FR3033790A1 - Utilisation de proanthocyanidines pour limiter la denitrification - Google Patents

Abstract

La présente invention d'utilisation d'au moins une proanthocyanidine pour limiter la dénitrification causée par des microorganismes, notamment présents dans un milieu, par mise en contact de ladite au moins proanthocyanidine avec lesdits microorganismes.

Description

La r in' rne le domaine envr.nruureurs' précisément Je Hîniter la dénitrificaU dans l'environnemenl: ,0mrilent dans les sols, et plu. ,:u-ernent les sols. de culture. L'azote est un facteur limitant de la croissance des végétaux (I eBauer 84. Treseder, 2008). Le Dbpement des végétaux dépend donc nent des processus du c.\»..le azote qui conditionnent la transforrruhon de l'azote sous toutes se- mment la disponibilité en NH4 et NO3, qui sont les formes assim ft-,2.;.3 végétaux. 10 Par ni les procu.us ycle' iizote, la dénitrification, réalisée en :é par des bactéries dites dénitrifuntes, qui consiste en la réduction du Nu en N20 et N2, est considérée comme la principale voie biologique de perte d'azote des sols. Dans les agrosystèmes européens, ces pertes représentent 59% des :es toi lu système (Oenema et al., 2009). En 15 effet, les formes gazeuses ^120 et N2, géï..d7"es par dénitrifica ,à7.inc rendues inaccessibles aux plantes, es pertes d'azote causées par la sont libérées dans l'atmosp ne mnière classique uu dén 'ication et responsables de perte de rendement sont compensées par l'ajout d'engrais azotés. Toutefois, cet apport entraine une augmentation 20 d',,,,u-nission de NO, gaz à effi7t de serre 330 fois plus puissant que le CC... Certaines solutions, base de corr posés de 5 thèse, t( diméthylpyrazol (DMPP), ont été proposées pou, ;Walter temporairement le :es en inhibant la nitrification, processus en amont de la déniU cln la transformation de l'ammonium (p n 25 nitrate (NO3). Ces composées. "activité de.'7, bactéries, litrifiantes du sol et en conséquence limite.: .ormation e l'ammc:rUJM (NH4) en (NO3). Des extraits de racines et c omes de Fallopia spp., un complexe de plante invasive, ont, quant à euxs étérlrrits comme ru ,..ant le processus 30 de dénitrificatior: ces sols (Eurdon 2014). Bar. t al. 2014, urit identifié dans cette publication, , , c,,iartain nombre de métabolites pu:UuE-ults dans extrait testé de Fallopia s 3 (+)-ca échine, la (+)-épicateLnifie, 3033790 2 le piceal7rl glucoside, e resve -rolosida, ,odine, le physici, resv. t du mon entre la concenU en cal:échine dans les extraits et I H e lai dénitrification. Par la suite, les inventeurs de présente demande cir-a ,:-)re'vet ont testé l'effet de la catéchine, ainsi que Cl b"IJUS les composés identif ans cette publication (épicaL -- resvérn dénitrification de manière totale-ne 71 autres 10 n'avait pas cl'eïiei. sur la dei--i;.irrification. Les inventeurs ont alors mis en évidence que d'autres moléc.. encore identifiées, les proanthocyar nes étaient responsables de d- la ..iénitrification observées avec les extraits de Fallopia x bohemica. De ces composés n'affectent pas ou peu l'activité des enzymes de la 15 respit'ati -Î'onction importante pour croissance des ,rganismes du sol. Dans ce ca;-itexte, la préser ention r 'utilisation d'au une proanthocyanidine pou. 'i,,:0..j()n causée par -,s oorganismes, par rr act de adite ns proanthocyani, 20 avec lesdits microorg -es. Les microorganismes à l'origJ ,té dénitrifiante qui est réduite dans le cade,:,i, dE l'invention Fr' !,,.! ,duvent présents dans un milieu. s.ation selon les microorganismes seront alors présents clans le milieu avec ladi.:a p:oanthocyanidine. Dans ce cas, 25 la proanthocyanicr mi contact avec le milieu r de ce fait, avec les micro cibler :ertains cas, la n'OSE n contact de la proanthocyandrr, des ',lb ut smes se fera suite à un phénorràTe Je diffusion l thocyanidir le milieu. Le milieu (avec TP,. el la proanthoyanidine est mise en ri-Intact nommé milieu traité), peut être in 30 milieu al que sol, et e -1 sol de G,Iture, compost lisier, terreau, ca station o ,euration, sédiments ,su encore un milieu Ariodine hfiFintes -,et con té, de .