocan constitutes an effective therapeutic solution for treating ARDS.
Claims (13)
(a) mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon de sang du patient,
(b) administrer au patient l’ESM-1 ou la composition en contenant lorsque la quantité d’ESM-1 mesurée à l’étape (a) est inférieure à une valeur de référence.ESM-1 or a pharmaceutical composition containing it for use in a method according to any one of claims 1 to 10, wherein the method comprises the steps of:
(a) measuring the amount of ESM-1 in a blood sample from the patient,
(b) administering the ESM-1 or the composition containing it to the patient when the quantity of ESM-1 measured in step (a) is less than a reference value.
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