FR3073047A1 - Procede optique d'estimation d'un volume representatif de particules presentes dans un echantillon - Google Patents

Procede optique d'estimation d'un volume representatif de particules presentes dans un echantillon Download PDF

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Abstract

L'invention est un procédé d'estimation d'un volume représentatif de particules d'intérêt (10i) baignant dans un échantillon, l'échantillon s'étendant selon au moins un plan, dit plan de l'échantillon (P10), l'échantillon comportant un agent sphérisant, apte à modifier la forme des particules, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) selon un axe de propagation (Z) ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (I0) de l'échantillon (10), formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (14) dite d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image (16) sous l'effet de l'illumination ; c) utilisation de l'image de l'échantillon (I0), acquise lors de l'étape b), et d'un opérateur de propagation holographique, pour calculer une expression complexe (A(x,y, z)) de l'onde lumineuse d'exposition (14) en différentes positions par rapport au plan de détection; le procédé comportant une étape d'estimation du volume représentatif (V) des particules d'intérêt (10i) en fonction des expressions complexes calculées lors de l'étape c)

Description

Procédé optique d'estimation d'un volume représentatif de particules présentes dans un échantillon
Description
DOMAINE TECHNIQUE
Le domaine technique de l'invention est l'estimation d'un volume représentatif de particules dans un échantillon liquide, comportant notamment un liquide biologique. Une application visée est l'estimation du volume moyen de globules rouges dans un échantillon sanguin.
ART ANTERIEUR
De nombreux développements ont eu lieu ces dernières années dans le domaine de l'imagerie sans lentille pour des applications biologiques. Les principes de l'imagerie sans lentille ont été décrits dans le document W02008090330, présentant un dispositif pour l'observation d'échantillons comportant des cellules par imagerie sans lentille. L'échantillon est disposé entre une source de lumière et un capteur d'image, sans disposer de lentille de grossissement optique entre l'échantillon et le capteur d'image. Ainsi, le capteur d'image collecte une image d'une onde lumineuse transmise par l'échantillon. Cette image, également appelée hologramme, est formée de figures d'interférences entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. Ces figures d'interférences sont généralement composées d'une succession d'anneaux concentriques. Elles sont parfois dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ». On acquiert ainsi des images, dont le champ d'observation est nettement plus important que celui d'un microscope. Lorsque la concentration en cellules de l'échantillon est suffisamment faible, à chaque cellule peut être associée une figure d'interférences ; leur dénombrement permet la numération des cellules présentes dans l'échantillon. Mais l'hologramme ne permet pas un comptage fiable des cellules lorsque la concentration augmente.
Afin de prendre en compte cette limitation, des algorithmes de reconstruction holographiques ont été développés, permettant une meilleure caractérisation des cellules biologiques observées par imagerie sans lentille. La demande de brevet WO2016151248 décrit par exemple un procédé, basé sur l'acquisition d'une image par un dispositif d'imagerie sans lentille, et permettant d'identifier une cellule sanguine.
Des travaux ont également été menés, avec l'objectif d'estimer le volume de cellules sanguines, et en particulier des globules rouges. La publication Roy M. et al, low-cost telemedicine device performing cell and particule size measurement based on lens-free shadow imaging technology, Biosensors and Bioelectronics 67 (2015) 715-723 décrit un procédé d'estimation du volume de globules rouges basé sur une analyse des figures de diffraction formées sur une image acquise par un capteur d'image. La mise en œuvre d'un tel procédé s'accommode difficilement d'une concentration élevée de globules rouges. En effet, lorsque la concentration augmente, les figures de diffraction se superposent, rendant difficile leur caractérisation précise. Aussi, cette méthode est principalement destinée à des échantillons sanguins très dilués.
La publication Seo S et al, High-Throughput lens-free blood analysis on a chip, Anal Chem. 2010 June 1 ; 82(11): 4621-4627 propose une méthode basée sur une reconstruction holographique d'une image acquise par un capteur d'image dans une configuration d'imagerie sans lentille. La reconstruction holographique vise à obtenir une image reconstruite représentative de la phase de l'onde lumineuse se propageant entre l'échantillon sanguin analysé et le capteur d'image. L'image reconstruite présente une résolution nettement améliorée par rapport à l'image acquise par le capteur d'image, et son analyse permet une estimation du volume de globules rouges présents dans l'échantillon. L'image de phase reconstruite permet d'estimer une aire de chaque globule rouge, tandis que la valeur de la phase constitue un indicateur de leur épaisseur. Ainsi, on attribue à chaque globule rouge une aire et une valeur de phase, le volume étant estimé par le produit de l'aire et de l'épaisseur, déduite de la phase mesurée en faisant une hypothèse sur la valeur de l'indice de réfraction.
Les inventeurs de la présente invention ont observé qu'une telle méthode présente des limitations, en particulier liées à la position des globules rouges dans l'échantillon, et/ou à leur orientation. Ils proposent une méthode plus fiable et moins contraignante pour estimer un volume caractéristique de particules sanguines, et en particulier de globules rouges. L'invention permet notamment une estimation du volume moyen des globules rouges.
EXPOSE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est un procédé d'estimation d'un volume représentatif de particules d'intérêt baignant dans un échantillon, ou d'estimation d'une dispersion du volume desdites particules d'intérêt, l'échantillon s'étendant selon au moins un plan, dit plan de l'échantillon, l'échantillon comportant un agent sphérisant, apte à modifier la forme des particules, le procédé comportant les étapes suivantes :
a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation;
b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse dite d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image sous l'effet de l'illumination ;
c) utilisation de l'image de l'échantillon, acquise lors de l'étape b), et d'un opérateur de propagation holographique, pour calculer une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition en différentes positions distantes du plan de détection;
le procédé comportant une étape d'estimation d'un volume représentatif des particules d'intérêt en fonction des expressions complexes calculées lors de l'étape c), ou d'un indice quantifiant une dispersion des volumes des particules d'intérêt de l'échantillon.
Le volume représentatif caractérise les particules d'intérêt. Il peut s'agir d'un volume moyen des particules d'intérêt, ou d'un volume médian des particules d'intérêt, ou encore du volume de chaque particule d'intérêt, prise individuellement l'une de l'autre. Dans ce dernier cas, l'invention permet d'obtenir une distribution des volumes d'intérêt. Il peut également s'agir du volume total des particules dans l'échantillon.
Selon un premier mode de réalisation, le volume représentatif des particules d'intérêt est estimé par le calcul d'une image complexe correspondant à une distribution de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition selon un plan dans lequel s'étend l'échantillon, de préférence parallèlement au plan de détection. Un tel mode de réalisation permet une estimation simple d'un volume représentatif des particules d'intérêt, basée sur une hypothèse de sphéricité de chaque particule d'intérêt, hypothèse légitime étant donné l'étape de sphérisation. Selon ce premier mode de réalisation, le procédé peut comporter une formation d'une image complexe dans le plan de l'échantillon. Il peut également comporter :
une détection, à partir de l'image complexe, de régions d'intérêt, chaque région d'intérêt étant associée à une particule d'intérêt ;
une détermination d'une taille de chaque région d'intérêt ;
l'estimation du volume représentatif des particules d'intérêt étant effectuée en fonction de ladite taille, chaque particule d'intérêt étant considérée comme sphérique.
Selon un deuxième mode de réalisation, le volume représentatif des particules d'intérêt est estimé par le calcul d'une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition à différentes distances du plan de détection. Un tel mode de réalisation est robuste vis-à-vis de la position des particules d'intérêt dans l'échantillon. Ce mode de réalisation peut comporter les étapes suivantes :
d) détermination des positions planaires respectives de plusieurs particules d'intérêt dans un plan parallèle au plan de détection, chaque position planaire étant associée à une particule d'intérêt;
e) à partir des expressions complexes calculées lors de l'étape c), calcul d'au moins une grandeur caractéristique de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition à chaque position planaire, et à une pluralité de distances du plan de détection;
f) formation d'un profil, représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape e) selon un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par chaque position planaire déterminée lors de l'étape d), chaque profil étant associé à une particule d'intérêt ;
g) estimation d'un volume représentatif des particules d'intérêt en fonction des profils formés lors de l'étape f).
Selon ce mode de réalisation, l'étape c) comporte de préférence une formation d'une pile d'images complexes, chaque image complexe formant une distribution de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition selon un plan de reconstruction. Chaque plan de reconstruction est de préférence parallèle au plan de détection. La formation de la pile d'images complexes peut comporter les sous-étapes suivantes :
ci) à partir de l'image acquise lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation, de façon à calculer une image complexe, dite image de référence, représentative de l'onde lumineuse d'exposition, dans un plan de référence;
cii) application d'un opérateur de propagation à l'image de référence, de façon à obtenir des images complexes, dites images complexes secondaires, à différentes distances du plan de référence selon l'axe de propagation, les images complexes secondaires et l'image de référence formant la pile d'images complexes.
