FR3025216A1 - Procede d'extraction de lipide par electropulsation - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé d'électroextraction de lipides dans un flux de milieu liquide consistant à soumettre des cellules à parois telles qu'une microalgue, une macroalgue, une cyanobactérie, une levure ou une cellule végétale à l'électropulsation et à récupérer les lipides libérés. Le procédé consiste en une étape d'électropulsation suivie d'une étape d'incubation, laissant structurellement intacte une partie des cellules cibles.
Description
1 La présente invention concerne un procédé d'électroextraction de lipides contenus dans des organelles lipidiques cytoplasmiques au sein des cellules vivantes sans addition de solvant organique, laissant structurellement intacte une partie des cellules cibles. Les cellules à parois telles que les microalgues, les macroalgues, les cyanobactéries, les levures et les cellules végétales peuvent accumuler le carbone absorbé sous forme de lipides. Ces lipides sont associés au sein d'organelles complexes par des processus d'auto-assemblage de triglycérides, de phospholipides et de protéines. Ce sont des auto-assemblages de composés hydrophobes dans une coque protéolipidique à caractère amphiphile. L'extraction de ces lipides exige donc soit le passage direct de ces assemblages complexes à travers la paroi qui est connue comme un assemblage de biomacromolécules, soit une rupture de cette paroi. Pour extraire ces lipides, il existe plusieurs méthodes. Mais ces techniques sont très dispendieuses et représentent 50% du coût total de production et 90 % de la consommation totale énergétique lorsque l'extraction nécessite une étape préliminaire de séchage. Les principales techniques sont peu nombreuses pour le moment et demandent l'utilisation de méthodes soit physiques, soit chimiques. Lorsque ce sont les méthodes physiques qui sont utilisées, telles que le broyage et les ultrasons, elles reposent sur une rupture mécanique de la paroi pour relarguer le contenu cytoplasmique donnant lieu à la formation de débris. Les débris cellulaires vont être difficiles à séparer. Il y a un risque de piégeage des lipides dans les débris, ce qui rend difficile les étapes ultérieures de séparation. Lorsque ce sont les méthodes chimiques qui sont utilisées, dans la majorité des cas, l'utilisation d'une phase organique est nécessaire. Cette phase est coûteuse et néfaste pour l'environnement en raison de la toxicité des solvants.
Des travaux portant sur les micro-ondes, les ultrasons, et les traitements lasers ont été menés, mais les résultats décrits dans J. R. McMillan, I.A Watson, M.Ali, W.Jaafar, Applied Energy 103 (2013) 128-134 indiquent que ces techniques causent des dommages aux cellules et sont très coûteuses en énergie.
3025216 2 Ainsi, le but de la présente invention est de pallier les inconvénients de l'art antérieur précités et de fournir un procédé d'extraction de lipides, ledit procédé étant économique, facile à mettre en oeuvre et permettant de conserver intactes une partie des cellules. La présente invention a ainsi pour premier objet un procédé d'électroextraction de 5 lipides à partir de cellules à parois dans un flux de milieu liquide caractérisé en ce qu'il comprend successivement (i) une étape d'électropulsation, (ii) une étape d'incubation et (iii) une étape de récupération des lipides. La présente invention concerne donc un procédé comprenant un traitement d'électropulsation appliqué sur un écoulement d'une suspension de cellules à parois, suivi 10 d'une phase d'incubation dans un milieu adapté. L'application de décharges électriques bipolaires pulsées de haut voltage permet à la membrane de devenir perméable. Ainsi les cellules ne sont pas détruites et restent viables et cultivables. Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, une partie de la population cellulaire peut être réutilisée. Une partie des cellules à parois pouvant ainsi être 15 réutilisée, le procédé est non destructif. Les cellules à parois restent intactes macroscopique ment. L'association d'une contrainte électromécanique de longue durée à I'électroperméabilisation de la membrane plasmique induit une déformation de la paroi. La déformation n'étant pas linéaire avec le temps de la contrainte, la durée de l'impulsion doit 20 être longue. La paroi se trouve ainsi perméable et les lipides peuvent être récupérés. La paroi n'ayant pas été détruite, une partie des cellules peut ainsi être réutilisée. Cela facilite la séparation des lipides par des méthodes de centrifugation et/ou de filtration. Une purification des lipides par des procédés classiques tels que la chromatographie est rendue plus aisée car les problèmes de colmatage sont évités.
25 Selon l'objet 1 de l'invention, les cellules à parois peuvent être préférentiellement choisies parmi des microalgues, des cyanobactéries, des levures mais aussi des macroalgues, et des cellules végétales ou leurs mélanges.
3025216 3 Les microalgues sont des cellules à parois photosynthétiques qui utilisent entre autres la lumière du soleil comme source d'énergie pour fixer le dioxyde de carbone. Les lipides accumulés par les microalgues, pouvant atteindre jusqu'à 80% de leur poids sec, sont présents sous forme de triglycérides.
