FR3079524A1 - MICROPUTIC PLATES IN BIOCOMPATIBLE HYDROGEL - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une plaque de micropuits en hydrogel biocompatible adaptés à la croissance d'agrégats cellulaires, son procédé de préparation et son utilisation pour la croissance d'agrégats cellulaires dans les puits, en particulier pour observer la réponse des agrégats cellulaires cultivés en réaction à des stimuli, comme par exemple leur exposition à des substances toxiques ou à des candidats médicaments.The invention relates to a biocompatible hydrogel microwell plate adapted for the growth of cell aggregates, its method of preparation and its use for the growth of cell aggregates in wells, in particular for observing the response of cell aggregates grown in reaction. stimuli, such as exposure to toxic substances or drug candidates.
Description
PLAQUES DE MICROPUITS EN HYDROGEL BIOCOMPATIBLEBIOCOMPATIBLE HYDROGEL MICROWELL PLATES
La présente invention concerne une plaque de micropuits en hydrogel biocompatible adaptés à la croissance d’agrégats cellulaires, son procédé de préparation et son utilisation pour la croissance d’agrégats cellulaires dans les puits, en particulier pour observer la réponse des agrégats cellulaires cultivés en réaction à des stimuli, comme par exemple leur exposition à des substances toxiques ou à des candidats médicaments.The present invention relates to a plate of biocompatible hydrogel microwells suitable for the growth of cell aggregates, its preparation process and its use for the growth of cell aggregates in wells, in particular for observing the response of cell aggregates cultured in reaction. stimuli, such as exposure to toxic substances or drug candidates.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUETECHNOLOGICAL BACKGROUND
Il est maintenant admis que la culture cellulaire 2D ne représente que peu l’environnement cellulaire in vivo et de nombreux systèmes se développent pour cultiver les cellules en 3D, avec des agrégats cellulaires, en particulier des agrégats cellulaires organisés. Un des modèles en plein essor est l’utilisation de cellules s’auto-organisant en sphères (Multicellular Tumor Spheroids -MCTS).It is now recognized that 2D cell culture represents little of the cellular environment in vivo and many systems are being developed to cultivate cells in 3D, with cell aggregates, particularly organized cell aggregates. One of the burgeoning models is the use of self-organizing cells into spheres (Multicellular Tumor Spheroids -MCTS).
Il existe des systèmes de plaques 96 puits standard présentant une très faible adhésion cellulaire pour former les agrégats cellulaires.There are standard 96-well plate systems with very low cell adhesion to form cell aggregates.
Il existe également des systèmes de plaques sur lesquelles les agrégats cellulaires sont cultivés à partir d’une cellule liée à la plaque, comme les plaques commercialisées sous la marque ONCOSPHERES™ par la société CYTOO (https://cytoo.com/). Il existe également des plaques de micropuits en PDMS dont la surface est enduite d’un matériau biocompatible comme le polyéthylène glycol (Karp et al., Lab Chip, 2007, 7, 786-794). Ces solutions présentent toutefois l’inconvénient d’offrir une paroi rigide aux cellules, et donc de contraindre fortement la structure des agrégats, ce qui influe sur leurs réactions, notamment sur leurs capacités à modifier leur volume et leur organisation en fonction d’un stimulus.There are also plate systems on which the cell aggregates are cultured from a cell linked to the plate, such as the plates marketed under the brand ONCOSPHERES ™ by the company CYTOO (https://cytoo.com/). There are also PDMS microwell plates whose surface is coated with a biocompatible material such as polyethylene glycol (Karp et al., Lab Chip, 2007, 7, 786-794). However, these solutions have the drawback of offering a rigid wall to the cells, and therefore of strongly constraining the structure of the aggregates, which influences their reactions, in particular their ability to modify their volume and their organization as a function of a stimulus. .
Il existe également des plaques de « micro-puits » en matériaux biocompatibles comme l’agarose, permettant la formation d’agrégats, comme les plaques commercialisées sous la marque 3D Pétri Dish® par la société Microtissues (www.microtissues .corn). Les micro-puits en hydrogel (agarose) ont l’avantage de laisser librement diffuser les molécules de taille <30 nm. Ceci permet d’assurer l’apport de nutriments et de molécules d’intérêt. Toutefois, les solutions existantes ne permettent pas des observations par des moyennes optiques hautes résolutions, comme le suivi par microscopie avec des objectifs à fort grossissement (x40, x63, x100), notamment du fait de l’épaisseur de la couche d’hydrogel. Les objectifs compatibles avec ce type de micropuits ne peuvent aller que jusqu’au grossissement x20 (Napolitano & al., BioTechniques, 2017, 43, No. 4).There are also "micro-well" plates made of biocompatible materials such as agarose, allowing the formation of aggregates, such as the plates sold under the 3D Petri Dish® brand by the company Microtissues (www.microtissues .corn). Hydrogel micro-wells (agarose) have the advantage of allowing molecules of size <30 nm to diffuse freely. This ensures the supply of nutrients and molecules of interest. However, existing solutions do not allow observations by high resolution optical means, such as microscopy monitoring with high magnification objectives (x40, x63, x100), in particular due to the thickness of the hydrogel layer. Objectives compatible with this type of microwell can only go up to x20 magnification (Napolitano & al., BioTechniques, 2017, 43, No. 4).
