FR3037403A1 - Procede de prediction de la sensibilite d'une tumeur gastro-intestinale a un traitement inhibiteur - Google Patents

Abstract

La présente invention a principalement pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'une thérapie antitumorale comprenant l'administration d'un inhibiteur de la quinolinate phosphoribosyl transférase (QPRT). Un procédé selon l'invention comprend notamment une étape de détermination de l'expression de QPRT dans un échantillon test de ladite tumeur gastro-intestinale, l'expression de QPRT dans des cellules de l'échantillon test étant indicateur de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de QPRT. La présente invention a également pour objet l'utilisation de QPRT en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT.

Description

1 PROCEDE DE PREDICTION DE LA SENSIBILITE D'UNE TUMEUR GASTRO-INTESTINALE A UN TRAITEMENT INHIBITEUR La présente invention se situe dans le domaine médical et plus précisément dans le domaine de la thérapie anti-cancéreuse. L'invention a principalement pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'une thérapie anti-tumorale comprenant l'administration d'un inhibiteur de la quinolinate phosphoribosyl transférase (QPRT). Un procédé selon l'invention comprend notamment une étape de détermination de l'expression de QPRT dans un échantillon test de ladite tumeur gastro-intestinale, l'expression de QPRT dans des cellules de l'échantillon test étant indicateur de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de QPRT. La présente invention a également pour objet l'utilisation de QPRT en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT. Afin d'optimiser les traitements thérapeutiques et la pertinence des essais cliniques dans le domaine de la thérapie anti-cancéreuse, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et de biomarqueurs prédictifs de la sensibilité des patients à ce traitement, qu'il soit utilisé seul d'un ou en combinaison avec d'autres approches thérapeutiques, demeure un objectif important pour le développement futur de ces traitements. Il est donc nécessaire de disposer de nouveaux traitements et de procédés efficaces permettant de prédire la sensibilité d'un patient à ces traitements lourds et associés à des effets secondaires importants. Les inventeurs ont maintenant développé un nouveau procédé permettant la sélection de patients atteints d'une tumeur gastro-intestinale susceptibles de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT. Ce procédé comprend la détermination de l'expression de QPRT dans un échantillon test de tumeur du patient, une expression supérieure dans l'échantillon test par rapport à un échantillon de référence étant indicatrice de la sensibilité du patient à un traitement inhibiteur de QPRT. Plusieurs signatures d'expression génique (« classifiers ») permettant de suivre l'évolution des maladies de Crohn et les colites ont été décrites (Montero-Melendez et al., 2013). La publication de Watanabe (2013) décrit une signature d'expression génique et une 25 méthode de prédiction de l'évolution d'une colite ulcérative vers un cancer colorectal. La signature décrite dans ce document comprend 40 gènes exprimés de façon différentielle selon que les patients atteints de lésions néoplastiques, ou non atteints par de telles lésions. La publication de Malik et al (2013) décrit la structure cristallographique de la QPRT humaine sous une forme complexée avec son inhibiteur, l'acide phtalique. Cet inhibiteur est 30 cependant peu spécifique, la concentration à laquelle il est effectif in vitroest de l'ordre du millimolaire (10-3M). 3037403 2 La publication de Sahm et al (2013) enseigne que l'acide quinolique, métabolite endogène du tryptophane et précurseur du NAD, confère aux gliomes une résistance au stress oxydatif. L'inflammation chronique constitue un terrain fertile au développement de cancers. Dans les muqueuses enflammées, pour autant le stress oxydatif induit une érosion des télomères et des 5 signes de senescence réplicative au sein des cellules souches intestinales. Les inventeurs ont montré que la comparaison du profil d'expression génique de cellules épithéliales de colon humaines ayant échappé à la sénescence induite par un stress oxydatif avec le profil génique de la lignée parentale met en exergue l'induction d'un programme génique spécifique, caractérisé par l'activation d'une cinquantaine de gènes et la répression d'une trentaine 10 d'autres. Ce programme génique est dit alternatif (ALT). Les inventeurs ont montré in vitro que l'expression de QPRT confère un avantage de survie aux cellules ayant échappé à la senescence, dans des conditions d'inflammation chronique ou lorsqu'elles sont soumises à un agent oxydant. Les inventeurs ont aussi montré que la déplétion en QPRT des cellules ayant échappé à la senescence induit la mort de ces cellules par apoptose dans des conditions d'inflammation 15 chronique, et que l'inhibition de l'expression de QPRT empêche ces cellules de tolérer des activations oncogéniques. Ils ont également démontré que des cellules de lignées cancéreuses intestinales ayant un programme alternatif (ALT) activé (score de la signature élevé) sont dépendantes la protéine QPRT pour leur prolifération. Par ailleurs, les inventeurs ont montré que la protéine QPRT est absente dans les 20 entérocytes de tissu normal de l'intestin, alors qu'une augmentation du nombre de cellules épithéliales marquées lors de la détection de QPRT est observée dans les dysplasies de bas- ou de haut-grade et dans les cancers développés dans un contexte inflammatoire, ainsi que dans les cellules épithéliales des adénomes et des cancers sporadiques. De plus, une proportion des adénocarcinomes oesophagiens exprime la protéine QPRT alors qu'aucun marquage n'est observé dans l'épithélium malpighien, utilisé comme contrôle interne. La protéine QPRT est donc potentiellement une cible thérapeutique particulièrement intéressante et l'inhibition de QPRT constitue donc une approche thérapeutique anti-tumorale prometteuse, le cas échéant en association avec un autre traitement anti-tumoral, en particulier avec une thérapie capable d'induire un stress oxydant.