Le plan de référence peut être le plan de l'échantillon.
La formation de la pile d'images complexes peut comporter le calcul, à partir de l'image acquise, de plusieurs images complexes à différentes distances du plan de détection, selon l'axe de propagation.
Dans un mode de réalisation, lors de l'étape d), la position planaire de chaque particule d'intérêt est déterminée à partir d'une image complexe de la pile d'images complexes. L'étape d) comporte alors les sous-étapes suivantes :
di) détection de particules dans l'image complexe ;
dii) sélection, parmi les particules détectées, de particules d'intérêt.
Selon un mode de réalisation, l'étape e), la grandeur caractéristique comprend le module ou la phase d'une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition.
Selon un mode de réalisation, le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen desdites particules. Lors de l'étape g), le volume moyen des particules d'intérêt est estimé en appliquant une métrique à chaque profil formé lors de l'étape f), de façon à obtenir un paramètre pour chaque profil et en effectuant une moyenne des paramètres de chaque profil.
Selon un mode de réalisation, dans lequel le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen desdites particules ; lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, le volume moyen des particules d'intérêt correspond à un volume globulaire moyen de l'échantillon.
Selon un mode de réalisation, le procédé comporte l'établissement d'un paramètre représentant une dispersion des volumes respectifs des particules d'intérêt. Il peut également comporter une détermination d'un indice de répartition des globules rouges.
Selon un mode de réalisation, le procédé comporte une détermination d'une quantité de particules d'intérêt dans l'échantillon. Lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, le procédé peut comporter une étape de détermination d'un taux d'hématocrite à partir du volume moyen des particules d'intérêt et de la quantité de particules d'intérêt dans l'échantillon. Un deuxième objet de l'invention est un dispositif pour l'estimation d'un volume représentatif de particules d'intérêt disposées dans un échantillon, le dispositif comportant :
- une source de lumière apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon ;
- un support, configuré pour maintenir l'échantillon entre la source de lumière et un capteur d'image;
un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image et pour mettre en œuvre au moins l'étape c) du procédé selon le premier objet de l'invention, le processeur étant configuré pour estimer le volume représentatif des particules d'intérêt à partir des expressions complexes calculées lors de l'étape c). Le processeur peut être configuré pour mettre en œuvre les étapes d) à g) décrites en lien avec le premier objet de l'invention.
D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous.
FIGURES
La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention.
La figure 2 montre les principales étapes d'un premier mode de réalisation de l'invention.
Les figures 3A et 3B représentent des estimations de la taille de globules rouges obtenues en mettant en œuvre le premier mode de réalisation. La figure 3C illustre une comparaison entre les volumes globulaires moyens d'échantillons sanguins respectivement estimés selon le premier mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. La figure 3D illustre une comparaison entre les taux d'hématocrite de différents échantillons respectivement estimés selon le premier mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. La figure 3E illustre l'établissement d'une calibration du premier mode de réalisation, avec et sans utilisation d'un agent sphérisant. Chaque calibration vise à établir une relation entre une dimension, donnée par le premier mode de réalisation, et un volume globulaire moyen, obtenu par une méthode de référence. La figure 3F montre une comparaison entre le volume globulaire moyen en utilisant respectivement une méthode de référence et le premier mode de réalisation, avec et sans utilisation d'un agent sphérisant.
La figure 4A illustre les principales étapes d'un deuxième mode de réalisation de l'invention. La figure 4B détaille l'étape 210 de la figure 4A dans un mode de réalisation particulier. La figure 4C schématise certaines étapes mentionnées sur la figure 4A.
Les figures 4D et 4E montrent des exemples de métriques appliquées à des profils.
Les figures 5A et 5B sont des images au microscope d'un échantillon de sang respectivement sans et avec un agent sphérisant.
Les figures 5C et 5D montrent des profils du module d'une expression complexe obtenue par reconstruction holographique à partir d'une image formée par le capteur d'image du dispositif. Chaque profil de la figure 5C correspond à un globule rouge sans ajout d'un agent sphérisant dans l'échantillon analysé. Chaque profil de la figure 5D correspond à un globule rouge avec ajout d'un agent sphérisant dans l'échantillon analysé. Les figures 5E et 5F représentent des profils moyens calculés respectivement sur la base des profils représentés sur les figures 5C et 5D.
Les figures 5G et 5H représentent, pour différents échantillons comportant du sang, le volume globulaire moyen de chaque échantillon, exprimé en femtolitre, en fonction d'une moyenne de métriques calculées sur des profils correspondant à des globules rouges desdits échantillons. Les échantillons utilisés pour obtenir la figure 5G ne comportent pas d'agent sphérisant. Les échantillons utilisés pour obtenir la figure 5H comportent un agent sphérisant.
Les figures 51 et 5J représentent, pour différents échantillons comportant du sang, le volume globulaire moyen de chaque échantillon, exprimé en femtolitre, en fonction d'une moyenne de métriques calculées sur des profils correspondant à des globules rouges desdits échantillons. Les échantillons utilisés pour obtenir la figure 51 ne comportent pas d'agent sphérisant. Les échantillons utilisés pour obtenir la figure 5J comportent un agent sphérisant.
Les figures 6A et 6B montrent des profils de la phase d'une expression complexe obtenue par reconstruction holographique à partir d'une image formée par le capteur d'image du dispositif. Chaque profil de la figure 6A correspond à un globule rouge sans ajout d'un agent sphérisant dans l'échantillon analysé. Chaque profil de la figure 6B correspond à un globule rouge avec ajout d'un agent sphérisant dans l'échantillon analysé. Les figures 6C et 6D représentent des profils moyens calculés respectivement sur la base des profils représentés sur les figures 6A et 6B.
Les figures 7A à 7F représentent, pour différents échantillons comportant du sang, le volume globulaire moyen de l'échantillon en fonction d'une moyenne de métriques calculées sur des profils correspondant à des globules rouges des échantillons. Les figures 7A, 7C et 7E ont été obtenues sur la base d'une pile d'images complexes, dont chaque image complexe résulte d'une application d'un opérateur de propagation holographique à partir de l'image acquise par le capteur d'image. Les figures 7B, 7D et 7F ont été obtenues sur la base d'une pile d'images complexes, dont chaque image complexe résulte de l'application d'un opérateur de propagation holographique à une image complexe de référence, l'image complexe de référence ayant été obtenue par application d'un opérateur de propagation holographique à partir de l'image acquise par le capteur d'image.
Les figures 8A et 9A illustrent des comparaisons entre les volumes globulaires moyens respectivement estimés selon le deuxième mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. Sur la figure 8A, on a utilisé une première métrique ; sur la figure 9A, on a utilisé une deuxième métrique.
Les figures 8B et 9B illustrent des comparaisons entre les taux d'hématocrite de différents échantillons respectivement estimés selon le deuxième mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. Sur la figure 8B, on a utilisé une première métrique ; sur la figure 9B, on a utilisé une deuxième métrique.
Les figures 8C et 9C illustrent des comparaisons entre l'indice de distribution en volume des globules rouges de différents échantillons respectivement estimés selon le deuxième mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. Sur la figure 8C, on a utilisé une première métrique ; sur la figure 9C, on a utilisé une deuxième métrique.
La figure 10A représente différents plans de reconstruction disposés de part et d'autre d'un plan de focalisation.
La figure 10B représente une comparaison de coefficients de corrélation calculés entre:
des volumes globulaires moyens estimés par une méthode de référence ;
des volumes globulaires moyens respectivement estimés par le premier mode de réalisation et par le deuxième mode de réalisation.
La comparaison est réalisée en modifiant la position d'un plan de focalisation, selon lequel s'étendent la majorité des particules de l'échantillon.
EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale d'illumination Δλ.
L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il comprend notamment un milieu liquide 10m dans lequel baignent des particules, dites particules d'intérêt 10,. Le milieu 10m peut être un liquide tampon. Il peut également comporter un liquide corporel, à l'état pur ou dilué. Par liquide corporel, on entend un liquide généré par un corps vivant. Il peut en particulier s'agir, à titre non limitatif, de sang, d'urine, de liquide céphalorachidien, de sperme, de lymphe. Par particule, on entend notamment une cellule, par exemple une cellule sanguine, ou un microorganisme, par exemple une bactérie. L'invention s'applique notamment à une particule d'intérêt ayant, dans son état normal, une forme non sphérique. Dans les exemples décrits ci-après, les particules d'intérêt sont des globules rouges.
