FR3135526A1 - METHOD FOR ANALYZING THE VIABILITY OF ANIMAL CELLS BY ELECTROCHEMICAL MEASUREMENT - Google Patents
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Abstract
PROCEDE D’ANALYSE DE LA VIABILITE DE CELLULES ANIMALES PAR MESURE ELECTROCHIM I QU E La présente invention concerne un procédé in vitro d’analyse de la viabilité cellulaire par électrochimie, au moyen de médiateurs d’oxydoréduction, par application d’un potentiel constant, permettant une mesure stable en continu. Figure pour l'abrégé : AucuneMETHOD FOR ANALYZING THE VIABILITY OF ANIMAL CELLS BY ELECTROCHEMICAL MEASUREMENT The present invention relates to an in vitro method for analyzing cell viability by electrochemistry, by means of redox mediators, by application of a constant potential, allowing stable, continuous measurement. Figure for abstract: None
Description
La présente invention concerne l’analyse de la viabilité cellulaire par électrochimie, notamment par analyse de l’activité du transfert d’électrons.The present invention relates to the analysis of cell viability by electrochemistry, in particular by analysis of electron transfer activity.
Les cellules eucaryotes, notamment les cellules animales, notamment humaines, peuvent réaliser des transferts d’électrons vers le compartiment extracellulaire, c’est-à-dire transférer des électrons intracellulaires vers le milieu extracellulaire au travers de la membrane plasmique. Ce mécanisme de transfert d’électrons est couramment nommé tPMET pour « trans-Plasma Membrane Electron Transport ». Outre les cellules animales et humaines il est retrouvé chez de nombreux organismes tels que les levures et les plantes.Eukaryotic cells, in particular animal cells, notably human cells, can transfer electrons to the extracellular compartment, that is to say transfer intracellular electrons to the extracellular environment through the plasma membrane. This electron transfer mechanism is commonly called tPMET for “trans-Plasma Membrane Electron Transport”. In addition to animal and human cells, it is found in many organisms such as yeasts and plants.
Les tPMET ont été mis en évidence dans les années 60 en montrant que des cellules sont capables de réduire des colorants incapables de pénétrer à l’intérieur des cellules. Cependant, les effets de composés redox sur les cellules ont été observés bien avant la découverte des tPMET. Dès 1925, il a été démontré que des colorants peuvent être réduits par des explants de tissus, puis que les membranes plasmiques sont imperméables à ces colorants.tPMETs were demonstrated in the 1960s by showing that cells are capable of reducing dyes that are incapable of penetrating inside cells. However, the effects of redox compounds on cells were observed long before the discovery of tPMETs. As early as 1925, it was demonstrated that dyes can be reduced by tissue explants, and then that plasma membranes are impermeable to these dyes.
Les tPMET sont impliqués dans une grande diversité de processus cellulaires physiologiques et pathologiques. En oxydant le NADH/NADPH intracellulaire, les tPMET permettent d’ajuster l’état redox au sein de la cellule et de contrôler les ratios NAD+/NADH et NADP+/NADPH. Ces deux ratios sont des éléments majeurs du contrôle du métabolisme cellulaire. La simplicité des mécanismes tPMET permet de régénérer rapidement le NAD(P)+; en quelques secondes l’ensemble du pool intracellulaire de NAD(P)H peut être ré-oxydé.tPMETs are involved in a wide variety of physiological and pathological cellular processes. By oxidizing intracellular NADH/NADPH, tPMETs adjust the redox state within the cell and control the NAD + /NADH and NADP + /NADPH ratios. These two ratios are major elements in the control of cellular metabolism. The simplicity of tPMET mechanisms allows rapid regeneration of NAD(P) + ; in a few seconds the entire intracellular pool of NAD(P)H can be re-oxidized.
Les tPMET semblent également être associés à la régulation de la prolifération cellulaire. Ils sont impliqués dans l’entrée d’éléments nutritifs dans les cellules et à la captation du fer. En conditions physiologiques, les tPMET sont impliqués dans la défense de l’organisme contre les attaques d’agents pathogènes par exemple. Les électrons captés du cytoplasme sont utilisés pour générer des composés oxydants toxiques comme du peroxyde d’hydrogène.tPMETs also appear to be associated with the regulation of cell proliferation. They are involved in the entry of nutrients into cells and the uptake of iron. Under physiological conditions, tPMETs are involved in the body's defense against attacks by pathogens, for example. Electrons captured from the cytoplasm are used to generate toxic oxidizing compounds like hydrogen peroxide.
Les tPMET sont en outre impliqués dans divers processus pathologiques. Dans les cellules cancéreuses, les tPMET semblent jouer un rôle majeur en termes d’activité métabolique modifiée/augmentée. En particulier, ils contribuent à la ré-oxydation rapide du NADH généré par la glycolyse et permettent aux cellules de se développer en absence de dioxygène. L’expression d’oncogènes, comme N-myc, semble corrélée au niveau d’activité tPMET de lignées en culture. L’inhibition des tPMET chez les cellules cancéreuses pourrait constituer une nouvelle stratégie pour les thérapies anticancéreuses.tPMETs are further implicated in various pathological processes. In cancer cells, tPMETs appear to play a major role in terms of altered/increased metabolic activity. In particular, they contribute to the rapid re-oxidation of NADH generated by glycolysis and allow cells to grow in the absence of oxygen. The expression of oncogenes, such as N-myc, seems to be correlated with the level of tPMET activity of cultured lines. Inhibition of tPMET in cancer cells could constitute a new strategy for anticancer therapies.
Le suivi des tPMET présente donc un grand intérêt dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire visant des applications biomédicales très variées.Monitoring tPMETs is therefore of great interest in many areas of cell biology targeting very varied biomedical applications.
L’activité tPMET est couramment évaluée par spectrophotométrie en suivant l’apparition ou la disparition de couleur associée à la réduction de colorants. En raison du couplage entre les tPMET et l’activité mitochondriale, cette méthode est utilisée en routine pour évaluer la viabilité des cellules. Les principaux colorants utilisés sont le XTT et le MTT. Le kit de détection commercialisé par ATCC (XTT Cell proliferation Asasy Kit) repose sur ce principe. Les cellules réduisent le médiateur redox phénazine methosulfate (PMS) qui, à son tour, réduit le sel de tétrazolium XTT. La concentration de la forme réduite est mesurée par spectrophotométrie. Il s’agit donc d’une mesure finale qui se fait après que la forme réduite du médiateur redox se soit accumulée en solution.tPMET activity is commonly assessed spectrophotometrically by monitoring the appearance or disappearance of color associated with dye reduction. Due to the coupling between tPMET and mitochondrial activity, this method is routinely used to assess cell viability. The main dyes used are XTT and MTT. The detection kit marketed by ATCC (XTT Cell proliferation Asasy Kit) is based on this principle. Cells reduce the redox mediator phenazine methosulfate (PMS) which, in turn, reduces the tetrazolium salt XTT. The concentration of the reduced form is measured spectrophotometrically. It is therefore a final measurement which is made after the reduced form of the redox mediator has accumulated in solution.
