FR3022461A1

FR3022461A1 - THERAPEUTIC METHODS AND COMPOSITIONS

Info

Publication number: FR3022461A1
Application number: FR1455816A
Authority: FR
Inventors: Eric Belot
Original assignee: NEUROPTIS BIOTECH
Current assignee: NEUROPTIS BIOTECH
Priority date: 2014-06-23
Filing date: 2014-06-23
Publication date: 2015-12-25
Anticipated expiration: 2034-06-23
Also published as: FR3022461B1

Abstract

La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies inflammatoires, allergiques et/ou oculaires, en particulier des pathologies oculaires de surface, chez les mammifères, notamment chez l'homme ou l'animal.The present application relates to compositions and methods for the treatment of inflammatory, allergic and / or ocular pathologies, in particular surface ocular pathologies, in mammals, in particular in humans or animals.

Description

1 METHODES THERAPEUTIQUES ET COMPOSITIONS Domaine de l'invention La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies inflammatoires, allergiques et/ou oculaires, en particulier des pathologies oculaires de surface, chez les mammifères, notamment chez l'homme ou l'animal. Arrière plan technologique Les cellules immunitaires comme les polynucléaires neutrophiles et les leucocytes présentent à leur surface des récepteurs à la molécule ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) ou CD54. La molécule ICAM-1 est une protéine transmembranaire d'adhésion, permettant aux cellules immunitaires la migration vers les sites d'infections et participe au phénomène de présentation de l'antigène (Lebedva T et al, Curr. Opin. Immunol, 2005:17;251-258). La protéine ICAM-1 participe donc au phénomène inflammatoire et sa sécrétion est induite par des protéines pro-inflammatoires comme le TNFa ou l'ILl, elles mêmes sécrétées par les cellules immunitaires (Hubbard A.K et al, Free. Radic. Biol. Med, 2000:28;1379-1386). Ainsi, lors d'une inflammation prolongée, on assiste au phénomène d'amplification suivant : - expression de ICAM-1 - migration de cellules immunitaires sur le site d'infection - sécrétion de cytokines pro-inflammatoires - induction de la production d'ICAM-1, etc... Pour limiter l'inflammation, deux stratégies thérapeutiques peuvent être envisagées. La première consiste en l'inhibition de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires par les cellules du système immunitaire, la seconde consistant à stopper la migration de ces dernières. Dans l'optique de la mise en oeuvre de cette seconde stratégie, les inventeurs ont pu mettre en évidence le rôle anti-inflammatoire du peptide 18 (ou P18). P18 est un peptide de séquence Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH2 identifiée comme un inhibiteur de la kinase de la chaîne légère de la myosine (ou MLCK pour Myosin Light Chain Kinase) (Lukas T.J et al, J.Med.Chem, 1999:142;910-919).FIELD OF THE INVENTION The present application relates to compositions and methods for the treatment of inflammatory, allergic and / or ocular pathologies, in particular surface ocular pathologies, in mammals, in particular in humans or humans. 'animal. BACKGROUND ART Immune cells such as neutrophils and leukocytes have on their surface receptors on the molecule ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) or CD54. The ICAM-1 molecule is a transmembrane adhesion protein, allowing immune cells to migrate to infection sites and participate in the phenomenon of antigen presentation (Lebedva T et al, Immunol Opin, 2005: 17). ; 251-258). The ICAM-1 protein thus participates in the inflammatory phenomenon and its secretion is induced by pro-inflammatory proteins such as TNFα or IL1, themselves secreted by the immune cells (Hubbard AK et al, Free Radic Biol Med, 2000: 28; 1379-1386). Thus, during prolonged inflammation, there is the following amplification phenomenon: - expression of ICAM-1 - migration of immune cells at the site of infection - secretion of pro-inflammatory cytokines - induction of ICAM production -1, etc ... To limit inflammation, two therapeutic strategies can be considered. The first consists in the inhibition of the secretion of proinflammatory cytokines by the cells of the immune system, the second consisting in stopping the migration of the latter. In view of the implementation of this second strategy, the inventors have been able to highlight the anti-inflammatory role of peptide 18 (or P18). P18 is an Arg-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH2 sequence peptide identified as a myosin light chain kinase inhibitor (or MLCK for Myosin Light Chain Kinase) (Lukas). TJ et al., J.Med.Chem, 1999: 142; 910-919).