L'échantillon comporte également un agent dit sphérisant 10r, apte à modifier la tension de surface de la membrane délimitant les particules. Sous l'effet d'un tel agent, les particules d'intérêt 10, prennent une forme sphérique, ou se rapprochant de la forme d'une sphère. Ainsi, les particules d'intérêt 10, sont suffisamment souples et déformables de façon que leur morphologie puisse être modifiée sous l'action d'un tel agent. L'usage d'agents sphérisants pour déformer des globules rouges est connu, et a été décrit, dans des applications de cytométrie dans les documents US5633167, US8837803, ou US5284771. De tels agents permettent de modifier la forme d'un globule rouge. Il peut notamment s'agir d'un tensioactif, par exemple un tensioactif zwiterrionique. Il peut par exemple s'agir d'un dérivé de la glycine bétaïne, par exemple un alkylbétaïne, ou un alkylamido bétaïne (par exemple de la bétaïne de cocamidopropyle CAPB), un alkyle maltoside, un alkyle glucamide. Il peut s'agir de 3-(Λ/,Λ/Dimethyldodecylammonio)propanesulfonate. L'agent sphérisant 10r est de préférence dilué dans une solution tampon neutre et isotonique, par exemple un tampon phosphate, usuellement désigné par l'acronyme PBS (Phosphate Buffer Saline). L'homme du métier peut adapter le facteur de dilution, de telle sorte que le réactif sphérisant déforme suffisamment les particules d'intérêt 10,, sans les lyser. La concentration d'agent sphérisant est typiquement comprise entre 50 mg/l et 300 mg/l, préférentiellement 100 mg/l. L'échantillon peut comprendre du sang total dilué dans la solution d'agent sphérisant selon un facteur de dilution compris préférentiellement entre 1/400 et 1/1200.
L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une chambre fluidique de type Countess ® d'épaisseur e=100 pm. L'épaisseur e de la chambre fluidique 15, et donc de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation, varie typiquement entre 10 pm et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 pm et 500 pm. L'échantillon s'étend selon un plan ?io> dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Il est maintenu sur un support 10s à une distance d d'un capteur d'image 16.
Le réactif sphérisant est ajouté à l'échantillon avant introduction dans la chambre fluidique 15. Il peut également être ajouté postérieurement à cette introduction, ou au cours de cette introduction, en étant par exemple présent à l'état sec dans la chambre fluidique 15. La concentration en agent sphérisant dans l'échantillon est adaptée par l'homme du métier en fonction de l'échantillon utilisé.
L'échantillon peut comporter des particules 10; différentes des particules d'intérêt 10, que l'on souhaite analyser. Dans ce cas, le procédé comporte une étape de sélection, parmi les particules, des particules d'intérêt 10,. Cette étape est décrite par la suite.
La distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à un diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 pm et 1 mm, de préférence entre 50 pm et 500 pm. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 pm. Selon une autre configuration, le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif représenté sur la figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 80°. Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur.
De préférence, la bande spectrale d'émission Δλ de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale.
Selon un mode de réalisation, la source de lumière 11 comporte plusieurs sources de lumière élémentaires 11k, chacune étant apte à émettre une onde lumineuse incidente 12k dans une bande spectrale AÀk. De préférence, les bandes spectrales des différentes sources de lumière 11k sont différentes les unes des autres.
L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et le capteur d'image 16 précédemment évoqué. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan ?io selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Dans cet exemple, l'échantillon s'étend selon un plan XY, perpendiculaire à l'axe de propagation Z.
Le capteur d'image 16 est apte à former une image Io selon un plan de détection Po. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection Po s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance d entre la chambre fluidique 15 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 μιτ et 2 cm, de préférence comprise entre 100 μιτ et 2 mm.
On remarque, dans ce mode de réalisation, l'absence d'optique de grossissement ou de formation d'image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de détection.
Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les particules présentes dans l'échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection Po, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12' transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, désignée par le terme onde d'exposition, peut comprendre :
une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque particule de l'échantillon ;
une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon.
Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection Po. Aussi, l'image Io acquise par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), chaque figure d'interférences pouvant être associée à une particule de l'échantillon.
Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image Io acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20.
Une image Io acquise par le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet pas d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. Comme décrit en lien avec l'art antérieur, on peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation holographique h, de façon à calculer une grandeur complexe A représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14 en tout point de coordonnées (x,y,z) de l'espace, et en particulier dans un plan de reconstruction Pz situé à une distance \z\, dite distance de reconstruction, du capteur d'image 16. Le plan de reconstruction est de préférence le plan selon lequel s'étend l'échantillon ?w> avec :
A(x,y,z) = I0(x,y,z) * h, le symbole * désignant l'opérateur produit de convolution.
L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x, y,z), situé à une distance |z| du capteur d'image. L'expression complexe A de l'onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées (x, y, z)de l'espace, est telle que: A(x,y,z) = M(x,y,z)eip(x’y’z) (3). Il est possible de déterminer le module M(x, y, z) et/ou la phase φ (x, y, z) l'onde lumineuse 14, à la distance | z |, avec :
M(x,y,z)= abs [A(x,y,z)J ;
- φ(χ, y, z) = arg [ri (x, y, z)] ;
Les opérateurs abs et arg désignent respectivement le module et l'argument.
Dans la suite de cette description, les coordonnées (x,y) désignent une position planaire dans un plan radial XY perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La coordonnée z désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z.
L'expression complexe ri est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'amplitude de l'onde lumineuse d'exposition 14 détectée par le capteur d'image 16. Le produit de convolution de l'image Io par l'opérateur de propagation h permet d'obtenir une image complexe riz représentant une distribution spatiale de l'expression complexe ri dans un plan de reconstruction Pz, s'étendant à une distance |z| du plan de détection Po. Dans cet exemple, le plan de détection Po a pour équation z = 0. L'image complexe riz correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction Pz. Elle représente également une distribution spatiale bidimensionnelle de l'expression complexe ri décrivant l'onde d'exposition 14. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image Mz du module ou de la phase <pz de l'expression complexe décrivant l'onde lumineuse d'exposition 14, dans le plan de reconstruction. L'image du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 s'obtient respectivement selon les expressions suivantes :
Mz = mod (riz) et φζ = arg(riz).
L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : h (x, y,z) = e 72πΣθχρ (/π ^-).
La propagation d'une image Io acquise par un capteur d'image a déjà été décrite dans la publication Seo 2010, citée en lien avec l'art antérieur. Dans cette publication, une image de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 est reconstruite dans un plan parallèle au plan de détection. L'aire de chaque globule rouge, dans l'image de phase, est détectée par un algorithme de seuillage. Elle est ensuite multipliée par la valeur de l'épaisseur, obtenue en divisant la phase par l'indice optique supposé connu, de façon à obtenir une estimation du volume de chaque globule rouge. Les inventeurs ont constaté que selon la méthode décrite dans cette publication, il est préférable, si ce n'est indispensable, d'attendre que les globules rouges sédimentent, de façon à ce qu'ils s'accumulent selon un même plan, selon une même orientation. En effet, les globules rouges étant des particules biconcaves, l'estimation de leur volume à partir d'une image nécessite que leur orientation soit maîtrisée. A défaut, l'estimation du volume des globules rouges, peut être affectée d'une incertitude importante.
Cette difficulté est amoindrie par la présence de l'agent sphérisant dans l'échantillon. Les inventeurs ont en effet constaté qu'en présence d'un tel agent sphérisant, l'obtention d'une image complexe, dans un plan de reconstruction, permet une estimation correcte du volume des globules rouges, ou de leur volume moyen. La question de leur orientation ne se pose plus, puisque leur forme est sphérique. Il n'est donc pas besoin d'attendre une quelconque sédimentation.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, on estime un volume moyen de particules d'intérêt, en l'occurrence des globules rouges. Un tel volume est usuellement désigné par le terme volume globulaire moyen. Le procédé d'estimation suit les étapes représentées sur la figure 2.
Etape 100 : acquisition d'une image Io de l'échantillon par le capteur d'image 16. Un des intérêts de la configuration sans lentille, représentée sur la figure 1, est le large champ observé, permettant d'adresser simultanément un grand nombre de particules. Le champ observé dépend de la taille du capteur d'image 16, en étant légèrement inférieur à la surface de détection de ce dernier, du fait de l'espacement entre les pixels du capteur et l'échantillon. Le champ observé est généralement supérieur à 10 mm2, et est typiquement compris entre 10 mm2 et 50 mm2, ce qui est significativement plus élevé qu'avec un microscope.
Etape 110 : application d'un opérateur de propagation h à une image obtenue à partir de l'image Io acquise lors de l'étape 100 pour obtenir une image complexe Az dans un plan de reconstruction Pz. De préférence, l'opérateur de propagation est appliqué à l'image acquise /0, éventuellement normalisée par la valeur moyenne Io de l'image acquise. L'application de l'opérateur de propagation, par un produit de convolution tel que précédemment évoqué, permet de former une image complexe Az dans le plan de reconstruction Pz. Différentes façons d'obtenir une image complexe dans un plan de reconstruction sont présentées ci-après, en lien avec l'étape 210 du deuxième mode de réalisation.
