FR3027533A1

FR3027533A1 - PREPARATION OF MONOPLASMIDIC POLYPLEXES

Info

Publication number: FR3027533A1
Application number: FR1460272A
Authority: FR
Inventors: Philippe Guegan; Jerome Mathe; Patrick Midoux; Elodie Tarnaud
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2016-04-29
Also published as: WO2016063225A1

Abstract

L'invention est relative à un procédé de préparation de complexes de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, en particulier de polyplexes comprenant un polymère cationique et une seule molécule d'acide nucléique, notamment un plasmide. La présente invention concerne également les complexes obtenus par le procédé et leur utilisation pour la transfection in vitro, ex vivo et in vivo de molécules d'intérêt chargées, en particulier des molécules thérapeutique, telles que notamment des acides nucléiques.The invention relates to a process for the preparation of charged polymer complexes and a single molecule of opposite charge interest, in particular polyplexes comprising a cationic polymer and a single nucleic acid molecule. , especially a plasmid. The present invention also relates to the complexes obtained by the method and their use for the in vitro, ex vivo and in vivo transfection of charged molecules of interest, in particular therapeutic molecules, such as in particular nucleic acids.

Description

PREPARATION DE POLYPLEXES MONOPLASIVIIDIQUES La présente invention a pour objet un procédé de préparation de complexes de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, en particulier de polyplexes comprenant un polymère cationique et une seule molécule d'acide nucléique, notamment un plasmide, tels que des polyplexes monoplasmidiques. La présente invention a également pour objet les complexes obtenus par le procédé. Particulièrement, la présente invention a pour objet des polyplexes comprenant un polymère cationique et une seule molécule d'acide nucléique et leur utilisation pour la transfection in vitro, ex vivo et in vivo de molécules d'intérêt chargées, en particulier de molécules thérapeutique, telles que notamment des acides nucléiques. Les stratégies utilisées en thérapie génique pour introduire un gène médicament dans les cellules font appel à des virus modifiés encore appelés vecteurs viraux. Ces vecteurs posent un certain nombre de problèmes pour leur application en toute sécurité chez l'homme. Il existe également des méthodes physiques telles que l'électroperméation et l'utilisation des ultrasons ou sonoporation. Les vecteurs chimiques (lipides cationiques et polymères cationiques) pourraient à priori remplacer les vecteurs viraux car moins immunogènes et de plus faible coût de fabrication. Il a été montré depuis près de vingt ans qu'il est possible d'utiliser un polymère cationique, telle que la polylysine, la polyéthylènimine ou le chitosan pour condenser un acide nucléique (polynucléotide tel que notamment un ADN plasmidique ou un ARN) et former une particule qui pourra ensuite être utilisée pour véhiculer le polynucléotide vers l'intérieur de la cellule. Par exemple, la Demande WO 2009/112402 et Bertrand et al., Chem. Commmun., 2011, 14, 12547- 12549 décrivent des polymères linéaires de polyéthylènimine, modifiés par des résidus d'histidine, qui ont une bonne efficacité de transfection et une toxicité cellulaire faible. L'utilisation de polymères cationiques pour la transfection de cellules repose sur la formation de complexes électrostatiques entre un polymère 30 cationique et un acide nucléique, dénommés polyplexes. La méthodologie classiquement utilisée pour préparer des polyplexes consiste à ajouter une solution de polymère cationique dans une solution contenant le plasmide ADN, et les particules se forment spontanément. L'optimisation de polyplexes est assurée par la variation du rapport N/P, exprimant le nombre de charges positives (N pour azote) par molécule de polymère rapporté au nombre de charges négatives (P pour phosphate) par molécule d'ADN. Les particules sont caractérisées par leur diamètre hydrodynamique moyen et leur charge de surface ou potentiel zéta. Les particules ont un diamètre moyen généralement supérieur à 100 nm et sont constituées de plusieurs (3 à 4) molécules de plasmides (Clamme el al., Biophysical Journal, 2003, 84, 1960-1968; Midoux el al., Somatic Cell and Molecular Genetics, 2002, 27, 27-47). Lors de la préparation de ces particules par cette méthode, le rapport de charge N/P entre le polycation et le polyanion évolue puisque le polycation est versé dans la solution de polyanion. N/P est initialement inférieur à 1, puis augmente jusqu'à la neutralisation (N/P autour de 1) pour atteindre une valeur finale de N/P voisine de 3 ou 6 selon les formulations. Ainsi, le procédé de formulation « remonte » le diagramme de phase proposé par Mengarelli, V (Complexes de polyélectrolytes de charge opposée : des polymères synthétiques à la thérapie génique ; Thèse de doctorat en Physique, Université de Paris-sud XI, Orsay, 2009), et passe systématiquement par le point N/P ( ou X) = 0, zone de précipitation, observée à partir d'une concentration, généralement de l'ordre du ug/ut. Ainsi les polyplexes sont généralement formés à une concentration en ADN bien inférieure à celle nécessaire pour des études in vivo et ce quelques soient les modes d'administration. Les polyplexes ainsi générés ont donc des diamètres généralement supérieurs à 100 nm permettant d'envisager leur utilisation in vitro, mais rendant leur utilisation in vivo impossible du fait des risques de toxicité sévères. De plus les polyplexes ainsi formés sont instables en présence de solution saline telle que le sérum physiologique : ils forment rapidement des agrégats pouvant atteindre la taille de 1 um. Pour éviter les problèmes de précipitation observés aux concentrations élevées d'ADN, il a été proposé de préparer des polyplexes selon le procédé standard, avec des concentrations d'ADN inférieures à celles induisant la formation d'agrégats (solution très peu saline) puis de concentrer les polyplexes. Toutefois, cette méthode conduit le plus souvent à la formation d'agrégats. En vue d'applications de transfert de gènes in vivo, il est donc indispensable de disposer de nouveaux procédés de formulation des polyplexes permettant de préparer des nanoparticules de faible diamètre (<100 nm), stables en milieu salin, pour des concentrations élevées d'ADN et de polymère. La réduction de la taille des particules doit faciliter tant la biodistribution dans l'organisme que la pénétration dans la cellule et le trafic intracellulaire vers la délivrance nucléaire. En effet, il a été démontré que le processus d'internalisation de particules dans une cellule peut être directement corrélé aux tailles de ces particules : des particules de diamètre faible sont plus facilement intemalisées que des particules de diamètre élevé. L'entrée des polyplexes dans le cytoplasme qui se fait généralement par endocytose clathrine ou cavéoline dépendante, implique que le diamètre des polyplexes soit inférieur à la taille de l'endosome (environ 100 nm). La taille élevée des polyplexes tient en partie au fait que ces complexes sont formés avec plusieurs molécules d'ADN plasmidique. Une façon de diminuer celle-ci est de contrôler le processus de fonnation de particules de façon à ce qu'elles contiennent une seule molécule d'ADN plasmidique. Des polyplexes monoplasmidiques n'ont jamais été obtenus en milieu concentré avec des polymères cationiques. De tels polyplexes n'ont été obtenus qu'a deux reprises, et uniquement en utilisant une formulation à base de lipides (Chittimalla et al., JACS, 2005, 127, 11436-11441 ; Rudorf, J. O. Radier, JACS, 2012, 134, 11852-11858). La formation de polyplexes monoplasmidiques utilisables en thérapie reste donc un challenge. Les inventeurs ont mis au point un procédé original de préparation de polyplexes qui permet avantageusement de produire des polyplexes monoADN à base d'ADN et de polymère cationique tout en s'affranchissant des problèmes de précipitation rencontrés avec le procédé standard de préparation de polyplexes de l'art antérieur. De façon générale, ce procédé est utilisable pour produire des polyplexes à base de polymère(s) chargé(s) positivement (polymère(s) cationique(s)) ou négativement (polymère(s) anionique(s)) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée (polyélectrolyte négatif ou positif), notamment un seul acide nucléique. En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'au moins un complexe de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: - la distribution d'une solution de molécules d'intérêt chargées dans un premier compartiment séparé d'un deuxième compartiment par une surface 5 poreuse, et ledit deuxième compartiment comprenant une solution de polymère(s) de charge opposée, et - l'extrusion des molécules d'intérêt chargées, une à une, au travers de ladite surface poreuse vers la solution de polymère de charge opposée pour former des complexes entre le(s) polymère(s) chargé(s) et une seule molécule d'intérêt de 10 charge opposée. Le principe du procédé est illustré dans les figures 1 et 2. Le procédé de préparation de polyplexes comprenant une seule molécule d'intérêt selon l'invention présente les avantages suivants par rapport au procédé classique de préparation de polyplexes : 15 - Il permet d'obtenir des nanoparticules de taille comprise entre 50 nm et 100 nm, préférentiellement 50 nm. - Il permet de s'affranchir des questions relatives au diagramme de phase du mélange polyélectrolyte positif/polyélectrolyte négatif, notamment, ADN/polymère cationique, et donc du passage de la zone de précipitation pour 20 laquelle il est observé une floculation des complexes, généralement autour de N/P=1, qui les rend impropres à une utilisation biologique. - Chaque molécule