FR3053592A1 - STABLE LIQUID FIBRINOGEN - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une composition comprenant du fibrinogène stable sous forme liquide.The invention relates to a composition comprising stable fibrinogen in liquid form.
Description
Titulaire(s) : LABORATOIRE FRANÇAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES Société anonyme.Holder (s): FRENCH LABORATORY OF FRACTIONATION AND BIOTECHNOLOGIES Société anonyme.
Demande(s) d’extensionExtension request (s)
Mandataire(s) : CABINET PLASSERAUD.Agent (s): CABINET PLASSERAUD.
(04) FIBRINOGENE LIQUIDE STABLE.(04) FIBRINOGENIC STABLE LIQUID.
_ L'invention concerne une composition comprenant du fibrinogène stable sous forme liquide.The invention relates to a composition comprising stable fibrinogen in liquid form.
FR 3 053 592 - A1FR 3 053 592 - A1
ii
La présente invention concerne une composition comprenant du fibrinogène stable sous forme liquide, utile en thérapie.The present invention relates to a composition comprising stable fibrinogen in liquid form, useful in therapy.
Le fibrinogène est une protéine essentielle de la coagulation sanguine, car sa polymérisation en fibrine insoluble formée au terme de la cascade de réactions qui gouvernent la coagulation, aboutit à la formation d'un caillot obturant la brèche vasculaire, responsable du saignement.Fibrinogen is an essential protein for blood coagulation, because its polymerization into insoluble fibrin formed at the end of the cascade of reactions which govern coagulation, results in the formation of a clot closing the vascular breach, responsible for bleeding.
La mise en place du caillot est ainsi essentielle pour assurer l'arrêt du saignement. De plus, la fibrine formée au niveau de la plaie constitue un réseau fibrillaire qui assure la réparation tissulaire, donc la cicatrisation.The placement of the clot is thus essential to ensure that the bleeding stops. In addition, the fibrin formed at the level of the wound constitutes a fibrillar network which ensures tissue repair, therefore scarring.
De nombreuses pathologies sont actuellement traitées par voie intraveineuse en utilisant des compositions comprenant du fibrinogène. On peut citer par exemple les hypofibrinogénémies, dys-fibrinogénémies ou a-fibrinogénémies constitutionnelles chez les patients présentant une hémorragie spontanée ou post-traumatique, le traitement complémentaire dans la prise en charge d’une hémorragie sévère incontrôlée dans le cadre d’une hypofibrinogénémie acquise, etc.Many pathologies are currently treated intravenously using compositions comprising fibrinogen. We can cite for example hypofibrinogenemias, dys-fibrinogenemias or constitutional a-fibrinogenemias in patients with spontaneous or post-traumatic hemorrhage, complementary treatment in the management of severe uncontrolled hemorrhage in the context of acquired hypofibrinogenemia , etc.
Pour le traitement de certaines pathologies, rutilisation de compositions comprenant du fibrinogène stables au stockage et prêtes à l’emploi peut s’avérer particulièrement avantageuse. Cette forme d’administration offre en effet plus de flexibilité et de rapidité d’administration aux praticiens, améliorant la prise en charge urgente des patients hémorragiques. A cette fin, des compositions comprenant du fibrinogène lyophilisées, stables au stockage et adaptées à une constitution rapide ont été développées. Cependant, la reconstitution de telles compositions lyophilisées nécessite quelques minutes. De plus, la reconstitution doit être réalisée doucement pour permettre la dissolution complète du lyophilisât, garantissant la concentration du produit, et ce sans formation de mousse, de trouble ou de dépôt qui rendrait la composition difficilement ou non administrable. L’utilisation de tels produits lyophilisés n’est donc pas optimale dans un contexte de médecine d’urgence intra ou péri-hospitalière ou chaque minute compte pour le traitement de l’hémorragie.For the treatment of certain pathologies, the use of compositions comprising fibrinogen which are stable on storage and ready to use can prove to be particularly advantageous. This form of administration offers more flexibility and speed of administration to practitioners, improving the urgent management of hemorrhagic patients. To this end, compositions comprising lyophilized fibrinogen, stable in storage and suitable for rapid constitution have been developed. However, the reconstitution of such lyophilized compositions requires a few minutes. In addition, the reconstitution must be carried out gently to allow complete dissolution of the lyophilisate, guaranteeing the concentration of the product, and this without formation of foam, cloudiness or deposit which would make the composition difficult or unmanageable. The use of such freeze-dried products is therefore not optimal in the context of intra- or peri-hospital emergency medicine where every minute counts for the treatment of hemorrhage.
A ce jour, les compositions comprenant du fibrinogène sont commercialisées sous forme lyophilisée à reconstituer et ne donnent pas entière satisfaction en termes de stabilité liquide notamment.To date, the compositions comprising fibrinogen are marketed in lyophilized form to be reconstituted and are not entirely satisfactory in terms of liquid stability in particular.
Notamment, Chabbat et al (Thrombosis Research, vol.76, No.6, 525-533, 1994), décrit une composition de fibrinogène comprenant du NaCl, de l’acide aminocaproïque, de la glycine, de l’arginine et de l’aprotinine. L’aprotinine, inhibiteur compétitif des sérines protéases naturel, est néanmoins défavorable aux patients lors de l’administration intraveineuse, d’une part du point de vue de son origine animale (préparation à partir de poumon de bœuf) avec un risque non négligeable de choc anaphylactique, et d’autre part vis-à-vis de son activité anticoagulante pouvant aggraver le défaut de coagulation du patient à traiter.In particular, Chabbat et al (Thrombosis Research, vol. 76, No. 6, 525-533, 1994), describes a fibrinogen composition comprising NaCl, aminocaproic acid, glycine, arginine and l 'aprotinin. Aprotinin, a natural competitive inhibitor of serine proteases, is nevertheless unfavorable to patients during intravenous administration, on the one hand from the point of view of its animal origin (preparation from beef lung) with a significant risk of anaphylactic shock, and on the other hand vis-à-vis its anticoagulant activity which can worsen the defect of coagulation of the patient to be treated.