3022461 2 La phosphorylation des chaines légères de myosines via l'inhibition de l'activité des MLCKs ou bien leur phosphorylation est un élément régulateur de l'activité d'adhésion des intégrines des polynucléaires neutrophiles et des leucocytes en général (Chilcoat et al, J. Leukoc. Biol. 2008:83;964-971). Cependant, la capacité d'inhibiteurs de MLCK, et en particulier du peptide 5 P18, à inhiber l'expression de marqueurs de l'inflammation, et plus particulièrement d'ICAM- 1, notamment au niveau de l'épithélium oculaire, n'a jamais été rapportée dans la littérature. Résumé de l'invention 10 Un premier aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un composé inhibiteur de MLCK et inhibiteur de l'expression de marqueurs de l'inflammation, en tant que modulateur de l'inflammation. Un second aspect de l'invention concerne un composé inhibiteur de MLCK et inhibiteur de 15 l'expression de marqueurs de l'inflammation, pour une utilisation dans une méthode de traitement d'un trouble inflammatoire ou allergique. Un troisième aspect concerne un composé inhibiteur de MLCK et inhibiteur de l'expression de marqueurs de l'inflammation, pour une utilisation dans une méthode de traitement d'une 20 pathologie oculaire, en particulier d'une pathologie oculaire de surface. Un quatrième aspect concerne une composition pharmaceutique comprenant un composé inhibiteur de MLCK et inhibiteur de l'expression de marqueurs de l'inflammation, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.The phosphorylation of myosin light chains via the inhibition of the activity of MLCKs or their phosphorylation is a regulatory element of the adhesion activity of integrins of neutrophils and leukocytes in general (Chilcoat et al., J. Leukoc Biol., 2008: 83, 964-971). However, the ability of inhibitors of MLCK, and in particular of P18 peptide, to inhibit the expression of markers of inflammation, and more particularly of ICAM-1, in particular at the level of the ocular epithelium, has never been reported in the literature. SUMMARY OF THE INVENTION A first aspect of the invention relates to the use of an MLCK inhibitory compound and inhibitor of expression of inflammation markers as a modulator of inflammation. A second aspect of the invention relates to an MLCK inhibitor compound and an inflammation marker expression inhibitor for use in a method of treating an inflammatory or allergic disorder. A third aspect relates to an MLCK inhibitor compound and inhibitor of inflammation marker expression for use in a method of treating ocular pathology, particularly surface ocular pathology. A fourth aspect relates to a pharmaceutical composition comprising an MLCK inhibitor compound and an inhibitor of expression of inflammation markers in a pharmaceutically acceptable excipient.

25 Selon des modes particuliers de réalisation de ces différents aspects de l'invention, le composé est un inhibiteur peptide de MLCK, en particulier le peptide comprenant la séquence d'acides aminés Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys (SEQ ID NO:1), ou un dérivé fonctionnel de celui-ci. Selon un mode particulièrement préféré, le peptide est le peptide P18 de séquence 30 SEQ ID NO:1.According to particular embodiments of these various aspects of the invention, the compound is an MLCK peptide inhibitor, in particular the peptide comprising the amino acid sequence Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg- Arg-Lys (SEQ ID NO: 1), or a functional derivative thereof. According to a particularly preferred mode, the peptide is the peptide P18 of sequence SEQ ID NO: 1.

3022461 3 Description détaillée de l'invention L'invention repose sur la mise en évidence d'une double action inhibitrice du peptide P18. En effet, il est montré dans la présente que ce peptide, reconnu pour son activité inhibitrice de 5 MLCK, a également une activité inhibitrice sur la production de marqueurs de l'inflammation, notamment de RNASE7, SLPI, TLR5, et plus particulièrement d'ICAM-1. Ces propriétés remarquables sont identifiées pour la première fois par les présents inventeurs. En conséquence, l'invention concerne l'utilisation d'un composé inhibiteur de MLCK et 10 inhibiteur de l'expression de marqueurs de l'inflammation, en tant que modulateur, plus particulièrement inhibiteur, de l'inflammation. De tels composés peuvent être identifiés facilement sur la base de l'enseignement fourni par la présente demande.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The invention is based on the demonstration of a double inhibitory action of the P18 peptide. Indeed, it is shown herein that this peptide, recognized for its MLCK inhibitory activity, also has an inhibitory activity on the production of inflammation markers, in particular of RNase7, SLPI, TLR5, and more particularly of ICAM-1. These remarkable properties are identified for the first time by the present inventors. Accordingly, the invention relates to the use of an MLCK inhibitory compound and an inhibitor of expression of inflammation markers as a modulator, more particularly an inhibitor, of inflammation. Such compounds can be easily identified on the basis of the teaching provided by this application.

15 MLCK est une kinase qui phosphoryle la chaîne légère de la myosine. Plusieurs méthodes sont connues de l'homme du métier pour déterminer l'activité de MLCK. Ce dernier peut notamment utiliser le substrat naturel de cette enzyme, la chaîne légère de la myosine, et déterminer l'incorporation d'ATP radioactif dans ce substrat par la MLCK en présence ou 20 absence d'un composé test, dans un essai in vitro. Une incorporation de radioactivité plus faible en présence du composé test signifie que ce composé est un inhibiteur de MLCK. A titre illustratif, l'homme du métier pourra se référer au protocole décrit dans Hathaway et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 22(4): 458-460 ou Lukas et al., cité ci-avant.MLCK is a kinase that phosphorylates the myosin light chain. Several methods are known to those skilled in the art for determining MLCK activity. The latter can in particular use the natural substrate of this enzyme, the light chain of myosin, and determine the incorporation of radioactive ATP into this substrate by MLCK in the presence or absence of a test compound, in an in vitro test. . A lower radioactivity incorporation in the presence of the test compound means that this compound is an inhibitor of MLCK. By way of illustration, one skilled in the art can refer to the protocol described in Hathaway et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 22 (4): 458-460 or Lukas et al., Cited above.

