FR3132574A1 - Procédé in vitro ou ex vivo de détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique utilisant l’activité neuronale large échelle. - Google Patents
Procédé in vitro ou ex vivo de détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique utilisant l’activité neuronale large échelle. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur une interface biologique, comprenant notamment la mise en œuvre d’un biorécepteur comprenant un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé intégrant une co-culture cellulaire pertinente sur laquelle ledit échantillon est appliqué. La réponse du réseau neuronal à cet échantillon, notamment une modification du réseau cellulaire/neuronale, est enregistré puis analysé. Un diagnostic différentiel est ensuite réalisé en comparant les marqueurs réseau des vrais positifs et les échantillons testés. Figure 5
Description
L’invention concerne le domaine du diagnostic, en particulier celui des biorécepteurs de diagnostic, associés à une technologie microfluidique en tant que biocapteurs. Ainsi, l’invention se rapporte à un procédé de détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique, à un biorécepteur mis en œuvre dans un tel procédé ainsi qu’aux utilisations dudit biorécepteur.
Les pathologies du système nerveux central et/ou périphérique affectent plus de 700 millions de personnes dans le monde, plus de 10 millions en Europe et des dizaines de milliers en France. Ces pathologies sont considérées comme étant les plus complexes en termes d’étiologie, d’évolution mais aussi de traitement. Ces affections neurocognitives (e.g. la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, les traumatismes crâniens, les accidents vasculaires cérébraux, ou encore la sclérose latérale amyotrophique), conduisent à un déficit cognitif, fonctionnel et/ou comportemental d’un sujet, c’est-à-dire une altération des capacités liées au langage, aux interactions sociales, à la mémoire, au raisonnement logique ou encore à l’autonomie. Ces pathologies, également dénommées affections neurologiques ou nerveuses, constituent donc un problème de santé publique majeur.
Actuellement, le diagnostic de ces affections se fait essentiellement après l’apparition et l’observation des premiers symptômes. Suite à ce premier diagnostic clinique, des dosages de fluides biologiques, tels que le sang ou le liquide cérébrospinal (LCS), complétés par des tests d’imageries sont réalisés. Concernant d’autres troubles neuronaux, tels que les traumatismes crâniens (ou commotions cérébrales), le diagnostic repose sur l’établissement d’un score de Glasgow établi par des observations et symptômes cliniques.
Au cours de ces dernières années, il a été mis en évidence la présence de nouveaux biomarqueurs permettant le diagnostic de ces affections neurologiques ou nerveuses. A titre d’exemple, des micro-ARN présents dans des fluides biologiques tels que le LCS ou le sang permettent de diagnostiquer des commotions cérébralesviades techniques très classiques de dosages biologiques comme l’amplification en chaîne par polymérase (oupolymerase chain reactionou PCR) ou encore la technique immuno-enzymatique sur support solide (ouenzyme-linked immunosorbent assayou ELISA).
Les traitements actuels s’inscrivent dans une démarche d’accompagnement et de prévention secondaire et tertiaire visant à préserver la qualité de vie, à prévenir les complications et les crises comportementales en anticipant les stades avancés des maladies. De plus, la recherche de nouveaux traitements est rendue difficile par la complexité d’établir un diagnostic différentiel fiable. En effet, pour plusieurs affections différentes telles que les maladies neurodégénératives, il peut y avoir des symptômes cliniques identiques ou proches en raison de l’implication dans ces troubles de mêmes protéines dysfonctionnelles.
Afin d’assurer une prise en charge efficace et au plus tôt de la maladie, il est donc indispensable d’établir un diagnostic fiable et précoce d’une telle affection neurologique ou nerveuse et ainsi pouvoir améliorer l’identification d’un traitement adapté.
Cependant, à ce jour, il n’existe aucun test sensible, rapide et reproductible permettant le diagnostic précoce et déterministe d’un déficit cognitif, fonctionnel et/ou comportemental associé à une affection neurologique et/ou nerveuse.
En parallèle, des méthodes de dosage de l’activité d’un agent, par exemple un médicament, sur l’activité neurologique reposent généralement sur des altérations comportementales d’animaux vivants ou utilisent des biocapteurs tissulaires. Cependant, ce type de tests comportementaux sur des modèles animaux s’avèrent coûteux, long, difficilement quantifiable et peu reproductible.
L’utilisation de biocapteurs à base de tissus surmontent certaines des limites imposées par les tests comportementaux et proposent un résultat dont la quantification est plus facile. Cependant, de tels biocapteurs ont une sensibilité limitée et ne peuvent pas détecter des altérations subtiles de la fonction cognitive. Les biocapteurs tissulaires capables de détecter des agents qui altèrent ou modifient autrement la fonction neuronale se composent généralement de neurones cultivés maintenus sur un réseau d’électrodes qui enregistrent les propriétés passives de la membrane cellulaire, comme l’impédance d’entrée, ou l’activité du potentiel d’action spontanée. Du fait d’une faible sensibilité, ces types de biocapteurs sont essentiellement mis en œuvre pour la détermination d’une mort cellulaire aiguë due à une exposition à des concentrations élevées d’agents toxiques (e.g. l’excitotoxicité induite par de fortes concentrations de glutamate dans la fente synaptique). De plus, la plupart des biocapteurs ne fournissent que des données à court terme.
De manière générale, les solutions conventionnelles ont pour inconvénientsi) qu’elles ne permettent pas ou peu la détection de la présence d’agents insoupçonnés ou nouveaux qui pourraient être à l’origine ou indiqué la présence d’une affection neurologique et/ou nerveuse;ii) qu’elles détectent essentiellement l’effet d’agents à action rapide alors que les agents qui nécessitent plusieurs heures ou jours pour produire leur effet ne peuvent généralement pas être détectés avec des méthodes connues ; etiii) qu’elles ne permettent pas une distinction des populations neuronales affectées.
Il ressort de ce qui précède qu’il existe un besoin évident de développer de nouvelles solutions permettant un diagnostic différentiel rapide, efficace, précoce et fiable d’affections neurologiques et/ou nerveuses.
Les inventeurs ont mis au point, de manière inattendue et surprenante, un procédé de détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique impliquant un réseau de neurones. Ce procédé est mis en œuvre au moyen d’un biocapteur innovant comprenant notamment un biorécepteur comprenant, avantageusement se présentant sous la forme de, un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé. Ce procédé, y compris le biorécepteur pour déterminer l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique et ses utilisations, sont caractérisés tout au long de la présente description.
Un objet de la présente invention est d’obtenir des données sur l’état du réseau de neurones exposé à un échantillon biologique puis d’analyser ces données afin d’établir rapidement et à moindre coût un diagnostic différentiel d’une affection neurologique et/ou nerveuse chez un sujet avec un rapport spécificité/sensibilité amélioré.In fine, le but est de proposer un traitement adapté au sujet visant à préserver la qualité de vie, prévenir les complications et anticiper l’évolution de la pathologie, notamment vers des stades avancés des pathologies.
Ainsi, la présente invention concerne un procédéin vitroouex vivode détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique, comprenant les étapes suivantes de :
a. Fournir un biorécepteur comprenant, avantageusement se présentant sous la forme de, un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé comprenant :
i) au moins un premier compartiment et un deuxième compartiment ;
ii) au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et deuxième compartiments ;
iii) la culture d’au moins un type de cellules ou d’explant par compartiment, le premier compartiment comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et le deuxième compartiment, sur lequel peut être appliqué ledit échantillon biologique, comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ou la culture d’un explant ;
iv) au moins un dispositif permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment, le dispositif étant susceptible d’être combiné à un moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données d’activité fonctionnelle ;
b. Mettre en contact directe ou indirecte les neurones en culture dans le premier compartiment ou les neurones et/ou cellules non neuronales ou l’explant en culture dans le deuxième compartiment avec un échantillon biologique ;
c. Réaliser un enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment sur la pluralité de points de mesure sur une durée de mesure suite à la mise en contact des neurones en culture dans le premier compartiment avec l’échantillon biologique selon l’étape b) ;
d. Réalisation d’une conversion de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment en données d’activité fonctionnelle ;
e. Analyser les données d’activité fonctionnelle obtenues à l’étape d) et construire un graphe représentant le réseau de neurones;
f. Détermination d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle analysées à l’étape e), l’au moins un paramètre, ou une combinaison de ces paramètres, étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ;
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vii) un index de centralité d’un nœud
a. Fournir un biorécepteur comprenant, avantageusement se présentant sous la forme de, un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé comprenant :
i) au moins un premier compartiment et un deuxième compartiment ;
ii) au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et deuxième compartiments ;
iii) la culture d’au moins un type de cellules ou d’explant par compartiment, le premier compartiment comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et le deuxième compartiment, sur lequel peut être appliqué ledit échantillon biologique, comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ou la culture d’un explant ;
iv) au moins un dispositif permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment, le dispositif étant susceptible d’être combiné à un moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données d’activité fonctionnelle ;
b. Mettre en contact directe ou indirecte les neurones en culture dans le premier compartiment ou les neurones et/ou cellules non neuronales ou l’explant en culture dans le deuxième compartiment avec un échantillon biologique ;
c. Réaliser un enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment sur la pluralité de points de mesure sur une durée de mesure suite à la mise en contact des neurones en culture dans le premier compartiment avec l’échantillon biologique selon l’étape b) ;
d. Réalisation d’une conversion de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment en données d’activité fonctionnelle ;
e. Analyser les données d’activité fonctionnelle obtenues à l’étape d) et construire un graphe représentant le réseau de neurones;
f. Détermination d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle analysées à l’étape e), l’au moins un paramètre, ou une combinaison de ces paramètres, étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ;
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vii) un index de centralité d’un nœud
g. Réaliser une comparaison entre l’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones et une valeur de référence d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones afin de déterminer l’effet d’un échantillon biologique.
Dans la suite de l’exposé et pour des raisons de simplification :
- le terme « neurone » est utilisé de manière équivalente à « cellules neuronales » ;
- le terme « affection neurologique et/ou nerveuse » est utilisé de manière équivalente à « pathologie du système nerveux central et/ou périphérique » ou « affection neurocognitive » ou « déficit cognitif, fonctionnel et/ou comportemental » ; et
- le terme « affection » est utilisé de manière équivalente à « pathologie », « atteinte » ou encore « lésion ».
- le terme « neurone » est utilisé de manière équivalente à « cellules neuronales » ;
- le terme « affection neurologique et/ou nerveuse » est utilisé de manière équivalente à « pathologie du système nerveux central et/ou périphérique » ou « affection neurocognitive » ou « déficit cognitif, fonctionnel et/ou comportemental » ; et
- le terme « affection » est utilisé de manière équivalente à « pathologie », « atteinte » ou encore « lésion ».
Dans le cadre de la présente invention, par « modèle biologique » on désigne la culture de cellules, non humaines, humaines dérivées de cellules souches pluripotentes ou humaine primaires, seule ou en co-culture, neuronales ou non neuronale isolées de leur environnement biologique naturel, dans une architecture microfluidique multi-compartimentalisé dans laquelle les compartiments sont connectés directement ou indirectement. En d’autres termes, il s’agit de cultiver des cellules dans un environnement artificiel avec un minimum d’altération des conditions naturelles ou conditionsin vivo.