-técnine nié rr e a .iriee 1X Hirement :=--se.ntes dans l'extr,73it' 3033790 Przip' tel qL. i .aqucux. du type eau e eaux usées, eaux de station d'épuratic.: s,ns qu cel:te liste soit Dans le cadre de l'inventi'. la mise en contact jne proanthocyanidine avec le rnWeu neut être réali5 toute. technique appropriée, notai---ni,,,,rt par de la pro:::hnrvnidine sur ledit milieu ou par mélang - .le la proi svec leÉ temps rie mise en contact avec les micri nermettar. i'effet microorgan'sr-es --espond à ia durée souhait_ 'Dbtention de limitant la dénitrificatii 10 Dans le cadre hnvaiLion, une ou plusieurs proanl-hhin,3nidine(s) est(sont) utilisée( limiter la dénitrification caL par des microorganismes aya malement la capacité de réd '1 (présent dans le milieu traité) r\12 (capacité qualifiée d'activite den lad En particulier, de tels microorganismes possèdent les gènes co. DOLr 15 et nitrite réductases. De tels microorganismes sont flot oe -,r't des -nplons tels que Cylindrocarpon tonkinense, Fusarium oxysporum ou LIG.7 bactéries des genres Pseudonomas, Bacillus, Burkholderia, Achromobacter, Ochrobactrum, Citrobacter, Paracoccus, Micrococcus, telles que les espèces Pseudomonas brassicacearum, Pseudomonas stutzeri, 20 Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas fluorescens, Burkholderia .vietnamiensis, Achromobacter xylosoxidans, Paracoccus denitrificans, Bacillus cereus, connues pour être des !-téries dénitrifiantes. Ces bactéries sont . plus souvent présentes dar: La mise en contact oorganismes est réalisée, de manière à 25 obtenir une diminution , denitMcation causée par les microo présentant une ou en d'autres termes de manièr-(7. à inhiber au moins d-êrti,,,i1p,.,,ment i'activité dénitrifiante des n'ici- mes. Dans le cadre de Vhvention, une telle limitation, diminution ou est à conFidérer, par -,,71.2nort. à l'émission de N-n N- et/ou à :...L ation 30 (trans mation c n N20 qu ttenue en mise--in contact des ir icrc.rqanismes concernés avi proanthocyanidine. Pour évaiuer ie pourcentage d'inhibition de la 3033790 4 dénitrification, de est obtenue mesure de - 120 + N2, d'une présence et, part, en l'absence, de prde .blocyaPci ce qui permet d'obten!7 un pourceni-----!. d'inhibition de la dénitrification correspondant à (émission Cë?. N20 présence de proanthocyanidine) Iq'rrliceinn de N20 + en ehsen.:2 de. proanthocyanidine) *100. dénitrification par les prcY:n-'--H l'inhil de la niveau maxini:-_,! de 100%, et notamment a _Indre un ldra dans le cadre de l'invention un % d'inhibition de dénitrification, e jénéral de 20 à 100 %, de préférenc:,e- 10 à 100%. La 'technique décrite dans Dambreville et al. 2006, et utilisée dans les exemples, peut être utilisée pour évaluer l'émission de N20 + N2. Les conditions de mise en contact et la quantité de proanthocyanic...e.(s) utilisées seront ajustées par l'homme du métier pour obtenir l'effet souhaité. Les proarthocyanidines, également nommées tanins 15 proanthocyanidiques, tanins condensés, ou proanthocyaniir ,nt des flavonoïdes, et plus précisément, des polymères d'hydroxyflavan-3-ol. Les monomères hydroxyflavan-3-ol, constitutifs des proanthocyarcik. présentent la structure suivante (I) : 4 R 0 (I) 20 dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5 et e, identiques ou différents, scn, choisis parmi l'hydrogèri,-::., les groupements hydroxyle, gallate, méthyle Ces motif,' 2ees sont donc nius ou moins hydroxyl4s sur les yaux A et B, allai 0 à 3 wements hydrox'y Ces wnères, hydroxyf1avan-3..l, peuvent _ s: .ent être estérifiés par ur )u des 3033790 groupements gallate et/ou glycosylés et/ou méthylés sur les noyaux A, B et: C. Il existe de..:x grands types de proanthocyanidines, qui peuvent t7.7s deux être utiftsés dans le cadre de l'invention, ces deux types étant défn par les liaisous ddtre monomères : les proanthocyanidinas d. type A proanthocyanidines de type B. L proanthocyanidines B, préf_. _ dans le cadre de l'in n, sont des polymère J'hydron ol dont deux monomères cons utifs sont reliés par une seule covalente entre deux carbones, .lon les positions 4-6 ou 4-8 (pc7i-ions respectives che. es deux mu,- ->-,,,res), comme illustré sur la Formule (II) correspondarfr à un dimère comprenant une liaison 4-8, suivie d'une liaison 4-6: 2' R Liaison 4 -> 6 2" OH (II) avec Ri, R2, R3, .