FR3099179A1 - METHOD FOR DETERMINING THE EFFECT OF A MUTATION ON THE EXPRESSION OF A GENE OF INTEREST - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne une méthode pour déterminer l’effet d’une mutation, en particulier une mutation synonyme sur l’expression d’un gène d’intérêt comprenant l’expression dans une cellule d’un vecteur comprenant un gène d’intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur et un gène d’intérêt comprenant ladite mutation fusionnée à un deuxième gène rapporteur, lesdits gènes étant sous le contrôle d’un promoteur bidirectionnel. Cette méthode est particulièrement adaptée pour déterminer l’effet d’une mutation préalablement détectée dans un échantillon de patient. L’invention concerne également le vecteur utilisé dans la méthode et les cellules exprimant ledit vecteur.The invention relates to a method for determining the effect of a mutation, in particular a synonymous mutation on the expression of a gene of interest comprising the expression in a cell of a vector comprising a wild-type gene of interest. fused to a first reporter gene and a gene of interest comprising said mutation fused to a second reporter gene, said genes being under the control of a bidirectional promoter. This method is particularly suitable for determining the effect of a mutation previously detected in a patient sample. The invention also relates to the vector used in the method and to the cells expressing said vector.
Description
L’invention concerne une méthode pour déterminer l’effet d’une mutation, en particulier une mutation synonyme sur l’expression d’un gène d’intérêt comprenant l’expression dans une cellule d’un vecteur comprenant un gène d’intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur et un gène d’intérêt comprenant ladite mutation fusionnée à un deuxième gène rapporteur, lesdits gènes étant sous le contrôle d’un promoteur bidirectionnel. Cette méthode est particulièrement adaptée pour déterminer l’effet d’une mutation préalablement détectée dans un échantillon de patient. L’invention concerne également le vecteur utilisé dans la méthode et les cellules exprimant ledit vecteur.The invention relates to a method for determining the effect of a mutation, in particular a synonymous mutation on the expression of a gene of interest comprising the expression in a cell of a vector comprising a wild-type gene of interest fused to a first reporter gene and a gene of interest comprising said mutation fused to a second reporter gene, said genes being under the control of a bidirectional promoter. This method is particularly suitable for determining the effect of a mutation previously detected in a patient sample. The invention also relates to the vector used in the method and the cells expressing said vector.
Le code génétique permettant de traduire les informations contenues dans le génome des cellules vivantes et de synthétiser les protéines est redondant. Ainsi, la plupart des acides aminés sont codés par plus d’un codon. Les codons codant pour le même acide aminé sont dits synonymes. Dès lors, une mutation génétique qui transforme un codon en un autre codon synonyme est sans incidence sur la séquence de la protéine synthétisée.The genetic code for translating the information contained in the genome of living cells and for synthesizing proteins is redundant. Thus, most amino acids are encoded by more than one codon. Codons coding for the same amino acid are said to be synonymous. Consequently, a genetic mutation which transforms a codon into another synonymous codon has no effect on the sequence of the synthesized protein.
Les mutations synonymes ont longtemps été considérées comme n’ayant aucune conséquence sur le profil d’expression et la fonction de la protéine. Les mutations synonymes ont été largement négligées en pathologie humaine, dans la mesure où ces modifications n’ont aucun impact attendu sur la séquence protéique. Pourtant, très récemment, de nombreuses mutations synonymes ont été associées à des maladies graves chez l’humain, notamment grâce à des études de criblage génétique.Synonymous mutations have long been considered to have no consequence on the expression profile and function of the protein. Synonymous mutations have been largely overlooked in human pathology, as these changes have no expected impact on protein sequence. However, very recently, many synonymous mutations have been associated with serious diseases in humans, in particular thanks to genetic screening studies.
Les mutations synonymes peuvent entrainer des perturbations moléculaires, cellulaires et physiologiques et jouent un rôle dans l’épissage de l’ARNm (Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Nat Rev Genet. 2002 ; 3 : 285–298), sa stabilité (Nackley AG, Shabalina SA, Tchivileva IE, et al. Science 2006), sa structure (Shen LX, Basilion JP, Stanton VP. Proc Natl Acad Sci USA 1999 ; 96 : 7871–7876) mais également dans la traduction et la structure tertiaire des protéines (Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, et al. Science 2007).Synonymous mutations can lead to molecular, cellular and physiological disturbances and play a role in mRNA splicing (Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Nat Rev Genet. 2002; 3: 285–298), its stability ( Nackley AG, Shabalina SA, Tchivileva IE, et al. Science 2006), its structure (Shen LX, Basilion JP, Stanton VP. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 7871–7876) but also in translation and tertiary structure proteins (Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, et al. Science 2007).
L’étude des mutations, notamment des mutations synonymes et de leurs effets sur l’expression et la fonction de la protéine est nécessaire pour comprendre les causes des maladies associées à ces mutations.The study of mutations, especially synonymous mutations and their effects on protein expression and function is necessary to understand the causes of the diseases associated with these mutations.
Actuellement, les mutations, en particulier les mutations synonymes sont étudiées en exprimant de manière ectopique des versions sauvages et mutées d’un gène d’intérêt dans des cellules distinctes, puis en mesurant la quantité de protéines produites par immunofluorescence ou immunoblot, lorsque les anticorps correspondants existent. Dans ce système, l’utilisation de cellules distinctes conduit à une variabilité de l’expression des gènes sauvages et mutés. Une comparaison précise des profils d’expression des gènes sauvage et muté, notamment du niveau d’expression et de la localisation subcellulaire des protéines codées par ces gènes n’est donc pas possible.Currently, mutations, in particular synonymous mutations, are studied by ectopically expressing wild-type and mutated versions of a gene of interest in separate cells, and then measuring the amount of protein produced by immunofluorescence or immunoblot, when antibodies correspondents exist. In this system, the use of distinct cells leads to variability in the expression of wild-type and mutated genes. A precise comparison of the expression profiles of the wild-type and mutated genes, in particular the level of expression and the subcellular localization of the proteins coded by these genes, is therefore not possible.
Il reste ainsi un besoin de développer une méthode plus sensible permettant de comparer précisément les profils d’expression du gène sauvage et muté permettant notamment de mettre en évidence de faibles différences d’expression.There thus remains a need to develop a more sensitive method making it possible to precisely compare the expression profiles of the wild-type and mutated genes, making it possible in particular to highlight small differences in expression.
Les inventeurs ont développé un système expérimental reposant sur l’expression simultanée d’un gène d’intérêt sauvage et portant une mutation sous le contrôle d’un même promoteur bidirectionnel. Chaque version du gène est fusionnée en phase à un gène rapporteur différent pour déterminer le profil d’expression de chacun des gènes. Ce système est particulièrement adapté pour étudier l’effet des mutations synonymes.The inventors have developed an experimental system based on the simultaneous expression of a wild-type gene of interest and carrying a mutation under the control of the same bidirectional promoter. Each version of the gene is fused in frame to a different reporter gene to determine the expression profile of each gene. This system is particularly suitable for studying the effect of synonymous mutations.
La présente invention concerne ainsi une méthode pour déterminer l’effet d’une mutation, de préférence une mutation synonyme sur l’expression d’un gène d’intérêt dans une cellule, ladite méthode comprenant les étapes suivantes de : i) expression dans une cellule d’un vecteur comprenant un gène d’intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur codant pour une première protéine de fusion et un gène d’intérêt comprenant au moins une mutation, de préférence une mutation synonyme fusionnée à un deuxième gène rapporteur codant pour une deuxième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur bidirectionnel ; ii) détection de l’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion ; iii) comparaison des profils d’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion. La détection de l’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion en ii) peut comprendre la détermination de la localisation subcellulaire de la première et de la deuxième protéine de fusion. La dite étape ii) peut également comprendre la mesure du niveau d’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion et dans ce cas l’étape iii) peut comprendre la comparaison du niveau d’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion, de préférence en mesurant le ratio du niveau d’expression de la deuxième protéine de fusion sur le niveau d’expression de la première protéine de fusion.The present invention thus relates to a method for determining the effect of a mutation, preferably a synonymous mutation, on the expression of a gene of interest in a cell, said method comprising the following steps: i) expression in a cell of a vector comprising a wild-type gene of interest fused to a first reporter gene encoding a first fusion protein and a gene of interest comprising at least one mutation, preferably a synonymous mutation fused to a second reporter gene encoding a second fusion protein, said genes being under the transcriptional control of a bidirectional promoter; ii) detection of the expression of the first and the second fusion protein; iii) comparison of the expression profiles of the first and the second fusion protein. Detection of expression of the first and second fusion protein in ii) may include determining the subcellular localization of the first and second fusion protein. Said step ii) can also comprise the measurement of the level of expression of the first and of the second fusion protein and in this case the step iii) can comprise the comparison of the level of expression of the first and of the second fusion protein, preferably by measuring the ratio of the level of expression of the second fusion protein to the level of expression of the first fusion protein.
Dans un mode particulier, le vecteur utilisé dans la méthode selon l’invention peut comprendre un promoteur bidirectionnel inductible, de préférence inductible par de la tétracycline ou un de ses analogues. Dans un autre mode particulier, le vecteur utilisé dans ladite méthode peut comprendre des gènes rapporteurs codant pour des protéines fluorescentes différentes, de préférence la mCherry et la mEGFP. Dans ce cas-là, la dite méthode comprend une étape ii) de détection de l’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion par microscopie en fluorescence ou par cytométrie en flux.In a particular mode, the vector used in the method according to the invention can comprise an inducible bidirectional promoter, preferably inducible by tetracycline or one of its analogs. In another particular mode, the vector used in said method can comprise reporter genes coding for different fluorescent proteins, preferably mCherry and mEGFP. In this case, said method comprises a step ii) of detecting the expression of the first and of the second fusion protein by fluorescence microscopy or by flow cytometry.
La dite méthode selon l’invention peut comprendre en outre les étapes de normalisation suivantes : iv) expression dans une autre cellule d’un vecteur comprenant un gène d’intérêt sauvage fusionné audit premier gène rapporteur codant pour une troisième protéine de fusion et une deuxième copie du gène d’intérêt sauvage fusionné audit deuxième gène rapporteur codant pour une quatrième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle transcriptionnel dudit promoteur bidirectionnel ; v) mesure du niveau d’expression de la troisième et de la quatrième protéine de fusion ; vi) calcul du ratio du niveau d’expression de la quatrième protéine de fusion sur le niveau d’expression de la troisième protéine de fusion ; vii) normalisation du ratio des niveaux d’expression des protéines de fusion obtenu en iii) par le ratio des niveaux d’expression des protéines de fusion obtenu en vi).Said method according to the invention may further comprise the following normalization steps: iv) expression in another cell of a vector comprising a wild-type gene of interest fused to said first reporter gene coding for a third fusion protein and a second copy of the wild-type gene of interest fused to said second reporter gene encoding a fourth fusion protein, said genes being under the transcriptional control of said bidirectional promoter; v) measuring the level of expression of the third and fourth fusion protein; vi) calculation of the ratio of the level of expression of the fourth fusion protein to the level of expression of the third fusion protein; vii) normalization of the ratio of fusion protein expression levels obtained in iii) by the ratio of fusion protein expression levels obtained in vi).