Plus récemment, Sherman et al., Whole Eukaryotic Cells. Anal. Chem. 90, 2780–2786, 2018b ont également rapporté l’évaluation de l’activité tPMET par électrochimie : Dans ce cas, le médiateur redox est le ferricyanure de potassium et la concentration de sa forme réduite est mesurée par électrochimie. Toutefois, la mesure décrite dans cette étude est une mesure réalisée sur le milieu, après extraction des cellules de la suspension cellulaire. Cette méthode reste donc une mesure finale de la forme réduite du médiateur qui doit d’abord s’accumuler en solution. Elle ne permet pas le suivi en temps réel. Elle exige en outre une étape supplémentaire d’extraction des cellules du milieu de culture avant que la concentration du ferrocyanure ne soit mesurée par électrochimieMore recently, Sherman et al., Whole Eukaryotic Cells. Anal. Chem. 90, 2780–2786, 2018b also reported the evaluation of tPMET activity by electrochemistry: In this case, the redox mediator is potassium ferricyanide and the concentration of its reduced form is measured by electrochemistry. However, the measurement described in this study is a measurement carried out on the medium, after extraction of the cells from the cell suspension. This method therefore remains a final measurement of the reduced form of the mediator which must first accumulate in solution. It does not allow real-time tracking. It also requires an additional step of extracting cells from the culture medium before the concentration of ferrocyanide is measured by electrochemistry.
EP 1 199 560 décrit un procédé électrochimique pour la détermination du nombre de cellules et l’activité des systèmes biologiques. Cependant, le procédé implique l’application d’une substance gélifiante dans la contre-électrode employée comme récipient de réaction, et l’introduction du système biologique, préalablement mis en suspension dans une phase liquide, dans le récipient de réaction, de façon à ce que ledit système biologique soit immobilisé avec le médiateur d’oxydoréduction au sein de la substance gélifiante.EP 1 199 560 describes an electrochemical process for determining the number of cells and the activity of biological systems. However, the method involves the application of a gelling substance in the counter electrode used as a reaction vessel, and the introduction of the biological system, previously suspended in a liquid phase, into the reaction vessel, so as to that said biological system is immobilized with the redox mediator within the gelling substance.
De plus, le procédé ne fait que mesurer l’intensité et il n’est fait aucune mention de l’application d’un potentiel contrôlé (fixe ou variable) à l’électrode de travail. Curieusement, le procédé selon EP 1 199 560 applique le système biologique à évaluer sur la contre-électrode sans imposer de potentiel à l’électrode de travail. Ceci semble donc indiquer un fonctionnement de type pile dans lequel l’intensité est régulée par la différence de potentiel entre l’électrode de travail et la contre-électrode sur laquelle le système biologique est immobilisé. Ces systèmes électrochimiques de type pile sont connus pour leur manque de stabilité car l’intensité qui traverse le circuit électrique dépend des cinétiques électrochimiques de l’électrode de travail et de la contre-électrode ainsi que de la migration ionique au sein de la suspension, donc des caractéristiques de conduction ionique de la solution.Additionally, the method only measures intensity and there is no mention of applying a controlled potential (fixed or variable) to the working electrode. Curiously, the method according to EP 1 199 560 applies the biological system to be evaluated on the counter electrode without imposing a potential on the working electrode. This therefore seems to indicate a battery type operation in which the intensity is regulated by the potential difference between the working electrode and the counter electrode on which the biological system is immobilized. These battery-type electrochemical systems are known for their lack of stability because the intensity which passes through the electrical circuit depends on the electrochemical kinetics of the working electrode and the counter electrode as well as the ionic migration within the suspension, therefore the ionic conduction characteristics of the solution.
Ce procédé exige donc une préparation préalable du système biologique qui doit être fixé sur la contre-électrode et Il ne permet pas la mesure stable et fiable de la viabilité cellulaire.This process therefore requires prior preparation of the biological system which must be fixed on the counter-electrode and it does not allow stable and reliable measurement of cell viability.
Il reste donc désirable de mettre à disposition un procédé permettant une mesure en direct, en temps réel, fiable, rapide et stable du transfert d’électrons, corrélée à la quantité/activité des cellules et permettant une miniaturisation. Idéalement, ce procédé ne doit exiger qu’un minimum d’opérations de préparation du milieu afin de ne pas risquer d’altérer la viabilité cellulaire du fait de ces opérations ou risquer d’introduire un biais à la mesure du fait de l’impact de la phase de préparation de l’échantillon. Par exemple, des étapes d’immobilisation du système biologique, comme décrit dans EP 1 199 560, peuvent introduire une variabilité sur l’état ou sur la quantité des cellules impliquées dans la mesure.It therefore remains desirable to provide a method allowing live, real-time, reliable, rapid and stable measurement of electron transfer, correlated to the quantity/activity of cells and allowing miniaturization. Ideally, this process should only require a minimum of medium preparation operations so as not to risk altering cell viability due to these operations or risk introducing bias into the measurement due to the impact of the sample preparation phase. For example, steps of immobilizing the biological system, as described in EP 1 199 560, can introduce variability in the state or quantity of the cells involved in the measurement.
Il reste en outre désirable d’obtenir une mesure d’intensité de courant qui soit le plus strictement corrélée à l’activité cellulaire, c’est-à-dire à la cinétique des transferts d’électrons qui ont lieu sur l’électrode de mesure, dite électrode de travail, en s’affranchissant de la cinétique des transferts à la seconde électrode, dite contre-électrode ou électrode auxiliaire, et des caractéristiques de conductivité ionique du milieu. Pour cela, l’électrochimie met en œuvre des montages expérimentaux dits à trois électrodes avec potentiel contrôlé, qui assurent que le courant traversant le circuit ne dépend que de la cinétique des transferts d’électrons à l’électrode. Les montages à trois électrodes avec potentiel contrôlé permettent de s’affranchir de la cinétique des transferts à la contre-électrode et, de l’impact de la conductivité ionique de la solution.It also remains desirable to obtain a current intensity measurement which is most strictly correlated to the cellular activity, that is to say to the kinetics of the electron transfers which take place on the electrode of measurement, called the working electrode, by dispensing with the kinetics of transfers to the second electrode, called the counter electrode or auxiliary electrode, and the ionic conductivity characteristics of the medium. For this, electrochemistry implements so-called three-electrode experimental setups with controlled potential, which ensure that the current passing through the circuit depends only on the kinetics of electron transfers at the electrode. Three-electrode assemblies with controlled potential make it possible to overcome the kinetics of transfers to the counter-electrode and the impact of the ionic conductivity of the solution.
Selon un premier objet, l’invention concerne un procédéin vitrod’analyse de la viabilité de cellules animales, ledit procédé comprenant :
- L’obtention d’un échantillon contenant lesdites cellules animales ;
- la mise en contact dans une cellule électrochimique dudit échantillon avec un médiateur d’oxydoréduction ;
- l’application d’un potentiel constant à ladite cellule électrochimique ;
- la mesure de l’intensité ; et
- la détermination de la viabilité desdites cellules animales.
- Obtaining a sample containing said animal cells;
- bringing said sample into contact in an electrochemical cell with a redox mediator;
- applying a constant potential to said electrochemical cell;
- measuring intensity; And
- determining the viability of said animal cells.