-.41 K R5 et R6, R2', R4', -5' K et R6', Ri-, R2-, R3-, R4-, -5" K et R6", pouvant être les mêmes groupements ou des groupements différents 3033790 6 représentant l'hydrogc in groupement hydroxyle, un groupemer -ate, un groupement méthyle encore un groupement osidique. Les proantn..Dcyanidines de typ,7., A rt. des polymères d'hydroxyflavan- 3-01 dont monomères sont reliés par deux liaisons cr-9Ientes eie .eux càrbones, .:À) position 2-7 et 4-8 (positions respectives -s deux monorr,), illustrées dans le cas d'un dimère par la formule cf-après (III) avec Rl, R2, R3, R4, R5 et R6, Rr, R2', R4', R5' et R6', pouvant être les mêmes 10 groupements ou des grouper--nts différents, représentant l'hydrogène, un groupement hydroxyle, un g 2ipement gallate, un groupement méthyl ou encore un groupement osidique. Les proanthocyanidines pouvart être utilisées dans le cadre le l'invention sont constituées de 2 à n monomères (h ir _1yf1avan-3-O, 15 par des liaisons covalentes précédemment décrites, selon toutes les déclinaisons possibles. En particir, on utilisera dans le cadre vention une ou plusieurs proanthocy k, choisies parmi les dimères, toères et tétramères. Les proanthocyanidines les plus connues sont des polymères de (- +)- catéchine, (-/+)-épicatéc (-/+)-gallocatéchine et +)- HO R6 O Liaison 4 -> 8 et 2 -> 7 2 3033790 7 alloca1 bine, D7TIS le groupe )roanthocyark:n1e7...; sont retrouvés des SC -aroui; de ri.)1écules, emple, les prodelphinidines (prociE,'s procyapidines (procyanidol). Les proc correspondert (1,r.,-,7 polymères de (-/+)-catéchine et/ épicatél-,ïn, . Les prudelphi.-.;,, les polymères de (-/+) échine et (-/+)-é- -allocatéchine. Par ( désigrE. -rare (+) -,ère (-) ou un r de ces isomères. Les proanthocyanidines fe produits naturf: ui peuve-n: notamr-ne .re obte t pu rtir d'extraits de Fallopia spp, et 10 parttee.rier i"allopia Àbol7eniice comr,,, mis en évidence les inventeurs, ou encore à partir de pépins de raisin de, de Pteridiurr Vivicium p p Schinopsis spp., Vicia spp., spp., Quercus spn.. De no proanthocyanidines commerciale. sponibles, notamment chez L (Bordeaux, France), Organic He --b ,,'ilangsha, Chine) Nanjing Zelang 15 Medical Technology Co., Ltd. (Jiangsu., Che). Dans le cadre de l'inve , on utilisera, de préférence., proanthocyanidines de type B, manière encore plus prkép...., procyanidhes de type B, en particulier sous la forme de tr ..ére ou tétramère 20 Selon des modes de réalisation moins proanthocyanidine utilisée ne extrait de Fallopia spp. conte f f4 de Fallopia x bohemica, et/ou en l'abser, catéchine et/ou d'én articuliers de l'inventic 1t7 présente pas sous la "brrrpn:Anthocyanidines, et en p-.,,,Ï-Ucuik.., proanthocyanidine est utilisée, e cad rInventon,a ou les proanthocyanidine sées 1PP .'Jées, sur le rneH,,,,1 ,,,:ontenant les microorganisme dont l'efl.i''-,i-t,:ritiant est à limiter, ou mélangées à ce dernier, sous la forme d'urK7.! 9.,:ktic:,n ou - - Tnsion aqueuse ou encore sous la forme d'une poudre ou gra.

Les - .éalisation dans lesquels les microorg T'Isras sont présents :7,C» Kit maintenant être décrits, de manière plus détaillée. Dans le r-'7' 'ie l'invention, au moins une proanthocyanidine pourra, 3033790 notamment, être utilisée r favoriser croissance végétale sur i sol de À..ire, par réduction d,,:?' clénitrifica causée par les microor mes entant une activité r, -tkr.7,,liér. causée par lés Le.ries défttrifiantes, présents dans k5dit - '.'yanidine des produits naturels, leur utilisatiGri dans des e total l'environnement. Les urdu peuvent ri être T en agriculture biologiaue. Dans le -- r.disation selon l'invention sur un sol, au r une inthocyanidine est appliquée sur un sol, et notamment un sc CUbi 10 par exemple par dépôt ou pulvérisation F!...ir la terre. En particulier, ladite au moins proanthocyanidine es s e pour la dénitrification causée par des bact du . que Pseudomonas brassicacearum et/ou Bac///us cereus. Dans le cas d'une solution de proanthocyanidine(s), celle-ci pourra être 15 liguée par pulvérisation ou tout autre moyen approprié. Les sols qui pourront être traités dans le cadre de l'invention sont, notamment, des sols de ri dture, de maraichage, de culture céréalière, de viticulture généralement, des sols ( des végétaux divers d'intérêt agronomique, notamment des plantes ou fleurs diverses, sont cultivés.