Dans un mode particulier, la méthode selon l’invention est caractérisée en ce que la mutation du gène d’intérêt est préalablement détectée dans un échantillon d’un sujet, de préférence d’un sujet malade.In a particular mode, the method according to the invention is characterized in that the mutation of the gene of interest is detected beforehand in a sample from a subject, preferably from a sick subject.
La présente invention concerne également un vecteur comprenant deux gènes rapporteurs sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur bidirectionnel, comprenant de préférence des sites de restrictions permettant le clonage en phase de gènes d’intérêt avec des gènes rapporteurs de sorte à coder pour des protéines de fusion. De préférence, ledit vecteur comprend en outre un gène d’intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur et un gène d’intérêt comprenant une mutation fusionné au deuxième gène rapporteur. Dans un autre aspect, l’invention concerne une cellule exprimant le vecteur selon l’invention.The present invention also relates to a vector comprising two reporter genes under the transcriptional control of a bidirectional promoter, preferably comprising restriction sites allowing the in-phase cloning of genes of interest with reporter genes so as to encode proteins of merger. Preferably, said vector further comprises a wild-type gene of interest fused to the first reporter gene and a gene of interest comprising a mutation fused to the second reporter gene. In another aspect, the invention relates to a cell expressing the vector according to the invention.
Fig. 1Fig. 1
Fig. 2Fig. 2
Fig. 3Fig. 3
Fig. 4Fig. 4
Fig. 5Fig. 5
Fig. 6Fig. 6
Les inventeurs ont développé un nouveau vecteur comprenant un gène d’intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur codant pour une première protéine de fusion et un gène d’intérêt muté fusionnée à un deuxième gène rapporteur codant pour une deuxième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle d’un promoteur bidirectionnel. L’expression des protéines de fusion dans une cellule à partir de ce vecteur ainsi que leur détection et la comparaison de leurs profils d’expression permettent de déterminer l’effet d’une mutation sur l’expression d’un gène d’intérêt. Par profil d’expression, on entend notamment les niveaux d’expression et/ou la localisation subcellulaire des protéines de fusion.The inventors have developed a new vector comprising a wild-type gene of interest fused to a first reporter gene encoding a first fusion protein and a mutated gene of interest fused to a second reporter gene encoding a second fusion protein, said genes being under the control of a bidirectional promoter. The expression of fusion proteins in a cell from this vector as well as their detection and the comparison of their expression profiles make it possible to determine the effect of a mutation on the expression of a gene of interest. By expression profile is meant in particular the expression levels and/or the subcellular localization of the fusion proteins.
L’invention concerne ainsi un vecteur comprenant un gène d’intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur et un gène d’intérêt comprenant une mutation fusionnée à un deuxième gène rapporteur, lesdits gènes étant sous le contrôle d’un promoteur bidirectionnel.The invention thus relates to a vector comprising a wild-type gene of interest fused to a first reporter gene and a gene of interest comprising a mutation fused to a second reporter gene, said genes being under the control of a bidirectional promoter.
Par « gène », on entend une molécule d’acide nucléique codant pour un polypeptide. Le terme gène d’intérêt utilisé dans la présente demande se réfère préférentiellement à l’ADN complémentaire également appelé ADNc codant pour le produit d’un gène d’intérêt. Le produit d’un gène peut être un peptide ou une protéine.By "gene" is meant a nucleic acid molecule encoding a polypeptide. The term gene of interest used in the present application preferably refers to the complementary DNA also called cDNA coding for the product of a gene of interest. The product of a gene can be a peptide or a protein.
Les termes « acide nucléique » ou « séquence nucléotidique » peuvent être utilisés de manière interchangeable pour se référer à toute molécule composée de ou comprenant des monomères nucléotidiques. Un acide nucléique peut être un oligonucléotide ou un polynucléotide. Une séquence nucléotidique peut être un ADN ou un ARN. Une séquence nucléotidique peut être modifiée chimiquement ou artificiellement. Les séquences nucléotidiques peuvent comprendre les acides nucléiques, peptidiques, les morpholinos, les acides nucléiques bloqués ainsi que les acides nucléiques à glycols et les acides nucléiques à thréose. Chacune de ces séquences diffère de l’ADN ou ARN naturel par la nature du squelette. Les nucléotides phosphorothioate peuvent être utilisés. D’autres analogues d’acides nucléiques tels que les méthylphosphonates, phosphoramidates, phosphorodithioatesn N3’P5’-phosphoramidates et les oligoribonucléotide phosphorothioates et les analogues 2'-0-allyl et 2'-0-methylribonucléotide methylphosphonates peuvent être utilisés dans le cadre de l’invention.The terms "nucleic acid" or "nucleotide sequence" can be used interchangeably to refer to any molecule composed of or comprising nucleotide monomers. A nucleic acid can be an oligonucleotide or a polynucleotide. A nucleotide sequence can be DNA or RNA. A nucleotide sequence can be modified chemically or artificially. The nucleotide sequences can include nucleic acids, peptides, morpholinos, blocked nucleic acids as well as glycol nucleic acids and threose nucleic acids. Each of these sequences differs from natural DNA or RNA by the nature of the backbone. Phosphorothioate nucleotides can be used. Other nucleic acid analogues such as methylphosphonates, phosphoramidates, phosphorodithioatesn N3'P5'-phosphoramidates and oligoribonucleotide phosphorothioates and 2'-0-allyl and 2'-0-methylribonucleotide methylphosphonate analogues can be used in the context of the invention.
Le gène sauvage correspond à la séquence nucléotidique, de préférence l’ADNc du gène d’intérêt sauvage. Par gène sauvage, on entend le gène fonctionnel possédé originellement par l’espèce ou la forme fonctionnelle la plus répandue qui sert de référence.The wild-type gene corresponds to the nucleotide sequence, preferably the cDNA of the wild-type gene of interest. By wild gene, we mean the functional gene originally possessed by the species or the most widespread functional form which serves as a reference.
La mutation se réfère à une modification de la séquence nucléotidique de la version sauvage d’un gène d’intérêt. La mutation peut conduire à la délétion, l’insertion, la substitution d’un ou plusieurs acides aminés de la séquence peptidique codée par le gène d’intérêt.Mutation refers to a change in the nucleotide sequence of the wild-type version of a gene of interest. The mutation can lead to the deletion, insertion or substitution of one or more amino acids of the peptide sequence coded by the gene of interest.
De préférence, la mutation est une mutation synonyme. La mutation synonyme se réfère à une mutation de la séquence nucléotidique présente dans la région codante d’un gène d’intérêt, par exemple dans un exon dudit gène, et qui ne modifie pas la séquence d’acides aminés traduite.Preferably, the mutation is a synonymous mutation. The synonymous mutation refers to a nucleotide sequence mutation present in the coding region of a gene of interest, for example in an exon of said gene, and which does not modify the translated amino acid sequence.
Dans le cadre de la présente demande, le gène comprenant une mutation est appelé gène muté.In the context of the present application, the gene comprising a mutation is called mutated gene.
On entend ici par "vecteur", une molécule d'ADN qui est indifféremment sous la forme de simple brin ou de double brin.The term “vector” is understood here to mean a DNA molecule which is indifferently in the form of a single strand or a double strand.
Un vecteur recombinant selon l'invention est de préférence un vecteur plasmidique ou un vecteur d'intégration. Dans certains modes de réalisation de l'invention, le vecteur est un plasmide. On entend ici par "plasmide" une molécule d'ADN circulaire double brin qui possède une origine de réplication afin qu'il puisse se répliquer de manière autonome dans la cellule et un gène de sélection pour qu'il ne soit pas perdu par l'organisme au fil des multiplications cellulaires. De nombreux vecteurs sont connus en eux-mêmes ; le choix d’un vecteur approprié dépend de l’utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d’intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l’hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.A recombinant vector according to the invention is preferably a plasmid vector or an integration vector. In certain embodiments of the invention, the vector is a plasmid. By "plasmid" is meant here a double-stranded circular DNA molecule which has an origin of replication so that it can replicate autonomously in the cell and a selection gene so that it is not lost by the organism through cell multiplication. Many vectors are known per se; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence in extrachromosomal form, or integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
De préférence, ledit vecteur est un vecteur d’expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression des gènes d’intérêt tels que définis ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d’expression incluant au moins un gène d’intérêt tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d’épissage).Preferably, said vector is an expression vector comprising all the elements necessary for the expression of the genes of interest as defined above. For example, said vector comprises an expression cassette including at least one gene of interest as defined above, under the control of appropriate transcriptional and optionally translational regulatory sequences (promoter, activator, intron, codon d (ATG), stop codon, polyadenylation signal, splice site).
De préférence, le vecteur est un vecteur épisomal capable de se répliquer de manière autonome.Preferably, the vector is an episomal vector capable of replicating autonomously.
En plus de la région codante, le gène d’intérêt peut comprendre ou être associé avec un ou plusieurs éléments qui facilitent ou augmentent l’expression dudit gène, tel que des séquences activatrices, des éléments de réponses, des insulateurs, des signaux de polyadénylation et/ou tout autre élément fonctionnel.In addition to the coding region, the gene of interest may comprise or be associated with one or more elements which facilitate or increase the expression of said gene, such as activator sequences, response elements, insulators, polyadenylation signals and/or any other functional element.
Les gènes d’intérêt peuvent être insérés dans un vecteur d’expression, sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur bidirectionnel, pour permettre l’expression simultanée des deux gènes d’intérêt, en particulier les gènes d’intérêt sauvage et muté.The genes of interest can be inserted into an expression vector, under the transcriptional control of a bidirectional promoter, to allow the simultaneous expression of the two genes of interest, in particular the wild-type and mutated genes of interest.
Par « promoteur », on entend tout polynucléotide capable de réguler positivement l'expression, dans une cellule, d'une séquence nucléotidique à laquelle il est lié de façon opérationnelle. Un promoteur ou une séquence promotrice est une région de l’ADN située à proximité d’un gène et indispensable à la transcription de l’ADN en ARN. Les séquences promotrices sont en général situées en amont du site de démarrage de la transcription. Les séquences promotrices correspondent à la région sur laquelle se fixe initialement l’ARN polymérase avant de démarrer la synthèse de l’ARN.By “promoter”, is meant any polynucleotide capable of positively regulating the expression, in a cell, of a nucleotide sequence to which it is linked in an operational manner. A promoter or a promoter sequence is a region of DNA located near a gene and essential for the transcription of DNA into RNA. Promoter sequences are generally located upstream of the transcription start site. Promoter sequences correspond to the region to which RNA polymerase initially binds before starting RNA synthesis.