L'invention sera maintenant décrite de manière détaillée à l'aide d'exemples destinés à l'illustrer sans la limiter, diverses modifications pouvant y être apportées sans sortir du cadre général de l'invention. La présente invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la 35 quinolinate phosphoribosyltransférase (QPRT), à partir d'un échantillon test de ladite tumeur, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) La détermination de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test, 3037403 3 b) La comparaison de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test avec l'expression de QPRT dans un échantillon de référence, c) La sélection d'un patient susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT à partir de la comparaison de l'étape b), un niveau d'expression supérieur de 5 QPRT dans l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de QPRT. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPRT), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : i) 10 l'obtention d'un échantillon test de ladite tumeur, ii) la détermination de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test, iii) la comparaison de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test avec l'expression de QPRT dans un échantillon de référence, iv) la prédiction de la sensibilité d'un d'un patient à un traitement inhibiteur de QPRT à partir de la comparaison de l'étape iii), un niveau d'expression supérieur de QPRT dans l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de 15 référence étant indicateur de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de QPRT. Par « sensibilité d'un patient à un traitement », on entend l'observation d'un effet thérapeutique tel que l'amélioration de la survie d'un patient ayant reçu ledit traitement thérapeutique. L'absence de réponse d'un patient, ou l'absence de sensibilité du patient à un traitement thérapeutique, est au contraire définie par le terme de « résistance » d'un patient audit 20 traitement thérapeutique, dans laquelle aucun effet thérapeutique n'est observé. Un procédé in vitro de sélection d'un patient susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT, permet de prédire la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT. La quinolinate phosphoribosyltransférase (QPRT, UniProtKB Q15274 mise à jour le 18 25 mai 2010 (SEQ ID N°1), aussi dénommée Nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase catalyse la conversion de l'acide quinolinique (QA) en nicotinamide mononucleotide (NAMN) par le transfert du groupe phosphoribosyl du 5-phospho-D-ribose-1-diphosphate (PRPP), lors de la première étape de biosynthèse du NAD+. Par « traitement inhibiteur de QPRT » on entend l'application d'un traitement destiné à 30 inhiber l'activité et/ou les effets de la protéine QPRT. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, le traitement inhibiteur de QPRT comprend l'administration d'un inhibiteur de l'activité enzymatique de QPRT, et notamment un agoniste de la protéine QPRT. Un exemple connu d'un agoniste de l'activité enzymatique de QPRT est l'acide phtalique (Malik et al. 2013). Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale, susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT, comprenant la détermination du niveau d'expression de QPRT dans un échantillon test de tumeur, dans lequel l'échantillon test de tumeur est choisi parmi : un tissu tumoral, une pièce opératoire et une biopsie.

3037403 4 Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT, dans lequel ledit patient est un patient non-traité pour ladite tumeur. Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'échantillon test de ladite 5 tumeur comprend des cellules épithéliales. Selon un aspect encore plus particulier d'un procédé selon l'invention, l'échantillon test de ladite tumeur est issu de la tumeur primaire. L'expression «niveau d'expression supérieur » indique que le niveau d'expression observé dans ledit échantillon test est plus important que le niveau d'expression observé dans l'échantillon de référence, du point de vue du nombre de cellules dans lesquelles l'expression est détectée et/ou 10 de l'intensité du signal détecté et/ou de la localisation des cellules pour lesquelles l'expression est détectée. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPRT), ledit procédé comprenant la détermination de 15 l'expression de QPRT dans les cellules épithéliales dudit échantillon test. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPRT), ledit procédé comprenant la détermination de la présence de QPRT dans les cellules épithéliales dudit 20 échantillon test, et dans lequel la détection de la présence de QPRT dans des cellules épithéliales de l'échantillon test est indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de QPRT. Par « cellules marquées » on entend des cellules pour lesquelles un signal est détecté lors de la recherche de l'expression de QPRT.

25 En effet, les inventeurs ont montré que la protéine QPRT est absente dans les entérocytes de tissu normal de l'intestin, alors qu'une augmentation du nombre de cellules épithéliales marquées lors de la détection de QPRT est observée dans les dysplasies de bas- ou de haut-grade et dans les cancers développés dans un contexte inflammatoire, ainsi que dans les cellules épithéliales des adénomes et des cancers sporadiques.

30 De plus, une proportion des adénocarcinomes oesophagiens exprime la protéine QPRT alors qu'aucun marquage n'est observé dans l'épithélium malpighien, utilisé comme contrôle interne. De façon avantageuse, dans un procédé selon l'invention, l'expression de la protéine QPRT est déterminée par comparaison avec l'expression de la protéine QPRT dans un échantillon de 35 référence, l'expression de la protéine QPRT dans un échantillon de référence étant notamment choisie parmi : l'expression de QPRT dans un échantillon test de tissu sain de même nature que le tissu de l'échantillon test, l'expression de QPRT dans un échantillon de tissu d'un patient atteint d'une maladie gastro-intestinale inflammatoire non associée à des lésions dysplasiques (c'est-à-dire 3037403 5 de nature non tumorale), et/ou l'expression de QPRT dans un échantillon de tissu du patient testé, prélevé alors que le patient n'était pas atteint d'une tumeur gastro-intestinale. Les maladies gastro-intestinales inflammatoires non tumorales connues sont : la maladie de Crohn, la colite ulcérative ; la gastrite chronique et les reflux gastro-oesophagiens chronique (dans 5 le cadre de l'adénocarcinome). Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, dans lequel la détermination de l'expression de QPRT comprend la détermination de la présence de la protéine QPRT dans un échantillon test de ladite tumeur.

10 La détermination du niveau d'expression de la protéine QPRT est réalisée quantitativement ou semi-quantitativement par tout procédé connu par l'homme du métier permettant la détection spécifique et/ou la quantification d'une protéine particulière dans un échantillon. Un tel procédé de détermination est notamment choisi parmi les procédés utilisant des anticorps liant QPRT, incluant en particulier l'immunohistochimie (IHC), une détection par immunofluorescence (IF), par 15 immuno-précipitation, par une technique ELISA ou par une méthode de type western-blot. L'expression de QPRT peut être définie à l'aide d'un score histologique prenant en compte, d'une part, l'intensité de marquage observée et, d'autre part, le pourcentage de cellules marquées, ou en combinant le pourcentage de cellules marquées et l'intensité de marquage. Selon ce procédé, des sections d'échantillon tumoral sont analysées par microscopie après avoir mis en présence 20 lesdites sections avec un anticorps liant spécifiquement QPRT. Selon un mode plus particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT, dans lequel la détermination de la présence de la protéine QPRT est réalisée au moyen d'au moins une étape d'immunohistochimie.

25 Par « immunohistochimie », on entend d'une méthode de localisation de protéines dans les cellules d'une coupe de tissu, par la détection d'un antigène particulier au moyen d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux liant cet antigène. Le couple anticorps-antigène peut être visualisé par exemple par la conjugaison à une enzyme qui peut catalyser une réaction de production de couleur, par l'utilisation d'anticorps marqués, notamment par un fluorophore, ou par l'utilisation 30 d'anticorps dits « secondaires » capables de lier les anticorps liant l'antigène. Dans une méthode d'immunohistochimie, le tissu est placé sur un support solide. Un anticorps primaire lié à un système de détection (ou un anticorps primaire suivi d'un anticorps secondaire) est ajouté. Le signal est observé par des techniques de microscopie. Dans un mode particulier de réalisation d'un procédé selon l'invention de sélection d'un 35 patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT, l'échantillon test de ladite tumeur est mis en contact avec un anticorps liant QPRT, ledit anticorps étant choisi panni les anticorps polyclonaux anti-QPRT et les anticorps monoclonaux anti-QPRT.

3037403 6 Selon un mode particulier de réalisation d'un procédé selon l'invention, ledit anticorps lie QPRT en conditions natives, l'homme de l'art peut aisément choisir un anticorps répondant à ce critère, on peut citer notamment l'anticorps Sigma HPA011887. Dans ces conditions, QPRT se présente notamment sous la forme d'un hexamère.