La demande W00021568 décrit des compositions comprenant du fibrinogène, des ions calcium, un immuno-stimulateur, et des anti-fibrinolytiques, pour leur utilisation comme colle de fibrine. Néanmoins de telles compositions ne peuvent être administrées par voie intraveineuse aux patients.Application W00021568 describes compositions comprising fibrinogen, calcium ions, an immunostimulator, and anti-fibrinolytics, for their use as fibrin glue. However, such compositions cannot be administered intravenously to patients.
La demande EPI648496 de la demanderesse, décrit quant à elle des compositions comprenant du fibrinogène, stabilisé par addition d’arginine, de citrate trisodique, de leucine/isoleucine et de glycine et/ou lysine, permettant la stabilisation et la solubilisation du lyophilisât. Une telle composition n’est en revanche pas totalement adaptée à une formulation liquide de fibrinogène.Applicant's application EPI648496, for its part, describes compositions comprising fibrinogen, stabilized by the addition of arginine, trisodium citrate, leucine / isoleucine and glycine and / or lysine, allowing the stabilization and the solubilization of the lyophilisate. However, such a composition is not entirely suitable for a liquid formulation of fibrinogen.
Dans ce contexte, les besoins en compositions liquides comprenant du fibrinogène d’utilisation aisée persistent.In this context, the needs for liquid compositions comprising fibrinogen for easy use persist.
La Demanderesse a mis au point une nouvelle composition comprenant du fibrinogène, préférentiellement du fibrinogène humain, qui est stable à l’état liquide.The Applicant has developed a new composition comprising fibrinogen, preferably human fibrinogen, which is stable in the liquid state.
L'invention concerne donc une composition comprenant du fibrinogène stable sous forme liquide.The invention therefore relates to a composition comprising stable fibrinogen in liquid form.
De manière surprenante et avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence qu’il est possible d’obtenir des compositions comprenant du fibrinogène particulièrement stables dans le temps sous forme liquide, en utilisant un nombre limité et des quantités minimales d’excipients.Surprisingly and advantageously, the Applicant has demonstrated that it is possible to obtain compositions comprising fibrinogen which are particularly stable over time in liquid form, by using a limited number and minimum quantities of excipients.
Le fibrinogène est une protéine constitué d'un dimère de trois chaînes polypeptidiques dénommées alpha, beta et gamma. Le fibrinogène est donc un dimère et chaque monomère est composé de trois chaînes (alpha, bêta, gamma). La forme principale de fibrinogène a un poids moléculaire (PM) de 340 kDa. Le fibrinogène est formé de deux sous-unités identiques reliées par des ponts disulfures, donnant à la molécule une forme de fibre comportant 3 globules : un central (domaine E) et deux distaux (domaines D). La molécule entière contient 2964 acides aminés : 610 acides aminés pour la chaîne alpha (a), 461 acides aminés pour la chaîne beta (β), et 411 acides aminés pour la chaîne gamma (y).Le fibrinogène intervient dans l'hémostase primaire ainsi que dans la coagulation. H est le plus souvent prescrit pour le traitement des complications associées à l'afibrinogénémie constitutionnelle ou sévère et les syndromes hémorragiques ou risques d'hémorragies associés à une hypofibrinogénémie.Fibrinogen is a protein made up of a dimer of three polypeptide chains called alpha, beta and gamma. Fibrinogen is therefore a dimer and each monomer is composed of three chains (alpha, beta, gamma). The main form of fibrinogen has a molecular weight (MW) of 340 kDa. Fibrinogen is formed from two identical subunits linked by disulfide bridges, giving the molecule a form of fiber comprising 3 globules: a central (domain E) and two distals (domains D). The entire molecule contains 2964 amino acids: 610 amino acids for the alpha (a) chain, 461 amino acids for the beta (β) chain, and 411 amino acids for the gamma (y) chain. Fibrinogen is involved in primary hemostasis as well as in coagulation. It is most often prescribed for the treatment of complications associated with constitutional or severe afibrinogenemia and hemorrhagic syndromes or risks of hemorrhage associated with hypofibrinogenemia.
Le terme « stable » correspond à la stabilité physique et/ou chimique de la composition comprenant le fibrinogène. Le terme « stabilité physique » se réfère à la réduction ou l’absence de formation d’agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques du fibrinogène, à la réduction ou l’absence de formation de précipité, ainsi qu’à la réduction ou l’absence de toute dénaturation structurale de la molécule. Le terme « stabilité chimique » se réfère à la réduction ou l’absence de toute modification chimique de la composition comprenant le fibrinogène pendant le stockage, à l’état liquide, dans des conditions accélérées.The term "stable" corresponds to the physical and / or chemical stability of the composition comprising fibrinogen. The term "physical stability" refers to the reduction or absence of formation of insoluble or soluble aggregates of the dimeric, oligomeric or polymeric forms of fibrinogen, to the reduction or absence of precipitate formation, as well as to the reduction or absence of any structural denaturation of the molecule. The term "chemical stability" refers to the reduction or absence of any chemical change in the composition comprising fibrinogen during storage, in the liquid state, under accelerated conditions.
Un test de stabilité peut être effectué en différentes conditions de température, d'humidité, et de lumière. Préférentiellement, dans le cadre de la présente invention, le test de stabilité peut durer au minimum 1 semaine, préférentiellement au moins 1 mois, préférentiellement au moins 2 mois, préférentiellement au moins 3 mois, préférentiellement au moins 4 mois, préférentiellement au moins 5 mois, plus préférentiellement au moins 6 mois.A stability test can be performed under different temperature, humidity, and light conditions. Preferably, in the context of the present invention, the stability test can last at least 1 week, preferably at least 1 month, preferably at least 2 months, preferably at least 3 months, preferably at least 4 months, preferably at least 5 months , more preferably at least 6 months.