Les solutions existantes et leurs méthodes de préparation sont notamment rappelées dans l’article « Three-dimensional culture Systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model » (Nath & Devi, Pharmacology & Therapeutics, 2016, 163, 94-108).The existing solutions and their preparation methods are notably recalled in the article "Three-dimensional culture Systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model" (Nath & Devi, Pharmacology & Therapeutics, 2016, 163, 94-108).
L’invention permet de résoudre les inconvénients propres à chaque système, permettant une culture dans des micropuits aux parois suffisamment souples pour ne pas contraindre de manière trop forte les agrégats cellulaires, en particulier en réponse à des stimuli à observer, mais aussi de permettre l’observation de ces stimuli par des moyens optiques à fort grossissement.The invention makes it possible to solve the drawbacks specific to each system, allowing culture in microwells with sufficiently flexible walls not to overly constrain the cell aggregates, in particular in response to stimuli to be observed, but also to allow the observation of these stimuli by high magnification optical means.
BREVE DESCRIPTION DE L’INVENTIONBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
La solution est apportée par une plaque de micropuits en hydrogel biocompatible adaptée à la croissance d’agrégats cellulaires qui comprend une première couche d’hydrogel biocompatible comprenant les micropuits posée sur une plaque support en matériau rigide transparent aux rayonnements lumineux, la distance entre le fond des micropuits et la surface de la plaque support allant de 50 à 500 pm.The solution is provided by a microwell plate made of biocompatible hydrogel adapted to the growth of cellular aggregates which comprises a first layer of biocompatible hydrogel comprising the microwells placed on a support plate made of rigid material transparent to light radiation, the distance between the bottom microwells and the surface of the support plate ranging from 50 to 500 μm.
Par agrégats cellulaires, on entend selon l’invention l’auto-assemblage d’un ou plusieurs types de cellules en 3 dimensions (aussi appelé neurosphéres, sphéroïdes, organoïdes)By cellular aggregates is meant according to the invention the self-assembly of one or more types of cells in 3 dimensions (also called neurospheres, spheroids, organoids)
Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, l’hydrogel biocompatible est un hydrogel d’agarose.According to a preferred embodiment of the invention, the biocompatible hydrogel is an agarose hydrogel.
L’invention concerne également un procédé de préparation de la plaque de micropuits par moulage d’une solution de gélifiant biocompatible, capable de former un hydrogel à température ambiante, sur un moule comprenant une plaque sensiblement plane et des doigts perpendiculaires à la plaque qui formeront les micropuits de l’hydrogel, d’appliquer la plaque support sur la solution de gélifiant biocompatible de manière à étaler ladite solution sur une épaisseur constante dans le moule, de laisser l’hydrogel se former puis de démouler la plaque de micropuits obtenue.The invention also relates to a method for preparing the microwell plate by molding a biocompatible gelling solution capable of forming a hydrogel at room temperature, on a mold comprising a substantially flat plate and fingers perpendicular to the plate which will form microwells of the hydrogel, to apply the support plate to the biocompatible gelling agent solution so as to spread said solution over a constant thickness in the mold, to allow the hydrogel to form and then to release the microwell plate obtained.
L’invention concerne aussi l’utilisation d’une plaque de micropuits selon l’invention pour la culture d’agrégats cellulaires dans les micropuits, et notamment pour l’analyse des réactions d’agrégats cellulaires cultivés dans les micropuits en réponse à un stimulus, en particulier par microscopie à fort grossissement.The invention also relates to the use of a microwell plate according to the invention for the cultivation of cellular aggregates in microwells, and in particular for the analysis of reactions of cellular aggregates cultivated in microwells in response to a stimulus , in particular by high magnification microscopy.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTIONDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
La présente invention concerne une plaque de micropuits adaptés à la croissance d’agrégats cellulaires, caractérisée en ce qu’elle comprend une première couche d’hydrogel biocompatible comprenant les micropuits posée sur une plaque support en matériau rigide caractérisé en ce que la distance entre le fond des micropuits et la surface de la plaque support va de 50 à 500 pm, avantageusement de 100 à 300 pm, préférentiellement de 150 à 250 pm.The present invention relates to a plate of microwells suitable for the growth of cellular aggregates, characterized in that it comprises a first layer of biocompatible hydrogel comprising the microwells placed on a support plate of rigid material characterized in that the distance between the bottom of the microwells and the surface of the support plate ranges from 50 to 500 μm, advantageously from 100 to 300 μm, preferably from 150 to 250 μm.
Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, la plaque support est en matériau rigide transparent aux rayonnements lumineux, plus particulièrement pour permettre un usage en microscopie optique à fort grossissement.According to a preferred embodiment of the invention, the support plate is made of a rigid material transparent to light radiation, more particularly to allow use in optical microscopy at high magnification.
Par « transparent aux rayonnements lumineux » on entend un matériau qui est transparent à des rayonnements lumineux allant de l’ultra-violet à l’infra-rouge, en particulier dans le spectre lumineux visible.By "transparent to light radiation" is meant a material which is transparent to light radiation ranging from ultra violet to infrared, in particular in the visible light spectrum.
La plaque support est avantageusement une plaque de verre, ou plus particulièrement une lamelle de verre, d’une épaisseur adaptée à une observation par microscopie à fort grossissement, en particulier une épaisseur de 100 à 170 pm.The support plate is advantageously a glass plate, or more particularly a glass slide, of a thickness suitable for observation by microscopy at high magnification, in particular a thickness of 100 to 170 μm.
Les hydrogels biocompatibles sont bien connus de l’homme du métier, en particulier les hydrogels d’agarose (Napolitano & al., BioTechniques, 2017, 43, No. 4; Gong & al., 2015, PLOS ONE, 10(6)) ou les hydrogels à base de gélatine méthacryloyl (Loessner & al., 2016, Nature Protocol 11(4):727-746).Biocompatible hydrogels are well known to those skilled in the art, in particular agarose hydrogels (Napolitano & al., BioTechniques, 2017, 43, No. 4; Gong & al., 2015, PLOS ONE, 10 (6) ) or methacryloyl gelatin hydrogels (Loessner & al., 2016, Nature Protocol 11 (4): 727-746).
L’hydrogel biocompatible selon l’invention est stable à des températures proches de la température ambiante, allant de 0°C à 30 °C.The biocompatible hydrogel according to the invention is stable at temperatures close to room temperature, ranging from 0 ° C to 30 ° C.
De préférence, l’hydrogel est un hydrogel d’agarose, en particulier un hydrogel comprenant essentiellement de l’agarose et de l’eau. L’agarose et les hydrogels d’agarose sont bien connus de l’homme du métier, en particulier dans le domaine de la biologie. Les hydrogels peuvent être préparés avec différentes rigidités en fonction de l’agarose employée et de sa concentration. Les différents types d’agarose et les propriétés des gels obtenus sont bien connus de l’homme du métier. On citera en particulier les agaroses commercialisés sous les dénominations Agarose Standard, Agarose Low Gelling Température et Agarose Ultra-Low Gelling Température par la société Sigma-Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) dans des qualités compatibles avec la croissance cellulaire et leur usage pour observer l’effet de stimuli sur la croissance cellulaire.Preferably, the hydrogel is an agarose hydrogel, in particular a hydrogel essentially comprising agarose and water. Agarose and agarose hydrogels are well known to those skilled in the art, particularly in the field of biology. Hydrogels can be prepared with different stiffnesses depending on the agarose used and its concentration. The different types of agarose and the properties of the gels obtained are well known to those skilled in the art. Mention will in particular be made of the agaroses marketed under the names Agarose Standard, Agarose Low Gelling Temperature and Agarose Ultra-Low Gelling Temperature by the company Sigma-Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) in qualities compatible with cell growth and their use to observe the effect of stimuli on cell growth.
Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, l’hydrogel biocompatible comprend de 1 à 5% en masse d’agarose par rapport à la masse totale de l’hydrogel, le reste étant essentiellement de l’eau.According to a preferred embodiment of the invention, the biocompatible hydrogel comprises from 1 to 5% by mass of agarose relative to the total mass of the hydrogel, the remainder being essentially water.
