FR3021219A1

FR3021219A1 - OLIGO-PORPHYRANES, METHOD AND MEDICINAL PRODUCT

Info

Publication number: FR3021219A1
Application number: FR1454592A
Authority: FR
Inventors: Sourd Frederic Le; Gaelle Correc; Murielle Jam; Catherine Boyen; Mirjam Czjzek
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2015-11-27
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: FR3021219B1; WO2015177457A1

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'oligo-porphyranes, à des oligo-porphyranes susceptibles d'être obtenus par ce procédé, ainsi qu'à des utilisations de ces oligoporphyranes. La présente invention se rapporte également aux oligoporphyranes susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention, comme médicament, notamment comme médicament destiné à moduler l'immunité. Le procédé de l'invention comprend une étape (a) d'hydrolyse enzymatique de porphyrane au moyen de beta-agarase B. La présente invention trouve par exemple des applications en santé humaine et animale, par exemple en immuno-modulation, dans le domaine pharmaceutique, ainsi que dans les domaines cosmétique et nutraceutique.The present invention relates to a process for the manufacture of oligo-porphyrans, to oligo-porphyrans obtainable by this process, as well as to uses of these oligoporphyranes. The present invention also relates to the oligoporphyranes obtainable by the method of the invention, as a medicament, especially as a medicament for modulating immunity. The method of the invention comprises a step (a) of enzymatic hydrolysis of porphyran by means of beta-agarase B. The present invention finds, for example, applications in human and animal health, for example in immunomodulation, in the field of pharmaceuticals, as well as in the fields of cosmetics and nutraceuticals.

Description

OLIGO-PORPHYRANES, PROCÉDÉ ET MÉDICAMENT Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'oligo-porphyranes, à des oligo-porphyranes susceptibles d'être obtenus par ce procédé, ainsi qu'à des utilisations de ces oligoporphyranes. La présente invention se rapporte également aux oligoporphyranes susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention, comme médicament, notamment comme médicament destiné à moduler l'immunité. La présente invention trouve par exemple des applications en santé humaine et animale, par exemple en immuno-modulation, dans le domaine pharmaceutique, ainsi que dans les domaines cosmétique et 15 nutraceutique. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique 20 L'intérêt des oligosaccharides sulfatés extraits des algues est largement reconnu dans le monde scientifique, notamment pour des applications en santé humaine et animale et en cosmétique. Actuellement, l'obtention de ces molécules repose sur des procédés d'hydrolyse chimique qui ne permettent pas de préserver les 25 motifs de sulfatation naturels (« Natural sulfatation pattern »), ce qui altère le potentiel d'activité biologique des molécules générées. D'autres méthodes consistent à sulfater des oligosaccharides afin de les fonctionnaliser. Ce procédé chimique ne permet cependant pas, sinon très difficilement, de maîtriser finement un état de sulfatation propice 30 à une activité biologique précise. Il existe donc un réel besoin de trouver de nouveau moyens de synthèse de ces molécules, palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, et qui à la fois préservent et permettent de contrôler les motifs de sulfatation naturels, soient économiques en coût de fabrication, écologiques et permettent de produire des oligosaccharides exempts de produits réactionnels toxiques Description de l'invention La présente invention pallie les inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé de fabrication d'un oligoporphyrane, ledit procédé comprenant une étape (a) d'hydrolyse enzymatique de porphyrane au moyen de béta-agarase B.TECHNICAL FIELD The present invention relates to a process for the manufacture of oligo-porphyrans, to oligo-porphyrans obtainable by this process, as well as to uses of these oligoporphyrans. BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention also relates to the oligoporphyranes obtainable by the method of the invention, as a medicament, especially as a medicament for modulating immunity. The present invention finds, for example, applications in human and animal health, for example in immunomodulation, in the pharmaceutical field, as well as in the cosmetic and nutraceutical fields. In the description below, references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text. STATE OF THE ART The interest of sulfated oligosaccharides extracted from algae is widely recognized in the scientific world, particularly for applications in human and animal health and in cosmetics. At present, obtaining these molecules relies on chemical hydrolysis processes which do not make it possible to preserve the natural sulfation patterns ("natural sulfation pattern"), which alters the potential for biological activity of the molecules generated. Other methods include sulfating oligosaccharides to functionalize them. This chemical process, however, does not allow, if not very difficult, to finely control a sulfation state conducive to a specific biological activity. There is therefore a real need to find new means of synthesis of these molecules, overcoming these defects, disadvantages and obstacles of the prior art, and which both preserve and control the natural sulfation patterns, are cost-effective The present invention overcomes the drawbacks of the prior art by providing a method of manufacturing an oligoporphyran, said process comprising a step (a) of the present invention. of enzymatic hydrolysis of porphyran by means of beta-agarase B.