5 Selon un autre mode particulier de réalisation d'un procédé selon l'invention, ledit anticorps lie QPRT lors d'une incubation en conditions dénaturantes, on peut citer notamment l'anticorps Abcam ab57175. Dans ces conditions, QPRT est sous forme monomérique. Selon un mode encore plus particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un 10 traitement inhibiteur de QPRT, dans lequel la détermination de la présence de la protéine QPRT dans l'échantillon test de ladite tumeur est réalisée au moyen d'au moins une étape d'immunohistochimie comprenant la localisation de cellules marquées au sein du tissu épithélial de l'échantillon test. Selon un mode encore plus particulier, un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité 15 d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, selon l'invention, comprend la détermination du pourcentage de cellules épithéliales marquées au sein du tissu épithélial de l'échantillon test. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur 20 de QPRT, dans lequel la détermination de l'expression de QPRT comprend la détermination du pourcentage de cellules tumorales marquées. Selon un aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention, un niveau d'expression de QPRT dans l'échantillon test correspondant à au moins 10% des cellules épithéliales marquées est indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de QPRT.

25 Selon un autre mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, dans lequel la détermination de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test, et notamment dans les cellules épithéliales du dit échantillon test, comprend la détermination du niveau de l'expression transcriptionnelle du gène codant pour QPRT, et dans lequel un niveau 30 d'expression transcriptionelle supérieur du gène codant pour QPRT dans l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence est indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de QPRT. Selon un autre mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie 35 QPRT, dans lequel la détermination du niveau d'expression de QPRT comprend la détermination du niveau d'expression d'un ARNm codant pour la protéine QPRT. Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend la détermination de la quantité d'un ARNm codant pour la protéine QPRT. La détermination de la quantité de l'ARNm codant pour la protéine QPRT est 3037403 7 réalisée par tout procédé connu par l'homme du métier permettant la détection spécifique d'un ARNm dans un tissu. Un tel procédé comprend notamment la détection spécifique d'un ARNm à l'aide de sondes d'acide nucléique complémentaires de la séquence dudit ARNm, notamment par RT-PCR, par un procédé de type Northern-Blot ou par hybridation sur une sonde immobilisée.

5 La PCR quantitative permet de mesurer la quantité initiale d'acide nucléique. Les acides nucléiques amplifiés, et notamment les ARNm, peuvent être détectés et quantifiés par tout procédé connu par un homme du métier, tel que notamment par spectrométrie à 260 nm ou par Northern blot en utilisant un procédé d'hybridation de sondes radioactives ou fluorescentes sur l'acide nucléique amplifié.

10 La séquence nucléotidique de l'ARNm correspondant à la quinolinate phosphoribosyltransférase est connue (NCBI référence NM_014298, mise à jour le 15 mars 2015, SEQ ID N°2). Un homme du métier spécialiste du domaine technique concevra aisément, à partir de cette séquence nucléotidique, des amorces capables de s'hybrider de manière spécifique à l'acide nucléique codant pour QPRT, permettant ainsi sa détection. A titre d'exemple, les amorces 15 décrites dans la présente demande de brevet (SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4) sont utilisables dans un procédé selon l'invention. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPRT), à partir d'un échantillon test de 20 ladite tumeur, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) La détermination, dans ledit échantillon test, du niveau de l'expression transcriptionnelle du gène codant pour QPRT et d'au moins un autre gène cité dans le programme ALT, b) La comparaison de l'expression transcriptionnelle, dans ledit échantillon test, du 25 gène codant pour QPRT et d'au moins un gène identifié dans le programme ALT, avec l'expression transcriptionnelle de ce QPRT et d'au moins un gène identifié dans le programme ALT, dans un échantillon de référence, c) La sélection d'un patient susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT à partir de la comparaison de l'étape b), un niveau d'expression supérieur de 30 QPRT dans l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de QPRT. L'expression des gènes de la signature du programme ALT, désigne les 23 gènes indiqués dans la Figure 9, dont les inventeurs ont démontré que l'expression est supèrieure à des échantillons de colon sains.

35 Selon un autre mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, dans lequel la détermination de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test comprend la détermination du niveau de l'expression transcriptionnelle du gène codant pour 3037403 8 QPRT, et dans lequel un niveau d'expression transcriptionnel supérieur du gène codant pour QPRT dans l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence est indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de QPRT. Selon un mode particulier de réalisation, dans un procédé in vitro de prédiction de la 5 sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale est choisie parmi : le cancer colorectal, le cancer gastrique et l'adénocarcinome de rcesophage. L'expression « cancer colorectal » désigne une tumeur issue de la transformation néoplasique des cellules épithéliales de la muqueuse du colon ou du rectum. Le cancer colorectal 10 peut se développer sur un contexte inflammatoire (colites ulcératives ou maladie de Crohn) ou non et selon résulter de la progression maligne de dysplasie ou de polypes. Selon la taille et la profondeur de la tumeur, l'infiltration des ganglions et leur nombre, les tumeurs sont classées des stades de 0 à 4 (classification TNM) L'adénocarcinome gastrique désigne une tumeur issue de la transformation néoplasique de 15 la muqueuse de l'estomac et résulte de la progression d'une gastrite chronique en gastrite chronique atropique, métaplasie, dysplasie avant l'éventuelle évolution en adénocarcinome. On distingue les stades localisés, localement avancée et métastatiques. L'adénocarcinome oesophagien désigne une tumeur issue de l'épithélium de la glande de Barrett et résulte d'une cicatrisation anormale de lésions liées à l'aggression chronique de la 20 muqueuse du bas de rcesophage par un reflux gastrooesophagiens chronique. Le stumeurs sont classées selon la classification TNM). Selon un mode plus particulier de réalisation, dans un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale est développée dans un contexte inflammatoire 25 chronique. L'expression « contexte inflammatoire chronique » désigne la répétition de phases d'inflammation et de rémission, cette période peut s'étendre sur des années, comme pour les patients atteints de maladie de Crohn ou de colites ulcératives, conduisant progressivement à une altération de l'épithélium, en induisant par exemple une instabilité génétique dans les cellules 30 épithéliales. Cette inflammation chronique augmente sur du long terme l'incidence de cancers. Selon un mode encore plus particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale développée sur un contexte inflammatoire chronique à un traitement inhibiteur de QPRT, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale étant un cancer colorectal.

35 Selon un autre mode particulier de réalisation, dans un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale est un cancer colorectal sporadique.