L’hydrogel peut éventuellement comprendre d’autres constituants, dans la mesure où ils ne viennent pas interférer avec la biocompatibilité de l’hydrogel, ni avec sa capacité à laisser librement diffuser les nutriments nécessaires à la culture cellulaire et les molécules de petite taille dont l’effet sur les agrégats cellulaires sera observé, par exemple il est possible de rajouter des nanoparticules fluorescentes à la taille et concentration souhaitée dans l’agarose liquide. Ces nanoparticules peuvent avantageusement être utilisées comme traçeurs pour mesurer les forces exercées par les agrégats cellulaires lors de leur croissance (Burnette,& al. (2014), The Journal of Cell Biology. 205(1), 83-96; Delanoë-Ayari, & al. (2010) Physical Review Letters, 105(24), 2-5; Style& al. (2014) Soft Matter, 10(23), 4047-4055).The hydrogel may possibly include other constituents, insofar as they do not interfere with the biocompatibility of the hydrogel, nor with its capacity to allow the nutrients necessary for cell culture and small molecules, including the effect on the cellular aggregates will be observed, for example it is possible to add fluorescent nanoparticles of the desired size and concentration in the liquid agarose. These nanoparticles can advantageously be used as tracers to measure the forces exerted by cellular aggregates during their growth (Burnette, & al. (2014), The Journal of Cell Biology. 205 (1), 83-96; Delanoë-Ayari, & al. (2010) Physical Review Letters, 105 (24), 2-5; Style & al. (2014) Soft Matter, 10 (23), 4047-4055).
De manière avantageuse, la couche d’hydrogel biocompabtible adhère à la face supérieure de la plaque support.Advantageously, the biocompatible hydrogel layer adheres to the upper face of the support plate.
A cet effet, la face supérieure de la plaque support au contact de l’hydrogel comprend un matériau qui favorise l’adhésion de la couche d’hydrogel biocompatible. Ce matériau peut être ajouté sur la face supérieure de la plaque support par un traitement de surface.For this purpose, the upper face of the support plate in contact with the hydrogel comprises a material which promotes the adhesion of the biocompatible hydrogel layer. This material can be added to the upper face of the support plate by a surface treatment.
Lorsque l’hydrogel est un hydrogel d’agarose, la face supérieure du support rigide est avantageusement traitée par l’ajout d’une couche de silane, notamment par greffage de silane à la surface de la plaque support.When the hydrogel is an agarose hydrogel, the upper face of the rigid support is advantageously treated by the addition of a layer of silane, in particular by grafting silane to the surface of the support plate.
Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, la plaque support est une plaque de verre dont la face supérieure est traitée par l’ajout d’une couche de silane. L’homme du métier connaît bien les méthodes de modification de la surface de la plaque support avec des silanes et les silanes susceptibles d’être employés, en particulier pour les supports en verre avec des silanes, notamment en reprenant les technologies employées de manière usuelle pour modifier la surface des matériaux utilisés dans les systèmes microfluidiques (Séguin& al. (2010) Applied Surface Science, 256(8), 2524-2531 ; Wu & al. (2011) Surface and Coatings Technology, 205(10), 3182-3189 ; Zhou & al. (2012) Electrophoresis, 33(1), 89-104).According to a preferred embodiment of the invention, the support plate is a glass plate, the upper face of which is treated by the addition of a layer of silane. Those skilled in the art are well aware of the methods of modifying the surface of the support plate with silanes and the silanes capable of being used, in particular for glass supports with silanes, in particular by adopting the technologies used in the usual manner. to modify the surface of materials used in microfluidic systems (Séguin & al. (2010) Applied Surface Science, 256 (8), 2524-2531; Wu & al. (2011) Surface and Coatings Technology, 205 (10), 3182- 3189; Zhou & al. (2012) Electrophoresis, 33 (1), 89-104).
Parmi les silanes susceptibles d’être employés on citera notamment les silanes à terminaison mercapto comme le 3-mercaptopropyltrimethoxysilane et de manière préférée les silanes à terminaisons amines, qui permettent d’avoir des groupements amines à la surface du support rigide, facilitant ainsi l’accroche ultérieure du gel. Comme silanes à terminaison amines on citera en particulier l’amino-propyl-triethoxysilane (APTS), le 3-amino-propyl-trimethoxysilane, le 3amino-propyl-methyldiethoxysilane et le méthylamino-propyl-trimethoxysilane, de préférence l’APTS.Among the silanes capable of being used, mention will be made in particular of mercapto-terminated silanes such as 3-mercaptopropyltrimethoxysilane and preferably amine-terminated silanes, which make it possible to have amine groups on the surface of the rigid support, thus facilitating the subsequent attachment of the gel. As amine-terminated silanes, mention will be made in particular of amino-propyl-triethoxysilane (APTS), 3-amino-propyl-trimethoxysilane, 3 amino- propyl-methyldiethoxysilane and methylamino-propyl-trimethoxysilane, preferably APTS.
Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, la plaque support est une plaque de verre, particulièrement une lamelle de verre, dont la face supérieure au contact de l’hydrogel comprend une couche de silane, de préférence l’APTS.According to a preferred embodiment of the invention, the support plate is a glass plate, particularly a glass slide, the upper face of which in contact with the hydrogel comprises a layer of silane, preferably APTS.
L’épaisseur de la couche d’hydrogel dépendra essentiellement de la profondeur recherchée pour les puits. Avantageusement, la couche d’hydrogel a une épaisseur de 200 à 1000 pm, de préférence de 500 pm environ.The thickness of the hydrogel layer will essentially depend on the depth desired for the wells. Advantageously, the hydrogel layer has a thickness of 200 to 1000 μm, preferably approximately 500 μm.
Les micropuits ont des dimensions appropriées pour l’usage recherché d’observation des agrégats cellulaires. II s’agit généralement de dimensions « standard » que l’on retrouve habituellement dans les plaques de micropuits employées dans les laboratoires de biologies, notamment adaptés aux matériels et aux outils, robots et appareils employés dans ces laboratoires.The microwells have dimensions suitable for the intended use for observing cellular aggregates. These are generally "standard" dimensions that are usually found in microwell plates used in biology laboratories, particularly adapted to the materials and tools, robots and devices used in these laboratories.
Ces dimensions standard vont permettre à l’homme du métier d’employer les plaques selon l’invention avec les mêmes outils, robots et appareils de laboratoire que les plaques usuelles de micropuits.These standard dimensions will enable a person skilled in the art to use the plates according to the invention with the same tools, robots and laboratory devices as the usual microwell plates.
En particulier, les micropuits ont un diamètre d’au moins 5 pm environ, voire d’au moins 50 pm, généralement de 100 à 500 pm, voir plus.In particular, the microwells have a diameter of at least about 5 μm, or even at least 50 μm, generally from 100 to 500 μm, or even more.
Les plaques comprennent généralement 0,5 à 11 puits/mm2 lesquels sont avantageusement répartis régulièrement sur un repère orthonormé.The plates generally comprise 0.5 to 11 wells / mm 2 which are advantageously distributed regularly over an orthonormal reference frame.
Avantageusement tous les micropuits d’une même plaque ont les mêmes dimensions.Advantageously, all the microwells of the same plate have the same dimensions.
Ces plaques sont avantageusement dimensionnées pour être employées dans des plaques multipuits standard (les multipuits des marques Falcon ou Corning très utilisés en biologie par exemple) ainsi que plaques dédiées à la vidéo-microscopie (lamelles de verre par exemple).These plates are advantageously sized to be used in standard multi-well plates (multi-wells of the Falcon or Corning brands widely used in biology for example) as well as plates dedicated to video microscopy (glass slides for example).
L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une plaque de micropuits selon l’invention telle que définie précédemment et dans les exemples, ledit procédé comprenant les étapes de préparer un moule inerte vis-à-vis de l’hydrogel biocompatible, ledit moule comprenant une plaque sensiblement plane et une pluralité de doigts s’élevant perpendiculairement à la plaque, la plaque correspondant à la face supérieure de la couche d’hydrogel biocompatible et chaque doigt correspondant à un puit de la couche d’hydrogel biocompatible, appliquer sur le moule inerte une quantité appropriée d’une solution de gélifiant biocompatible, appliquer sur la solution de gélifiant biocompatible une plaque de support en matériau rigide transparent de manière à étaler ladite solution sur une épaisseur constante dans le moule, laisser gélifier la solution de gélifiant en hydrogel biocompatible, et démouler la plaque de micropuits obtenue.The invention also relates to a process for preparing a microwell plate according to the invention as defined above and in the examples, said process comprising the steps of preparing a mold inert with respect to the biocompatible hydrogel, said mold comprising a substantially flat plate and a plurality of fingers rising perpendicular to the plate, the plate corresponding to the upper face of the biocompatible hydrogel layer and each finger corresponding to a well of the biocompatible hydrogel layer, apply to the mold inert an appropriate quantity of a biocompatible gelling solution, apply to the biocompatible gelling solution a support plate in transparent rigid material so as to spread said solution on a constant thickness in the mold, let the gelling solution gel biocompatible hydrogel, and unmold the microwell plate obtained.
De manière avantageuse, le moule est en polydiméthylsiloxane (PDMS).Advantageously, the mold is made of polydimethylsiloxane (PDMS).