Le plan de reconstruction Pz peut être défini en mettant en œuvre un algorithme de focalisation numérique, connu de l'homme du métier, consistant à effectuer différentes propagations dans différents plans de reconstruction, chaque plan étant situé à une distance de reconstruction différente du plan de détection. On établit un critère de netteté à partir de chaque image complexe reconstruite. Le plan de reconstruction finalement retenu, dit plan de focalisation Pfocus’ est celui Pour lequel le critère de netteté est optimal. Ce plan est un plan selon lequel s'étend l'échantillon, et selon lequel s'étendent la majorité des particules d'intérêt 10, présentes dans l'échantillon. De façon alternative, le plan de focalisation est déterminé a priori.
Etape 120 : formation d'une image, dite image d'observation Iobs, à partir du module ou de la phase de l'image complexe reconstruite. L'image d'observation Iobs permet une observation des particules de l'échantillon. L'image d'observation Iobs correspond à une image du module Mz ou de la phase <pz de l'image complexe Az formée dans le plan de reconstruction, en l'occurrence le plan de focalisation PfOCUS. Sur l'image d'observation Iobs, les particules d'intérêt 10, correspondent à une région d'intérêt ROIi ayant une forme prédéterminée. Du fait de la présence de l'agent sphérisant, il s'agit d'une forme circulaire, chaque particule d'intérêt 10, formant un disque. Une analyse morphologique de l'image du module ou de la phase permet de détecter chaque région d'intérêt ROIt associée à une particule d'intérêt 10,. Cette étape permet également d'obtenir un nombre Nt de particules d'intérêt 10,.
L'échantillon peut comporter d'autres particules 10;, de formes et/ou de tailles différentes de celles des particules d'intérêt 10,. L'analyse morphologique de l'image du module ou de phase permet de discriminer les particules d'intérêt 10, des autres particules 10;.
Etape 130 : Estimation du volume 7, de chaque particule d'intérêt 10,.
A partir de la détection, sur l'image d'observation Iobs, de chaque région d'intérêt ROIi associée à une particule d'intérêt 10,, on détermine une dimension d, de la région d'intérêt, par exemple le diamètre, ce qui permet une estimation du volume Vj de la particule d'intérêt 10, associée, en se basant sur l'hypothèse selon laquelle la particule d'intérêt est sphérique. La dimension d, peut être initialement obtenue en pixels puis convertie en pm en se basant sur un facteur de calibration, déterminé au cours d'une phase de calibration avec des particules sphériques de volumes connus, ou déterminés par une méthode de référence. L'hypothèse de sphéricité des particules d'intérêt est validée par la présence de l'agent sphérisant 10r dans l'échantillon.
Etape 140 : Détermination de paramètres statistiques.
Le terme paramètre statistique désigne un paramètre caractérisant la distribution statistique du volume des particules ou caractérisant la distribution statistique des dimensions d, déterminées lors de l'étape 130. Il peut en particulier s'agir d'une valeur moyenne, d'une valeur médiane ou d'un paramètre de dispersion, par exemple l'écart type σ.
Cette étape peut permettre de déterminer des paramètres statistiques des volumes F, des particules d'intérêt 10, estimés lors de l'étape 130. On peut par exemple déterminer le volume moyen V des particules d'intérêt 10, à partir des volumes 7, estimés lors de l'étape 130.
Alternativement, on détermine une dimension moyenne d des particules, c'est-à-dire une moyenne des dimensions d, de chaque particule d'intérêt 10,, puis on détermine le volume moyen V partir de la dimension moyenne, en prenant en compte une fonction de calibration effectuée avec des échantillons de calibration. Le volume moyen des particules d'intérêt dans les échantillons de calibration est connu, en étant par exemple déterminé par une méthode de référence. Une telle calibration est représentée sur la figure 3E, décrite par la suite en lien avec les essais expérimentaux.
Lorsque les particules d'intérêt 10, sont des globules rouges, on obtient ainsi un volume globulaire moyen (VGM). On peut également calculer un indicateur de dispersion de la dimension d, des particules d'intérêt, l'indicateur de dispersion étant par exemple l'écart type σ des dimensions d,. Lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, on peut ainsi déterminer un indice de répartition (IDR) des globules rouges. Le passage entre l'indicateur de dispersion de la dimension d, des particules d'intérêt et l'indice de répartition peut être réalisé en se basant sur une calibration. La calibration permet d'établir une fonction de calibration reliant l'indicateur de dispersion, par exemple σ, avec VIDR d'échantillons de calibration dont \'IDR est connu.
L'étape 140 peut également comprendre l'établissement d'une distribution des volumes estimés Vi, ou des dimensions d, des particules d'intérêt, et l'estimation d'un paramètre de dispersion d'une telle distribution, par exemple une largeur à mi-hauteur ou une largeur à 1 dixième de la hauteur. Lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, cela permet de déterminer un ratio usuellement désigné par l'acronyme anglosaxon RDW (Red blood cells Distribution Width).
Etape 150 : Détermination de ratios volumiques
Au cours de cette étape, on estime le volume total occupé par les particules d'intérêt 10; dans le champ d'observation et on effectue un ratio entre le volume total des particules d'intérêt 10; sur le volume d'échantillon dans le champ d'observation du capteur d'image 16. Lorsque les particules d'intérêt 10; sont des globules rouges, on peut ainsi déterminer l'hématocrite (Ht) dans l'échantillon. Le volume total des particules d'intérêt peut être obtenu en multipliant le volume moyen des particules d'intérêt, résultant de l'étape 140, par le nombre Nt de particules d'intérêt 10;, établi lors de l'étape 120 : Ht = ΝίΧναΜ, où y représente le volume de l'échantillon.
Ce premier mode de réalisation a été testé sur des échantillons sanguins, les résultats étant commentés par la suite, en lien avec les essais expérimentaux et les figures 3A à 3F. Un tel procédé est cependant sensible à la détermination du plan de focalisation Pf0CUS> dans lequel est reconstruite l'image complexe. Il suppose également une certaine coplanarité des particules d'intérêt.
Les inventeurs ont mis au point un deuxième mode de réalisation, permettant une estimation du volume représentatif de particules d'intérêt, à partir de l'image Io acquise par le capteur d'image 16. Les principales étapes de ce procédé sont décrites en lien avec la figure 4A. Le procédé est schématisé sur la figure 4C. Dans cet exemple, le volume représentatif est le volume moyen des particules d'intérêt.
Etape 200 : acquisition d'une image de l'échantillon par le capteur d'image Io. Cette étape est similaire à l'étape 100 précédemment décrite.
Etape 210 :obtention d'une pile d'images complexes. Au cours de cette étape, on applique l'opérateur de propagation h à une image obtenue à partir de l'image Io acquise lors de l'étape 200 pour obtenir une pile d'images complexes Az à différentes distances du plan de détection Po. Comme précédemment évoqué, l'opérateur de propagation peut être appliqué à une image représentant la racine carrée de l'image acquise /0, éventuellement normalisée par la valeur moyenne /0 de l'image acquise.
Selon une première variante, on applique l'opérateur de propagation h à l'image Io en considérant successivement différentes distances de propagation z1...zn entre le plan de détection et l'échantillon. On obtient ainsi autant d'images complexes AZi„..AZn que de distances de propagation. Les distances de propagation sont telles que des images complexes sont formées entre le plan de détection et l'échantillon, voire au-delà de l'échantillon. Cette première variante peut présenter un inconvénient lié à la qualité des images complexes reconstruites, ces dernières étant affectées d'un bruit de reconstruction, usuellement désigné par le terme twin image, signifiant image jumelle. La présence d'un tel bruit est dû au fait que l'image acquise Io ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14. De ce fait, la reconstruction holographique s'effectue sur la base d'une information optique incomplète, basée uniquement sur l'intensité de l'onde lumineuse 14 collectée sur le capteur d'image 16. L'amélioration de la qualité de la reconstruction holographique a fait l'objet de nombreux développements, en mettant en œuvre des algorithmes fréquemment dénommés « Phase retrieval », permettant une estimation de la phase de l'onde lumineuse à laquelle le capteur d'image est exposé. Ce type d'algorithme permet de limiter le bruit de reconstruction affectant l'image complexe reconstruite.
Aussi, selon une deuxième variante, représentée sur la figure 4B, au cours d'une étape 212, on applique un algorithme de reconstruction holographique afin de former une image complexe dite de référence Arej dans un plan de référence ?ref Le plan de référence est un plan avantageusement perpendiculaire à l'axe de propagation Z, et/ou parallèle au plan de détection Ρϋ. Il s'agit de préférence d'un plan T’io selon lequel s'étend l'échantillon. En effet, c'est généralement dans ce plan que la résolution spatiale d'une image complexe reconstruite est optimale, un tel principe étant à la base des algorithmes de focalisation numérique précédemment évoqués.