5 Les microalgues peuvent être autotrophes ou hétérotrophes. Les microalgues de métabolisme autotrophe utilisent le carbone inorganique, principalement le CO2 comme source de carbone et la lumière comme source d'énergie. Elles sont principalement cultivées en bassins extérieurs ou dans des photobioréacteurs. Les microalgues hétérotrophes doivent utiliser du carbone organique comme source de carbone et d'énergie. Elles sont principalement 10 cultivées dans des bioréacteurs fermés en absence de rayonnement solaire. Les microalgues peuvent être choisies parmi Botryococcus braunii, Chlorella protothecoides, Cyclotella DI 35, Dunaliella tertiolecta, Hantzchia DI 160, Isochrysis sp, Nannochloris, Nannochloropsis sp, Neochloris oleabundans, Nitzschia sp, Phaeodactylum tricornutum, Pleurochrysis carterae, Scenedesmus TR-84, Stichococcus, Tetraselmis suecica, 15 Thalassiosira pseudonana, Chlorococcum sp, Haematococcus pluvialis, Nostoc sp, Tolypothris sp, Chlamydomonas reinhardtii, Ankistrodesmus falcatus, Chlorella vulgaris, Dunaliella sp, Porphyridium cruentum, Scenedesmus obliquus, Scenedesmus quadricauda. Les macroalgues peuvent être choisies parmi des Euglenophytes, des Chrysophytes, des Phaeophytes, des Rhodophytes et des Pyrrophytes, de préférence aux Euglenophytes, 20 Rhodophytes et Phaeophytes. Les levures peuvent être choisies parmi des Ascomycètes, notamment Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium toruloides, Trichosporon fermentons, Cryptococcus albidus, Yarrowia lipolytica et Lipomyces starkeyi. Les cyanobactéries peuvent être choisies parmi Spirulina, Arthrospira, Anabaema, 25 Nostoc ou Microcystis, de préférence Spirulina. Les cellules végétales peuvent être choisies parmi du soja, palme, maïs, canne à sucre, betterave, colza, arachide, noix, noisette, amande de préférence palme et soja.
3025216 4 Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, les cellules à parois sont des microalgues. La présente invention résout les problèmes évoqués ci-dessus. En effet, selon l'invention, le traitement électrique ne détruit pas les cellules, une partie des cellules restent 5 intactes. Par ailleurs, le procédé se réalisant à température ambiante, cela permet de réduire les coûts. Selon une variante de l'invention, le procédé comprend deux étapes préliminaires à l'étape (i) : (a) une mise en culture de l'échantillon suivie (b) d'un lavage pour éliminer tous les sels du milieu. La seconde étape préliminaire de lavage permet d'obtenir la conductivité 10 souhaitée. L'échantillon subit ensuite le traitement électrique et il est mis à incuber dans un milieu d'incubation conformément au procédé selon l'invention. Les lipides sont alors libérés du volume cytoplasmique et se retrouvent majoritairement libres dans la solution externe. La récupération des lipides est effectuée par les moyens usuels. Selon une variante de la présente invention, l'électropulsation est précédée d'une étape 15 de culture (a). La culture des micro-algues doit être optimisée, pour cela il faut faire un compromis entre la croissance sans carence et la production d'huile qui est induite en réaction à un stress qui ralentit la croissance. Le déséquilibre transitoire entre le flux de carbone issu de la photosynthèse et le flux des éléments nécessaires à la croissance tel que l'azote permet le stockage des lipides.
20 Selon l'objet 1 de l'invention, les cellules sont en suspension dans le milieu liquide lorsqu'elles sont soumises à l'électropulsation. Selon l'objet 1 de l'invention, l'écoulement peut-être linéaire ou turbulent, de préférence turbulent. Selon l'objet 1 de l'invention, le milieu d'extraction consiste en une solution aqueuse 25 dont l'osmolarité est comprise entre 1 mOsm et 1000 mOsm, de préférence de l'eau. Selon l'objet 1 de l'invention, la concentration de cellules à parois dans le milieu est comprise entre 0,1 à 50% V/V, de préférence entre 0,5 et 20% V/V.
3025216 5 Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, sur l'écoulement de cellules à parois sont appliquées des impulsions électriques bipolaires entre les électrodes. Selon l'objet 1 de l'invention, le traitement d'électropulsation est réalisé avec des électrodes planes et parallèles, cylindriques parallèles, coaxiales ou colinéaires, de préférence 5 planes et parallèles. Selon l'objet 1 de l'invention, les électrodes utilisées sont en matériaux conducteurs, de préférence en acier inoxydable. Selon l'objet 1 de l'invention, la durée des impulsions pour tout type de cellules à parois est de préférence choisie pour être supérieure à 0,1 ms. Elle peut atteindre jusqu'à 1s. Elle est 10 de préférence choisie entre 0,1 ms à 5 ms. Selon l'objet 1 de l'invention, l'électropulsation est effectuée avec des distributions de champ électrique dans la chambre de pulsation comprises entre 0,05 kV/cm et 50 kV/cm, de préférence entre 0,1 kV/cm et 7kV/cm, notamment entre 3 kV/cm et 6 kV/cm. Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, l'électropulsation 15 sur les microalgues et les levures avec un jeu d'électrodes planes et parallèles est effectuée avec des distributions de champ électrique dans la chambre de pulsation comprises entre 0,05 kV/cm et 50 kV/cm, de préférence entre 0,1 kV/cm et 7kV/cm, notamment entre 3 kV/cm et 6 kV/cm. Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, l'électropulsation 20 sur les macroalgues et les cellules végétales avec un jeu d'électrodes planes et parallèles est effectuée avec des distributions de champ électrique dans la chambre de pulsation comprises entre 0,1 kV/cm et 5 kV/cm, notamment entre 1kV/cm et 3 kV/cm. Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, l'électropulsation sur les cyanobactéries avec un jeu d'électrodes planes et parallèles est effectuée avec des 25 distributions de champ électrique dans la chambre de pulsation comprises entre 0,5 kV/cm à 10 kV/cm, notamment entre 4 kV/cm et 7 kV/cm.
3025216 6 Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, l'électropulsation sur les microalgues et les levures avec un jeu d'électrodes cylindriques parallèles, coaxiales ou colinéaires est effectuée avec des distributions de champ électrique dans la chambre de pulsation comprises entre 0,05 kV/cm et 50 kV/cm, de préférence entre 0,1 kV/cm et 7 kV/cm, 5 notamment entre 3 kV/cm et 6 kV/cm. Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, l'électropulsation sur les macroalgues et les cellules végétales avec un jeu d'électrodes cylindriques parallèles, coaxiales ou colinéaires est effectuée avec des distributions de champ électrique dans la chambre de pulsation comprises entre 0,1 kV/cm et 5 kV/cm, de préférence entre 1 kV/cm et 3 10 kV/cm. Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, l'électropulsation sur les cyanobactéries avec un jeu d'électrodes cylindriques parallèles, coaxiales ou colinéaires est effectuée avec des distributions de champ électrique dans la chambre de pulsation comprises entre 0,5 kV/cm et 10 kV/cm, de préférence entre 4 kV/cm et 7 kV/cm.