Ce moule, négatif de la plaque de micropuits obtenue, peut être préparé par moulage dans un premier moule reprenant les caractéristiques dimensionnelles de la plaque selon l’invention que l’homme du métier cherche à obtenir. Ce premier moule peut être préparé avantageusement sur plaque de silicium (wafer de silicium), par des techniques bien connues de photolithographie, employées dans les domaines de l’électronique ou de la microfluidique (Zhao & al. (1997), Journal of Materials Chemistry, 7(7), 1069-1074).This mold, negative of the microwell plate obtained, can be prepared by molding in a first mold incorporating the dimensional characteristics of the plate according to the invention that the skilled person seeks to obtain. This first mold can be advantageously prepared on a silicon wafer, by well-known photolithography techniques, used in the fields of electronics or microfluidics (Zhao & al. (1997), Journal of Materials Chemistry , 7 (7), 1069-1074).
Dans le procédé selon l’invention, l’étape de préparation du moule comprend son chauffage à une température de 30 à 100 °C, pour recevoir la solution de gélifiant biocompatible, qui est elle-même généralement chauffée pour rester sous forme de solution, la gélification se faisant à température ambiante, voire, selon le gélifiant employé à une température proche de 0°C.In the process according to the invention, the step of preparing the mold comprises heating it to a temperature of 30 to 100 ° C., to receive the solution of biocompatible gelling agent, which is itself generally heated to remain in the form of a solution, gelling takes place at room temperature, or even, depending on the gelling agent used at a temperature close to 0 ° C.
L’homme du métier saura déterminer la concentration en gélifiant employée en fonction du gélifiant et de la rigidité recherchée pour la couche d’hydrogel. Il saura également déterminer la quantité de solution de gélifiant à appliquer sur le moule inerte en fonction du volume total d’hydrogel, lui-même fonction de la taille des micropuits et leur nombre.A person skilled in the art will be able to determine the concentration of gelling agent used as a function of the gelling agent and of the rigidity sought for the hydrogel layer. He will also be able to determine the quantity of gelling solution to be applied to the inert mold as a function of the total volume of hydrogel, itself a function of the size of the microwells and their number.
L’invention concerne aussi l’utilisation d’une plaque de micropuits selon l’invention, définie ci-dessus et dans les exemples, pour la culture d’agrégats cellulaires dans les micropuits et en particulier pour l’analyse des réactions d’agrégats cellulaires cultivés dans les micropuits en réponse à un stimulus.The invention also relates to the use of a microwell plate according to the invention, defined above and in the examples, for the culture of cellular aggregates in the microwells and in particular for the analysis of the reactions of aggregates. cells grown in microwells in response to a stimulus.
L’invention concerne aussi un procédé pour l’observation des réactions d’agrégats cellulaires en réponse à un stimulus, lequel comprend les étapes de ensemencer les micropuits d’une plaque selon l’invention avec au moins une cellule, apporter aux cellules dans les micropuits les nutriments nécessaires à leur croissance et à la formation d’agrégats cellulaires, soumettre les agrégats cellulaires formés à un stimulus et observer les réactions des agrégats en réponse à ce stimulus.The invention also relates to a method for observing the reactions of cellular aggregates in response to a stimulus, which comprises the steps of inoculating the microwells of a plate according to the invention with at least one cell, supplying the cells in the microwells the nutrients necessary for their growth and for the formation of cellular aggregates, subjecting the cellular aggregates formed to a stimulus and observing the reactions of the aggregates in response to this stimulus.
Les observations peuvent être faites avantageusement par microscopie à très fort grossissement (x40, x63, x100).The observations can advantageously be made by microscopy at very high magnification (x40, x63, x100).
Après soumission aux stimuli, les agrégats cellulaires peuvent être récupérés pour d’autres analyses sans affecter leur structure et leur composition.After submission to the stimuli, cell aggregates can be recovered for further analysis without affecting their structure and composition.
Ces différents stimuli peuvent être des produis toxiques, des candidats médicaments, des réactifs destinés à identifier la présence ou l’absence de certains marqueurs biologiques, etc.These different stimuli can be toxic products, drug candidates, reagents intended to identify the presence or absence of certain biological markers, etc.