Par « promoteur bidirectionnel », on entend des régions régulatrices pouvant potentiellement induire l’expression de deux gènes contigus situés en orientations opposées. De préférence, le promoteur bidirectionnel comprend deux promoteurs identiques disposés dos à dos. Le fait d'utiliser un promoteur bidirectionnel pour les deux gènes d’intérêt sauvage et muté permet une expression transcriptionnelle identique des deux gènes d’intérêt et donc des deux gènes rapporteurs auxquels ils sont fusionnés.By “bidirectional promoter”, we mean regulatory regions that can potentially induce the expression of two contiguous genes located in opposite orientations. Preferably, the bidirectional promoter comprises two identical promoters arranged back to back. The fact of using a bidirectional promoter for the two wild-type and mutated genes of interest allows identical transcriptional expression of the two genes of interest and therefore of the two reporter genes to which they are fused.
Le promoteur bidirectionnel peut être un promoteur naturellement exprimé chez l’homme ou un promoteur synthétique. Les promoteurs pouvant être utilisés dans la méthode de l’invention incluent mais ne sont pas limités au promoteur du gène de la thymidine kinase (TK) du virus de l'herpès, le promoteur du CMV, le promoteur PGK. De préférence le promoteur est un promoteur du CMV.The bidirectional promoter can be a promoter naturally expressed in humans or a synthetic promoter. Promoters that can be used in the method of the invention include but are not limited to the herpes virus thymidine kinase (TK) gene promoter, CMV promoter, PGK promoter. Preferably the promoter is a CMV promoter.
Dans un mode préféré, le promoteur bidirectionnel tel qu’utilisé dans la méthode de l’invention est un promoteur bidirectionnel inductible. Le promoteur inductible est activé en réponse à la présence d’un composé externe particulier, appelé inducteur tel que les antibiotiques, les hormones ou d’une condition externe telle que l’augmentation de la température. L’utilisation d’un promoteur bidirectionnel inductible permet d’exprimer simultanément les deux gènes d’intérêt.In a preferred mode, the bidirectional promoter as used in the method of the invention is an inducible bidirectional promoter. The inducible promoter is activated in response to the presence of a particular external compound called an inducer such as antibiotics, hormones or an external condition such as an increase in temperature. The use of an inducible bidirectional promoter makes it possible to simultaneously express the two genes of interest.
Dans un mode préféré, le promoteur inductible est un promoteur inductible à la tétracycline ou un de ses dérivés. Ce promoteur inductible comprend un promoteur minimal opérationnellement lié à un ou plusieurs opérateur(s) de la tétracycline. De préférence, le promoteur bidirectionnel a une séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1.In a preferred mode, the inducible promoter is a tetracycline inducible promoter or a derivative thereof. This inducible promoter comprises a minimal promoter operably linked to one or more tetracycline operator(s). Preferably, the bidirectional promoter has a nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.
Il existe deux versions de protéines transactivatrices capables de se lier à la séquence opérateur tet et donc d’activer la transcription du gène en aval, l'une pouvant être activée par la tétracycline ou ses dérivés et l'autre inactivée par ces mêmes molécules (Gossen M. et Bujard H., Proc Natl Acad Sci U S A, 89 (1992) 5547-5551; Gossen M. et coll., Science, 268 (1995) 1766-1769). La protéine activatrice de transcription comprend deux polypeptides, un premier qui se lie aux séquences tet opérateurs et un deuxième qui active la transcription. La liaison aux séquences opérateurs de la tétracycline d’une protéine activatrice de transcription en présence (système tet on) ou en absence (système tet off) de tétracycline ou un de ses analogues permet l’activation du promoteur et la transcription du gène associé.There are two versions of transactivator proteins capable of binding to the tet operator sequence and thus activating downstream gene transcription, one of which can be activated by tetracycline or its derivatives and the other inactivated by these same molecules ( Gossen M. and Bujard H., Proc Natl Acad Sci U S A, 89 (1992) 5547-5551; Gossen M. et al., Science, 268 (1995) 1766-1769). The transcription activator protein comprises two polypeptides, a first which binds to the tet operator sequences and a second which activates transcription. Binding to the tetracycline operator sequences of a transcription activating protein in the presence (tet on system) or absence (tet off system) of tetracycline or one of its analogues allows the activation of the promoter and the transcription of the associated gene.
Par analogues de la tétracycline, on entend par exemple la doxycycline, la chlorotétracycline et l’anhydrotétracycline.Tetracycline analogues include, for example, doxycycline, chlorotetracycline and anhydrotetracycline.
La séquence nucléotidique codant pour la protéine transactivatrice capable de se lier à la séquence opérateur tet peut être située sur le même vecteur comprenant la séquence opérateur tet ou peut être située sur un vecteur distinct.The nucleotide sequence encoding the transactivator protein capable of binding to the tet operator sequence may be located on the same vector comprising the tet operator sequence or may be located on a separate vector.
Parmi les autres systèmes inductibles, on peut citer les fusions de VP16 ou Gal4 avec des séquences protéiques de contrôle comme certains récepteurs aux hormones nucléaires, plus ou moins modifiées pour répondre de façon spécifique à la présence d'analogues d'hormones.Among the other inducible systems, mention may be made of fusions of VP16 or Gal4 with control protein sequences such as certain nuclear hormone receptors, more or less modified to respond in a specific manner to the presence of hormone analogues.
Pour pouvoir détecter distinctement l’expression du gène d’intérêt sauvage et du gène d’intérêt muté, chacun des gènes est fusionné à des gènes rapporteurs différents.To be able to distinctly detect the expression of the wild-type gene of interest and of the mutated gene of interest, each of the genes is fused to different reporter genes.
Par fusion de deux ou plusieurs gènes, on entend l’association de deux ou plusieurs gènes qui codent pour des protéines ou des fragments de protéines différentes, la traduction des deux gènes fusionnés donnant un seul polypeptide fonctionnel. Dans le cadre de l’invention, le gène d’intérêt est fusionné en phase de lecture avec le gène rapporteur pour donner une protéine de fusion qui permet de détecter la protéine d’intérêt.By fusion of two or more genes, we mean the association of two or more genes which code for different proteins or fragments of proteins, the translation of the two fused genes giving a single functional polypeptide. In the context of the invention, the gene of interest is fused in reading phase with the reporter gene to give a fusion protein which makes it possible to detect the protein of interest.
De préférence, le gène d’intérêt est fusionné au gène rapporteur par l’intermédiaire d’un « linker », de préférence une séquence nucléotidique qui code pour une séquence peptidique qui permet de lier les différentes protéines ou fragment de protéines de telle sorte que la protéine adopte une meilleure conformation pour l’activité des protéines. En particulier, la séquence nucléotidique code pour une séquence peptidique de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 acides aminés. Dans un mode préféré, le linker code pour une séquence peptidique consistant en cinq glycines.Preferably, the gene of interest is fused to the reporter gene via a "linker", preferably a nucleotide sequence which codes for a peptide sequence which makes it possible to link the different proteins or protein fragments in such a way that the protein adopts a better conformation for protein activity. In particular, the nucleotide sequence codes for a peptide sequence of 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 or 50 amino acids. In a preferred mode, the linker encodes a peptide sequence consisting of five glycines.
Le terme "gène rapporteur" désigne un gène dont le produit (une protéine) possède une caractéristique lui permettant d'être observé ou quantifié, par exemple par détection d'une bioluminescence (par exemple fluorescence) ou d'une activité enzymatique. Ainsi, un gène rapporteur utile dans la mise en œuvre de la présente invention peut être choisi parmi les gènes rapporteurs codant pour une protéine fluorescente, et les gènes rapporteurs codant pour une enzyme dont l'action provoque l'apparition d'un produit coloré ou d'un phénotype facilement caractérisable ou toute autre protéine ayant toute autre activité quantifiable.The term "reporter gene" designates a gene whose product (a protein) has a characteristic allowing it to be observed or quantified, for example by detection of a bioluminescence (for example fluorescence) or of an enzymatic activity. Thus, a useful reporter gene in the implementation of the present invention can be chosen from reporter genes coding for a fluorescent protein, and reporter genes coding for an enzyme whose action causes the appearance of a colored product or of an easily characterizable phenotype or any other protein having any other quantifiable activity.
Dans certains modes de réalisation, un gène rapporteur selon l'invention est choisi parmi les gènes rapporteurs codant pour une enzyme, comme par exemple le gène de la luciférase de Vibrio (Lux), le gène de la bêta-galactosidase (LacZ) ou d'une hydrolase (β-glucoronidase, phosphatase- alcaline), le gène de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT) et le gène de la bêta-lactamase (TEM-1).In certain embodiments, a reporter gene according to the invention is chosen from reporter genes encoding an enzyme, such as for example the luciferase gene of Vibrio (Lux), the beta-galactosidase gene (LacZ) or d hydrolase (β-glucoronidase, alkaline phosphatase), the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene and the beta-lactamase (TEM-1) gene.
Dans un mode particulier, un gène rapporteur selon l'invention est un gène rapporteur codant pour une protéine fluorescente.In a particular mode, a reporter gene according to the invention is a reporter gene coding for a fluorescent protein.
De préférence, le premier gène rapporteur code pour une première protéine fluorescente, le deuxième gène rapporteur code pour une deuxième protéine fluorescente, et les première et deuxième protéines fluorescentes sont différentes. Chacune de ces protéines fluorescentes doit être adaptée à l'exploration cellulaire. Par "protéines fluorescentes différentes", on entend des protéines qui fluorescent dans des régions différentes du spectre optique, ou plus spécifiquement des protéines qui émettent une fluorescence à des longueurs d'onde suffisamment différentes pour qu'elles puissent être distinguées en utilisant une méthode classique de détection ou de mesure de fluorescence. Ainsi, la première protéine fluorescente peut émettre dans le rouge (longueur d'onde d'émission comprise entre environ 605 nm et 780 nm) et la deuxième protéine fluorescente peut émettre dans le vert (longueur d'onde d'émission comprise entre environ 510 nm et 570 nm). Alternativement, la première protéine fluorescente peut émettre dans le bleu (longueur d'onde comprise entre environ 460 nm et 480 nm) et la deuxième protéine fluorescente peut émettre dans l'orangé (longueurs d'onde d'émission comprise entre environ 585 nm et 605 nm). L'homme du métier sait sélectionner deux protéines fluorescentes différentes pour développer un système rapporteur selon l'invention.Preferably, the first reporter gene codes for a first fluorescent protein, the second reporter gene codes for a second fluorescent protein, and the first and second fluorescent proteins are different. Each of these fluorescent proteins must be suitable for cellular exploration. By "differently fluorescent proteins" is meant proteins which fluoresce in different regions of the optical spectrum, or more specifically proteins which fluoresce at sufficiently different wavelengths that they can be distinguished using a conventional method. for detecting or measuring fluorescence. Thus, the first fluorescent protein can emit in the red (emission wavelength between approximately 605 nm and 780 nm) and the second fluorescent protein can emit in the green (emission wavelength between approximately 510 nm and 570 nm). Alternatively, the first fluorescent protein can emit in blue (wavelength between about 460 nm and 480 nm) and the second fluorescent protein can emit in orange (emission wavelengths between about 585 nm and 605nm). A person skilled in the art knows how to select two different fluorescent proteins to develop a reporter system according to the invention.
