FR3084836A1 - PROTEIN EXTRACTS FROM MARINE MACROALGAE, COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND ANTI-AGING COSMETIC USE - Google Patents
PROTEIN EXTRACTS FROM MARINE MACROALGAE, COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND ANTI-AGING COSMETIC USE Download PDFInfo
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Abstract
L'objet de l'invention des extraits aqueux de macroalgues marines appartenant au genre Ulva, à différents niveaux de pureté, solubles dans l'eau et comprenant au moins 5 %, en poids de matière sèche de l'extrait, de protéines de poids moléculaires compris entre 1 et 100 kDa. L'invention concerne également son utilisation comme principe actif cosmétique anti-âge pour prévenir et/ou retarder et/ou limiter les signes du vieillissement de la peau.The object of the invention aqueous extracts of marine macroalgae belonging to the genus Ulva, at different levels of purity, soluble in water and comprising at least 5%, by weight of dry matter of the extract, of weight proteins molecular values between 1 and 100 kDa. The invention also relates to its use as an anti-aging cosmetic active principle for preventing and / or delaying and / or limiting the signs of aging of the skin.
Description
EXTRAITS PROTEIQUES DE MACROALGUES MARINES, COMPOSITIONS EN CONTENANT ET UTILISATION COSMETIQUE ANTI-AGEPROTEIN EXTRACTS FROM MARINE MACROALGAE, COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND ANTI-AGING COSMETIC USE
L'invention a pour objet des extraits protéiques de macroalgues marines et leur utilisation pour un effet cosmétique anti-âge. Elle se rapporte également à des compositions l'incluant ainsi qu'à un procédé de traitement cosmétique de la peau destinée à lutter contre le vieillissement cutané.The subject of the invention is protein extracts from marine macroalgae and their use for an anti-aging cosmetic effect. It also relates to compositions including it as well as to a method of cosmetic treatment of the skin intended to combat skin aging.
Le vieillissement de la peau est un phénomène complexe résultant de deux processus biologiques appelés vieillissements intrinsèque et extrinsèque. Il est à l'origine de différentes conséquences sur la peau avec, en particulier, des changements importants de la matrice extracellulaire (MEC) du derme. Or, la structure et la fonction de la peau dépendent largement de la composition de la MEC du derme en termes de nature, quantité et qualité. Parmi les différents composés impactés par le vieillissement cutané, on connaît notamment le collagène. En effet, la diminution âge-dépendante de la quantité de collagène a été identifiée comme l'un des facteurs majeurs à l'origine de nombreuses propriétés physiques du vieillissement cutané, incluant la formation de rides et la perte d'élasticité de la peau.Skin aging is a complex phenomenon resulting from two biological processes called intrinsic and extrinsic aging. It is the cause of various consequences on the skin with, in particular, significant changes in the extracellular matrix (ECM) of the dermis. However, the structure and function of the skin largely depend on the composition of the ECM of the dermis in terms of nature, quantity and quality. Among the various compounds impacted by skin aging, collagen is known in particular. Indeed, the age-dependent decrease in the amount of collagen has been identified as one of the major factors behind many of the physical properties of skin aging, including the formation of wrinkles and the loss of skin elasticity.
Plusieurs principes actifs cosmétiques revendiqués comme augmentant la production de collagène existent sur le marché, comme en particulier l'acide ascorbique ou le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β). L'activité anti-âge de ces stimulants conventionnels provient principalement de leur capacité à stimuler la croissance des fibroblastes dermiques plutôt qu'à stimuler la biosynthèse du collagène par ces cellules. Or, la stimulation de la croissance peut être inadaptée dans certains cas (par exemple en cas de présence de cellules tumorales) et en outre c'est le nombre de cellules qui est augmentée et non la quantité de collagène produite par chaque cellule.Several active cosmetic ingredients claimed to increase the production of collagen exist on the market, such as in particular ascorbic acid or the transforming growth factor beta (TGF-β). The anti-aging activity of these conventional stimulants comes mainly from their ability to stimulate the growth of dermal fibroblasts rather than stimulating the biosynthesis of collagen by these cells. However, the stimulation of growth may be unsuitable in certain cases (for example in the presence of tumor cells) and in addition it is the number of cells which is increased and not the quantity of collagen produced by each cell.
L'objectif de la présente invention est de proposer un principe actif cosmétique capable d'augmenter la production de collagène par les fibroblastes du derme.The objective of the present invention is to provide a cosmetic active principle capable of increasing the production of collagen by fibroblasts of the dermis.
Pour y répondre l'invention propose d'utiliser au moins un extrait de macroalgue marine.To respond to this, the invention proposes to use at least one extract of marine macroalga.
En particulier, l'invention a pour objet un extrait aqueux de macroalgues marines appartenant au genre Ulva comprenant au moins 5 %, en poids de matière sèche de l'extrait, de protéines de poids moléculaires compris entre 1 et 100 kDa, et son utilisation comme principe actif cosmétique anti-âge.In particular, the subject of the invention is an aqueous extract of marine macroalgae belonging to the genus Ulva comprising at least 5%, by weight of dry matter of the extract, of proteins of molecular weight between 1 and 100 kDa, and its use as an anti-aging cosmetic active ingredient.
Des extraits d'algues ont déjà été décrits dans l'art antérieur mais aucun ne présente les caractéristiques et effets des extraits selon l'invention. Les algues sont déjà très largement utilisées en cosmétique, en particulier pour les propriétés gélifiantes et épaississantes de leurs polysaccharides. Des algues entières et des extraits sont également utilisées en cosmétique mais aucun n'a une efficacité sur la biosynthèse collagène telle que celle des extraits selon l'invention. On peut citer par exemple la demande EP1433463 qui décrit l'utilisation de protéines algales et dérivés pour l'hydratation de la peau et des cheveux, les algues étant choisies parmi les genres Porphyra, Spirulina ou Undaria.Algae extracts have already been described in the prior art, but none have the characteristics and effects of the extracts according to the invention. Algae are already widely used in cosmetics, in particular for the gelling and thickening properties of their polysaccharides. Whole algae and extracts are also used in cosmetics, but none has an efficacy on collagen biosynthesis such as that of the extracts according to the invention. One can cite for example the application EP1433463 which describes the use of algal proteins and derivatives for the hydration of the skin and the hair, the algae being chosen from the genera Porphyra, Spirulina or Undaria.
En effet, de façon avantageuse, les extraits particuliers selon l'invention sont capables d'augmenter la production de collagène synthétisé par les fibroblastes du derme, sans stimuler la prolifération des fibroblastes, ou de façon mineure, et leur utilisation cosmétique est particulièrement efficace pour lutter contre le vieillissement de la peau.In fact, advantageously, the specific extracts according to the invention are capable of increasing the production of collagen synthesized by fibroblasts of the dermis, without stimulating the proliferation of fibroblasts, or in a minor way, and their cosmetic use is particularly effective for fight against aging skin.
L'invention a également pour objet des compositions comprenant de tels extraits et un procédé de traitement cosmétique pour lutter contre le vieillissement cutané qui consiste à appliquer sur la peau ces compositions.A subject of the invention is also compositions comprising such extracts and a cosmetic treatment method for combating skin aging which consists in applying these compositions to the skin.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description en détail de l'invention qui va suivre en regard des Figures annexées sur lesquelles :Other characteristics and advantages will emerge from the detailed description of the invention which will follow with reference to the appended figures in which:
La Figure 1 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple IA, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération de FDHN in vitro après 48 h d'incubation, par rapport au témoin négatif,FIG. 1 represents the results of a test carried out with example IA, on the effect of an extract according to the invention on the proliferation of FDHN in vitro after 48 h of incubation, compared to the negative control,
La Figure 2A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple IA, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif,FIG. 2A represents the results of a test carried out with Example IA, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention by well compared to the negative control,
La Figure 2B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple IA, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif,FIG. 2B represents the results of a test carried out with Example IA, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention per cell compared to the negative control,
La Figure 3 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple IB, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération de FDHN in vitro après 48 h d'incubation, par rapport au témoin négatif,FIG. 3 represents the results of a test carried out with example IB, on the effect of an extract according to the invention on the proliferation of FDHN in vitro after 48 h of incubation, relative to the negative control,
La Figure 4A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple IB, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence des extraits protéiques par puit par rapport au témoin négatif,FIG. 4A represents the results of a test carried out with example IB, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by the FDHN incubated for 48 h in the presence of the protein extracts per well compared to the negative witness,
La Figure 4B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple IB, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence des extraits polysaccharidiques par cellule par rapport au témoin négatif (Neg),FIG. 4B represents the results of a test carried out with example IB, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by the FDHN incubated for 48 h in the presence of the polysaccharide extracts per cell relative to the negative control (Neg),
La Figure 5 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 5 represents the results of a test carried out with Example 2A, on the effect of an extract according to the invention on the in vitro proliferation of FDHN incubated for 48 h with respect to the negative control (Neg.),
La Figure 6A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 6A represents the results of a test carried out with example 2A, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention by well compared to the negative control (Neg.),
La Figure 6B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.).FIG. 6B represents the results of a test carried out with Example 2A, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention per cell compared to the negative control (Neg.).
La Figure 7 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 7 represents the results of a test carried out with Example 2B, on the effect of an extract according to the invention on the in vitro proliferation of FDHN incubated for 48 h with respect to the negative control (Neg.),
La Figure 8A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 8A represents the results of a test carried out with Example 2B, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention by well compared to the negative control (Neg.),
La Figure 8B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.).FIG. 8B represents the results of a test carried out with example 2B, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention per cell compared to the negative control (Neg.).
La Figure 9 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 9 represents the results of a test carried out with Example 3A, on the effect of an extract according to the invention on the in vitro proliferation of FDHN incubated for 48 h with respect to the negative control (Neg.),
La Figure 10A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 10A represents the results of a test carried out with Example 3A, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention by well compared to the negative control (Neg.),
La Figure 10B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.).FIG. 10B represents the results of a test carried out with Example 3A, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention per cell compared to the negative control (Neg.).