20 L'effet de la ou des proanthocyanidines utilisées sur la dIlLc un sera obtenue, sur une large gamme de températures, notarr e température du sol de 0 à 50°C et avec un effet optimun Li un taux d'humidité supérieJ7 .i0% de la capacité au champ. quantité (kace de proanthocyanidine(s) pour obtenir 'a 25 de la dénitrificab(:) souhaitée sera appliquée sur le sol. La quantité uee sera adaptée, p l'homme du métier, notamment, en fonctii: sie la formulation et du taux d'humidité du sol. En particulier, de 0,01 à 10 mg/g de sol sec, et de préférence de 0,05 à 5 mg/g proanthocyanidine(s) est appliqué. Ces quantités sont sol sec de -Ahlpç des 30 milieux solides, autr. le sol emment cités, dans les microorganismes po être présents.

3033790 9 Les résultats pré7entés dans le cadre l'invention mettecÊ v que les proanthocyaridnes, et en particuher les procyanidir ,f,r? type B, permettent de le processus de Ltrii'crification bactérien des sols. Les re 'Res ont él us sur des de bactéries en culture, mais égaleru de prz comple ci Ir dee r s Je raturez TS un de bord de rivière et lin Fol ritenant r commur de bactérie tes. L'utilisation c,,,-77.1,c1., 'invention peq.-met donc de les pertes litrification et, par là même, le.- ,2,1-,i-nissions effet de .et, 10 --ient, de réduire a nécessite de- engrais azotés en ure. Néanmoins:, proanthocyanidinE )eut être associée, dans le caire , nvent,c,rt, un at, (azt ou phosphaté par exemple). ans le cadre de l'inverj,Jn, HlOi proanthocyan _ pourra 15 être appliquée sur un sol de culture, po fa...y.,.:)riser la croissance ue culture en luttant contre la dénitrification causée par les microorganisme;, en partici. bactéri- présents dans 1E - .plication pourra être faite, sans application conjointe d'un engrais azoté. Concernant maintenant, les modes de réalisation dans lesquels les microorganismes sont présents dans un milieu liqt Ij.On 7,7.13 rrne solide Hquide sera intégrée dans ledit milieu. Un -oe --nthocyanidine(s) pour obtenir !imitation de la 'ici iitW-:H:ition sou sera incorporée dans ledit n L uantité incorporée sera adaptée, par l'homme du métier. A titre de 0,01 à 2,. _ Lie 25 milieu liquide, et de préférence de 0,01 à 1 mg/L de millet de proanthocyanidine(s) sera incorporé. Les exr rès, en réri aux Figures annexées, p-7.- d'illustrer l'inventiccG Tais n'ont auc tèE Imitatif. 1 1. : pourcc-i'Lae d'inhibition (relabf .'ar rapport au contrôle) sur la 30 «fri,A: a r Pseudomonas brassicacearum d'un mélange des composés ;:q---ésents c Fallopia x bohemica et de l'extrait Fallopia x bohemica. Les barres ',/,F2r1:, clrrespondent al.3x variations obtenues sur 3033790 10 les diff: 3 3. Les étoiles 7J-i - les variations significatives par rapport contrr est de Tukey; a Figure 2: Chrorr PI-Dgramme 280 mn de l'extrait Fallopia x bohemica nr,:sentant les prc.plthocyanic _s et leurs mco détectés ainsi que leur spectre UV. des proanthocyanidines Figures 3A à 3C : Spectr _ . masse ESI de tvne R retrniivées dans Fallopla x bohemica (Dimères (Figure 3A), T jure 3B), Tétramères (Figure 3C)' Figure 4 : Pourcentage d' léni.:ffication et de la respiration 10 de a) Pseudomonas bras.dt.ddi-Liaî et b) 6. cereus en fonction 13 concentration en proanthocyankjintes purifiées. Les étoiles indk différences significatives de moyennes avec le contrô.e _..s proanthocyanidines (Test de T ey; a<0.05). Fiaure 5: Pourcentage on de la dénitrification des sols de bord de 15 re (Ain11) et de prairie en fonctior de la cc-7entratlon en p Inthocyaniciïns commerc Les étoiles indiquer._ significatives de moyennes avt,... ntrôle (Test de Tukey; Figure 6 : Pourcentage d'inNi, de la 'r,J,,f:':rih.i'H.fcation du sol tT daine Ami s 7 jours d'incubatior :3 cape:: a',; champ) en présence de 20 différentes quantités de proa -ianidines commercias. Les étc indiquent les différences significatives de moyenne:5 a',».7.2c he contrôle (Test de Tukey; a<0.05). I. Mi:RIELS ET [-',IL::..L'HODES 