d'intérêt chargée, par exemple un plasmide, est condensée de façon unique et indépendante, rendant les questions de concentration de formulation caduques : il est alors possible d'envisager la formation de polyplexes 25 comprenant une seule molécule d'intérêt quelle que soit la taille de la molécule d'intérêt, notamment du plasmide et la concentration à laquelle elle est foiinulée. Cette observation est particulièrement importante pour envisager des applications thérapeutiques pour lesquelles les molécules à délivrer dans les cellules, notamment les plasmides, sont de taille élevée, voire voisine de 20 kbp. 30 - Ce mode de folinulation peut s'appliquer à n'importe quel type de polymère chargé (anionique ou cationique).The subject of the present invention is a process for the preparation of charged polymer complexes and of a single molecule of interest of opposite charge, in particular polyplexes comprising a cationic polymer and a single molecule. DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS nucleic acid, especially a plasmid, such as monoplasmid polyplexes. The present invention also relates to the complexes obtained by the process. In particular, the subject of the present invention is polyplexes comprising a cationic polymer and a single nucleic acid molecule and their use for the in vitro, ex vivo and in vivo transfection of charged molecules of interest, in particular of therapeutic molecules, such as that especially nucleic acids. The strategies used in gene therapy to introduce a drug gene into cells use modified viruses called viral vectors. These vectors pose a number of problems for their safe application in humans. There are also physical methods such as electropolation and the use of ultrasound or sonoporation. Chemical vectors (cationic lipids and cationic polymers) could in principle replace viral vectors because they are less immunogenic and have a lower manufacturing cost. It has been shown for nearly twenty years that it is possible to use a cationic polymer, such as polylysine, polyethylenimine or chitosan to condense a nucleic acid (polynucleotide such as in particular a plasmid DNA or an RNA) and form a particle which can then be used to convey the polynucleotide to the interior of the cell. For example, WO 2009/112402 and Bertrand et al., Chem. Commmun., 2011, 14, 12547-125549 disclose linear polymers of polyethylenimine, modified with histidine residues, which have good transfection efficiency and low cell toxicity. The use of cationic polymers for cell transfection relies on the formation of electrostatic complexes between a cationic polymer and a nucleic acid, referred to as polyplexes. The methodology conventionally used to prepare polyplexes consists in adding a cationic polymer solution in a solution containing the plasmid DNA, and the particles are formed spontaneously. Optimization of polyplexes is ensured by the variation of the N / P ratio, expressing the number of positive charges (N for nitrogen) per molecule of polymer relative to the number of negative charges (P for phosphate) per molecule of DNA. The particles are characterized by their average hydrodynamic diameter and their surface charge or zeta potential. The particles have an average diameter generally greater than 100 nm and consist of several (3 to 4) plasmid molecules (Clamme et al., Biophysical Journal, 2003, 84, 1960-1968, Midoux et al., Somatic Cell and Molecular Genetics, 2002, 27, 27-47). In preparing these particles by this method, the N / P charge ratio between the polycation and the polyanion changes as the polycation is poured into the polyanion solution. N / P is initially less than 1, then increases to neutralization (N / P around 1) to reach a final value of N / P close to 3 or 6 depending on the formulations. Thus, the formulation process "goes back" the phase diagram proposed by Mengarelli, V (Complexes of oppositely charged polyelectrolytes: synthetic polymers to gene therapy, PhD thesis in Physics, University of Paris-Sud XI, Orsay, 2009 ), and systematically goes through the point N / P (or X) = 0, precipitation zone, observed from a concentration, usually of the order of ug / ut. Thus, polyplexes are generally formed at a concentration of DNA much lower than that required for in vivo studies, whatever the modes of administration. The polyplexes thus generated therefore have diameters generally greater than 100 nm making it possible to envisage their use in vitro, but making their use in vivo impossible because of the risks of severe toxicity. In addition, the polyplexes thus formed are unstable in the presence of saline solution such as physiological saline: they rapidly form aggregates up to 1 μm in size. To avoid the precipitation problems observed at high DNA concentrations, it has been proposed to prepare polyplexes according to the standard method, with DNA concentrations lower than those inducing the formation of aggregates (very little saline solution) then of focus the polyplexes. However, this method most often leads to the formation of aggregates. In view of in vivo gene transfer applications, it is therefore essential to have new methods for formulating polyplexes making it possible to prepare nanoparticles of small diameter (<100 nm), stable in saline medium, for high concentrations of DNA and polymer. Particle size reduction should facilitate both biodistribution in the body and penetration into the cell and intracellular trafficking to nuclear delivery. Indeed, it has been shown that the process of internalisation of particles in a cell can be directly correlated to the sizes of these particles: particles of small diameter are more easily internalized than particles of large diameter. The entry of polyplexes into the cytoplasm, which is usually by clathrin or dependent caveolin endocytosis, implies that the diameter of the polyplexes is less than the size of the endosome (about 100 nm). The high size of the polyplexes is partly due to the fact that these complexes are formed with several plasmid DNA molecules. One way to reduce this is to control the particle formation process so that it contains a single plasmid DNA molecule. Monoplasmid polyplexes have never been obtained in a concentrated medium with cationic polymers. Such polyplexes have been obtained only twice, and only by using a lipid-based formulation (Chittimalla et al., JACS, 2005, 127, 11436-11441, Rudorf, JO Radier, JACS, 2012, 134). , 11852-11858). The formation of monoplasmid polyplexes that can be used in therapy therefore remains a challenge. The inventors have developed an original process for the preparation of polyplexes which advantageously makes it possible to produce DNA and cationic polymer-based monoDNA polyplexes while avoiding the problems of precipitation encountered with the standard method for the preparation of polyplexes. prior art. In general, this method can be used to produce polyplexes based on positively charged polymer (cationic polymer (s)) or negatively (anionic polymer (s)) and a only molecule of opposite charge interest (negative or positive polyelectrolyte), especially a single nucleic acid. Accordingly, the present invention relates to a process for preparing at least one complex of polymer (s) charged (s) and a single molecule of interest of opposite charge, characterized in that it comprises at least the following steps: distributing a solution of charged molecules of interest in a first compartment separated from a second compartment by a porous surface, and said second compartment comprising a solution of polymer (s) of opposite charge, and the extrusion of the charged molecules of interest, one by one, through said porous surface to the oppositely charged polymer solution to form complexes between the charged polymer (s) and a single molecule of interest of 10 opposite charge. The principle of the process is illustrated in FIGS. 1 and 2. The process for preparing polyplexes comprising a single molecule of interest according to the invention has the following advantages over the conventional process for the preparation of polyplexes: obtain nanoparticles of size between 50 nm and 100 nm, preferably 50 nm. It makes it possible to dispense with the questions relating to the phase diagram of the positive polyelectrolyte / negative polyelectrolyte mixture, in particular the cationic DNA / polymer, and therefore of the passage of the precipitation zone for which there is observed a flocculation of the complexes, generally around N / P = 1, which renders them unfit for biological use. Each molecule of interest charged, for example a plasmid, is condensed in a unique and independent way, rendering the questions of formulation concentration obsolete: it is then possible to envisage the formation of polyplexes comprising a single molecule of interest. regardless of the size of the molecule of interest, particularly the plasmid and the concentration at which it is believed. This observation is particularly important for considering therapeutic applications for which the molecules to be delivered in the cells, in particular the plasmids, are of high size, or even close to 20 kbp. This folinulation mode can be applied to any type of charged polymer (anionic or cationic).

La quantité de polymère(s) chargé(s)nécessaire à la réalisation d'un polyplexe selon l'invention est fortement diminuée, ce qui a pour effet de diminuer la quantité de polyélectrolyte chargé, notamment de polyélectrolyte positif, souvent toxique, injectée lors de transfection in vivo.The amount of polymer (s) charged (s) necessary for producing a polyplex according to the invention is greatly reduced, which has the effect of reducing the amount of charged polyelectrolyte, especially positive polyelectrolyte, often toxic, injected during in vivo transfection.