Les atouts des plaques de micro-puits selon l’invention sont :The advantages of the microwell plates according to the invention are:
la possibilité de fabriquer des centaines d’agrégats, en particulier de sphéroïdes reproductibles en un seul pipetage, la possibilité de contrôler la taille finale des agrégats, en particulier sphéroïdes, en adaptant le diamètre des micro-puits, d’avoir hydrogel permettant l’apport de nutriments et de molécules d’intérêts, matériau élastique aux petites déformations : il est possible de calculer les forces générées par les agrégats, en particulier les sphéroïdes, que tous les agrégats, notamment sphéroïdes, obtenus sont sur un même plan optique, ce qui facilite la vidéomicroscopie, la compatibilité avec la microscopie à haute résolution, la possibilité d’incuber et de laver les agrégats, notamment sphéroïdes, avec différentes solutions sans les perdre ou les détériorer mécaniquement, qu’il est facile de récupérer les agrégats, notamment sphéroïdes, afin d’effectuer des analyses moléculaires et génétiques sur les mêmes échantillons (RT-PCR ; western blots, histologie, immuno-histochimie), le transfert dans des laboratoires de biologie cellulaire/analyse clinique des biopsies est facilement envisageable.the possibility of manufacturing hundreds of aggregates, in particular of reproducible spheroids in a single pipetting, the possibility of controlling the final size of the aggregates, in particular spheroids, by adapting the diameter of the micro-wells, of having hydrogel allowing the contribution of nutrients and molecules of interest, elastic material with small deformations: it is possible to calculate the forces generated by the aggregates, in particular the spheroids, that all the aggregates, in particular spheroids, obtained are on the same optical plane, this which facilitates videomicroscopy, compatibility with high resolution microscopy, the possibility of incubating and washing aggregates, in particular spheroids, with different solutions without losing or mechanically damaging them, that it is easy to recover the aggregates, in particular spheroids, to perform molecular and genetic analyzes on the same samples illons (RT-PCR; western blots, histology, immunohistochemistry), transfer to cell biology laboratories / clinical analysis of biopsies is easily possible.
DESCRIPTION DES FIGURESDESCRIPTION OF THE FIGURES
La Figure 1 représente une vue en coupe d’une plaque de micropuits selon l’invention.Figure 1 shows a sectional view of a microwell plate according to the invention.
La Figure 2 représente un exemple de micropuits disposés dans une plaque 24 puits standard. (A) Dans cet exemple, chaque puits comporte 130 micropuits de 200 pm de diamètre. (B) illustration d’agrégats cellulaires de 200 pm de diamètre (sphères noire) obtenus après 6 jours de culture (pris en microscopie à lumière blanche).Figure 2 shows an example of microwells arranged in a standard 24-well plate. (A) In this example, each well has 130 microwells 200 μm in diameter. (B) illustration of cell aggregates 200 µm in diameter (black spheres) obtained after 6 days of culture (taken under white light microscopy).
EXEMPLESEXAMPLES
Etape 1) Fabrication du moule sur wafer de silicium (h=250 pm, modulable si besoin)Step 1) Manufacture of the mold on silicon wafer (h = 250 pm, modular if necessary)
La fabrication du moule utilise les techniques classiques de photo-lithographie. Brièvement une résine photosensible (SU8 2100) est étalée de manière uniforme par centrifugation (500 tr/min, 10s puis 1200 tr/min, 30s). Cette résine est ensuite cuite (75°C, 20 min, puis 95 °C, 1 h), puis exposée aux UVs (360 mJ/cm2). La résine est recuite afin de solidifier l’accroche (75°C, 10 min puis 95 °C, 5 min). Enfin, le motif est développé (solution de PGMEA, 18 min) afin d’enlever la résine non exposée aux UVs. Ce 1er moule ainsi réalisé est ensuite silanisé la nuit avant d’être utilisable pour mouler le contre-moule en PDMS (étape 2). Ce moule peut être réutilisé pendant plusieurs années sans détérioration.The manufacture of the mold uses conventional photo-lithography techniques. Briefly, a photosensitive resin (SU8 2100) is spread uniformly by centrifugation (500 rpm, 10 s then 1200 r / min, 30 s). This resin is then cured (75 ° C, 20 min, then 95 ° C, 1 h), then exposed to UVs (360 mJ / cm 2 ). The resin is annealed in order to solidify the grip (75 ° C, 10 min then 95 ° C, 5 min). Finally, the pattern is developed (PGMEA solution, 18 min) in order to remove the resin not exposed to UVs. This first mold thus produced is then silanized overnight before being usable for molding the counter mold in PDMS (step 2). This mold can be reused for several years without deterioration.
Etape 2) Fabrication d’un contre-moule en PDMSStep 2) Manufacturing a PDMS counter mold
On utilise comme polymère le PolyDiMethylSiloxane (PDMS) pour obtenir un contre-moule réutilisable plusieurs fois. La base et le réticulant sont mélangés (rapport 10 :1 en masse), puis mis sous vide pendant 30 min afin d’éliminer les bulles. Le PDMS est alors étalé sur le moule en silicium et recuit 2h à 75°C.PolyDiMethylSiloxane (PDMS) is used as polymer to obtain a counter-mold which can be reused several times. The base and the crosslinker are mixed (10: 1 ratio by mass), then put under vacuum for 30 min in order to remove the bubbles. The PDMS is then spread on the silicon mold and annealed for 2 hours at 75 ° C.