3037403 9 Les tumeurs qui ne se développent pas sur un contexte inflammatoire sont dites sporadiques, elles résultent en général de la mutation du gène APC. Selon un autre mode particulier de réalisation, dans un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, 5 selon l'invention, ladite tumeur gastro-intestinale est un cancer colorectal qui atteint des patients ayant des mutations germinales sur le gène APC. Ces patients développent des polyposes adénomateuses juvéniles (FAP), qui peuvent évoluer en CRC. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de QPRT, combiné à un 10 autre traitement anti-tumoral. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ledit traitement anti-tumoral est choisi parmi : la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT, ledit patient ayant fait l'objet d'une étape de chirurgie destinée à retirer ladite 15 tumeur. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro d'identification d'une tumeur susceptible de répondre à un traitement comprenant l'administration d'un agent inhibiteur de QPRT, à partir d'un échantillon test de ladite tumeur, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : 20 a. La détermination de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test, b. La comparaison de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test avec l'expression de QPRT dans un échantillon de référence, c. L'identification de la tumeur susceptible de répondre à un traitement comprenant l'administration d'un agent inhibiteur de QPRT, à partir de la 25 comparaison de l'étape b), un niveau d'expression supérieur de QPRT dans l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité de ladite tumeur à un traitement inhibiteur de QPRT. Selon un autre mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation de QPRT en tant 30 que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT. L'invention a également pour objet l'utilisation de QPRT en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT.

35 Selon un aspect particulier, l'invention a également pour objet l'utilisation de QPRT en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT combiné à un traitement anti-tumoral, de préférence un traitement anti-tumoral susceptible d'induire un stress oxydatif des cellules tumorales.

3037403 10 Référence des séquences citées: SEQ ID N°1 : protéine QPRT. SEQ ID N°2 : séquence nucléotidique codant pour QPRT. SEQ ID N°3 : amorce pour la détection de QPRT.

5 SEQ ID N°4 : amorce pour la détection de QPRT. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et figures suivants. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES 10 Figures lA et 1B : L'échappement à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique permet l'émergence de cellules à risque. Fig.lA : Des cellules épithéliales de colon humaines immortalisées (HCEC-hTERT) ont été soumises tous les deux jours à des surnageants de macrophages activés (SMA). Les cellules arrêtent rapidement de proliférer (comme démontré par le taux d'histone H3-phosphorylé, pS10- 15 H3), entrent en sénescence comme démontré par la détection d'une activité SA-P-galactosidase, l'accumulation de protéine p53 acétylé (Ac-p53) et l'induction de son gène cible CIP1 (p21). Après un délai d'un mois, les cellules se remettent à proliférer. Fig.

1B : Les cellules ayant échappé à la sénescence (Echap, A et B issues de deux expériences distinctes) et les cellules HCEC parentales (Par) ont été soit traitées au tert-butyl-hydoxy-peroxyde (TBHP) (panel de gauche) soit transduites 20 par une version activée de la protéine RAS (HRASG12V, panel de droite) et colorées au cristal violet 12 jours plus tard. Le taux de protéine RAS est analysé par Western-blot. Figures 2A et 2B: L'échappement à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique résulte de l'induction du gène embryonnaire ZEB1. Fig. lA : Panel de gauche : analyse de l'expression des gènes SNAIl, TWIST2, ZEB1 et ZEB2 par q-RT-PCR. L'expression relative 25 est définie en comparaison au gène de ménage HPRT1 et aux cellules HCEC parentales. L'expression des gènes SNAI2 et TWIST1 est en dessous du seuil de détection. Panel de droite: analyse de l'expression des protéines ZEB, SNAIL et TWIST par Western-blot. Fig.

1B : Les cellules HCEC-hTERT ont été transduites par Zebl ou Zeb2, soumises soit à des surnageants de macrophages activés (SMA) ou à du TBHP. Après 12 jours de traitement, les cellules ont été 30 colorées au cristal violet. Figures 3A et 3B: La résistance au stress oxydatif est liée à l'induction d'un programme génique spécifique. Fig.

3A: La comparaison des profils géniques de cellules HCEC-hTERT ayant échappé à l'inflammation chronique (issues de deux expériences indépendantes, Echap A et B) ou transduites par Zebl ou Zeb2 met en exergue un ensemble de 49 gènes communément induits et de 35 32 gènes communément réprimés (voir Figure 12). Parmi cette liste, les deux gènes les plus induits sont QPRT et APOE. Fig.

3B: Les cellules HCEC ont été transduites par QPRT ou APOE et soumises soit à des surnageants de macrophage activés (SMA) soit un traitement au TBHP. Après 12 jours de traitement, les cellules ont été colorées au cristal violet.

3037403 11 Figures 4A et 4B : La survie des cellules ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique est dépendante de l'expression de QPRT. Fig.

4A: Panel du haut : les cellules HCEC ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique (Echap) ont été infectées par des vecteurs lentiviraux exprimant deux shRNA distincts dirigés 5 contre l'ARN QPRT (shRNA QPRT A et B) et soumises à des surnageants de macrophage activés (SMA). Après 12 jours de traitement, les cellules sont colorées au cristal violet. Les cellules HCEC parentales (Par) et Echap infectées par un shRNA control ont été utilisées respectivement comme contrôles négatif et positif. Panel du bas : analyse de QPRT et de la caspase 3 clivée (cl. casp. 3) par Western-blot.

10 Fig.

4B : Panel du haut : les cellules HCEC ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique (Echap) ont été déplétées en QPRT par ARN interférence et infectées par un vecteur rétroviral exprimant la version activée de la protéine HRAS (HRASG12V). 12 jours après infection, les cellules ont été colorées au cristal violet. Panel du bas : analyse de QPRT et RAS par Western blot.

15 Figure 5: Classification des lignées humaines de carcinomes colorectaux en fonction du score du programme alternatif. Les lignées utilisées dans les tests suivants et dans lesquelles le programme est induit sont OUMS-23, C2BBe 1, CL-14 ; les lignées dans lesquelles le programme n'est pas induit sont SW116, HCT116, HT-29, SW403, COLO-320. Figure 6 : La prolifération des lignées cancéreuses colorectales dans lesquelles le programme 20 alternatif est induit est dépendante de l'expression de QPRT. Panels du haut: différentes lignées colorectales dans lesquelles le programme alternatif est induit (notées en rouge) ou non (notées en vert) ont été infectées par des vecteurs lentiviraux exprimant des shRNA dirigés contre l'ARN QPRT (shRNA QPRT A et B) et colorées au cristal violet douze jours après infection. Panel du bas: analyse de QPRT dans les différentes lignées par Western-blot. .

25 Figure 7: Analyse de QPRT sur des échantillons humains par immunohistochimie (I). Exemples de marquage de QPRT par immunohistochimie sur des échantillons de colon sain (en haut à gauche), de muqueuses enflammées (en haut à droite), de dysplasies de bas- ou de haut-grade (rde et 3' rangée en partant du haut) ou des carcinomes développés sur un contexte inflammatoires. Echelle : 100 um.