La Figure 11 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 11 represents the results of a test carried out with Example 3B, on the effect of an extract according to the invention on the in vitro proliferation of FDHN incubated for 48 h compared to the negative control (Neg.),
La Figure 12A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 12A represents the results of a test carried out with Example 3B, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention by well compared to the negative control (Neg.),
La Figure 12B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.).FIG. 12B represents the results of a test carried out with Example 3B, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention per cell compared to the negative control (Neg.).
La Figure 13 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 13 represents the results of a test carried out with Example 4A, on the effect of an extract according to the invention on the in vitro proliferation of FDHN incubated for 48 h compared to the negative control (Neg.),
La Figure 14A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 14A represents the results of a test carried out with example 4A, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention by well compared to the negative control (Neg.),
La Figure 14B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.).FIG. 14B represents the results of a test carried out with example 4A, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention per cell compared to the negative control (Neg.).
La Figure 15 représente le profil d'élution de la fraction protéique d'Ulva sp dans l'exemple 4B,FIG. 15 represents the elution profile of the protein fraction of Ulva sp in example 4B,
La Figure 16 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 16 represents the results of a test carried out with example 4B, on the effect of an extract according to the invention on the in vitro proliferation of FDHN incubated for 48 h compared to the negative control (Neg.),
La Figure 17A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.),FIG. 17A represents the results of a test carried out with Example 4B, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention by well compared to the negative control (Neg.),
La Figure 17B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.).FIG. 17B represents the results of a test carried out with example 4B, on the effect of an extract according to the invention on the production of collagen by FDHN incubated for 48 h in the presence of an extract according to invention per cell compared to the negative control (Neg.).
La Figure 18 représente les profils chromatographiques obtenus sur une colonne TSK Gel 4000SW de la fraction protéique d'Ulva Intestinalis et de la fraction protéique d'Ulva RigidaFIG. 18 represents the chromatographic profiles obtained on a TSK Gel 4000SW column of the protein fraction of Ulva Intestinalis and of the protein fraction of Ulva Rigida
La Figure 19 représent les spectres UPLC-MS obtenus après digestion de la fraction protéique d'Ulva Intestinalis (A) et de la fraction protéiques d'Ulva Rigida (B).Figure 19 shows the UPLC-MS spectra obtained after digestion of the protein fraction of Ulva Intestinalis (A) and the protein fraction of Ulva Rigida (B).
La Figure 20 représente les profils d'élution de la fraction protéique provenant d'Ulva Intestinalis de l'exemple 4B.Figure 20 shows the elution profiles of the protein fraction from Ulva Intestinalis from Example 4B.
DéfinitionsDefinitions
Par « extrait » d'algue au sens de l'invention on entend au moins une molécule ou un ensemble de plusieurs molécules obtenues à partir d'une matière première algale. Il peut s'agir de molécules natives ou de molécules qui ont été transformées partout procédé. Il peut s'agir notamment de protéines.By "extract" of algae within the meaning of the invention means at least one molecule or a set of several molecules obtained from an algal raw material. These can be native molecules or molecules that have been transformed everywhere. It can especially be proteins.
Par « extrait aqueux» au sens de l'invention on entend un extrait obtenu à partir d'une solution aqueuse, préférentiellement par macération utilisant l'eau comme solvant. Il peut s'agir aussi bien d'un extrait aqueux non purifié, d'un rétentat ou d'une fraction de l'extrait aqueux ou du rétentat purifiée concentrée en protéines.By "aqueous extract" within the meaning of the invention means an extract obtained from an aqueous solution, preferably by maceration using water as a solvent. It can also be an unpurified aqueous extract, a retentate or a fraction of the aqueous extract or purified retentate concentrated in proteins.
Par « protéines » au sens de l'invention on entend toute molécule de nature protéique quel que soit son poids moléculaire, c'est-à-dire que le terme inclut les peptides.By “proteins” within the meaning of the invention is meant any molecule of protein nature whatever its molecular weight, that is to say that the term includes peptides.
Description détailléedetailed description
L'invention a pour objet un extrait aqueux de macroalgues marines appartenant au genre Ulva, préférentiellement soluble dans l'eau, comprenant au moins 5 %, en poids de matière sèche de l'extrait, de protéines de poids moléculaires compris entre 1 et 100 kDa.The subject of the invention is an aqueous extract of marine macroalgae belonging to the genus Ulva, preferably soluble in water, comprising at least 5%, by weight of dry matter of the extract, of proteins with molecular weights between 1 and 100 kDa.
Préférentiellement les protéines présentes dans l'extrait de poids moléculaires compris entre 1 et 100 kDa ont des poids moléculaires compris entre 2 et 60 kDa, encore plus préférentiellement compris entre 2 et 30 kDa.Preferably, the proteins present in the extract of molecular weights between 1 and 100 kDa have molecular weights between 2 and 60 kDa, even more preferably between 2 and 30 kDa.
Ces tailles de protéines entre 1 et 100 kDa, notamment entre 2 et 60 kDa et en particulier entre 2 et 30kDa.These protein sizes between 1 and 100 kDa, in particular between 2 and 60 kDa and in particular between 2 and 30 kDa.
Les protéines présentes dans les macroalgues du genre Ulva sont spécifiques et la sélection des protéines de cette origine avec des poids molécules spécifiques sont essentielles dans l'efficacité cosmétique et l'activité biologique des extraits selon l'invention.The proteins present in the macroalgae of the genus Ulva are specific and the selection of proteins of this origin with specific molecular weights are essential in the cosmetic efficiency and the biological activity of the extracts according to the invention.
L'extrait selon l'invention peut également comprendre des polysaccharides et/ou des polyphénols. Il peut éventuellement également comprendre d'autres protéines.The extract according to the invention can also comprise polysaccharides and / or polyphenols. It may possibly also include other proteins.
Préférentiellement l'extrait est obtenu à partir d'Ulva rigida et/ou Ulva intestinalis aussi connue sous le nom de laitue de mer et Aonori.Preferably, the extract is obtained from Ulva rigida and / or Ulva intestinalis also known as sea lettuce and Aonori.
L'extrait selon l'invention peut se présenter sous forme liquide ou sous forme solide.The extract according to the invention can be in liquid form or in solid form.
Les extraits selon l'invention peuvent avoir différents niveaux de purification en protéines :The extracts according to the invention can have different levels of protein purification:
- des extraits aqueux non purifiés,- unpurified aqueous extracts,
- des rétentats concentrés débarrassés des éléments de petite taille, préférentiellement de taille inférieure à 15 kDa, en particulier des sels minéraux ou des pigments,- concentrated retentates free of small elements, preferably less than 15 kDa, in particular mineral salts or pigments,
- des extraits aqueux purifiés, de préférence concentrés à plus de 40% en protéines.- purified aqueous extracts, preferably concentrated to more than 40% protein.
Les différents extraits selon l'invention peuvent être obtenus par tout procédé adapté, notamment par une méthode décrite dans le brevet FR2998894. La méthode d'extraction comprend les étapes suivantes :The different extracts according to the invention can be obtained by any suitable process, in particular by a method described in patent FR2998894. The extraction method includes the following steps:
- Extraction aqueuse par macération, de préférence à chaud, préférentiellement à une température supérieure à 60°C, d'un broyât de macroalgues vertes, de préférence dessalées.- Aqueous extraction by maceration, preferably hot, preferably at a temperature above 60 ° C, of a crushed green macroalgae, preferably desalted.
- Ultrafiltration de l'extrait aqueux sur une membrane permettant la récupération d'une part d'un rétentat concentré contenant les molécules de plus grande taille, et d'autre part d'un perméat contenant les éléments de plus petite taille, préférentiellement inférieure à 15 kDa.- Ultrafiltration of the aqueous extract on a membrane allowing the recovery on the one hand of a concentrated retentate containing the larger molecules, and on the other hand of a permeate containing the elements of smaller size, preferably less than 15 kDa.
- Déminéralisation du rétentat par échange d'ions, préférentiellement par échange d'anions puis échange de cations, en particulier au moyen d'une résine anionique forte et une résine cationique forte.- Demineralization of the retentate by ion exchange, preferably by anion exchange then cation exchange, in particular by means of a strong anionic resin and a strong cationic resin.
- Floculation du rétentat déminéralisé, préférentiellement à chaud, en particulier à une température supérieure à 60°C, permettant d'obtenir une fraction riche en protéines après centrifugation et neutralisation.- Flocculation of the demineralized retentate, preferably hot, in particular at a temperature above 60 ° C., making it possible to obtain a fraction rich in proteins after centrifugation and neutralization.
Avantageusement, ce procédé est facile à mettre en œuvre, économique et compatible avec une industrialisation. Sa mise en œuvre ne fait intervenir ni solvant, ni acide libre.Advantageously, this process is easy to implement, economical and compatible with industrialization. Its implementation does not involve any solvent or free acid.
De plus, les extraits selon l'invention sont des produits d'origine naturelle et les matières premières à l'origine des extraits sont des algues autorisées à la consommation humaine qui ont déjà démontré leur innocuité pour la consommation alimentaire.In addition, the extracts according to the invention are products of natural origin and the raw materials at the origin of the extracts are algae authorized for human consumption which have already demonstrated their harmlessness for food consumption.
Les extraits protéiques d'algues selon l'invention sont préférentiellement incorporés dans des compositions cosmétiques pour leur utilisation.The protein extracts of algae according to the invention are preferably incorporated in cosmetic compositions for their use.
L'invention a donc également pour objet une composition cosmétique comprenant au moins 0,01% d'un extrait selon l'invention en poids de matière sèche de la composition.The invention therefore also relates to a cosmetic composition comprising at least 0.01% of an extract according to the invention by weight of dry matter of the composition.
L'incorporation des extraits selon l'invention dans des compositions cosmétiques peut être réalisée très facilement du fait de leur caractère soluble dans l'eau. Comme ils forment des solutions non visqueuses dans l'eau ou les solutions salines diluées, il n'ajoutent pas consistance à la formulation cosmétique ce qui constitue un avantage important.The incorporation of the extracts according to the invention into cosmetic compositions can be carried out very easily because of their water-soluble nature. As they form non-viscous solutions in water or dilute saline solutions, they do not add consistency to the cosmetic formulation, which constitutes an important advantage.