Typiquement, la mesure des paramètres de stabilité, tel que définis ci-après, ont lieu avant la mise en test de stabilité d'une composition comprenant du fibrinogène ; on peut alors parler de taux initial; et pendant ou à l'issue dudit test de stabilité, étant entendu que ledit test de stabilité peut durer au minimum 1 semaine, préférentiellement au moins 1 mois, préférentiellement au moins 2 mois, préférentiellement au moins 3 mois, préférentiellement au moins 4 mois, préférentiellement au moins 5 mois, plus préférentiellement au moins 6 mois.Typically, the measurement of the stability parameters, as defined below, takes place before the stability testing of a composition comprising fibrinogen; we can then speak of an initial rate; and during or at the end of said stability test, it being understood that said stability test can last at least 1 week, preferably at least 1 month, preferably at least 2 months, preferably at least 3 months, preferably at least 4 months, preferably at least 5 months, more preferably at least 6 months.
La stabilité d’une composition comprenant du fibrinogène peut s’évaluer par inspection visuelle à l’aide notamment d’une mireuse pharmacopée européenne (opalescence, formation de particules), par mesure de la turbidité au moyen d’un spectrophotomètre mesurant l’absorbance ou densité optique à 400 nm, permettant de mesurer les particules en solution de tailles comprises entre 1 nm et 1 pm environ.The stability of a composition comprising fibrinogen can be evaluated by visual inspection using in particular a European pharmacopoeia mireuse (opalescence, formation of particles), by measurement of the turbidity by means of a spectrophotometer measuring the absorbance or optical density at 400 nm, making it possible to measure the particles in solution of sizes between 1 nm and 1 μm approximately.
Dans un mode de réalisation, la stabilité de la composition comprenant du fibrinogène est définie par la mesure du taux de monomères conservés pendant le test de stabilité au moyen de la méthode High Pressure Size Exclusion Chromatography (HPSEC) ou Dynamic Light Scattering (DLS). Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier.In one embodiment, the stability of the composition comprising fibrinogen is defined by measuring the level of monomers retained during the stability test using the High Pressure Size Exclusion Chromatography (HPSEC) or Dynamic Light Scattering (DLS) method. These methods are well known to those skilled in the art.
Une composition de fibrinogène est avantageusement considérée comme stable si la quantité de monomères de fibrinogène conservés pendant la mise en test de stabilité est supérieure à 50%, préférentiellement supérieure à 60%, préférentiellement supérieure à 70%, préférentiellement supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 90%, préférentiellement supérieure à 95% du taux initial de monomères de fibrinogène.A fibrinogen composition is advantageously considered to be stable if the quantity of fibrinogen monomers retained during the stability test is greater than 50%, preferably greater than 60%, preferably greater than 70%, preferentially greater than 80%, preferentially greater at 90%, preferably greater than 95% of the initial level of fibrinogen monomers.
Plus préférentiellement, la quantité de monomères de fibrinogène conservés pendant le test de stabilité est supérieure à 70% du taux initial de monomères de fibrinogène.More preferably, the quantity of fibrinogen monomers retained during the stability test is greater than 70% of the initial level of fibrinogen monomers.
Par taux initial de monomère de fibrinogène, on entend le taux de monomère observé avant la mise en test de stabilité. Typiquement, la quantité de monomère de fibrinogène est mesurée avant la mise en test de stabilité et pendant ou à l'issue dudit test de stabilité.By initial fibrinogen monomer level is meant the level of monomer observed before the stability test. Typically, the amount of fibrinogen monomer is measured before the stability test and during or after said stability test.
Alternativement, une composition de fibrinogène est considérée comme stable si la variation de quantité de monomères de fibrinogène durant le test de stabilité est inférieure à 20 %, préférentiellement inférieure à 10%, préférentiellement inférieure à 5%, préférentiellement inférieure à 1%.Alternatively, a fibrinogen composition is considered to be stable if the variation in the amount of fibrinogen monomers during the stability test is less than 20%, preferably less than 10%, preferably less than 5%, preferably less than 1%.
Dans un autre mode de réalisation, la stabilité de la composition comprenant du fibrinogène est définie par la mesure du taux de polymères de fibrinogène formés pendant la mise en test de stabilité au moyen de HPSEC. Les polymères de fibrinogènes sont des polymères comprenant au moins 2 chaînes polypeptidiques alpha, 2 chaînes polypeptidiques beta et 2 chaînes polypeptidiques gamma du fibrinogène. Ce terme inclue également les trimères de fibrinogène.In another embodiment, the stability of the composition comprising fibrinogen is defined by measuring the level of fibrinogen polymers formed during the stability test using HPSEC. Fibrinogen polymers are polymers comprising at least 2 alpha polypeptide chains, 2 beta polypeptide chains and 2 gamma fibrinogen polypeptide chains. This term also includes fibrinogen trimers.
Une composition de fibrinogène est avantageusement considérée comme stable si la quantité de polymères de fibrinogène formés pendant la mise en test de stabilité est inférieure à 10%, préférentiellement inférieure à 20%, préférentiellement inférieure à 30%, préférentiellement inférieure à 40%, préférentiellement inférieure à 50% par rapport au taux initial de polymères de fibrinogène. Typiquement, le taux initial de polymères de fibrinogène correspond à l'ensemble des formes polymériques (trimères et plus) du fibrinogène avant la mise en test de stabilité.A fibrinogen composition is advantageously considered to be stable if the quantity of fibrinogen polymers formed during the stability test is less than 10%, preferably less than 20%, preferably less than 30%, preferably less than 40%, preferably less at 50% compared to the initial rate of fibrinogen polymers. Typically, the initial level of fibrinogen polymers corresponds to all of the polymeric forms (trimer and more) of fibrinogen before the stability test.
Plus préférentiellement, la quantité de polymères de fibrinogène formés pendant la mise en test de stabilité est inférieure à 30%. Typiquement, la quantité de polymères de fibrinogène est mesurée avant la mise en test de stabilité et pendant ou à l'issue dudit test de stabilité.More preferably, the quantity of fibrinogen polymers formed during the stability test is less than 30%. Typically, the quantity of fibrinogen polymers is measured before the stability test and during or after said stability test.