Les polyplexes obtenus par le procédé selon l'invention ont des applications très variées dans tous les domaines mettant en oeuvre le transfert de molécules dans les cellules, notamment de gènes, à l'aide de vecteurs synthétiques, tels que de façon non-limitative le domaine de l'imagerie cellulaire, du diagnostic, de la thérapie, notamment la thérapie génique et la médecine régénérative, et de la bioproduction. Dans le cadre de la thérapie génique, les pathologies concernées sont extrêmement nombreuses, elles concernent aussi bien les maladies génétiques (Mucoviscidose, Dystrophie musculaire de Duchenne...) ou acquises (cancer, infections par des microorganismes pathogènes notamment des virus). Dans le cadre de la bioproduction, la méthode de formulation selon l'invention, en permettant d'éviter la formation d'agrégats en milieu concentré, constitue un débouché très important pour les polymères chargés, en particulier les polymères cationiques. La question de reproductibilité des formulations est peu discutée dans la littérature scientifique mais ce procédé présente l'avantage d'une standardisation des formulations, conduisant à une meilleure reproductibilité des résultats.The polyplexes obtained by the process according to the invention have very varied applications in all fields involving the transfer of molecules into cells, in particular of genes, using synthetic vectors, such as in a non-limiting way the field of cell imaging, diagnosis, therapy, including gene therapy and regenerative medicine, and bioproduction. In the context of gene therapy, the pathologies involved are extremely numerous, they concern both genetic diseases (Cystic Fibrosis, Duchenne Muscular Dystrophy ...) or acquired (cancer, infections by pathogenic microorganisms including viruses). In the context of biomanufacturing, the formulation method according to the invention, by making it possible to avoid the formation of aggregates in a concentrated medium, constitutes a very important outlet for the charged polymers, in particular the cationic polymers. The question of reproducibility of the formulations is little discussed in the scientific literature, but this process has the advantage of standardizing the formulations, leading to a better reproducibility of the results.

La membrane poreuse utilisée dans le procédé selon l'invention est constituée d'un matériau adapté à l'extrusion. De préférence, il s'agit d'une membrane de polycarbonate. Ladite membrane comprend avantageusement des pores d'une taille de 5 à 200 nm, de préférence de 10 à 50 nm (10, 20, 30, 40 ou 50 nm), de manière encore plus préférée de 50 nm, Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, l'extrusion est réalisée à une pression de 10 mbar à 3 bars, de préférence de 100 mbar à 2 bars, notamment 100 mbar, 500 mBar ou 2 bars, de manière encore plus préférée de 1 à 2 bars. La vitesse du flux au travers de la membrane est imposée par la taille des pores et la pression. Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec des concentrations variables de molécule d'intérêt chargée, notamment d'acide nucléique (premier compartiment), aussi bien faibles qu'élevées, comme le démontre les exemples de la présente Demande qui ont été réalisées avec des concentrations d'acide nucléique variant d'un facteur 1 à 200 (10 tg/ml à 2000 ug/m1). Les proportions respectives du polymère et de la molécule d'intérêt, notamment du polymère cationique et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de sorte que le rapport massique (pg/ug) entre le polymère et la molécule d'intérêt, notamment l'acide nucléique, soit de 2 à 6 ug/ug. La présente invention a également pour objet un complexe de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, obtenu ou susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un complexe de polymère(s) chargé(s) positivement (polymère(s) cationique(s)) et d'une seule molécule d'acide nucléique. Le complexe selon l'invention, dénommé également polyplexe, est formé par des associations, notamment électrostatiques, entre la molécule d'intérêt chargée et le(s) polymère(s) de charge opposée, notamment le(s) polymère(s) cationique(s) comprenant des charges positives et la molécule d'acide nucléique comprenant des charges négatives. Un polyplexe contenant de l'ADN est dénommé polyplexe monoADN ; lorsque l'ADN est un plasmide, il s'agit alors d'un polyplexe 20 monoplasmidique. Le polymère chargé englobe tous les polymères cationiques ou anioniques et les co-polymères possédant un bloc cationique ou anionique, utilisables pour transfecter des cellules in vitro, ex vivo ou in vivo. Il s'agit notamment de polymères cationiques ou de co-polymères possédant un bloc cationique. tels que par 25 exemple, la polylysine, la polyéthylénimine, le chitosan et leurs dérivés. Le polymère chargé est avantageusement un polymère cationique, de préférence une polyéthylèneimine linéaire, de manière préférée une polyéthylèneimine linéaire partiellement histidinylée (IPEI-His), de manière encore plus préférée dans laquelle 5% à 25 %, plus préférentiellement 16%, des monomères totaux sont 30 histidinylés ; de tels copolymères sont décrits dans la Demande WO 2009/112402. La molécule d'intérêt chargée est capable de former une particule avec le ou les polymère(s) de charge opposée.The porous membrane used in the process according to the invention consists of a material suitable for extrusion. Preferably, it is a polycarbonate membrane. Said membrane advantageously comprises pores with a size of 5 to 200 nm, preferably 10 to 50 nm (10, 20, 30, 40 or 50 nm), even more preferably 50 nm, according to one embodiment. advantageous embodiment of the process according to the invention, the extrusion is carried out at a pressure of 10 mbar at 3 bar, preferably 100 mbar at 2 bar, in particular 100 mbar, 500 mbar or 2 bar, more preferably 1 to 2 bars. The rate of flow through the membrane is dictated by pore size and pressure. The process of the invention can be carried out with variable concentrations of charged molecule, in particular nucleic acid (first compartment), both low and high, as demonstrated by the examples of the present Application which have were performed with nucleic acid concentrations ranging from a factor of 1 to 200 (10 μg / ml to 2000 μg / ml). The respective proportions of the polymer and the molecule of interest, in particular the cationic polymer and the nucleic acid, are preferably determined so that the mass ratio (μg / μg) between the polymer and the molecule of interest, especially the nucleic acid, ie from 2 to 6 μg / μg. The present invention also relates to a complex of polymer (s) charged (s) and a single molecule of interest of opposite charge, obtained or obtainable by the method according to the invention. More particularly, the subject of the present invention is a positively charged polymer complex (s) (cationic polymer (s)) and a single nucleic acid molecule. The complex according to the invention, also called polyplex, is formed by associations, in particular electrostatic, between the molecule of interest charged and the (s) polymer (s) of opposite charge, in particular the (s) cationic polymer (s) (s) comprising positive charges and the nucleic acid molecule comprising negative charges. A polyplex containing DNA is referred to as a mono DNA polyplex; when the DNA is a plasmid, it is then a monoplasmid polyplex. The charged polymer includes all cationic or anionic polymers and co-polymers having a cationic or anionic block, useful for transfecting cells in vitro, ex vivo or in vivo. These include cationic polymers or co-polymers having a cationic block. such as, for example, polylysine, polyethylenimine, chitosan and their derivatives. The charged polymer is advantageously a cationic polymer, preferably a linear polyethyleneimine, preferably a partially histidinylated linear polyethyleneimine (IPEI-His), even more preferably in which 5% to 25%, more preferably 16%, of the total monomers are histidinylated; such copolymers are described in Application WO 2009/112402. The molecule of interest charged is capable of forming a particle with the polymer (s) of opposite charge.