25 Par ailleurs, différents marqueurs de l'inflammation peuvent être suivis pour déterminer si le composé testé est capable d'en diminuer l'expression. L'expression des marqueurs RNASE7, SLPI, TLR5, ou plus particulièrement ICAM-1, pourra notamment être suivie selon toute méthode appropriée de l'homme du métier. Il pourra notamment être fait emploi de méthodes de suivi de l'expression protéique de ces marqueurs, notamment par western blot ou 30 cytométrie en flux, en utilisant des anticorps appropriés. Alternativement, il sera possible de suivre l'expression des ARN messagers codant ces protéines, notamment par Northern blot ou RT-PCR, de préférence une RT-PCR quantitative (notamment en temps réel). Les cellules dans lesquelles ce suivi sera réalisé peuvent être des cellules du système immunitaire, notamment des leucocytes, macrophages ou neutrophiles, mais également d'autres cellules 3022461 4 exprimant des marqueurs de l'inflammation, comme par exemple des cellules épithéliales. A ce titre, on peut citer les cellules HCE-2 utilisées dans les exemples ci-dessous. Elles correspondent à une lignée de cellules épithéliales de la cornée humaines sensibles à des cytokines pro-inflammatoires telles que l'ILl, le TNFa et l'IFN-y.In addition, different markers of inflammation can be monitored to determine whether the test compound is capable of decreasing expression. The expression of the markers RNASE7, SLPI, TLR5, or more particularly ICAM-1, may in particular be followed by any method appropriate to those skilled in the art. In particular, it will be possible to use methods for monitoring the protein expression of these markers, in particular by Western blotting or flow cytometry, by using appropriate antibodies. Alternatively, it will be possible to follow the expression of messenger RNAs encoding these proteins, in particular by Northern blot or RT-PCR, preferably quantitative RT-PCR (especially in real time). The cells in which this monitoring will be performed may be cells of the immune system, in particular leucocytes, macrophages or neutrophils, but also other cells 3022461 4 expressing markers of inflammation, such as epithelial cells. In this respect, mention may be made of the HCE-2 cells used in the examples below. They correspond to a line of human corneal epithelial cells sensitive to pro-inflammatory cytokines such as IL1, TNFa and IFN-γ.

5 Selon un mode particulièrement préféré de réalisation, le marqueur de l'inflammation est ICAM-1. A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement un composé inhibiteur de MLCK et inhibiteur de l'expression d'ICAM-1, en tant que modulateur de l'inflammation ou d'une allergie, et en particulier en tant qu'inhibiteur d'une inflammation ou allergie.According to a particularly preferred embodiment, the marker of inflammation is ICAM-1. As such, the invention relates more particularly to an MLCK inhibitory compound and inhibitor of the expression of ICAM-1, as a modulator of inflammation or allergy, and in particular as an inhibitor of an inflammation or allergy.

10 L'invention concerne par ailleurs un tel composé inhibiteur de MLCK et inhibiteur de l'expression de marqueurs de l'inflammation, en particulier d'ICAM-1, pour une utilisation dans une méthode de traitement d'un trouble inflammatoire. A titre illustratif, l'expression "trouble inflammatoire" couvre notamment l'asthme, l'arthrite, certains types de cancer (notamment les tumeurs mammaires et mélanomes), et toute autre pathologie inflammatoire 15 impliquant ICAM-1. Selon un mode particulier de réalisation, le trouble inflammatoire traité est un trouble inflammatoire oculaire. Parmi les troubles inflammatoires oculaires, on peut notamment citer la conjonctivite, la kératite, les sclérites et épisclérites, les uvéites antérieures, les uvéites 20 intermédiaires, les uvéites postérieures, les vascularites rétiniennes, la nécrose rétinienne aiguë, les panuvéites, la maladie de Behçet, la sarcoïdose oculaire et les uvéo-méningites. L'invention concerne en outre un composé inhibiteur de MLCK et inhibiteur de l'expression de marqueurs de l'inflammation, en particulier d'ICAM-1, pour une utilisation dans une 25 méthode de traitement d'une pathologie oculaire, en particulier d'une pathologie oculaire de surface. Un inhibiteur de MLCK peut permettre de réguler la perméabilité paracellulaire de l'épithélium oculaire, notamment l'épithélium de surface, comme décrit dans la demande PCT/FRO5/03095, alors que l'action sur les marqueurs de l'inflammation permet la modulation de la réponse inflammatoire, correspondant au segment antérieur et/ou postérieur 30 de l'oeil. L'invention est donc utilisable pour le traitement des affections oculaires telles que les affections provoquées par une allergie (conjonctivite allergique par exemple) ou une 3022461 5 inflammation au niveau de l'oeil, les conjonctivites infectieuses, les kératites variées et la maladie de l'oeil sec. Les utilisations selon l'invention, mentionnées précédemment, sont particulièrement efficaces 5 dans le traitement d'une affection oculaire choisie parmi une kératite, une conjonctivite, le syndrome de l'oeil sec et plus particulièrement toute autre altération de la perméabilité paracellulaire de l'épithélium oculaire pouvant entrainer une réponse inflammatoire. Des exemples de situations susceptibles de provoquer une telle altération sont par exemple le port par un patient de lentilles de contact ou encore les phases de cicatrisation chez un sujet 10 souffrant d'une atteinte traumatique ou chirurgicale de l'épithélium oculaire. En particulier, la présente invention est particulièrement adaptée au traitement d'une sensibilisation à un allergène. L'allergie du segment antérieur de l'oeil est une pathologie oculaire fréquente qui concerne 20% des populations nord américaine et européenne. Le 15 nombre de patients affectés par ce type d'allergie est sans cesse en évolution en raison des facteurs environnementaux et/ou de l'augmentation de la durée de vie. Au niveau de la cornée de l'oeil, cette allergie est à l'origine de kératites allergiques. Au niveau de la conjonctive, l'allergie est responsable de conjonctivites qui se traduisent par un oeil rouge.The invention further relates to such an MLCK inhibitory compound and inhibitor of expression of inflammation markers, particularly ICAM-1, for use in a method of treating an inflammatory disorder. By way of illustration, the term "inflammatory disorder" covers, in particular, asthma, arthritis, certain types of cancer (in particular mammary tumors and melanomas), and any other inflammatory pathology involving ICAM-1. According to a particular embodiment, the inflammatory disorder treated is an ocular inflammatory disorder. The ocular inflammatory disorders include conjunctivitis, keratitis, scleritis and episcleritis, anterior uveitis, intermediate uveitis, posterior uveitis, retinal vasculitis, acute retinal necrosis, panuveitis, Behçet's disease. ocular sarcoidosis and uveo-meningitis. The invention further relates to an MLCK inhibitor compound and inhibitor of expression of inflammation markers, particularly ICAM-1, for use in a method of treating an ocular pathology, particularly a surface ocular pathology. An inhibitor of MLCK may be able to regulate the paracellular permeability of the ocular epithelium, especially the surface epithelium, as described in application PCT / FRO5 / 03095, while the action on the markers of inflammation allows the modulation the inflammatory response, corresponding to the anterior and / or posterior segment of the eye. The invention is therefore useful for the treatment of ocular conditions such as conditions caused by an allergy (allergic conjunctivitis, for example) or an inflammation in the eye, infectious conjunctivitis, various keratitis and the disease of the eye. dry eye. The uses according to the invention, mentioned above, are particularly effective in the treatment of an eye condition chosen from keratitis, conjunctivitis, dry eye syndrome and more particularly any other alteration of the paracellular permeability of the eye. Ocular epithelium may cause an inflammatory response. Examples of situations likely to cause such an alteration are, for example, the wearing by a patient of contact lenses or the healing phases in a subject suffering from traumatic or surgical injury to the ocular epithelium. In particular, the present invention is particularly suitable for the treatment of sensitization to an allergen. Allergy in the anterior segment of the eye is a common eye disease affecting 20% of North American and European populations. The number of patients affected by this type of allergy is constantly changing due to environmental factors and / or increased life span. In the cornea of the eye, this allergy is at the origin of allergic keratitis. In the conjunctiva, the allergy is responsible for conjunctivitis that result in a red eye.