Le gène rapporteur qui peut être utilisé dans le contexte de la présente invention est un gène codant pour une protéine fluorescente appartenant à la catégorie des BFPs (comme par exemple les protéines Sirius, EBFP, SBFP2, EBFP2, Azurite, mKalamal, TagBFP et mBlueberry2), des CFPs (comme par exemple SCFP3A, mTurquoise, mseCFP, Cerulean, ECFP, CyPet, TagCFP, mTFPl, Midori-ishi Cyan, et mUKG), des GFPs (comme par exemple TurboGFP, AceGFP, Azami Green, ZsGreen, TagGFP2, EGFP, mEGFP, mWasabi, Emerald, Superfolder GFP, Sapphire, T-Sapphire, et SGFP2), des YFPs (comme par exemple TagYFP, mAmetrine, EYFP, Topaz, SYFP2, Venus, mCitrine, Ypet, PhiYFP, et ZsYellowl), des OFPs (comme par exemple mBanana, mOrange, Kusabira Orange2, mOrange2, OFP, et TurboRFP), des RFPs (comme par exemple tdTomato, DsRed2, DsRed, DsRed-Express, TagRFP, TagRFP-T, mTangerine, DsRed-Express2, DsRed-Max, AsRed2, mApple, mStrawberry, mRuby, mRFPl, tdRFP611 et mCherry), ou des FRFPs (comme par exemple eqFP611, tdKeima, mKeima, mRaspberry, tdRFP639, tdKatushka2, mKate, mKate2, mPlum, mNeptune et AQ143).The reporter gene which can be used in the context of the present invention is a gene coding for a fluorescent protein belonging to the category of BFPs (such as for example the proteins Sirius, EBFP, SBFP2, EBFP2, Azurite, mKalamal, TagBFP and mBlueberry2) , CFPs (such as for example SCFP3A, mTurquoise, mseCFP, Cerulean, ECFP, CyPet, TagCFP, mTFP1, Midori-ishi Cyan, and mUKG), GFPs (such as for example TurboGFP, AceGFP, Azami Green, ZsGreen, TagGFP2, EGFP , mEGFP, mWasabi, Emerald, Superfolder GFP, Sapphire, T-Sapphire, and SGFP2), YFPs (such as TagYFP, mAmetrine, EYFP, Topaz, SYFP2, Venus, mCitrine, Ypet, PhiYFP, and ZsYellowl), OFPs (such as mBanana, mOrange, Kusabira Orange2, mOrange2, OFP, and TurboRFP), RFPs (such as tdTomato, DsRed2, DsRed, DsRed-Express, TagRFP, TagRFP-T, mTangerine, DsRed-Express2, DsRed-Max , AsRed2, mApple, mStrawberry, mRuby, mRFPl, tdRFP611 and mCherry), or FRFPs (such as eqFP611, tdKeima, mKeima, mRaspberry, tdRFP639, tdKatushka2, mKate, mKate2, mPlum, mNeptune and AQ143).
De préférence, le vecteur comprend un premier gène rapporteur codant pour la mEGFP et un deuxième gène rapporteur codant pour la mCherry.Preferably, the vector comprises a first reporter gene encoding mEGFP and a second reporter gene encoding mCherry.
Dans certains modes de réalisation, le vecteur comprend en outre des sites de restriction permettant la modification ou le remplacement du gène sauvage et/ou muté, mais éventuellement également du promoteur, du premier gène rapporteur, du deuxième gène rapporteur. Le terme "site de restriction" désigne une séquence particulière de nucléotides qui est reconnue par une enzyme de restriction comme un site de coupure dans la molécule d'ADN. Ces sites de restriction peuvent, par exemple, être reconnus par des enzymes choisis parmi BamHI, HindIII, Kpnl, Ndel, Apal, Xbal, BglII, et EcoRI. Préférablement, les sites de restriction des éléments modifiables ou remplaçables tels que les gènes d’intérêt sauvage et muté, promoteur, premier gène rapporteur, deuxième gène rapporteur sont tous uniques et différents les uns des autres pour que ces éléments puissent être modifiés ou remplacés spécifiquement et indépendamment les uns des autres. De préférence, le vecteur comprend au moins un site de restriction permettant le clonage d’un gène d’intérêt en phase de lecture avec le gène rapporteur de sorte à coder pour une protéine de fusion.In certain embodiments, the vector also comprises restriction sites allowing modification or replacement of the wild-type and/or mutated gene, but optionally also of the promoter, of the first reporter gene, of the second reporter gene. The term "restriction site" designates a particular sequence of nucleotides which is recognized by a restriction enzyme as a cleavage site in the DNA molecule. These restriction sites can, for example, be recognized by enzymes chosen from BamHI, HindIII, KpnI, NdeI, Apal, XbaI, BglII, and EcoRI. Preferably, the restriction sites of the modifiable or replaceable elements such as the wild and mutated genes of interest, promoter, first reporter gene, second reporter gene are all unique and different from each other so that these elements can be modified or replaced specifically and independently of each other. Preferably, the vector comprises at least one restriction site allowing the cloning of a gene of interest in the reading phase with the reporter gene so as to code for a fusion protein.
Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur peut également comprendre un marqueur de sélection qui permet de sélectionner les cellules exprimant ce vecteur. Par exemple, les marqueurs de sélection peuvent être des gènes conférant une résistance aux antibiotiques. Un gène de résistance aux antibiotiques est un gène qui produit une protéine qui permet de rendre la cellule résistante aux antibiotiques. Préférablement, le gène de résistance à l’antibiotique permet de réaliser une sélection dans les cellules procaryotes et est sélectionné, sans être limité, parmi le groupe constitué du : gène de résistance à l'ampicilline, à l’actinomycine, la kanamycine, la néomycine, la puromycine, la gentamycine. Dans une autre mode particulier, le vecteur de l'invention peut également comprendre un gène de résistance permettant de réaliser une sélection dans les cellules eucaryotes, tel que par exemple le gène de résistance à l’hygromycine, la blastidicine, la généticine, la zéocine, la puromycine.According to a particular embodiment, the vector can also comprise a selection marker which makes it possible to select the cells expressing this vector. For example, the selection markers can be genes conferring resistance to antibiotics. An antibiotic resistance gene is a gene that produces a protein that makes the cell resistant to antibiotics. Preferably, the antibiotic resistance gene allows selection to be made in prokaryotic cells and is selected, without being limited, from the group consisting of: ampicillin, actinomycin, kanamycin, neomycin, puromycin, gentamycin. In another particular embodiment, the vector of the invention may also comprise a resistance gene making it possible to carry out a selection in eukaryotic cells, such as for example the gene for resistance to hygromycin, blastidicin, geneticin, zeocin , puromycin.
Le vecteur selon l’invention est un vecteur comprenant un premier gène rapporteur et un deuxième gène rapporteur sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur bidirectionnel, de préférence inductible. Dans un mode particulier, le vecteur comprend un gène d’intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur et un gène d’intérêt muté, de préférence un gène d’intérêt comprenant une mutation synonyme fusionné à un deuxième gène rapporteur sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur bidirectionnel, de préférence inductible. De préférence, le vecteur comprend des sites de restriction permettant le clonage en phase de lecture des gènes d’intérêt en amont des gènes rapporteurs de sorte à coder pour des protéines de fusion. De préférence, le vecteur selon l’invention a une séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 ou 5, en fonction de s’il comprend ou non le système transactivateur tet.The vector according to the invention is a vector comprising a first reporter gene and a second reporter gene under the transcriptional control of a bidirectional promoter, preferably inducible. In a particular mode, the vector comprises a wild-type gene of interest fused to a first reporter gene and a mutated gene of interest, preferably a gene of interest comprising a synonymous mutation fused to a second reporter gene under the transcriptional control of a bidirectional promoter, preferably inducible. Preferably, the vector comprises restriction sites allowing the cloning in reading phase of the genes of interest upstream of the reporter genes so as to code for fusion proteins. Preferably, the vector according to the invention has a nucleotide sequence SEQ ID NO: 4 or 5, depending on whether or not it comprises the tet transactivator system.
Un vecteur selon l'invention peut être préparé par n'importe quelle méthode appropriée, la méthode d'obtention du vecteur n'étant pas un élément critique ou limitant de l'invention.A vector according to the invention can be prepared by any suitable method, the method for obtaining the vector not being a critical or limiting element of the invention.
Des méthodes de préparation de telles constructions d'acide nucléique sont connues dans l'art et ont, par exemple, été décrites dans plusieurs ouvrages de référence comme Sambrook, Fritsch et Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Μanual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, et Silhavy, Berman, et Enquist, "Experiments with Gene Fusions", 1984, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor; F.M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", 1989, John Wiley & Sons: New York.Methods for preparing such nucleic acid constructs are known in the art and have, for example, been described in several reference books such as Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, and Silhavy, Berman, and Enquist, "Experiments with Gene Fusions", 1984, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor; F.M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", 1989, John Wiley & Sons: New York.
L’invention concerne également une cellule exprimant le dit vecteur de l’invention.The invention also relates to a cell expressing the said vector of the invention.