15 Lorsque des champs électriques de haute intensité sont appliqués, en général une seule impulsion est appliquée, mais une série d'impulsions consécutives peut être réalisée, chaque impulsion ayant une durée allant de 0,1 ms à 1s, et de préférence de 0,1 à 5 ms. Selon l'objet 1 de l'invention, le nombre d'impulsions reçues par chaque cellule à parois est de l'ordre de 1 à 1000, et de préférence de 1 à 50 impulsions avec inversion de polarité.
20 Selon l'objet 1 de l'invention, la fréquence d'impulsions est comprise entre 0,01 Hz et 5 kHz, de préférence entre 0,1 Hz et 1 kHz, que cela soit pour les microalgues, les macroalgues, les levures, les cyanobactéries ou les cellules végétales. Selon l'objet 1 de l'invention, les impulsions de champ électrique peuvent être, des impulsions carrées (mono ou bialternance), trapézoïdales (mono ou bialternance), triangulaires 25 (mono ou bialternance), sinusoïdales redressées ou non, ou à déclin exponentiel (mono ou bialternance). Les impulsions peuvent être unipolaires, bipolaires, symétriques, asymétriques. De préférence, ce sont les impulsions bipolaires carrées qui sont utilisées.
3025216 7 Selon l'objet 1 de l'invention, la solution aqueuse du milieu d'extraction a une température comprise entre 4 et 50°C, de préférence à température ambiante. Selon l'étape (ii) du procédé selon l'invention, après le traitement électrique, le milieu liquide comportant les cellules traitées est mis à incuber pour favoriser la sortie des lipides.
5 Selon l'objet 1 de l'invention, le milieu d'incubation comporte un tampon salin comprenant éventuellement du dithiothreitol, de préférence contenant 100 mM de NaCI et 1 mM de dithiothreitol, ou de l'eau. Selon l'objet 1 de l'invention, l'étape d'incubation a une durée comprise entre 30 min et 24h, notamment 12 heures.
10 Selon l'étape (iii) du procédé selon l'invention, à la fin de l'incubation, les lipides sont purifiés par tout moyen connu de séparation de lipides d'un milieu liquide, par exemple par chromatographie ou extraction au CO2 supercritique. Pour ce qui est du choix des milieux de culture, d'incubation et d'extraction, le spécialiste du traitement des levures, des cyanobactéries, des macroalgues, des microalgues et 15 des cellules végétales pourra ajuster la composition de ces milieux au type de cellules à parois. En ce qui concerne le matériel mis en oeuvre pour la réalisation du procédé, le flux du fluide à traiter entre dans la chambre d'impulsion qui est entourée de deux électrodes métalliques reliées à un générateur. Ensuite, le flux du fluide traité sort de la chambre d'impulsion. (Figure 10) 20 La détection de la sortie des lipides des cellules à parois peut être réalisée par le test au Nile red, méthode de référence pour effectuer un dosage des lipides dans un surnageant aqueux. Selon une forme de réalisation préférée de l'objet 1 de l'invention, les lipides détectés sont des triglycérides.
25 Les lipides peuvent être concentrés et purifiés par des méthodes connues.
3025216 8 L'invention a pour deuxième objet des lipides obtenus par le procédé conforme au premier objet de l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, le lipide extrait par le procédé conforme au premier objet de l'invention est un triglycéride.
5 L'invention a pour troisième objet une composition comportant au moins un lipide obtenu par le procédé conforme au premier objet de l'invention. LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Histogramme de taille de Nannochloropsis salina.
10 L'axe des ordonnées indique le nombre de cellules de microalgue. L'axe des abscisses indique la taille en diamètre des cellules de microalgue. La majorité des cellules de Nannochloropsis salina ont une taille de 3-4 gm. Figure 2: Graphe représentant l'intensité d'émission de fluorescence en fonction de la longueur d'émission en nm pour Nannochloropsis salina (incubation eau).
15 1EE signifie un électrotraitement ; 2EE signifie 2 traitements aux électropulsations successives. L'échantillon est dilué d'un facteur 5. Ctrl est le Nile red en solution aqueuse. Neg correspond à la simple incubation dans l'eau pendant la nuit. Il convient de noter que l'échantillon n'est dilué que d'un facteur 2.
20 H2O signifie que l'incubation post électropulsation a été réalisée dans l'eau. Le graphe montre une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm.
3025216 9 Figure 3: Graphe représentant l'intensité d'émission de fluorescence en fonction de la longueur d'émission en nm pour Nannochloropsis salina (incubation en tampon salin).
1EE signifie un électrotraitement ; 2EE signifie 2 traitements aux électropulsations successives. L'échantillon est dilué d'un facteur 5.
5 Ctrl est le Nile red en solution aqueuse. Neg correspond à la simple incubation dans le tampon salin pendant la nuit. PB/DTT signifie que l'incubation post électropulsation a été réalisée dans un tampon phosphate salin contenant du DTT. Le graphe montre une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm.
10 Figure 4 : Histogramme de taille de Chlorella vulgaris. L'axe des ordonnées indique le nombre de cellules de microalgue. L'axe des abscisses indique la taille en diamètre des cellules de microalgue. La majorité des cellules de Chlorella vulgaris ont une taille de 4-5 pm. Figure 5: Graphe représentant l'intensité d'émission de fluorescence en fonction de la 15 longueur d'émission en nm pour Chlorella vulgaris (incubation eau).