Après recuit, le PDMS est décollé du moule en silicium. Il constitue notre contre-moule sur lequel nous allons mouler l’agarose (étape 4).After annealing, the PDMS is detached from the silicon mold. It constitutes our counter-mold on which we will mold the agarose (step 4).
Etape 3) Fonctionalisation des lamelles de verre pour pouvoir faire adhérer les micro-puitsStep 3) Functionalization of the glass slides to be able to adhere the micro-wells
Les lamelles de verre sont fonctionnalisées avec l’amino-propyltri(ethoxy)silane (APTS 1%, dans une solution d’acide acétique 5 mM, 20 min, température ambiante sous agitation). Les lamelles sont ensuite lavées à l’eau distillée et recuit 15 min à 100°C (afin de solidifier la couche de silane). Les lamelles peuvent être préparées à l’avance et stockées à température ambiante, à l’abri de la poussière.The glass slides are functionalized with amino-propyltri (ethoxy) silane (APTS 1%, in a solution of acetic acid 5 mM, 20 min, room temperature with stirring). The coverslips are then washed with distilled water and annealed for 15 min at 100 ° C (to solidify the silane layer). The coverslips can be prepared in advance and stored at room temperature, protected from dust.
Etape 4) Moulage des micro-puits en agaroseStep 4) Molding of agarose micro-wells
Les micro-puits ont été moulés à partir de 2 types d’agarose, à choisir en fonction de la rigidité souhaité (voir tableau 1). Les contre-moules en PDMS sont disposés sur une plaque chauffante (à 78°C ou 50°C selon le type d’agarose utilisé, voir tableau 1). L’agarose est préparé en mélangeant la poudre (% selon tableau 1) avec de l’eau distillé. La poudre d’agarose est dissoute dans l’eau distillée à l’aide d’un autoclave. La solution ainsi obtenue est maintenue à l’état liquide à l’aide d’un bain à sec maintenu à la bonne température (Tableau 1). Un volume d’agarose (déterminé en fonction de la taille des puits à mouler, cf. Tableau 2) est ensuite déposé sur les contre-moules en PDMS chaud. Une lamelle fonctionnalisée à l’APTS est ensuite déposée sur la goutte d’agarose afin de l’étaler sur une épaisseur constante. L’ensemble (moule PDMS-agarose-lamelle) est alors retiré de la plaque chauffante et laissé à gélifier selon le temps et la température indiqué dans le tableau 1.The micro-wells were molded from 2 types of agarose, to be chosen according to the desired stiffness (see table 1). The PDMS counter molds are placed on a hot plate (at 78 ° C or 50 ° C depending on the type of agarose used, see Table 1). The agarose is prepared by mixing the powder (% according to table 1) with distilled water. The agarose powder is dissolved in distilled water using an autoclave. The solution thus obtained is maintained in the liquid state using a dry bath maintained at the right temperature (Table 1). A volume of agarose (determined as a function of the size of the wells to be molded, cf. Table 2) is then deposited on the counter molds in hot PDMS. A lamella functionalized with APTS is then deposited on the agarose drop in order to spread it over a constant thickness. The whole (PDMS-agarose-coverslip mold) is then removed from the hot plate and left to gel according to the time and the temperature indicated in table 1.
Tableau 1. Paramètres utilisés pour la fabrication des micropuits en agarose.Table 1. Parameters used for the manufacture of agarose microwells.
Tableau 2. Volume d’agarose à déposer sur les différents moules en PDMS pour un moule de 20 mm de diamètreTable 2. Volume of agarose to be deposited on the various PDMS molds for a 20 mm diameter mold
Etape 5) Ensemencement des cellules dans les micro-puitsStep 5) Seeding of cells in micro-wells
Une fois l’agarose gélifié, les micropuits sont démoulés, placé dans du PBS et stérilisé par traitement UV. Ces micro-puits peuvent être gardés ainsi plusieurs jours à 4°C sans détérioration.Once the agarose has gelified, the microwells are removed from the mold, placed in PBS and sterilized by UV treatment. These micro-wells can be kept for several days at 4 ° C without deterioration.
Les micro-puits sont ensuite incubés avec du milieu de culture (2h), avant de les ensemencer avec des cellules (1.2 105 cellules total, dans 3 mL par puits).The micro-wells are then incubated with culture medium (2 h), before inoculating them with cells (1.2 × 10 5 cells total, in 3 ml per well).
RÉFÉRENCESREFERENCES
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Cited By (4)
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