Par « cellule » on entend, une cellule eucaryote, de préférence animale. L’invention peut être réalisée dans n’importe quelle cellule, en particulier des cellules de mammifères. Les cellules peuvent être des cellules de primates, dont les cellules humaines, les cellules de singes, chimpanzés, macaques ou babouins. Les cellules peuvent également être des cellules de bovins, de caprins, d'ovins, de porcins, d'équidés, de lapin. Les cellules peuvent également être des cellules de rongeurs, notamment de souris, de rat, de hamster, de cobaye. Des exemples de cellules de mammifères comprennent donc les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les cellules hématopoïétiques. De préférence, les cellules sont des lignées cellulaires qui représentent une population homogène de cellules, stables après des mitoses successives. De préférence, les lignées cellulaires sont issues de cellules prélevées chez un patient immortalisées. On citera à titre d'exemples non limitatifs les cellules 3T3, les cellules HeLa, les cellules U2OS, les cellules RPE, les cellules HCT116, les cellules HEK293, les cellules HEK293T, les cellules CHO ou les fibroblastes primaires.By "cell" is meant a eukaryotic cell, preferably animal. The invention can be carried out in any cell, in particular mammalian cells. The cells can be cells from primates, including human cells, cells from monkeys, chimpanzees, macaques or baboons. The cells can also be bovine, caprine, ovine, porcine, equine or rabbit cells. The cells can also be rodent cells, in particular mouse, rat, hamster, guinea pig. Examples of mammalian cells therefore include fibroblasts, endothelial cells, epithelial cells, hematopoietic cells. Preferably, the cells are cell lines which represent a homogeneous population of cells, stable after successive mitoses. Preferably, the cell lines are derived from cells taken from an immortalized patient. Mention will be made, by way of non-limiting examples, of 3T3 cells, HeLa cells, U2OS cells, RPE cells, HCT116 cells, HEK293 cells, HEK293T cells, CHO cells or primary fibroblasts.
Le vecteur est exprimé dans la cellule en introduisant ledit vecteur dans la cellule. Le vecteur peut être introduit dans la cellule par n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier.The vector is expressed in the cell by introducing said vector into the cell. The vector can be introduced into the cell by any method known to those skilled in the art.
Le vecteur peut être introduit dans la cellule par électroporation, conjugaison, transfection, transduction, ou toute autre technique connue de l'homme du métier. Le vecteur peut être associé à une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu’un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l’introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l’électroporation ou la microinjection.The vector can be introduced into the cell by electroporation, conjugation, transfection, transduction, or any other technique known to those skilled in the art. The vector can be associated with a substance allowing it to cross the membrane of the host cells, such as a transporter such as a nanotransporter or a preparation of liposomes, or of cationic polymers, or else introduce it into said host cell using methods physical such as electroporation or microinjection.
Les cellules transformées par le vecteur peuvent également être utilisées pour produire des animaux transgéniques. Dans un autre aspect, l’invention concerne des animaux transgéniques non-humains comprenant une cellule exprimant le vecteur tel que décrit ci-dessus. Les procédés de modification de l’identité génétique des animaux tel que décrits dans la présente demande ne sont pas de nature à provoquer des souffrances sans utilité médicale substantielle pour l’homme ou l’animal.Vector-transformed cells can also be used to produce transgenic animals. In another aspect, the invention relates to non-human transgenic animals comprising a cell expressing the vector as described above. The processes for modifying the genetic identity of animals as described in the present application are not likely to cause suffering without substantial medical benefit for humans or animals.
Par animal transgénique, on entend désigner un animal non humain, de préférence un mammifère choisi dans le groupe des rongeurs et notamment de la souris, du rat, du hamster, du cobaye. Alternativement, l'animal transgénique peut être choisi parmi les animaux d'élevage et notamment les porcins, ovins, caprins, bovins, équidés, notamment le cheval, les lagomorphes, notamment le lapin. L'animal transgénique selon l'invention peut également être choisi parmi les primates, notamment les singes, tels le macaque, le chimpanzé ou le babouin.By transgenic animal is meant a non-human animal, preferably a mammal chosen from the group of rodents and in particular mice, rats, hamsters, guinea pigs. Alternatively, the transgenic animal can be chosen from farm animals and in particular pigs, sheep, goats, cattle, equines, in particular horses, lagomorphs, in particular rabbits. The transgenic animal according to the invention can also be chosen from primates, in particular monkeys, such as the macaque, the chimpanzee or the baboon.
Pour réaliser des animaux transgéniques, après transformation, les cellules sont ensemencées sur une couche nourricière et/ou dans un milieu approprié. Les cellules contenant la construction peuvent être détectées en utilisant un milieu sélectif. Pour réaliser le criblage des cellules exprimant le vecteur, des gènes de sélection, tel que des gènes de résistance aux antibiotiques peuvent être insérés dans le vecteur. Les colonies positives, c'est-à-dire contenant des cellules exprimant le vecteur sont identifiées par une analyse par southern blot et/ou par des techniques de PCR. Les cellules positives peuvent ensuite être utilisées pour réaliser les manipulations sur l'embryon et notamment l'injection des cellules exprimant le vecteur dans les blastocystes. Pour ce qui concerne la souris, les blastocystes sont obtenus à partir de femelles superovulées de 4 à 6 semaines. Les cellules sont trypsinées et les cellules modifiées sont injectées dans le blastocèle d'un blastocyste. Après l'injection, les blastocystes sont introduits dans la corne utérine de femelles pseudo-gestantes. On laisse ensuite les femelles aller jusqu'à leur terme et les portées résultantes sont analysées pour déterminer la présence de cellules possédant le vecteur.To produce transgenic animals, after transformation, the cells are seeded on a feeder layer and/or in an appropriate medium. Cells containing the construct can be detected using a selective medium. To screen for cells expressing the vector, selection genes, such as antibiotic resistance genes, can be inserted into the vector. Positive colonies, ie colonies containing cells expressing the vector, are identified by Southern blot analysis and/or by PCR techniques. The positive cells can then be used to carry out the manipulations on the embryo and in particular the injection of the cells expressing the vector into the blastocysts. As far as the mouse is concerned, the blastocysts are obtained from superovulated females aged 4 to 6 weeks. The cells are trypsinized and the modified cells are injected into the blastocoel of a blastocyst. After injection, the blastocysts are introduced into the uterine horn of pseudo-pregnant females. The females are then allowed to carry to term and the resulting litters are analyzed for the presence of cells possessing the vector.
Le vecteur de l’invention est utilisé pour déterminer l’effet d’une mutation, de préférence une mutation synonyme sur l’expression d’un gène d’intérêt. Ainsi, l’invention concerne également une méthode pour déterminer l’effet d’une mutation, de préférence une mutation synonyme sur l’expression d’un gène d’intérêt dans laquelle le vecteur selon l’invention est exprimé dans une cellule. L’expression des deux protéines de fusion, notamment le niveau d’expression et/ou la localisation subcellulaire des deux protéines de fusion est ensuite détectée puis les profils d’expression sont comparés. L’expression du vecteur dans la cellule peut être réalisée en introduisant dans la cellule ledit vecteur. Le vecteur peut être introduit dans la cellule par n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier.The vector of the invention is used to determine the effect of a mutation, preferably a synonymous mutation on the expression of a gene of interest. Thus, the invention also relates to a method for determining the effect of a mutation, preferably a synonymous mutation on the expression of a gene of interest in which the vector according to the invention is expressed in a cell. The expression of the two fusion proteins, in particular the level of expression and/or the subcellular localization of the two fusion proteins is then detected and then the expression profiles are compared. The expression of the vector in the cell can be achieved by introducing said vector into the cell. The vector can be introduced into the cell by any method known to those skilled in the art.
L'étape de détection de l’expression des protéines de fusion peut correspondre à une étape de détection de la localisation subcellulaire et/ou de mesure du niveau d’expression des protéines de fusion codées par les gènes d’intérêt fusionnés aux gènes rapporteurs de la construction génétique.The step of detecting the expression of the fusion proteins can correspond to a step of detecting the subcellular localization and/or measuring the level of expression of the fusion proteins coded by the genes of interest fused to the reporter genes of the genetic construct.
Dans un mode particulier, l’étape de détection consiste à mesurer le niveau d’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion. La détection de l’expression des protéines de fusion peut se faire par détection ou mesure du signal qui peut correspondre par exemple à l’activité enzymatique ou la fluorescence des protéines de fusion.In a particular mode, the detection step consists in measuring the level of expression of the first and of the second fusion protein. The detection of the expression of the fusion proteins can be done by detection or measurement of the signal which can correspond for example to the enzymatic activity or the fluorescence of the fusion proteins.
Dans certains modes de réalisation, le premier gène rapporteur code pour une première protéine fluorescente et le deuxième gène rapporteur code pour une deuxième protéine fluorescente. L'étape de détection du niveau d’expression des protéines de fusion comprend alors la mesure de l’intensité de fluorescence émise par la première protéine de fusion et la mesure de l’intensité de fluorescence émise par la deuxième protéine de fusion. La quantification ou mesure de l’intensité de fluorescence peut être effectuée par n'importe quelles techniques de fluorescence connues de l’homme du métier, telles que la microscopie en fluorescence, spectroscopie de fluorescence, cytométrie en flux etc. Ainsi, par exemple, les mesures de fluorescence peuvent être réalisées par microscopie en fluorescence par observation entre lame et lamelle des cellules. Après acquisition des images, la détermination de fluorescence peut être réalisée par le traitement d'information en utilisant des logiciels tels que PCI ou ImageJ (Ramadoss et al, P.N.A.S USA, 2016, 110: 10282-10287). De préférence, pour chaque cellule, on supprime le bruit de fond de la mesure de l’intensité de fluorescence.In some embodiments, the first reporter gene encodes a first fluorescent protein and the second reporter gene encodes a second fluorescent protein. The step of detecting the level of expression of the fusion proteins then comprises measuring the intensity of fluorescence emitted by the first fusion protein and measuring the intensity of fluorescence emitted by the second fusion protein. The quantification or measurement of the fluorescence intensity can be carried out by any fluorescence technique known to those skilled in the art, such as fluorescence microscopy, fluorescence spectroscopy, flow cytometry, etc. Thus, for example, the fluorescence measurements can be carried out by fluorescence microscopy by observation between slide and coverslip of the cells. After image acquisition, fluorescence determination can be performed by processing information using software such as PCI or ImageJ (Ramadoss et al, P.N.A.S USA, 2016, 110: 10282-10287). Preferably, for each cell, background noise is removed from the fluorescence intensity measurement.
Dans un autre mode particulier, l’étape de détection consiste à déterminer la localisation subcellulaire des protéines de fusion codées par les gènes rapporteurs fusionnés aux gènes d’intérêt sauvage et muté, afin de mettre en évidence un éventuel défaut de localisation cellulaire dû à la mutation dans le gène d’intérêt. En particulier, les gènes rapporteurs sont des gènes codant pour des protéines fluorescentes différentes. La détection de la fluorescence dans la cellule peut être effectuée par n'importe quelles techniques de fluorescence connues de l’homme du métier, en particulier par microscopie en fluorescence. Les différents organites cellulaires peuvent être détectés par des marqueurs connus de l’homme du métier. A titre d’exemple, le noyau peut être marqué par un marquage de l’ADN en utilisant par exemple le DAPI.In another particular mode, the detection step consists in determining the subcellular localization of the fusion proteins coded by the reporter genes fused to the wild-type and mutated genes of interest, in order to highlight a possible cellular localization defect due to the mutation in the gene of interest. In particular, the reporter genes are genes coding for different fluorescent proteins. The detection of fluorescence in the cell can be carried out by any fluorescence technique known to those skilled in the art, in particular by fluorescence microscopy. The various cell organelles can be detected by markers known to those skilled in the art. For example, the nucleus can be marked by DNA labeling using, for example, DAPI.