25 A) :7 7E 3101.:1K7iIQUE DES PROANTI-1,3CYANIDP,TES - FRUARATION DES EXTRAITS DE FALLOPIA Des composés ont été extraits de racines et cie rhizomes du génotype F x bohemica (Chrtek et Chrtkovà). L ,zomes collectés sur le terrain ont été plantés en pots dans du compost v:lasmann TS3/sand, 80/20). Les 30 rhizomes ont été mis en culture pendant six mois dans une serre, sous lumière artificielle à 21°C. Les rhizomes et les racines produits ont été récoltés, nettoyés à l'eau et lyorll-;és. Soixante-cinq grammes de rhizomes 3033790 11 et racines lyophilisU !iiiiroyés Li un 7-7: JeLyser II bea iag Venlo, Netherlands'i été mis en suspen: 750 ml . mélarua eau : 'T.hanol v/v) et placés aux u pendant 30 min. Après fetlat:H.:::.,n à l'aide d'une pompe cc . et une autre extrücton a été réalisée sur le rciu EVec 2 x mL di ol pur. Tous les éluats ont ensuite été mélangés et séchés. Puis, ces extraits secs ont été re-suspendus dans un mé j eau : méthanol (50/50; v/v) à la concentration de 10 mg mL-1. 10 - IDENTIFICATION DES PROANTHOCYANIDINES CONTENUS DANS L'EXTRAIT DE F. X BOHEMICA : L'extrait a été analysé à l'aide d'un ae d'UHPLC 12" series (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) coe'.p à un dét 15 barrette diodes G4212'ei, r.)AD (AelleFiii: Technologies, Santa C le ma JF 65- 1 1es nt Technol es, Santa -aticli des composés a été réalisée sur une colonne PC PT)Sh Eq`i y pm, 3,0 x 100 mm, Agilent Technologies, Santa ClarE. 20 une tempérai--e de 60°C. phase mobile était un g néaire de 0,4% d'acide ac que dans di eau (solvant A) et acétonitrile (solvant B). La phase mobile v..;isait à trav colonne à 1ln flux de m!/min. Le graiinéaire était de 0 à 2% solvaiyii B; 1,5 à min à 17% SO _; 22 à 41 min 17°/o à 100% solvant B; 41 à 41,5 ml '.1.00°/0 solvant 25 B. système a été préalabiernent équilibré avant chaque éc -. Le volum d'injection était de lpi. Les res UV ont été erregistrés entre 190 e!7. rm et la réponse à 280 nrr utilisée pour les interprétations a source ESI a été optirtii de la manière si,...iivante 7 mode ioriisation positive, scan des 30 spectres de m/z 80 à 2000., 73pillaire 3,0 kV, fragmenteLir 70 V, a collision Je dissebation 1-1-induced dissociation ; CD) 3033790 12 fixée à 20 eV. L'azote a été omme nébt. Ji gaz avec un flux de 12 l/min et une température Des p i'cwithocyanidines ont fiées dans l'extrait par analyse des spectres UV, MS and MS/MS, c itilisant le logiciel MassHunter Qualitative ,A.rlysis (Agitent Techno. :es, Santa Clara, USA), les spectres obtenus présentés da',', B). - PURIFICA.TjON DES PROANTHOCYA :S. DE F. x BOHEMICA ',Juanthocyanidines contenues dans l'extrait de F x bohemica ont 10 été purifiées à l'aide d'une colonne de - phadex LH20. Le Sephadex LH 20 a été préalablement équilibré trois fois e lumidifiant 25 g de Sephadex LH 20 avec 100 ml d'éthanol 80% et en r ensuite le surnageant. L'extrait F. x bohemica (100 ml) concentré à 10 mg ml-1 a ensuite été ajouté au Sephadex LH 20 équilibré et agité nendant 3 minj Ie Sephadex chargé en extrait a été 15 chargé dans un Buch n verre de Le Sephadex LH 20 a été lavé avec de l'éthanol 95% jusqu'à ce que l'absorbance de l'éluat à 280 nm soit proche de zéro. Le Sephadex LH 20 a ensuite été lavé avec de l'acétone 50% jusqu'à ce que le Sephadex soit totalement lavé. L'éluat d'acét 50% récupéré a été évaporé à l'aide d'un évaporateur rot... Les 20 proanthocyanidines sèches, purifiées ont par la suite été mises en solution à 10 mg.m1-1 dans dei cette solution étant nommée par la suite proanthocyanidines pur Ls. Cette solution coHient les dimère- trimères et tétramères es Figures 3A et 3B, mais pas les monomères catéchine 25 B)- SOURCE COMMERCIALE DES PROANTFIOCYANIDINES Proanthocyanidines purifiées à partir de pépins iotan, Lafforh: nordeaux, France). Une analyse par UHPLC a permis Ue véritnn que 30 ces pro7elà.ocyanidines n'étaient pas en mélange avec de la catcHin, ni avec de l'épicatéchine.