1EE signifie un électrotraitement. Neg correspond à la simple incubation dans l'eau pendant la nuit. Il convient de noter que l'échantillon n'est dilué que d'un facteur 2. H2O signifie que l'incubation post électropulsation a été réalisée dans l'eau.
20 Le graphe montre une augmentation du signal de fluorescence vers 650 nm.
3025216 10 Figure 6: Graphe représentant l'intensité d'émission de fluorescence en fonction de la longueur d'émission en nm pour Chlorella vulgaris (incubation tampon salin).
1EE signifie un électrotraitement. Neg correspond à la simple incubation dans le tampon salin pendant la nuit.
5 PB/DTT signifie que l'incubation post électropulsation a été réalisée dans un tampon phosphate salin contenant du DTT. Le graphe montre une augmentation du signal de fluorescence vers 650 nm. Figure 7 : Histogramme de taille de Dunaliella. L'axe des ordonnées indique le nombre de cellules de microalgue.
10 L'axe des abscisses indique la taille en diamètre des cellules de microalgue. La majorité des cellules de Dunaliella salina ont une taille de 2-3 pal. Figure 8: Graphe représentant l'intensité d'émission de fluorescence en fonction de la longueur d'émission en nm pour Dunaliella (incubation eau).
1EE signifie un électrotraitement.
15 Neg correspond à la simple incubation dans l'eau pendant la nuit. Il convient de noter que l'échantillon n'est dilué que d'un facteur 2. H2O signifie que l'incubation post électropulsation a été réalisée dans l'eau. Le graphe montre une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm. Figure 9: Graphe représentant l'intensité d'émission de fluorescence en fonction de la 20 longueur d'émission en nm pour Dunaliella (incubation tampon salin).
1EE signifie un électrotraitement. Neg correspond à la simple incubation dans le tampon salin pendant la nuit.
3025216 11 PB/DTT signifie que l'incubation post électropulsation a été réalisée dans un tampon phosphate salin contenant du DU. Le graphe montre une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm. Figure 10 : Schéma de la chambre d'extraction.
5 Deux électrodes métalliques, reliées à un générateur, entourent la chambre d'impulsion. Le flux du fluide à traiter entre dans la chambre, reçoit les impulsions et ressort. 1 : générateur 2 : flux entrant du fluide à traiter 3 : flux sortant du fluide à traiter 10 4 : chambre d'impulsions 5 : électrodes métalliques EXEMPLES A. Protocole avec incubation post électro traitement dans un milieu salin Exemple 1 : Electroextraction de lipide à partir de la microalgue Nannochloropsis salina.
15 Mesure de la taille des cellules Sous microscope, la taille des cellules à parois a été évaluée. (Figure 1) Culture 100 mL de la culture de Nannochloropsis salina ont été réalisés dans l'eau à une concentration cellulaire de 108 cellules/mL. Les souches ont été fournies par la société (Phytolutions GmbH).
20 L'échantillon a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C).
3025216 12 Lavage Le culot a été récupéré et repris dans 100 mL d'eau distillée. La conductivité de la suspension doit être de 100 ii.S/cm. Ce point doit être soigneusement contrôlé, en procédant le cas échéant à un second lavage à l'eau. Electroextraction L'électroextraction a été réalisée à l'aide d'un Deex bio® (Beta Tech, Saint Orens de Gameville, France) avec des cellules d'écoulement de 0,15 mL de volume de traitement et une distance inter-électrodes de 3 mm. Les paramètres électriques ont été de 1800 V et d'une durée de 2 ms en bipolaire à une fréquence de 66 10 ms pour une vitesse d'écoulement de 0,15 mL/s. Le nombre de trains d'impulsions bipolaires délivré sur chaque cellule a été de 15. Un contrôle en ligne des décharges électriques a été réalisé pour confirmer le bon déroulement du traitement. Incubation 15 Après le traitement électrique, la suspension cellulaire a été diluée 5 fois dans une solution saline (PB/DTT) (PB 105 mM, 0,3 M Glycerol, 1 mM DTT, pH=7). Les échantillons ont été incubés pendant la nuit à température ambiante. Récupération Les échantillons ont été centrifugés sous 2500 g pendant 5 min.
20 Le surnageant a été alors récupéré. Le dosage a été effectué sur les surnageants.
3025216 13 Contrôle négatif : Un échantillon de 5 mL d'une suspension dans l'eau de Nannochloropsis a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). Le culot a été repris dans une solution saline (PB 105 mM, 0,3 M Glycerol, 1 mM DTT, pH=7).
5 La suspension cellulaire a été incubée pendant la nuit à température ambiante. Elle a été centrifugée sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante. Le dosage a été effectué sur les surnageants. Evaluation des extraits lipidiques : Une détermination par spectrofluorescence a été réalisée en utilisant le marquage au Nile red 10 (Greenspan et al., 1984, 1985; Greenspan and Fowler, 1985; Fowler and Greenspan, 1985; Cooksey et al., 1987). Il est utilisé en routine pour la mesure du contenu en lipides des extraits de microalgues. En effet, à une concentration fixe de marqueur fluorescent, l'émission de fluorescence augmente linéairement lors de l'addition de lipides. Une solution stock de Nile red (9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one, C20H18N202) est 15 préparée à 1 mM en dissolvant 3,18 mg de Nile red dans 10 ml de DMSO, qui, sera conservée à -20°C à l'abri de la lumière. La concentration finale lors des essais sera de 1 p.M par dilutions successives dans le PBS. La fluorescence relative est la différence entre l'émission des surnageants des échantillons pulsés et celle des surnageants des contrôles.
20 La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 580 nm. Les mesures ont été réalisées sur un PTI Fluorescence Spectrophotometer à température ambiante. Les essais ont été réalisés sur les souches en utilisant 2 milieux d'incubation post CEP (eau et Phosphate Buffer avec DTT pour casser les ponts disulfures de la paroi à température ambiante). Une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm est détectée, cela prouve une sortie de 25 lipides à travers la paroi de la microalgue traitée par électropulsation. (Figure 3) 3025216 14 Exemple 2 : Electroextraction de lipide à partir de la microalgue Chlorella Vulgaris Mesure de la taille des cellules Les souches Chlorella vulgaris ont été achetées chez Teramer (T0051, Nimes, France). Elles ont été cultivées en phototropie sous agitation douce dans le milieu Teramer (KTS 001).