Après avoir détecté l’expression des deux protéines de fusion, les profils d’expression sont comparés. Par comparaison des profils d’expression des deux protéines de fusion, on entend notamment la comparaison des niveaux d’expression des protéines de fusion et/ou la comparaison de la localisation subcellulaire des protéines de fusion. La mise en évidence de différences de profils d’expression des protéines de fusion codées par des gènes rapporteurs fusionnés soit au gène muté, soit au gène sauvage, permet ainsi de caractériser l’effet de la mutation.After detecting the expression of the two fusion proteins, the expression profiles are compared. By comparison of the expression profiles of the two fusion proteins, is meant in particular the comparison of the expression levels of the fusion proteins and/or the comparison of the subcellular localization of the fusion proteins. The demonstration of differences in the expression profiles of the fusion proteins coded by the reporter genes fused either to the mutated gene or to the wild-type gene, thus makes it possible to characterize the effect of the mutation.
Dans le mode particulier où le niveau d’expression des protéines de fusion est mesuré, les profils d’expressions peuvent être comparés en mesurant le ratio entre les niveaux d’expression des protéines de fusion. En particulier, le ratio Ra entre le niveau d’expression de la deuxième protéine de fusion codée par le gène d’intérêt muté fusionné au deuxième gène rapporteur et le niveau d’expression de la première protéine de fusion codée par le gène d’intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur est mesuré. Dans le cas particulier où le gène rapporteur code pour une protéine fluorescente, le ratio Ra correspond au ratio entre l’intensité de fluorescence de la deuxième protéine de fusion codée par le gène d’intérêt muté fusionné au deuxième gène rapporteur et l’intensité de fluorescence de la première protéine de fusion codée par le gène d’intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur.In the particular mode where the expression level of the fusion proteins is measured, the expression profiles can be compared by measuring the ratio between the expression levels of the fusion proteins. In particular, the ratio Ra between the level of expression of the second fusion protein encoded by the mutated gene of interest fused to the second reporter gene and the level of expression of the first fusion protein encoded by the gene of interest wild type fused to the first reporter gene is measured. In the particular case where the reporter gene codes for a fluorescent protein, the ratio Ra corresponds to the ratio between the fluorescence intensity of the second fusion protein coded by the mutated gene of interest fused to the second reporter gene and the intensity of fluorescence of the first fusion protein encoded by the wild-type gene of interest fused to the first reporter gene.
Pour la mesure de l’expression des deux gènes rapporteurs fusionnés au gène d’intérêt sauvage et muté, la méthode selon l’invention peut comprendre en outre des étapes de normalisation. En particulier, la normalisation comprend l’expression dans une deuxième cellule dudit vecteur tel que décrit ci-dessus comprenant non pas un gène sauvage et un gène muté mais deux gènes d’intérêt sauvages fusionnés chacun auxdits gènes rapporteurs. Les niveaux d’expression des protéines de fusion sont mesurés puis comparés. La comparaison des niveaux d’expression des protéines de fusion codées par les deux gènes rapporteurs fusionnés aux deux copies du gène d’intérêt sauvage permet ainsi de normaliser les niveaux d’expression des protéines codées par les mêmes gènes rapporteurs fusionnés aux gènes d’intérêt sauvage et muté. En particulier, le ratio RNORMentre le niveau d’expression de la protéine de fusion codée par le gène d’intérêt sauvage fusionné audit deuxième gène rapporteur et le niveau d’expression de la protéine de fusion codée par le gène d’intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur est mesuré. Dans le cas particulier où le gène rapporteur code pour une protéine fluorescente, le niveau d’expression correspond à l’intensité de fluorescence. La normalisation est réalisée en divisant le ratio Ra par le ratio RNORM.For measuring the expression of the two reporter genes fused to the wild-type and mutated gene of interest, the method according to the invention may also comprise normalization steps. In particular, the normalization comprises the expression in a second cell of said vector as described above comprising not a wild-type gene and a mutated gene but two wild-type genes of interest each fused to said reporter genes. The expression levels of the fusion proteins are measured and then compared. The comparison of the expression levels of the fusion proteins coded by the two reporter genes fused to the two copies of the wild-type gene of interest thus makes it possible to normalize the expression levels of the proteins coded by the same reporter genes fused to the genes of interest wild and mutated. In particular, the ratio R NORM between the level of expression of the fusion protein coded by the wild-type gene of interest fused to said second reporter gene and the level of expression of the fusion protein coded by the wild-type gene of interest fused to the first reporter gene is measured. In the particular case where the reporter gene encodes a fluorescent protein, the expression level corresponds to the fluorescence intensity. Normalization is performed by dividing the Ra ratio by the R NORM ratio.
Les anomalies de profil d’expression dues aux mutations sont responsables de nombreuses maladies. Plus d’une cinquantaine de maladies ont été caractérisées comme étant associées à une mutation synonyme. Des exemples de maladies associées aux mutations synonymes sont : le syndrome d’insensibilité aux androgènes, l’ataxie, la maladie de stockage des esters du cholestérol, granulomatose chronique, la polypose recto-colique familiale, le cancer colorectal héréditaire sans polypose, les mélanomes, le syndrome de Treacher-Collins, l’atrophie spino-musculaire liée à l’X de l’enfant, la fibrose cystique, la maladie de Hirschsprung, le syndrome de Marfan, la maladie de McArdle, Phenylcétonurie, le syndrome de Seckel, l’hydrocéphalie liée à l’X et l’holoprosencéphalie.Expression profile abnormalities due to mutations are responsible for many diseases. More than fifty diseases have been characterized as being associated with a synonymous mutation. Examples of diseases associated with synonymous mutations are: androgen insensitivity syndrome, ataxia, cholesterol ester storage disease, chronic granulomatosis, familial colorectal polyposis, hereditary nonpolyposis colorectal cancer, melanomas , Treacher-Collins syndrome, X-linked spinomuscular atrophy of childhood, cystic fibrosis, Hirschsprung's disease, Marfan's syndrome, McArdle's disease, Phenylketonuria, Seckel's syndrome, X-linked hydrocephalus and holoprosencephaly.
Ainsi, la méthode selon l’invention peut être utilisée pour déterminer l’effet d’une mutation, de préférence une mutation synonyme dans un gène d’intérêt chez un sujet. La méthode selon l’invention est ainsi particulièrement adaptée pour identifier chez un sujet malade l’effet d’une mutation, de préférence synonyme associée à une maladie. L’identification de la mutation responsable de la maladie peut ainsi permettre d’adapter le traitement au sujet. Par sujet, on entend un mammifère, de préférence un humain.Thus, the method according to the invention can be used to determine the effect of a mutation, preferably a synonymous mutation in a gene of interest in a subject. The method according to the invention is thus particularly suitable for identifying in a sick subject the effect of a mutation, preferably a synonym associated with a disease. The identification of the mutation responsible for the disease can thus make it possible to adapt the treatment to the subject. By subject is meant a mammal, preferably a human.
Ainsi, l’invention concerne également une méthode telle que décrit ci-dessus dans laquelle la mutation est préalablement détectée dans un échantillon d’un sujet, de préférence d’un sujet malade.Thus, the invention also relates to a method as described above in which the mutation is detected beforehand in a sample from a subject, preferably from a sick subject.
L'échantillon utilisé peut être du sang ou tout autre fluide corporel ou tissu obtenu d'un individu. L'ADN peut être extrait en utilisant toute méthode connue de l'état de la technique, telles que les méthodes décrites dans Sambrook et al. (1989). L'ARN peut également être isolé, par exemple à partir de tissus obtenus lors d'une biopsie, en utilisant des méthodes standard bien connues de l'homme du métier, telles que l'extraction par phénol-chloroforme.The sample used may be blood or any other bodily fluid or tissue obtained from an individual. The DNA can be extracted using any method known in the state of the art, such as the methods described in Sambrook et al. (1989). RNA can also be isolated, for example from tissue obtained during a biopsy, using standard methods well known to those skilled in the art, such as phenol-chloroform extraction.
Après les étapes d'extraction et de purification de l'acide nucléique, l'amplification PCR au moyen des amorces peut être utilisée pour améliorer la détection du signal. Par exemple, l'ARN isolé peut être soumis à une transcription-réverse puis une amplification, telle qu’une réaction RT-PCR en utilisant les oligonucléotides spécifiques du site muté ou qui permettent l'amplification de la région contenant la mutation.After the nucleic acid extraction and purification steps, PCR amplification using primers can be used to improve signal detection. For example, the isolated RNA can be subjected to reverse transcription and then amplification, such as an RT-PCR reaction using oligonucleotides specific for the mutated site or which allow amplification of the region containing the mutation.
Dans un mode de réalisation, la mutation peut être détectée par analyse de la molécule d'acide nucléique du gène d’intérêt. La présence ou l’absence de la mutation peut être détectée par séquençage, amplification et/ou hybridation avec une sonde et des amorces spécifiques.In one embodiment, the mutation can be detected by analysis of the nucleic acid molecule of the gene of interest. The presence or absence of the mutation can be detected by sequencing, amplification and/or hybridization with a specific probe and primers.
Les méthodes pour la détection de la mutation sont décrites par exemple dans Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Fourth Edition, M.R. Green, J. Sambrook, (Cold Spring Harbor Laboratory, 2012) et Laboratory Protocols for Mutation Detection, Ed. by U. Landegren, Oxford University Press, 1996 et PCR, 2ème édition par Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997.Methods for the detection of the mutation are described for example in Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Fourth Edition, M.R. Green, J. Sambrook, (Cold Spring Harbor Laboratory, 2012) and Laboratory Protocols for Mutation Detection, Ed. by U. Landegren, Oxford University Press, 1996 and PCR, 2nd edition by Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997.
Les exemples suivants illustrent l’invention sans en limiter la portée.The following examples illustrate the invention without limiting its scope.
ExemplesExamples
1. Construction du vecteur ibis1. Construction of the ibis vector
Le vecteur ibis (induced bifluorescence system) permet l’expression inductible et simultanée de deux versions sauvage et mutée de gènes d’intérêt fusionnées à deux fluorophores distinguables l’un de l’autre par leur spectre d’émission de fluorescence (mEGFP et mCherry).The ibis (induced bifluorescence system) vector allows the inducible and simultaneous expression of two wild-type and mutated versions of genes of interest fused to two fluorophores distinguishable from each other by their fluorescence emission spectra (mEGFP and mCherry ).