Selon une première possibilité, l'échantillon est illuminé successivement ou simultanément dans différentes bandes spectrales AÂfc, et on acquiert, dans le plan de détection Po, une image /0(AÂfc) représentative de chaque bande spectrale. L'algorithme permet d'obtenir une image complexe 4re^(AÂfc) de l'échantillon 10, dans le plan de référence, dans chaque bande spectrale AÂfc. Les images complexes ainsi obtenues peuvent être combinées, par exemple en effectuant une moyenne, en chaque pixel, de leur module et de leur phase, ce qui permet de former l'image de référence Aref. Alternativement, l'image complexe de référence est une image complexe 4re^(AÂfc) dans une bande spectrale AÂfc. Un tel algorithme a été décrit dans la publication S. N. A. Morel, A. Delon, P. Blandin, T. Bordy, O. Cioni, L. Hervé, C. Fromentin, J. Dinten, and C. Allier, Wide-Field Lensfree Imaging of Tissue Slides, in Advanced Microscopy Techniques IV;
and Neurophotonics II, E. Beaurepaire, P. So, F. Pavone, and E. Hillman, eds., Vol. 9536 of SPIE Proceedings (Optical Society of America, 2015) ainsi que dans la demande de brevet FR1554811 déposée le 28 mai 2015, et plus précisément dans les étapes itératives 100 à 500 décrites dans cette demande. On a montré que l'utilisation de deux ou trois bandes spectrales différentes permet d'obtenir une image complexe de référence Aref présentant une bonne qualité de reconstruction.
Selon une deuxième possibilité, qui correspond à une variante préférée, l'image complexe de référence Arej est calculée en se basant sur une image Io acquise de l'échantillon lorsque ce dernier est illuminé dans une seule bande spectrale Δλ. L'image complexe de référence peut être obtenue en utilisant un algorithme itératif tel que décrit dans la demande de brevet FR1652500 déposée le 23 mars 2016, et plus précisément selon les étapes 110 à 160 décrites dans ladite demande de brevet.
Enfin, l'image complexe de référence Aref peut être obtenue, à partir de l'image acquise, par le biais d'autres algorithmes de reconstruction connus, un exemple étant décrit dans US2012/0218379.
La coordonnée zrej, selon l'axe Z, du plan de référence ?ref est déterminée soit a priori, notamment lorsque la position de l'échantillon est maîtrisée par rapport au capteur d'image 16, soit par le biais d'un autofocus numérique, en se basant sur un critère de netteté de l'image de référence Arep cette dernière étant d'autant plus nette que le plan de référence correspond au plan dans lequel se trouvent les particules. Le critère de netteté peut être appliqué à l'image du module Mref ou de la phase de l'image <pref de référence.
L'image complexe Arej est désignée comme étant une image de référence, car elle sert de base à l'obtention, au cours d'une étape 214, d'images complexes Aref z, dites secondaires, le long de l'axe de propagation Z. Au cours de cette étape, l'image complexe de référence Arej est propagée selon une pluralité de distances de reconstruction z, en utilisant un opérateur de propagation h tel que précédemment défini, de façon à disposer d'une pluralité d'images complexes, dites secondaires, Are^z reconstruites aux différentes distances z du plan de référence ?ref· Ainsi, cette étape comprend la détermination d'une pluralité d'images complexes Are^ z telles que :
Aref.z Aref * h-z avec Ζγ Z Zn.
Les valeurs ζΎ et zn sont les coordonnées minimales et maximales, selon l'axe Z, entre lesquelles l'image complexe de référence est propagée. De préférence, les images complexes sont reconstruites selon une pluralité de coordonnées z entre l'échantillon 10 et le capteur d'image
16. Les inventeurs ont estimé qu'il était préférable d'obtenir des images complexes secondaires de part et d'autre du plan de référence Pref, de telle sorte que zx < zre^ < zn. De préférence, deux plans de reconstruction adjacents sont espacés les uns des autres selon un maillage fin, compris par exemple entre 1 pm et 50 pm, et par exemple 5 ou 10 pm. Il s'agit d'une propagation locale, car réalisée selon une distance comprise entre 10 pm et 2 mm de part et d'autre du plan de référence Pref, par exemple à ± 200 pm. Contrairement à l'image acquise Io par le capteur d'image 16, l'image complexe de référence Aref décrit avantageusement l'onde lumineuse d'exposition 14, en particulier au niveau de sa phase. Par conséquent, on estime que les images secondaires ArefZ, obtenues par propagation de l'image de référence Aref, forment un bon descripteur de l'onde lumineuse d'exposition 14 dans les différents plans de reconstruction. Ainsi, les images complexes secondaires sont calculées rapidement, sans nécessiter la mise en œuvre d'un procédé itératif tel que celui mis en œuvre pour calculer l'image complexe de référence Aref. Le procédé consistant à appliquer un algorithme itératif pour établir une image complexe de référence Aref (étape 212) puis, d'obtenir des images complexes secondaires par application d'un opérateur de propagation h à l'image complexe de référence (étape 214), permet d'obtenir une pile d'images complexes Aref Z1 ...Aref Zn en optimisant les moyens de calcul.
Selon un autre mode de réalisation, on met en œuvre un procédé de reconstruction itératif, tel que précédemment décrit, à partir de l'image acquise Io, en considérant successivement différentes distances de reconstruction zx ... zn. On obtient alors une pile d'images complexes Az ....Az .
Quelles que soient les variantes mises en œuvre pour obtenir la piles d'images complexes, on dispose, à l'issue de l'étape 210, d'une pile d'images complexes, permettant de connaître une expression complexe A(x, y, z) de l'onde lumineuse d'exposition 14 à différentes distances z du plan de détection Po. La pile d'images complexes est schématisée sur la figure 4C.
Etape 220 : détection des particules d'intérêt 10, et de leurs coordonnées planaires (%,,)/,). Cette étape consiste à obtenir les coordonnées planaires (η,)/) de particules d'intérêt 10,, dans le plan radial XY. Cette étape peut être effectuée sur la base de l'image acquise par le capteur d'image, mais on préfère généralement l'effectuer sur la base d'une image d'observation Iobs formée à partir d'une image complexe de la pile d'images complexes établie lors de l'étape 210. L'image d'observation Iobs correspond par exemple à l'image du module Mz ou de la phase <pz de l'image complexe Az prise en compte.
De préférence, on prend en compte une image complexe établie dans un plan selon lequel s'étend l'échantillon. Sur l'image d'observation lobs, chaque particule d'intérêt 10, est associée à une région d'intérêt ROlt ayant une forme prédéterminée. La localisation de chaque région d'intérêt ROlt peut être réalisée automatiquement. Pour cela, comme décrit en lien avec l'étape 120 du premier mode de réalisation, les particules d'intérêt 10, sont détectées par analyse morphologique. L'analyse morphologique peut prendre en compte un ou plusieurs critères morphologiques correspondant à une région d'intérêt ROIt, par exemple son aire. Des algorithmes basés sur une corrélation spatiale avec des formes prédéterminées peuvent également être mis en œuvre.
L'échantillon peut comporter des particules 10;, différentes des particules d'intérêt 10, à analyser. Dans ce cas, l'analyse morphologique précédemment décrite peut permettre de discriminer les particules d'intérêt des autres particules 10;. Des algorithmes de classification, basés sur des critère de forme, peuvent être mis en œuvre pour permettre une distinction entre les particules d'intérêt 10, et les autres particules 10;.
La position (χ,,γ,), selon le plan radial XY, des particules d'intérêt 10, détectées, est ensuite déterminée en considérant par exemple le centroïde de chaque région d'intérêt ROIt résultant de l'analyse morphologique. Cette étape permet également de dénombrer une quantité de particules d'intérêt Nt dans le champ d'observation du capteur d'image.
Sur la figue 4C, on a représenté une position planaire (x^y,) d'une particule d'intérêt sous la forme d'un trait vertical en pointillés, parallèle à l'axe de propagation Z.
Etape 230 : Formation d'un profil associé à chaque particule d'intérêt.
A partir de chaque image complexe formant la pile d'images résultant de l'étape 210, on estime une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse d'exposition 14, à chaque position planaire (%j, yi) déterminée lors de l'étape 220, et à une pluralité de distances z du plan de détection Po, puis on forme un profil représentant une évolution de la grandeur caractéristique selon l'axe de propagation Z. La grandeur caractéristique peut notamment être établie à partir du module et de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14. Il peut s'agir du module, de la phase, ou de leur combinaison. A l'issue de cette étape, à chaque particule d'intérêt 10, correspond un profil. Un tel profil est schématisé sur la figure 4C. Sur ce schéma, on a représenté un profil Airfz) obtenu en considérant le module de chaque image complexe à la position planaire (x^y,) représentée par un trait en pointillés.