5 Le dénombrage cellulaire a été obtenu sur cellule de Malassez. Sous microscope, la taille des cellules à parois a été évaluée. (Figure 4) Culture 100 mL de la culture de Chlorella vulgaris ont été réalisés dans l'eau à une concentration cellulaire de 107 cellules /mL.
10 L'échantillon a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). Lavage Le culot a été récupéré et repris dans 100 mL d'eau distillée. La conductivité de la suspension doit être de 200 pS/cm. Ce point doit être soigneusement contrôlé, en procédant le cas échéant à un second lavage à l'eau.
15 Electroextraction L'électroextraction a été réalisée à l'aide d'un Deex bio® (Beta Tech, Saint Orens de Gameville, France) avec des cellules d'écoulement de 1 mL de volume de traitement et une distance interélectrodes de 6 mm. Les paramètres électriques ont été de 1800 V et d'une durée de 2 ms en bipolaire à une fréquence de 66 20 ms pour une vitesse d'écoulement de 1 mL/s. Le nombre de trains d'impulsions bipolaires délivré sur chaque cellule a été de 15. Un contrôle en ligne des décharges électriques a été réalisé pour confirmer le bon déroulement du traitement.
3025216 15 Incubation Après le traitement électrique, la suspension cellulaire a été diluée 5 fois dans une solution saline (PB/DTT) (PB 105 mM, 0,3 M Glycerol, 1 mM DTT, pH=7). Les échantillons ont été incubés pendant la nuit à température ambiante.
5 Récupération Les échantillons ont été centrifugés sous 2500 g pendant 5 min. Le surnageant a été récupéré. Le dosage a été effectué sur les surnageants. Contrôle négatif : 10 Un échantillon de 5 mL d'une suspension dans l'eau de Chlorella a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). Le culot a été repris dans une solution saline (PB 105 mM, 0,3 M Glycerol, 1 mM DTT, pH=7). La suspension cellulaire a été incubée pendant la nuit à température ambiante. Elle a été centrifugée sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante.
15 Le dosage a été effectué sur les surnageants. Evaluation des extraits lipidiques : Une détermination par spectrofluorescence a été réalisée en utilisant le marquage au Nile red (Greenspan et al., 1984, 1985; Greenspan and Fowler, 1985; Fowler and Greenspan, 1985; Cooksey et al., 1987). Il est utilisé en routine pour la mesure du contenu en lipides des extraits de microalgues. En 20 effet à une concentration fixe de marqueur fluorescent, l'émission de fluorescence augmente linéairement lors de l'addition de lipides. Une solution stock de Nile red (9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one, C20H18N202) est préparée à 1 mM en dissolvant 3,18 mg de Nile red dans 10 ml de DMSO, qui sera conservée à -20°C à l'abri de la lumière.
3025216 16 La concentration finale lors des essais sera de 11.1M par dilutions successives dans le PBS. La fluorescence relative est la différence entre l'émission des surnageants des échantillons pulsés et celle des surnageants des contrôles. La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 580 nm.
5 Les mesures ont été réalisées sur un PTI Fluorescence Spectrophotometer à température ambiante. Les essais ont été réalisés sur les souches en utilisant 2 milieux d'incubation post CEP (eau et Phosphate Buffer avec DTT pour casser les ponts disulfures de la paroi à température ambiante). Une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm est détectée, cela prouve une sortie de lipides à travers la paroi de la microalgue traitée par électropulsation. (Figure 6) 10 Exemple 3 : Electroextraction de lipide à partir de la microalgue Dunaliella salina Mesure de la taille des cellules La souche Dunaliella a été obtenue auprès de Teramer (T0057). Elle a été cultivée en phototropie sous agitation dans de l'eau salée (30g de sel au litre). Les instructions de Teramer ont été observées en particulier avec l'utilisation du kit starter (KTS 001).
15 Le dénombrage cellulaire a été obtenu sur cellule de Malassez. Sous microscope, la taille des cellules à parois a été évaluée. (Figure 7) Culture 100 mL de la culture de Dunaliella ont été réalisés dans l'eau à une concentration cellulaire de 108 cellules /mL.
20 L'échantillon a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). Lavage Le culot a été récupéré et repris dans 100 mL d'eau distillée.
3025216 17 La conductivité de la suspension doit être de 100 µS/cm. Ce point doit être soigneusement contrôlé, en procédant le cas échéant à un second lavage à l'eau. Electroextraction L'électroextraction a été réalisée à l'aide d'un Deex bio® (Beta Tech, Saint Orens de Gameville, France) 5 avec des cellules d'écoulement de 0,15 mL de volume de traitement et une distance interélectrodes de 3 mm. Les paramètres électriques ont été de 1800 V et d'une durée de 2 ms en bipolaire à une fréquence de 66 ms pour une vitesse d'écoulement de 0,15 mL/s. Le nombre de trains d'impulsions bipolaires délivré sur chaque cellule a été de 15.
10 Un contrôle en ligne des décharges électriques a été réalisé pour confirmer le bon déroulement du traitement. Incubation Après le traitement électrique, la suspension cellulaire a été diluée 5 fois dans une solution saline (PB/DTT) (PB 105 mM, 0.3 M Glycerol, 1 mM DTT, pH=7).
15 Les échantillons ont été incubés pendant la nuit à température ambiante. Récupération Les échantillons ont été centrifugés sous 2500 g pendant 5 min. Le surnageant a été récupéré. Le dosage a été effectué sur les surnageants.