La composition cosmétique selon l'invention comprend également des excipients adaptés à une application topique sur la peau, cosmétiquement acceptables, et éventuellement d'autres principes actifs cosmétiques.The cosmetic composition according to the invention also comprises excipients suitable for topical application to the skin, cosmetically acceptable, and possibly other cosmetic active ingredients.
La composition selon l'invention peut se présenter sous toute forme adaptée à une application topique sur la peau, en particulier elle se présente sous forme de crème, sérum, onguent, gel, lotion, émulsion, solution, solution à pulvériser, huile, bâton, crayon ou gloss à lèvres ou à contour des lèvres, poudre, mousse ou savon.The composition according to the invention can be in any form suitable for topical application to the skin, in particular it is in the form of a cream, serum, ointment, gel, lotion, emulsion, solution, spray, oil, stick , lip pencil or lip gloss or lip liner, powder, foam or soap.
Les extraits selon l'invention et les compositions l'incluant peuvent être utilisés pour un effet anti-âge et lutter contre le vieillissement de la peau. En effet, les extraits protéiques d'algues selon l'invention, lorsqu'ils sont appliqués sur la peau, sont capables de stimuler et d'augmenter la synthèse de collagène par les fibroblastes.The extracts according to the invention and the compositions including it can be used for an anti-aging effect and to fight against aging of the skin. In fact, the algae protein extracts according to the invention, when applied to the skin, are capable of stimulating and increasing the synthesis of collagen by fibroblasts.
Les fibres de collagène au sein du derme ont pour fonction de lui donner son épaisseur et sa résistance aux forces de traction (van der Rest et Garrone 1991; Myllyharju et Kivirikko 2001; Ricard-Blum et Ruggiero 2005; Prost-sguarcioni et al. 2008).The function of the collagen fibers within the dermis is to give it its thickness and its resistance to tensile forces (van der Rest and Garrone 1991; Myllyharju and Kivirikko 2001; Ricard-Blum and Ruggiero 2005; Prost-sguarcioni et al. 2008 ).
Au cours du vieillissement cutané, la synthèse de collagène dans le derme diminue ce qui a des conséquences multiples sur la peau : perte d'élasticité et de fermeté menant à l'apparition de rides, de tâches, etc. Les extraits protéiques obtenus à partir d'Ulva selon l'invention sont capables de stimuler la synthèse de collagène au sein du derme et ainsi lutter contre ces manifestations disgracieuses du vieillissement de la peau, en particulier contre l'apparition des rides.During skin aging, the synthesis of collagen in the dermis decreases, which has multiple consequences on the skin: loss of elasticity and firmness leading to the appearance of wrinkles, spots, etc. The protein extracts obtained from Ulva according to the invention are capable of stimulating the synthesis of collagen within the dermis and thus fighting against these unsightly manifestations of aging of the skin, in particular against the appearance of wrinkles.
L'invention a par conséquent également pour objet l'utilisation cosmétique non thérapeutique d'un extrait selon l'invention, comme principe actif cosmétique anti-âge pour prévenir et/ou retarder et/ou limiter les signes du vieillissement de la peau, en particulier comme principe actif cosmétique anti-âge augmentant la production de collagène par les fibroblastes dermiques.The invention therefore also relates to the non-therapeutic cosmetic use of an extract according to the invention, as an anti-aging cosmetic active principle for preventing and / or delaying and / or limiting the signs of aging of the skin, particularly as an anti-aging cosmetic active ingredient increasing the production of collagen by dermal fibroblasts.
L'invention vise aussi spécifiquement l'utilisation des extraits protéiques d'algues comme principes actifs anti-rides.The invention also specifically relates to the use of protein extracts of algae as anti-wrinkle active principles.
Préférentiellement, l'extrait est utilisé dans une composition cosmétique. L'invention a aussi pour objet un procédé de traitement cosmétique de la peau pour lutter contre le vieillissement cutané caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer au moins une fois par jour sur la peau du visage une composition comprenant au moins un extrait protéique d'algue selon l'invention.Preferably, the extract is used in a cosmetic composition. The subject of the invention is also a method of cosmetic treatment of the skin to combat skin aging, characterized in that it consists in applying at least once a day to the skin of the face a composition comprising at least one protein extract d algae according to the invention.
Avantageusement, les extraits selon l'invention augmentent la production de collagène par cellule individuelle tout en présentant un effet très limité sur la croissance des fibroblastes, différant ainsi des stimulants conventionnels agissant principalement sur la prolifération des cellules.Advantageously, the extracts according to the invention increase the production of collagen per individual cell while having a very limited effect on the growth of fibroblasts, thus differing from the conventional stimulants acting mainly on the proliferation of cells.
L'invention est à présent illustrée par des exemples d'extraits selon l'invention et par des résultats d'essais démontrant leur efficacité sur la production de collagène par des fibroblastes humains (FDHN).The invention is now illustrated by examples of extracts according to the invention and by test results demonstrating their effectiveness on the production of collagen by human fibroblasts (FDHN).
ExemplesExamples
Exemple IA : Extraction aqueuse à partir d'Ulva intestinalisExample IA: Aqueous extraction from Ulva intestinalis
Procédé d'obtention de l'extrait aqueux :Process for obtaining the aqueous extract:
Le procédé comprend la succession des étapes suivantes :The process includes the following steps:
1. Lavage des algues à traiter1. Washing of the algae to be treated
2. Broyage des algues lavées2. Grinding of washed algae
3. Macération dans l'eau des algues lavées dans un volume d'eau réduit3. Maceration in water of algae washed in a reduced volume of water
4. Filtration des pulpes de façon à obtenir un jus de pressage d'une part et des pulpes de pressage d'autre part.4. Filtration of the pulps so as to obtain a pressing juice on the one hand and pressing pulps on the other hand.
kg d'algues sèches est trempé dans 20 L d'eau brute pendant 10 min à température ambiante. Les algues sont ensuite essorées et pressées à l'aide d'un cône en tissu afin de retirer le plus d'eau possible. Les algues lavées sont ensuite broyées dans 5 L d'eau déminéralisée à 80°C, à l'aide d'un broyeur à couteau, jusqu'à l'obtention de particules de moins de 2 mm de diamètre. Les 5 L de broyât sont ensuite transférés dans une cuve thermostatée à 80°C contenant 10 L d'eau déminéralisée préalablement placée à température. L'extraction est réalisée sous agitation constante à l'aide d'un agitateur à pales à une vitesse de rotation de 10 tours/min pendant 2 h. Le mélange obtenu à l'issue de la macération est soutiré de la cuve, filtré et pressé à l'aide d'un cône en tissu afin d'extraire le plus de jus possible.kg of dry algae is soaked in 20 L of raw water for 10 min at room temperature. The algae are then wrung out and pressed using a fabric cone to remove as much water as possible. The washed algae are then ground in 5 L of demineralized water at 80 ° C., using a knife mill, until particles less than 2 mm in diameter are obtained. The 5 L of ground material is then transferred to a tank thermostatically controlled at 80 ° C containing 10 L of demineralized water previously placed at temperature. The extraction is carried out with constant stirring using a paddle agitator at a rotational speed of 10 revolutions / min for 2 h. The mixture obtained at the end of the maceration is withdrawn from the tank, filtered and pressed using a fabric cone in order to extract as much juice as possible.
Détermination de la composition biochimique des extraits :Determination of the biochemical composition of the extracts:
La teneur en sucres a été déterminée par la méthode de Dubois (Dubois et al. 1956), la teneur protéique par la méthode de Kjeldahl (Kjeldahl et al. 1883), la teneur en sulfates liés aux polysaccharides par le dosage à I'Azure A (Jaques et al. 1968; Gao et al. 2003), la teneur en polyphénols par une méthode adaptée de la méthode initiale de Singleton et Rossi (1965) et la teneur en lipides par la méthode de Chabrol et Charonnat (1937). Toutes les analyses ont été réalisées au minimum en triplicata.The sugar content was determined by the Dubois method (Dubois et al. 1956), the protein content by the Kjeldahl method (Kjeldahl et al. 1883), the content of sulfates linked to polysaccharides by the Azure assay. A (Jaques et al. 1968; Gao et al. 2003), the polyphenol content by a method adapted from the initial method of Singleton and Rossi (1965) and the lipid content by the method of Chabrol and Charonnat (1937). All analyzes were carried out at least in triplicate.
Tableau 1 : Composition biochimique de l'extrait aqueux d'Ulva intestinalisTable 1: Biochemical composition of the aqueous extract of Ulva intestinalis
Effet de l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis sur la prolifération des FDHN :Effect of the aqueous extract of Ulva intestinalis on the proliferation of FDHN:
L'objectif est d'analyser les effets de l'extrait sur la prolifération de fibroblastes dermiques humains normaux (FDHN). Deux lignées de FDHN fournies par Manassas (USA), ont été testées : des fibroblastes provenant d'une peau de femme de 20 ans, de code CCD-1059Sk (ATCC’ CRL-2072™) et provenant d'une peau de femme de 46 ans, de code CCD-1090Sk (ATCC® CRL-2106™). Les cellules sont cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, PAN Biotech, Dutscher) supplémenté par 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (PAN Biotech, Dutscher) et 1% (v/v) de solution antibiotique (pénicilline 10,000 U/mL et streptomycine 10 mg/mL) (PAN Biotech, Dutscher). Les cellules sont cultivées dans un incubateur humide à température contrôlée à 37°C, avec 5% de CO2, dans des flasques ventilées de 75 cm2 (BD Falcon). Elles sont entretenues partrypsination (trypsine 0,05%, PAN Biotech) et le milieu de culture est changé tous les 2 ou 3 jours. Les cellules sont utilisées entre les 3ème et 6ème passages.The objective is to analyze the effects of the extract on the proliferation of normal human dermal fibroblasts (FDHN). Two lines of FDHN supplied by Manassas (USA) were tested: fibroblasts from a skin of 20 year old woman, code CCD-1059Sk (ATCC 'CRL-2072 ™) and from a skin of a woman from 46 years old, code CCD-1090Sk (ATCC® CRL-2106 ™). The cells are cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, PAN Biotech, Dutscher) supplemented with 10% (v / v) fetal calf serum (PAN Biotech, Dutscher) and 1% (v / v) of antibiotic solution (penicillin 10,000 U / mL and streptomycin 10 mg / mL) (PAN Biotech, Dutscher). The cells are cultured in a humid incubator at controlled temperature at 37 ° C., with 5% CO 2, in ventilated flasks of 75 cm 2 (BD Falcon). They are maintained by trypsination (0.05% trypsin, PAN Biotech) and the culture medium is changed every 2 or 3 days. The cells are used between the 3 rd and 6 th passages.