Les expérimentations mettant en oeuvre le procédé de la présente invention et les résultats correspondants, par exemple ceux présentés dans la partie « Exemples » ci-dessous, démontrent en effet les nombreux avantages du procédé de l'invention par rapport à ceux de l'art antérieur, notamment en fournissant : - Un procédé d'hydrolyse finement contrôlable - Des produits générés de taille et de structure chimique précisément contrôlés ; - Des produits générés de meilleure qualité que les procédés connus de l'art antérieur, notamment chimiques, en particulier par un état de sulfatation préservé par rapport aux molécules naturelles et par l'absence de résidus réactionnels potentiellement toxiques ; - La possibilité de tirer profit d'un réservoir de biodiversité naturelle aisément renouvelable afin d'isoler des molécules bioactives ; et - Un procédé biotechnologique très respectueux de l'environnement Selon l'invention, la bêta-agarase B peut être par exemple la beta-agarase B exprimée par la bactérie marine Zobellia galactanivorans. Il peut s'agir également de celle exprimée par Zobellia neoagarotetraose ou neoagarobiose.The experiments implementing the method of the present invention and the corresponding results, for example those presented in the "Examples" section below, demonstrate in fact the numerous advantages of the process of the invention over those of the art. previous, in particular by providing: - A finely controllable hydrolysis process - Generated products of precisely controlled size and chemical structure; - Generated products of better quality than known processes of the prior art, including chemical, in particular by a state of sulfation preserved compared to natural molecules and by the absence of potentially toxic reaction residues; - the possibility of taking advantage of a reservoir of natural biodiversity that is easily renewable in order to isolate bioactive molecules; and a biotechnological process that is very respectful of the environment. According to the invention, the beta-agarase B may be, for example, beta-agarase B expressed by the marine bacterium Zobellia galactanivorans. It may also be that expressed by Zobellia neoagarotetraose or neoagarobiose.

Selon l'invention, le porphyrane est de préférence extrait par exemple à partir de l'algue rouge marine Porphyra sp.. ou macro-algue rouge Porphyra umbilicalis, en particulier à partir de leur paroi. Le porphyrane peut également être extrait à partir d'autres algues rouges agarophytes. Selon l'invention, le porphyrane peut être par exemple un polysaccharide hétérogène présentant une alternance de beta-Dgalactopyranose-(1,4)-3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranoside (motif G-LA) et de beta-D-galactopyranose-(1-4)-alpha-L-galactose-6-sulfate (motif G- L6). Ces molécules sont schématisées dans les exemples ci-dessous. Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape (b) de purification de l'oligo-porphyrane, par exemple par ultrafiltrations successives de l'hydrolysat sur membrane et/ou par tout autre procédé connu de l'homme du métier pour la purification d'un oligo- porphyrane, par exemple par chromatographie d'exclusion préparative, par exemple avec trois colonnes Superdex 30 (26/60) (marque de commerce) de GE HealthCare en série, intégrées sur un système HPLC System injecteur/collecteur liquide (Gilson). Les oligosaccharides peuvent être détectés par exemple comme exposé dans les exemples ci-dessous, ou encore par leur index réfractif, par exemple au moyen d'un détecteur Spectra System RI-50, et l'intégration des données (Gilson et détecteur réfraction) par le logiciel Unipoint (Gilson). Le procédé d'hydrolyse enzymatique des polysaccharides de la présente invention est donc contrôlé, doux et propre. Ce procédé est un procédé biotechnologique qui permet de tirer profit d'une biodiversité riche, d'exploiter largement son potentiel en générant un éventail de molécules naturelles, accentuant ainsi les possibilités d'identifier des nouvelles molécules bioactives. En effet, à l'inverse des procédés d'hydrolyse chimiques conventionnels, le procédé de la présente invention présente l'avantage de préserver le large potentiel bioactif que possèdent les polysaccharides d'algues marines et tout particulièrement leurs produits d'hydrolyse en préservant la complexité structurale naturelle et initiale des oligosaccharides générés.According to the invention, the porphyran is preferably extracted for example from the marine red algae Porphyra sp .. or red macroalga Porphyra umbilicalis, in particular from their wall. Porphyran can also be extracted from other agarophytic red algae. According to the invention, the porphyran may be for example a heterogeneous polysaccharide having alternating beta-Dgalactopyranose- (1,4) -3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranoside (G-LA motif) and beta-D -galactopyranose- (1-4) -alpha-L-galactose-6-sulfate (G-L6 motif). These molecules are schematized in the examples below. According to the invention, the process may furthermore comprise a step (b) for purifying the oligo-porphyran, for example by successive ultrafiltration of the hydrolyzate on the membrane and / or by any other method known to those skilled in the art. for the purification of an oligoporphyran, for example by preparative exclusion chromatography, for example with three columns of Superdex 30 (26/60) (trademark) of GE HealthCare in series, integrated on a system HPLC System injector / liquid collector (Gilson). The oligosaccharides can be detected for example as set forth in the examples below, or by their refractive index, for example by means of a Spectra System RI-50 detector, and the integration of the data (Gilson and refractive detector) by the Unipoint software (Gilson). The enzymatic hydrolysis process of the polysaccharides of the present invention is therefore controlled, gentle and clean. This process is a biotechnological process that makes it possible to take advantage of a rich biodiversity, to exploit its potential to a large extent by generating a range of natural molecules, thus increasing the possibilities of identifying new bioactive molecules. Indeed, unlike conventional chemical hydrolysis processes, the method of the present invention has the advantage of preserving the broad bioactive potential that seaweed polysaccharides possess and especially their hydrolysis products while preserving the natural and initial structural complexity of the oligosaccharides generated.