20 Contrôle négatif : Un échantillon de 5 mL d'une suspension dans l'eau de Dunaliella a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). Le culot a été repris dans une solution saline (PB 105 mM, 0,3 M Glycerol, 1 mM DTT, pH=7).
3025216 18 La suspension cellulaire a été incubée pendant la nuit à température ambiante. Elle a été centrifugée sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante. Le dosage a été effectué sur les surnageants. Evaluation des extraits lipidiques : 5 Une détermination par spectrofluorescence a été réalisée en utilisant le marquage au Nile red (Greenspan et al., 1984, 1985; Greenspan and Fowler, 1985; Fowler and Greenspan, 1985; Cooksey et al., 1987). Il est utilisé en routine pour la mesure du contenu en lipides des extraits de microalgues. En effet à une concentration fixe de marqueur fluorescent, l'émission de fluorescence augmente linéairement lors de l'addition de lipides.
10 Une solution stock de Nile red (9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one, C20H18N202) est préparée à 1 mM en dissolvant 3,18 mg de Nile red dans 10 ml de DMSO, qui sera conservée à -20°C à l'abri de la lumière. La concentration finale lors des essais sera de 1 itM par dilutions successives dans le PBS. La fluorescence relative est la différence entre l'émission des surnageants des échantillons pulsés et 15 celle des surnageants des contrôles. La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 580 nm. Les mesures ont été réalisées sur un PTI Fluorescence Spectrophotometer à température ambiante. Les essais ont été réalisés sur les souches en utilisant 2 milieux d'incubation post CEP (eau et Phosphate Buffer avec DU pour casser les ponts disulfures de la paroi à température ambiante).
20 Une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm est détectée, cela prouve une sortie de lipides à travers la paroi de la microalgue traitée par électropulsation. (Figure 9) 3025216 19 B. Protocole avec incubation post électrotraitement dans l'eau Exemple 4 : Electroextraction de lipide à partir de la microalgue Chlorella Vulgaris Mesure de la taille des cellules Les souches Chlorella vulgaris ont été achetées chez Teramer (T0051, Nimes, France).
5 Elles ont été cultivées en phototropie sous agitation douce dans le milieu Teramer (KTS 001). Le dénombrage cellulaire a été obtenu sur cellule de Malassez. Sous microscope, la taille des cellules à parois a été évaluée. (Figure 4) Culture 100 mL de la culture de Chlorella vulgaris ont été réalisés dans l'eau à une concentration cellulaire de 10 107 cellules /mL. L'échantillon a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). Lavage Le culot a été récupéré et repris dans 100 mL d'eau distillée. La conductivité de la suspension doit être de 200 pS/cm.
15 Ce point doit être soigneusement contrôlé, en procédant le cas échéant à un second lavage à l'eau. Electroextraction L'électroextraction a été réalisé à l'aide d'un Deex bio® (Beta Tech, Saint Orens de Gameville, France) avec des cellules d'écoulement de 1 mL de volume de traitement et une distance interélectrodes de 6 MM.
20 Les paramètres électriques ont été de 1800 V et d'une durée de 2 ms en bipolaire à une fréquence de 66 ms pour une vitesse d'écoulement de 1 mL/s. Le nombre de trains d'impulsions bipolaires délivré sur chaque cellule a été de 15.
3025216 20 Un contrôle en ligne des décharges électriques a été réalisé pour confirmer le bon déroulement du traitement Incubation Après le traitement électrique, la suspension cellulaire a été diluée 5 fois dans de l'eau pure.
5 Les échantillons ont été incubés pendant la nuit à température ambiante. Récupération Les échantillons ont été centrifugés sous 2500g pendant 5 min. Le surnageant a été alors récupéré. Le dosage a été effectué sur les surnageants.
10 Contrôle négatif : Un échantillon de 5 mL d'une suspension dans l'eau de Chlorella a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). La suspension cellulaire a été diluée 5 fois dans de l'eau pure. La suspension cellulaire a été incubée pendant la nuit à température ambiante.
15 Elle a été centrifugée sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante. Le dosage a été effectué sur les surnageants. Evaluation des extraits lipidiques : Une détermination par spectrofluorescence a été réalisée en utilisant le marquage au Nile red (Greenspan et al., 1984, 1985; Greenspan and Fowler, 1985; Fowler and Greenspan, 1985; Cooksey et 20 al., 1987). Il est utilisé en routine pour la mesure du contenu en lipides des extraits de microalgues. En effet à une concentration fixe de marqueur fluorescent, l'émission de fluorescence augmente linéairement lors de l'addition de lipides.
3025216 21 Une solution stock de Nile red (9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one, C20H18N202) est préparée à 1 mM en dissolvant 3,18 mg de Nile red dans 10 ml de DMSO, qui sera conservée à -20°C à l'abri de la lumière. La concentration finale lors des essais sera de 1 p.M par dilutions successives dans le PBS.
5 La fluorescence relative est la différence entre l'émission des surnageants des échantillons pulsés et celle des surnageants des contrôles. La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 580 nm. Les mesures ont été réalisées sur un PTI Fluorescence Spectrophotometer à température ambiante. Les essais ont été réalisés sur les souches en utilisant 2 milieux d'incubation post CEP (eau et Phosphate 10 Buffer avec DTT pour casser les ponts disulfures de la paroi à température ambiante). Une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm est détectée, cela prouve une sortie de lipides à travers la paroi de la microalgue traitée par électropulsation. (Figure 5) Exemple 5 : Electroextraction de lipide à partir de la microalgue Dunaliella Mesure de la taille des cellules 15 Les souches Dunaliella ont été obtenues auprès de Teramer (T0057). Elles ont été cultivées en phototropie dans de l'eau salée (30g de sel au litre). Les instructions de Teramer ont été observées en particulier avec l'utilisation du kit starter (KTS 001). Le dénombrage cellulaire a été obtenu sur cellule de Malassez. Sous microscope, la taille des cellules à parois a été évaluée. (Figure 7) 20 Culture 100 mL de la culture de Dunaliella ont été réalisés dans l'eau à une concentration cellulaire de 108 cellules /mL. L'échantillon a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C).