De façon classique, les cellules telles que présentes dans l‘échantillon à un instant donné réduisent le médiateur redox ; la concentration de la forme réduite du médiateur, qui dépend ainsi de l’état c’est-à-dire de la viabilité des cellules dans l’échantillon, est mesurée par électrochimie.Classically, the cells as present in the sample at a given time reduce the redox mediator; the concentration of the reduced form of the mediator, which thus depends on the state, that is to say the viability of the cells in the sample, is measured by electrochemistry.
Selon l’invention, la détection électrochimique est effectuée à potentiel imposé constant : Le dosage électrochimique selon l’invention a donc pour effet d’oxyder le médiateur redox réduit et donc de régénérer en continu sa forme oxydée (Figure 1B). Ceci assure une concentration de la forme oxydée du médiateur pratiquement constante. Ainsi, le procédé n’est pas limité par la concentration du médiateur redox. La mesure peut ainsi être réalisée en continu, sans que la forme oxydée du médiateur ne s’épuise et sans que la forme réduite du médiateur ne s’accumule.According to the invention, the electrochemical detection is carried out at constant imposed potential: The electrochemical dosage according to the invention therefore has the effect of oxidizing the reduced redox mediator and therefore of continuously regenerating its oxidized form (Figure 1B). This ensures a practically constant concentration of the oxidized form of the mediator. Thus, the process is not limited by the concentration of the redox mediator. The measurement can thus be carried out continuously, without the oxidized form of the mediator being exhausted and without the reduced form of the mediator accumulating.
Le principe est représenté schématiquement à la Figure 1B.The principle is represented schematically in Figure 1B.
Le procédé selon l’invention se distingue ainsi des méthodes spectrophotométriques (Figure 1A), et de la méthode électrochimique après extraction décrite par Sherman et al, 2018 (Figure 1C) : selon ces méthodes, la concentration du médiateur redox réduit s’accumule au sein de la solution et tend à inhiber progressivement l’activité métabolique.The process according to the invention is thus distinguished from spectrophotometric methods (Figure 1A), and from the electrochemical method after extraction described by Sherman et al, 2018 (Figure 1C): according to these methods, the concentration of the reduced redox mediator accumulates at within the solution and tends to gradually inhibit metabolic activity.
Cet effet d’inhibition dû à l’accumulation de la forme réduite du médiateur est donc levé selon l’invention. Ainsi, le procédé selon l’invention permet un suivi de l’évolution de la viabilité cellulaire sur de longues périodes, jusqu’à plusieurs heures par exemple.This inhibition effect due to the accumulation of the reduced form of the mediator is therefore lifted according to the invention. Thus, the method according to the invention allows monitoring of the evolution of cell viability over long periods, up to several hours for example.
On entend par mesure de viabilité la détermination en nombre ou en proportion de cellules vivantes et/ou mortes/endommagées.By viability measurement we mean the determination of the number or proportion of living and/or dead/damaged cells.
La mesure de la viabilité peut être corrélée à la mesure de l’activité cellulaire, c’est-à-dire l’activité de transfert d’électrons tPMET. Ce transfert illustre notamment l’activité enzymatique ou métabolique des cellules considérées.The measurement of viability can be correlated with the measurement of cellular activity, i.e. tPMET electron transfer activity. This transfer illustrates in particular the enzymatic or metabolic activity of the cells considered.
Ladite mesure peut comprendre la mesure d’une valeur à un moment donné, ou le suivi dynamique, en suivant ces paramètres dans le temps.Said measurement may include measuring a value at a given time, or dynamic monitoring, tracking these parameters over time.
Typiquement, le procédé selon l’invention est réalisé sur un échantillon des cellules à tester.Typically, the method according to the invention is carried out on a sample of the cells to be tested.
L’échantillon des cellules à tester peut être obtenu par prélèvement d’un milieu cellulaire contenant les cellules animales, telles que des cellules humaines dont on cherche à mesurer la viabilité cellulaire. Selon ce mode de réalisation, l’échantillon ainsi prélevé peut être utilisé directement dans le procédé selon l’invention, en y ajoutant le médiateur d’oxydoréduction.The sample of cells to be tested can be obtained by taking a cell medium containing animal cells, such as human cells whose cell viability is being measured. According to this embodiment, the sample thus collected can be used directly in the process according to the invention, by adding the redox mediator.
Alternativement, l’échantillon peut être obtenu par modification du prélèvement, par exemple par toute méthode permettant sa mesure par électrochimie, telle que notamment par dilution, concentration, et/ou supplémentation. Ainsi, ledit prélèvement cellulaire peut ainsi être dilué dans un milieu de culture cellulaire, ou dans une solution de composition chimique simple, afin de constituer l’échantillon à tester. A titre illustratif, ledit prélèvement peut être dilué dans un milieu de culture cellulaire ou une solution n’altérant pas la survie cellulaire tel que par exemple une solution à pH contrôlé, notamment à pH physiologique (7.20-7.5), présentant une osmolarité physiologique (270-320 milli osmol), et comprenant de préférence une source d’énergie (glucose 1-4 g/L), pour assurer la survie des cellules le temps de la mesure. Typiquement, on peut citer la solution saline équilibrée de Hank (HBSS).Alternatively, the sample can be obtained by modifying the sample, for example by any method allowing its measurement by electrochemistry, such as in particular by dilution, concentration, and/or supplementation. Thus, said cell sample can be diluted in a cell culture medium, or in a solution of simple chemical composition, in order to constitute the sample to be tested. As an illustration, said sample can be diluted in a cell culture medium or a solution that does not alter cell survival such as for example a solution with controlled pH, in particular at physiological pH (7.20-7.5), having a physiological osmolarity ( 270-320 milli osmol), and preferably comprising an energy source (glucose 1-4 g/L), to ensure the survival of the cells during the measurement. Typically, we can cite Hank's balanced salt solution (HBSS).
Ainsi, selon un mode de réalisation, l’obtention dudit échantillon comprend l’étape de prélèvement à partir d’un milieu cellulaire contenant les cellules et la dilution éventuelle dans un milieu qui assure la survie des cellules le temps de la mesure.Thus, according to one embodiment, obtaining said sample comprises the step of sampling from a cellular medium containing the cells and possible dilution in a medium which ensures the survival of the cells for the duration of the measurement.
Le milieu de mesure comprenant l’échantillon et le médiateur présente typiquement une concentration cellulaire permettant une mesure de l’intensité du courant proportionnelle au nombre de cellules. Ainsi selon un mode de réalisation, la concentration cellulaire dans le milieu de mesure est comprise entre 1 000 et 1 000 000 cellules.ml-1(cell.ml-1).The measurement medium comprising the sample and the mediator typically has a cellular concentration allowing measurement of the current intensity proportional to the number of cells. Thus according to one embodiment, the cellular concentration in the measurement medium is between 1,000 and 1,000,000 cells.ml -1 (cell.ml -1 ).
On entend par « médiateur d’oxydoréduction » un accepteur d’électrons qui est réduit par les cellules puis réoxydé par les électrodes. Ledit médiateur est typiquement non cytotoxique à la concentration considérée pour ne pas affecter la détection de la viabilité cellulaire.By “oxidoreduction mediator” we mean an electron acceptor which is reduced by the cells then reoxidized by the electrodes. Said mediator is typically non-cytotoxic at the concentration considered so as not to affect the detection of cell viability.