De plus, le procédé de la présente invention s'inscrit parfaitement dans le cadre des efforts mondiaux mis en oeuvre pour s'orienter vers des procédés de production respectueux de l'environnement.In addition, the process of the present invention fits perfectly within the framework of global efforts made to move towards environmentally friendly production processes.

En outre, en termes de coûts, un autre aspect important vient renforcer l'intérêt du procédé de la présente invention : alors que les procédés chimiques demandent en permanence des intrants chimiques coûteux, les enzymes utilisés par les inventeurs pour l'accomplissement de la présente invention sont stables et peuvent être réutilisées pour plusieurs cycles de production, ce qui permet avantageusement d'adapter un protocole de production en continu. Egalement, comme démontré dans la partie « Exemples » ci-dessous, les oligo-porphyranes susceptibles d'être obtenus grâce au procédé de l'invention présentent un degré de sulfatation préservé et contrôlé par rapport à l'état naturel de la source de ces oligo-porphyranes. Ces molécules présentent donc un intérêt tout particulier pour la santé humaine et animale et pour l'agro-alimentaire. Ainsi, la présente invention se rapporte donc également à un oligo-porphyrane susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention.In addition, in terms of costs, another important aspect reinforces the interest of the process of the present invention: while chemical processes constantly require expensive chemical inputs, the enzymes used by the inventors for the accomplishment of the present invention. The invention is stable and can be reused for several production cycles, which advantageously makes it possible to adapt a production protocol continuously. Also, as demonstrated in the "Examples" section below, the oligo-porphyrans obtainable by the process of the invention have a degree of sulfation preserved and controlled with respect to the natural state of the source of these porphyrans trace. These molecules are therefore of particular interest for human and animal health and for the agri-food industry. Thus, the present invention thus also relates to an oligo-porphyran obtainable by the method of the invention.