Test de numération des cellules :Cell count test:
Le test MTT a été réalisé en suivant la méthode décrite par Mosmann (1983). Les cellules sont ensemencées dans des plaques 96 puits (BD Falcon) à 5xl04 cellules/mL dans 100 pL de milieu complet et incubées durant 24 h. Le milieu est ensuite retiré et 100 pL de milieu DMEM contenant 1% (v/v) de solution antibiotique associé aux extraits à différentes concentrations, au TGF-β (témoin positif) ou sans extrait (témoin négatif) sont ajoutés dans chaque puit. Après 48 h, 25 pL de MTT (5% dans le PBS) sont ajoutés dans chaque puit et les plaques sont incubées pendant 4 h à 37°C. Le milieu est ensuite retiré et 200 pL de diméthylsulfoxyde sont ajoutés dans chaque puit avant une incubation de 10 min. L'absorbance à 550 nm est finalement mesurée à l'aide d'un lecteur microplaques Fluostar Omega (BMG Labtech). Le test de numération des cellules a été effectué de la même façon pour les deux lignées cellulaires.The MTT test was carried out using the method described by Mosmann (1983). The cells are seeded in 96-well plates (BD Falcon) at 5 × 10 4 cells / ml in 100 μL of complete medium and incubated for 24 h. The medium is then removed and 100 μL of DMEM medium containing 1% (v / v) of antibiotic solution associated with the extracts at different concentrations, with TGF-β (positive control) or without extract (negative control) are added to each well. After 48 h, 25 μL of MTT (5% in PBS) are added to each well and the plates are incubated for 4 h at 37 ° C. The medium is then removed and 200 μL of dimethylsulfoxide are added to each well before an incubation of 10 min. The absorbance at 550 nm is finally measured using a Fluostar Omega microplate reader (BMG Labtech). The cell count test was performed in the same way for the two cell lines.
Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 1. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait.The results obtained are presented in FIG. 1. The results are expressed as a relative percentage relative to the negative control without extract.
Le nombre de cellules après 48 h d'incubation en présence de l'extrait semble dosedépendant. A la plus élevée des concentrations testée (500 pg.mL1), les deux lignées présentent un nombre similaire de cellules par puit, aux alentours de 35% par rapport au témoin négatif. Les puits traités à une concentration de 100 pg.mL1 comportent respectivement 42% et 98% de cellules par rapport au témoin négatif pour les lignées 1059 et 1090. L'effet est donc différent d'une lignée à l'autre. Cette différence de comportement est confirmée à la concentration de 10 pg.mL1 puisque les puits traités comportent respectivement 97% (lignée 1059) et 136% (lignée 1090) de cellules par rapport au témoin négatif. Les résultats obtenus dans les puits traités mettent ainsi en évidence une augmentation de la population cellulaire 1090 de 36% par rapport aux puits non traités.The number of cells after 48 h of incubation in the presence of the extract seems to be dependent. At the highest of the concentrations tested (500 pg.mL 1 ), the two lines have a similar number of cells per well, around 35% compared to the negative control. The wells treated at a concentration of 100 pg.mL 1 respectively contain 42% and 98% of cells compared to the negative control for lines 1059 and 1090. The effect is therefore different from one line to another. This difference in behavior is confirmed at the concentration of 10 pg.mL 1 since the treated wells respectively contain 97% (line 1059) and 136% (line 1090) of cells compared to the negative control. The results obtained in the treated wells thus demonstrate an increase in the 1090 cell population of 36% compared to the untreated wells.
Effet de l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis sur la production de collagène par les FDHN : Les cellules sont ensemencées dans des plaques 24 puits (BD Falcon) à 5xl04 cellules/mL dans 1 mL de milieu complet, puis incubées 24 h. Le milieu est ensuite retiré et 1 mL de milieu contenant 1% (v/v) de solution antibiotique associé aux extraits à différentes concentrations, ou sans extrait (témoin négatif), est ajouté dans chaque puit. Après 48 h d'incubation à 37°C, la production de collagène est mesurée par le test au Sirius red staining. Le milieu est retiré et les cellules sont lavées deux fois avec du PBS puis fixées pendant 1 h avec 1 mL de solution de Bouin à température ambiante. Suite à la fixation, la solution de Bouin est retirée et les cellules sont lavées deux fois à l'eau ultrapure. Le collagène est ensuite coloré par ajout de 1 mL de solution de Sirius red (0,5 g de Sirius red dans 500 mL d'acide picrique à saturation) et la plaque est agitée 1 h à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés successivement avec de l'eau ultrapure et une solution d'HCI 0,01M afin de retirer tout le colorant non lié. Le colorant lié est finalement solubilisé par ajout de 500 pL de NaOH 0,lM puis la plaque est incubée 1 h sous agitation sur un agitateur de microplaques à 200 rpm. Finalement, l'absorbance est lue à 550 nm. Le dosage de collagène a été effectué de la même façon pour les deux lignées cellulaires.Effect of the aqueous extract of Ulva intestinalis on the production of collagen by the FDHN: The cells are seeded in 24-well plates (BD Falcon) at 5 × 10 4 cells / ml in 1 ml of complete medium, then incubated for 24 h. The medium is then removed and 1 ml of medium containing 1% (v / v) of antibiotic solution associated with the extracts at different concentrations, or without extract (negative control), is added to each well. After 48 h of incubation at 37 ° C., the production of collagen is measured by the Sirius red staining test. The medium is removed and the cells are washed twice with PBS and then fixed for 1 h with 1 ml of Bouin solution at room temperature. Following fixation, the Bouin solution is removed and the cells are washed twice with ultrapure water. The collagen is then colored by adding 1 ml of Sirius red solution (0.5 g of Sirius red in 500 ml of picric acid at saturation) and the plate is stirred for 1 h at room temperature. The wells are then washed successively with ultrapure water and a 0.01M HCl solution in order to remove all the unbound dye. The bound dye is finally solubilized by adding 500 μL of 0.1M NaOH then the plate is incubated for 1 h with shaking on a microplate shaker at 200 rpm. Finally, the absorbance is read at 550 nm. The collagen assay was carried out in the same way for the two cell lines.
Les résultats sur les figures sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait.The results in the figures are expressed as a relative percentage compared to the negative control without extract.
La figure 2A, représentant la production de collagène par puit, montre une augmentation de la production de collagène dans les puits traités, et ce pour les deux lignées cellulaires. Si aucun effet n'est décelé pour une concentration en extrait de 10 pg.mL_1, une augmentation de l'ordre de 27% pour la lignée 1059 et 52% pour la lignée 1090 est décelée pour une concentration en extrait de 100 pg.mL1. Cette augmentation est par ailleurs encore plus significative à la concentration en extrait de 500 pg.mL_1, de 46% pour la lignée 1059 et 79% pour la lignée 1090. En ce qui concerne la production de collagène par cellule (figure 2B), la quantité de collagène produite est très significativement augmentée, de l'ordre de 300% pour la lignée 1059 et 323% pour la lignée 1090, ce qui est en accord avec les observations relevées précédemment sur l'effet de l'extrait sur la prolifération cellulaire, mettant en évidence à cette même concentration un ralentissement de la prolifération (figure 1).FIG. 2A, representing the production of collagen per well, shows an increase in the production of collagen in the treated wells, and this for the two cell lines. If no effect is detected for an extract concentration of 10 pg.mL _1 , an increase of around 27% for the 1059 line and 52% for the 1090 line is detected for an extract concentration of 100 pg. mL 1 . This increase is moreover still more significant at the extract concentration of 500 pg.mL _1 , of 46% for the 1059 line and 79% for the 1090 line. With regard to the production of collagen per cell (FIG. 2B), the amount of collagen produced is very significantly increased, of the order of 300% for the 1059 line and 323% for the 1090 line, which is in agreement with the observations noted previously on the effect of the extract on proliferation cell, highlighting at this same concentration a slowdown in proliferation (Figure 1).
Exemple IB : Extraction aqueuse à partir d'Ulva sp.Example IB: Aqueous extraction from Ulva sp.
L'exemple IA a été répété en réalisant une extraction à partir d'Ulva rigidaExample IA was repeated by extracting from Ulva rigida
Tableau 2 : Composition biochimique de l'extrait aqueux d'Ulva rigidaTable 2: Biochemical composition of the aqueous extract of Ulva rigida
Effet de l'extrait aqueux d'Ulva rigida sur la prolifération des FDHN :Effect of the aqueous extract of Ulva rigida on the proliferation of FDHN:
Les résultats sont présentés sur la Figure 3. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait.The results are presented in FIG. 3. The results are expressed as a relative percentage relative to the negative control without extract.