3033790 13 II. EFFET DES PROANTHOCYANIDINES SUR LA DENITRIFICATION : A)- TES L' 11TAIRES CONTENUS r..:.. LES EXTRAITS DE F X BOK L'effet de la catéchine, 'épicaté( le picéide, le resvératrol, l'émodine et le physcion, identifiés par ,ion et al. (2014) comme les composés majoritaires des extraits de Fallopia x bohemica, ont été testés en mélange sur l'activité de dénitrification de Pseudomonas brassicacearum, 10 comme décrit dans le paragraphe suivant. A partir de produits commerciaux purs (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA), tous ces composés ont été préparés en mélange dans une solution inéthanol eau (v/v, 50/50) à la concentration retrouvée dans les extraits de Fallopia x bohemica. Les concentrations de ces composés exposés aux bactéries dans le milieu sont de 0,0037 mg m1-1 catéchine, 0,0057 mg m14 épicatécV 0,022 mg ml picéide, 0,0007 mg m1-1 resvératrol, 0,0015 mg m et 0,0047 mg m1-1 physcion). 13)- SOUCHES BACTERIENNES DENUI NTES L'effet des proanthocyanidines riflées à partir des extrt..; F. x 20 bohemica a été testé à des concentrations de 0,1; 0,07 ; 0,01 CU sur la dénitrification et la respration d Pseudomonas brassoo NFM421 et Bacillus cereus A19, deu> éries dénitrifiantes f--". rencontrées dans les sols. Pour cela, e milieu de croissanl avec 23 mM de K,NO3, mntenant s différentes concei 25 proanthocyanidines, a é lé à une densité optique de (D.0.) = mesures de dénitrification ont été réalisées dans des flacons plasma par un bouchon en caoutchouc, par le dosage de l'accumulation du N20. a été réalisé après avoir remplacé l'air des flacons par un mne d'hé et d'acétylène (He/C2H2; 90/10). C cun des traitements a Lè réalise en 30 quatre réplicats. L'acétylène a pour onction de bloquer la transformation de N20 en N2, la mesure de l'émi N20 étant alors reconnue comme représentative de l'émission de N20 ambreville et al. 2006).

3033790 14 Les mesures de respiration ont été réalisées dans s flacons plasma scellés par dosage de l'accumulation de CO2 sans remplar itmosphère des fia cc 77. L3 N20 et le CO2 émis ont été mesurés toutes les deux heures pendant 48 het1-5 à l'aide d'un microcatharomètre (pGC-R3000, SRA instruments, Marc )ile, France). c; 1MUNAUTES COMPLEXES I'"; EN SUI Afin de tester l'effet des proanthocyanidines sur la dénitrificat communautés complexes présentes dans le sol, des proanthocyanidines 10 commerciales purifiées à partir de pépins de raisins ont été utilisées (Laffort, Bordeaux, France). Des échantillons de dei sols ont été récoltés sur les sites Ain 11 (45°57'53"N; 5°15'25"E) et Ain H.'-,°48'15"N; 5°10'29"E), puis tamisés à 2 mm. Le taux de dénitrification a été mesuré par émission c NO toutes les deux heures pendant 30 heures en anaérobiose avec uï 15 catharomètre (pGC-R3000, SRA instruments, Marcy l'Etoile, Franci gramme de sol équivalent sec a été placé dans un flacon plasma de scellé par un bouchon .?.ri caoutchouc. L'atmosphère du flacon remplacéu p...H un mélange He/C2I-12 mixture (90/10 v/v). Les sols ont été mis en suspension dans 10 ml de tampon phosphate 0,1M (NaH2PO4 et NaHPO4; 20 pH=7,5) supplémenté de glucose de C-glucose.m1-1), d'acide glutamique (0,5mg de C-acide glutamique.m1-1) et ce KNO3 (20 mM). L'effet des proanthocyanidines sur la dénitrification a été mesuré pour ries concentrations de 2,5; 1; 0,5; 0,1; 0,05; 0,01 et 0 mg. au ajoutant de l'eau ou des proanthocyanidines :7,,y._,,Densions de s suspensions de sol ont iainten, 'an agitation à 28°C tout a l'ex 7-ice. Tous les traitements ont été réalisés en