Selon le mode de réalisation, ledit médiateur est soluble dans le milieu cellulaire.According to the embodiment, said mediator is soluble in the cellular medium.
Il existe une grande variété d’accepteurs d’électrons extracellulaires.There is a wide variety of extracellular electron acceptors.
In vivo, les électrons transférés permettent notamment la réduction du dioxygène ou d’ions métalliques (Fe3+, Cu2+).In vitro, en plus des substrats cités précédemment, les électrons peuvent réduire différents composés redox tels que Fe(CN)6 3 -, DCIP, des quinones (hydroquinone, ménadione…) ou des colorants à base de tétrazolium (MTT, XTT, WST-1). In vivo , the transferred electrons allow the reduction of dioxygen or metal ions (Fe 3+ , Cu 2+ ). In vitro , in addition to the substrates mentioned above, electrons can reduce different redox compounds such as Fe(CN) 6 3 - , DCIP, quinones (hydroquinone, menadione, etc.) or tetrazolium-based dyes (MTT, XTT, WST). -1).
Des médiateurs d’oxydoréduction sont utilisés pour les mesures de viabilité cellulaire avec détection spectrophotométrie, tels que le 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP) (E° = 0,226 V/ESH); l’hexacyanoferrate III, également appelé ferricyanure (Fe(CN)6 3-) (E° = 0,37 V/ESH) ; les dérivés de naphtoquinones, tels que la ménadione (2-methyl-1,4-naphthoquinone, également appelée vitamine K3) et ses dérivés (Elhabiri et al., Redox Behavior Predictions. Chem. Eur. J. 21 (2015) 3415 – 3424) tels que les hydroquinones (Martínez-Cifuentes et al., Molecules 22 (2017) 577) et les benzoquinones (M.T. Huynh et al., J. Am. Chem. Soc. 138 (2015) 15903-15910); les colorants à base de tétrazolium tels que le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), le 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT), le disulfonate de 4-[3-(4-iodophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-5-tétrazolio]-1,3-benzène (WST-1).Redox mediators are used for cell viability measurements with spectrophotometric detection, such as 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP) (E° = 0.226 V/ESH); hexacyanoferrate III, also called ferricyanide (Fe(CN)6 3-) (E° = 0.37 V/ESH); naphthoquinone derivatives, such as menadione (2-methyl-1,4-naphthoquinone, also called vitamin K3) and its derivatives (Elhabiri et al., Redox Behavior Predictions. Chem. Eur. J. 21 (2015) 3415 – 3424) such as hydroquinones (Martínez-Cifuentes et al., Molecules 22 (2017) 577) and benzoquinones (M.T. Huynh et al., J. Am. Chem. Soc. 138 (2015) 15903-15910); tetrazolium-based dyes such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1).
Des médiateurs redox sont également communément utilisés dans des procédés électrochimiques. Il s’agit par exemple de la phénazine méthosulfate (PMS) (O.S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357), du bleu de méthylène (O.S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357) et les médiateurs redox utilisés en bioélectrocatalyse (notamment décrits par D.P. Hickey et al., Electrochemistry 13 (2016) 97-132) tels que les composés dérivés de bipyridine (viologènes), d’osmium ou de ferrocène.Redox mediators are also commonly used in electrochemical processes. These are, for example, phenazine methosulfate (PMS) (O.S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357), methylene blue (O.S. Ksenzhek et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics 4 (1977) 346-357) and redox mediators used in bioelectrocatalysis (in particular described by D.P. Hickey et al., Electrochemistry 13 (2016) 97-132) such as compounds derived from bipyridine (viologens), osmium or ferrocene.
Les références indiquent des travaux qui ont déterminé ou approché les valeurs des potentiels redox des médiateurs cités. Des valeurs différentes sont souvent trouvées dans la bibliographie du fait de la différence des dérivés, d’études divergentes ou de composés pouvant donner plusieurs réactions électrochimiques.The references indicate work which has determined or approximated the values of the redox potentials of the mediators cited. Different values are often found in the bibliography due to the difference in derivatives, divergent studies or compounds that can give several electrochemical reactions.
Ces médiateurs peuvent être également mis en œuvre dans le procédé électrochimique selon l’invention.These mediators can also be used in the electrochemical process according to the invention.
A titre de médiateur convenant à l’invention, on peut notamment citer des composés redox tels que le 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP) ; l’hexacyanure de fer III (Fe(CN)6 3 -) ; les dérivés de quinones tels que l’hydroquinone, ou la ménadione ; la phénazine méthosulfate (PMS) ; les colorants à base de tétrazolium tels que le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), le 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT), le disulfonate de 4-[3-(4-iodophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-5-tétrazolio]-1,3-benzène (WST-1).As a mediator suitable for the invention, mention may in particular be made of redox compounds such as 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP); iron III hexcyanide (Fe(CN)6 3 -) ; quinone derivatives such as hydroquinone or menadione; phenazine methosulfate (PMS); tetrazolium-based dyes such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1).
La méthode pour réaliser la mise en contact du médiateur et de l’échantillon et ainsi constituer le milieu de mesure n’est pas limitée:The method for bringing the mediator and the sample into contact and thus constituting the measurement medium is not limited:
Selon un mode de réalisation, ceci peut être fait par exemple par dissolution dudit médiateur dans ledit échantillon pour constituer le milieu de mesure.According to one embodiment, this can be done for example by dissolving said mediator in said sample to constitute the measurement medium.
Selon un autre mode de réalisation, ceci peut être réalisé par mélange de l’échantillon avec une solution dudit médiateur préalablement préparée. Une telle solution peut être constituée notamment par le médiateur dilué dans l’eau ou dans un soluté tel que le milieu HBSS, PBS ou EBSS, plus particulièrement HBSSAccording to another embodiment, this can be achieved by mixing the sample with a solution of said mediator previously prepared. Such a solution may consist in particular of the mediator diluted in water or in a solute such as HBSS, PBS or EBSS medium, more particularly HBSS
Le médiateur ainsi en solution est placé dans la cellule électrochimique, puis l’échantillon est injecté ensuite dans la cellule électrochimique.The mediator thus in solution is placed in the electrochemical cell, then the sample is then injected into the electrochemical cell.
Selon un autre mode de réalisation, le médiateur peut être déposé sous forme d’une couche solide à la surface de l’électrode et le médiateur est dissous dans l’échantillon lorsque ce dernier est introduit dans la cellule. Ce mode de réalisation peut être particulièrement utile pour miniaturiser le système de mesure.According to another embodiment, the mediator can be deposited in the form of a solid layer on the surface of the electrode and the mediator is dissolved in the sample when the latter is introduced into the cell. This embodiment can be particularly useful for miniaturizing the measurement system.
Typiquement, le milieu de mesure comprenant l’échantillon et le médiateur présente une concentration en médiateur comprise entre 10 et 500 µM.Typically, the measurement medium comprising the sample and the mediator has a mediator concentration of between 10 and 500 µM.