La figure 4D représente un profil, dit profil Mj(z) du module, mesuré en considérant le module, à une même position planaire (x,, y,) de chaque image complexe d'une pile d'images complexes d'un échantillon comportant des globules rouges. La pile d'images complexes est formée par des images successives distantes l'une de l'autre de 5 pm. L'axe des abscisses de cette figure représente une coordonnée z selon l'axe de propagation Z. L'axe des ordonnées représente la valeur du module. Le plan de l'échantillon ?io correspond à la valeur minimale prise par le profil. La figure 4E représente un profil, dit profil de phase φι(ζ), réalisé en considérant la phase de chaque image complexe à une même position planaire (xi; y,). Les profils du module et de phase représentent l'évolution respective, selon l'axe Z, du module et de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14. Les images complexes de la pile d'images complexes étant distantes les unes des autres, chaque profil est initialement formé par des points discrets, une interpolation étant effectuée entre deux coordonnées z successives.
Les inventeurs ont observé que lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, il est préférable de former des profils basés sur le module de l'expression complexe décrivant l'onde lumineuse d'exposition 14.
Etape 240 : Estimation de paramètres de profils correspondant respectivement à différentes particules d'intérêt 10,.
A partir du profil associé à chaque particule d'intérêt 10,, résultant de l'étape 230, on procède à une estimation d'un paramètre p,. Le paramètre de chaque profil est obtenu en appliquant une métrique audit profil. Ainsi, à chaque particule d'intérêt 10, correspond un paramètre pt, par l'intermédiaire du profil associé à ladite particule, par exemple du profil de phase <ρ;(ζ) et/ou du profil du module Μ,ζζ). On détermine ensuite une valeur moyenne p des paramètres correspondant respectivement aux différentes particules d'intérêt localisées. A l'aide d'une fonction de calibration, on détermine un volume moyen V des particules d'intérêt à partir de la valeur moyenne p. La fonction de calibration est obtenue à partir d'échantillons de calibration, comportant des particules dont le volume moyen est connu, en étant par exemple établi par une méthode de mesure de référence. Les échantillons de calibration peuvent comporter, de préférence, un nombre de particules d'intérêt supérieur à 1000, par exemple 10000 ou 15000 particules d'intérêt. La fonction de calibration établit une relation entre la valeur moyenne p et le volume moyen des particules V de l'échantillon. Lorsque les particules sont des globules rouges, le volume moyen V correspond au volume globulaire moyen VGM.
La métrique appliquée à chaque profil peut être l'une des métriques listées ci-dessous :
une pente ou une pente moyenne d'un profil ;
une largeur du profil entre deux points du profil ;
une aire délimitée par le profil entre deux points du profil ;
une valeur minimale ou maximale du profil.
Sur la figure 4D, on a représenté :
une première métrique Ml, basée sur une aire s'étendant entre le profil et deux bornes
PI, P2 respectivement disposées de part et d'autre d'un pic décrit par le profil (ou plus précisément d'un pic inversé). La première borne PI correspond à un point du profil dont la valeur s'écarte de Xl% par rapport à une première ligne de base BL1 décrite par le profil, pour des coordonnées situées en deçà du pic. La deuxième borne P2 à une borne du profil dont la valeur s'écarte de X2% par rapport à une deuxième ligne de base
BL2 décrite par le profil, pour des coordonnées situées au-delà du pic. Dans cet exemple, XI =15.2 % et Χ2 = 13.5%. La première métrique Ml permet de définir l'aire du pic, délimitée par une droite passant par les deux bornes PI et P2.
une deuxième métrique M2, basée sur une largeur à mi-hauteur d'un pic décrit par le profil ;
une troisième métrique M3, basée sur une pente moyenne d'une partie ascendante du profil.
Le terme métrique désigne une fonction appliquée au profil de façon à obtenir un paramètre correspondant à la particule associée au profil. Ce paramètre peut une valeur scalaire ou un vecteur caractérisant le profil et permettant d'obtenir une valeur quantitative représentative d'un volume d'une particule d'intérêt.
Sur la figure 4E, on a représenté une quatrième métrique M4, qui met en œuvre un profil du module Mj(z) et un profil de la phase φ^ζ) passant par une particule d'intérêt 10,. Cette métrique comporte le calcul d'une aire délimitée :
par le profil de phase φ^ζ), dont l'axe des abscisses représente les coordonnées z et l'axe des ordonnées représente les valeurs de la phase à chaque coordonnée ;
par une première droite DI parallèle à l'axe des ordonnées du profil de phase, et passant par la coordonnée zmin_M., de l'axe des abscisses, pour laquelle le profil du module Mj(z) prend une valeur minimale ;
par une deuxième droite D2, parallèle à l'axe des abscisses du profil de phase, et passant par la coordonnée φί^Ζγηίη-φ/) de l'axe des ordonnées à laquelle le profil de phase (Pi(z) prend une valeur minimale.
A l'issue de l'étape 240, on dispose d'une estimation du volume globulaire moyen. On peut alors mettre en œuvre une ou plusieurs étapes décrites ci-dessous.
Etape 250 : Détermination de paramètres statistiques
Cette étape est similaire à l'étape 140 du premier mode de réalisation, en considérant la dispersion du paramètre de chaque profil. Comme précédemment évoqué dans la description de l'étape 140, le terme paramétre statistique désigne un paramètre caractérisant la distribution statistique du volume des particules ou caractérisant la distribution statistique des paramètres Pi. Il peut en particulier s'agir d'un paramètre de dispersion, par exemple l'écart type σ du paramètre pt. Ce dernier peut être utilisé pour estimer l'indice de répartition IDR de l'échantillon. La relation entre \'IDR et l'écart-type σ du paramètre pt, ou de façon plus générale l'indicateur de dispersion du paramètre pt, peut être une relation empirique, établie lors d'une phase de calibration mettant en œuvre des échantillons de calibration dont VIDR est connu.
Etape 260 : Détermination de ratios volumiques.
Cette étape est similaire à l'étape 150 du premier mode de réalisation.
Essais expérimentaux
Les modes de réalisation précédemment décrits ont fait l'objet d'essais expérimentaux, selon les conditions suivantes:
Echantillon 10 : il s'agit de sang humain dilué au l/600'eme dans un tampon phosphate PBS, auquel une concentration de 100 mg/l d'agent sphérisant 3-(Λ/,Λ/Dimethyldodecylammoniojpropanesulfonate.
Source de lumière 11 : diode électroluminescente Créé MC-E Color, comportant trois diodes électroluminescentes pouvant être simultanément ou successivement activées, chaque diode émettant respectivement dans les bandes spectrales Δλ suivantes : 440nm - 460 nm ; 500nm - 540 nm ; 624nm - 648 nm. Alternativement, Une diode laser émettant à 405 nm, et de puissance inférieure à 5 mW, a également été utilisée.
Chambre fluidique 15 : chambre countess d'épaisseur 100 pm disposée sur le capteur d'image, ou chambre en verre d'épaisseur 100 pm.
Capteur d'image 16 : Capteur CMOS Aptina MT9J003 monochrome 3884 x 2764 pixels, chaque pixel mesurant 1.67 pm de côté, la surface de détection s'étendant sur environ mm2. Compte tenu de l'épaisseur de la chambre fluidique, le volume d'échantillon adressé par chaque image s'élève à environ 2.8 pl.
Distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 : entre 2 cm et 30 cm Diamètre de l'ouverture du filtre spatial 18 :150 pm, un tel filtre n'étant pas nécessaire lorsque la source de lumière est la diode laser.
Dans une première série d'essais, le premier mode de réalisation, décrit en lien avec la figure 2, a été testé, la source de lumière étant une diode laser. Les figures 3A et 3B représentent le volume globulaire moyen (axe des ordonnées), mesuré sur un automate de référence en fonction du diamètre moyen des globules rouges, exprimé en pm (axe des abscisses). Les estimations de la figure 3A ont été obtenues en formant une image complexe, dans le plan de l'échantillon, en mettant en œuvre un algorithme de reconstruction tel que décrit dans la demande de brevet FR1652500 déposée le 23 mars 2016. Les estimations de la figure 3B ont été obtenues en formant une image complexe, dans le plan de l'échantillon, par application simple d'un opérateur de reconstruction holographique à partir de la racine de l'image acquise par le capteur d'image. Les coefficients de corrélation r2 obtenus sur les deux figures sont de 0.88.
Différents échantillons sanguins ont ensuite été testés. Les figures 3C et 3D représentent différents résultats issus de la mise en œuvre des étapes 100 à 150 du premier mode de réalisation. Elles montrent respectivement les volumes globulaires moyens des échantillons (axe des ordonnées), en fonction de mesures de référence (axe des abscisses). Le coefficient de corrélation r2 entre les mesures de référence et les estimations issues de la méthode est égal à 0.91.
le taux d'hématocrite des échantillons (axe des ordonnées), en fonction d'une mesure de référence (axe des abscisses). Le coefficient de corrélation r2 entre les mesures de référence et les estimations issues de la méthode est égal à 0.94.