Les séquences codant les fluorophores mEGFP et mCherry sont placées en orientation divergente et sous le contrôle d’un même promoteur bidirectionnel inductible par de la doxycycline. Des sites de restriction uniques sont présents en 5’ des séquences mCherry (Xho) et mEGFP (SwaI) et permettent l’insertion des cDNA d’intérêt en phase avec les séquences mCherry et mEGFP. En outre, une séquence codant 5 résidus glycine est insérée en amont des séquences des fluorophores. Cet élément très flexible de 5 glycines minimise grandement le risque d’une perturbation du repliement et du comportement des protéines d’intérêt par les fluorophores.The sequences encoding the mEGFP and mCherry fluorophores are placed in divergent orientation and under the control of the same bidirectional promoter inducible by doxycycline. Unique restriction sites are present 5′ of the mCherry (Xho) and mEGFP (SwaI) sequences and allow the insertion of the cDNAs of interest in phase with the mCherry and mEGFP sequences. In addition, a sequence encoding 5 glycine residues is inserted upstream of the sequences of the fluorophores. This highly flexible element of 5 glycines greatly minimizes the risk of disruption of the folding and behavior of proteins of interest by fluorophores.
Les éléments permettant l’inductibilité par la doxycycline ont déjà été décrits (Bornkamm GW et al, NAR, 2005, 33(16) : e137) et sont portés soit sur la même construction plasmidique dans la version du vecteur utilisé dans les exemples suivants (Figure 1A, Version 1 ; SEQ ID NO : 4), soit sur un vecteur distinct.The elements allowing inducibility by doxycycline have already been described (Bornkamm GW et al, NAR, 2005, 33(16): e137) and are carried either on the same plasmid construct in the version of the vector used in the following examples ( Figure 1A, Version 1; SEQ ID NO: 4), or on a separate vector.
Dans la version du vecteur utilisé dans les exemples suivants (Version 1), les éléments ibis (entre les sites PacI et NotI, Figure 1) et d’inductibilité à la doxycycline (entre les sites NotI et AscI) sont portés sur le plasmide épisomal initialement décrit par Bornkamm et al. Ce vecteur a été modifié en éliminant la séquence codant la protéine mEGFP. La séquence codant la protéine mEGFP a été insérée d’un côté du promoteur dont elle est séparée par un site de restriction SwaI et une séquence codant 5 glycines. La séquence codant la luciférase a été éliminée. La séquence codant la protéine mCherry a été insérée du côté du promoteur opposé à celui de la séquence mEGFP. La séquence codant la protéine mCherry est séparée du promoteur par un site de restriction XhoI et une séquence codant 5 glycines. Des séquences permettant la sélection des bactéries (ampicilline) et des cellules de vertébrés (hygromycine) sont également présentes.In the version of the vector used in the following examples (Version 1), the ibis (between the PacI and NotI sites, Figure 1) and doxycycline inducibility (between the NotI and AscI sites) elements are carried on the episomal plasmid originally described by Bornkamm et al. This vector was modified by eliminating the sequence encoding the mEGFP protein. The sequence encoding the mEGFP protein was inserted on one side of the promoter from which it is separated by a SwaI restriction site and a sequence encoding 5 glycines. The luciferase coding sequence was removed. The sequence encoding the mCherry protein was inserted on the opposite side of the promoter to that of the mEGFP sequence. The sequence encoding the mCherry protein is separated from the promoter by an XhoI restriction site and a sequence encoding 5 glycines. Sequences allowing the selection of bacteria (ampicillin) and vertebrate cells (hygromycin) are also present.
Dans une deuxième version envisagée (Figure 1B, Version 2, SEQ ID NO : 5), les éléments permettant l’inductibilité par la doxycycline sont situés sur un plasmide distinct. Dans cette deuxième version, le plasmide ibis est obtenu à partir de la version 1 en retirant les éléments d’inductibilité à la doxycycline par digestion enzymatique (PacI/NotI). La simple fermeture par ligation du plasmide linéarisé résultant permet l’obtention du plasmide épisomal portant ibis. Des séquences permettant la sélection des bactéries (ampicilline) et des cellules de vertébrés (hygromycine) sont également présentes.In a second version considered (Figure 1B, Version 2, SEQ ID NO: 5), the elements allowing inducibility by doxycycline are located on a separate plasmid. In this second version, the ibis plasmid is obtained from version 1 by removing the doxycycline inducibility elements by enzymatic digestion (PacI/NotI). The simple closure by ligation of the resulting linearized plasmid makes it possible to obtain the episomal plasmid carrying ibis. Sequences allowing the selection of bacteria (ampicillin) and vertebrate cells (hygromycin) are also present.
Les éléments d’inductibilité à la doxycycline obtenus à l’étape précédente sont insérés dans un plasmide tel que pCDNA3.1. Des séquences permettant la sélection des bactéries (kanamycine) et des cellules de vertébrés (G418, généticine) sont également présentes. Cette construction est appelé doxycycline induction element, ou DIE.The doxycycline inducibility elements obtained in the previous step are inserted into a plasmid such as pCDNA3.1. Sequences allowing the selection of bacteria (kanamycin) and vertebrate cells (G418, geneticin) are also present. This construct is called doxycycline induction element, or DIE.
La séquence sauvageSHHest insérée en phase avec le gène rapporteur mCherry (site XhoI) dans toutes les versions d’ibis. La séquence portant les mutations d’intérêt ou la séquence sauvage est insérée en phase avec le gène rapporteur mEGFP (site SwaI) pour la version ibis à tester ou la version normalisatrice, respectivement. Pour chaque gène d’intérêt, il y a donc une version d’ibis gène d’intérêt wt-wt et autant de versions mut-wt que de mutations à tester. Ces constructions plasmidiques s’obtiennent par techniques classiques de clonage d’ADN.The SHH wild-type sequence is inserted in phase with the mCherry reporter gene (XhoI site) in all versions of ibis. The sequence carrying the mutations of interest or the wild-type sequence is inserted in frame with the mEGFP reporter gene (SwaI site) for the ibis version to be tested or the normalizing version, respectively. For each gene of interest, there is therefore a version of ibis gene of interest wt-wt and as many mut-wt versions as there are mutations to be tested. These plasmid constructs are obtained by standard DNA cloning techniques.
2. Préparation des lignées cellulaires et analyse de l’intensité de fluorescence2. Preparation of cell lines and analysis of fluorescence intensity
Des lignées de cellules humaines sont établies pour chaque version d’ibis. Les cellules humaines HeLa sont transfectées par les vecteurs ibis par lipofection. Les cellules transfectées sont ensuite cultivées et sélectionnées en présence d’hygromycine (100µg/mL). Les cellules sont ensuite cultivées pour être amplifiées dans un milieu de culture en présence de 25 µg/mL d’hygromycine.Human cell lines are established for each version of ibis. Human HeLa cells are transfected with ibis vectors by lipofection. The transfected cells are then cultured and selected in the presence of hygromycin (100µg/mL). The cells are then cultured to be amplified in a culture medium in the presence of 25 μg/mL of hygromycin.
Les cellules sont ensemencées et cultivées sur lamelles de verre et l’expression induite par traitement à la doxycycline (1-5 µg/ml, 20h à 72h) puis lavées, fixées (formaldéhyde 4%), colorées au DAPI (ADN), montées entre lame et lamelles puis scellées. Les cellules fixées sont ensuite observées et photographiées à l’aide d’un microscope à fluorescence.The cells are seeded and cultured on glass coverslips and the expression induced by treatment with doxycycline (1-5 μg/ml, 20h to 72h) then washed, fixed (4% formaldehyde), stained with DAPI (DNA), mounted between blade and slats then sealed. The fixed cells are then observed and photographed using a fluorescence microscope.
Pour chaque cellule, les intensités de fluorescence mEGFP (vert, IEGFP) et mCherry (rouge ; ImCherry) sont mesurées, diminuées du bruit de fond (IEGFP BGD, ImCherry BGD) et exprimées sont forme de ratio :For each cell, the mEGFP (green, I EGFP ) and mCherry (red; I mCherry ) fluorescence intensities are measured, reduced by the background noise (I EGFP BGD , I mCherry BGD ) and expressed as a ratio:
Ra= (IaEGFP- IaEGFP BGD)/ (IamCherry- IamCherry BGD)Ra= (Ia EGFP - Ia EGFP BGD )/ (Ia mCherry - Ia mCherry BGD )
Les différentes mesures obtenues par condition (lignée cellulaire) sont exprimées sous forme de moyenne et valeur de dispersion. Ainsi on obtient pour deux mutations 1 et 2 des moyennes de ratio Rwt-moy, Rmut1-moy et Rmut2-moy. Ces moyennes peuvent être normalisées par rapport à la condition contrôle wt-wt (ie, divisée par Rwt-moy).The different measurements obtained by condition (cell line) are expressed in the form of mean and dispersion value. Thus, for two mutations 1 and 2, average ratios Rwt-avg, Rmut1-avg and Rmut2-avg are obtained. These means can be normalized with respect to the wt-wt control condition (ie, divided by Rwt-avg).
Un test statistique approprié (par exemple des variantes du test de Student, non appariées, bilatérales et non paramétriques) permet ensuite de déterminer la significativité des différences observées.An appropriate statistical test (for example variants of the Student's test, unpaired, two-sided and nonparametric) then makes it possible to determine the significance of the differences observed.
3. Efficacité de la méthode3. Effectiveness of the method
L’efficacité de la méthode selon l’invention permettant de déterminer l’effet de mutations notamment synonymes dépend d’une part d’une forte corrélation de l’expression des gènes rapporteurs codant pour les protéines EGFP et mCherry dans chaque cellule, et d’autre part de la reproductibilité des résultats obtenus entre expériences. Ces deux aspects ont été traités en utilisant la protéine SonicHedgeHog (SHH) humaine.The effectiveness of the method according to the invention making it possible to determine the effect of mutations, in particular synonymous, depends on the one hand on a strong correlation of the expression of the reporter genes coding for the proteins EGFP and mCherry in each cell, and on on the other hand the reproducibility of the results obtained between experiments. These two aspects were addressed using the human SonicHedgeHog (SHH) protein.
3.1.3.1. DD étermination du niveau de corrélation entre SHH-EGFP et SHH-determination of the level of correlation between SHH-EGFP and SHH- mcherrymcherry
Des cellules humaines HeLa ont été transfectées avec un vecteur ibis comprenant deux copies du gèneSHHsauvage fusionnés à l’EGFP et la mCherry. L’intensité de fluorescence de la EGFP et de la mCherry a été analysée en microscopie par fluorescence.Human HeLa cells were transfected with an ibis vector comprising two copies of the wild-type SHH gene fused to EGFP and mCherry. The fluorescence intensity of EGFP and mCherry was analyzed by fluorescence microscopy.