Dans le cadre de la présente invention, par « interface biologique » on désigne un système comprenant une jonction de contact entre des populations cellulaires comprises dans le dispositif de l’invention permettant une communication des cellules entre elles par échanges d’informationviaune communication électrique et/ou chimique. Au sens de l’invention, il peut s’agir d’une culture de cellules neuronales, de cellules non-neuronales ou encore d’un explant tissulaire.
Dans le cadre de la présente invention, par « biorécepteur » on désigne un ensemble de molécules et/ou cellules permettant la reconnaissance sélective d’une molécule (ou analyte). A titre d’exemple, on peut citer des enzymes, des cellules, des aptamères, des nanoparticules ou encore des anticorps. Au sens de l’invention, le biorécepteur est une culture de neurones, par exemple des neurones humains dérivés de cellules souches pluripotentes, comprise dans un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé modélisant une architecture réseau pouvant être caractéristique d’une pathologie neurologique et/ou nerveuse. Ce biorécepteur est associé à un transducteur qui va convertir l’association de l’analyte et du biorécepteur en un signal mesurable. Selon l’invention, cette combinaison d’un biorécepteur et d’un transducteur se définit comme un biocapteur dont l’avantage est l’établissement d’un diagnostic rapide et fiable, notamment grâce à la présence d’une interface biologique au sein de ces architectures microfluidiques qui rend le biorécepteur plus physiologique, c’est-à-dire qu’il s’agit d’un modèle expérimental innovant dont l’organisation physique, biochimique et biologique, le fonctionnement et les réactions permettent de transposer les résultats obtenus à l’Homme.
Dans le cadre de la présente invention, par « activité fonctionnelle des neurones » on désigne l’émission et de la propagation d’un message nerveux sous forme de signaux électriques et/ou de sécrétions de neurotransmetteurs.
Dans le cadre de la présente invention, par « un moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données » on désigne un transducteur. On peut regrouper les transducteurs en 3 grandes catégories : Optique (e.g. fibre optique), électrochimique (e.g. ampérométrique, potentiométrique, impédimétrique ou encore conductiométrique), et basé sur la masse (e.g. piézoélectrique et magnétoélastique).
Dans le cadre de la présente invention, par « nœud », «node link» ou «vertices/edge» on désigne un neurone, un assemblage de cellules ou de population de neurones reliées de manière continue et présentant une activité fonctionnelle. A noter que le cerveau comprend environ 100 milliards de neurones et 1 neurones peut établir jusqu’à 10000 connexions.
Dans le cadre de la présente invention, par « module » on désigne plusieurs nœuds connectés ensemble formant des groupes ou «clusters».
Ainsi, dans le cadre de la présente invention, par :
- « coefficient de connexion » ou « coefficient declustering» on désigne la probabilité que deux nœuds soient connectés sachant qu’ils ont un voisin en commun ;
- « moyenne des longueurs minimum inter-nœuds » on désigne la moyenne des longueurs entre deux nœuds connectés ; et
- par « moyenne des potentiels d’action par seconde » on désigne la moyenne du nombre d’influx nerveux par seconde, à savoir la succession d’une dépolarisation transitoire et locale de la membrane plasmique puis d’une repolarisation de la membrane interne (éventuellement suivie d’une hyperpolarisation pour les cellules non myélinisées)) ;
- par « index de connectivité du réseau » ou «Small World Index» ; on désigne une connexion structurelle (connexions physiques, i.e. synapses et axones) et des connexions physiologiques (connectivité fonctionnelle/relation symétrique et connectivité effective/relation causale) entre deux ou plusieurs nœuds, qui est le reflet de la robustesse du réseau de neurones. De préférence, l’index de connectivité du réseau est déterminé par le ratio entre le coefficient de connexion et la moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
- par score z ou «z-score» on désigne une mesure permettant de caractériser la façon dont la connectivité des nœuds est distribuée dans les modules, c’est-à-dire de caractériser des intra-modules ;
- par coefficient de participation ou «Participation Coefficient» on désigne une mesure permettant de caractériser dont la connectivité des nœuds est distribuée entre plusieurs modules soit inter-module ; et
- par « index de centralité d’un nœud » on désigne une valeur proportionnelle au nombre de passages par ce nœud lors d’un parcours aléatoire du graphe, représentant le réseau de neurones selon l’invention, en empruntant aléatoirement l’une des connexions partant d’un nœud.
- « coefficient de connexion » ou « coefficient declustering» on désigne la probabilité que deux nœuds soient connectés sachant qu’ils ont un voisin en commun ;
- « moyenne des longueurs minimum inter-nœuds » on désigne la moyenne des longueurs entre deux nœuds connectés ; et
- par « moyenne des potentiels d’action par seconde » on désigne la moyenne du nombre d’influx nerveux par seconde, à savoir la succession d’une dépolarisation transitoire et locale de la membrane plasmique puis d’une repolarisation de la membrane interne (éventuellement suivie d’une hyperpolarisation pour les cellules non myélinisées)) ;
- par « index de connectivité du réseau » ou «Small World Index» ; on désigne une connexion structurelle (connexions physiques, i.e. synapses et axones) et des connexions physiologiques (connectivité fonctionnelle/relation symétrique et connectivité effective/relation causale) entre deux ou plusieurs nœuds, qui est le reflet de la robustesse du réseau de neurones. De préférence, l’index de connectivité du réseau est déterminé par le ratio entre le coefficient de connexion et la moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
- par score z ou «z-score» on désigne une mesure permettant de caractériser la façon dont la connectivité des nœuds est distribuée dans les modules, c’est-à-dire de caractériser des intra-modules ;
- par coefficient de participation ou «Participation Coefficient» on désigne une mesure permettant de caractériser dont la connectivité des nœuds est distribuée entre plusieurs modules soit inter-module ; et
- par « index de centralité d’un nœud » on désigne une valeur proportionnelle au nombre de passages par ce nœud lors d’un parcours aléatoire du graphe, représentant le réseau de neurones selon l’invention, en empruntant aléatoirement l’une des connexions partant d’un nœud.
De préférence, la présente invention a pour objet un procédéin vitroouex vivode détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique tel que défini précédemment présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison :
- l’interface biologique comprend, avantageusement consiste en au moins un des éléments sélectionné dans le groupe constitué par des microcanaux fluidiques ; des microcanaux PDMS ; une membrane poreuse, dont la porosité est, avantageusement, comprise entre 10 nm et 40 µm et dont la densité de pores est, avantageusement, comprise entre 10 et 1.109pores par cm2, avantageusement entre 1.105et 1.109pores par cm2; une membrane capillaire poreuse, avantageusement il s’agit d’une membrane sur laquelle est cultivée au moins un organoïde (i.e. une structure multicellulaire tridimensionnelle qui reproduitin vitrola micro-anatomie d’un organe), en polycarbonate, en polyester, en polyéthylène téréphtalate et/ou en polytétrafluoroéthylène ; un gel ;un hydrogel et leurs mélanges ;
- la construction du graphe représentant le réseau de neurones à l’étape e) est obtenu en mettant en œuvre la théorie des graphes ; avantageusement les nœuds du graphe correspondent aux points de mesure de l’activité fonctionnelle et les connexions entre nœuds correspondent aux corrélations des communications axonales ;
- l’étape f) comprend la détermination de deux paramètres, avantageusement trois paramètres, quatre paramètres, de préférence cinq paramètres, six paramètres, voire même sept paramètres, caractéristiques de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle, lesdits paramètres étant sélectionnés dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ;
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vii) un index de centralité d’un nœud;
- l’index de connectivité du réseau est le ratio entre le coefficient de connexion et la moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
- la moyenne des potentiels d’action par seconde doit avoir une valeur supérieure ou égale, avantageusement strictement supérieure, à 0,5, de préférence à 1 ou 1,5 voire même à 2, pour permettre l’analyse d’au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vii) un index de centralité d’un nœud ;
- le coefficient de connexion a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 0,5, avantageusement comprise entre 0 et 1 ;
- la moyenne des longueurs minimum inter-nœuds a une valeur supérieure ou égale à 1, de préférence à 1,5 ou 2 ;
- l’index de connectivité du réseau a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 0,5, avantageusement comprise entre 0 et 1 ;
- le score z ou «z-score» a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 5, avantageusement compris entre 0 et 10 ;
- le coefficient de participation ou «Participation Coefficient» a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 0,5, avantageusement compris entre 0,5 et 1 ;
- l’index de centralité d’un nœud a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 5, avantageusement compris entre 6 et 10 ;
- le dispositif permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment selon l’étape a.iv) est, de préférence un dispositif permettant un enregistrement en contact indirect avec les cellules en culture, sélectionné dans le groupe constitué par :
- un dispositif d’enregistrement de l’activité par des réseaux de microélectrodes planaire ou non planaire, des électrodes semi-solides, par ampérométrie ou voltamétrie ;
- un dispositif d’enregistrement d’imagerie par fluorescence, telle que l’imagerie calcique ou l’imagerie le flux ioniques transmembranaires ;
- un dispositif d’enregistrement de l’activité électrophysiologique intracellulaire, extracellulaire ou en patch-clamp en configuration cellule entière, cellule attachée,inside-outououtside-out;
- le moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données selon l’étape a.iv) est un système algorithmique de conversion de données électriques et/ou électrophysiologiques en données binaires ;
- la durée de mesure de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment selon l’étape c) est comprise entre 300 ms et 20 min, avantageusement entre 1 min et 15 min, de préférence entre 5 min et 12 min ;
- le biorécepteur comprend en outre un troisième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et troisième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et troisième compartiments ; avantageusement un quatrième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et quatrième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et quatrième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et quatrième compartiments ; de préférence un cinquième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les quatrième et cinquième compartiments ;
- la mise en contact des neurones en culture dans le premier compartiment avec un échantillon biologique selon l’étape b) est indirecte en ce que l’échantillon biologique est appliqué sur l’interface biologique du deuxième compartiment et/ou troisième compartiment et/ou quatrième compartiment et/ou cinquième compartiment ;
-chacun des compartiments compris dans le dispositif de l’invention comprend la culture d’un, deux voire même trois types de cellules neuronales et/ou non neuronales
- les neurones sont sélectionnées dans le groupe constitué des neurones glutamatergiques, GABAergiques, sérotoninergiques, cholinergiques, dopaminergiques, adrénergiques, noradrénergiques, sensitifs et des motoneurones ;
- les cellules non neuronales sont sélectionnées dans le groupe constitué des cellules gliales (comprenant la microglie/les macrophages et la macroglie (i.e. astrocytes, oligodendrocytes, cellules de Schwann, et épendymocytes)), épithéliales, conjonctives, thyroïdiennes, graisseuses, sanguines, immunitaires, osseuses, cartilagineuses, gastriques, pancréatiques, hépatiques, intestinales, pulmonaires, endothéliales, musculaires, vasculaires, cardiaques, mésenchymateuses, des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien et des cellules rétiniennes;
- l’explant est un tissu d’origine cérébrale, épithéliale, oculaire, thyroïdien, graisseux, vasculaire, osseux, cartilagineux, gastrique, pancréatique, hépatique, intestinale, pulmonaire, endothéliale, musculaires, rétinien, cardiaque et placentaire ; et/ou
- l’échantillon biologique est sélectionné dans le groupe constitué par le sang, la salive, l’urine, les larmes, la sueur, les expectorations, le mucus, le pus, la lymphe, le liquide céphalorachidien, les sécrétions nasopharyngés, les sécrétions oropharyngées, la synovie, le liquide pleural, le liquide péritonéal, le liquide péricardique, l’humeur aqueuse, le liquide amniotique et le plasma ; et/ou
- l’échantillon biologique peut être un « agent » ou « agent d’essai », c’est-à-dire un composé ayant des propriétés modulatrices de l’activité fonctionnelle des neurones ou un agent dont on ne sait pas s’il possède des propriétés modulatrices de l’activité fonctionnelle des neurones, auquel cas le procédé de l’invention permet d’identifier et/ou caractériser d’éventuelles propriétés dudit agent, voire même d’identifier une « concentration seuil ». En d’autres termes, en particulier lorsque l’agent d’essai est un médicament, il s’agit de la concentration de l’agent sous un régime de traitement minimal (i.e. pour une composition pharmacologique, sous le dosage thérapeutique généralement prescrit le plus bas pour l’animal ou l’Homme). Dans ce mode de réalisation de l’invention, la comparaison à une valeur de référence réalisée à l’étape g) consiste à comparer au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones de l’invention consistant en une valeur obtenue avant application de l’agent ou agent d’essai et/ou à une valeur obtenue après application de l’agent ou agent d’essai, ladite valeur étant antérieure dans le temps pour assurer un suivi ou « monitoring » de l’effet dudit agent ou agent d’essai.