30 Figure 8: Analyse de QPRT sur des échantillons humains par immunohistochimie (II). Exemples de marquage de QPRT par immunohistochimie sur des échantillons d'adénomes faiblement ou fortement dysplasiques et dans des cancers sporadiques. Echelle 100 um. Figures 9A à 9C: Le programme alternatif est induit dans les muqueuses enflammées de patients atteints de colites ulcératives ou de maladie de Crohn. Fig.

9A. La comparaison de la signature du 35 programme ALT aux profils géniques de patients atteints de maladie de Crohn (CD) ou de colite ulcérative (UC) (séries G5E36807 et G5E37283) met en évidence deux groupes de gènes distincts : notés cluster I et II. Les deux clusters II présentent une liste commune de 23 gènes qui constituent la signature du programme ALT in vivo. Fig.

9B-C. La signature du programme ALT permet de 3037403 12 ségréger un certain nombre de patients. Notons dans la série de patients atteints de colites ulcératives GSE37283 la capacité de la signature à ségréger ceux ayant ou non développé des lésions colorectales cancéreuses. Figures 10A à 10C : Analyse de la signification biologique du programme alternatif sur une large 5 cohorte de patients atteints de cancers colorectaux sporadiques (tumeurs primaires de patients n'ayant subi aucun traitement thérapeutique). L'analyse est menée sur une cohorte de 566 carcinomes colorectaux (GSE39582) classifiés selon leur profil génique en six types moléculaires (de Cl à C6, Marisa et al., 2013). Fig.

10A. Analyse du score de la signature du programme alternatif dans les six types moléculaires. Fig.

10B. Analyse de la corrélation entre les scores des 10 signatures du programme alternatif et des cellules souches intestinales Lgr5 et EphB2. Fig.

10C. Représentation de Kaplan-Meier de la survie sans récidive de patients atteints de cancers colorectaux selon le score du programme ALT, élevé, intermédiaire ou faible. Figure 11 - Analyse de QPRT par immunohistochimie dans les adénocarcinomes oesophagiens. Exemples d'adénocarcinomes oesophagiens exprimant (QPRT+) ou non (QPRT-) la protéine 15 QPRT. L'épithélium malpighien du tiers inférieur de l'oesophage est utilisé comme contrôle interne (panel en bas à droite). Echelle 100 Figure 12: Liste des gènes communément induits ou réprimés dans les cellules HCEC ayant échappé à la sénescence induite en réponse à une inflammation chronique (Echap A et B) ou transduites par Zebl ou Zeb2.

20 EXEMPLES Exemple 1: Matériel et méthodes Plasmides et lignées : Les constructions HRASGI2v, ZEB1 et ZEB2 pBabe Puro ont été décrites 25 antérieurement (Morel et al., 2012). Les vecteurs d'expression APOEE3 et QPRTen pbabe Puro ont été générés à partir des vecteurs pLenti-GIII-hAPOE-GFP-2A-Puro constructs (abm) et QPRT pCMV6 (Origene). Le cDNA QPRT RK138/139 a été synthétisé par la société Genscript et sous-cloné dans le vecteur rétroviral pBabe Puro (Addgene). Les shRNA QPRT A (5'- TCGCTCTGAAGGTGGAGT-3') and shRNA QPRT B (5'-AGTCCTAAACCGGAAGAGG-3') 30 en pLK0.1 ont été obtenus auprès de la société Sigma. Les lignées HT-29, HCT116, 5W403, COL0320HSR and C2BBe 1 ont été obtenues auprès de l'ATCC. Les lignées 0UM523 et CL-14 ont été fournies par la banque cellulaire JCRB (Japon) et le DSMZ GmbH (Allemagne), respectivement. Les lignées 0UM523 and c2BBe 1 ont été cultivées en milieu DMEM (Life Technologies) complémenté par 10% SVF (Cambrex) et 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (PS, 35 Life Technologies), les lignées HT-29 et HCT116 en milieu McCoy's 5A (Life Technologies) complémenté par 10% SVF + 100 U/ml PS, les lignées SW116, 5W403 and C0L0320 en milieu RPMI (Life Technologies) complémenté avec 10% FBS + 100 U/ml PS, et la lignée CL-14 en milieu DMEM/HAMF12 1:1 (Invitrogen) complémenté avec 20% FBS et 100 U/ml PS. Les 3037403 13 cellules primaires épithéliales de colon ont été obtenues auprès de la société abm (T4056), immortalisées par transduction d'hTERT et cultivées in milieu Prigrow III (TM003, abm) complémenté 5% FBS and 100 U/ml PS sur des boites de collagène (BD BioCoat Collagen type I, Dutscher).

5 Induction d'un stress oxydatif dans les cellules HCEC: La lignée monocytaire THP-1 a été obtenue auprès de l'ATCC et cultivée en milieu RPMI (Life Technologies) complémenté avec 10% FBS, 100 U/ml PS, 1 mM Sodium pyruvate (Life Technologies) and des acides aminés non-essentiels (Life Technologies). La différentiation cellulaire (5.107 cellules) a été induite par un traitement au PMA (0.162 jtM, Sigma) pendant une journée et l'activation des macrophages ainsi 10 obtenus ensuite induite par du LPS (LPS-EB ultra-pure de la lignée E.coli 0111:B4, InvivoGen) pendant une journée. Le surnageant a été collecté, filtré sur 0.45 jtM, dilué au demi dans le milieu de culture des HCEC et placé sur les cellules HCEC (5 x105 en boite 6 puits). Le surnageant des macrophages activés a été renouvelé tous les deux jours. De manière similaire, le traitement des cellules HCEC avec du tert-Butyl-hydroperoxide (30 jtM, Sigma) a été renouvelé tous les deux 15 jours. Les cellules ont été colorées au cristal violet après dix jours de traitement. Les tests SA-13- galactosidase ont été effectués comme préalablement décrits (Dimri et al., 1995). Infections rétrovirales and lentivirales : La production ectopique de protéines dans les cellules HCEC-hTERT a été effectuée par le biais d'infections rétrovirales comme préalablement décrit (Gras et al., 2014). Brièvement, les cellules sont « murinisées » par l'expression ectopique d'un 20 récepteur écotrope (Baker et al., 1992; Boehm et al., 2005) avant d'être infectées par les vecteurs d'expression rétroviraux. Les infections séquentielles sont espacées de 48h et la sélection est initiée 24h après la seconde infection avec de la puromycine (1.5 jtg/ml). Les particules lentivirales des shRNA QPRT ont été générées par transfection de la lignée HEK293T avec les vecteurs pLK0.1, pCMV AR8.91 (gag-pop-Tat-Rev) (Zufferey et al., 1997) et phCMVG-VSVG (env) (Burns et al., 25 1993) par la technique de calcium phosphate. La déplétion en QPRT a été obtenue par trois infections successives, chacune séparée de 12h. Nous avons confirmé l'infection de plus de 90% des cellules. Analyse des protéines par Western-bot : Les extraits cellulaires ont été effectués en milieu RIPA (100 mM NaC1, 1% NP40, 0.1% SDS, 50 mM Tris pH8) complémenté par des cocktails 30 d'inhibiteurs de protéase (Roche) et de phosphatases (Sigma) et les débris cellulaires éliminés par centrifugation. Les protéines ont été analysées par Western-blot en utilisant les anticorps monoclonaux anti-TWIST1 2Cla (Abcam), anti-p21CIP1/WAF1 clone SX118 (Dako) et antiQPRT (ab57125, Abcam), et les anticorps polyclonaux anti-H-RAS N-18 (Santa-Cruz), anti-ZEB1 H102 (Santa-Cruz), anti-ZEB2 (Sayan et al., 2009), p-histone H3 (Ser10)-R (Santa-Cruz), and 35 phospho-histone H2A.X 5er139 (Cell Signaling) et des anticorps secondaires couplés à la peroxidase (Dako). Les complexes antigène-anticorps ont été révélés par le réactif Luminol (Santa Cruz).