Il s'agit d'un polyélectrolyte positif ou négatif, notamment une molécule utilisée pour le diagnostic, la thérapie ou l'imagerie cellulaire/tissulaire. La molécule d'intérêt chargée est en particulier un acide nucléique, notamment une molécule d'ADN, d'ARN ou mixte ADN/ARN, simple-brin, double- brin (en totalité ou partiellement), linéaire ou circulaire, naturelle, recombinante, synthétique ou semi-synthétique, incluant les acides nucléiques modifiés au niveau de la partie sucre et/ou ou base de leurs nucléotides, et/ou de leurs liaisons internucléotidiques, par exemple du type morpholino ou PNA. L'acide nucléique est avantageusement un ADN ou un ARNm 10 comprenant une séquence codant pour un polypeptide ou une protéine d'intérêt, notamment thérapeutique; un ADN ou ARN antisens, un ARN interférant ou un ribozyme comprenant une séquence complémentaire d'un gène d'intérêt, notamment thérapeutique; un ADN codant les ARN précédents. De préférence, ledit acide nucléique comprend les éléments permettant son expression dans la cellule ou 15 l'organisme hôte, à savoir des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction (promoteur, polyA). Il peut être également incorporé dans un vecteur tel qu'un vecteur plasmidique. Parmi les acides nucléiques d'intérêt thérapeutique, on peut citer la forme non-mutée et par conséquent fonctionnelle des gènes impliqués dans les 20 maladies héréditaires, notamment les maladies héréditaires monogéniques, ainsi que les acides nucléiques codant pour des antigènes de microorganismes ou des antigènes tumoraux. Selon un mode de réalisation avantageux, l'acide nucléique est un ADN, de préférence un plasmide. 25 Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit acide nucléique est un acide nucléique d'intérêt thérapeutique. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le complexe selon l'invention est une particule de taille inférieure à 100 nm, de préférence inférieure à 70 nm. Il s'agit notamment d'une particule de 10 à 70 nm, de préférence de 30 à 30 70 nm, de manière préférée d'environ 50 nm. De préférence, ladite particule est un polyplexe d'acide nucléique, de manière préférée un polyplexe monoplasmidique.It is a positive or negative polyelectrolyte, especially a molecule used for diagnosis, therapy or cell / tissue imaging. The molecule of interest charged is in particular a nucleic acid, in particular a molecule of DNA, RNA or mixed DNA / RNA, single-stranded, double-stranded (in whole or in part), linear or circular, natural, recombinant synthetic or semi-synthetic, including nucleic acids modified at the level of the sugar moiety and / or the base of their nucleotides, and / or their internucleotide linkages, for example of the morpholino or PNA type. The nucleic acid is advantageously a DNA or an mRNA comprising a sequence coding for a polypeptide or a protein of interest, in particular therapeutic; an antisense DNA or RNA, an interfering RNA or a ribozyme comprising a sequence complementary to a gene of interest, in particular therapeutic; a DNA encoding the previous RNAs. Preferably, said nucleic acid comprises elements allowing its expression in the cell or the host organism, namely transcriptional and / or translational regulatory elements (promoter, polyA). It can also be incorporated in a vector such as a plasmid vector. Among the nucleic acids of therapeutic interest, mention may be made of the non-mutated and therefore functional form of the genes involved in hereditary diseases, in particular heritable monogenic diseases, as well as the nucleic acids coding for antigens of microorganisms or antigens. tumor. According to an advantageous embodiment, the nucleic acid is a DNA, preferably a plasmid. According to another advantageous embodiment, said nucleic acid is a nucleic acid of therapeutic interest. According to another advantageous embodiment, the complex according to the invention is a particle of size less than 100 nm, preferably less than 70 nm. It is in particular a particle of 10 to 70 nm, preferably 30 to 70 nm, preferably about 50 nm. Preferably, said particle is a nucleic acid polyplex, preferably a monoplasmid polyplex.

L'invention englobe les particules chargées négativement ou positivement, telles que notamment des particules inorganiques ou magnétiques. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'invention et éventuellement un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont les excipients classiques bien connus de l'Homme du métier. La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un autre composé, notamment un principe actif d'un médicament ou un adjuvant capable de s'associer au complexe polymère/acide nucléique selon l'invention et d'améliorer le pouvoir transfectant dudit complexe. Selon un mode de réalisation avantageux, le complexe ou la composition de l'invention comprennent un élément ou agent de ciblage permettant d'orienter le transfert de la molécule d'intérêt chargée, notamment l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus souhaités, par exemple des cellules tumorales, hépatiques, immunitaires ou hématopoïétiques. Il peut s'agir également d'un élément de ciblage intracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés, par exemple le noyau, les microtubules ou les mitochondries. Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides oligonucléotides, les lipides ou les protéines. Avantageusement, il s'agit de sucres, de peptides ou de protéines, tels que de façon non-limitative : des anticorps ou fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou des fragments de récepteurs. En particulier, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de cytokines, de lectines cellulaires ou de protéines d'adhésion. On peut également citer le récepteur de la transferrine. des IIDL et des LDL. L'élément de ciblage peut également être la partie sucre permettant de cibler le récepteur du fragment Fc des immunoglobulines.The invention encompasses negatively or positively charged particles, such as in particular inorganic or magnetic particles. The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a complex according to the invention and optionally a pharmaceutically acceptable excipient. Pharmaceutically acceptable excipients are the conventional excipients well known to those skilled in the art. The pharmaceutical composition according to the invention may further comprise at least one other compound, in particular an active ingredient of a drug or an adjuvant capable of associating with the polymer / nucleic acid complex according to the invention, and of improving the transfecting capacity. of said complex. According to an advantageous embodiment, the complex or the composition of the invention comprises a targeting element or agent for orienting the transfer of the charged molecule of interest, in particular the nucleic acid. This targeting element may be an extracellular targeting element, making it possible to direct the transfer of the nucleic acid towards certain cell types or certain desired tissues, for example tumoral, hepatic, immune or hematopoietic cells. It may also be an intracellular targeting element, to guide the transfer of nucleic acid to certain preferred cellular compartments, for example the nucleus, microtubules or mitochondria. Among the targeting elements that may be used in the context of the invention, mention may be made of sugars, oligonucleotide peptides, lipids or proteins. Advantageously, these are sugars, peptides or proteins, such as, but not limited to: antibodies or antibody fragments, cell receptor ligands or fragments thereof, receptors or fragments thereof. receptors. In particular, they may be growth factor receptor ligands, cytokines, cell lectins or adhesion proteins. We can also mention the transferrin receptor. IIDL and LDL. The targeting element may also be the sugar moiety for targeting the immunoglobulin Fc receptor.

L'élément de ciblage est avantageusement lié au complexe selon l'invention, de façon directe ou indirecte, par l'intermédiaire de liaisons covalentes et/ou non-covalentes, selon les techniques standards connues de l'homme du métier. De préférence, l'agent de ciblage est fixé sur le polymère cationique ou anionique de façon à être exposé à la surface du polyplexe selon l'invention, en particulier un polyplexe MonoADN, pour obtenir une efficacité de ciblage maximale du complexe selon l'invention. Les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie orale, parentérale, notamment intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée, sublinguale ; locale, notamment topique, transdermique, rectale, vaginale, intraoculaire, intranasale ; intratumorale, ou par inhalation. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, pour une administration par inhalation (aérosol), ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir de solutions stériles isotoniques ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettant la constitution de solutés injectables.The targeting element is advantageously linked to the complex according to the invention, directly or indirectly, via covalent and / or non-covalent bonds, according to the standard techniques known to those skilled in the art. Preferably, the targeting agent is attached to the cationic or anionic polymer so as to be exposed on the surface of the polyplex according to the invention, in particular a Mono DNA polyplex, to obtain a maximum targeting efficiency of the complex according to the invention. . The compositions according to the invention may be formulated for oral, parenteral, in particular intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, sublingual administration; local, including topical, transdermal, rectal, vaginal, intraocular, intranasal; intratumoral, or by inhalation. Preferably, the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for direct injection into the desired organ, for administration by inhalation (aerosol), or for topical administration ( on skin and / or mucosa). It may be isotonic sterile solutions or dry compositions, in particular lyophilized, which by addition according to the case of sterilized water or physiological saline, allowing the constitution of injectable solutions.

Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. Les complexes et compositions selon l'invention peuvent être utilisés pour le transfert de molécules d'intérêt chargées, notamment d'acides nucléiques dans les cellules in vivo, in vitro ou ex vivo. En particulier, du fait de leur toxicité réduite et de leur efficacité de transfection, les complexes selon l'invention peuvent être utilisés pour transférer de manière efficace des acides nucléiques dans de nombreux types cellulaires habituellement difficiles à transfecter, notamment des lignées cellulaires primaires et des cellules fragiles, particulièrement sensibles à la toxicité des agents de transfection.The nucleic acid doses used for the injection as well as the number of administrations may be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or the duration of the desired treatment. The complexes and compositions according to the invention can be used for the transfer of charged molecules of interest, in particular nucleic acids into the cells in vivo, in vitro or ex vivo. In particular, because of their reduced toxicity and transfection efficiency, the complexes according to the invention can be used to efficiently transfer nucleic acids into many cell types that are usually difficult to transfect, including primary cell lines and cell lines. fragile cells, particularly sensitive to the toxicity of transfection agents.

Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un complexe selon la présente invention pour transfecter des cellules, in vitro ou ex vivo. La présente invention a également pour objet un procédé pour transférer in vitro ou ex vivo une molécule d'intérêt chargée, notamment un acide nucléique, en particulier un plasmide, dans des cellules, ledit procédé comprenant la mise en contact desdites cellules avec au moins un complexe selon la présente invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention. Les cellules peuvent être d'origine procaryote ou eucaryote, en particulier animale, végétale ou humaine.Thus, the present invention relates to the use of a complex according to the present invention for transfecting cells, in vitro or ex vivo. The present invention also relates to a method for transferring in vitro or ex vivo a charged molecule of interest, in particular a nucleic acid, in particular a plasmid, into cells, said method comprising contacting said cells with at least one complex according to the present invention or a pharmaceutical composition according to the invention. The cells may be of prokaryotic or eukaryotic origin, in particular animal, plant or human origin.