- l’interface biologique comprend, avantageusement consiste en au moins un des éléments sélectionné dans le groupe constitué par des microcanaux fluidiques ; des microcanaux PDMS ; une membrane poreuse, dont la porosité est, avantageusement, comprise entre 10 nm et 40 µm et dont la densité de pores est, avantageusement, comprise entre 10 et 1.109pores par cm2, avantageusement entre 1.105et 1.109pores par cm2; une membrane capillaire poreuse, avantageusement il s’agit d’une membrane sur laquelle est cultivée au moins un organoïde (i.e. une structure multicellulaire tridimensionnelle qui reproduitin vitrola micro-anatomie d’un organe), en polycarbonate, en polyester, en polyéthylène téréphtalate et/ou en polytétrafluoroéthylène ; un gel ;un hydrogel et leurs mélanges ;
- la construction du graphe représentant le réseau de neurones à l’étape e) est obtenu en mettant en œuvre la théorie des graphes ; avantageusement les nœuds du graphe correspondent aux points de mesure de l’activité fonctionnelle et les connexions entre nœuds correspondent aux corrélations des communications axonales ;
- l’étape f) comprend la détermination de deux paramètres, avantageusement trois paramètres, quatre paramètres, de préférence cinq paramètres, six paramètres, voire même sept paramètres, caractéristiques de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle, lesdits paramètres étant sélectionnés dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ;
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vii) un index de centralité d’un nœud;
- l’index de connectivité du réseau est le ratio entre le coefficient de connexion et la moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
- la moyenne des potentiels d’action par seconde doit avoir une valeur supérieure ou égale, avantageusement strictement supérieure, à 0,5, de préférence à 1 ou 1,5 voire même à 2, pour permettre l’analyse d’au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vii) un index de centralité d’un nœud ;
- le coefficient de connexion a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 0,5, avantageusement comprise entre 0 et 1 ;
- la moyenne des longueurs minimum inter-nœuds a une valeur supérieure ou égale à 1, de préférence à 1,5 ou 2 ;
- l’index de connectivité du réseau a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 0,5, avantageusement comprise entre 0 et 1 ;
- le score z ou «z-score» a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 5, avantageusement compris entre 0 et 10 ;
- le coefficient de participation ou «Participation Coefficient» a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 0,5, avantageusement compris entre 0,5 et 1 ;
- l’index de centralité d’un nœud a une valeur supérieure ou égale à 0, de préférence à 5, avantageusement compris entre 6 et 10 ;
- le dispositif permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment selon l’étape a.iv) est, de préférence un dispositif permettant un enregistrement en contact indirect avec les cellules en culture, sélectionné dans le groupe constitué par :
- un dispositif d’enregistrement de l’activité par des réseaux de microélectrodes planaire ou non planaire, des électrodes semi-solides, par ampérométrie ou voltamétrie ;
- un dispositif d’enregistrement d’imagerie par fluorescence, telle que l’imagerie calcique ou l’imagerie le flux ioniques transmembranaires ;
- un dispositif d’enregistrement de l’activité électrophysiologique intracellulaire, extracellulaire ou en patch-clamp en configuration cellule entière, cellule attachée,inside-outououtside-out;
- le moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données selon l’étape a.iv) est un système algorithmique de conversion de données électriques et/ou électrophysiologiques en données binaires ;
- la durée de mesure de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment selon l’étape c) est comprise entre 300 ms et 20 min, avantageusement entre 1 min et 15 min, de préférence entre 5 min et 12 min ;
- le biorécepteur comprend en outre un troisième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et troisième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et troisième compartiments ; avantageusement un quatrième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et quatrième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et quatrième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et quatrième compartiments ; de préférence un cinquième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les quatrième et cinquième compartiments ;
- la mise en contact des neurones en culture dans le premier compartiment avec un échantillon biologique selon l’étape b) est indirecte en ce que l’échantillon biologique est appliqué sur l’interface biologique du deuxième compartiment et/ou troisième compartiment et/ou quatrième compartiment et/ou cinquième compartiment ;
-chacun des compartiments compris dans le dispositif de l’invention comprend la culture d’un, deux voire même trois types de cellules neuronales et/ou non neuronales
- les neurones sont sélectionnées dans le groupe constitué des neurones glutamatergiques, GABAergiques, sérotoninergiques, cholinergiques, dopaminergiques, adrénergiques, noradrénergiques, sensitifs et des motoneurones ;
- les cellules non neuronales sont sélectionnées dans le groupe constitué des cellules gliales (comprenant la microglie/les macrophages et la macroglie (i.e. astrocytes, oligodendrocytes, cellules de Schwann, et épendymocytes)), épithéliales, conjonctives, thyroïdiennes, graisseuses, sanguines, immunitaires, osseuses, cartilagineuses, gastriques, pancréatiques, hépatiques, intestinales, pulmonaires, endothéliales, musculaires, vasculaires, cardiaques, mésenchymateuses, des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien et des cellules rétiniennes;
- l’explant est un tissu d’origine cérébrale, épithéliale, oculaire, thyroïdien, graisseux, vasculaire, osseux, cartilagineux, gastrique, pancréatique, hépatique, intestinale, pulmonaire, endothéliale, musculaires, rétinien, cardiaque et placentaire ; et/ou
- l’échantillon biologique est sélectionné dans le groupe constitué par le sang, la salive, l’urine, les larmes, la sueur, les expectorations, le mucus, le pus, la lymphe, le liquide céphalorachidien, les sécrétions nasopharyngés, les sécrétions oropharyngées, la synovie, le liquide pleural, le liquide péritonéal, le liquide péricardique, l’humeur aqueuse, le liquide amniotique et le plasma ; et/ou
- l’échantillon biologique peut être un « agent » ou « agent d’essai », c’est-à-dire un composé ayant des propriétés modulatrices de l’activité fonctionnelle des neurones ou un agent dont on ne sait pas s’il possède des propriétés modulatrices de l’activité fonctionnelle des neurones, auquel cas le procédé de l’invention permet d’identifier et/ou caractériser d’éventuelles propriétés dudit agent, voire même d’identifier une « concentration seuil ». En d’autres termes, en particulier lorsque l’agent d’essai est un médicament, il s’agit de la concentration de l’agent sous un régime de traitement minimal (i.e. pour une composition pharmacologique, sous le dosage thérapeutique généralement prescrit le plus bas pour l’animal ou l’Homme). Dans ce mode de réalisation de l’invention, la comparaison à une valeur de référence réalisée à l’étape g) consiste à comparer au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones de l’invention consistant en une valeur obtenue avant application de l’agent ou agent d’essai et/ou à une valeur obtenue après application de l’agent ou agent d’essai, ladite valeur étant antérieure dans le temps pour assurer un suivi ou « monitoring » de l’effet dudit agent ou agent d’essai.
En particulier, le dispositif permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment selon l’étape a.iv) comprend des électrodes en contact direct ou indirect des neurones. Ce dispositif permet d’enregistrer la différence de polarisation des neurones permettant de communiquer entre eux par potentiels d’action caractérisés par une différence de potentiel supérieur à 1 µV.
Le moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données d’activité fonctionnelle selon l’étape a.iv) de l’invention est un système algorithmique de conversion de données électriques et/ou électrophysiologiques en données binaires. En particulier, il s’agit :
i) de convertir des données électrophysiologiques au moyen d’un transducteur de signal fourni avec l’équipement d’enregistrement, ledit transducteur pouvant être couplé avec un amplificateur de signal;
ii) d’établir un seuil de détection pour binariser l’activité électrophysiologique des neurones, de manière individuel ou collective par nœud ;
iii) de créer une matrice spatio-temporelle d’activité fonctionnelle des nœuds à partir des données dites données matricielles obtenues à l’étape précédente ; et
iv) de créer une carte représentant la corrélation spatio-temporelle croisée et pondérée de l’activité de chaque nœud relié à d’autres nœuds afin de fournir un ensemble de données quantitatives (ou données matricielles), qui s’avèrent être caractéristique pour chaque modèle biologique selon l’invention, en configuration de représentation pathologique. En particulier, il s’agit de générer une « signature d’activité fonctionnelle » qui sera comparée à une « bibliothèque de référence de signatures d’activité fonctionnelle » ou à une « signature d’activité fonctionnelle du même réseau préalablement enregistré » ou à une « collection d’activités fonctionnelle du même réseau préalablement enregistré », permettant ainsi d’établir les différences relatives entre les signatures enregistrées et les signatures de référence.
i) de convertir des données électrophysiologiques au moyen d’un transducteur de signal fourni avec l’équipement d’enregistrement, ledit transducteur pouvant être couplé avec un amplificateur de signal;
ii) d’établir un seuil de détection pour binariser l’activité électrophysiologique des neurones, de manière individuel ou collective par nœud ;
iii) de créer une matrice spatio-temporelle d’activité fonctionnelle des nœuds à partir des données dites données matricielles obtenues à l’étape précédente ; et
iv) de créer une carte représentant la corrélation spatio-temporelle croisée et pondérée de l’activité de chaque nœud relié à d’autres nœuds afin de fournir un ensemble de données quantitatives (ou données matricielles), qui s’avèrent être caractéristique pour chaque modèle biologique selon l’invention, en configuration de représentation pathologique. En particulier, il s’agit de générer une « signature d’activité fonctionnelle » qui sera comparée à une « bibliothèque de référence de signatures d’activité fonctionnelle » ou à une « signature d’activité fonctionnelle du même réseau préalablement enregistré » ou à une « collection d’activités fonctionnelle du même réseau préalablement enregistré », permettant ainsi d’établir les différences relatives entre les signatures enregistrées et les signatures de référence.