Le nombre de cellules après 48 h d'incubation en présence de l'extrait est dose-dépendant. A une forte concentration (500 pg.mL_1), les puits traités comportent 70% de cellules en moins que dans les puits non traités. A la concentration de 100 pg.mL_1, le nombre de cellules dans les puits traités est augmenté d'environ 45% pour la lignée 1059 et 83% pour la lignée 1090. A la plus faible concentration testée de 10 pg.mL-Ι, l'extrait ne présente qu'un effet très limité sur la prolifération cellulaire de la lignée 1090, avec un nombre de cellules dans les puits traités d'environ 117% par rapport aux puits non traités, ce qui n'est pas le cas pour la lignée 1059, pour laquelle une diminution de l'ordre de 35% est observée. Là encore, une différence de comportement des deux lignées cellulaires est décelée.The number of cells after 48 h of incubation in the presence of the extract is dose-dependent. At a high concentration (500 pg.mL _1 ), the treated wells contain 70% fewer cells than in the untreated wells. At the concentration of 100 pg.mL _1 , the number of cells in the treated wells is increased by approximately 45% for the 1059 line and 83% for the 1090 line. At the lowest tested concentration of 10 pg.mL-Ι , the extract has only a very limited effect on cell proliferation of the 1090 line, with a number of cells in the treated wells of approximately 117% compared to the untreated wells, which is not the case for line 1059, for which a decrease of around 35% is observed. Again, a difference in behavior of the two cell lines is detected.
Les résultats obtenus pour l'extrait aqueux d'Ulva rigida sont similaires à ceux obtenus pour l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis. Il n'y pas de différence significative entre les effets des deux extraits sur les profils de production de collagène.The results obtained for the aqueous extract of Ulva rigida are similar to those obtained for the aqueous extract of Ulva intestinalis. There is no significant difference between the effects of the two extracts on the collagen production profiles.
Les résultat de l'effet de l'extrait aqueux d'Ulva rigida sur la production de collagène par les FDHN sont présentés sur les Figure 4A e 4B. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait.The results of the effect of the aqueous extract of Ulva rigida on the production of collagen by the FDHN are presented in FIGS. 4A and 4B. The results are expressed as a relative percentage compared to the negative control without extract.
La production de collagène dans les puits présente une augmentation d'environ 5%, 14% et 20% à respectivement 10, 100 et 500 pg.mL1 d'extrait pour la lignée 1059 (figure 4A). L'effet sur la lignée 1090 est quant à lui plus limité. En revanche, l'étude montre un fort impact de l'extrait sur la production de collagène par cellule (figure 4B) avec une augmentation très significative de 300% pour la lignée 1059 et 400% pour la lignée 1090, à la concentration en extrait de 500 pg.ml_1. A la concentration intermédiaire de 100 pg.ml_1, les augmentations décelées sont toujours significatives, de 151% pour la lignée 1059 et 62% pour la lignée 1090, fait très intéressant sachant que l'impact sur la croissance cellulaire est plus modéré à cette concentration, particulièrement pour la lignée 1090 (figure 3).Collagen production in the wells increased by approximately 5%, 14% and 20% to 10, 100 and 500 pg.mL 1 of extract for line 1059, respectively (Figure 4A). The effect on the 1090 line is more limited. On the other hand, the study shows a strong impact of the extract on the production of collagen per cell (Figure 4B) with a very significant increase of 300% for the 1059 line and 400% for the 1090 line, at the extract concentration. of 500 pg.ml _1 . At the intermediate concentration of 100 pg.ml _1 , the increases detected are still significant, of 151% for the 1059 line and 62% for the 1090 line, a very interesting fact given that the impact on cell growth is more moderate at this concentration, particularly for line 1090 (Figure 3).
Exemple 2A : Obtention d'un rétentat à partir d'Ulva intestinalisExample 2A: Obtaining a Retentate from Ulva Intestinalis
Procédé d'obtention d'un rétentat à partir d'Ulva intestinalisMethod for obtaining a retentate from Ulva intestinalis
Le procédé comprend la même succession d'étapes que dans l'exemple 1, suivie d'une 5ème étape d'ultrafiltration du jus de pressage de façon à obtenir la récupération d'une part d'un rétentat concentré contenant les molécules de plus grande taille, et d'autre part d'un perméat contenant les éléments de plus petite taille, inférieure à 15 kDa. Après l'extraction aqueuse, environ 13 litres de jus d'extraction sont récupérés puis filtrés via une unité d'ultrafiltration équipée d'une membrane de type Kerasep KBW 15 kDa de Novasep Process. La filtration est réalisée à 80°C, 5 bars et à un débit de circulation de 450 L/h, soit une vitesse de circulation de 5 m/s. La filtration est poursuivie jusqu'à obtenir un rétentat d'environ 4°B, qui est alors soutiré de l'unité.The method comprises the same sequence of steps as in Example 1, followed by a 5 th step pressing juice ultrafiltration so as to obtain the recovery of the one part of a concentrated retentate containing the molecules more large size, and secondly a permeate containing the elements of smaller size, less than 15 kDa. After the aqueous extraction, approximately 13 liters of extraction juice are recovered and then filtered via an ultrafiltration unit equipped with a Kerasep KBW 15 kDa type membrane from Novasep Process. Filtration is carried out at 80 ° C, 5 bars and at a circulation rate of 450 L / h, i.e. a circulation speed of 5 m / s. Filtration is continued until a retentate of approximately 4 ° B is obtained, which is then withdrawn from the unit.
Détermination de la composition biochimique du rétentat d'ultrafiltration :Determination of the biochemical composition of the ultrafiltration retentate:
Les compositions biochimiques ont été déterminées de la même manière que dans l'exemple 1.The biochemical compositions were determined in the same manner as in Example 1.
Tableau 3 : Composition biochimique du rétentat d'Ulva intestinalisTable 3: Biochemical composition of the retentate of Ulva intestinalis
Effet du rétentat d'ultrafiltration d'Ulva intestinalis sur la prolifération des FDHN :Effect of the ultrafiltration retentate of Ulva intestinalis on the proliferation of FDHN:
Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 5. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans rétentat.The cell tests were carried out in the same manner as in Example 1. The results obtained are presented in FIG. 5. The results are expressed in relative percentage compared to the negative control without retentate.
Le nombre de cellules après 48 h d'incubation avec les extraits est dose-dépendant. En effet, à la plus haute concentration (500 pg.mL_1), les puits traités en présence du rétentat d'Ulva intestinalis comportent respectivement autour de 60% (lignée 1059) et 73% (lignée 1090) de cellules en moins que dans les puits non traités. Cet effet est ensuite beaucoup moins marqué lorsque la concentration en rétentat diminue, de l'ordre de 45% de diminution à 100 pg.mL1 et seulement 22% à 10 pg.mL_1.The number of cells after 48 h of incubation with the extracts is dose-dependent. Indeed, at the highest concentration (500 pg.mL _1 ), the wells treated in the presence of Ulva intestinalis retentate contain respectively around 60% (line 1059) and 73% (line 1090) fewer cells than in untreated wells. This effect is then much less marked when the retentate concentration decreases, of the order of 45% decrease at 100 pg.mL 1 and only 22% at 10 pg.mL _1 .
Effet du rétentat d'Ulva intestinalis sur la production de collagène par les FDHN :Effect of Ulva intestinalis retentate on collagen production by FDHN:
Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1.The cell tests were carried out in the same manner as in Example 1.
Les résultats sont présentés sur les Figures 6A et 6B. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans rétentat.The results are shown in Figures 6A and 6B. The results are expressed as a relative percentage compared to the negative control without retentate.
La production de collagène augmente pour les puits traités de la lignée 1059, avec respectivement +10%, +17% et +32% à 10,100 et 500 pg.ml1 (figure 6A). En revanche, l'effet reste limité pour la lignée 1090 et n'est véritablement notable qu'à partir de 500 pg.ml1 avec une augmentation de 23% de la production de collagène dans les puits traités. L'augmentation de la production de collagène semble être dose-dépendante. Les résultats sont particulièrement intéressants concernant la production de collagène par cellule (figure 6B). En effet, à de faibles concentrations, la production de collagène augmente respectivement de 39% (lignée 1059) et 23% (lignée 1090) à 10 pg.ml1,109% (lignée 1059) et 30% (lignée 1090) à 100 pg.ml1 et 212% (lignée 1059) et 387% (lignée 1090) à 500 pg.ml_1.The production of collagen increases for the treated wells of line 1059, with + 10%, + 17% and + 32% respectively at 10.100 and 500 pg.ml 1 (FIG. 6A). On the other hand, the effect remains limited for the 1090 line and is really noticeable only from 500 pg.ml 1 with a 23% increase in the production of collagen in the treated wells. The increase in collagen production appears to be dose-dependent. The results are particularly interesting concerning the production of collagen per cell (FIG. 6B). Indeed, at low concentrations, the production of collagen increases respectively by 39% (line 1059) and 23% (line 1090) at 10 pg.ml 1 , 109% (line 1059) and 30% (line 1090) to 100 pg.ml 1 and 212% (line 1059) and 387% (line 1090) at 500 pg.ml _1 .
Comme observé précédemment avec l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis, les résultats montrent ici une différence notable entre les deux lignées cellulaires. L'âge de la donneuse semble impacter et influencer les mécanismes métaboliques mis en jeu lors de la stimulation de la production de collagène.As previously observed with the aqueous extract of Ulva intestinalis, the results here show a notable difference between the two cell lines. The age of the donor seems to impact and influence the metabolic mechanisms involved in stimulating the production of collagen.
Exemple 2B : Obtention d'un rétentat à partir d'Ulva rigidaExample 2B: Obtaining a retentate from Ulva rigida
L'exemple 2A a été répété en réalisant une extraction à partir d'Ulva rigidaExample 2A was repeated while extracting from Ulva rigida
Tableau 4 : Composition biochimique du rétentat d'Ulva rigidaTable 4: Biochemical composition of the Ulva rigida retentate
Effet du rétentat d'Ulva rigida sur la prolifération des FDHN :Effect of Ulva rigida retentate on the proliferation of FDHN:
Les résultats sont présentés sur la Figure 7. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans rétentat.The results are presented in FIG. 7. The results are expressed as a relative percentage relative to the negative control without retentate.
Le nombre de cellules après 48 h d'incubation avec les extraits est dose-dépendant.The number of cells after 48 h of incubation with the extracts is dose-dependent.