Avantageusement, les cellules sont des cellules de mammifères, de façon avantageuse choisies parmi : des cellules souches hématopoïétiques, des cellules du système immunitaire, telles que des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes ; des cellules du foie ; des cellules des muscles squelettiques ; des cellules de la peau telles que des fibroblastes, des kératinocytes, des cellules dendritiques et des mélanocytes ; des cellules des vaisseaux et microvaisseaux sanguins, telles que des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses ; des cellules épithéliales des voies aériennes ; des cellules du système nerveux central ; des cellules cancéreuses ; des cellules du tissu conjonctif, telles que des ténocytes. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la méthode de transfection ou l'utilisation du complexe ou de la composition pharmaceutique selon l'invention pour la transfection in vitro ou ex vivo se caractérisent en ce que l'on met en présence le complexe ou la composition dans un milieu contenant des cellules à transfecter, dans des conditions telles que le complexe passe au travers de la membrane plasmique des cellules et libère la molécule d'intérêt chargée, notamment l'acide nucléique, en particulier le plasmide, dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules. L'acide nucléique ainsi libéré dans les cellules est transcrit et la protéine correspondante exprimée dans la cellule. La présente invention a en outre pour objet un complexe selon l'invention pour son utilisation comme médicament.Advantageously, the cells are mammalian cells, advantageously chosen from: hematopoietic stem cells, cells of the immune system, such as dendritic cells, macrophages and lymphocytes; liver cells; skeletal muscle cells; skin cells such as fibroblasts, keratinocytes, dendritic cells and melanocytes; blood vessel and microvessel cells, such as endothelial cells and smooth muscle cells; epithelial cells of the airways; central nervous system cells; cancer cells; connective tissue cells, such as tenocytes. According to an advantageous embodiment of the invention, the method of transfection or the use of the complex or the pharmaceutical composition according to the invention for transfection in vitro or ex vivo is characterized in that the complex or the composition in a medium containing cells to be transfected, under conditions such that the complex passes through the plasma membrane of the cells and releases the charged molecule of interest, in particular the nucleic acid, in particular the plasmid, in the cytoplasm and / or the nucleus of the cells. The nucleic acid thus released into the cells is transcribed and the corresponding protein expressed in the cell. The present invention further relates to a complex according to the invention for its use as a medicament.

L'invention englobe également un complexe selon l'invention pour son utilisation dans le traitement d'une maladie génétique héréditaire ou acquise. La maladie génétique héréditaire est de préférence une maladie monogénique telle que de façon non-limitative les syndromes de déficit immunitaire combiné sévère (SCID), la mucoviscidose, l'hémophilie, la drépanocytose, la béta-thalassémie et la dystrophie musculaire de Duchenne. La maladie génétique acquise inclut les cancers et les infections par des microorganismes pathogènes tels que notamment des bactéries, virus ou parasites pathogènes. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure I illustre le principe de la formation de polyplexes selon le procédé de l'invention, en utilisant comme exemple les polyplexes monoplasmidiques (MonoADN). - la figure 2 illustre le procédé de formulation des polyplexes par extrusion de plasmide. la figure 3 représente l'analyse par diffusion dynamique de la lumière (DLS) du diamètre des polyplexes d'ADN du phage lambda et de polyéthyléneimine linéaire, non modifiée (1-PEI) ou modifiée par des groupements histidyles (1-PEI-Histidine 16 %), préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention : -figure 3a. Diamètre des polyplexes en fonction du diamètre des pores de la membrane d'extrusion (15 nm à 1000 nm), à une pression de 120 mbars. -figure 3b. Diamètre des polyplexes en fonction du diamètre des pores de la membrane d'extrusion (15 nm à 1000 nm), à une pression de 2 bars. -figure 3c. Diamètre des polyplexes en fonction du rapport massique (pg/pg) entre le polymère et l'ADN, N/P (1 à 6), à une pression de 2 bars, en utilisant une membrane d'extrusion avec des pores de 50 nm. - la figure 4 représente des images de microscopie électronique en transmission (TEM) de polyplexes monoADN formés par extrusion d'une solution de plasmide d'environ 9500 paires de bases dans une solution de polycations de IPEI 30 greffée histidine (16% de greffage) avec un rapport de charge ADN : Polymère de 1 : 1. Les pores utilisés ont un diamètre de 50 nm et la pression d'extrusion est de 2 bars. A. images de TEM en coloration négative des polyplexes formulés en milieu dilué (0,1 pg/pL d'ADN). La barre d'échelle sur l'image de gauche représente 50 nm. La barre d'échelle sur l'image de droite représente 150 nm. L'image du polyplexe montre en clair les parties anioniques et en foncé les parties cationiques. B. image de CryoTEM des polyplexes formulés en milieu concentré (2 pg4tL d'ADN). La barre d'échelle représente 100 nnt. - la figure 5 représente la mesure par diffusion dynamique de la lumière du diamètre des polyplexes monoADN à base de plasmide et de polymère cationique (1-PEI-Histidine 16 %) préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention, en utilisant des concentrations croissantes (0,1 à 2 mg/mi) de deux plasmides (ADNp 1 : 9,6 kb et ADNp 2 : 5,9 kb). - la figure 6 représente la mesure de l'activité luciférase (RLU) après transfection de cellules Hela avec des polyplexes MonoADN préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention, en utilisant un plasmide de 9500 paires de base (2,5 ug) codant pour la luciférase (pCMVLuc) et différents polymères cationiques : polyéthylénimine linéaire comprenant 0, 6 ou 14 % de momomères histidylés (1PEI, 6 % ou 14 %), avec un rapport N/P (rapport massique (ug/pg) entre le polymère et l'ADN) variable, compris entre 1 et 6, par comparaison avec des polyplexes obtenus par le procédé de formulation standard (N/P=6). - la figure 7 représente la mesure de la toxicité induite par la transfection de cellules HeLa avec des polyplexes issus de la complexation de l'ADN (2,5pg ou 5pg) par plusieurs types de polymères cationiques : polyéthylénimine linéaire non-modifiée (1PEI) et polyéthylénimine linéaire comprenant 6 ou 14 % de momomères histidylés (1PEI-Histidine 