Dans le cadre de la présente invention, par « signature d’activité fonctionnelle » on désigne un profil d’activité, c’est-à-dire une éventuelle altération de l’activité fonctionnelle (i.e. activité électrique) des neurones en culture sous forme de réseau dans le premier compartiment du dispositif selon l’invention.
Dans le cadre de la présente invention, par « bibliothèque de signature d’activité fonctionnelle » on désigne une collection de signatures d’activité pour une multiplicité d’échantillon biologique différents (par exemple 2 ou plus, avantageusement plus de 10, de préférence plus de 100, plus de 1 000, voire plus de 10 000 ou même plus de 1 000 000 échantillons biologiques) qui peuvent être identifiées les unes des autres.
Dans le cadre de l’invention, la comparaison à une valeur de référence réalisée à l’étape f) consiste à comparer au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones de l’invention consistant en une valeur obtenue à partir d’un prélèvement d’échantillon réalisé préalablement (en termes de secondes, minutes, heures, jours, mois et/ou années) à au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones obtenue après application de l’échantillon dont l’effet est à déterminer par le procédé de l’invention ; et/ou consistant en une valeur issue d’une bibliothèque de référence ou collection de référence. En particulier,
- dans le cas de la mise en œuvre le procédéin vitroouex vivode détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique pour assurer le suivi, ou «monitoring», de l’état d’un sujet (i.e. suivre l’évolution à la hausse ou à la baisse d’une pathologie, en particulier d’une affection neurologiques et/ou nerveuses, l’apparition d’une pathologie, en particulier d’une affection neurologiques et/ou nerveuses ou encore l’effet d’un traitement par administration d’un agent/agent d’essai), alors un suivi dans le temps des valeurs d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones avec un critère d’évolution (seuil à la hausse ou à la baisse sur une période de temps d’analyse avantageusement compris entre 30 sec et 60 min, avantageusement entre 1 et 50 min, entre 2 et 40 min, entre 3 et 30 min, voire même entre 4 et 20 min, de préférence entre 5 et 10 min, notamment avec déviation standard, utilisation de la dérivée) est effectué ;
- dans le cas d’une comparaison d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones à une bibliothèque d’activité fonctionnelle existante, il faut considérer l’ensemble des paramètres i) à vii) enregistrés, ce qui permet notamment d’obtenir un diagnostic différentiel plus fiable, c’est-à-dire d’être discriminants entre les différents diagnostics possibles pour lesquels il peut y avoir des symptômes cliniques identiques ou proches en raison de l’implication dans ces troubles de mêmes protéines dysfonctionnelles. Dans ce cas, l’étape de comparaison selon l’invention comprend, de préférence consiste, en une comparaison absolue par rapport à d’autres sujets dits « vrais positifs » et/ou « vrais négatifs » formant des regroupements, ou « clusters », de sujets/données de référence ; ou
- la comparaison à une valeur de référence réalisée à l’étape f) peut également consister à une comparaison absolue avec une bibliothèque et un suivi, ou « monitoring », de l’état d’un sujet, tels que décrits précédemment.
- dans le cas de la mise en œuvre le procédéin vitroouex vivode détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique pour assurer le suivi, ou «monitoring», de l’état d’un sujet (i.e. suivre l’évolution à la hausse ou à la baisse d’une pathologie, en particulier d’une affection neurologiques et/ou nerveuses, l’apparition d’une pathologie, en particulier d’une affection neurologiques et/ou nerveuses ou encore l’effet d’un traitement par administration d’un agent/agent d’essai), alors un suivi dans le temps des valeurs d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones avec un critère d’évolution (seuil à la hausse ou à la baisse sur une période de temps d’analyse avantageusement compris entre 30 sec et 60 min, avantageusement entre 1 et 50 min, entre 2 et 40 min, entre 3 et 30 min, voire même entre 4 et 20 min, de préférence entre 5 et 10 min, notamment avec déviation standard, utilisation de la dérivée) est effectué ;
- dans le cas d’une comparaison d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones à une bibliothèque d’activité fonctionnelle existante, il faut considérer l’ensemble des paramètres i) à vii) enregistrés, ce qui permet notamment d’obtenir un diagnostic différentiel plus fiable, c’est-à-dire d’être discriminants entre les différents diagnostics possibles pour lesquels il peut y avoir des symptômes cliniques identiques ou proches en raison de l’implication dans ces troubles de mêmes protéines dysfonctionnelles. Dans ce cas, l’étape de comparaison selon l’invention comprend, de préférence consiste, en une comparaison absolue par rapport à d’autres sujets dits « vrais positifs » et/ou « vrais négatifs » formant des regroupements, ou « clusters », de sujets/données de référence ; ou
- la comparaison à une valeur de référence réalisée à l’étape f) peut également consister à une comparaison absolue avec une bibliothèque et un suivi, ou « monitoring », de l’état d’un sujet, tels que décrits précédemment.
A titre d’exemple, dans le cas de la détermination de la présence ou non d’une infection au SARS-CoV-2, ou COVID-19, l’étape f) du procédé de l’invention comprend, avantageusement consiste, en une comparaison absolue par rapport à une bibliothèque d’activité fonctionnelle.
A titre d’exemple, dans le cas de l’établissement d’un diagnostic différentiel de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson, l’étape g) du procédé de l’invention comprend, avantageusement consiste, en une comparaison absolue par rapport à une bibliothèque d’activité fonctionnelle. Ensuite et dans le but de suivre l’évolution de l’affection un suivi dans le temps des valeurs de l’index de connectivité du réseau (paramètre iv)) avec un critère d’évolution (seuil à la hausse ou à la baisse sur une période de temps moyenne avec déviation standard, utilisation de la dérivée) est avantageusement effectué.
A titre d’exemple, dans le cas de la détermination de la présence ou non d’un traumatisme crânien, l’étape g) du procédé de l’invention comprend, avantageusement consiste, en un suivi de l’évolution de l’affection par un suivi dans le temps des valeurs de l’index de connectivité du réseau (paramètre iv)) avec un critère d’évolution (seuil à la hausse ou à la baisse sur une période de temps moyenne avec déviation standard, utilisation de la dérivée).
A titre d’exemple, le moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données d’activité fonctionnelle est un système algorithmique de conversion de données électriques et/ou électrophysiologiques en données binaires.
Selon l’invention, il peut s’agir de la conversion du signal d’activité fonctionnelle enregistré par le système MEA2100-Headstage (Multichannel systems, Reutlingen, Allemagne) en signal numérique par un ’convertisseur analogique digital, éventuellement couplé à un amplificateur ou ensemble d’amplificateurs, ledit convertisseur étant directement intégré dans l’équipement d’enregistrement. Ce signal binaire de flux de données est lu par le logiciel ’MEA2100-256-Systems (Multichannel systems, Reutlingen, Allemagne), fourni avec l’équipement.
A titre d’exemple, le moyen de conversion de l’activité numérique d’un nœud en signal binaire d’un nœud est assuré par un algorithme de seuillage, classiquement connu de l’Homme du métier, qui consiste à analyser le bruit de fond du signal et ’appliquer des filtres adaptés afin d’appliquer un seuil de binarisation sur l’ensemble du signal.
Le procédé de l’invention permet d’appliquer un échantillon biologique provenant d’un sujet (e.g. échantillon de liquide cérébro-spinal, de sang, de mucus de salive ou encore un agent d’essai) dans un biorécepteur comprenant, avantageusement se présentant sous la forme de, un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé intégrant une co-culture cellulaire pertinente (de cellules neuronales et/ou non-neuronales et/ou d’explant). De préférence l’échantillon est appliqué sur la culture de neurones de manière indirecte, c’est-à-dire que l’application ne se fait pas sur la culture de neurones mais sur au moins une des co-cultures associées qui agit alors via l’interface biologique connectée à la culture de neurones par des axones et/ou synapses s’étendant, par exemple, dans les microcanaux du dispositif microfluidique multi-compartimentalisé de l’invention. La réponse du réseau neuronal, à savoir une éventuelle modification de l’activité fonctionnelle du réseau neuronale, suite à l’application dudit échantillon biologique est ensuite enregistrée puis analysée.
En particulier, ladite modification de l’activité fonctionnelle du réseau neuronale peut se traduire par tous les moyens connus de l’Homme du métier, en particulier par :
- une communication fonctionnelle modifiée, c’est-à-dire des changements dans l’efficacité de la communication de cellule à cellule dans laquelle la capacité d’un ou plusieurs neurones à activer les neurones cibles auxquels ils sont connectés de manière synaptique ou non synaptique, est soit augmentée, soit diminuée, soit détruite;
- une modification des réseaux de connexions axonales et/ou dendritiques, par exemple par destruction desdites axones et/ou dendrites ;
- une modification d’un ou plusieurs types cellulaires affectant la communication neuronale, par exemple perturbation des cellules gliales uniquement au sein d’un nœud, et/ou
- une modification des potentiels d’action, c’est-à-dire une augmentation ou une diminution de l’amplitude, de la fréquence, de la durée, du potentiel « seuil » permettant une dépolarisation membranaire et/ou du rythme des potentiels d’action.
Ces altérations se traduisent alors par une modification d’au moins un paramètre sélectionné dans le groupe constitué par i) un coefficient de connexion ; ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ; iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ; iv) un index de connectivité du réseau ; v) un score z ; vi) un coefficient de participation ; et vii) un index de centralité d’un nœud. Il s’ensuit l’obtention d’une signature d’activité fonctionnelle, issue de la corrélation desdits paramètres, qui est caractéristique d’un état pathologique ou non.In fine, le diagnostic est réalisé en comparant la signature d’activité fonctionnelle ainsi obtenue à une signature d’activité fonctionnelle dite « vrai positif », c’est-à-dire pour laquelle les marqueurs réseau sont des vrais positifs.
En particulier, ladite modification de l’activité fonctionnelle du réseau neuronale peut se traduire par tous les moyens connus de l’Homme du métier, en particulier par :
- une communication fonctionnelle modifiée, c’est-à-dire des changements dans l’efficacité de la communication de cellule à cellule dans laquelle la capacité d’un ou plusieurs neurones à activer les neurones cibles auxquels ils sont connectés de manière synaptique ou non synaptique, est soit augmentée, soit diminuée, soit détruite;
- une modification des réseaux de connexions axonales et/ou dendritiques, par exemple par destruction desdites axones et/ou dendrites ;
- une modification d’un ou plusieurs types cellulaires affectant la communication neuronale, par exemple perturbation des cellules gliales uniquement au sein d’un nœud, et/ou
- une modification des potentiels d’action, c’est-à-dire une augmentation ou une diminution de l’amplitude, de la fréquence, de la durée, du potentiel « seuil » permettant une dépolarisation membranaire et/ou du rythme des potentiels d’action.
Ces altérations se traduisent alors par une modification d’au moins un paramètre sélectionné dans le groupe constitué par i) un coefficient de connexion ; ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ; iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ; iv) un index de connectivité du réseau ; v) un score z ; vi) un coefficient de participation ; et vii) un index de centralité d’un nœud. Il s’ensuit l’obtention d’une signature d’activité fonctionnelle, issue de la corrélation desdits paramètres, qui est caractéristique d’un état pathologique ou non.In fine, le diagnostic est réalisé en comparant la signature d’activité fonctionnelle ainsi obtenue à une signature d’activité fonctionnelle dite « vrai positif », c’est-à-dire pour laquelle les marqueurs réseau sont des vrais positifs.