On entend par « cellule électrochimique » un système capable d’oxyder le médiateur d’oxydoréduction grâce à l’énergie électrique. Les cellules électrochimiques convenant à l’invention peuvent être choisies parmi les cellules classiquement utilisées, à 3 électrodes (électrode de référence, électrode de travail et contre-électrode, cette dernière étant également nommée électrode auxiliaire) ou à 2 électrodes comprenant une électrode de travail et une contre-électrode qui est alors utilisée comme électrode de référence, communément nommée « pseudo-référence »By “electrochemical cell” we mean a system capable of oxidizing the redox mediator using electrical energy. The electrochemical cells suitable for the invention can be chosen from cells conventionally used, with 3 electrodes (reference electrode, working electrode and counter electrode, the latter also being called auxiliary electrode) or with 2 electrodes comprising a working electrode. and a counter electrode which is then used as a reference electrode, commonly called a “pseudo-reference”
Selon un mode de réalisation, la cellule électrochimique comprend une électrode de travail, une électrode auxiliaire, et éventuellement une électrode de référence.According to one embodiment, the electrochemical cell comprises a working electrode, an auxiliary electrode, and optionally a reference electrode.
Les cellules électrochimiques miniaturisées peuvent avantageusement être utilisées.Miniaturized electrochemical cells can advantageously be used.
L’application d’un potentiel désigne le potentiel appliqué à l’électrode de travail par rapport à l’électrode de référence. Typiquement, le potentiel constant peut être appliqué au moyen d’un potentiostat ou d’un générateur de tension. Le potentiostat peut être notamment un potentiostat portable.The application of a potential refers to the potential applied to the working electrode relative to the reference electrode. Typically, the constant potential can be applied by means of a potentiostat or a voltage generator. The potentiostat may in particular be a portable potentiostat.
Selon un mode de réalisation, ledit potentiel constant est appliqué entre l’électrode de travail et l’électrode de référence ou l’électrode auxiliaire utilisée comme pseudo-référence.According to one embodiment, said constant potential is applied between the working electrode and the reference electrode or the auxiliary electrode used as pseudo-reference.
Le potentiel est constant en ce qu’il ne varie pas au cours du temps. Il peut être ajusté en fonction de la nature du médiateur utilisé.The potential is constant in that it does not vary over time. It can be adjusted depending on the nature of the mediator used.
Selon un mode de réalisation, le potentiel est typiquement supérieur à ou égal au potentiel redox du médiateur utilisé. Ainsi, il est généralement supérieur d’au moins 50 mV au potentiel redox du médiateur d’oxydoréduction utilisé.According to one embodiment, the potential is typically greater than or equal to the redox potential of the mediator used. Thus, it is generally at least 50 mV higher than the redox potential of the redox mediator used.
Selon un mode de réalisation, le potentiel est généralement inférieur au potentiel d’oxydation de l’eau dans le milieu de la cellule électrochimique comprenant l’échantillon et le médiateur d’oxydoréduction en solution.According to one embodiment, the potential is generally lower than the oxidation potential of the water in the medium of the electrochemical cell comprising the sample and the redox mediator in solution.
Selon un mode de réalisation l’électricité mesurée est générée par le flux d’électrons générés par la réoxydation du médiateur par les électrodes :According to one embodiment, the measured electricity is generated by the flow of electrons generated by the reoxidation of the mediator by the electrodes:
MRed->Mox+e- M Red ->M ox +e -
Où MRed désigne le médiateur sous sa forme réduite et Moxdésigne le médiateur sous sa forme oxydée. Where MRed designates the mediator in its reduced form and Moxdesignates the mediator in its oxidized form.
Selon un mode de réalisation, la re-oxydation dudit médiateur préalablement réduit par les cellules a lieu à l’électrode de travail, en libérant des électrons générant le courant.According to one embodiment, the re-oxidation of said mediator previously reduced by the cells takes place at the working electrode, releasing electrons generating the current.
L’intensité du courant mesurée est typiquement proportionnelle au flux d’électrons transférés lors de la réaction d’oxydation du médiateur, donc au flux de médiateur réduit par ledit échantillon et par conséquent au flux d’électrons issus du transfert par tPMET, et peutin fineêtre corrélée à la viabilité cellulaire (et éventuellement au nombre de cellules dans l’échantillon).The intensity of the current measured is typically proportional to the flow of electrons transferred during the oxidation reaction of the mediator, therefore to the flow of mediator reduced by said sample and consequently to the flow of electrons resulting from the transfer by tPMET, and can ultimately be correlated to cell viability (and possibly to the number of cells in the sample).
Selon un mode de réalisation, la viabilité cellulaire peut être corrélée à l’intensité par étalonnage préalable : typiquement, ces étalonnages comprennent le dosage avec des courbes de calibration pour des milieux cellulaires de référence, pour un type de cellules donné, selon le milieu cellulaire à tester.According to one embodiment, cell viability can be correlated to the intensity by prior calibration: typically, these calibrations include the assay with calibration curves for reference cell media, for a given cell type, depending on the cell medium. to test.
Selon un mode de réalisation, il est possible de s’affranchir de la quantification du nombre de cellules dans l’échantillon en préparant pour chaque essai un contrôle avec des cellules fixées juste avant la mesure (de viabilité à 0 %) et un témoin non exposé au produit à tester (viabilité 100 % par convention), le contrôle et le témoin étant préparés dans les mêmes conditions, de façon à rendre négligeable la différence du nombre de cellules entre les différentes conditions.According to one embodiment, it is possible to avoid quantifying the number of cells in the sample by preparing for each test a control with cells fixed just before the measurement (0% viability) and a non-viability control. exposed to the product to be tested (100% viability by convention), the control and the witness being prepared under the same conditions, so as to make the difference in the number of cells between the different conditions negligible.
Ainsi, toutes les mesures de viabilité peuvent être comprises entre la valeur pour le contrôle et le témoin.Thus, all viability measurements can be between the value for the control and the control.
Typiquement, l’électrode de travail permet le suivi de l’évolution de l’intensité. Selon un mode de réalisation, l’intensité est mesurée entre l’électrode de travail et l’électrode auxiliaire.Typically, the working electrode allows monitoring of the evolution of the intensity. According to one embodiment, the intensity is measured between the working electrode and the auxiliary electrode.
L’intensité peut être mesurée au moyen d’un ampèremètre situé dans le circuit électrique de la cellule électrochimique, entre l’électrode de travail et la contre-électrode. Lorsqu’un potentiostat est utilisé pour fixer le potentiel de l’électrode de travail, l’ampèremètre est généralement inclus dans le potentiostat.The intensity can be measured using an ammeter located in the electrical circuit of the electrochemical cell, between the working electrode and the counter electrode. When a potentiostat is used to set the potential of the working electrode, the ammeter is usually included in the potentiostat.
A partir d’un milieu cellulaire, un ou plusieurs prélèvements peuvent être effectués à différents instants t, conduisant à un ou plusieurs échantillons, respectivement, sur lesquels conduire la mesure électrochimique du procédé selon l’invention.From a cellular medium, one or more samples can be taken at different times t, leading to one or more samples, respectively, on which to conduct the electrochemical measurement of the process according to the invention.
Il est ainsi possible d’analyser la variation de la viabilité du milieu cellulaire en comparant les mesures pour des échantillons prélevés à différents instants t.It is thus possible to analyze the variation in the viability of the cellular medium by comparing the measurements for samples taken at different times t.