La détermination du niveau de corrélation entre SHH-EGFP et SHH-mCherry est présentée en Figure 2. L’analyse par cellule des signaux de SHH-mCherry et SHH-mEGFP (Figure 2B) révèle une très forte corrélation (R= 0,91 ; R2=0,82 ; pvalue < 2,2.10-16) des niveaux d’expression de ces deux protéines au sein de chaque cellule et satisfait au besoin d’une relation linéaire entre signaux.The determination of the level of correlation between SHH-EGFP and SHH-mCherry is presented in Figure 2. Analysis by cell of the signals of SHH-mCherry and SHH-mEGFP (Figure 2B) reveals a very strong correlation (R= 0.91 R2=0.82, pvalue<2.2.10 −16 ) of the expression levels of these two proteins within each cell and satisfies the need for a linear relationship between signals.
En outre, les deux protéines SHH-mEGFP et SHH-mCherry sont parfaitement co-localisées à l’échelle subcellulaire (voir également Figures 4 et 6).In addition, the two proteins SHH-mEGFP and SHH-mCherry are perfectly co-localized at the subcellular level (see also Figures 4 and 6).
3.2.3.2. LI a reproductibilité entre expériencesa reproducibility between experiments
La reproductibilité entre expériences a été déterminée comme suit. Les ratios d’intensités de fluorescence étant normalisés sur la moyenne des valeurs contrôle, ie SHHwt/wt, une version de SHH contenant une mutation, c.C522T, a été insérée en amont de la séquence mEGFP et utilisée pour établir une lignée de cellules correspondante. Pour chaque expérience, les ratios normalisées sur les ratios wt/wt ont été calculés (Figure 3). Trois expériences indépendantes ont été menées, et les ratios normalisés correspondants calculés et présentés sous forme de graphique. L’absence d’effet de la mutation c.C522T deSHHest conservée entre expériences (pvalues=0,1429, 0,0035, 0,0735). En outre, les valeurs moyennes et dispersion sont très similaires entre expériences.Reproducibility between experiments was determined as follows. The fluorescence intensity ratios being normalized on the mean of the control values, ie SHHwt/wt, a version of SHH containing a mutation, c.C522T, was inserted upstream of the mEGFP sequence and used to establish a cell line corresponding. For each experiment, the normalized ratios on the wt/wt ratios were calculated (Figure 3). Three independent experiments were conducted, and the corresponding normalized ratios calculated and presented graphically. The absence of effect of the SHH c.C522T mutation is maintained between experiments (pvalues=0.1429, 0.0035, 0.0735). Furthermore, the mean and dispersion values are very similar between experiments.
3.3.3.3. MM ise en évidence des défauts de localisation cellulairehighlights defects in cell localization
Enfin, la capacité de la méthode à mettre en évidence des défauts de localisation cellulaire de protéines d’intérêt dépend de la parfaite colocalisation des versions mCherry et mEGFP. Cette propriété cruciale du système est illustrée en Figure 4 dans laquelle des images de cellules exprimant SHHwt-mEGFP et SHHwt-mCherry indiquent la superposition des signaux et, donc, leur parfaite colocalisation. De manière plus détaillée : après induction par la doxycycline de l’expression des protéines de fusion, les cellules sont ensemencées et cultivées sur lamelles de verre et l’expression induite par traitement à la doxycycline (1-5 µg/ml) puis fixées (formaldéhyde 4%), colorées au DAPI (ADN), montées entre lames et lamelles et scellées. Les cellules fixées sont ensuite observées et photographiées à l’aide d’un microscope à fluorescence (microscopie à épifluorescence ou confocale).Finally, the ability of the method to highlight cellular localization defects of proteins of interest depends on the perfect colocalization of the mCherry and mEGFP versions. This crucial property of the system is illustrated in Figure 4 in which images of cells expressing SHHwt-mEGFP and SHHwt-mCherry indicate the superposition of the signals and, therefore, their perfect colocalization. In more detail: after induction by doxycycline of the expression of the fusion proteins, the cells are seeded and cultured on glass slides and the expression induced by treatment with doxycycline (1-5 μg/ml) then fixed ( 4% formaldehyde, stained with DAPI (DNA), mounted between slides and coverslips and sealed. The fixed cells are then observed and photographed using a fluorescence microscope (epifluorescence or confocal microscopy).
4. Procédé et illustration pratique par la mise en évidence de l’effet de mutations de4. Method and practical illustration by highlighting the effect of mutations of SHHSHH sur la quantité de SHH produiteon the amount of SHH produced
Afin de valider la capacité de ce système à mettre en évidence l’effet de mutation sur la quantité de protéine produite, deux mutations deSHH, l’une fréquente dans la population générale et sans effet (c.C522T), l’autre retrouvée chez des patients atteints de déficience de SHH -holoprosencéphalie, c.C552G- ont été utilisées en contrôle négatif et positif, respectivement.In order to validate the capacity of this system to highlight the effect of mutation on the quantity of protein produced, two SHH mutations, one frequent in the general population and without effect (c.C522T), the other found in patients with SHH deficiency -holoprosencephaly, c.C552G- were used as negative and positive control, respectively.
Pour chaque version d’ibis (SHHwt/wt, SHHc.C522T/wt, SHHc.C552G/wt) des cellules humaines en culture sont transfecteés et sélectionnées en présence d’hygromycine (100 µg/ml, 8-12 jours typiquement). Après sélection les cellules sont prêtes à l’emploi.For each version of ibis (SHHwt/wt, SHHc.C522T/wt, SHHc.C552G/wt) human cells in culture are transfected and selected in the presence of hygromycin (100 µg/ml, 8-12 days typically). After selection the cells are ready to use.
Les cellules sont cultivées sur lamelles de verre et l’expression induite par traitement à la doxycycline (1-5 µg/ml, 20h à 72h) puis fixées (formaldéhyde 4%), colorées au DAPI (ADN), montées et observées au microscope à fluorescence, utilisé pour photographier des cellules dans les différentes conditions comme illustré en figure 2. Les ratios d’intensités de fluorescence sont alors calculés pour chaque cellule, puis normalisés sur la moyenne des ratios de cellules SHHwt/wt pour chacune des trois expériences indépendantes réalisées (Figure 5).The cells are cultured on glass slides and the expression induced by treatment with doxycycline (1-5 μg/ml, 20h to 72h) then fixed (4% formaldehyde), stained with DAPI (DNA), mounted and observed under a microscope. fluorescence, used to photograph cells under the different conditions as illustrated in Figure 2. The fluorescence intensity ratios are then calculated for each cell, then normalized on the average of the SHHwt/wt cell ratios for each of the three independent experiments performed (Figure 5).
5. Procédé et illustration pratique par la mise en évidence de l’effet de mutations de SHH sur la localisation de SHH5. Method and practical illustration by highlighting the effect of SHH mutations on the localization of SHH
Afin de valider la capacité de ce système à mettre en évidence l’effet de mutation sur la localisation d’une protéine d’intérêt, la version sauvage de SHH et une version portant la mutation c.C1206T ont été utilisées.In order to validate the ability of this system to highlight the effect of mutation on the localization of a protein of interest, the wild-type version of SHH and a version carrying the c.C1206T mutation were used.
Pour chaque version d’ibis (SHHwt/wt, SHH c.C1206T /wt) des cellules humaines en culture sont transfectées et sélectionnées en présence d’hygromycine (100 µg/ml, 8-12 jours typiquement). Après sélection les cellules sont prêtes à l’emploi.
La mutation c.C1206T deSHH(SHH-mEGFP) entraîne superposition imparfaite avec la version sauvage de SHH (SHH-mCherry) en comparaison de la situation wt/wt présentée en Figure 2. Ce résultat révèle l’effet délétère de la mutation c.1206 de SHH sur la localisation de SHH et qui sous-tend la pathogénicité de cette mutation.For each version of ibis (SHHwt/wt, SHH c.C1206T/wt) human cells in culture are transfected and selected in the presence of hygromycin (100 μg/ml, typically 8-12 days). After selection the cells are ready for use.
The c.C1206T mutation of SHH (SHH-mEGFP) leads to imperfect overlap with the wild-type version of SHH (SHH-mCherry) compared to the wt/wt situation presented in Figure 2. This result reveals the deleterious effect of the c .1206 of SHH on the localization of SHH and which underlies the pathogenicity of this mutation.
Claims (10)
i) expression dans une cellule d’un vecteur comprenant un gène d’intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur codant pour une première protéine de fusion et un gène d’intérêt comprenant au moins une mutation fusionnée à un deuxième gène rapporteur codant pour une deuxième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur bidirectionnel,
ii) détection de l’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion,
iii) comparaison des profils d’expression de la première et de la deuxième protéine de fusion.Method for determining the effect of a mutation on the expression of a gene of interest in a cell, the said method comprising the following steps:
i) expression in a cell of a vector comprising a wild-type gene of interest fused to a first reporter gene encoding a first fusion protein and a gene of interest comprising at least one mutation fused to a second reporter gene encoding a second fusion protein, said genes being under the transcriptional control of a bidirectional promoter,
ii) detection of the expression of the first and of the second fusion protein,
iii) comparison of the expression profiles of the first and the second fusion protein.
iv) expression dans une autre cellule d’un vecteur comprenant un gène d’intérêt sauvage fusionné audit premier gène rapporteur codant pour une troisième protéine de fusion et une deuxième copie du gène d’intérêt sauvage fusionné audit deuxième gène rapporteur codant pour une quatrième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle transcriptionnel dudit promoteur bidirectionnel,
v) mesure du niveau d’expression de la troisième et de la quatrième protéine de fusion,
vi) calcul du ratio du niveau d’expression de la quatrième protéine de fusion sur le niveau d’expression de la troisième protéine de fusion,
vii) normalisation du ratio des niveaux d’expression des protéines de fusion obtenu en iii) par le ratio des niveaux d’expression des protéines de fusion obtenu en vi).A method according to any of claims 4 to 6 further comprising the steps of:
iv) expression in another cell of a vector comprising a wild-type gene of interest fused to said first reporter gene coding for a third fusion protein and a second copy of the wild-type gene of interest fused to said second reporter gene coding for a fourth protein fusion, said genes being under the transcriptional control of said bidirectional promoter,
v) measurement of the level of expression of the third and of the fourth fusion protein,
vi) calculating the ratio of the level of expression of the fourth fusion protein to the level of expression of the third fusion protein,
vii) normalization of the ratio of fusion protein expression levels obtained in iii) by the ratio of fusion protein expression levels obtained in vi).
Priority Applications (1)
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FR1908269A FR3099179A1 (en) | 2019-07-22 | 2019-07-22 | METHOD FOR DETERMINING THE EFFECT OF A MUTATION ON THE EXPRESSION OF A GENE OF INTEREST |
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