Le résultat de la mise en œuvre du procédé de l’invention dans un diagnostic différentiel permet d’obtenir un résultat en moins de 72 heures, avantageusement en moins de 48h, de préférence en moins de 24h, voire en moins de 12 heures, 6 heures, 3 heures, 2 heures 1 heures, ou en moins de 30 minutes, 20 minutes, 15 minutes ou encore moins de 10 minutes voire même immédiatement par analyse fonctionnelle du réseau de neurones.
Il ressort de ce qui précède que l’innovation de l’invention réside donc dans l’utilisation des marqueurs réseaux comme marqueurs de diagnostic, dans l’identification d’une architecture neurones-cellules-explant pertinentes (i.e. cellules neuronales ou non-neuronales ou explant tissulaire) pour l’établissement d’un diagnostic donné et dans la quantification des marqueurs réseaux par type de diagnostic permettant de certifier le diagnostic.
Un des avantages du procédé de l’invention est qu’il permet d’établir un diagnostic différentiel fiable, c’est-à-dire un diagnostic permettant de différencier une pathologie neurologique et/ou nerveuse d’une autre qui présentent des symptômes proches ou similaires, voire une pathologie qui présent peu ou pas de symptômes observables au cours d’une auscultation clinique primaire.
Un autre avantage du procédé de l’invention est qu’il assure un diagnostic différentiel rapide.
En outre, le procédé de l’invention permet d’améliorer le rapport spécificité/sensibilité. En effet, le procédé de l’invention présente une meilleure résolution de détection par rapport à un couplage de molécules classiques (e.g. ELISA) ou aux limites d’amplification de la PCR ; assure une spécificité du fait de l’utilisation de neurones et d’au moins une co-culture pertinente associée permettant de modéliser une architecture cellulaire et moléculaire spécifique pour diagnostiquer une pathologie donnée.
De plus, le procédé de l’invention est peu coûteux puisqu’il ne nécessite pas l’utilisation de machines spécifiques telles que des dosages ELISA, des marquages immunospécifiques, des PCR ou d’autres techniques de dosage de biochimiques.
Enfin, le procédé de l’invention est peu contraignant et, selon les modes d’intervention de prélèvement peut être peu invasif , puisqu’il requiert l’utilisation d’un très petit volume de fluide, de préférence de l’ordre du microlitre, compte tenu de la mise en œuvre d’un dispositif microfluidique.
L’invention concerne également un biorécepteur pour déterminer l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique. En particulier, il s’agit d’un biorécepteur apte à être mis en œuvre dans le procédé de l’invention tel que décrit précédemment.
L’invention se rapporte donc à un biorécepteur pour déterminer l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique, comprenant, avantageusement se présentant sous la forme de, un dispositif multi-compartimenté comprenant :
i) au moins un premier compartiment et un deuxième compartiment ;
ii) au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et deuxième compartiments ( ) ;
iii) la culture d’au moins un type de cellules ou d’un explant par compartiment, le premier compartiment comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et le deuxième compartiment sur lequel peut être appliqué ledit échantillon biologique, comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ou la culture d’un explant ;
iv) au moins un dispositif permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment, le dispositif étant susceptible d’être combiné à un moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données.
i) au moins un premier compartiment et un deuxième compartiment ;
ii) au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et deuxième compartiments (
iii) la culture d’au moins un type de cellules ou d’un explant par compartiment, le premier compartiment comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et le deuxième compartiment sur lequel peut être appliqué ledit échantillon biologique, comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ou la culture d’un explant ;
iv) au moins un dispositif permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment, le dispositif étant susceptible d’être combiné à un moyen de conversion de l’activité fonctionnelle en données.
De préférence, la présente invention a pour objet un biorécepteur pour déterminer l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique tel que décrit précédemment présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison :
- l’interface biologique comprend, avantageusement consiste en au moins un des éléments sélectionné dans le groupe constitué par des microcanaux fluidiques ; des microcanaux PDMS ; une membrane poreuse, dont la porosité est, avantageusement, comprise entre 10 nm et 40 µm et dont la densité de pores est, avantageusement, comprise entre 10 et 1.109pores par cm2, avantageusement entre 1.105et 1.109pores par cm2; une membrane capillaire poreuse, avantageusement il s’agit d’un membrane sur laquelle est cultivée au moins un organoïde (i.e. une structure multicellulaire tridimensionnelle qui reproduitin vitrola micro-anatomie d’un organe), en polycarbonate, en polyester, en polyéthylène téréphtalate et/ou en polytétrafluoroéthylène ; un gel ;un hydrogel et leurs mélanges ;
- il comprend en outre un moyen de conversion de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment en données d’activité fonctionnelle ;
- il comprend en outre, un moyen d’analyse agencé de manière à déterminer au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle, l’au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ; et
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ;
vii) un index de centralité d’un nœud ;
- il comprend en outre, un moyen pour réaliser une comparaison entre l’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones et une valeur de référence d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones afin de déterminer l’effet d’un échantillon biologique ;
- il comprend en outre un troisième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et troisième compartiments (1, 3) et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et troisième compartiments ( ) ; avantageusement un quatrième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et quatrième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et quatrième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et quatrième compartiments ( ); de préférence un cinquième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et cinquième compartiments et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les quatrième et cinquième compartiments ( ) ;
- il peut être compris dans un kit portatif ou non portatif, visant déterminer l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique pour,in fine, établir un diagnostic différentiel d’une affection neurologique et/ou nerveuse.
- l’interface biologique comprend, avantageusement consiste en au moins un des éléments sélectionné dans le groupe constitué par des microcanaux fluidiques ; des microcanaux PDMS ; une membrane poreuse, dont la porosité est, avantageusement, comprise entre 10 nm et 40 µm et dont la densité de pores est, avantageusement, comprise entre 10 et 1.109pores par cm2, avantageusement entre 1.105et 1.109pores par cm2; une membrane capillaire poreuse, avantageusement il s’agit d’un membrane sur laquelle est cultivée au moins un organoïde (i.e. une structure multicellulaire tridimensionnelle qui reproduitin vitrola micro-anatomie d’un organe), en polycarbonate, en polyester, en polyéthylène téréphtalate et/ou en polytétrafluoroéthylène ; un gel ;un hydrogel et leurs mélanges ;
- il comprend en outre un moyen de conversion de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment en données d’activité fonctionnelle ;
- il comprend en outre, un moyen d’analyse agencé de manière à déterminer au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle, l’au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ; et
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ;
vii) un index de centralité d’un nœud ;
- il comprend en outre, un moyen pour réaliser une comparaison entre l’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones et une valeur de référence d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones afin de déterminer l’effet d’un échantillon biologique ;
- il comprend en outre un troisième compartiment et au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et troisième compartiments (1, 3) et/ou au moins un moyen formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et troisième compartiments (
- il peut être compris dans un kit portatif ou non portatif, visant déterminer l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique pour,in fine, établir un diagnostic différentiel d’une affection neurologique et/ou nerveuse.
L’invention concerne également l’utilisation du biorécepteur tel que décrit précédemment dans un procédéin vitroouex vivode diagnostic d’une affection neurologique ou nerveuse, avantageusement sélectionnée dans le groupe constitué par la maladie d’Alzheimer ; maladie de Parkinson ; traumatisme crânien ; accident vasculaire cérébrale par occlusion thrombotique ou embolique ou par ischémie ; accident ischémique transitoire ; forme neuronale d’une infection au SARS-CoV-2 ; intoxication neuronale, par exemple aux composés organophosphorés ; analgésie ; maladie neuro-inflammatoire, telle que la sclérose en plaque, la névrite otique, les myélites, le Lupus, la maladie de Crohn ; surdité par atteinte du nerf auditif ; sclérose latérale amyotrophique ; neuropathie rétinienne, par exemple induite par un diabète ; épilepsie, psoriasis, herpès ; méningo-encéphalite ; méningite lymphocytaire isolée ; polyradiculonévrite de type Guillain-Barré ou mononévrite ; neuropathie périphérique et myélopathie.
L’invention concerne également l’utilisation du biorécepteur tel que décrit précédemment dans un procédéin vitroouex vivode suivi d’un traitement préventif et/ou curatif d’une affection neurologique ou nerveuse, avantageusement un traitement par thérapie génique, thérapie cellulaire, thérapie de repousse axonale, administration d’un ou plusieurs agents curatifs et/ou préventifs et/ou anesthésiques.
L’invention concerne également l’utilisation du biorécepteur tel que décrit précédemment dans un procédé de criblage rapide et sensible d’agents ou agents d’essai comme médicaments potentiels. En effet, le dispositif de l’invention permet d’identifier l’effet thérapeutique éventuel d’un agent d’essai ainsi que d’évaluer la concentration physiologiquement pertinente (par exemple la quantité présente dans un tissu particulier sous un régime posologique prescrit) de cet agent identifié comme un médicament. L’application indirecte de l’agent d’essai sur une culture de neurones dans le premier compartiment produit une signature d’activité fonctionnelle reconnaissable ou caractéristique permettant d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’un agent rapidement et efficacement. La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples de réalisation qui suivent à l’appui des figures annexées.
Il est considéré que sans plus de précision, l’Homme du métier sera capable, au vu de la description et des exemples de réalisation de mettre en œuvre et d’utiliser le procédé et le biorécepteur revendiqués.
Comme déjà évoqué précédemment, l’invention concerne, dans un premier mode de réalisation tel que représenté par les Figures 1 et 5, un biorécepteur comprenant un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé comprenant, dans un premier mode de réalisation, un premier compartiment 1 et un deuxième compartiment 2, comprenant chacun la culture d’au moins un type de cellules ou d’explant ; et au moins un moyen formant une interface biologique 21 pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et deuxième compartiments 1, 2.
Le biorécepteur de l’invention comprend également au moins un dispositif 40 permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment, le dispositif étant susceptible d’être combiné à un moyen de conversion 50 de l’activité fonctionnelle en données d’activité fonctionnelle, un moyen d’analyse 60 de ces données d’activité fonctionnelle agencé de manière à déterminer au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle, l’au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ; et
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ;
vii) un index de centralité d’un nœud ;
et un moyen 70 pour réaliser une comparaison entre l’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones et une valeur de référence d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones afin de déterminer l’effet d’un échantillon biologique.
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ; et
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ;
vii) un index de centralité d’un nœud ;
et un moyen 70 pour réaliser une comparaison entre l’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones et une valeur de référence d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones afin de déterminer l’effet d’un échantillon biologique.
Dans un deuxième mode de réalisation tel que représenté par la , le biorécepteur de l’invention comprend, en outre, un troisième compartiment 3 ; au moins un moyen 31 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et troisième compartiments 1, 3 et/ou au moins un moyen 32 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et troisième compartiments 2, 3.
Dans un troisième mode de réalisation tel que représenté par la , le biorécepteur de l’invention comprend, en outre, un quatrième compartiment 4 ; au moins un moyen 41 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et quatrième compartiments 1, 4 et/ou au moins un moyen 42 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et quatrième compartiments 2, 4 et/ou au moins un moyen 43 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et quatrième compartiments 3, 4.