6 % et 1PEI-Histidine 14 %), selon la formulation standard (rapport massique (tg/tg) entre le polymère et l'ADN, N/P =6 et la formulation par extrusion (rapport massique (pg/ug) entre le polymère et l'ADN, N/P=3) EXEMPLE 1: 1VIATERIELS ET METHODES 1) Matériels - Polymères cationiques Deux polymères cationiques standards ont été testé: - polyéthylénimine linéaire, 11PEI (jetPEIO, POLYPLUS TRANSFECTION) et - polyéthylénimine linéaire histidylée (1PEI-His) telle que décrite dans la Demande WO 2009/112402 et commercialisée par POLYTHERA.GENE : 1PEI-His comprenant 6, 14, 16 ou 30% de momomères histidylés, également dénommée PTG16, PTG114 PTG116, PTG130 ou 1PEI-Histidine 6 %, 1PEI-Histidine 14 %, 1PEI-Histidine 16 % et 1PEI-Histidine 30 %, respectivement. - Acides nucléiques ADN linéaire de phage lambda (48 kb) ; plasmide de 9,6 kb ; plasmide de 5,9 kb ; plasmide pCMV-lue codant pour le gène de la luciferase (Luc) de lampyre (Photinus pyralis) sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus humain (CMV ; pTG11033, 9514 bp, Transgène S.A., Strasbourg, France) : - Cellules Les cellules HeLa (CCL2, ATCC, Rockville MD, USA) sont maintenues en culture par passage régulier dans du milieu MEM (Gibco, Invitrogen SARL, CergyPontoise, France) contenant 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur, 2 mM 1-glutamine et 100 U/mL de penicilline et 50 U/mL de streptomycine (Gibco). 2) Méthodes - Extrusion du plasmide dans la solution de polymère cationique L'extrudeuse est de type pneumatique (LiposoFastTm ; AVESTIN).The invention also encompasses a complex according to the invention for use in the treatment of a hereditary or acquired genetic disease. The hereditary genetic disease is preferably a monogenic disease such as, but not limited to, severe combined immunodeficiency syndromes (SCID), cystic fibrosis, hemophilia, sickle cell anemia, beta-thalassemia and Duchenne muscular dystrophy. The acquired genetic disease includes cancers and infections by pathogenic microorganisms such as, in particular, pathogenic bacteria, viruses or parasites. In addition to the foregoing, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the subject of the present invention, with reference to the accompanying drawings in FIG. which: - Figure I illustrates the principle of the formation of polyplexes according to the method of the invention, using as an example the monoplasmid polyplexes (MonoDNA). FIG. 2 illustrates the process for the formulation of polyplexes by plasmid extrusion. FIG. 3 represents the dynamic light scattering analysis (DLS) of the diameter of phage lambda DNA polyplexes and linear unmodified polyethylenimine (1-PEI) or modified with histidyl groups (1-PEI-Histidine). 16%), prepared according to the extrusion process of the invention: FIG. 3a. Diameter of the polyplexes as a function of the pore diameter of the extrusion membrane (15 nm to 1000 nm) at a pressure of 120 mbar. -figure 3b. Diameter of the polyplexes as a function of the pore diameter of the extrusion membrane (15 nm to 1000 nm) at a pressure of 2 bar. 3c. Diameter of the polyplexes as a function of the mass ratio (μg / μg) between the polymer and the DNA, N / P (1 to 6), at a pressure of 2 bar, using an extrusion membrane with pores of 50 nm . FIG. 4 represents transmission electron microscopy (TEM) images of mono-DNA polyplexes formed by extrusion of a plasmid solution of approximately 9500 base pairs in a solution of polycations of histidine-grafted IPEI (16% grafting). with a DNA charge ratio: Polymer of 1: 1. The pores used have a diameter of 50 nm and the extrusion pressure is 2 bars. A. TEM images in negative staining of polyplexes formulated in diluted medium (0.1 μg / μL of DNA). The scale bar on the left image represents 50 nm. The scale bar on the right image represents 150 nm. The image of the polyplex clearly shows the anionic parts and darkens the cationic parts. B. CryoTEM image of the polyplexes formulated in a concentrated medium (2 μg / ml of DNA). The scale bar represents 100 nnt. FIG. 5 represents the dynamic light scattering measurement of the diameter of the plasmid-based and cationic polymer-based mono-DNA polyplexes (1-PEI-Histidine 16%) prepared according to the extrusion method of the invention, using increasing concentrations (0.1 to 2 mg / ml) of two plasmids (pDNA 1: 9.6 kb and pDNA 2: 5.9 kb). FIG. 6 shows the measurement of luciferase activity (RLU) after transfection of Hela cells with Mono DNA polyplexes prepared according to the extrusion method of the invention, using a plasmid of 9500 base pairs (2.5 μg). ) coding for luciferase (pCMVLuc) and various cationic polymers: linear polyethylenimine comprising 0, 6 or 14% of histidylated momomers (1PEI, 6% or 14%), with a N / P ratio (mass ratio (μg / μg) between the polymer and DNA) varying between 1 and 6, compared with polyplexes obtained by the standard formulation process (N / P = 6). FIG. 7 represents the measurement of the toxicity induced by the transfection of HeLa cells with polyplexes resulting from the complexation of DNA (2.5 μg or 5 μg) by several types of cationic polymers: unmodified linear polyethylenimine (1PEI) and linear polyethylenimine comprising 6 or 14% of histidylated momomers (1PEI-Histidine 6% and 1PEI-Histidine 14%), according to the standard formulation (mass ratio (tg / tg) between the polymer and the DNA, N / P = 6 and the extrusion formulation (mass ratio (μg / μg) between the polymer and the DNA, N / P = 3). EXAMPLE 1: 1VIATERIALS AND METHODS 1) Materials - Cationic Polymers Two standard cationic polymers were tested: linear polyethylenimine , 11PEI (jetPEIO, POLYPLUS TRANSFECTION) and -histidylated linear polyethylenimine (1PEI-His) as described in Application WO 2009/112402 and marketed by POLYTHERA.GENE: 1PEI-His comprising 6, 14, 16 or 30% of histidylated momomers , also designated as PTG16, PTG114 PTG116, PTG130 or 1PEI-Histidine 6%, 1PEI-Histidine 14%, 1PEI-Histidine 16% and 1PEI-Histidine 30%, respectively. Nucleic acids Linear phage lambda DNA (48 kb); 9.6 kb plasmid; 5.9 kb plasmid; plasmid pCMV-luc coding for the lamprey luciferase (Luc) gene (Photinus pyralis) under the control of the human cytomegalovirus promoter (CMV, pTG11033, 9514 bp, Transgene SA, Strasbourg, France): - Cells HeLa cells ( CCL2, ATCC, Rockville MD, USA) are maintained in culture by regular passage in MEM medium (Gibco, Invitrogen Ltd., CergyPontoise, France) containing 10% heat-inactivated fetal calf serum, 2 mM 1-glutamine and 100 U / mL penicillin and 50 U / mL streptomycin (Gibco). 2) Methods Extrusion of the Plasmid into the Cationic Polymer Solution The extruder is of pneumatic type (LiposoFast ™ AVESTIN).