Pour un échantillon donné, il est également possible d’effectuer des mesures en continu sur une période de temps déterminée.For a given sample, it is also possible to carry out continuous measurements over a specific period of time.
L’intensité peut présenter en fonction du temps un plateau (système cellulaire stable) ou des variations de pente négative (décroissance cellulaire) ou positive (croissance cellulaire).The intensity can present a plateau over time (stable cellular system) or variations of negative slope (cellular decay) or positive slope (cellular growth).
Typiquement, l’intensité s’établit à une valeur plateau lorsque le régime de fonctionnement stable du milieu cellulaire est atteint, pour lequel la concentration de la forme réduite du médiateur est constante. Dans ce régime stationnaire, le médiateur est consommé à l’électrode à la même vitesse qu’il est généré par le milieu cellulaire.Typically, the intensity settles at a plateau value when the stable operating regime of the cellular medium is reached, for which the concentration of the reduced form of the mediator is constant. In this stationary regime, the mediator is consumed at the electrode at the same rate as it is generated by the cellular environment.
Une diminution d’intensité correspond à une baisse du flux de médiateur réduit par le milieu cellulaire testé, et de fait, à une perte de viabilité et/ou activité cellulaire.A decrease in intensity corresponds to a drop in the flow of mediator reduced by the cellular medium tested, and therefore, to a loss of cell viability and/or activity.
Une augmentation d’intensité détecte une hausse du flux de médiateur réduit par le milieu cellulaire testé, et de fait, une croissance cellulaire et/ou croissance de l’activité cellulaire.An increase in intensity detects an increase in the flow of mediator reduced by the cellular medium tested, and therefore, cell growth and/or growth in cellular activity.
Le procédé selon l’invention permet notamment la miniaturisation des dispositifs d’évaluation de la viabilité cellulaire et/ou dosages basés sur la détection de tPMET, tel qu’illustré selon les exemples. A l’heure actuelle, le dosage spectrophotométrique ne permet pas une miniaturisation aisée.The method according to the invention allows in particular the miniaturization of devices for evaluating cell viability and/or assays based on the detection of tPMET, as illustrated according to the examples. At present, spectrophotometric dosage does not allow easy miniaturization.
Le procédé selon l’invention permet également une mesure en direct sans accumulation ou extraction du médiateur. Le procédé selon l’invention permet un rendu de résultats rapide.The method according to the invention also allows direct measurement without accumulation or extraction of the mediator. The method according to the invention allows rapid rendering of results.
Le procédé permet également un suivi de l’intensité et ses variations en continu. Il permet également un suivi du milieu cellulaire en continu, par exemple pendant la phase de croissance de cellules jusqu’à l’obtention d‘un régime stationnaire.The process also allows continuous monitoring of the intensity and its variations. It also allows continuous monitoring of the cellular environment, for example during the cell growth phase until a steady state is obtained.
En offrant la possibilité d’une mesure en fonction du temps, la détection électrochimique permet une caractérisation plus précise des tPMET par exemple par la détermination de vitesses initiales ou de variations de la vitesse en fonction du temps. Elle ouvre également la voie au suivi en continu de l’activité métabolique.By offering the possibility of measurement as a function of time, electrochemical detection allows more precise characterization of tPMETs, for example by determining initial speeds or variations in speed as a function of time. It also paves the way for continuous monitoring of metabolic activity.
Il permet par exemple d’identifier l’activité d’agents cytotoxiques ou activateurs de croissance sur les cellules.For example, it makes it possible to identify the activity of cytotoxic agents or growth activators on cells.
Ceci permet notamment la mise en œuvre du procédé dans le domaine de la thérapie cellulaire pour le contrôle de la viabilité des cellules en cours de préparation (du prélèvement à la production finale), avant utilisation/injection et au niveau des banques de tissus (greffes notamment) par exemple. Il permet des applications biomédicales très variées car les tPMET sont impliqués dans une grande diversité de processus cellulaires physiologiques et pathologiques : régulation de la prolifération cellulaire, activité métabolique modifiée/augmentée des cellules cancéreuses, etc.This allows in particular the implementation of the process in the field of cell therapy for monitoring the viability of cells during preparation (from sampling to final production), before use/injection and at the level of tissue banks (grafts). notably) for example. It allows very varied biomedical applications because tPMETs are involved in a wide diversity of physiological and pathological cellular processes: regulation of cell proliferation, modified/increased metabolic activity of cancer cells, etc.
Plus précisément, la Figure 2A représente un système illustratif à trois électrodes comprenant :More precisely, Figure 2A represents an illustrative system with three electrodes comprising:
une électrode de travail 1 de carbone ;a carbon working electrode 1;
une électrode auxiliaire 2 en carbone ;an auxiliary electrode 2 made of carbon;
une électrode de pseudo-référence 3 en argent (PRA) ;a silver pseudo-reference 3 electrode (PRA);
une connexion électrique 4 de l’électrode de travail 1;an electrical connection 4 of the working electrode 1;
une connexion électrique 5 de l’électrode auxiliaire ; etan electrical connection 5 of the auxiliary electrode; And
une connexion électrique 6 de la PRA.an electrical connection 6 of the PRA.
Ce système est réalisé par sérigraphie sur une bandelette en céramique de 34 mm de long, 10 mm de large et 0.5 mm d’épaisseur (Metrohm Dropsens, figure A). Ainsi, une électrode de travail de 4 mm de diamètre est illustrée à la Figure 2A.This system is produced by screen printing on a ceramic strip 34 mm long, 10 mm wide and 0.5 mm thick (Metrohm Dropsens, figure A). Thus, a working electrode of 4 mm diameter is shown in Figure 2A.
La Figure 2B représente une cellule de mesure électrochimique dans laquelle la bandelette 7 de la Figure 2A est disposée à la base d’une cellule en téflon constituée de deux parties :Figure 2B represents an electrochemical measuring cell in which the strip 7 of Figure 2A is arranged at the base of a Teflon cell made up of two parts:
la partie supérieure 8 de la cellule;the upper part 8 of the cell;
la partie inférieure 9 de la cellule ;the lower part 9 of the cell;
les parties 8 et 9 étant séparées par un joint torique 10;parts 8 and 9 being separated by an O-ring 10;
un film de parafilm 11 obturant la partie supérieure 8.a parafilm film 11 closing the upper part 8.
Un tel système peut être miniaturisé en réduisant considérablement le volume de l’échantillon, par exemple en ménageant au-dessus de l’électrode un volume de seulement quelques microlitres dans lequel on introduit l’échantillon à doser par capillarité. De telles configurations sont notamment développées pour les bandelettes de mesure de la glycémie.Such a system can be miniaturized by considerably reducing the volume of the sample, for example by providing above the electrode a volume of only a few microliters into which the sample to be measured is introduced by capillary action. Such configurations are particularly developed for blood glucose measuring strips.
Les essais ont été réalisés sur des lignées de cellules de mammifères, une lignée humaine Hela (ATCC CCL-2, carcinomateuses du col de l’utérus) et une lignée non humaine Vero (ATCC CCL-81, rein de singe vert Cercopithecus aethiops). Toutes les lignées proviennent de l’American Type Culture Collection (Manassas, Virginie, Etats-Unis).The tests were carried out on mammalian cell lines, a human Hela line (ATCC CCL-2, cervical carcinomas) and a non-human Vero line (ATCC CCL-81, green monkey kidney Cercopithecus aethiops) . All lines come from the American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, United States).