Dans un quatrième mode de réalisation tel que représenté par la , le biorécepteur de l’invention comprend, en outre, un cinquième compartiment 5 ; au moins un moyen 51 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et cinquième compartiments 1, 5 et/ou au moins un moyen 52 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et cinquième compartiments 2, 5 et/ou au moins un moyen 53 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et cinquième compartiments 3, 5 et/ou au moins un moyen 54 formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les quatrième et cinquième compartiments 4, 5.
Tel que représenté par les et 7, la mise en œuvre du procédéin vitroouex vivode détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique selon l’invention permet d’obtenir un enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones Figures 6 et 7A en culture dans le premier compartiment 1, c’est-à-dire, un enregistrement de l’activité extracellulaire des neurones qui se traduits par des pics appelés « spikes » qui, quand un réseau de neurones est synchronisé (ou en condition non-pathologique), apparaissent périodiquement. Ainsi, une forte activité du réseau de neurones en culture dans le premier compartiment 1 est observé par la présence de rafale de pics appelés «burst». Au contraire, d’autres types de neurones, comme les neurones GABAergiques, ne présentent pas une activité fonctionnelle synchronisée (données non représentées). Dans ce cas, la perturbation éventuelle de l’activité fonctionnelle ne se traduira pas par une désynchronisation des «spikes» et/ou une diminution ou absence des «burst», mais pas une modification des paramètres caractéristiques de l’état du réseau de neurones selon l’invention.
Cet enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sous forme de réseau en culture dans le premier compartiment est soumis à un moyen de conversion 50 permettant d’obtenir des données d’activité fonctionnelle, en particulier des données binaires (Figures 6 et 7B).
Ces données d’activité fonctionnelle sont à leur tour soumise à un moyen d’analyse 60 agencé de manière à déterminer au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle, l’au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ; et
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ;
vii) un index de centralité d’un nœud.
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ; et
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ;
vii) un index de centralité d’un nœud.
In fine, ces données/paramètres caractéristiques de l’état du réseau de neurones sont corrélés et peuvent être représentés sous forme d’un graphique de corrélation croisée (Figures 6 et 7C).
Le biorécepteur comprend un moyen 70 pour réaliser une comparaison entre l’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones et une valeur de référence d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones afin de déterminer l’effet de l’application d’un échantillon biologique sur un modèle biologique et, par conséquent, de déterminer la présence ou non d’une atteinte neurologiques et/ou nerveuse chez un sujet, voire d’identifier de nouvelles solutions thérapeutiques (nouvelles molécules ou encore nouvelles posologie) à partir du criblage d’agents d’essai.
En particulier, lorsque la moyenne des potentiels d’action par seconde a une valeur supérieure à 0,5 alors il est possible d’analyser au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ; et
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ;
vii) un index de centralité d’un nœud;
En particulier, l’analyse comprend, avantageusement consiste en, la détermination de la valeur du ratio coefficient de connexion:moyenne des longueurs minimum inter-nœuds, permettantin fine, de déterminer l’index de connectivité du réseau qui sera alors le paramètre mis en œuvre dans l’étape de comparaison.
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ; et
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ;
vii) un index de centralité d’un nœud;
En particulier, l’analyse comprend, avantageusement consiste en, la détermination de la valeur du ratio coefficient de connexion:moyenne des longueurs minimum inter-nœuds, permettantin fine, de déterminer l’index de connectivité du réseau qui sera alors le paramètre mis en œuvre dans l’étape de comparaison.
La présente invention va être illustrée plus avant en rapport avec un biorécepteur comprenant un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé 10 comprenant 2 compartiments (exemples 1 à 3) ou 5 compartiments (exemple 4). Toutefois, ces exemples ne sont en aucun cas limitatifs de l’invention.
- Contexte
Plus de 10 millions de personnes en Europe souffrent de maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer (MA) et ce chiffre tend à doubler dans moins de 20 ans. Il n’existe aucun traitement curatif pour ces troubles et la recherche de nouveaux traitements est rendue difficile par la complexité d’établir un diagnostic différentiel fiable. Les premières lésions de la MA apparaissent dans l’hippocampe, qui est une zone du cerveau impliquée dans les processus de mémorisation (enregistrement, restitution et organisation des souvenirs) et dans la gestion des émotions, avant de diffuser progressivement en direction des zones externes en suivant les connexions établies entre les différentes régions cérébrales. L’hippocampe est une structure composée de cellules gliales (astrocytes ou cellules microgliales) et, de neurones dont la grande majorité sont des neurones glutamatergiques et GABAergiques.
- Matériels et méthodes
Le biorécepteur de l’invention se présente sous la forme d’un dispositif multi-compartimenté dans lequel un premier compartiment comprend la culture de neurones glutamatergiques humains dérivés de cellules souches et, un second compartiment comprend la culture de neurones GABAergiques humains dérivés de cellules souches.
Des neurones gluamatergiques sont stockés dans l’azote à une température d’environ -200°C. Une étape de décongélation progressive est effectuée selon les techniques conventionnelles largement connues de l’Homme du métier. Les cellules décongelées sont ensuite reprises dans environ 10 mL d’un milieu de culture dédié à 37°C. L’aliquot est centrifugé puis traité à l’aide d’un compteur automatique ou avec une cellule de Malassez afin de déterminer la concentration de neurones glutamatergiques et les dilutions à effectuer. L’aliquot est ensuite dilué et ensemencé dans le premier compartiment d’un dispositif selon l’invention préalablement traité selon les techniques conventionnelles largement connues de l’Homme du métier pour faciliter l’adhésion des neurones glutamatergiques au substrat.
Des neurones GABAergiques sont mis en culture dans le deuxième compartiment dudit dispositif, selon le même protocole que celui détaillé ci-dessus.
L’activité fonctionnelle des neurones glutamatergiques ainsi cultivés est enregistrée au moyen de réseaux de microélectrodes (MEA) planaires 256MEA100/30iR-ITO-w/o (Multichannel systems, Reutlingen, Allemagne) constitué d’électrodes de 30 µm de diamètre espacé de 100 µm d’électrodes. Cet enregistrement s’effectue pendant 10 min grâce au logiciel MEA2100-256-Systems (Multichannel systems, Reutlingen, Allemagne). La technologie des réseaux de microélectrodes permet d’enregistrer l’activité extracellulaire fonctionnelle et spontanée des neurones en tant que marqueur de connectivité réseau.
Pour l’enregistrement fonctionnel, deux conditions ont été testées :
- condition « test » : échantillon de liquide céphalorachidien d’un sujet susceptible d’être atteint de la MA ; et
- condition « référence » : échantillon de liquide céphalorachidien d’un sujet dit « vrai négatif », servant de valeur de référence.
- condition « test » : échantillon de liquide céphalorachidien d’un sujet susceptible d’être atteint de la MA ; et
- condition « référence » : échantillon de liquide céphalorachidien d’un sujet dit « vrai négatif », servant de valeur de référence.
En particulier, concernant la condition « référence », il est à noter qu’il s’agit d’un échantillon obtenu à partir d’un sujet sain et présentant un résultat négatif au test conventionnel de la MA. En d’autres termes, il s’agit d’un échantillon rendant compte d’un diagnostic dit « vrai négatif ».
- Résultats
Les résultats sont représentés par les figures 6 et 7.
Au cours de l’enregistrement électrophysiologique, les neurones glutamatergiques en culture ont montré une activité fonctionnelle représentée par des pointes (Figures 6A et 7A). Ces pics sont détectés dans le temps et l’espace par l’algorithme du logiciel MEA2100-256-Systems qui attribue alors à une valeur, identifiées par chacun des points sur les pics.
A partir desdites valeurs identifiées par l’algorithme, une matrice (tracé raster ourasterplot) est générée afin de visualiser l’activité de chaque électrode active en fonction du temps (Figures 6B et 7B). Ce graphique permet d’évaluer la synchronicité d’un réseau neuronal, à savoir la capacité des neurones à avoir une activité en même temps. Il ressort clairement de ces graphiques que le réseau de neurones glutamatergiques est synchronisé en condition « référence » (Figure 6B) et désynchronisé en condition « test » (Figure 7B).
En outre, la structure optimale du réseau est définie par des paramètres quantitatifs obtenus par un algorithme de corrélation croisée et permet d’estimer la qualité de la connectivité réseau. Dans ce cas, la moyenne des potentiels d’action par seconde a une valeur supérieure à 0,5 ; ce qui permet la détermination de la valeur du ratio coefficient de connexion:moyenne des longueurs minimum inter-nœuds, et,in fine, la détermination de la valeur de l’index de connectivité du réseau.
Le traitement et l’analyse, tels que décrit précédemment, des données obtenues permet de représenter un réseau de neurones, défini par des nœuds et interactions entre eux (Figure 6C et 7C). La corrélation croisée est un algorithme représentant le degré du réseau de neurones et permet d’estimer la fonction état du réseau.
L’analyse du réseau montre que le réseau de neurones en condition « test » (Figure 7C) a moins de connexion que le réseau de neurones en condition « référence » (Figure 6C).
- Conclusion
Il ressort de la mise en œuvre du procédé de l’invention que l’échantillon de la condition « test » est issu d’un sujet présentant une affection neurologique et/ou nerveuse.
La comparaison de la représentation du réseau de neurones en condition « test » (Figure 7C) avec une bibliothèque de signatures d’activité fonctionnelle permet d’établir un diagnostic rapide et fiable de la maladie d’Alzheimer.
Ensuite, un suivi de l’état d’un sujet (i.e. suivre l’évolution à la hausse ou à la baisse de la MA) est effectué par un suivi dans le temps des valeurs de l'index de connectivité du réseau (paramètre iv)) avec un critère d’évolution (seuil à la hausse ou à la baisse sur une période de temps moyenne avec déviation standard, utilisation de la dérivée) par rapport à la valeur de référence correspondant à la valeur obtenu au moment du diagnostic de la maladie, c’est-à-dire la valeur obtenue telle que décrit précédemment).
Exemple 2 : Diagnostic d’un traumatisme crânien intervenu pendant un match de rugby
- Contexte
Dans certains sports à risque, comme le rugby, les joueurs sont très exposés au risque de traumatisme crânien (ou commotion cérébrale). Elle peut être définie comme un dysfonctionnement de courte durée des fonctions cérébrale en l’absence de lésions macro- ou microscopique. La fréquence des commotions est en augmentation ces 15 dernière années. L’incidence dans le rugby est observée entre 4,1 et 7,9/1000 heure-joueur en cours de match. Actuellement, le diagnostic repose sur l’établissement d’un score de Glasgow établi par des observations et symptômes cliniques. La commotion cérébrale peut résulter d’un coup autre que sur la tête, le joueur peut avoir des signes cliniques et symptômes très faible voire inaperçu, sans perte de connaissance, ce qui peut rendre le diagnostic plus difficile et plus lent. Le temps entre le diagnostic et le pronostic du joueur peut être très long et immobiliser le joueur pendant plusieurs jours, voire semaines et avoir, parfois, des conséquences néfastes, lourdes et à long terme.