20 Les conjonctivites allergiques sont de plusieurs types : on observe les conjonctivites saisonnières, les conjonctivites des habitations, les conjonctivites provoquées par le port de lentilles de contact (giganta-papillaire) telles que mentionnées précédemment, les conjonctivites atopiques et les conjonctivites ayant pour origine l'utilisation de cosmétiques.There are several types of allergic conjunctivitis: seasonal conjunctivitis, conjunctivitis of habitations, conjunctivitis caused by contact lenses (giganta-papillary) as mentioned above, atopic conjunctivitis and conjunctivitis originating from use of cosmetics.

25 L'inflammation provoquée par les radicaux libres, souvent libérés sous l'influence de facteurs environnementaux (pollution, air conditionné, agents chimiques, etc.), atteint la cornée et la conjonctive. C'est le cas dans la conjonctivite vernale, forme très répandue chez les enfants et les jeunes adultes. Il existe aussi une kératoconjonctivite atopique qui survient chez des patients plus âgés qui souffrent d'éruptions cutanées. Cette forme de conjonctivite non 30 saisonnière peut occasionner des lésions graves de la cornée et de la conjonctive si elle n'est pas traitée. La présente invention peut être utilisée pour le traitement ou la prise en charge de toutes les pathologies oculaires engendrées par les microorganismes, telles que les conjonctivites 3022461 6 bactériennes (les kératites sont des complications fréquemment induites par ce type de conjonctivite) et les conjonctivites virales (adenovirus), très souvent bilatérales (associées également le plus souvent à une kératite), avec photophobie intense, douleurs et rougeurs.Inflammation caused by free radicals, often released under the influence of environmental factors (pollution, air conditioning, chemical agents, etc.), reaches the cornea and the conjunctiva. This is the case in vernal conjunctivitis, a common form in children and young adults. There is also atopic keratoconjunctivitis that occurs in older patients who have rash. This form of non-seasonal conjunctivitis can cause serious lesions of the cornea and conjunctiva if left untreated. The present invention can be used for the treatment or management of all ocular pathologies caused by microorganisms, such as bacterial conjunctivitis (keratites are complications frequently induced by this type of conjunctivitis) and viral conjunctivitis ( adenovirus), very often bilateral (most often associated with keratitis), with intense photophobia, pain and redness.