quatre réplicats. ID)- EFFETS DES PROANTHOCYANIDINES SUR UNE COMMUNAUTE COMPLEXE DE SOL RAPPORTES EN MASSE DE PROANTHOCYANIDINES PAR RAPPORT A UNE MASSE DE 30 SOL SEC Une gamme de concentrations en proanthocyanidines actives sur dénitrification du sol rapportée en g de sol sec a été réalisée. Le sol u 3033790 15 pour cette expérience est le sol Ain 11. Dix grammes de sol é sec ont été incubés en flacon plasma à l'air libre pendant 7 à 28"C à la capacité au champ. L'équivalent de 10; 5; 1; 0,5; 0,1; 0,05; 0,01 et: ni de sol sec de proanthocyanidines commerciales ont été apportés ors de 5 l'humidcation à la capacité au champ du sol. Chaque trê3fte,'R t4 réalisé en quatre réplicats. Après 7 sols traités a été réalisée par toutes les 30 min pendant 6 R3000, SRA instruments, Marcy LEf a mesure de dénitr, "'LIU mission de N20 en anaérobi microcatharomètre (pGCLes flacons plasma ont été 10 scellés par un bouchon en caoutchouc, l'atrnosphr des flacons a été remplacé par de l'hélium à l'aide d'un banc d'inertage. Les sols ont été supplémentés d'une solution de û ml contenant l'équivalent de 50 pgN- KNO3.g-1 sol sec, 0,5 mg de C-a, lutamique.g-1 de sol sec et 0,5 mg de C-glucose.g-1 de sol sec. 15 suL1A )-ué.-S POSE' MAJORITAIRES SUR LA DENITRIFICATION DE PSEUDOMONASBR La dénitrification de Pseudomonas brassicacearum n'est pas inhibée par 20 le mélare des composés ma. res (catéchine, épicatéchine, picéide, resvératrü' émodine et phys(.71 .ésents dans les extraits de Fallopia x bohemica, alors qu'un effet inhïbiteur marqué est obtenu avec l'extrait Fallopia x bohemica pour une même concentration de c. omposés, comme dans la Figure 1. Il apparaît donc que l'activi7 nhibitrice obtenue 25 n'impli Las ces composés. 13)- IDENTIFICATION r;'ROANTHOCYA- -tS EN1.7ES DANS LES EXTRA IT D X BOHEMICA Les prc.),-:y-o- ....yanidines détectées rr IIHPLC dans l'extrait de de F. x 30 bohemica sont de rocyanidines de typE - du dimère au tét le catéchine et d'épi :échine avec une absorbance maximale à 278 nrr L masses moléculaires de 579,15, 867,21et 1155,27 g mol-1 3033790 16 le ires 2 e- Dectre 3A cc I au dm Figure tétramel e). la Figt _ spectre de C)- EFFET DES PROA.... _ ...NIDINES FLHHLL SUR LA DENITRIFIL..: DES B L.IES DENITRIFIANTES Il apparaît que - roantL,-,-yanidines purifiées ir significativement la dénitriiiLouun de Pseudomonas brassicacearum LJ cereus, comme cela ressort des résultats présentés Figure 4. Pour les deux 10 souches bactériennes, la dénitrification est affectée jusqu'à 8001o. La réponse à l'inhibition est dose-dépendante entre 0,01 et 2,5 mg.m1-1. EFFET DES PR.OANTHOCY.... '77.S COMMERCIALES SUR LA .'.77.2ICATION DES SOLS EN SUSP.E.1,;...: 15 Il jalement été observé que et manthocyanidines comme -' testées inhibent significativement la dénitrification des deux sois en suspension (Figure 5). L'inhibition est dose-dépendante avec un maximum d'inhibition atteint dès 0,5 mg, pour le sol Ainll et 1 mg. m1-1 pour le sol Ain6. Le maximum d'inhibition est de 85% pour le sol Ain11 et de 80% pour le sol Ain6. Le plus faible effet significatif mesuré était à une concentration de 0,01 mg.m1-1. E)- EFFETS DES PROANTHOCYAN'7 '3£1.JTE COMPLEXE DE SOL RAPPORTES EN MASSE DE PROAFEHC RAPPORT A UNE MASSE DE 25 SOL SEC Les proanthocyanidines commerciales inhibent significativement la dénitrification du sol Ainll après 7 jours de contact avec lesdites proanthocyanidines (Figure 6). L'inhibition est dose-dépendante avec un maximum de 100% d'inhibition atteint à 5 mg.g-1 de sol sec. Le plus faible 30 effet significatif était une concentration de 0,1 mg.g de so C 3033790 17 Référer r ' ibliogr. F, Ilvert F.Z, Comte G, Me, "L71 G, Pommier T, Fulialdi S, msafack N, iy F. 2014. Evid:E.: for denitrificatio by plant secondan,,,, .