Les stocks primaires de cellules ont été gracieusement fournis par la Fonderphar (Fondation pour le développement et la recherche pharmaceutique, Toulouse, France). Pour chaque lignée cellulaire des stocks secondaires ont été produits en amplifiant le stock primaire. Les banques de cellules ont été conservées en solution cryoconservatrice (sérum fœtal de veau additionné de 10% de DMSO [Corning, Corning, Etats-Unis]) à -80°C.Primary cell stocks were kindly provided by Fonderphar (Foundation for Pharmaceutical Development and Research, Toulouse, France). For each cell line secondary stocks were produced by amplifying the primary stock. The cell banks were preserved in cryopreservative solution (fetal calf serum supplemented with 10% DMSO [Corning, Corning, United States]) at -80°C.
Le milieu de culture est le RPMI 1640 (ref 31870-025, ThermoFisher scientific, Waltham, Etats-Unis). Ce milieu a été supplémenté avec 10% (en volume) de sérum de veau fœtal décomplémenté (ref 10270, ThermoFisher scientific), 2 mM de L-glutamine (ref 25030-54, ThermoFisher scientific) et un mélange de pénicilline/streptomycine (10 unités/mL et 10 µg/mL, ref 14140-122, ThermoFisher scientific). Par la suite, le milieu supplémenté avec tous les additifs est appelé « milieu complet ».The culture medium is RPMI 1640 (ref 31870-025, ThermoFisher scientific, Waltham, United States). This medium was supplemented with 10% (by volume) of decomplemented fetal calf serum (ref 10270, ThermoFisher scientific), 2 mM L-glutamine (ref 25030-54, ThermoFisher scientific) and a mixture of penicillin/streptomycin (10 units/mL and 10 µg/mL, ref 14140-122, ThermoFisher scientific). Subsequently, the medium supplemented with all the additives is called “complete medium”.
Les cellules ont été cultivées en routine dans des flacons de 75 cm² (Corning) à 37°C dans une atmosphère humidifiée (80-95% d’humidité relative) et contenant 5% de CO2(incubateur à CO2). Arrivé à 70-90% de confluence, après rinçage du tapis cellulaire avec du DPBS, les cellules ont été décrochées par trypsinisation à 37°C. L’action de la trypsine a été stoppée par ajout de milieu RPMI complet et la suspension obtenue a été centrifugée 5 min à 200 g. Le culot de cellules a été repris dans du RPMI complet. Après numération (cellule de Malassez en présence de bleu trypan), la suspension de cellules a été diluée dans du RPMI afin d’obtenir la densité cellulaire requise (en cellules viables).Cells were routinely cultured in 75 cm² flasks (Corning) at 37°C in a humidified atmosphere (80-95% relative humidity) and containing 5% CO 2 (CO 2 incubator). Arriving at 70-90% confluence, after rinsing the cell layer with DPBS, the cells were removed by trypsinization at 37°C. The action of trypsin was stopped by adding complete RPMI medium and the suspension obtained was centrifuged for 5 min at 200 g. The cell pellet was taken up in complete RPMI. After counting (Malassez cell in the presence of trypan blue), the cell suspension was diluted in RPMI in order to obtain the required cell density (in viable cells).
Les cellules lysées ont été obtenues en reprenant le culot de cellules obtenu après centrifugation dans de l’eau ultra pure (ref 340 952-8 Cooper). La suspension obtenue a été passée au bain à ultrasons pendant 5 min à pleine puissance (modèle USC3300D, VWR). Après préparation, le lysat a été conservé dans de la glace fondante et utilisé sans délai.The lysed cells were obtained by taking the cell pellet obtained after centrifugation in ultra-pure water (ref 340 952-8 Cooper). The suspension obtained was passed through an ultrasonic bath for 5 min at full power (model USC3300D, VWR). After preparation, the lysate was stored in melting ice and used immediately.
Les cellules fixées ont été préparées en reprenant le culot de cellules dans un millilitre de formaldéhyde (ref FB002, ThermoFisher scientific) à 4% dans une solution de phosphates (PBS). Après une heure d’incubation à 37°C, les cellules ont été rincées trois fois avec du PBS afin d’éliminer le formaldéhyde en excès. Après le dernier rinçage, le culot de cellules a été repris dans une solution tamponnée (HBSS).The fixed cells were prepared by taking the cell pellet in one milliliter of formaldehyde (ref FB002, ThermoFisher scientific) at 4% in a phosphate solution (PBS). After one hour of incubation at 37°C, the cells were rinsed three times with PBS to remove excess formaldehyde. After the last rinse, the cell pellet was taken up in a buffered solution (HBSS).
Mesure électrochimique de la viabilité des cellulesElectrochemical measurement of cell viability
Les mesures électrochimiques sont réalisées avec des électrodes en carbone sérigraphiées sur des bandelettes en céramique (Metrohm Dropsens, DRP 110, Figure 2A). Ces électrodes comprennent une électrode de travail en carbone circulaire d’un diamètre de 4 mm, en partie entourée par l’électrode auxiliaire et l’électrode de pseudo-référence en argent (PRA), le tout déposé par jet d’encre (screen printed) sur des bandelettes en céramique qui s’insèrent dans un connecteur électrique dédié. Les électrodes et la cellule électrochimique sont représentées dans la
Le potentiel de l’électrode de pseudo-référence en argent (PRA) donné par le fournisseur est de -131 mV par rapport à l’électrode de référence classique au chlorure d’argent, soit +66 mV par rapport à l’électrode standard à hydrogène (ESH).The potential of the silver pseudo-reference electrode (PRA) given by the supplier is -131 mV compared to the classic silver chloride reference electrode, or +66 mV compared to the standard electrode hydrogen (ESH).
Les électrodes sont insérées à la base de réacteurs en téflon (Figure 2B). La partie inférieure du réacteur assure le maintien de l’électrode. La partie supérieure comporte une ouverture qui permet de remplir les réacteurs de milieu. Les deux parties sont maintenues entre elles par quatre vis en plastique. L’étanchéité est assurée par un joint torique situé entre l’électrode et la partie supérieure des réacteurs.The electrodes are inserted into the base of Teflon reactors (Figure 2B). The lower part of the reactor ensures that the electrode is held in place. The upper part has an opening which allows the reactors to be filled with medium. The two parts are held together by four plastic screws. Sealing is ensured by an O-ring located between the electrode and the upper part of the reactors.