5 La présente invention peut également être utilisée pour le traitement ou la prise en charge des sécheresses oculaires avec forte composante immuno-inflammatoire. Plus de 10 millions de personnes aux USA (représentant 15 % de la population âgée de plus de 65 ans) souffrent de cette agression de la surface oculaire. Dans cette pathologie, il faut distinguer deux types de syndromes : 10 - les syndromes secs simples sont engendrés par les facteurs environnementaux (pollution, radiations, air conditionné, port de lentilles, écrans d'ordinateurs, etc.), aggravés par l'âge, la ménopause et certains traitements. - les formes les plus graves sont souvent associées à des facteurs génétiques comme le syndrome de Gougerot-Sj45gren. Elles aboutissent à une maladie chronique, très 15 invalidante pour les patients et pouvant entraîner dans les cas les plus graves une cécité. L'inflammation chronique est toujours omniprésente dans l'oeil ; elle peut être primaire comme dans le syndrome de Gougerot-Sj45gren, ou secondaire comme dans la kératite sèche.The present invention can also be used for the treatment or management of ocular dryness with a strong immuno-inflammatory component. More than 10 million people in the US (representing 15% of the population over 65) suffer from this ocular surface aggression. In this pathology, two types of syndromes must be distinguished: 10 - simple dry syndromes are caused by environmental factors (pollution, radiation, air conditioning, wearing of lenses, computer screens, etc.), aggravated by age; , menopause and some treatments. - The most serious forms are often associated with genetic factors such as Sj45gren's syndrome. They result in a chronic disease, which is very disabling for patients and can cause blindness in the most severe cases. Chronic inflammation is always ubiquitous in the eye; it may be primary as in Sj45gren's syndrome, or secondary as in dry keratitis.

20 La présente invention peut être utilisée pour traiter toute inflammation de la surface oculaire chez des sujets exposés à des conservateurs (substances antiseptiques), en particulier chez les sujets présentant des signes d'intolérance liés à une inflammation clinique ou infraclinique provoquée par une telle exposition. Les conservateurs les plus connus sur le marché sont les ammoniums quaternaires comme le chlorure de benzalkonium (BAC) qui entre dans la 25 composition des collyres multidoses dont ceux enregistrés pour le traitement du glaucome. Ces conservateurs, en provoquant la libération de radicaux libres et une apoptose des cellules oculaires, atteignent l'épithélium cornéen et stimulent l'infiltration de la conjonctive par des cellules inflammatoires.The present invention can be used to treat any inflammation of the ocular surface in subjects exposed to preservatives (antiseptic substances), particularly in subjects with signs of intolerance related to clinical or subclinical inflammation caused by such exposure. . The best known preservatives on the market are quaternary ammoniums such as benzalkonium chloride (BAC) which is included in the composition of multidose eye drops, including those registered for the treatment of glaucoma. These preservatives, by inducing the release of free radicals and apoptosis of the eye cells, reach the corneal epithelium and stimulate the infiltration of the conjunctiva by inflammatory cells.

30 Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire, chez un patient, le passage d'une molécule connue pour son effet inflammatoire tel qu'un conservateur de collyre multidoses (préférentiellement utilisé dans le traitement du glaucome).Another particular object of the invention resides in the use of a compound as defined above, for the preparation of a medicament intended to reduce, in a patient, the passage of a molecule known for its effect. inflammatory such as a multidose eye drops preservative (preferentially used in the treatment of glaucoma).

3022461 7 Le terme « traitement » désigne le traitement curatif, symptomatique et/ou préventif. Les composés et compositions de la présente invention peuvent ainsi être utilisées chez des sujets (comme les mammifères, en particulier humains) atteints d'une maladie déclarée. Les composés et compositions de la présente invention peuvent aussi être utilisés pour retarder ou 5 ralentir la progression ou prévenir une progression plus en avant de la maladie, améliorant ainsi la condition des sujets. Dans un mode particulier de réalisation, le composé utilisé est un composé inhibiteur compétitif sélectif de MLCK. Selon un aspect préféré, le composé mis en oeuvre est un 10 composé peptidique, en particulier un peptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO:1 (de préférence amidée en position C-terminale), ou un variant fonctionnel de ce dernier. D'autres peptides inhibiteurs de MLCK peuvent également être utilisés, notamment ceux décrits dans l'article de Lukas et al. cité ci-avant. Cet article décrit par ailleurs des méthodes permettant d'identifier de tels inhibiteurs peptidiques de MLCK qui pourront être 15 mises en oeuvre par l'homme du métier. Dans le contexte de la présente invention, on entend par "variant fonctionnel", un peptide présentant une identité de séquence d'au moins 75 %, de préférence au moins 80 %, 85 %, 90 %, ou au moins 95 %, voire d'au moins 99%, avec le peptide P18 de séquence SEQ ID NO:1, 20 et possédant une activité d'inhibiteur de MLCK et d'inhibiteur de l'expression de marqueurs de l'inflammation, de préférence ICAM-1, telles que définies ci-dessus. Selon un mode particulièrement préféré de réalisation, le composé est un peptide dont la séquence en acides aminés consiste en la séquence SEQ ID NO:1, de préférence amidée en position C-terminale.The term "treatment" refers to curative, symptomatic and / or preventive treatment. The compounds and compositions of the present invention can thus be used in subjects (such as mammals, in particular humans) with a declared disease. The compounds and compositions of the present invention may also be used to delay or slow progression or prevent further progression of the disease, thereby improving the condition of the subjects. In a particular embodiment, the compound used is a selective competitive inhibitory MLCK compound. According to a preferred aspect, the compound used is a peptide compound, in particular a peptide comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 (preferably amidated in the C-terminal position), or a functional variant thereof. . Other MLCK inhibitory peptides may also be used, including those described in the article by Lukas et al. cited above. This article also describes methods for identifying such peptide inhibitors of MLCK that can be implemented by those skilled in the art. In the context of the present invention, the term "functional variant" is intended to mean a peptide having a sequence identity of at least 75%, preferably at least 80%, 85%, 90%, or at least 95%, or even at least 99%, with the peptide P18 of sequence SEQ ID NO: 1, and possessing an activity of inhibitor of MLCK and inhibitor of the expression of markers of inflammation, preferably ICAM-1, as defined above. According to a particularly preferred embodiment, the compound is a peptide whose amino acid sequence consists of the sequence SEQ ID NO: 1, preferably amidated at the C-terminal position.