3025216 22 Lavage Le culot a été récupéré et repris dans 100 mL d'eau distillée. La conductivité de la suspension doit être de 100 µS/cm. Ce point doit être soigneusement contrôlé, en procédant le cas échéant à un second lavage à l'eau.
5 Electroextraction L'électroextraction a été réalisé à l'aide d'un Deex bio® (Beta Tech, Saint Orens de Gameville, France) avec des cellules d'écoulement de 0.15 mL de volume de traitement et une distance interélectrodes de 3 mm. Les paramètres électriques ont été de 1800 V et d'une durée de 2 ms en bipolaire à une fréquence de 66 10 ms pour une vitesse d'écoulement de 0,15 mL/s. Le nombre de trains d'impulsions bipolaires délivré sur chaque cellule a été de 15. Un contrôle en ligne des décharges électriques a été réalisé pour confirmer le bon déroulement du traitement. Incubation 15 Après le traitement électrique, la suspension cellulaire est diluée 5 fois dans de l'eau pure. Les échantillons sont incubés pendant la nuit à température ambiante. Récupération Les échantillons sont centrifugés sous 2500 g pendant 5 min. Le surnageant a été récupéré.
20 Le dosage a été effectué sur les surnageants. Contrôle négatif : Un échantillon de 5 mL d'une suspension dans l'eau de Dunaliella est centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C).
3025216 23 La suspension cellulaire a été diluée 5 fois dans de l'eau pure. La suspension cellulaire est incubée pendant la nuit à température ambiante. Elle est alors centrifugée sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante. Le dosage est effectué sur les surnageants.
5 Evaluation des extraits lipidiques : Une détermination par spectrofluorescence a été réalisée en utilisant le marquage au Nile red (Greenspan et al., 1984, 1985; Greenspan and Fowler, 1985; Fowler and Greenspan, 1985; Cooksey et al., 1987). Il est utilisé en routine pour la mesure du contenu en lipides des extraits de microalgues. En effet à une concentration fixe de marqueur fluorescent, l'émission de fluorescence augmente 10 linéairement lors de l'addition de lipides. Une solution stock de Nile red (9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one, C20H18N202) est préparée à 1 mM en dissolvant 3,18 mg de Nile red dans 10 ml de DMSO, qui sera conservée à -20°C à l'abri de la lumière. La concentration finale lors des essais sera de 111M par dilutions successives dans le PBS.
15 La fluorescence relative est la différence entre l'émission des surnageants des échantillons pulsés et celle des surnageants des contrôles. La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 580 nm. Les mesures ont été réalisées sur un PTI Fluorescence Spectrophotometer à température ambiante. Les essais ont été réalisés sur les souches en utilisant 2 milieux d'incubation post CEP (eau et Phosphate 20 Buffer avec DTT pour casser les ponts disulfures de la paroi à température ambiante). Une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm est détectée, cela prouve une sortie de lipides à travers la paroi de la microalgue traitée par électropulsation. (Figure 8) 3025216 24 Exemple 6 Electroextraction de lipide à partir de la microalgue Nannochloropsis salina Mesure de la taille des cellules Sous microscope, la taille des cellules à parois a été évaluée. (Figure 1) Culture 5 100 mL de la culture de Nannochloropsis salina ont été réalisés dans l'eau à une concentration cellulaire de 108 cellules/mL. Les souches ont été fournies par la société Phytolutions GmbH. L'échantillon a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). Lavage Le culot a été récupéré et repris dans 100 mL d'eau distillée.
10 La conductivité de la suspension doit être de 100 iiS/cm. Ce point doit être soigneusement contrôlé, en procédant le cas échéant à un second lavage à l'eau. Electroextraction L'électroextraction a été réalisée à l'aide d'un Deex bio® (Beta Tech, Saint Orens de Gameville, France) avec des cellules d'écoulement de 0,15 mL de volume de traitement et une distance inter-électrodes de 15 3 mm. Les paramètres électriques ont été de 1800 V et d'une durée de 2 ms en bipolaire à une fréquence de 66 ms pour une vitesse d'écoulement de 0,15 mL/s. Le nombre de trains d'impulsions bipolaires délivré sur chaque cellule a été de 15. Un contrôle en ligne des décharges électriques a été réalisé pour confirmer le bon déroulement du 20 traitement. Incubation Après le traitement électrique, la suspension cellulaire a été diluée 5 fois dans de l'eau pure. Les échantillons ont été incubés pendant la nuit à température ambiante.
3025216 25 Récupération Les échantillons ont été centrifugés sous 2500 g pendant 5 min. Le surnageant a été alors récupéré. Le dosage a été effectué sur les surnageants.
5 Contrôle négatif : Un échantillon de 5 mL d'une suspension dans l'eau de Nannochloropsis a été centrifugé sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante (environ 22°C). La suspension cellulaire a été diluée 5 fois dans de l'eau pure. La suspension cellulaire a été incubée pendant la nuit à température ambiante.
10 Elle a été centrifugée sous 2500 g pendant 5 min à température ambiante. Le dosage a été effectué sur les surnageants. Evaluation des extraits lipidiques : Une détermination par spectrofluorescence a été réalisée en utilisant le marquage au Nile red (Greenspan et al., 1984, 1985; Greenspan and Fowler, 1985; Fowler and Greenspan, 1985; Cooksey et 15 al., 1987). Il est utilisé en routine pour la mesure du contenu en lipides des extraits de microalgues. En effet à une concentration fixe de marqueur fluorescent, l'émission de fluorescence augmente linéairement lors de l'addition de lipides. Une solution stock de Nile red (9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one, C20H18N202) est préparée à 1 mM en dissolvant 3,18 mg de Nile red dans 10 ml de DMSO, qui sera conservée à -20°C à 20 l'abri de la lumière. La concentration finale lors des essais sera de 11.1M par dilutions successives dans le PBS. La fluorescence relative est la différence entre l'émission des surnageants des échantillons pulsés et celle des surnageants des contrôles. La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 580 nm.