Alternativement, une composition de fibrinogène est considérée comme stable si la variation de quantité de polymères de fibrinogène durant le test de stabilité est inférieure à 20%, préférentiellement inférieure à 10%, préférentiellement inférieure à 5%, préférentiellement inférieure à 1%.Alternatively, a fibrinogen composition is considered to be stable if the variation in quantity of fibrinogen polymers during the stability test is less than 20%, preferably less than 10%, preferably less than 5%, preferably less than 1%.
Dans un autre mode de réalisation, la stabilité de la composition comprenant du fibrinogène est évaluée par la mesure de l’activité coagulable du fibrinogène rapportée à la mesure antigénique du fibrinogène (aussi appelée activité spécifique). De manière particulièrement avantageuse, la composition de fibrinogène stable présente un ratio fibrinogène coagulable / fibrinogène antigène supérieur à 0,5; préférentiellement supérieur à 0,6; supérieur à 0,7; supérieur à 0,8; supérieur à 0,9; encore plus préférentiellement environ égal à 1,0.In another embodiment, the stability of the composition comprising fibrinogen is evaluated by measuring the coagulable activity of fibrinogen relative to the antigenic measurement of fibrinogen (also called specific activity). In a particularly advantageous manner, the stable fibrinogen composition has a coagulable fibrinogen / fibrinogen antigen ratio greater than 0.5; preferably greater than 0.6; greater than 0.7; greater than 0.8; greater than 0.9; even more preferably approximately equal to 1.0.
Par « fibrinogène coagulable » on entend la mesure du fibrinogène fonctionnel par une technique de coagulation, déterminée selon la méthode de von Clauss. L’activité coagulable est exprimée eu g/L de solution de fibrinogène. Cette technique est connue de l'homme du métier qui peut se référer à la publication Von Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, 17, 237-246.By “coagulable fibrinogen” is meant the measurement of functional fibrinogen by a coagulation technique, determined according to the von Clauss method. The coagulable activity is expressed in g / L of fibrinogen solution. This technique is known to those skilled in the art who can refer to the publication Von Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, 17, 237-246.
Par « fibrinogène antigène » on entend la quantité de fibrinogène, qu’il soit actif ou non, mesurée par méthode néphélémétrique. La quantité de fibrinogène antigénique est exprimée en g/L.By "fibrinogen antigen" means the amount of fibrinogen, whether active or not, measured by the nephelometric method. The amount of antigenic fibrinogen is expressed in g / L.
La stabilité de la composition comprenant du fibrinogène est également évaluée par la mesure en SDS PAGE de la conservation des chaînes alpha, beta et gamma de fibrinogène, préférentiellement avant et après un test de stabilité comme défini dans le cadre de la présente invention. Ainsi, une composition de fibrinogène est avantageusement considérée comme stable si :The stability of the composition comprising fibrinogen is also evaluated by measuring in SDS PAGE the conservation of the alpha, beta and gamma chains of fibrinogen, preferably before and after a stability test as defined in the context of the present invention. Thus, a fibrinogen composition is advantageously considered to be stable if:
l'ensemble des chaînes alpha est conservée à au moins 50%, préférentiellement au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, préférentiellement au moins 80%, préférentiellement au moins 90%; plus préférentiellement conservée à environ 100%, et/ou l'ensemble des chaînes beta est conservée à au moins 50%, préférentiellement au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, préférentiellement au moins 80%, préférentiellement au moins 90%; plus préférentiellement conservée à environ 100%, et/ou l'ensemble des chaînes gamma est conservée à au moins 50%, préférentiellement au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, préférentiellement au moins 80%, préférentiellement au moins 90%; plus préférentiellement conservée à environ 100%.all the alpha chains are kept at least 50%, preferably at least 60%, preferably at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%; more preferably kept at around 100%, and / or all of the beta chains are kept at least 50%, preferably at least 60%, preferably at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%; more preferably kept at around 100%, and / or all of the gamma chains are kept at least 50%, preferably at least 60%, preferably at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%; more preferably kept at around 100%.
La stabilité de la composition comprenant du fibrinogène est également définie par la mesure de la turbidité au moyen de la spectrophotométrie UV à 400nm. En effet, la turbidité reflète la quantité en matière qui trouble la solution. Une composition de fibrinogène est avantageusement considérée comme stable si la turbidité mesurée après le test de stabilité comme défini dans la présente invention est comparable à la turbidité mesurée avant stabilité.The stability of the composition comprising fibrinogen is also defined by measuring the turbidity by means of UV spectrophotometry at 400 nm. In fact, the turbidity reflects the quantity of material which cloudes the solution. A fibrinogen composition is advantageously considered to be stable if the turbidity measured after the stability test as defined in the present invention is comparable to the turbidity measured before stability.
Avantageusement, la turbidité mesurée après la mise en test de stabilité correspond à moins de 130%, moins de 120%, moins de 110% ; avantageusement correspond à 100% de la turbidité mesurée avant stabilité.Advantageously, the turbidity measured after the stability test corresponds to less than 130%, less than 120%, less than 110%; advantageously corresponds to 100% of the turbidity measured before stability.
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la composition comprenant du fibrinogène est stable pendant au moins 1 mois, au moins 2 mois, au moins 3 mois, au moins 4 mois, au moins 5 mois, au moins 6 mois à 4°C.In an advantageous embodiment of the invention, the composition comprising fibrinogen is stable for at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months to 4 ° C.
Par «composition selon l'invention», on entend désigner la composition comprenant du fibrinogène, ladite composition étant stable sous forme liquide. Préférentiellement, ladite composition est constituée de fibrinogène, d'arginine et de citrate.The term “composition according to the invention” is intended to denote the composition comprising fibrinogen, said composition being stable in liquid form. Preferably, said composition consists of fibrinogen, arginine and citrate.
Par « composition de fibrinogène sous forme liquide » on entend une composition comprenant du fibrinogène en solution, préférentiellement qui n’a pas été soumise à une étape de lyophilisation, dessiccation, déshydratation ou séchage, et qui n’a donc pas besoin d’être reconstituée avant utilisation.By “fibrinogen composition in liquid form” is meant a composition comprising fibrinogen in solution, preferably which has not been subjected to a lyophilization, drying, dehydration or drying step, and which therefore does not need to be reconstituted before use.