3037403 14 Immunohistochimie : Les échantillons de patients ont été obtenus auprès du Centre de Ressources Biologiques de l'Hôpital Lyon Est et Saint-Antoine (Paris) avec l'accord des comités éthiques locaux. Les échantillons ont été utilisés avec l'accord écrit informé des patients. Cette étude a été approuvée par les comités éthiques des deux institutions. Les marquages ont été opérés sur des 5 sections de 40 tm de tissus fixés en formol et incubés dans de la paraffine. Les lames ont été successivement déparaffinées par trois bains successifs de xylène et réhydratées par des bains en éthanol pur, à 90% et 80%. L'antigène a ensuite été démasqué en chauffant les lames au micro-onde (5 et 10 min) dans une solution de démasquage à PH6 (Dako). Après avoir bloqué l'activité peroxydase endogène par un bain d'eau oxygénée à 0.3% pendant 10 min, les lames ont été 10 incubées en présence d'anticorps QPRT (anticorps Atlas, HPA011887, Sigma) à température ambiante pendant lh à une dilution au 1/100ème. Le marquage est ensuite révélé en utilisant le Polymer Kit Novolink (Leica). Analyse de l'expression transcriptionnelle des gènes par q-RT-PCR : La préparation des ADN et la transcription reverse ont été effectuées comme précédemment décrit (Gras et al., 2014). Les 15 amorces de PCR ont été sélectionnées par le biais du logiciel primer3. Le gène de ménage HPRT1 a été utilisé pour la normalisation. Les couples d'amorces suivants ont été sélectionnés: ID Nom Séquence NM 000041 APOE 5'-TGGACAAGTCTGGGATCCTT-3' 5'-CATCTTCCTGCCTGTGATTG-3' NM_014298 QPRT 5'-GTCACCATGGACGCTGAA-3' (SEQ ID N°3) 5'-GAGCCAGCTGTCACCAG-3' (SEQ ID N°4) NM_000194.1 HPRT1 5'-TGACCTTGATTTATTTTGCATACC-3' 5'-CGAGCAAGACGTTCAGTCCT-3' NM_000474.3 TWIST] 5'-GGCTCAGCTACGCCTCTC-3' 5'-CCTTCTCTGGAAACAATGACATCT-3' NM_057179 TWIST2 5'-CATGTCCGCCTCCCACTA-3' 5'-GCATCATTCAGAATCTCCTCCT-3' NM_001128128.1 ZEB1 5'-AACTGCTGGGAGGATGACAC-3' 5'-TCCTGCTTCATCTGCCTGA-3' NM_014795.2 ZEB2 5'-AAGCCAGGGACAGATCAGC-3' 5'-GCCACACTCTGTGCATTTGA-3' NM_005985 SNAI1 5'-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3' 5'-ATCTCCGGAGGTGGGATG-3' NM_003068 SNAI2 5'-TGGTTGCTTCAAGGACACAT-3' 5'-GTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3' Tableau 1 3037403 15 Profils d'expression génique : Les profils d'expression génique et l'analyse des données ont été effectués par le biais de la plateforme ProfileXpert (Lyon, France). Les profils d'expression ont été analysés sur la base de puces contenant 47231 sondes (HumanHT-12 v4 Expression BeadChip,Illumina Inc., USA). L'ARN total (500 ng) a été amplifié et marqué à la biotine en 5 utilisant le kit Illumina TotalPrepTM RNA Amplification Kit (Ambion Inc., USA). L'hybridation a été réalisée avec 750 ng de cRNA marqué à la biotine. Les puces ont été scannées en utilisant le protocole standard d'Illumina et le scanner theiScan (Illumina Inc., USA) et les données ont été normalisées en utilisant le logiciel Genome Studio 2010 (Illumina Inc.,USA). Analyses in silico de la pertinence du programme alternatif : L'analyse des données a été 10 effectuée par le biais du logiciel Array Studio (Omicsoft Corporation). Les données brutes des séries analysées (CEL) ont été traitées en utilisant la normalisation quantile et l'algorithme Robust multi-array average (PMA et transformées en Log2 (Irizarry et al., 2003). Différents outils informatiques dont le « Hierarchical clustering analysis », le « Principal Component Analysis (PCA) et la méthodologie de projection ssGSEA ont été utilisés. Le score de la signature a été 15 déterminé en utilisant les « Empirical cumulative Distribution Functions » (ECDF) des gènes et les corrélations entre les signatures déterminées par une corrélation de Pearson. Exemple 2 : L'échappement à la sénescence induite en réponse à une l'inflammation chronique conduit à l'émergence de cellules à risque et résulte d'une reprogrammation des 20 cellules, orchestrée par le facteur de transcription 2-7,31. Le modèle établi in vitro repose sur l'utilisation de cellules épithéliales de colon immortalisées (HCEC-hTERT) cultivées en présence de surnageant de macrophages activés (SMA, conditions mimant une inflammation chronique). Ces conditions expérimentales conduisent à l'induction de dommages à l'ADN simple brin qui évoluent en dommages double brin (confirmé par 25 l'accumulation de protéine yH2AX). Ces dommages induisent un arrêt de la prolifération cellulaire (démontré par la diminution du taux d'histone H3 phosphorylée sur le résidu Ser10, p-S10-H3) et l'engagement des cellules épithéliales dans un programme de sénescence (mis en évidence par l'acétylation de la protéine p53 (Ac-p53), l'induction de son gène cible CIP1 (p21) et la détection d'une activité SA-P-galactosidase): une séquence d'évènements récapitulant les observations faites 30 in vivo. Pour autant, après un délai d'un mois, les cellules se remettent invariablement à proliférer (Figure 1A). Les cellules émergentes (notées ensuite « Echap » pour « échappement à l'inflammation ») sont non seulement capables de proliférer dans des conditions d'inflammation chronique mais également de supporter des stress oxydatifs qu'ils soient induits en réponse à un peroxyde chimique (tel le tert-butyl-hydroxy-peroxyde ou TBHP) ou en réponse à une activation 35 oncogénique (transduction d'une version activée de la protéine RAS, H-RASG12v) (Figure 1B). Les cellules émergentes ont donc acquis une résistance intrinsèque aux stress oxydatifs et en tolérant des activations oncogéniques sont susceptibles d'évoluer vers un phénotype malin.