25 L'invention concerne par ailleurs une composition pharmaceutique comprenant un composé inhibiteur de MLCK et inhibiteur de l'expression de marqueurs de l'inflammation, en particulier d'ICAM-1, dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Selon un mode préféré de réalisation, la composé est le peptide P18 décrit ci-dessus, ou un variant fonctionnel de ce dernier. La composition peut notamment comprendre l'un des inhibiteurs 30 peptidique de MLCK décrits dans Lukas et al. cité ci-dessus. La composition selon l'invention peut être administrée de différentes manières et se présenter sous différentes formes galéniques. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être des compositions administrables par voie orale, nasale, sublinguale, rectale ou 3022461 8 parentérale, notamment par voie systémique (par exemple par voie intraveineuse ou intraartérielle). La composition peut être également administrée localement, notamment sous la forme d'un collyre ou d'un gel lorsqu'elle est destinée au traitement de pathologies oculaires. Il est généralement avantageux de formuler de telles compositions pharmaceutiques sous forme 5 de dose unitaire. Chaque dose comprend alors une quantité prédéterminée du principe actif, associée au véhicule, excipients et / ou adjuvants appropriés, calculés pour obtenir un effet thérapeutique donné. En particulier, le composé décrit ci-dessus, en particulier le peptide P18, peut se présenter sous forme de collyre, gel, comprimés, gélules, poudres, granulés, lyophilisats, solutés buvables ou injectables, sirops, suspensions ou encore suppositoires, 10 selon le traitement envisagé. Les formulations appropriées pour la forme d'administration choisie sont connues et décrites, par exemple dans : Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19è édition, 1995, Mack Publishing Company et peuvent donc être facilement préparées par l'homme de l'art.The invention further relates to a pharmaceutical composition comprising an MLCK inhibitory compound and an inhibitor of expression of inflammation markers, particularly ICAM-1, in a pharmaceutically acceptable excipient. According to a preferred embodiment, the compound is the P18 peptide described above, or a functional variant thereof. The composition may include, in particular, one of the peptide inhibitors of MLCK described in Lukas et al. Cited above. The composition according to the invention can be administered in different ways and be in different galenic forms. The pharmaceutical compositions according to the invention may be compositions that can be administered orally, nasally, sublingually, rectally or parenterally, in particular systemically (for example intravenously or intraarterially). The composition may also be administered locally, in particular in the form of an eye drop or a gel when it is intended for the treatment of ocular pathologies. It is generally advantageous to formulate such pharmaceutical compositions in unit dose form. Each dose then comprises a predetermined amount of the active ingredient, associated with the vehicle, excipients and / or appropriate adjuvants, calculated to obtain a given therapeutic effect. In particular, the compound described above, in particular the peptide P18, may be in the form of eye drops, gel, tablets, capsules, powders, granules, lyophilizates, oral or injectable solutions, syrups, suspensions or suppositories, 10 according to the treatment envisaged. Formulations suitable for the chosen form of administration are known and described, for example in: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, 1995, Mack Publishing Company and may therefore be readily prepared by those skilled in the art .