Un objet de l’invention est donc une composition pharmaceutique comprenant du fibrinogène stable sous forme liquide non reconstituée après lyophilisation.An object of the invention is therefore a pharmaceutical composition comprising stable fibrinogen in liquid form which is not reconstituted after lyophilization.
Un autre objet de l’invention est une composition pharmaceutique comprenant du fibrinogène et un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables, stable sous forme liquide.Another subject of the invention is a pharmaceutical composition comprising fibrinogen and one or more pharmaceutically acceptable excipients, stable in liquid form.
Le terme « excipient pharmaceutiquement acceptable » correspond à tout excipient avantageusement utilisable pour la formulation de protéines humaines, notamment aux substances choisies parmi les sels, les acides aminés, les sucres, les tensioactifs ou tout autre excipient.The term “pharmaceutically acceptable excipient” corresponds to any excipient advantageously usable for the formulation of human proteins, in particular to substances chosen from salts, amino acids, sugars, surfactants or any other excipient.
Les excipients pharmaceutiquement acceptables de l'invention excluent notamment l’isoleucine, la glycine, et le NaCl.The pharmaceutically acceptable excipients of the invention notably exclude isoleucine, glycine, and NaCl.
Avantageusement, les excipients pharmaceutiquement acceptables selon l’invention incluent l’arginine et/ou le citrate. La Demanderesse a mis en évidence qu'il était possible d'obtenir des compositions particulièrement stables dans le temps sous forme liquide comprenant du fibrinogène, de l’arginine et du citrate. Une telle composition est optimale, car elle limite le nombre d’excipients et donc le risque d’effets secondaires dus aux composants de la formulation tout en permettant la conservation sous forme liquide de la composition prête à l’emploi.Advantageously, the pharmaceutically acceptable excipients according to the invention include arginine and / or citrate. The Applicant has demonstrated that it is possible to obtain compositions which are particularly stable over time in liquid form comprising fibrinogen, arginine and citrate. Such a composition is optimal because it limits the number of excipients and therefore the risk of side effects due to the components of the formulation while allowing the ready-to-use composition to be stored in liquid form.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une composition comprenant, préférentiellement constitué, du fibrinogène, de l'arginine, et du citrate, et qui est stable sous forme liquide.Thus, in a preferred embodiment, the invention relates to a composition comprising, preferably consisting of, fibrinogen, arginine, and citrate, and which is stable in liquid form.
Préférentiellement, ledit fibrinogène est un fibrinogène humain.Preferably, said fibrinogen is a human fibrinogen.
Selon l'invention, on peut utiliser plusieurs sources de matière première contenant du fibrinogène. La composition de fibrinogène peut ainsi être issue de plasma sanguin autrement dénommées fractions plasmatiques, de surnageant de culture cellulaire ou de lait d’animaux transgéniques.According to the invention, several sources of raw material containing fibrinogen can be used. The fibrinogen composition can thus be obtained from blood plasma otherwise known as plasma fractions, cell culture supernatant or milk from transgenic animals.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention n'a subi aucune étape préalable de lyophilisation, dessiccation, déshydratation ou séchage.In a preferred embodiment, the composition of the invention has not undergone any prior lyophilization, drying, dehydration or drying step.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention n'a subi aucune étape préalable de reconstitution d’un lyophilisât.In a preferred embodiment, the composition of the invention has not undergone any prior stage of reconstitution of a lyophilisate.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l’invention est une fraction plasmatique, de préférence une fraction plasmatique obtenue à partir de plasma sanguin prépuririé.In a particular embodiment, the composition according to the invention is a plasma fraction, preferably a plasma fraction obtained from pre-purified blood plasma.
Par « fraction plasmatique obtenue à partir de plasma sanguin prépuririé», on entend toute partie ou sous-partie du plasma sanguin humain, ayant fait l’objet d’une ou plusieurs étapes de purification. Lesdites fractions plasmatiques incluent ainsi le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma (remis en suspension), la fraction I obtenue par fractionnement éthanolique (selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann), les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromatographie, y compris des chromatographies multicolonnes, et les filtrats.The term "plasma fraction obtained from prepurified blood plasma" means any part or sub-part of human blood plasma, which has been subjected to one or more purification steps. Said plasma fractions thus include the supernatant of cryoprecipitate plasma, the cryoprecipitate of plasma (resuspended), fraction I obtained by ethanolic fractionation (according to the method of Cohn or Kistler & Nitschmann), the eluates of chromatography and the non-adsorbed fractions chromatography columns, including multicolumn chromatographies, and filtrates.
Dans un mode de réalisation préféré de rinvention, la composition selon rinvention est issue d’un éluat de chromatographie ou d’une fraction non adsorbée de colonne de chromatographie, y compris de chromatographie multicolonnes.In a preferred embodiment of the invention, the composition according to the invention is obtained from a chromatography eluate or from a non-adsorbed fraction of a chromatography column, including multicolumn chromatography.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l’invention, la composition selon l’invention est issue d’une fraction plasmatique obtenue à partir de cryosurnageant ou de cryoprécipité remis en suspension.Thus, in a preferred embodiment of the invention, the composition according to the invention is obtained from a plasma fraction obtained from cryosupernatant or cryoprecipitate resuspended.
Selon l’invention, le « surnageant de plasma cryoprécipité », ou « cryosurnageant », correspond à la phase liquide obtenue après décongélation de plasma congelé (cryoprécipitation). Notamment, le cryosurnageant peut être obtenu par congélation de plasma sanguin à une température comprise entre -10°C et -40°C, puis décongélation douce à une température comprise entre 0°C et +6°C, préférentiellement entre 0°C et +1°C, suivie d’une centrifugation du plasma décongelé pour séparer le cryoprécipité et le cryosurnageant. Le cryoprécipité est un concentré en fibrinogène, fibronectine, facteur von Willebrand et facteur VIII, tandis que le cryosurnageant contient les facteurs du complément, les facteurs vitamine K dépendants tels que la protéine C, la protéine S, la protéine Z, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX et le facteur X, du fibrinogène, les immunoglobulines et l’albumine.According to the invention, the “cryoprecipitate plasma supernatant”, or “cryosupernatant”, corresponds to the liquid phase obtained after thawing of frozen plasma (cryoprecipitation). In particular, the cryosupernatant can be obtained by freezing blood plasma at a temperature between -10 ° C and -40 ° C, then gentle thawing at a temperature between 0 ° C and + 6 ° C, preferably between 0 ° C and + 1 ° C, followed by centrifugation of the thawed plasma to separate the cryoprecipitate and the cryosupernatant. Cryoprecipitate is a concentrate of fibrinogen, fibronectin, von Willebrand factor and factor VIII, while the cryosupernatant contains complement factors, dependent vitamin K factors such as protein C, protein S, protein Z, factor II, factor VII, factor IX and factor X, fibrinogen, immunoglobulins and albumin.