3037403 16 Le statut du gène TP53 est sauvage dans les cellules `Echap' et la voie de signalisation reste inductible en réponse à un stress génotoxique. L'analyse de l'expression des membres des trois principales familles Snail, Twist et Zeb a été analysée. Invariablement, sur trois expériences indépendantes, l'échappement à la sénescence est associé à une induction du gène ZEB1 et des 5 gènes SNAll et ZEB2 dans une moindre mesure (Figure 2A), suggérant un éventuel lien entre ces deux évènements. En accord avec cette hypothèse, la production ectopique de la protéine murine ZEB1 ou de la protéine murine apparentée ZEB2 (lignées HCEC-Zeb/ et HCEC-Zeb2) octroie aux cellules HCEC un avantage prolifératif dans des conditions de stress oxydatif (induit soit par une inflammation chronique ou par un traitement au TBHP) (Figure 2B).

10 Exemple 3. Les protéines ZEB1 et ZEB2 induisent un programme génique spécifique accordant aux cellules une résistance au stress oxydatif. La comparaison des profils d'expression génique des lignées HCEC-Echap, HCEC-Zeb/ et HCECZeb2 à la lignée parentale (HCEC-Par) a permis de mettre en évidence l'activation d'un programme 15 génique spécifique par les protéines ZEB constitué de l'activation d'une cinquante de gènes et de la répression d'une trentaine d'autres (Figure 3A, gènes activés listés dans la Figure 12). Ce programme dit alternatif (ALT program, alternatif au programme d'EMT communément induit par ces facteurs) n'inclut aucun des gènes de détoxification connu. L'implication dans l'octroi de cet avantage de survie des deux gènes les plus induits de ce programme, à savoir QPRT et APOE, a été 20 testée. L'expression ectopique de l'un ou de l'autre (avec une efficacité supérieure pour QPRT) confère effectivement un avantage de survie aux cellules dans des conditions d'inflammation chronique ou lorsqu'elles sont soumises à un peroxyde chimique (Figure 3B). Cette observation confirme que plusieurs composantes de ce programme contribuent à accorder un avantage de survie et/ou de prolifération à des cellules épithéliales de colon dans ces conditions de stress.

25 Exemple 4 : L'activation du programme alternatif se traduit par une dépendance des cellules à la protéine QPRT pour leur prolifération ou survie. La protéine QPRT (pour quinurénine phospho-ribosyl-transférase) est une enzyme à l'origine décrite comme étant impliquée dans la voie de la kynurénine (Liu et al., 2007). Si sa contribution à 30 la production de novo de NAD + est effective dans le foie et le rein, la protéine QPRT est également présente dans d'autres types cellulaires, assurant vraisemblablement d'autres fonctions, dont l'inhibition de l'activation de la caspase 3 comme récemment décrit dans des cellules HeLa (Ishidoh et al., 2010). La déplétion des cellules HCEC Echap en QPRT induit la mort des cellules par apoptose dans des conditions d'inflammation chronique (Figure 4A). De manière intéressante, 35 l'inhibition de l'expression de QPRT empêche également ces cellules de tolérer des activations oncogéniques (Figure 4B). La comparaison du programme alternatif aux profils d'expression des 55 lignées cancéreuses colorectales de la banque du Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (données G5E36133) (Barretina et al., 2012) met en évidence dans un certain nombre de lignées 3037403 17 une expression conjointe de plusieurs des gènes induits du programme ALT (pas d'expression conjointe des gènes réprimés). L'ensemble des gènes activés du programme ALT a été utilisé comme signature, les lignées ont été classées selon leur score et leur addiction à QPRT a été évaluée (Figure 5). Sur l'ensemble des lignées analysées, seules les cellules ayant un programme 5 alternatif activé (score de la signature élevé) semblent être dépendantes de la protéine QPRT pour leur prolifération, à en juger par une coloration au cristal violet (Figure 6) et par l'analyse de courbes de prolifération (résultats non montrés). L'ensemble de ces données démontre la pertinence biologique de la signature ALT et souligne son intérêt en termes prédictifs d'une dépendance à QPRT.

10 Le score de la signature ALT est parallèle au taux de protéine QPRT détectée en Western-blot (Figure 6). Pour autant, bien que le programme ne soit pas actif dans la lignée COLO-320, la protéine QPRT y est détectable, à un taux certes plus faible. En immunohistochimie (IHC), le signal détecté dans cette lignée est suffisamment élevé pour être considéré comme faiblement positif.