3025216 26 Les mesures ont été réalisées sur un PTI Fluorescence Spectrophotometer à température ambiante. Les essais ont été réalisés sur les souches en utilisant 2 milieux d'incubation post CEP (eau et Phosphate Buffer avec DTT pour casser les ponts disulfures de la paroi à température ambiante). Une augmentation du signal de fluorescence vers 640-650 nm est détectée, cela prouve une sortie de 5 lipides à travers la paroi de la microalgue traitée par électropulsation. (Figure 2). 10 15 20
Claims (24)
- REVENDICATIONS1. Procédé d'électroextraction de lipides à partir de cellules à parois dans un flux de milieu liquide caractérisé en ce qu'il comprend successivement (i) une étape d'électropulsation, (ii) une étape d'incubation et (iii) une étape de récupération des lipides.
- 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la concentration de cellules à parois soumise à électroextraction est comprise entre 0,1 à 50% WV, de préférence de 0,5 à 20% V/V.
- 3. Procédé selon les revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une partie de la population cellulaire peut être réutilisée.
- 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'incubation a d'une durée comprise entre 30 min et 24h, notamment 12 heures.
- 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ou les cellules à parois sont en suspension dans le milieu liquide soumis à l'électropulsation.
- 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu d'extraction de l'electropulsation est une solution aqueuse dont la température est comprise entre 4 et 50°C, de préférence à température ambiante.
- 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'écoulement soit linéaire ou turbulent, de préférence turbulent.
- 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les cellules à parois sont choisies parmi les cyanobactéries, les microalgues, les macroalgues, les levures, les cellules végétales ou un mélange de celles-ci, de préférence parmi les microalgues.
- 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que la cyanobactérie est choisie parmi les espèces Spirulina, Arthrospira, Anabaema, Nostoc, Microcystis, de préférence Spirulina. 3025216 28
- 10. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les microalgues sont choisies parmi les espèces Botryococcus braunii, Chlorella vulgaris, Chlorella protothecoides, Cyclotella Dl 35, Porphyridium cruentum, Dunaliella tertiolecta, Hantzchia Dl 160, Isochrysis sp, 5 Nannochloris, Nannochloropsis sp, Neochloris oleabundans, Nitzschia sp, Phaeodactylum tricornutum, Pleurochrysis carterae, Dunaliella sp, Scenedesmus TR-84, Scenedesmus obliquus, Scenedesmus quadricauda, Stichococcus, Tetraselmis suecica, Thalassiosira pseudonana, chlorococcum Sp, Haematococcus pluvialis, Nostoc Sp, Tolypothris sp, Chlamydomonas reinhardtii, Ankistrodesmus falcatus, de préférence parmi Botryococcus braunii, Chlorella 10 vulgaris, Dunaliella sp, Haematococcus pluvialis, Nannochloropsis sp, Nitzschia sp, Porphyridium cruentum, Scenedesmus obliquus, Scenedesmus quadricauda.
- 11. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les macroalgues sont choisies parmi les Euglenophytes, les Chrysophytes, les Phaeophytes, les Rhodophytes, les 15 Pyrrophytes, de préférence Euglenophytes, Rhodophytes et Phaeophytes.
- 12. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les levures sont choisies parmi les espèces Ascomycetes, de préférence Saccharomyces, Kluyveromyces, 20 Pichia, Hansenula, Rhodosporidium toruloides, Trichosporon fermentons, Cryptococcus albidus , Yarrowia lipolytica et Lipomyces starkeyi.
- 13. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les cellules végétales sont choisies parmi le soja, palme, maïs, canne à sucre, betterave, colza, arachide, noix, noisette, 25 amande, de préférence palme et soja.
- 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les électrodes utilisées pour l'électropulsation sont choisies parmi les électrodes planes et 30 parallèles, cylindriques parallèles, coaxiales ou colinéaires, de préférence planes et parallèles. 3025216 29
- 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'électropulsation avec un jeu d'électrodes planes et parallèles, est effectuée avec des distributions de champ électrique dans la chambre de pulsation comprises entre 0,05 kV/cm et 50 kV/cm, de préférence entre 0,1 kV/cm et 7kV/cm, notamment entre 3 kV/cm et 6 kV/cm.
- 16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la durée de l'impulsion est comprise entre 0,1 ms et 1s, de préférence entre 0,1 à 5 ms.
- 17. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la 10 fréquence des impulsions est comprise entre 0,01 Hz et 5KHz, de préférence entre 0,1 Hz et 1 kHz.
- 18. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre d'impulsions reçues par chaque cellule à parois est compris entre 1 et 1000, de 15 préférence entre 1 et 50.
- 19. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu d'incubation comporte un tampon salin comprenant du dithiothreitol ou de l'eau. 20
- 20. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu d'extraction consiste en une solution aqueuse dont l'osmolarité est comprise entre 1 mOsm et 1000 mOsm.
- 21. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le profil 25 des impulsions de champ électrique est carré (mono ou bialternance), trapézoïdal (mono ou bialternance), triangulaire (mono ou bialternance), sinusoïdal redressé ou non, ou à déclin exponentiel, unipolaire, bipolaire, symétrique, asymétrique, de préférence bipolaire carré.
- 22. Lipides obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21. 30
- 23. Lipides selon la revendication 22 caractérisé en ce que le lipide est un triglycéride. 3025216 30
- 24. Compositions comportant au moins un lipide obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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Year of fee payment: 2 |
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| PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20160304 |
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| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 3 |
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| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20180531 |