Les seringues et pré-filtres support du système d'extrusion sont nettoyés par sinisation dans l'éthanol puis rincés à l'eau doublement dé-ionisée. La membrane poreuse en polycarbonate (Nucleporen4 ; WHATMANe) est préalablement trempée dans l'éthanol quelques secondes puis dans l'eau afin d'assurer le remplissage des pores. Les seringues (d'une contenance de lmL) sont remplies au maximum jusqu'à moitié.The syringes and pre-filters in the extrusion system are cleaned with ethanol and then rinsed with doubly deionized water. The porous polycarbonate membrane (Nucleporen4; WHATMANe) is previously soaked in ethanol a few seconds and then in water to ensure the filling of the pores. Syringes (with a capacity of 1 ml) are filled to a maximum of half.

Ainsi après extrusion le volume ne dépassera pas la contenance de la seringue trans. Les solutions d'ADN et de polyélectrolytes positifs sont placées dans chaque seringue. Les pré-filtres support de l'extrudeuse sont insérés dans l'embouchure de chaque seringue. La membrane poreuse est placée sans la sécher sur l'un des pré-filtres et les deux seringues sont montées sur l'extrudeuse pneumatique. L'activation de l'extrudeuse, injecte une solution dans l'autre au travers de la membrane poreuse. Puis les seringues sont démontées de l'extrudeuse et les polyplexes formés sont récupérés dans la seringue remplie. - Mesure de la taille des particules par Diffitsion dynamique de la lumière (DLS pour Dynamic Light Scattering) Les solutions de polyplexes sont diluées de façon à obtenir 1 mL de solution puis analysées par un Zetasizer Nano (MALVERN, Malvem Instrument, France, Laser rouge : 633 nm, angle 173°) utilisant la diffusion de la lumière dynamique, d'après la diffusion des particules. - Analyse des particules par microscopie électronique en transmission (TEM pour Transmission Electron Microscopy) CryoTEM Une grille de carbone Quantifoil (Jena, Allemagne) est ionisée par décharge électrique et 5 !JI de polyplexes y sont déposés. La grille est rapidement imergée dans de l'éthane liquide par un cryoplongeur puis stockée dans l'azote liquide avant analyse. L'échantillon congelé est alors introduit dans un microscope électronique à transmission de précision JEOL 2011 par un porte échantillon cryogénique. Les polyplexes sont imagés à 200 kV en utilisant une dose d'exposition minimale pour garder le film intact et permettre un grossissement de 50,000X. Les photographies sont digitalisées à 4000 points par pouce par un scanner Nikon CoolScan. - Visualisation des molécules d'ADN franchissant les pores La méthode utilisée est celle précédemment décrite (Auger et al., Physical Review Letters ; 9 juillet 2014, 113, 028302.1-5). - Test de cytotoxicité (MIT) Après incubation des cellules avec les polyplexes pendant 48h, 100 jti d'une solution de 3 (4,5-diméthylthiazol-2-y1) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) à 5 mg/ml dans du PBS sont ajoutés par puits de culture, et les cellules sont incubées pendant 4 h à 37 °C. Le MTT qui a été converti en formazan est solubilisé par la suite avec de l'isopropanol acide. La cytotoxicité a été déterminée en mesurant l'absorbance à 570 mn avec un spectrophotomètre Victor I (PerkinElmer, Courtaboeuf, France) et exprimée en pourcentage de l'absorbance des cellules incubées avec les polyplexes par rapport à l'absorbance des cellules incubées sans polyplexes. - Test de mesure de l'activité luciférase L'efficacité de transfection est quantifiée après 48 h de culture en mesurant l'activité de la luciférase dans les lysats cellulaires comme suit. Le milieu de culture est éliminé et les cellules sont lysées à la température ambiante pendant 10 min dans du tampon de lyse (1% de Triton X-100, 25 mM de Tris-phosphate, 1 mM de DTT, 1 mM EDTA, 15% glycérol, 1 mM MgC12, pH 7,8). Le substrat de la luciférase (Beetle luciférine, Promega, Madison, USA) est ajouté au surnageant de lysat en présence de 1 mM d'ATP. L'activité luciférase est mesurée en utilisant un luminomètre (Lumat LB 9507, Berthold, Thoiry, France) et exprimée en RLU par mg de protéine après normalisation des protéines en utilisant le test colorimétrique BCA et la sérum-albumine bovine. EXEMPLE 2: PREPARATION DE POLYPLEXES MONO-ADN Des polyplexes monoplasmidiques ont été préparés selon la méthode décrite à l'exemple 1 dont le principe et les conditions de mise en oeuvre sont schématisés sur les figures 1 et 2. Typiquement, deux compartiments séparés par une surface poreuse sont respectivement remplis d'une solution d'ADN et de polymère cationique. L'ADN est extrudé vers la solution de polymère cationique, provoquant ainsi la condensation des macromolécules d'ADN, une à une (Figure 1). Les concentrations d'ADN plasmidique et de polymère utilisées dans ce travail sont répertoriées sur la figure 2. Il a été montré qu'une pression d'extrusion de 2 bars est suffisante pour permettre la translocation d'ADN linéaire du phage lambda (48 kb) au rayon de giration de l'ordre de 650 nm ou de plasmide de taille élevée, au travers de pores de 50 mn de diamètre. Les expériences réalisées avec l'ADN de ce virus ont montré que cet ADN était capable de passer à travers un pore d'environ 50 nm (figure 3a et 3b) ; ceci implique qu'une contrainte est exercée sur la molécule lors du franchissement. Cependant, 90% de l'ADN passe effectivement le pore. Le diamètre du pore a été varié entre 15 nm et 1000 nm, et il semble que le meilleur diamètre de pore soit autour des 50 nm, pour les plasmides. Il est probable que le diamètre des pores doive être adapté à la taille du plasmide à transloquer. La nature de la membrane importe peu.Thus after extrusion the volume will not exceed the capacity of the trans syringe. The solutions of DNA and positive polyelectrolytes are placed in each syringe. The pre-filter support of the extruder is inserted into the mouth of each syringe. The porous membrane is placed without drying on one of the pre-filters and the two syringes are mounted on the pneumatic extruder. Activation of the extruder injects a solution into the other through the porous membrane. Then the syringes are disassembled from the extruder and the formed polyplexes are recovered in the filled syringe. - Measurement of the particle size by Dynamic Light Scattering (DLS) Polyplex solutions are diluted to obtain 1 mL of solution and analyzed by a Zetasizer Nano (MALVERN, Malvem Instrument, France, Red Laser 633 nm, angle 173 °) using dynamic light scattering, based on particle scattering. Particle Analysis by Transmission Electron Microscopy (TEM) CryoTEM A Quantifoil carbon grid (Jena, Germany) is ionized by electric discharge and 5 μl of polyplexes are deposited thereon. The grid is rapidly immersed in liquid ethane by a cryoplonger and then stored in liquid nitrogen before analysis. The frozen sample is then introduced into a JEOL 2011 precision transmission electron microscope with a cryogenic sample holder. The polyplexes are imaged at 200 kV using a minimum exposure dose to keep the film intact and allow 50,000X magnification. The photographs are digitized at 4000 dots per inch by a Nikon CoolScan scanner. - Visualization of the DNA molecules crossing the pores The method used is that previously described (Auger et al., Physical Review Letters, July 9, 2014, 113, 028302.1-5). Cytotoxicity test (MIT) After incubation of the cells with the polyplexes for 48 hours, 100 ml of a solution of 3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium (MTT) at 5 mg / ml in PBS are added per culture well, and the cells are incubated for 4 h at 37 ° C. MTT which has been converted to formazan is subsequently solubilized with isopropanol acid. Cytotoxicity was determined by measuring the absorbance at 570 min with a Victor I spectrophotometer (PerkinElmer, Courtaboeuf, France) and expressed as a percentage of the absorbance of the cells incubated with the polyplexes relative to the absorbance of the incubated cells without polyplexes. . Luciferase Activity Measurement Assay The transfection efficiency is quantified after 48 h of culture by measuring luciferase activity in the cell lysates as follows. The culture medium is removed and the cells are lysed at room temperature for 10 min in lysis buffer (1% Triton X-100, 25 mM Tris-phosphate, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 15% glycerol, 1 mM MgCl2, pH 7.8). The luciferase substrate (Beetle luciferin, Promega, Madison, USA) is added to the lysate supernatant in the presence of 1 mM ATP. The luciferase activity is measured using a luminometer (Lumat LB 9507, Berthold, Thoiry, France) and expressed in RLU per mg of protein after normalization of the proteins using the BCA colorimetric test and the bovine serum albumin. EXAMPLE 2 PREPARATION OF MONO-DNA POLYPLEXES Monoplasmid polyplexes were prepared according to the method described in Example 1, the principle and the conditions of implementation of which are shown diagrammatically in FIGS. 1 and 2. Typically, two compartments separated by a porous surface are respectively filled with a solution of DNA and cationic polymer. The DNA is extruded to the cationic polymer solution, thereby causing the condensation of the DNA macromolecules one by one (Figure 1). The concentrations of plasmid DNA and polymer used in this work are listed in Figure 2. It has been shown that an extrusion pressure of 2 bar is sufficient to allow linear DNA translocation of phage lambda (48 kb ) at the radius of gyration of the order of 650 nm or of high-size plasmid, through pores of 50 nm in diameter. The experiments carried out with the DNA of this virus showed that this DNA was capable of passing through a pore of approximately 50 nm (FIGS. 3a and 3b); this implies that a constraint is exerted on the molecule during the crossing. However, 90% of the DNA actually passes the pore. The diameter of the pore was varied between 15 nm and 1000 nm, and it seems that the best pore diameter is around 50 nm, for the plasmids. It is likely that the pore diameter should be adapted to the size of the plasmid to be translocated. The nature of the membrane does not matter.