Avant chaque utilisation, les réacteurs ont été nettoyés par immersion durant 2 h dans une solution de détergent (RBS35 2% v/v dans l’eau, Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne) puis soigneusement rincés à l’eau courante puis à l’eau distillée. Les pièces des réacteurs (support, vis, joint) ainsi que les électrodes ont été stérilisées par immersion 30 min dans une solution d’éthanol à 70% (v/v dans l’eau, VWR, Radnor, Etats-Unis). Les électrodes ont été brièvement rincées par immersion dans l’eau ultra pure (eau pour préparation injectable, ref 340 952-8, Cooper, Melun, France) avant séchage complet sous poste de sécurité microbiologique (PSM). Le montage des réacteurs a été réalisé en conditions stériles, sous PSM, avec des outils stérilisés selon le même protocole.Before each use, the reactors were cleaned by immersion for 2 h in a detergent solution (RBS35 2% v/v in water, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) then carefully rinsed under running water and then with distilled water. The reactor parts (support, screw, gasket) as well as the electrodes were sterilized by immersion for 30 min in a 70% ethanol solution (v/v in water, VWR, Radnor, United States). The electrodes were briefly rinsed by immersion in ultrapure water (water for injection, ref 340 952-8, Cooper, Melun, France) before complete drying in a microbiological safety station (PSM). The assembly of the reactors was carried out in sterile conditions, under PSM, with tools sterilized according to the same protocol.
Les réacteurs équipés d’électrode en carbone (Metrohm Dropsens, DRP 110) sont remplis avec deux millilitres de tampon HBSS contenant du 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP, (ref D1878 Sigma Aldrich) à la concentration de 50 µM, médiateur redox utilisé pour les mesures. Immédiatement après, les réacteurs sont transférés dans un incubateur à 37°C/5% CO2, les électrodes de travail sont polarisées à +300 mV/PRA (soit 366 mV/ESH) à l’aide d’un potentiostat multicanaux (Biologics) et le courant est enregistré en continu. Après 20 à 50 minutes, 50 µL de suspension cellulaire (un million de cellules), ou seulement de solution tamponnée pour les contrôles, sont injectés dans les réacteurs, sans interruption de la polarisation. Les mesures sont poursuivies pendant au moins une heure après l’injection des cellules.The reactors equipped with a carbon electrode (Metrohm Dropsens, DRP 110) are filled with two milliliters of HBSS buffer containing 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP, (ref D1878 Sigma Aldrich) at a concentration of 50 µM, redox mediator used for the measurements. Immediately afterwards, the reactors are transferred to an incubator at 37°C/5% CO 2 , the working electrodes are polarized at +300 mV/PRA (i.e. 366 mV/ESH) using a potentiostat multichannel (Biologics) and the current is recorded continuously. After 20 to 50 minutes, 50 µL of cell suspension (one million cells), or only buffered solution for controls, are injected into the reactors, without interrupting the polarization The measurements are continued for at least one hour after the injection of the cells.
Un potentiel de 300 mV par rapport à la pseudo-référence DropSens est appliqué en continu. Ce potentiel assure l’oxydation rapide de la forme réduite du 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP), médiateur redox utilisé pour les mesures. Ce médiateur est également couramment utilisé pour le dosage spectrophotométrique.A potential of 300 mV relative to the DropSens pseudo-reference is applied continuously. This potential ensures the rapid oxidation of the reduced form of 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP), the redox mediator used for the measurements. This mediator is also commonly used for spectrophotometric assay.
Les cellules Vero sont une lignée cellulaire issue de rein de singe vert communément utilisées en biotechnologie pour la culture de virus, la production de vaccins et des déterminations de cytotoxicité.Vero cells are a cell line derived from green monkey kidney commonly used in biotechnology for virus culture, vaccine production and cytotoxicity determinations.
Dès l’injection des cellules, le courant répond par un saut brusque qui atteint environ 800 nA après 2 à 3 minutes. Il croît ensuite lentement pendant environ 40 minutes et se stabilise les 30 minutes supplémentaires que dure l’essai aux environs de 1300 nA (
Le même protocole repris avec des cellules Hela conduit à des résultats similaires, avec des courants plus faibles (
Pour vérifier que le flux d’électrons enregistré est bien lié à la viabilité des cellules, le même type d’essai a été répété en injectant également des cellules préalablement fixées au formaldéhyde ou des cellules lysées par ultrasons dans de l’eau ultra-pure (
L’injection de cellules viables conduit aux mêmes observations que précédemment : une augmentation très rapide de l’intensité du courant durant les quelques minutes qui suivent l’injection des cellules puis une évolution plus lente. Ici le temps de mesure a été prolongé au-delà des 120 minutes de l’essai précédent, faisant apparaitre une décroissance linéaire de l’intensité du courant au-delà de deux heures de mesure. L’injection de cellules fixées ou lysées ne provoque pas de modification de l’intensité. Seules les cellules viables sont détectées.The injection of viable cells leads to the same observations as previously: a very rapid increase in the intensity of the current during the few minutes following the injection of the cells then a slower evolution. Here the measurement time was extended beyond the 120 minutes of the previous test, revealing a linear decrease in the current intensity beyond two hours of measurement. Injection of fixed or lysed cells does not cause a change in intensity. Only viable cells are detected.
Claims (11)
- L’obtention d’un échantillon contenant lesdites cellules animales ;
- La mise en contact dans une cellule électrochimique dudit échantillon avec un médiateur d’oxydoréduction ;
- l’application d’un potentiel constant à ladite cellule électrochimique ;
- la mesure de l’intensité ; et
- la détermination de la viabilité desdites cellules animales.
- Obtaining a sample containing said animal cells;
- Bringing said sample into contact in an electrochemical cell with a redox mediator;
- applying a constant potential to said electrochemical cell;
- measuring intensity; And
- determining the viability of said animal cells.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| FR2204472A FR3135526A1 (en) | 2022-05-11 | 2022-05-11 | METHOD FOR ANALYZING THE VIABILITY OF ANIMAL CELLS BY ELECTROCHEMICAL MEASUREMENT |
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| FR2204472 | 2022-05-11 | ||
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| FR2204472A Pending FR3135526A1 (en) | 2022-05-11 | 2022-05-11 | METHOD FOR ANALYZING THE VIABILITY OF ANIMAL CELLS BY ELECTROCHEMICAL MEASUREMENT |
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Citations (4)
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| EP0221663A1 (en) * | 1985-09-25 | 1987-05-13 | Paul De La Pena Limited | Methods and equipment for the bioelectrochemical cell measurement of microbial activity |
| EP1199560A1 (en) | 2000-10-07 | 2002-04-24 | DECHEMA Gesellschaft für Chemische Technik und Biotechnologie e.V. | Electrochemical measuring cell for the determination of the cell count and the biological activity |
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| WO2020117650A1 (en) * | 2018-12-03 | 2020-06-11 | Avails Medical, Inc. | Apparatus, systems, and methods for quantifying infectious agents |
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2022
- 2022-05-11 FR FR2204472A patent/FR3135526A1/en active Pending
-
2023
- 2023-05-10 WO PCT/EP2023/062379 patent/WO2023217839A1/en unknown
Patent Citations (4)
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| MARTINEZ-CIFUENTES ET AL., MOLECULES, vol. 22, 2017, pages 577 |
| O.S. KSENZHEK ET AL., BIOELECTROCHEMISTRY AND BIOENERGETICS, vol. 4, 1977, pages 346 - 357 |
| SHERMAN ET AL., ANAL. CHEM., vol. 90, 2018, pages 2780 - 2786 |
| SHERMAN ET AL.: "Whole Eukaryotic Cells", ANAL. CHEM., vol. 90, 2018, pages 2780 - 2786 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023217839A1 (en) | 2023-11-16 |
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