-,--abolites. New Phytologist: 3trom 3K, Mattl'.') 7'4 2008. HPLC determc cf extractab[?..ccJ unextractab,e , in plart ,!--naterials. Journal of Fclod Cherl5try 56(17): 7617-732,- Lacombe S, Sun X11, Wu VCcL 013. The effect of 10 Americdri macrocarpor.) LLients or, the growth irhbition, membrane integrity, and injury of Eschericf ccii 0157:H7 and Listeria monocytogenes in comparison to rhamnosus. Food Microbiology 34(2): 777-759. Lacombe A, Wu VCH, White J, Tadepalli S, Andre EE. 2012. The antimicrobial 15 .s of the lowbush blueberry (Vaccinium an(ju fractional components against foodborne pathog.,.: conservation of probiotic Lactobacillus rhamnosus. Foc.. Ncrobioc 30(1): 12.,,L-131. LeBauer DS' Tr.seder KK. 2008. Nitroger Ictation of net primary 20 pr,,,Auctivity in terrestrh osystem s giobally distributed. Ecology 89(2): 371-379. Oenema 0, Witzke HP, Klimont Z, Lesschen JP, Velthof GL. .2009. Integrated assessment of promising measures to decreacc eccccc losses from agriculture in L 27. Agriculture Ecosystems & Envirolment 133(3-4): 25 280-288. Christophe Dambrevil'-'',phanie Hallet,Christoph yrcTc rv a n , Jean-Claude Gclindn, Lau ,I-P,-oliwot 2006. Sth : -1 and âCCiViii -Df the denitrifying commun , ,3ize-croppec I fertilized with composted pig rr, c. arnrviniurn nitrate , MICROBIOLOGY 30 ECOLOGY, Volume: 56; 1:119-131

Claims (3)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation moins une proanthocyanidine,. pour dénitr: ica4ion causée par des microorganismes, r n- Ise en contact e ladite. au mons proanthocyanidine avec lesdits microorgaMitio.
2. 2 -UtLc elon la revendicE 1 caracté.....' que ladite au moins proantitiiiiii-ic\i/einidine est une .:;q'oanthocyanidine de type B.
3. 3 - Utilisation selon la riendication 1 ou 2 caractérisée en ce que au ricins proanthocyaniciineèsi L >LIU --xclusiver nt de monorneres rmi la catéchine epicatéchine. Utilisation selon l'une niiPiconoue des revendications 1 à 3 ctérisée en ce que ladite a n roanthocyanii est LH ère, ère ou tétramère. 5 - Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que le °organismes sont présents dans un ans lequel ladite au moins priithocyanidine est présente. Utilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que le un (i l'au moins une proanthocyanidine est appliquée sur ledit se- par exemple pas dépôt ou pulvérisation. tiiillisation selon la I n -aractér en ce que de 0,01 à 20 10 de sol sec, et de piéletelice ue 0,5 à 5 mg /i de sol sec, de proanthocyanidine(s) est appliqué sur ledit sol. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en C.C. que ladite ietniii . proanthocyanidine est utilisée pur limiter la dénitrication des bactéries dénitrifiantes, en particuliii.i 25 choisies parmi Pseudomonas brassicacearum, Pseudomonas stutzerl, Pseudomonas alcallgenes, Pseudomonas fiuorescens, Burkholderia vietnamiensis' Achromobacter xylosoxidans, Paracoccus denitrificans, Bacillus cereus. 9 - Utilistc l'une quelconque des revendiutic: 1 à 8 30 caractérisée fl ce 7)Je ladite au n),::irrls iiiiroanthocyaniiiline ne se prése pas sous la forme d'un extrait de Fallopia spp. contenant des proanthocyar 3033790 19 10 Utilisation selon l'une quelconque des vnçiications 1 à 9 caractérisée en ce que ladite au moins proanthc ast utilisée, en l'absence de catéchine et/ou d '°-hine.