Les mesures de références ont été réalisées en utilisant l'automate HORIBA ABX Pentra 120 DX. Afin d'évaluer l'impact de l'agent sphérisant, on a mis en œuvre le procédé décrit en lien avec la figure 2 avec et sans agent sphérisant. La figure 3E représente, pour différents échantillons, la détermination du volume globulaire moyen (axe des ordonnées), établi par une méthode de référence, en fonction de la moyenne des dimensions de chaque particule (axe des abscisses), estimées à partir de l'image. Les échantillons avec et sans agent sphérisant sont respectivement schématisés par une marque ronde et carrée. Cette figure permet d'établir une fonction de calibration pour les échantillons comportant l'agent sphérisant et une autre fonction de calibration pour les échantillons sans agent sphérisant. La figure 3F montre, pour différents échantillons, le volume globulaire moyen (axe des ordonnées), obtenu en appliquant les fonctions de calibration, déterminée comme indiqué en lien avec la figure 3E, en fonction du volume globulaire moyen de chaque échantillon, établi par une méthode de référence (axe des abscisses), et cela sur des échantillons avec et sans agent sphérisant. Pour les échantillons sans agent sphérisant (marque de forme carrée), le coefficient de corrélation r2 est égal à 0.85 tandis que pour les échantillons avec agent sphérisant (marque de forme ronde), le coefficient de corrélation r2 atteint 0.95. Ces essais montrent l'intérêt de l'utilisation d'un agent sphérisant dans l'échantillon : cela permet d'améliorer la corrélation des mesures avec les mesures de référence. Par conséquent, la présence de l'agent sphérisant améliore significativement la fiabilité de la méthode.
Dans une deuxième série d'essais, le deuxième mode de réalisation, décrit en lien avec les étapes 200 à 250, a été testé. Lors de ces essais, la source de lumière 11 était une diode laser.
Les figures 5A et 5B sont des images formées au microscope de l'échantillon respectivement sans et en présence de l'agent sphérisant. On observe que sur l'image de la figure 5B, les globules rouges ont une forme circulaire.
Les figures 5C et 5D représentent chacune cinquante profils du module Mj(z) établis en utilisant respectivement un échantillon ne comportant pas et comportant un agent sphérisant. On observe que la présence de l'agent sphérisant permet d'obtenir une meilleure répétabilité des profils. Les figures 5E et 5F sont des profils moyens formés respectivement à partir des profils tracés sur les figures 5C et 5D.
Au cours des essais expérimentaux, différents échantillons ont été considérés et on a déterminé, pour chacun d'entre eux, un volume globulaire moyen (VGM) à l'aide d'un automate Horiba ABX Pentral20 DX. Sur chaque échantillon, on a mis en œuvre les étapes 200 à 230 du procédé précédemment décrit, de façon à détecter les globules rouges, déterminer leur position planaire et obtenir, pour chacun d'entre eux, un profil décrivant l'évolution, selon l'axe de propagation Z, du module de l'expression complexe décrivant l'onde lumineuse 14, l'axe de chaque profil passant par chaque position planaire. On a appliqué une métrique à chaque profil et une métrique moyenne a été obtenue pour chaque échantillon. Sur chaque échantillon, on a calculé une métrique moyenne, cette dernière permettant une estimation du volume globulaire moyen de l'échantillon.
Les figures 5G et 5H représentent, pour chaque échantillon, le volume globulaire moyen, exprimé en femtolitres, établi selon la méthode de référence, en fonction de la valeur de la métrique moyenne calculée pour l'échantillon à l'aide des profils. La figure 5G montre les résultats obtenus sans agent sphérisant tandis que la figure 5H montre les résultats obtenus en présence de l'agent sphérisant. Sur ces figures, l'axe des abscisses représente la valeur moyenne de la métrique. On observe que la présence d'un agent sphérisant minimise la dispersion des résultats autour d'une relation linéaire reliant le volume globulaire moyen de chaque échantillon à la valeur moyenne de la métrique calculée pour ledit échantillon. Dans cet exemple, la métrique utilisée a été la première métrique Ml décrite en lien avec la figure 3A. On a déterminé, sur chacune de ces figures, un coefficient de corrélation r2, représentant la corrélation des valeurs mesurées avec un modèle de régression linéaire. Sur les figures 5G et 5H, le coefficient r2 est respectivement égal à 0.53 et 0.78. Cela montre que l'agent sphérisant permet une meilleure corrélation des valeurs mesurées avec un modèle de régression linéaire.
Les figures 51 et 5J sont similiaires aux figures 5G et 5H, et concernent respectivement un échantillon sans agent sphérisant et un échantillon avec agent sphérisant. La métrique considérée est une largeur à mi-hauteur de chaque profil, correspondant à la métrique M2 décrite en lien avec la figure 3A. On constate une relation linéaire entre les valeurs moyennes de la métrique et les volumes globulaires moyens, la dispersion étant moindre sur l'échantillon comportant le réactif sphérisant. Sur les figures 51 et 5J, le coefficient r2 est respectivement égal à 0.48 et 0.89, ce qui confirme l'avantage lié à l'utilisation de l'agent sphérisant.
Les résultats présentés sur les figures 5C à 5J ont été obtenus en formant une image complexe de référence dans le plan de l'échantillon, puis en formant des images complexes secondaires à partir de l'image complexe de référence. L'image complexe de référence a été formée selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR1652500 déposée le 23 mars 2016, comme précédemment décrit.
Les figures 6A et 6B montrent chacune cinquante profils de phase φ^ζ) établis en mettant en œuvre l'invention en utilisant respectivement un échantillon ne comportant pas et comportant un agent sphérisant. Comme observé en lien avec les figures 5C et 5D, on observe que la présence de l'agent sphérisant permet d'obtenir une meilleure répétabilité des profils. Les figures 6C et 6D sont des profils moyens formés respectivement à partir des profils tracés sur les figures 6A et 6B.
Sur les figures 7A à 7F, on a comparé des résultats obtenus à partir d'une pile d'images complexes obtenues :
soit directement en effectuant des propagations à partir de l'image acquise par le capteur d'image : cf. figures 7A, 7C et 7E, ce qui correspond à la première variante décrite dans l'étape 210.
soit en utilisant une image complexe de référence, puis en propageant l'image complexe de référence, comme représenté sur la figure 4B : cf. figures 7B, 7D et 7F, ce qui correspond à la deuxième variante décrite dans l'étape 210.
Chaque figure représente le volume globulaire moyen d'un échantillon (axes des ordonnées) en fonction d'une valeur moyenne de métriques appliquées à des profils du module établis le long d'un axe passant par chaque globule rouge détecté (axe des abscisses).Les figures 7A et 7B ont été obtenues en appliquant la métrique M2 (largeur à mi-hauteur) préalablement définie. Les figures 7C et 7D ont été obtenues en appliquant la métrique Ml (aire définie par le profil), préalablement définie. Les figures 7E et 7F ont été obtenues en appliquant la métrique M3 (valeur moyenne d'une pente sur une partie ascendante du profil), préalablement définie. Sur chacune de ces figures, on observe une linéarité entre le volume globulaire moyen et les valeurs moyennes des métriques déterminées pour chaque échantillon. La source de lumière utilisée était la diode laser précédemment décrite.
Les coefficients de corrélation r2 des figures 7A, 7B, 7C, 7D, 7E et 7F sont respectivement : 0.96, 0.98, 0.93, 0.94, 0.89, 0.96. Cela montre que les métriques une estimation correcte du VGM, quelle que soit la méthode adoptée pour former la pile d'images complexes.
Le deuxième mode de réalisation a été mis en œuvre pour estimer le volume globulaire moyen VGM, le taux d'hématocrite Ht et l'indice de répartition IDR d'échantillons sanguin. Les figures 8A, 8B et 8C montrent respectivement les VGM, \'Ht, \'IDR calculés sur la base des profils (axes des ordonnées) en fonction de ces grandeurs mesurées par une mesure de référence, à l'aide de l'automate HORIBA ABX Pentra 120 DX. Sur ces essais, la métrique appliquée à chaque profil était la métrique Ml, décrite en lien avec la figure 4D. La source de lumière utilisée était la diode laser précédemment décrite. On constate une relation linéaire entre les estimations et les mesures de référence. Sur les figures 8A, 8B et 8C, les coefficients de corrélation r2 entre les mesures de référence et les estimations issues de la méthode sont respectivement égaux à 0.94, 0.95 et 0.75.
D'autres métriques ont été utilisées, par exemple la largeur à mi-hauteur du pic formé par chaque profil, correspondant à la métrique M2. Les figures 9A, 9B et 9C montrent respectivement les VGM, \'Ht, \'IDR calculés sur la base des profils (axes des ordonnées) en fonction de ces grandeurs mesurées par une mesure de référence (axes des abscisses), à l'aide de l'automate précédemment cité. Sur les figures 9A, 9B et 9C, les coefficients de corrélation r2 entre les mesures de référence et les estimations issues de la méthode sont respectivement égaux à 0.97, 0.97 et 0.71.
La métrique M3 décrite en lien avec la figure 4D a également été testée. Des résultats similaires à ceux précédemment décrits ont été observés, avec une valeur de coefficient de corrélation r2 proche de 0.96 dans le cas de l'estimation du VGM ou de VHt.