15 Il est connu que la posologie varie d'un individu à l'autre, selon la nature et l'intensité de l'affection, la voie d'administration choisie, le poids, l'âge et le sexe du malade en conséquence les doses efficaces devront être déterminées en fonction de ces paramètres par le spécialiste en la matière. A titre indicatif, les doses efficaces pourraient s'échelonner entre 20 0,001 et 100 mg/Kg/jour le composé utilisé. En tout état de cause, dans les méthodes selon l'invention, le composé est administré en une quantité efficace sur le plan thérapeutique. L'expression "quantité efficace sur le plan thérapeutique" désigne une quantité d'un composé suffisante pour produire le résultat 25 biologique souhaité. Une quantité efficace sur le plan thérapeutique est donc une quantité efficace pour prévenir, améliorer, traiter ou retarder l'apparition de la maladie ou condition. L'homme du métier pourra adapter cette quantité au sujet et à la pathologie à traiter, ainsi qu'à l'état d'avancement de la maladie. Les quantités mentionnées ci-dessus représentent des quantités illustratives, non limitatives, susceptibles d'être administrées à un sujet souffrant 30 d'une des maladies mentionnées dans la présente description. Les composés tels que définis dans la présente invention peuvent être utilisés seuls, en combinaison et/ou en association avec au moins un autre agent actif, tel que, par exemple, d'autres substances utilisées dans le traitement des pathologies oculaires, en particulier des 3022461 9 pathologies oculaires de surface. On peut citer par exemple les larmes artificielles, certains antioxydants, les différentes formes de cyclosporine, les agents antiseptiques, antibiotiques ou antiviraux, etc. Ces différents agents peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante.It is known that the dosage varies from one individual to another, depending on the nature and intensity of the condition, the route of administration chosen, the weight, age and sex of the patient accordingly. effective doses will have to be determined according to these parameters by the specialist in the field. As an indication, the effective doses could range between 0.001 and 100 mg / kg / day the compound used. In any case, in the methods according to the invention, the compound is administered in a therapeutically effective amount. The term "therapeutically effective amount" refers to an amount of a compound sufficient to produce the desired biological result. A therapeutically effective amount is therefore an amount effective to prevent, ameliorate, treat or delay the occurrence of the disease or condition. Those skilled in the art will be able to adapt this quantity to the subject and the pathology to be treated, as well as to the state of progress of the disease. The amounts mentioned above represent illustrative, non-limiting amounts which may be administered to a subject suffering from one of the diseases mentioned in the present description. The compounds as defined in the present invention may be used alone, in combination and / or in combination with at least one other active agent, such as, for example, other substances used in the treatment of ocular pathologies, particularly 3022461 9 ocular surface pathologies. Examples include artificial tears, certain antioxidants, various forms of cyclosporin, antiseptic, antibiotic or antiviral agents, and so on. These different agents can be used in combination therapeutic, administered in separate, combined, spread over time or concomitant form.

5 D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Exemples 10 Afin de déterminer si le composé peptide 18 possède des effets sur les cellules épithéliales de l'oeil, ce composé a été testé sur une lignée de cellules épithéliales de la cornée humaine (ref. HCE-2, N°ATCC CRL-11135, conditions de cultures 37°C, 5% CO2). Les cellules ont été cultivées selon les recommandations du fournisseur pendant 24h, puis le milieu a été remplacé 15 par du milieu d'essai Keratinocyte - SFM (Gibco 17005-042) complémenté avec de la gentamycine à 25 µg/ml, et les cellules ont été incubées 24h supplémentaires. Une incubation de 2h supplémentaires dans du milieu contenant le composé P18 ou non à été réalisée. A la fin du prétraitement, un mélange de cytokines pro-inflammatoires (IL1, TNFa et IFN-y à une concentration de lOng/m1 chacune) a été ajouté (ou non, pour les témoins non stimulés) et une 20 incubation de 20 minutes supplémentaires a été réalisée. Toutes les conditions ont été réalisées en triplicat. L'expression des marqueurs de l'inflammation a été évaluée par RT-qPCR sur les ARNm extraits des cellules épithéliales HCE-2. L'analyse des gènes a été réalisée à l'aide d'un PCR- 25 array contenant des gènes sélectionnés pour leur importance dans l'inflammation tissulaire (mQPA H-inflammation Tissue-64; BIOalternatives). Les gènes dont l'expression a été évaluée ainsi que les séquences utilisées sur ce PCR-array sont listés dans le tableau suivant.Other aspects and advantages of the present invention will become apparent from the following examples, which should be considered as illustrative and not limiting. EXAMPLES In order to determine whether the peptide compound 18 has effects on the epithelial cells of the eye, this compound has been tested on a human corneal epithelial cell line (ref HCE-2, ATCC No. CRL-11135 culture conditions 37 ° C, 5% CO2). The cells were cultured according to the supplier's recommendations for 24 hours, then the medium was replaced by Keratinocyte-SFM test medium (Gibco 17005-042) supplemented with gentamicin at 25 μg / ml, and the cells have been incubated for 24 hours. An additional 2h incubation in medium containing compound P18 or not was carried out. At the end of the pretreatment, a mixture of pro-inflammatory cytokines (IL1, TNFα and IFN-γ at a concentration of 10 ng / ml each) was added (or not, for the unstimulated controls) and incubated for 20 minutes. additional information has been produced. All the conditions were realized in triplicate. The expression of inflammation markers was evaluated by RT-qPCR on mRNAs extracted from HCE-2 epithelial cells. Gene analysis was performed using a PCR-array containing genes selected for their importance in tissue inflammation (mQPA H-inflammation Tissue-64; BIOalternatives). The genes whose expression has been evaluated as well as the sequences used on this PCR-array are listed in the following table.