En ce qui concerne la lignée 1059, les puits traités comportent respectivement 21%, 26% et 35% de cellules en moins que dans les puits non traités, aux trois concentrations en rétentat testées. En revanche, pour la lignée 1090, les puits comportent 21% et 11% de cellules en plus par rapport aux puits contrôles, pour les concentrations de 10 et 100 pg.mL_1. Ici encore, un effet différent en fonction de la lignée cellulaire a pu être observé.As regards the 1059 line, the treated wells respectively contain 21%, 26% and 35% fewer cells than in the untreated wells, at the three retentate concentrations tested. On the other hand, for the 1090 line, the wells contain 21% and 11% more cells compared to the control wells, for the concentrations of 10 and 100 pg.mL _1 . Here again, a different effect depending on the cell line was observed.
Effet du rétentat d'Ulva rigida sur la production de collagène par les FDHN :Effect of Ulva rigida retentate on collagen production by FDHN:
Les résultats sont présentés sur les Figures 8A et 8B. sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans rétentat.The results are shown in Figures 8A and 8B. are expressed as a relative percentage compared to the negative control without retentate.
La production de collagène par puit augmente de manière dose-dépendante . L'augmentation de la production de collagène reste très légère pour la lignée 1059 (+10% à 100 pg.ml1 et +20% à 500 pg.ml_1). L'augmentation de la production de collagène dans les puits traités n'est décelable qu'à partir de 500 mg.ml1 pour la lignée 1090.Collagen production per well increases in a dose-dependent manner. The increase in collagen production remains very slight for the 1059 line (+ 10% at 100 pg.ml 1 and + 20% at 500 pg.ml _1 ). The increase in collagen production in the treated wells can only be detected from 500 mg.ml 1 for the 1090 line.
Concernant la production de collagène par cellule, l'impact est particulièrement important à 500 pg.ml1 avec des augmentations de 80% pour la lignée 1059 et 70% pour la lignée 1090. L'augmentation de la production de collagène par cellule reste dose-dépendante avec respectivement +35%, +46% (lignée 1059) et -7%, +10% (lignée 1090) à 10 et 100 pg.ml1 de rétentat (figure 8B).Concerning the production of collagen per cell, the impact is particularly significant at 500 pg.ml 1 with increases of 80% for the 1059 line and 70% for the 1090 line. The increase in the production of collagen per cell remains dose -dependent with respectively + 35%, + 46% (line 1059) and -7%, + 10% (line 1090) at 10 and 100 pg.ml 1 of retentate (Figure 8B).
Exemple 3A : Obtention d'un perméat à partir d'Ulva intestinalisExample 3A: Obtaining a permeate from Ulva intestinalis
Procédé d'obtention du perméat à partir d'Ulva intestinalis :Process for obtaining permeate from Ulva intestinalis:
Cette méthode correspond au procédé de fractionnement décrit dans le brevet FR2998894 deThis method corresponds to the fractionation process described in patent FR2998894 of
SEPROSYS permettant de récupérer un perméat riche en molécules de poids moléculaire inférieur à 15 kDa décrit dans l'exemple 2.SEPROSYS for recovering a permeate rich in molecules with a molecular weight of less than 15 kDa described in Example 2.
Détermination de la composition biochimique du perméat d'Ulva intestinalis :Determination of the biochemical composition of the permeate of Ulva intestinalis:
La composition biochimique du perméat a été mesurée de la même façon que dans l'exemple 1.The biochemical composition of the permeate was measured in the same way as in Example 1.
Tableau 5 : Composition biochimique du perméat d'Ulva intestinalisTable 5: Biochemical composition of the permeate of Ulva intestinalis
Effet du perméat d'Ulva intestinalis sur la prolifération des FDHN :Effect of permeate of Ulva intestinalis on the proliferation of FDHN:
Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1.The cell tests were carried out in the same manner as in Example 1.
Les résultats sont présentés sur la Figure 9. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans perméat.The results are presented in FIG. 9. They are expressed as a relative percentage relative to the negative control without permeate.
Le perméat ne présente pas d'effet significatif sur la croissance cellulaire de la lignée 1059 (figure 10). Pour la lignée 1090, seule la concentration de 100 pg.mL1 présente un effet sur la prolifération cellulaire avec une augmentation de 74% par rapport au témoin négatif.The permeate has no significant effect on cell growth of the 1059 line (FIG. 10). For the 1090 line, only the concentration of 100 pg.mL 1 has an effect on cell proliferation with an increase of 74% compared to the negative control.
Effet du perméat d'Ulva intestinalis sur la production de collagène par les FDHN :Effect of the permeate of Ulva intestinalis on the production of collagen by the FDHN:
Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés sur les Figures 10A et B. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans perméat.The cellular tests were carried out in the same manner as in Example 1. The results are presented in FIGS. 10A and B. The results are expressed as a relative percentage relative to the negative control without permeate.
La production de collagène par puit ne semble pas être impactée par le perméat (figure 10A). En effet, nous ne remarquons pas de surproduction de collagène par puit, et ce pour les deux lignées cellulaires.Collagen production per well does not seem to be impacted by the permeate (Figure 10A). Indeed, we do not notice an overproduction of collagen per well, and this for the two cell lines.
En ce qui concerne la production de collagène par cellule (figure 10B), seul la concentration en perméat de 10 pg.mL1 induit une augmentation de la production de collagène par cellule pour la lignée 1059 (+40%). Le perméat ne présente pas d'activité stimulante aux autres concentrations d'étude, ce qui diffère donc des extraits précédents.With regard to the production of collagen per cell (FIG. 10B), only the permeate concentration of 10 pg.mL 1 induces an increase in the production of collagen per cell for the 1059 line (+ 40%). The permeate does not exhibit stimulating activity at the other study concentrations, which therefore differs from the previous extracts.
Ce résultat est important car il apporte des informations sur le mode de stimulation des extraits. En effet, s'il ne stimule pas la production de collagène, le perméat induit une augmentation de la densité de cellules pour la lignée 1090 (figure 9), semblant donc orienter le métabolisme des fibroblastes 1090 vers la croissance cellulaire, ce qui se rapproche du mécanisme observé généralement dans le cas des stimulants conventionnels des fibroblastes dermiques humains tels que le TGF-β. En outre, une différence de comportement des deux lignées cellulaires est une fois encore notée, démontrant que l'orientation métabolique des fibroblastes est fonction de l'âge de la donneuse.This result is important because it provides information on the mode of stimulation of the extracts. Indeed, if it does not stimulate the production of collagen, the permeate induces an increase in the density of cells for the 1090 line (FIG. 9), therefore seeming to orient the metabolism of fibroblasts 1090 towards cell growth, which is similar of the mechanism generally observed in the case of conventional stimulants of human dermal fibroblasts such as TGF-β. In addition, a difference in behavior of the two cell lines is once again noted, demonstrating that the metabolic orientation of the fibroblasts is a function of the age of the donor.
Exemple 3B : Obtention d'un perméat à partir d'Ulva rigidaExample 3B: Obtaining a permeate from Ulva rigida
L'exemple 3A a été répété en réalisant une extraction à partir d'Ulva rigidaExample 3A was repeated while extracting from Ulva rigida
Tableau 6 : Composition biochimique du perméat d'Ulva rigidaTable 6: Biochemical composition of the permeate of Ulva rigida
Effet du perméat d'Ulva rigida sur la prolifération des FDHN :Effect of the permeate of Ulva rigida on the proliferation of FDHN:
Les résultats sont présentés sur la Figure 11. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans perméat.The results are presented in FIG. 11. They are expressed as a relative percentage relative to the negative control without permeate.
Concernant le perméat d'Ulva rigida, nous pouvons remarquer une réponse similaire à celle obtenue pour le perméat d'Ulva Intestinalis. La croissance de la lignée cellulaire 1090 est stimulée par l'extrait avec respectivement +28%, +50% et +18% d'augmentation après 48 h d'incubation pour les concentrations en perméat de 10,100 et 500 pg.ml1 (figure 11).Concerning the permeate of Ulva rigida, we can notice a similar response to that obtained for the permeate of Ulva Intestinalis. The growth of the cell line 1090 is stimulated by the extract with respectively + 28%, + 50% and + 18% increase after 48 h of incubation for the permeate concentrations of 10,100 and 500 pg.ml 1 (figure 11).
En revanche, l'effet de cette fraction est plutôt négatif sur la croissance cellulaire de la lignée 1059, une diminution de prolifération de 24% étant constatée à 10 et 100 pg.ml_1. Aucun effet n'est en revanche observé à 500 pg.ml_1.On the other hand, the effect of this fraction is rather negative on the cell growth of the 1059 line, a decrease in proliferation of 24% being observed at 10 and 100 pg.ml _1 . No effect is however observed at 500 pg.ml _1 .
Effet du perméat d'Ulva rigida sur la production de collagène par les FDHN :Effect of the permeate of Ulva rigida on the production of collagen by the FDHN:
Les résultats sont présentés sur les Figures 12A et 12B. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans perméat.The results are presented in Figures 12A and 12B. They are expressed as a relative percentage compared to the negative control without permeate.
La quantité de collagène par puit augmente légèrement concernant la lignée 1059 (+5% à 100 pg.ml1 et +30% à 500 pg.ml_1) (figure 12A). En revanche, à la plus forte concentration, la quantité de collagène par puit diminue pour la lignée 1090.The amount of collagen per well increases slightly for line 1059 (+ 5% at 100 pg.ml 1 and + 30% at 500 pg.ml _1 ) (Figure 12A). On the other hand, at the highest concentration, the amount of collagen per well decreases for the 1090 line.
Cette différence entre les deux lignées cellulaires met une fois de plus en évidence la différence d'orientation métabolique induite. La lignée fibroblastique 1090 semble privilégier la croissance à la production de collagène en présence du perméat d'Ulva rigidaThis difference between the two cell lines once again highlights the difference in metabolic orientation induced. The fibroblastic line 1090 seems to favor growth over the production of collagen in the presence of permeate from Ulva rigida
Ces résultats restent marqués concernant la production de collagène par cellule (figure 12B). En effet, les quantités de collagène produit par cellule sont respectivement augmentées de 30%, 44% et 30% à 10, 100 et 500 pg.ml1 pour la lignée 1059, alors qu'un effet négatif est observé sur la lignée 1090 avec -23% et -6% de production à 100 et 500 pg.ml_1.These results remain marked concerning the production of collagen per cell (FIG. 12B). Indeed, the amounts of collagen produced per cell are increased by 30%, 44% and 30% respectively at 10, 100 and 500 pg.ml 1 for the 1059 line, while a negative effect is observed on the 1090 line with -23% and -6% of production at 100 and 500 pg.ml _1 .