Des essais ont également été effectués en remplaçant la source de lumière laser par la diode électroluminescente telle que précédemment décrite. Les résultats se sont également révélés concluants.
Comme précédemment évoqué, la forme sphérique des particules permet de s'affranchir des incertitudes liées à leurs orientations. La figure 10A représente un schéma de particules d'intérêts 10; baignant dans un milieu 10m. On a utilisé le premier mode de réalisation de façon à estimer le volume globulaire moyen d'échantillons sanguins, le VGM étant également déterminé par une mesure de référence. Le premier mode de réalisation a été mis en œuvre en prenant en compte des plans de reconstruction légèrement décalés les uns des autres, le décalage entre deux plans successifs étant de 10 pm. Ce mode de réalisation est optimal lorsque le plan de reconstruction correspond au plan de focalisation Pf0CUS· Les différents plans de reconstruction sont schématisés par des tirets en pointillés sur la figure 10A, de part et d'autre du plan de focalisation. On a ensuite déterminé, pour chaque plan de reconstruction, un coefficient de corrélation r2 exprimant la corrélation linéaire entre les volumes globulaires moyens obtenus par la mise en œuvre du premier mode de réalisation, et les mesures de référence.
La figure 10B représente l'évolution du coefficient de corrélation r2 en fonction de la position des plans de reconstruction (courbe Cl). On a également estimé le volume globulaire moyen des échantillons à l'aide du deuxième mode de réalisation, la métrique utilisée étant la métrique M2 décrite en lien avec la figure 4D. La figure 10B représente l'évolution du coefficient de corrélation r2 (courbe C2).
La figure 10B montre que le premier mode de réalisation présente une certaine sensibilité à l'égard de la position du plan de reconstruction par rapport au plan de focalisation des particules Pfocus’ ce dernier correspondant au plan selon lequel s'étendent la plus grande partie des particules. Le deuxième mode de réalisation est, à cet égard, plus robuste que le premier mode de réalisation.
Bien que décrite relativement à une caractérisation de globules rouges, l'invention s'applique à d'autres particules aptes à être déformées par un agent sphérisant, dès lors que l'on souhaite 5 obtenir une estimation rapide et fiable de leurs volumes. D'autre part, bien que décrite en relation avec la détermination d'un volume moyen de particules d'intérêt, l'invention pourra s'appliquer à d'autres volumes caractérisant les particules d'intérêt : il peut s'agir, de façon non limitative, d'un volume médian, ou du volume de chaque particule d'intérêt.

Claims (20)

  1. REVENDICATIONS
    1. Procédé d'estimation d'un volume représentatif de particules d'intérêt (10,) baignant dans un échantillon, l'échantillon s'étendant selon au moins un plan, dit plan de l'échantillon (P10), l'échantillon comportant un agent sphérisant, apte à modifier la forme des particules, le procédé comportant les étapes suivantes :
    a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) selon un axe de propagation (Z) ;
    b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (/0) de l'échantillon (10), formée dans un plan de détection (Po), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (14) dite d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image (16) sous l'effet de l'illumination ;
    c) utilisation de l'image de l'échantillon (/0), acquise lors de l'étape b), et d'un opérateur de propagation holographique, pour calculer une expression complexe (A(x,y,z)) de l'onde lumineuse d'exposition (14) en différentes positions distantes du plan de détection;
    le procédé comportant une étape d'estimation du volume représentatif (V, FJ des particules d'intérêt (10,) en fonction des expressions complexes calculées lors de l'étape c)
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen (P) desdites particules d'intérêt.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel l'étape c) comporte une formation d'une image complexe (Az), correspondant à une distribution de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition (A(x,y,z)) dans le plan de l'échantillon (P10).
  4. 4. Procédé selon la revendication 3, comportant :
    une détection, à partir de l'image complexe, de régions d'intérêt (ROIi), chaque région d'intérêt étant associée à une particule d'intérêt (10,) ;
    une détermination d'une taille de chaque région d'intérêt ;
    l'estimation du volume représentatif (P) des particules d'intérêt (10,) étant effectuée en fonction de ladite taille, chaque particule d'intérêt étant considérée comme sphérique.
  5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'étape c) comporte le calcul d'une expression complexe (A(x, y, z)) de l'onde lumineuse d'exposition (14) à différentes distances (z) du plan de détection, le procédé comportant également les étapes suivantes :
    d) détermination des positions planaires (x^yj respectives de plusieurs particules d'intérêt (10,) dans un plan parallèle au plan de détection (Po), chaque position planaire étant associée à une particule d'intérêt;
    e) à partir des expressions complexes calculées lors de l'étape c), calcul d'au moins une grandeur caractéristique (Μ,φ) de l'onde lumineuse d'exposition (14), à chaque position planaire (x^y,), et à une pluralité de distances (z) du plan de détection (Po);
    f) formation d'un profil (Mrfz), çjrfz)), représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape e) selon un axe parallèle à l'axe de propagation (Z) et passant par chaque position planaire (x^y,) déterminée lors de l'étape d), chaque profil étant associé à une particule d'intérêt ;
    g) estimation du volume représentatif (Ë) des particules d'intérêt (10,) en fonction de chaque profil (Mrfz), ç?,(z)) formé lors de l'étape f).
  6. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'étape c) comporte une formation d'une pile d'images complexes, chaque image complexe formant une distribution de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition (14) selon un plan de reconstruction.
  7. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel lors de l'étape c), la formation de la pile d'images complexes comporte les sous-étapes suivantes :
    ci) à partir de l'image acquise (/0) lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation (h), de façon à calculer une image complexe (A-e/), dite image de référence, représentative de l'onde lumineuse d'exposition (14), dans un plan de référence (Pref) ;
    cii) application d'un opérateur de propagation (h) à l'image de référence (4rey), de façon à obtenir des images complexes, dites images complexes secondaires (Aref Z1 Aref Zn), à différentes distances (z± ...zn) du plan de référence (Pref) selon l'axe de propagation (Z), les images complexes secondaires et l'image de référence formant la pile d'images complexes.
  8. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le plan de référence (Pref) est le plan de l'échantillon (P10).
  9. 9. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la formation de la pile d'images complexes comporte le calcul, à partir de l'image acquise (/0), de plusieurs images complexes (Az Az ) à différentes distances (z± ...zn) du plan de détection (Po) selon l'axe de propagation (Z).
  10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel dans l'étape d), la position planaire (χ,,γ,) de chaque particule d'intérêt est déterminée à partir d'une image complexe de la pile d'images complexes.
  11. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l'étape d) comporte les sous-étapes :
    di) détection de particules (10,, 10;) dans l'image complexe ;
    dii) sélection, parmi les particules détectées, de particules d'intérêt (10,).
  12. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, dans lequel lors de l'étape e), la grandeur caractéristique comprend le module (M) ou la phase (<p) d'une expression complexe (4) de l'onde lumineuse d'exposition (14).
  13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, dans lequel le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen desdites particules, et dans lequel lors de l'étape g), le volume moyen (P) des particules d'intérêt (10,) est estimé en appliquant une métrique à chaque profil (Μ,ζζΧφ,ζζ)) formé lors de l'étape f), de façon à obtenir un paramètre (p,) pour chaque profil et en effectuant une moyenne (p) des paramètres de chaque profil.
  14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen desdites particules, et dans lequel les particules d'intérêt étant des globules rouges, le volume moyen (P) des particules d'intérêt correspond à un volume globulaire moyen (VGM), de l'échantillon.
  15. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant également l'établissement d'un paramètre représentant une dispersion des volumes des particules d'intérêt (10,).
  16. 16. Procédé selon la revendication 15 dépendant de la revendication 14, le procédé comportant la détermination d'un indice de répartition des globules rouges (IDR).
  17. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une détermination d'une quantité (Ni) de particules d'intérêt (10,) dans l'échantillon.
  18. 18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel les particules d'intérêt étant des globules rouges, le procédé comportant une étape de détermination d'un taux d'hématocrite (Ht) à partir du volume moyen des particules d'intérêt et de la quantité de particules d'intérêt dans l'échantillon.
    5
  19. 19. Dispositif pour l'estimation du volume représentatif de particules d'intérêt (10J disposées dans un échantillon (10), le dispositif comportant :
    - une source de lumière (11) apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ;
    - un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre la source de lumière
    10 (11) et un capteur d'image (16) ;
    un processeur (20), configuré pour recevoir une image (Io) de l'échantillon acquise par le capteur d'image (16) et pour mettre en œuvre au moins l'étape c) du procédé objet de l'une quelconque des revendications précédentes, le processeur étant configuré pour estimer le volume représentatif des particules d'intérêt à partir des expressions complexes calculées lors de l'étape 15 c).
  20. 20. Dispositif selon la revendication 19, dans lequel le processeur est configuré pour mettre en œuvre les étapes d) à f) du procédé objet de l'une quelconque des revendications 5 à 18.
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