30 3022461 10 Nom du gène Abréviation Gene Bank Amorce sens Amorce antisens ADNc bp Ribonuclease, RNASE7 NM 032572 CCTCCCCAGAAA AAGGACTC GGAATTGAAGGTC AGCCAAA 106 RNase A (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:3) family, 7 Secretory leukocyte peptidase inhibitor SLPI NM_003064 AATGCCTGGATC CTGTTGAC AAAGGACCTGGAC CACACAG 243 (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:5) Toll-like TLR5 NM 003268 GGGGACTAAGCC TCAACTCC AAGAGGGAAACC 280 receptor 5 (SEQ ID NO:6) CCAGAGAA (SEQ ID NO:7) Intercellular ICAM1 NM_000201 CACCTATGGCAA CGACTCCTTCTC GCCTCACACTTCA CTGTCACCTC 213 adhesion (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:9) molecule 1 L'extraction des ARN totaux de chaque échantillon a été réalisée à l'aide du réactif TriPure Isolation Reagent (Roche) selon le protocole du fournisseur. La quantité et la qualité des ARN 5 ont été évaluées à l'aide du dispositif Bioanalyzer (Agilent technologies). Les traces d'ADN potentiellement contaminant ont été quantifiées par traitement avec le système DNA-free d'Ambion. La réaction de transcription inverse de l'ARNm a été réalisée en présence de l'amorce oligo(dT) et de l'enzyme Superscript II (Gibco). L'ADNc ainsi obtenu a été quantifié à l'aide du dispositif Nanovue (GE Healthcare). Les ADNc ont ensuite été ajustés à 10 ngffil.Gene name Abbreviation Gene Bank Forward primer Antisense primer cDNA bp Ribonuclease, RNase7 NMR 032572 CCTCCCCAGAAA AAGGACTC GGAATTGAAGGTC AGCCAAA RNase A (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 3) family, 7 Secretory leukocyte peptidase inhibitor SLPI NM_003064 AATGCCTGGATC CTGTTGAC AAAGGACCTGGAC CACACAG 243 (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 5) Toll-like TLR5 NM 003268 GGGGACTAAGCC TCAACTCC AAGAGGGAAACC 280 receptor 5 (SEQ ID NO: 6) CCAGAGAA (SEQ ID NO: 7) Intercellular ICAM1 NM_000201 CACCTATGGCAA CGACTCCTTCTC GCCTCACACTTCA CTGTCACCTC 213 adhesion (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9) molecule 1 Total RNA extraction from each sample was performed using TriPure Isolation Reagent reagent (Roche) according to the protocol of the supplier . The quantity and quality of the RNAs were evaluated using the Bioanalyzer (Agilent Technologies) device. Traces of potentially contaminating DNA were quantified by treatment with the Ambion DNA-free system. The reverse transcription reaction of the mRNA was carried out in the presence of the oligo primer (dT) and the Superscript II enzyme (Gibco). The cDNA thus obtained was quantified using the Nanovue device (GE Healthcare). The cDNAs were then adjusted to 10 ngffil.

10 Les réactions de PCR ont été réalisées par PCR quantitative avec le système Light Cycler (Roche Molecular Systems Inc.) selon les procédures recommandées par le fournisseur. Le mélange réactionnel (10 tl final) pour chaque échantillon était le suivant: - 2,5 tl d'ADNc à 10 ngffil; 15 - amorces des différents marqueurs utilisés, à une concentration finale de 0,5 µM; - mélange réactionnel contenant l'enzyme Taq DNA polymérase, le marqueur SYBR Green I et du MgC12, utilisé selon les indications du fournisseur. Les données brutes ont été transférées et traitées dans le logiciel Microsoft Excel.PCR reactions were performed by quantitative PCR with Light Cycler System (Roche Molecular Systems Inc.) according to the procedures recommended by the supplier. The reaction mixture (10 μl final) for each sample was as follows: 2.5 μl of 10 ngffil cDNA; 15 - primers of the different markers used, at a final concentration of 0.5 μM; reaction mixture containing the enzyme Taq DNA polymerase, the SYBR Green I marker and MgC12, used according to the indications of the supplier. The raw data has been transferred and processed in the Microsoft Excel software.

20 Concernant le traitement des données brutes, les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l'aide du test T de Student.Regarding the processing of the raw data, the intergroup comparisons were made using the Student's T test.

3022461 11 Dans les conditions expérimentales de cette étude, le composé P18 testé à 5 iiM inhibe l'expression de marqueurs de l'immunité et de l'inflammation (RNASE7, SLPI et TLR5), la molécule d'adhésion ICAM-1 en particulier.In the experimental conditions of this study, the compound P18 tested at 5 μM inhibits the expression of markers of immunity and inflammation (RNase7, SLPI and TLR5), the adhesion molecule ICAM-1 in particular .

5 Ces résultats montrent une action anti-inflammatoire du composé P18.These results show an anti-inflammatory action of the compound P18.

Claims

REVENDICATIONS1. MLCK inhibitor compound and inhibitor of expression of inflammation markers for use as a modulator of inflammation.

2. MLCK inhibitor compound and inhibitor of expression of inflammation markers for use in a method of treating an inflammatory or allergic disorder.

3. MLCK inhibitor compound and inhibitor of expression of inflammation markers for use in a method of treating ocular pathology, particularly surface ocular pathology.

A compound according to claim 3 for use in the treatment of an eye condition such as a condition caused by an allergy or inflammation in the eye, infectious conjunctivitis, keratitis and the disease of the eye. dry eye.

5. A pharmaceutical composition comprising an MLCK inhibitory compound and an inhibitor of expression of inflammation markers in a pharmaceutically acceptable excipient.

6. Pharmaceutical composition according to claim 5, in the form of an eye drop or an ophthalmic gel.

A compound or composition according to any one of claims 1 to 6 wherein the compound is an inhibitor of MLCK and an inhibitor of ICAM-1 expression.

The compound or composition of any one of claims 1 to 7, the compound being a peptide comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, or a functional variant of such a peptide.

9. The compound or composition according to any one of claims 1 to 8, the compound being a peptide whose amino acid sequence consists of the sequence SEQ ID NO: 1.