On note un effet plus remarquable pour le perméat provenant d'Ulva rigida que pour celui provenant d'Ulva intestinalis (exemple 3B), bien que les orientations et valeurs obtenues soient proches entre les deux macroalgues vertes.There is a more remarkable effect for the permeate from Ulva rigida than for that from Ulva intestinalis (example 3B), although the orientations and values obtained are close between the two green macroalgae.
Exemple 4A : Obtention d'un extrait riche en protéines à partir d'Ulva intestinalisExample 4A: Obtaining an extract rich in proteins from Ulva intestinalis
Le procédé mis en oeuvre correspond au procédé de fractionnement décrit dans le brevet FR2998894 de SEPROSYS permettant de récupérer un extrait riche en protéine d'Ulva intestinalis. A partir du rétentat d'ultrafiltration obtenu dans l'exemple 2, deux étapes ont été ajoutées au procédé pour obtenir une fraction enrichie en protéines :The process used corresponds to the fractionation process described in patent FR2998894 of SEPROSYS allowing to recover an extract rich in protein of Ulva intestinalis. From the ultrafiltration retentate obtained in Example 2, two steps were added to the process to obtain a fraction enriched in proteins:
- Déminéralisation du rétentat d'ultrafiltration et décantation du rétentat déminéralisé- Demineralization of the ultrafiltration retentate and decantation of the demineralized retentate
- Récupération des protéines végétales présentes dans les algues par floculation- Recovery of vegetable proteins present in algae by flocculation
A cette fin, le rétentat (1,5 L) est déminéralisé par passage sur une colonne contenant 100 mL de résine anionique forte de type Amberlite FPA 98 sous forme OH, montée en série avec une colonne contenant 200 mL de résine cationique forte de type Amberlite IR 120 Na sous forme H+. La circulation s'effectue à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit de 2 BV/h pour la résine cationique. Le produit déminéralisé est ensuite laissé à décanter dans une cuve à 80°C pendant 2 h. Le surnageant purifié riche en polysaccharides sulfatés est alors séparé du culot protéique par centrifugation à 2150 g pendant 30 min.To this end, the retentate (1.5 L) is demineralized by passage over a column containing 100 ml of strong anionic resin of the Amberlite FPA 98 type in OH form, mounted in series with a column containing 200 ml of strong cationic resin of the type Amberlite IR 120 Na in H + form. Circulation is carried out using a peristaltic pump at a flow rate of 2 BV / h for the cationic resin. The demineralized product is then left to decant in a tank at 80 ° C for 2 h. The purified supernatant rich in sulfated polysaccharides is then separated from the protein pellet by centrifugation at 2150 g for 30 min.
Détermination de la composition biochimigue de l'extrait riche en protéines :Determination of the biochemical composition of the protein-rich extract:
La composition biochimique de l'extrait protéique a été mesurée de la même manière que dans l'exemple 1.The biochemical composition of the protein extract was measured in the same way as in Example 1.
Tableau 7 : Composition biochimique de l'extrait riche en protéines d'Ulva intestinalisTable 7: Biochemical composition of the protein-rich extract of Ulva intestinalis
Les analyses structurales des protéines présentes dans l'extrait ont été effectué sur une HPLC Agilent 1050. La fraction protéique a été séparée par gel perméation afin de déterminer le poids moléculaire moyenne des protéines présentes dans l'extrait à 280 nm. Un tampon phosphate 0.1 M contenant 0.3 M de NaCI nous a permis d'éluer notre échantillon sur une colonne TSK gel 3000 SW à un débit de 0.8 ml/min. Les résultats mettent en évidence la présence de plusieurs populations protéiques avec des masses moléculaires de 22,18 et 8 kDa minimum (figure 20).Structural analyzes of the proteins present in the extract were carried out on an Agilent 1050 HPLC. The protein fraction was separated by permeation gel in order to determine the average molecular weight of the proteins present in the extract at 280 nm. A 0.1 M phosphate buffer containing 0.3 M NaCl allowed us to elute our sample on a TSK gel 3000 SW column at a flow rate of 0.8 ml / min. The results highlight the presence of several protein populations with molecular masses of 22.18 and 8 kDa minimum (Figure 20).
Effet de l'extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis sur la prolifération des FDHN :Effect of the protein-rich extract of Ulva intestinalis on the proliferation of FDHN:
Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1.The cell tests were carried out in the same manner as in Example 1.
Les résultats sont présentés sur la Figure 13. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait.The results are presented in FIG. 13. They are expressed as a relative percentage relative to the negative control without extract.
Concernant la lignée 1059, le nombre de cellules après 48 h d'incubation en présence de l'extrait est dose-dépendant (figure 15). En effet, à 500 pg.mL1, plus haute concentration testée, les puits traités avec l'extrait comportent environ 40% de cellules en moins que dans les puits non traités. A la concentration de 100 pg.mL_1, le nombre de cellules est diminué de 28%. Aux concentrations les plus élevées, l'extrait enrichi en protéines impacte donc négativement la prolifération des fibroblastes.Concerning the 1059 line, the number of cells after 48 h of incubation in the presence of the extract is dose-dependent (FIG. 15). In fact, at 500 pg.mL 1 , the highest concentration tested, the wells treated with the extract contain approximately 40% fewer cells than in the untreated wells. At the concentration of 100 pg.mL _1 , the number of cells is reduced by 28%. At the highest concentrations, the protein-enriched extract therefore negatively impacts the proliferation of fibroblasts.
Pour la lignée 1090, aucun effet notable sur la croissance cellulaire n'est relevé jusqu'à la concentration de 100 pg.mL_1. En revanche, les puits traités avec l'extrait à 500 pg.mL1 voient le nombre de cellules diminuer de près de 35%.For the 1090 line, no significant effect on cell growth is noted up to the concentration of 100 pg.mL _1 . On the other hand, the wells treated with the extract at 500 pg.mL 1 see the number of cells decrease by almost 35%.
Effet d'un extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis sur la production de collagène par les FDHN :Effect of a protein-rich extract of Ulva intestinalis on collagen production by FDHN:
Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1.The cell tests were carried out in the same manner as in Example 1.
Les résultats sont présentés sur les figures 14A et 14B. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait.The results are shown in Figures 14A and 14B. The results are expressed as a relative percentage compared to the negative control without extract.
La production de collagène par les FDHN traités par l'extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis est fortement impactée. Elle augmente par rapport au témoin négatif de manière dose-dépendante (figure 14A) : sans effet notable à 10 pg.mL_1, l'extrait stimule en effet très fortement les deux lignées fibroblastiques pour la production de collagène par puit (+50% à 100 pg.mL1 et respectivement +152% et +80% à 500 pg.mL_1).Collagen production by FDHN treated with the protein-rich extract of Ulva intestinalis is strongly impacted. It increases compared to the negative control in a dose-dependent manner (FIG. 14A): without any noticeable effect at 10 pg.mL _1 , the extract indeed very strongly stimulates the two fibroblastic lines for the production of collagen per well (+ 50% at 100 pg.mL 1 and respectively + 152% and + 80% at 500 pg.mL _1 ).
Ceci nous conduit à penser que les fibroblastes traités avec l'extrait protéique tendent à ralentir leur métabolisme lié à la croissance cellulaire au profit de celui lié à la production de collagène. Il est à noter que cet extrait riche en protéines présente les meilleurs résultats en termes de stimulation de la production de collagène par puit par les deux lignées fibroblastiques.This leads us to believe that the fibroblasts treated with the protein extract tend to slow down their metabolism linked to cell growth in favor of that linked to the production of collagen. It should be noted that this protein-rich extract has the best results in terms of stimulation of collagen production by well by the two fibroblastic lines.
Cette fraction démontre également une activité particulièrement intéressante sur la production de collagène par cellule, menant à une augmentation significative de la quantité de collagène produit par les FDHN (figure 14B). En effet, la quantité de collagène produit par cellule en présence de cet extrait est respectivement augmentée de 60%, 130% et 300% pour la lignée 1059, et de 15%, 77% et 370% pour la lignée 1090, à 10, 100 et 500 pg.mL_1.This fraction also demonstrates a particularly interesting activity on the production of collagen per cell, leading to a significant increase in the amount of collagen produced by the FDHN (Figure 14B). Indeed, the amount of collagen produced per cell in the presence of this extract is respectively increased by 60%, 130% and 300% for the 1059 line, and by 15%, 77% and 370% for the 1090 line, to 10, 100 and 500 pg.mL _1 .
Cette activité est particulièrement remarquable puisqu'elle s'accompagne d'un faible impact sur la croissance cellulaire. (Figure 13).This activity is particularly remarkable since it is accompanied by a weak impact on cell growth. (Figure 13).
En outre, ce résultat confirme à nouveau que la stimulation de la production de collagène induite est liée à l'activation de l'anabolisme des fibroblastes et non à l'augmentation de la densité cellulaire, comme c'est le cas pour les stimulants conventionnels.Furthermore, this result confirms again that the stimulation of the induced collagen production is linked to the activation of the anabolism of fibroblasts and not to the increase in cell density, as is the case for conventional stimulants. .