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la composition selon l’invention est peut être obtenue selon le procédé décrit par la Demanderesse dans la demande EP1739093 ou dans la demande WO2015/136217.In an advantageous embodiment of the invention, the composition according to the invention can be obtained according to the method described by the Applicant in application EP1739093 or in application WO2015 / 136217.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la composition selon l’invention provient de lait d’animaux transgéniques, par exemple obtenu selon la méthode décrite dans WOOO/17234 ou dans WOOO/17239.In another particular embodiment of the invention, the composition according to the invention comes from milk of transgenic animals, for example obtained according to the method described in WOOO / 17234 or in WOOO / 17239.
Dans un mode de réalisation, la composition de l'invention est susceptible d’être obtenue par le procédé comprenant les étapes suivantes :In one embodiment, the composition of the invention is capable of being obtained by the process comprising the following steps:
une étape de purification par chromatographie d’affinité; au moins une étape de sécurisation biologique; et une étape de formulation sous forme liquide.a purification step by affinity chromatography; at least one biological security step; and a step of formulation in liquid form.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l'étape de purification par chromatographie d'affinité se fait par chromatographie d’affinité utilisant des ligands d’affinité choisis parmi les anticorps, les fragments d’anticorps, les dérivés d’anticorps ou des ligands chimiques tels que des peptides, des peptides mimétiques, des peptoïdes, des nanofitines ou encore des ligands oligonucléotidiques tels que les aptamères.In a particular embodiment of the invention, the purification step by affinity chromatography is carried out by affinity chromatography using affinity ligands chosen from antibodies, antibody fragments, antibody derivatives or chemical ligands such as peptides, mimetic peptides, peptoids, nanofitins or even oligonucleotide ligands such as aptamers.
ίοίο
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition liquide, stable et comprenant du fibrinogène est obtenue selon le procédé comprenant les étapes suivantes :In a particular embodiment of the invention, the liquid, stable composition comprising fibrinogen is obtained according to the process comprising the following steps:
obtention d’une fraction de cryosurnageant de plasma sanguin, précipitation du cryo-surnageant par 8 % d’éthanol afin d’obtenir une fraction enrichie en fibrinogène, purification de la fraction de plasma sanguin enrichie en fibrinogène après remise en suspension par séparation sur gel de chromatographie d’affinité utilisant préférentiellement des ligands d’affinité choisis parmi les anticorps, les fragments d’anticorps, les dérivés d’anticorps ou des ligands chimiques tels que des peptides, des peptides mimétiques, des peptoïdes, des nanofitines ou encore des ligands oligonucléotidiques tels que les aptamères, récupération de la fraction adsorbée purifiée comprenant du fibrinogène, éventuellement, ajout d’excipients pharmaceutiquement acceptables, de préférence de l’arginine et/ou du citrate.obtaining a fraction of cryosupernatant from blood plasma, precipitation of the cryo-supernatant with 8% ethanol in order to obtain a fraction enriched in fibrinogen, purification of the fraction of blood plasma enriched in fibrinogen after resuspension by separation on gel affinity chromatography preferably using affinity ligands chosen from antibodies, antibody fragments, antibody derivatives or chemical ligands such as peptides, mimetic peptides, peptoids, nanofitins or even ligands oligonucleotides such as aptamers, recovery of the purified adsorbed fraction comprising fibrinogen, optionally, addition of pharmaceutically acceptable excipients, preferably arginine and / or citrate.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend en outre une étape de conservation pendant au moins 3 mois à 4°C.In a particular embodiment, the method further comprises a storage step for at least 3 months at 4 ° C.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la chromatographie d’affinité utilisée est une matrice d’affinité avec des ligands de type fragment dérivé d’anticorps de lama telle que la matrice Fibrinogen CaptureSelect (Life Technologies).In a particular embodiment of the invention, the affinity chromatography used is an affinity matrix with ligands of fragment type derived from llama antibodies such as the Fibrinogen CaptureSelect matrix (Life Technologies).
De manière particulièrement avantageuse, la composition selon l’invention est dépourvue de protéases et/ou d’activateurs de la fibrinolyse.In a particularly advantageous manner, the composition according to the invention is devoid of proteases and / or fibrinolysis activators.
Par «composition de fibrinogène dépourvue de protéases et/ou d’activateurs de la fibrinolyse», il est entendu que la composition de fibrinogène a subi une ou plusieurs étapes permettant l’élimination des protéases telles que la thrombine, la prothrombine, plasmine, plasminogène de telle manière que la quantité résiduelle de protéases et/ou d’activateurs de la fibrinolyse soit :By “fibrinogen composition devoid of proteases and / or fibrinolysis activators”, it is understood that the fibrinogen composition has undergone one or more stages allowing the elimination of proteases such as thrombin, prothrombin, plasminogen, plasminogen in such a way that the residual quantity of proteases and / or fibrinolysis activators is:
très fortement réduite en comparaison à la solution de Fibrinogène pré-purifiée avant étape de chromatographie, et/ou nulle, et/ou inférieure aux seuils de détection des méthodes communément utilisées par l’homme du métier.very greatly reduced compared to the fibrinogen solution pre-purified before the chromatography step, and / or zero, and / or below the detection thresholds of the methods commonly used by a person skilled in the art.