Par microscopie, des molécules de plasmide franchissant les pores ont été visualisées ; en conclusion de cette étude, on peut affirmer qu'une unique molécule de plasmide passe le pore à la fois. La caractérisation en imagerie par microscopie électronique en transmission (TEM) en coloration négative a démontré que ces polyplexes sont formés d'un coeur riche en ADN (en clair les parties anioniques) et une couronne riche en polycations (en foncé les parties cationiques) (Figure 4). En outre, la taille mesurée du polyplexes est inférieure à celle théorique de deux molécules de plasmide condensées, indiquant que les polyplexes comprennent une seule molécule de plasmide par nanoparti cule. En variant les rapports N / P (rapports en masse de polymère / ADN, il a été observé que les polyplexes conservaient une taille constante, attestant de l'avantage de la méthode d'extrusion (figure 3c). De même, en faisant varier la concentration en ADN plasmidique, on obtient des polyplexes de taille comparable (figures 4 et 5). Les polyplexes formés avec du PEI-His sont plus petits, plus sphériques, et contiennent de l'ADN sous forme amorphe ; au contraire, ceux formés avec du PET seront plus gros, non-sphériques (apparition de renflements), et contiennent de l'ADN sous forme compactée (peut s'agréger dans le cytosol après la transfection). Les polyplexes conservent leur forme, même 3 jours après leur formation; ceci indique une grande stabilité des polyplexes préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention. Par comparaison, les polyplexes produits par le procédé standard sont peu stables (quelques heures seulement) et doivent donc être utilisés rapidement après leur préparation. EXEMPLE 3: TRANSFECTION IN VITRO AVEC LES POLYPLEXES MONO-ADN Les nanoparticules préparées selon le procédé d'extrusion décrit à l'exemple 1 ont été utilisées pour effectuer des tests de transfection sur des cellules Hela selon un protocole d'incubation de 4 heures, suivi de 48h de culture (conditions de formulation : pores : 50 nm ; P : 2 bars). Les résultats de transfection sont reportés sur la figure 6. Les polyplexes utilisés dans cette étude avaient différents rapports rapport massique (ug/ug) entre le polymère et l'ADN, N/P = 1, 2, 3 et 6). Les transfections sont évaluées par rapport au mode de foimulation standard avec un rapport 1/6. On observe que les diamètres moyens des nanoparticules mesurés 5 par Diffusion dynamique de la lumière (DLS pour Dynamic Light Scattering) sont inférieurs à 60 nm pour N/P = 6, quel que soit le polymère cationique utilisé. Ce diamètre est maintenu lorsque l'on diminue le rapport N/P jusqu'à 3 sauf pour la IPEI, et tend vers des valeurs proches de 150 nm pour N/P =1. De façon très surprenante, aucune précipitation n'est observée lorsque N/P=1, ce qui confiime les observations 10 faites par TEM, à savoir des particules non-homogènes probablement de type coeur-couronne. Les niveaux de transfection des polyplexes monoplasmidiques sont de l'ordre de ceux obtenus dans le cas d'une formulation standard, ce qui est tout à fait performant sauf pour la 1PEI avec laquelle les transfections sont moins efficaces. L'évaluation de la toxicité des formulations menée avec des 15 polyplexes obtenus par formulation classique et des polyplexes obtenus par formulation par extrusion a été conduite par le test MTT (Figure 7). Les résultats obtenus sur différents polymères, à différentes concentration en ADN montrent que les polyplexes monoplasmidiques sont moins toxiques que les nanoparticules issues de formulations standard. 20 D'un point de vue général, la toxicité induite par les polyplexes monoplasmidiques est significativement inférieure à celle des polyplexes standards, ouvrant de nouvelles perspectives pour le transfert de gènes in vivo. EXEMPLE 4: TRANSFECTION IN VIVO AVEC LES POLYPLEXES MONO-ADN 25 Des études in vivo ont également été menées pour évaluer l'efficacité de transfection des polyplexes produits par la méthode de l'invention. Des polyplexes contenant 40gg de plasmide codant pour la Luciférase ont été préparés selon le procédé décrit à l'exemple 1, puis injectés dans la veine caudale de souris. L'injection de Luciférine permet alors de détecter les cellules qui ont été transfectées 30 et expriment le gène luciférase. Les résultats de ces expériences montrent que les particules vont en majorité dans les poumons (capillaires fins), mais également dans la rate ou la vessie (prise en charge par le système de détoxification).By microscopy, plasmid molecules crossing the pores were visualized; at the conclusion of this study, it can be said that a single plasmid molecule passes the pore at a time. The characterization in transmission negative electron microscopy (TEM) showed that these polyplexes are composed of a DNA-rich core (clearly the anionic parts) and a ring rich in polycations (in dark the cationic parts) ( Figure 4). In addition, the measured size of the polyplexes is less than the theoretical size of two condensed plasmid molecules, indicating that the polyplexes comprise a single plasmid molecule per nanoparticle. By varying the N / P ratios (polymer / DNA mass ratios), it was observed that the polyplexes remained constant in size, indicating the advantage of the extrusion method (Figure 3c). the concentration of plasmid DNA, polyplexes of comparable size are obtained (Figures 4 and 5) The polyplexes formed with PEI-His are smaller, more spherical, and contain DNA in amorphous form, on the contrary, those formed with PET will be larger, non-spherical (appearance of bulges), and contain DNA in compacted form (may aggregate in the cytosol after transfection) Polyplexes retain their shape, even 3 days after their formation this indicates a high stability of the polyplexes prepared according to the extrusion method of the invention.In comparison, the polyplexes produced by the standard method are unstable (only a few hours) and must therefore be used quickly. after their preparation. EXAMPLE 3: IN VITRO TRANSFECTION WITH MONO-DNA POLYPLEXES The nanoparticles prepared according to the extrusion method described in Example 1 were used to perform transfection tests on Hela cells according to a 4-hour incubation protocol. followed by 48 hours of culture (formulation conditions: pores: 50 nm, P: 2 bars). The transfection results are reported in Figure 6. The polyplexes used in this study had different mass ratio ratios (μg / μg) between the polymer and the DNA, N / P = 1, 2, 3 and 6). Transfections are evaluated against the standard foimulation mode with a 1/6 ratio. It is observed that the average diameters of the nanoparticles measured by Dynamic Light Scattering (DLS) are less than 60 nm for N / P = 6, regardless of the cationic polymer used. This diameter is maintained when the N / P ratio is reduced to 3 except for IPEI, and tends to values close to 150 nm for N / P = 1. Very surprisingly, no precipitation is observed when N / P = 1, which confirms the observations made by TEM, namely non-homogeneous particles probably of the core-crown type. The transfection levels of the monoplasmid polyplexes are of the order of those obtained in the case of a standard formulation, which is quite efficient except for the 1PEI with which the transfections are less effective. The evaluation of the toxicity of the formulations carried out with polyplexes obtained by conventional formulation and polyplexes obtained by extrusion formulation was conducted by the MTT test (FIG. 7). The results obtained on different polymers with different concentrations of DNA show that monoplasmid polyplexes are less toxic than nanoparticles from standard formulations. From a general point of view, the toxicity induced by monoplasmid polyplexes is significantly lower than that of standard polyplexes, opening new perspectives for gene transfer in vivo. EXAMPLE 4: IN VIVO TRANSFECTION WITH MONO-DNA POLYPLEXES In vivo studies were also conducted to evaluate the transfection efficiency of the polyplexes produced by the method of the invention. Polyplexes containing 40 μg of plasmid encoding Luciferase were prepared according to the method described in Example 1, and then injected into the caudal vein of mice. The injection of Luciferin then makes it possible to detect the cells which have been transfected and express the luciferase gene. The results of these experiments show that the majority of particles are in the lungs (fine capillaries), but also in the spleen or bladder (supported by the detoxification system).

Conclusions La méthode de formulation d'ADN proposée dans cette étude permet d'obtenir des polyplexes monoplasmidiques ayant des niveaux de transfection in vitro équivalents à ceux obtenus dans le cas de formulation standard. Les nanoparticules obtenues semblent être de type coeur-couronne, ce qui est important pour une question de ciblage et de furtivité dans les applications in vivo. La toxicité déterminée est plus faible que dans le cas d'une formulation classique, et on peut s'attendre à ce que ce type de formulation limite les questions d'embolie pulmonaire lors d'injection IV dans les souris, et donc une diminution significative de la toxicité in vivo.Conclusions The method of DNA formulation proposed in this study allows to obtain monoplasmid polyplexes having in vitro transfection levels equivalent to those obtained in the case of standard formulation. The nanoparticles obtained seem to be of the heart-crown type, which is important for a question of targeting and stealth in in vivo applications. The determined toxicity is lower than in the case of a conventional formulation, and it can be expected that this type of formulation limits the issues of pulmonary embolism during IV injection in mice, and therefore a significant decrease in vivo toxicity.

Claims

REVENDICATIONS1. Process for the preparation of charged polymer complexes and of a single molecule of interest of opposite charge, characterized in that it comprises at least the following stages: the distribution of a solution of molecules of d interest charged in a first compartment separated from a second compartment by a porous surface, and said second compartment comprising a solution of polymer (s) of opposite charge, and - the extrusion of charged molecules of interest, one by one, through said porous surface to the oppositely charged polymer solution (s) to form complexes between the charged polymer (s) and a single molecule of opposite charge interest.

2. Method according to claim 1, characterized in that said surface is a membrane comprising pores with a size of 5 to 200 min.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the extrusion is carried out at a pressure of between 10 mbar and 3 bar.

4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said polymer is a cationic polymer.

5. Method according to claim 4, characterized in that said cationic polymer is a linear polyethyleneimine.

6. Method according to claim 5, characterized in that said polyethyleneimine is partially histidylated.

7. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said molecule of interest is a nucleic acid.

8. Method according to claim 7, characterized in that said nucleic acid is a plasmid.

9. Complex of cationic polymer (s) and a single molecule of nucleic acid.

10. Complex of charged polymer (s) and a single molecule of interest of opposite charge, obtained by the method according to any one of claims 1 to 8.

11. Complex according to claim 9 or 10, characterized in that it is a cationic polymer (s) complex (s) as (s) defined (s) to any one of claims 4 to 6 and a nucleic acid as defined in any one of claims 7 to 8.

12. Complex according to any one of claims 9 to 11, characterized in that it is a particle of size less than 70 nm.

13. Use of a complex according to any one of claims 9 to 12 for transfecting cells, in vitro or ex vivo.

14. A complex according to any one of claims 9 to 12 for use as a medicament.

15. Complex according to any one of claims 9 to 12 for its use in the treatment of a genetic or acquired disease.