Exemple 4B : Obtention d'un extrait riche en protéines à partir d'Ulva rigidaExample 4B: Obtaining an extract rich in proteins from Ulva rigida
L'exemple 4A a été répété en réalisant une extraction à partir d'Ulva rigidaExample 4A was repeated while extracting from Ulva rigida
Tableau 8 : Composition biochimique de l'extrait riche en protéines d'Ulva rigidaTable 8: Biochemical composition of the protein-rich extract of Ulva rigida
Les analyses structurales des protéines présentes dans l'extrait ont été effectuées sur une HPLC Agilent 1050. La fraction protéique a été séparée par gel perméation afin de déterminer le poids moléculaire moyenne des protéines présentes dans l'extrait à 280 nm. Un tampon phosphate 0.1 M contenant 0.3 M de NaCI nous a permis d'éluer notre échantillon sur une colonne TSK gel 3000 SW à un débit de 0.8 ml/min. Les résultats mettent en évidence la présence de plusieurs populations protéiques avec des masses moléculaires de 22,13, 8 et 2 kDa minimum (figure 15).The structural analyzes of the proteins present in the extract were carried out on an Agilent 1050 HPLC. The protein fraction was separated by permeation gel in order to determine the average molecular weight of the proteins present in the extract at 280 nm. A 0.1 M phosphate buffer containing 0.3 M NaCl allowed us to elute our sample on a TSK gel 3000 SW column at a flow rate of 0.8 ml / min. The results highlight the presence of several protein populations with molecular weights of 22,13, 8 and 2 kDa minimum (Figure 15).
Effet d'un extrait riche en protéines d'Ulva rigida sur la prolifération des FDHNEffect of a protein-rich extract of Ulva rigida on the proliferation of FDHN
Les résultats sont présentés sur la Figure 16. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait.The results are shown in Figure 16. They are expressed as a relative percentage compared to the negative control without extract.
Le nombre de cellules après 48 h d'incubation avec l'extrait riche en protéines d'Ulva rigida est dose-dépendant (figure 16). Un effet opposé est observé en fonction de la lignée cellulaire. En effet, pour la lignée 1059, les puits traités à 500 pg.ml1 comportent 43% de cellules en moins que les puits non traités, ce qui révèle un effet négatif de la fraction riche en protéines sur la prolifération de FDHN, toutefois limité à faible concentration, où une diminution du nombre de cellules de l'ordre de 15 à 25% à peine intervient.The number of cells after 48 h of incubation with the protein-rich extract of Ulva rigida is dose-dependent (FIG. 16). An opposite effect is observed depending on the cell line. Indeed, for the 1059 line, the wells treated at 500 pg.ml 1 contain 43% fewer cells than the untreated wells, which reveals a negative effect of the protein-rich fraction on the proliferation of FDHN, however limited. at low concentration, where a decrease in the number of cells on the order of barely 15 to 25% occurs.
La lignée 1090 présente quant à elle une augmentation de la prolifération corrélée avec l'augmentation de la concentration de l'extrait, partant de -20% à 10 pg.mL1 pour atteindre +11% à 500 pg.mL1.The 1090 line has an increase in proliferation correlated with the increase in the concentration of the extract, starting from -20% at 10 pg.mL 1 to reach + 11% at 500 pg.mL 1 .
Si nous comparons cet extrait avec l'extrait riche en protéines provenant d'Ulva intestinalis (exemple 4A), il apparaît que les profils de croissance cellulaire sont similaires pour la lignée 1059 mais différents pour la lignée 1090.If we compare this extract with the protein-rich extract from Ulva intestinalis (Example 4A), it appears that the cell growth profiles are similar for line 1059 but different for line 1090.
Effet d'un extrait riche en protéines d'Ulva rigida sur la production de collagène par les FDHN : Les résultats sont présentés sur les Figures 17A et 17B. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait.Effect of an extract rich in proteins from Ulva rigida on the production of collagen by the FDHN: The results are presented in Figures 17A and 17B. They are expressed as a relative percentage compared to the negative control without extract.
La production de collagène dans les puits traités par l'extrait riche en protéines d'Ulva rigida est très légèrement impactée par rapport à celles des puits non traités (figure 17A). En effet, la quantité de collagène pour les deux lignées n'augmentent que très légèrement à de fortes concentrations : +13% pour la lignée 1059 et +20% pour la lignée 1090 à 500 pg.mL_1.The production of collagen in the wells treated with the protein-rich extract of Ulva rigida is very slightly impacted compared with that of the untreated wells (FIG. 17A). Indeed, the quantity of collagen for the two lines increases only very slightly at high concentrations: + 13% for the line 1059 and + 20% for the line 1090 at 500 pg.mL _1 .
Comparativement à l'extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis (exemple 4A), l'effet est donc beaucoup moins marqué.Compared to the protein-rich extract of Ulva intestinalis (example 4A), the effect is therefore much less marked.
En ce qui concerne la quantité de collagène produit par cellule, on remarque un effet dosedépendant très intéressant de l'extrait riche en protéines d'Ulva rigida, principalement sur la lignée 1059, qui voit sa production augmenter respectivement de 23%, 61% et 100% à 10,100 et 500 pg.mL_1. L'effet est un peu moins marqué pour la lignée 1090, avec respectivement 20% et 35% d'augmentation à 100 et 500 pg.mL_1.Regarding the amount of collagen produced per cell, there is a very interesting dose-dependent effect of the protein-rich extract of Ulva rigida, mainly on the 1059 line, which sees its production increase by 23%, 61% and 100% at 10,100 and 500 pg.mL _1 . The effect is slightly less marked for the 1090 line, with respectively 20% and 35% increase at 100 and 500 pg.mL _1 .
Ces résultats sont particulièrement dignes d'intérêt, compte-tenu du fait que l'impact de cet extrait sur la croissance cellulaire est limité, y compris à forte concentration (figure 16). Les fibroblastes traités tendent à ralentir leur croissance cellulaire modérément, en particulier la lignée 1090, au profit de la surproduction de collagène.These results are particularly interesting, given the fact that the impact of this extract on cell growth is limited, including at high concentrations (Figure 16). The fibroblasts treated tend to slow their cell growth moderately, in particular the 1090 line, in favor of the overproduction of collagen.
Comparaison entre les deux fractions protéiques (Ulva Intestinalis et Ulva Rigida)Comparison between the two protein fractions (Ulva Intestinalis and Ulva Rigida)
Les fractions protéiques ont été séparées par gel perméation afin de déterminer le poids moléculaire moyenne des protéines présentes dans l'extrait à 280 nm. Un tampon phosphate 0.1 M contenant 0.3 M de NaCI nous a permis d'éluer notre échantillon sur une colonne TSK gel 4000 SW à un débit de 0.8 ml/min. La colonne TSK gel 4000 SW permet de séparer théoriquement de petites et moyennes protéines (100 à 10 kDa)The protein fractions were separated by permeation gel in order to determine the average molecular weight of the proteins present in the extract at 280 nm. A 0.1 M phosphate buffer containing 0.3 M NaCl allowed us to elute our sample on a TSK gel 4000 SW column at a flow rate of 0.8 ml / min. The TSK gel 4000 SW column theoretically separates small and medium proteins (100 to 10 kDa)
Les résultats mettent en évidence une similitude entre les profils chromatographiques entre Ulva Intestinalis et Ulva Sp (Figure 18).The results highlight a similarity between the chromatographic profiles between Ulva Intestinalis and Ulva Sp (Figure 18).
En effet, les profils protéiques montrent des populations protéiques similaires dans les deux extraits. Un pic majoritaire présent à 36 minutes prouve de la présence d'une population protéique aux alentours de 60-10 kDa.In fact, the protein profiles show similar protein populations in the two extracts. A majority peak present at 36 minutes proves the presence of a protein population around 60-10 kDa.
Ensuite, les extraits ont été digérés à l'aide de la protéinase K (une enzyme de la famille des protéases à sérine) afin de comparer la composition protéique d'Ulva Rigida et d'Ulva Intestinalis grâce aux profils peptidiques obtenus. Les peptides vont nous permettre d'identifier les profils protéiques grâces aux banques de données. Les extraits sont exposés à la protéinase K (1 mg.ml) pendant 1 heure à 37°C (pH=7).Next, the extracts were digested using proteinase K (an enzyme from the serine protease family) in order to compare the protein composition of Ulva Rigida and Ulva Intestinalis thanks to the peptide profiles obtained. The peptides will allow us to identify the protein profiles thanks to databases. The extracts are exposed to proteinase K (1 mg.ml) for 1 hour at 37 ° C (pH = 7).
Les échantillons ont été élués sur une colonne C18 (Acuity UPLC Hss T3) avec un gradient eauacétonitrile à un débit de 1 ml/minute sur une chaîne chromatographique L'Acquity UPLC H class (Waters corporation, Milford, Etats-Unis) couplée à un spectromètre de masse Xevo G2S Q-TOF (Waters corporation, Milford, Etats-Unis)The samples were eluted on a C18 column (Acuity UPLC Hss T3) with a water-acetonitrile gradient at a flow rate of 1 ml / minute on an Acquity UPLC H class chromatographic chain (Waters corporation, Milford, United States) coupled to a Xevo G2S Q-TOF mass spectrometer (Waters corporation, Milford, USA)
Les peptides permettent d'identifier les profils protéiques grâces aux banques de données. On retrouve les mêmes familles protéiques dans les fractions protéiques d'Ulva Intestinalis et d'Ulva Sp (figure 19) :Peptides are used to identify protein profiles thanks to databases. The same protein families are found in the protein fractions of Ulva Intestinalis and Ulva Sp (Figure 19):
Ribulose bisphosphate carboxylase large chainRibulose bisphosphate carboxylase large chain
Elongation factor Tu, chloroplasticElongation factor Tu, chloroplastic
5'-adenylylsulfate reductase5'-adenylylsulfate reductase
Actine (cytoplasme)Actin (cytoplasm)
ATP synthase subunit beta, chloroplastic p700 chlorophyll a-apoprotein A2 / 5'-adenylylsulfate reductaseATP synthase subunit beta, chloroplastic p700 chlorophyll a-apoprotein A2 / 5'-adenylylsulfate reductase
Translation elongation factor-like protein / Elongation factor-1 alpha-like proteinTranslation elongation factor-like protein / Elongation factor-1 alpha-like protein
Cytochrome C/ Ribulose bisphosphate carboxylase large chainCytochrome C / Ribulose bisphosphate carboxylase large chain
ATP SynthetaseATP Synthetase
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