- Matériels et méthodes
Le biorécepteur de l’invention se présente sous la forme d’un dispositif multi-compartimenté dans lequel un premier compartiment comprend la culture de neurones sensitifs humains dérivés de cellules souches et, un second compartiment comprend la culture de cellules de la muqueuse buccale. Voir le protocole détaillé au point 2. de l’exemple 1.
Pour l’enregistrement fonctionnel, deux conditions ont été testées :
- condition « test » : échantillon de salive obtenu à partir d’un sujet ayant reçu un choc au cours d’un match de rugby ; et
- condition « référence » : échantillon de salive obtenu à partir d’un sujet sain et présentant un résultat négatif au test conventionnel de détection d’un traumatisme crânien. En d’autres termes, il s’agit d’un échantillon rendant compte d’un diagnostic dit « vrai négatif ».
- condition « test » : échantillon de salive obtenu à partir d’un sujet ayant reçu un choc au cours d’un match de rugby ; et
- condition « référence » : échantillon de salive obtenu à partir d’un sujet sain et présentant un résultat négatif au test conventionnel de détection d’un traumatisme crânien. En d’autres termes, il s’agit d’un échantillon rendant compte d’un diagnostic dit « vrai négatif ».
- Résultats
Des données sont obtenues selon le protocole détaillé au point 3. de l’exemple 1.
- Conclusion
Il ressort de la mise en œuvre du procédé de l’invention que l’échantillon de la condition « test » est issu d’un sujet présentant une affection neurologique et/ou nerveuse.
La comparaison de la représentation du réseau de neurones en condition « test » avec une bibliothèque de signatures d’activité fonctionnelle permet d’établir un diagnostic rapide et fiable de présence d’un traumatisme crânien permettant d’assurer une prise en charge rapide et efficace du sujet.
- Contexte
Les coronavirus sont connus pour conduire à des syndromes respiratoires aigus sévères. Ces derniers ont été à l’origine de trois épidémies mortelles au cours du 21ème siècle. Le SARS-CoV-2, responsable de la maladie COVID-19, est à l’origine de la pandémie la plus récente avec un taux de mortalité significativement élevé et des coûts économiques dramatiques. En Europe, la mortalité cumulée est de 34% et est variable d’un pays européen à l’autre, corrélée avec l’émergence de nouveaux variants du SARS-CoV-2 et une forte hétérogénéité des symptômes (personnes asymptomatiques, formes bénignes, mort de l’individu). La capacité des coronavirus à envahir le système nerveux central avait déjà été décrite lors des deux épidémies précédentes causées par le SARS-CoV-1 et le MERS-CoV. Les atteintes neurologiques décrites sont de différents niveaux de gravité allant de simples maux de tête, à des confusions temporaires jusqu’aux accidents vasculaires cérébraux et aux convulsions dans les formes les plus sévères. Comme beaucoup d’autres maladies virales aéroportées, l’infection des voies respiratoires supérieures est la première porte d’entrée dans le corps. D’autant plus que les atteintes olfactives, incluant la perte de détection des odeurs (anosmique), suite à une infection au SARS-CoV-2 restent un des symptômes le plus commun et prédictif de l’infection avec même des tests en cours. Il a notamment été avancé que la neuroinvasion a lieu via la voie nasale. En effet, la présence de particules virales intactes dans les cellules de soutien de la muqueuse olfactive a été mise en évidence, soulignant que ce lieu pourrait être le siège de la réplication virale expliquant au passage la perte de gout et d’odorat. L’hypothèse concernant la neuroinvasion est que la propagation virale se faitviale bulbe olfactif (siège du traitement de l’information sensorielle olfactive) avant d’entrée dans le système nerveux central par l’intermédiaire des nerfs crâniaux.
- Matériels et méthodes
Le biorécepteur de l’invention se présente sous la forme d’un dispositif multi-compartimenté dans lequel un premier compartiment comprend la culture de cellules mitrales humaines dérivées du bulbe olfactif et, un second compartiment comprend la culture de cellules de la muqueuse nasale. Voir le protocole détaillé au point 2. de l’exemple 1.
Pour l’enregistrement fonctionnel, deux conditions ont été testées :
- condition « test » : échantillon nasopharyngé obtenu à partir d’un sujet ; et
- condition « référence » : échantillon nasopharyngé obtenu à partir d’un sujet sain et présentant un résultat négatif au test conventionnel de détection de la maladie COVID-19. En d’autres termes, il s’agit d’un échantillon rendant compte d’un diagnostic dit « vrai négatif ».
- condition « test » : échantillon nasopharyngé obtenu à partir d’un sujet ; et
- condition « référence » : échantillon nasopharyngé obtenu à partir d’un sujet sain et présentant un résultat négatif au test conventionnel de détection de la maladie COVID-19. En d’autres termes, il s’agit d’un échantillon rendant compte d’un diagnostic dit « vrai négatif ».
- Résultats
Des données sont obtenues selon le protocole détaillé au point 3. de l’exemple 1.
- Conclusion
Il ressort de la mise en œuvre du procédé de l’invention que l’échantillon de la condition « test » est issu d’un sujet présentant une affection neurologique et/ou nerveuse.
La comparaison de la représentation du réseau de neurones en condition « test » avec une bibliothèque de signatures d’activité fonctionnelle permet d’établir un diagnostic rapide et fiable d’atteinte par la maladie COVID-19.
Exemple 4 : Diagnostic de la maladie de Parkinson
- Contexte
La maladie de Parkinson (MP) est la seconde maladie neurodégénérative la plus répandue, après la maladie d’Alzheimer, avec une prévalence de 4% des plus de 80 ans. D’un point de vu clinique, elle présente des symptômes moteurs, affectant la marche et les mouvements du corps, associés à des symptômes non moteurs. La démence est un symptôme courant dans la maladie de Parkinson et correspond soit à une démence parkinsonienne soit à une démence à corps de Lewy.
D’un point de vu neuro-pathologique, la MP est caractérisée par une perte des neurones dopaminergiques dans la substance noire (SN, une région anatomique appartenant aux ganglions de la base) et par la présence d’inclusions intracellulaires appelés corps de Lewy. C’est dans ces corps de Lewy que se trouve la protéine α-synucléine, qui lorsqu’elle est mal repliée et conformée, entraîne une cascade de neurotoxicité.
Les projections axonales de la SN s’étendent vers le putamen et le noyau caudé (qui forment le striatum) où il y a une série de connexion vers le globus pallidus et le noyau subthalamique. Dans la MP, la dégénérescence de la voie nigrostriatal (voie entre la substance noire et le striatum) est la première cause des symptômes moteurs. Une conséquence clé de la mort des neurones dopaminergiques dans la SN et de la diminution de la dopamine est la perturbation de la signalisation dopaminergique des ganglions de la base au reste du cerveau. Le circuit moteur des ganglions de la base contrôle le mouvement. Dans ce circuit, on retrouve une voie directe et une voie indirecte. La voie directe est composée de 5 régions anatomiques : Le cortex, le striatum, la substance noire pars compacta, le thalamus et l’association du globus pallidus interne et de la substance noire reticularis.
- Matériels et méthodes
Le biorécepteur de l’invention se présente sous la forme d’un dispositif multi-compartimenté dans lequel un premier compartiment comprend la culture de cellules glutamatergiques et GABAergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes, un second compartiment comprend la culture de neurones GABAergiques, un troisième compartiment comprend la culture de neurones glutamatergiques, un quatrième compartiment comprend la culture de neurones GABAergiques et un cinquième compartiment comprenant des neurones dopaminergiques. Ces cinq compartiments correspondent aux cinq régions anatomiques de la boucle des ganglions de la base. Voir le protocole détaillé au point 2. de l’exemple 1.
Pour l’enregistrement fonctionnel, deux conditions ont été testées :
- condition « test » : échantillon de liquide céphalorachidien d’un sujet susceptible d’être atteint de la maladie de Parkinson ; et
- condition « référence » : échantillon de liquide céphalorachidien d’un sujet dit « vrai négatif », servant de valeur de référence.
- condition « test » : échantillon de liquide céphalorachidien d’un sujet susceptible d’être atteint de la maladie de Parkinson ; et
- condition « référence » : échantillon de liquide céphalorachidien d’un sujet dit « vrai négatif », servant de valeur de référence.
En particulier, concernant la condition « référence », il est à noter qu’il s’agit d’un échantillon obtenu à partir d’un sujet sain et présentant un résultat négatif au test conventionnel de la maladie de Parkinson. En d’autres termes, il s’agit d’un échantillon rendant compte d’un diagnostic dit « vrai négatif ».
- Résultats
Des données sont obtenues selon le protocole détaillé au point 3. de l’exemple 1.
- Conclusion
Il ressort de la mise en œuvre du procédé de l’invention que l’échantillon de la condition « test » est issu d’un sujet présentant une affection neurologique et/ou nerveuse.
La comparaison de la représentation du réseau de neurones en condition « test » avec une bibliothèque de signatures d’activité fonctionnelle permet d’établir un diagnostic rapide et fiable d’atteinte par la maladie de Parkinson.