De manière avantageuse, le taux de prothrombine résiduel est inférieur à 5 pUI / mg de fibrinogène, le taux de plasminogène est inférieur à 15 ng / mg de fibrinogène.Advantageously, the level of residual prothrombin is less than 5 pUI / mg of fibrinogen, the level of plasminogen is less than 15 ng / mg of fibrinogen.
Dans un mode de réalisation particulier de rinvention, la composition selon rinvention est donc dépourvue de protéases telles que la thrombine et/ou la plasmine ou leurs pro-enzymes correspondants prothrombine (facteur II de la coagulation) et/ou plasminogène, qui sont des zymogènes potentiellement activables.In a particular embodiment of the invention, the composition according to the invention is therefore devoid of proteases such as thrombin and / or plasmin or their corresponding pro-enzymes prothrombin (coagulation factor II) and / or plasminogen, which are zymogens potentially activatable.
Dans un mode de réalisation particulier de rinvention, la composition de fibrinogène selon rinvention est dépourvue d’inhibiteurs de protéases et/ou d’anti-fibrinolytiques.In a particular embodiment of the invention, the fibrinogen composition according to the invention is devoid of protease inhibitors and / or of anti-fibrinolytics.
Par « inhibiteurs de protéases et/ou anti-fibrinolytiques», on entend toute molécule à activité antiprotéasique, notamment toute molécule à activité inhibitrice de sérine protéase et/ou antifibrinolytique, en particulier toute molécule à activité inhibitrice de thrombine et/ou antiplasmine, en particulier l’hirudine, la benzamidine, l’aprotinine, le florure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), la pepstatine, la leupeptine, l’antithrombine III associée ou non avec del’héparine, l’alpha 2 macroglobuline, l’alpha 1 antitrypsine, l’acide hexanoïque ou epsilon aminocaproïque, l’acide tranéxamique, l’alpha 2 antiplasmine.By “protease inhibitors and / or anti-fibrinolytics” is meant any molecule with antiprotease activity, in particular any molecule with serine protease inhibiting activity and / or antifibrinolytic, in particular any molecule with thrombin inhibiting activity and / or antiplasmin, in particular hirudin, benzamidine, aprotinin, phenylmethylsulfonyl florure (PMSF), pepstatin, leupeptin, antithrombin III associated or not with heparin, alpha 2 macroglobulin, alpha 1 antitrypsin, hexanoic acid or epsilon aminocaproic, tranexamic acid, alpha 2 antiplasmin.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène selon l’invention est dépourvue d’hirudine et/ou de benzamidine et/ou d’aprotinine et/ou de PMSF et/ou de pepstatine et/ou de leupeptine et/ou d’antithrombine III associée ou non avec de l’héparine et/ou d’alpha 2 macroglobuline et/ou d’alpha 1 antitrypsine et/ou d’acide hexanoïque et/ou epsilon aminocaproïque et/ou d’acide tranéxamique et/ou d’alpha 2 antiplasmine.In a particular embodiment of the invention, the fibrinogen composition according to the invention is devoid of hirudin and / or benzamidine and / or aprotinin and / or PMSF and / or pepstatin and / or leupeptine and / or antithrombin III associated or not with heparin and / or alpha 2 macroglobulin and / or alpha 1 antitrypsin and / or hexanoic acid and / or epsilon aminocaproic acid and / or tranexamic acid and / or alpha 2 antiplasmin.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène selon l’invention est dépourvue d’ions métalliques.In a particular embodiment of the invention, the fibrinogen composition according to the invention is devoid of metal ions.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition selon l’invention est avantageusement dépourvue de calcium.In a particular embodiment of the invention, the composition according to the invention is advantageously devoid of calcium.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène selon l’invention est dépourvue d’isoleucine, de glycine et/ou de NaCl.In a particular embodiment of the invention, the fibrinogen composition according to the invention is devoid of isoleucine, glycine and / or NaCl.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène selon l’invention est dépourvue d’albumine.In a particular embodiment of the invention, the fibrinogen composition according to the invention is devoid of albumin.
De manière avantageuse, la composition selon l’invention possède une pureté supérieure ou égale à 70%, de manière préférée supérieure ou égale à 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.Advantageously, the composition according to the invention has a purity greater than or equal to 70%, preferably greater than or equal to 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99%.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition selon l’invention ne comprend pas d’autres protéines copurifiées, avantageusement pas de FXIII et/ou de fibronectine.In a particular embodiment of the invention, the composition according to the invention does not comprise other copurified proteins, advantageously no FXIII and / or fibronectin.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la composition de fibrinogène selon l’invention peut également comprendre une ou plusieurs protéines accompagnantes, éventuellement copurifiées. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition selon l’invention comprend avantageusement du FXIII.In another particular embodiment of the invention, the fibrinogen composition according to the invention can also comprise one or more accompanying proteins, possibly copurified. In a particular embodiment of the invention, the composition according to the invention advantageously comprises FXIII.
La composition selon l’invention est soumise, directement après purification, aux étapes de mise en forme pharmaceutique sous forme liquide : formulation, filtration stérilisante et répartition en contenant (flacon ou autre dispositif de conservation/administration).The composition according to the invention is subjected, directly after purification, to the stages of pharmaceutical formatting in liquid form: formulation, sterilizing filtration and distribution in a container (bottle or other storage / administration device).
De manière particulièrement avantageuse, la composition selon l’invention n’est soumise à aucune étape de lyophilisation, dessiccation, déshydratation ou séchage.In a particularly advantageous manner, the composition according to the invention is not subjected to any stage of lyophilization, drying, dehydration or drying.
De manière particulièrement avantageuse, la composition selon l’invention est donc sous forme liquide sans avoir subi d’étape de reconstitution d’un lyophilisât.In a particularly advantageous manner, the composition according to the invention is therefore in liquid form without having undergone any stage of reconstitution of a lyophilisate.