15 Exemple 5 : L'expression de QPRT est induite dans les phases précoces du développement de cancers colorectaux, développés sur un contexte inflammatoire ou non. L'analyse de l'expression de QPRT par IHC sur une cohorte de patients atteints de maladies chroniques de l'intestin montre une absence de la protéine dans les entérocytes du tissu normal (à 20 l'inverse des fibroblastes de la lamina propria et des cellules immunes infiltrées qui expriment fortement la protéine), une induction de son expression limitée à quelques cellules épithéliales situées au fond des cryptes dans les muqueuses enflammées (lieu où sont localisées les cellules souches intestinales) et une augmentation du nombre de cellules épithéliales marquées dans les dysplasies de bas-grade (45.4%, n=22), de haut-grade (18.2%, n=22) et de cancers (38.1%, n=21) 25 développés sur un contexte inflammatoire (Figure 7). De même, l'expression de QPRT est induite dans les cellules épithéliales des adénomes (faiblement ou fortement dysplasiques, 50%, n=20) et des cancers sporadiques (30%, n=10) (Figure 8). Exemple 6 : Le programme est induit dans les cellules souches intestinales et constitue un 30 facteur de mauvais pronostic. La signature génique du programme ALT a été établie sur un modèle de cellules épithéliales. Pour affiner cette signature de telle sorte à pouvoir l'utiliser sur des tumeurs (en tenant compte de leur hétérogénéité cellulaire), elle a été comparée à deux cohortes de patients atteints de colites ulcératives (UC) ou de maladie de Crohn (CD) depuis plus de sept ans (datasets G5E36807 et 35 G5E37283, (Montero-Melendez et al., 2013; Pekow et al., 2013)). Ces deux séries ont été sélectionnées du fait que les profils géniques aient été établis sur des muqueuses macroscopiquement non-enflammées de telle sorte à limiter l'impact direct de l'inflammation sur les niveaux de transcrits. Sur les deux cohortes, les analyses GSEA (Gene Set Enrichment 3037403 18 Analysis) mettent en évidence deux groupes de gènes distincts (notés cluster I et II). Si les gènes des clusters I se retrouvent activés dans les individus sains, à l'inverse ceux des clusters II y sont éteints et spécifiquement activés chez des patients UC et CD (Figure 9). Les deux clusters II ont donc été comparés, une liste de 23 gènes communs a été mise en exergue et cette liste a été définie 5 comme la signature du programme ALT in vivo (Figure 9A). L'analyse du score de cette signature permet dans les deux cohortes de patients de ségréger clairement deux sous-groupes (Figure 9 BC). Elle permet en particulier dans la seconde série de patients de distinguer à partir des lésions non-néoplasiques ceux ayant développé des dysplasies ou des carcinomes colorectaux (Figure 9 C). Le score de la signature du programme ALT reflète donc l'avancée de la maladie. Les analyses de 10 QPRT par IHC révèlent cependant un certain nombre de patients présentant des dysplasies de bas-grade positives et de haut-grade négatives. La détection de QPRT ne semble donc pas constituer un facteur de mauvais pronostic en soi. La distribution de la signature ALT a été analysée dans une troisième cohorte de patients (n=466) ayant développé exclusivement des carcinomes colorectaux sur un contexte non-inflammatoire 15 (données G5E39582) (Marisa et al., 2013). Ces tumeurs ont récemment été classées sur la base de leur profil génique en 6 catégories (de Cl à C6). L'analyse de la signature ALT met en exergue une activation du programme dans un certain nombre de tumeurs (18%, n=566), indépendamment de leur sous-type moléculaire (Figure 10 A). On peut noter une proportion plus forte de tumeurs positives dans le sous-groupe C4, décrit pour être enrichi en cellules souches (Marisa et al., 2013).

20 Dans cette cohorte, le score de la signature ALT et celui des signatures de cellules souches intestinales Lgr5 et EphB2 (Merlos-Suarez et al., 2011) corrèlent parfaitement (r>0.96, p<0.0001), confortant l'hypothèse selon laquelle le programme ALT est induit dans les cellules souches/précurseurs intestinales (Figure 10 B). Comme préalablement démontré pour les signatures EphB2 et Lgr5 (Merlos-Suarez et al., 2011), et démontré pour le sous-groupe C4 (Marisa et al., 25 2013), la signature ALT s'avère être prédictive d'un risque de récidive élevé (Figure 10 C). En conclusion cette analyse met en exergue un groupe de patients distincts, avec un risque de récidive élevé caractérisée par des scores de signatures souches intestinales et de programme ALT élevé. L'inter-relation existante entre l'inflammation chronique et l'induction du programme ALT dans ce 30 contexte est confirmée en montrant l'existence d'une corrélation entre le niveau d'inflammation (calculé à partir du score d'une signature immune, reflet d'infiltrats lymphocytaires, (Yoshihara et al., 2013)) et le score du programme alternatif (Rho=06154, p<0.0001). Cependant, le niveau de corrélation plus faible observé entre les scores des signatures immunes et de cellules souches intestinales (Rho<0.28, p<0.0001) montre indiscutablement que les signatures immunes et ALT ont 35 des significations biologiques distinctes.

3037403 19 Exemple 7: Extension des observations à un deuxième modèle de tumeurs développées sur un contexte inflammatoire. Les adénocarcinomes oesophagiens tirent leur origine de l'oesophage de Barrett (situé dans le tiers inférieur de l'oesophage) et l'inflammation chronique liée à la remontée de sucs gastriques y joue 5 un rôle clef. L'analyse de QPRT par immunohistochimie montre qu'une proportion des adénocarcinomes testés exprime la protéine QPRT (20%, n=10) suggérant que l'induction du programme puisse dans ce contexte également jouer un rôle clef dans l'initiation tumorale. Aucun marquage n'est observé dans l'épithélium malpighien, utilisé comme contrôle interne (Figure 11).

10 Conclusions : Ces résultats mettent en lumière l'intérêt potentiel que représente QPRT en tant que cible thérapeutique. Ces résultats mettent aussi en évidence un nouveau programme induit dans les cancers gastro-intestinaux, très vraisemblablement au sein des cellules souches. Au-delà de sa valeur prédictive en termes de risque de récidive, l'intérêt de cette signature est de constituer un nouvel outil pour identifier des tumeurs qui pourraient être ciblées par des inhibiteurs de QPRT.

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Claims (1)

1. REVENDICATIONS1. Procédé in vitro de sélection d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPRT) à partir d'un échantillon test de ladite tumeur, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) La détermination de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test, b) La comparaison de l'expression de QPRT dans ledit échantillon test avec l'expression de QPRT dans un échantillon de référence, c) La sélection d'un patient susceptible de bénéficier d'un traitement inhibiteur de QPRT à partir de la comparaison de l'étape b), un niveau d'expression supérieur de QPRT dans l'échantillon test par rapport à celui de l'échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de QPRT. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la détermination de l'expression de QPRT comprend la détermination de la présence de la protéine QPRT Procédé selon la revendication 2, dans lequel la détermination de l'expression de QPRT comprend au moins une étape d'immunohistochimie. Procédé selon l'une des revendications 2 à 3, dans lequel la détermination de l'expression de QPRT comprend la localisation de cellules marquées au sein du tissu épithélial de l'échantillon test. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4 dans lequel la détermination de l'expression de QPRT comprend la détermination du pourcentage de cellules épithéliales marquées. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la détermination de l'expression de QPRT comprend la détermination de l'expression transcriptionnelle du gène codant pour QPRT. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel ladite tumeur gastro-intestinale est choisie parmi le cancer colorectal, le cancer gastrique et l'adénocarcinome de rcesophage. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel ladite tumeur gastro-intestinale est développée dans un contexte inflammatoire chronique. Procédé selon la revendication 8, dans laquelle ladite tumeur gastro-intestinale est un cancer colorectal développé sur un contexte inflammatoire chronique. 3037403 21 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle ladite tumeur gastro-intestinale est un cancer colorectal sporadique. 11. Utilisation de QPRT en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur gastro-intestinale à un traitement inhibiteur de QPRT.