Claims (23)
- Procédéin vitroouex vivode détermination de l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique, comprenant les étapes suivantes de :
a. Fournir un biorécepteur comprenant un dispositif microfluidique multi-compartimentalisé (10) comprenant :
i) au moins un premier compartiment (1) et un deuxième compartiment (2) ;
ii) au moins un moyen formant une interface biologique (21) pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et deuxième compartiments ;
iii) le premier compartiment (1) comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et le deuxième compartiment (2), sur lequel peut être appliqué ledit échantillon biologique, comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ou la culture d’un explant;
iv) au moins un dispositif (40) permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment, le dispositif étant susceptible d’être combiné à un moyen de conversion (50) de l’activité fonctionnelle en données ;
b. Mettre en contact directe ou indirecte les neurones en culture dans le premier compartiment ou les neurones et/ou cellules non neuronales ou l’explant en culture dans le deuxième compartiment avec un échantillon biologique ;
c. Réaliser un enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment (1) sur la pluralité de points de mesure sur une durée de mesure suite à la mise en contact des neurones en culture dans le premier compartiment (1) avec l’échantillon biologique selon l’étape b) ;
d. Réalisation d’une conversion de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment (1) en données d’activité fonctionnelle ;
e. Analyser les données d’activité fonctionnelle obtenues à l’étape d) et construire un graphe représentant le réseau de neurones ;
f. Détermination d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment (1) à partir des données d’activité fonctionnelle, l’au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ;
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vii) un index de centralité d’un nœud;
g. Réaliser une comparaison entre l’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones et une valeur de référence d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones afin de déterminer l’effet d’un échantillon biologique. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étape f) comprend la détermination de deux paramètres, avantageusement trois paramètres, de préférence quatre paramètres, voire même cinq paramètres, en particulier six paramètres, plus particulièrement sept paramètres caractéristiques de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle, lesdits paramètres étant sélectionnés dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ;
iv) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
v) un score z ou «z-score» ;
vi) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vii) un index de centralité d’un nœud. - Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape g) comprend une étape de comparaison à des seuils, à savoir :
- la moyenne des potentiels d’action par seconde est comparé à un seuil de moyenne des potentiels d’action par seconde dont la valeur est supérieure ou égale, avantageusement strictement supérieure, à 0,5 ; et/ou
- le coefficient de connexion est comparé à un seuil de coefficient de connexion dont la valeur est supérieure ou égale à 0, avantageusement comprise entre 0 et 1 ; et/ou
- la moyenne des longueurs minimum inter-nœuds est comparée à un seuil de moyenne des longueurs minimum inter-nœuds dont la valeur est supérieure ou égale à 1, avantageusement à 1,5 ; et/ou
- l’index de connectivité du réseau connectivité entre nœuds est comparée à un seuil de connectivité entre nœuds dont la valeur est supérieure ou égale à 0, avantageusement comprise entre 0 et 1 ; et/ou
- le score z ou «z-score» a une valeur supérieure ou égale à 0, avantageusement à 5, de préférence comprise entre 0 et 10 ; et/ou
- le coefficient de participation ou «Participation Coefficient» a une valeur supérieure ou égale à 0, avantageusement à 0,5 et de préférence comprise entre 0,5 et 1 ; et/ou
- l’index de centralité d’un nœud a une valeur supérieure ou égale à 0, avantageusement à 5 et de préférence comprise entre 6 et 10. - Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape g) comprend une comparaison d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones tels que définis par l’étape f) à une bibliothèque de référence de signatures d’activité fonctionnelle.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape g) comprend un suivi des valeurs du paramètre iv) avec un critère d’évolution à la hausse ou à la baisse sur une période de temps d’analyse.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’à l’étape f) la détermination d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) un index de connectivité du réseau ou «Small World Index» ;
iv) un score z ou «z-score» ;
v) un coefficient de participation ou «Participation Coefficient» ; et
vi) un index de centralité d’un nœud;
est effectuée lorsque la moyenne des potentiels d’action par seconde est supérieure à 0,5. - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la détermination d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones comprend, avantageusement consiste en, la détermination de l’index de connectivité du réseau qui consiste en la valeur du ratio coefficient de connexion:moyenne des longueurs minimum inter-nœuds.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif (40) permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment (1) selon l’étape a.iv) est, de préférence un dispositif (40) permettant un enregistrement en contact indirect avec les cellules en culture, sélectionné dans le groupe constitué par :
- un dispositif d’enregistrement de l’activité par des réseaux de microélectrodes planaire ou non planaire, des électrodes semi-solides, par ampérométrie ou voltamétrie ;
- un dispositif d’enregistrement d’imagerie par fluorescence, telle que l’imagerie calcique ou l’imagerie le flux ioniques transmembranaires ; et
- un dispositif d’enregistrement de l’activité électrophysiologique intracellulaire, extracellulaire ou en patch-clamp en configuration cellule entière, cellule attachée,inside-outououtside-out. - Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le moyen de conversion (50) de l’activité fonctionnelle en données selon l’étape a.iv) est un système algorithmique de conversion de données électriques et/ou électrophysiologiques en données binaires.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la durée de mesure de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment selon l’étape c) est comprise entre 300 ms et 20 min, avantageusement entre 1 min et 15 min, de préférence entre 5 min et 12 min.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le biorécepteur comprend en outre :
i) un troisième compartiment (3) comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ; et
ii) au moins un moyen (31) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et troisième compartiments (1, 3) et/ou au moins un moyen (32) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et troisième compartiments (2, 3). - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le biorécepteur comprend en outre :
iii) un quatrième compartiment (4) comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ; et
iv) au moins un moyen (41) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et quatrième compartiments (1, 4) et/ou au moins un moyen (42) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et quatrième compartiments (2, 4) et/ou au moins un moyen (43) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et quatrième compartiments (3, 4). - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le biorécepteur comprend en outre :
v) un cinquième compartiment (5) comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ; et
vi) au moins un moyen (51) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et cinquième compartiments (1, 5) et/ou au moins un moyen (52) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les deuxième et cinquième compartiments (2, 5) et/ou au moins un moyen (53) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les troisième et cinquième compartiments (3, 5) et/ou au moins un moyen (54) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les quatrième et cinquième compartiments (4, 5). - Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mise en contact des neurones en culture dans le premier compartiment (1) avec un échantillon biologique selon l’étape b) est indirecte en ce que l’échantillon biologique est appliqué sur l’interface biologique du deuxième compartiment (21) et/ou troisième compartiment (31, 32) et/ou quatrième compartiment (41, 42, 43) et/ou cinquième compartiment (51, 52, 53, 54).
- Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que :
- les neurones sont sélectionnées dans le groupe constitué des neurones glutamatergiques, GABAergiques, sérotoninergiques, cholinergiques, dopaminergiques, adrénergiques, noradrénergiques, sensitifs et des motoneurones ; et/ou
- les cellules non neuronales sont sélectionnées dans le groupe constitué des cellules gliales, épithéliales, conjonctives, thyroïdiennes, graisseuses, sanguines, immunitaires, osseuses, cartilagineuses, gastriques, pancréatiques, hépatiques, intestinales, pulmonaires, endothéliales, musculaires, vasculaires, cardiaques, mésenchymateuses et des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien et des cellules rétiniennes; et/ou
- l’explant est un tissu d’origine cérébrale, épithéliale, oculaire, thyroïdien, graisseux, vasculaire, osseux, cartilagineux, gastrique, pancréatique, hépatique, intestinale, pulmonaire, endothéliale, musculaires, rétinien, cardiaque et placentaire. - Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est sélectionné dans le groupe constitué par le sang, la salive, l’urine, les larmes, la sueur, les expectorations, le mucus, le pus, la lymphe, le liquide céphalorachidien, les sécrétions nasopharyngés, les sécrétions oropharyngées, la synovie, le liquide pleural, le liquide péritonéal, le liquide péricardique, l’humeur aqueuse, le liquide amniotique et le plasma.
- Biorécepteur pour déterminer l’effet d’un échantillon biologique sur un modèle biologique, comprenant un dispositif microfluidique multi-compartimenté (10) comprenant :
i) au moins un premier compartiment (1) et un deuxième compartiment (2) ;
ii) au moins un moyen (21) formant une interface biologique pour permettre une communication par connexion neuronale entre les premier et deuxième compartiments (1, 2) ;
iii) le premier compartiment (1) comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et le deuxième compartiment (2) sur lequel peut être appliqué ledit échantillon biologique, comprenant au moins la culture de neurones sous forme d’un réseau de neurones et/ou la culture de cellules non neuronales ou la culture d’un explant ;
iv) au moins un dispositif (40) permettant l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones sur une pluralité de points de mesure disposés de façon répartie spatialement dans le premier compartiment, le dispositif étant susceptible d’être combiné à un moyen de conversion (50) de l’activité fonctionnelle en données. - Biorécepteur selon la revendication 17, caractérisé en ce qu’il comprend en outre un moyen de conversion de l’enregistrement de l’activité fonctionnelle des neurones en culture dans le premier compartiment en données d’activité fonctionnelle.
- Biorécepteur selon la revendication 18, caractérisé en ce qu’il comprend en outre, un moyen d’analyse (60) agencé de manière à déterminer au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones dans le premier compartiment à partir des données d’activité fonctionnelle, l’au moins un paramètre étant sélectionné dans le groupe constitué par :
i) un coefficient de connexion ;
ii) une moyenne des longueurs minimum inter-nœuds ;
iii) une moyenne des potentiels d’action par seconde ;
iv) un index de connectivité du réseau ou « Small World Index » ;
v) un score z ou « z-score » ;
vi) un coefficient de participation ou « Participation Coefficient » ; et
vii) un index de centralité d’un nœud. - Biorécepteur selon la revendication 19, caractérisé en ce qu’il comprend en outre, un moyen (70) pour réaliser une comparaison entre l’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones et une valeur de référence d’au moins un paramètre caractéristique de l’état du réseau de neurones afin de déterminer l’effet d’un échantillon biologique.
- Utilisation du biorécepteur selon l’une quelconque des revendications 17 à 20 dans un procédéin vitroouex vivode diagnostic d’une affection neurologique et/ou nerveuse, avantageusement sélectionnée dans le groupe constitué par la maladie d’Alzheimer ; maladie de Parkinson ; traumatisme crânien ; accident vasculaire cérébrale, par occlusion thrombotique ou embolique ou par ischémie ; accident ischémique transitoire ; forme neuronale d’une infection au SARS-CoV-2 (= covid-19) ; intoxication neuronale, par exemple aux composés organophosphorés ; analgésie ; maladie neuro-inflammatoire, telle que la sclérose en plaque, la névrite otique, les myélites, le Lupus, la maladie de Crohn ; surdité par atteinte du nerf auditif ; sclérose latérale amyotrophique ; neuropathie rétinienne, par exemple induite par un diabète ; épilepsie, psoriasis, herpès ; méningo-encéphalite ; méningite lymphocytaire isolée ; polyradiculonévrite de type Guillain-Barré ou mononévrite ; neuropathie périphérique et myélopathie.
- Utilisation du biorécepteur selon l’une quelconque des revendications 17 à 20 dans un procédéin vitroouex vivode suivi d’un traitement préventif et/ou curatif d’une affection neurologique ou nerveuse, avantageusement un traitement par thérapie génique, thérapie cellulaire, thérapie de repousse axonale, administration d’un ou plusieurs agents curatifs et/ou préventifs et/ou anesthésiques.
- Utilisation du biorécepteur selon l’une quelconque des revendications 17 à 20 dans un procédéin vitroouex vivod’identification et/ou de caractérisation des propriétés thérapeutiques d’un agent et/ou d’une concentration seuil d’un agent.
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO2010040920A2 (fr) * | 2008-10-10 | 2010-04-15 | Cnrs-Dae | Dispositif de culture cellulaire |
| WO2018237302A1 (fr) * | 2017-06-23 | 2018-12-27 | Koniku Inc. | Ordinateur biologique reconfigurable basé sur des portes neuronales couplées capables d'apprentissage |
| WO2020161412A1 (fr) * | 2019-02-07 | 2020-08-13 | Netri | Procédé assisté par ordinateur de détermination d'une architecture de circuit microfluidique reproduisant un circuit neuronal |
-
2022
- 2022-02-09 FR FR2201131A patent/FR3132574A1/fr active Pending
-
2023
- 2023-02-09 IL IL314857A patent/IL314857A/en unknown
- 2023-02-09 WO PCT/FR2023/050180 patent/WO2023152453A1/fr active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010040920A2 (fr) * | 2008-10-10 | 2010-04-15 | Cnrs-Dae | Dispositif de culture cellulaire |
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| REVYN N. ET AL.: "Recording neuronal activity on chip with segmented 3D microelectrode arrays", 2022 IEEE 35TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON MICRO ELECTRO MECHANICAL SYSTEMS CONFERENCE (MEMS), IEEE, 9 January 2022 (2022-01-09), pages 102 - 105, XP034082650 * |
| TEDESCO M. ET AL.: "Structurally and functionally interconnected 3D in vitro neuronal assemblies coupled to Micro-Electrode Arrays", 2017 8TH INTERNATIONAL IEEE/EMBS CONFERENCE ON NEURAL ENGINEERING (NER), IEEE, 25 May 2017 (2017-05-25), pages 235 - 238, XP033142899 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023152453A1 (fr) | 2023-08-17 |
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