De manière particulièrement avantageuse, la composition selon l’invention est sous forme liquide, et comprend donc, outre les éventuels excipients pharmaceutiquement acceptables, de l’eau.In a particularly advantageous manner, the composition according to the invention is in liquid form, and therefore comprises, in addition to any pharmaceutically acceptable excipients, water.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition sous forme liquide comprend du citrate et/ou de l’arginine, de préférence moins de 300mM d’arginine.In a particular embodiment of the invention, the composition in liquid form comprises citrate and / or arginine, preferably less than 300 mM of arginine.
De manière avantageuse, la composition selon l’invention est particulièrement adaptée à une administration par voie intraveineuse.Advantageously, the composition according to the invention is particularly suitable for administration by the intravenous route.
Un autre aspect de l'invention concerne la composition selon l'invention pour son utilisation en thérapie. Toutes les caractéristiques techniques énoncées précédemment s'appliquent ici.Another aspect of the invention relates to the composition according to the invention for its use in therapy. All the technical characteristics stated above apply here.
L'exemple qui suit illustre un mode de réalisation de la présente invention sans toutefois en limiter la portée.The example which follows illustrates an embodiment of the present invention without however limiting its scope.
Exemple 1 : Composition de fibrinogène liquide stableExample 1 Composition of Stable Liquid Fibrinogen
Matériel & méthodeMaterial & method
Fraction plasmatiquePlasma fraction
La matière première de départ est un pool de plasma humain préalablement soumis à une étape de cryo-précipitation puis soumis à une étape de précipitation avec 8% d’éthanol.The starting raw material is a pool of human plasma previously subjected to a cryo-precipitation step and then subjected to a precipitation step with 8% ethanol.
La solution de fibrinogène plasmatique pré-purifiée ainsi obtenue est diluée par 2 volumes de tampon d’équilibration du gel avant injection sur la colonne de chromatographie prééquilibrée en pH et en conductivité.The pre-purified plasma fibrinogen solution thus obtained is diluted with 2 volumes of gel equilibration buffer before injection on the chromatography column pre-balanced in pH and in conductivity.
Caractéristiques de la fraction plasmatique : fibrinogène antigénique ajusté par dilution à 4,74,8 g/L.Characteristics of the plasma fraction: antigenic fibrinogen adjusted by dilution to 4.74.8 g / L.
Solutions tamponBuffer solutions
La composition des solutions tampon utilisées lors des différentes étapes du procédé de chromatographie est résumée dans le tableau 1 ci-dessous.The composition of the buffer solutions used during the various stages of the chromatography process is summarized in Table 1 below.
Tableau 1 : Solutions tampon pour la chromatographie d’affinité.Table 1: Buffer solutions for affinity chromatography.
Gels de chromatographie d’affinitéAffinity chromatography gels
Pour la chromatographie, on utilise un gel d’affinité CaptureSelect Fibrinogen (Life 5 Technologies ref. 191291050, lots 171013-01 et 171013-05).For the chromatography, a CaptureSelect Fibrinogen affinity gel is used (Life 5 Technologies ref. 191291050, lots 171013-01 and 171013-05).
ColonnesColumns
Une colonne de 50 mm de diamètre (Référence XK 50/30 GE Healthcare), volume de gel 10 packé de 67 ml ; pour une hauteur de colonne de 3,4 cm a été utiliséeA column 50 mm in diameter (Reference XK 50/30 GE Healthcare), volume of gel 10 packaged with 67 ml; for a column height of 3.4 cm was used
Purification par affinitéAffinity purification
La solution de fibrinogène ajustée à environ 5 g/L est injectée sans autre ajustement sur la 15 colonne d’affinité CaptureSelect Fibrinogène équilibrée. Une charge d’environ 10 g/L a été appliquée.The fibrinogen solution adjusted to about 5 g / L is injected without further adjustment on the CaptureSelect Fibrinogen affinity column balanced. A load of approximately 10 g / L was applied.
L’éluat de chromatographie a ensuite été ultrafiltré et pré-formulé sur membrane de seuil de coupure 100 kDa (référence Pâli Oméga OSIOOCIO)The chromatography eluate was then ultrafiltered and pre-formulated on a cut-off membrane 100 kDa (reference Pâli Omega OSIOOCIO)
A la fin du procédé, le produit obtenu a une concentration en fibrinogène coagulable de 15,2 g/L et en fibrinogène antigénique de 15,2 mg/ml.At the end of the process, the product obtained has a concentration of coagulable fibrinogen of 15.2 g / L and of antigenic fibrinogen of 15.2 mg / ml.
Exemple 2 : stabilité d’une composition de fibrinogène liquideExample 2: Stability of a Liquid Fibrinogen Composition
Composition de fibrinogèneFibrinogen composition
La composition est formulée à minima avec de l’arginine lOOmM et du citrate 8,5mM à pH 7,0.The composition is formulated at least with lOOmM arginine and 8.5mM citrate at pH 7.0.
Stabilité de la composition de fibrinogèneStability of fibrinogen composition
La composition est mise en stabilité à 4°C sous air.The composition is stabilized at 4 ° C in air.
Des échantillons sont prélevés à ΤΟ, T+l mois, T+2 mois, et T+3 mois.Samples are taken at ΤΟ, T + 1 month, T + 2 months, and T + 3 months.
Les résultats à T+3 mois montrent que:The results at T + 3 months show that:
les chaînes alpha, beta et gamma restent stable dans le temps, confirmant la conservation de l’intégrité du fibrinogène liquide;the alpha, beta and gamma chains remain stable over time, confirming the preservation of the integrity of the liquid fibrinogen;
le ratio fibrinogène coagulable/fibrinogène antigène est conservé et stable à 1, confirmant la conservation de l’intégrité et de la fonctionnalité du fibrinogène liquidethe ratio of coagulable fibrinogen / fibrinogen antigen is conserved and stable at 1, confirming the conservation of the integrity and functionality of liquid fibrinogen
- les taux de monomères et de polymères sont conservés, montrant l’absence de phénomènes d’agrégation.- the levels of monomers and polymers are preserved, showing the absence of aggregation phenomena.
RésultatsResults
Cet essai démontre clairement que la composition de fibrinogène est stable sous forme liquide à 4°C pendant 3 mois.This test clearly demonstrates that the fibrinogen composition is stable in liquid form at 4 ° C for 3 months.
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