Selon l'invention, l'oligo-porphyrane peut avoir une masse moléculaire de 780 à 1600 g/mol. La présente invention se rapporte également à l'oligoporphyrane, susceptible d'être obtenu par le procédé de la présente invention, comme médicament, notamment comme médicament destiné à moduler l'immunité, par exemple comme médicament destiné à stimuler l'immunité. Les inventeurs ont en effet constaté de manière surprenante qu'au moins un oligo-porphyrane possède des propriétés de modulation de l'immunité qui présente une utilité importante dans le domaine de la santé. Selon l'invention, il peut s'agir d'un oligo-porphyrane seul ou d'un mélange d'oligo-porphyrane comme médicament, notamment destiné à moduler l'immunité, notamment la stimuler. Selon l'invention, il peut également s'agir d'une combinaison d'un oligo-porphyrane seul ou d'un mélange d'oligo-porphyrane avec un autre principe actif médicamenteux.According to the invention, the oligo-porphyran may have a molecular weight of 780 to 1600 g / mol. The present invention also relates to oligoporphyran, obtainable by the process of the present invention, as a medicament, especially as a medicament for modulating immunity, for example as a medicament for stimulating immunity. The inventors have in fact surprisingly found that at least one oligo-porphyran has immunity-modulating properties which have an important utility in the field of health. According to the invention, it may be an oligo-porphyran alone or a mixture of oligo-porphyran as a medicament, in particular for modulating immunity, including stimulating it. According to the invention, it may also be a combination of an oligo-porphyran alone or a mixture of oligo-porphyran with another medicinal active ingredient.

Selon l'invention, l'autre principe actif médicamenteux peut être par exemple une molécule agissant également sur l'immunité, ou immunomodulateur, d'un patient ou sur la ou les causes produisant variation non désirée d'immunité. Il peut s'agir par exemple : - d'un antiviral ou d'un mélange d'antiviraux, par exemple choisi parmi des adamantanes ou des inhibiteurs de neuramidinases, - d'un actif de traitement du cancer, par exemple des agents de chimiothérapie comme le taxotère, la doxorubicine, la cisplatine ou des anticorps monoclonaux, - d'un actif utilisé comme vaccin antimicrobien, par exemple à base de micro-organismes vivants atténués ou morts ou de nouveaux vaccins protéiques ou conjugués ou produits par génie génétique, - d'un actif pour le traitement d'allergies, par exemple à base d'histamines ou de corticostéroïdes. Ainsi, la présente invention permet non seulement de préparer des molécules actives implémentables au stade pré-industriel et industriel, mais fournit également ses molécules préparées qui sont utilisables comme principe actif, mélange de principe actif ou principe(s) actif(s) 2 0 associable à un ou plusieurs autres principes actifs, avec tout l'éventail d'applications dans les domaines de l'immunomodulation en santé humaine et animale, par exemple parmi celles précitées. Les inventeurs démontrent à travers les expérimentations présentées ci-dessous que les oligo-porphyranes dérivés du porphyrane 25 selon la présente invention, présentent une activité immunomodulatrice sur un modèle cellulaire animal d'étude in vitro, notamment une lignée monocytaire humaine. Ces oligo-porphyranes sont obtenus par un processus innovant d'hydrolyse enzymatique des polysaccharides par l'Agarase B, conformément au procédé de la présente invention. 30 Les inventeurs sont les premiers à démontrer que l'Agarase B peut être utilisée sur un autre substrat que celui habituellement décrit dans l'art antérieur, ce nouveau substrat étant le porphyrane, afin de produire des composés biologiquement actifs. Un des aspects majeurs innovants de la présente invention repose sur le processus d'hydrolyse enzymatique qui permet de préserver cet état de sulfatation, contrairement aux méthodes conventionnelles d'hydrolyse chimique des polysaccharides. Les résultats expérimentaux décrits ci-dessous suggèrent un rôle important de l'état de sulfatation des d'oligosaccharides de la présente invention. L'effet immunomodulateur des oligo-porphyranes de la présente invention comprend notamment la stimulation des caractères de différenciation des monocytes en macrophages, acteurs essentiels de l'immunité et de la réponse inflammatoire, ainsi que la stimulation de la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF-alpha par ces cellules. Ces résultats sont le reflet d'une réponse extracellulaire des macrophages dans un contexte d'enclenchement du processus immunitaire et inflammatoire. Enfin, une autre originalité de la présente invention vient du type de molécules que les inventeurs valorisent grâce au procédé de l'invention : les oligo-porphyranes. Celles-ci peuvent être libérées à partir du porphyrane d'algues marines par une famille d'enzymes exprimées par certaines bactéries associées à ces algues, les porphyranases. Des études récentes ont montré qu'un certain nombre de gènes codant pour ces enzymes et autres assimilées sont fréquemment retrouvées dans le génome de bactéries isolées de la flore intestinale de populations japonaises alors que ce n'est pas le cas pour les populations, entre autres, nord-américaines. Ces résultats suggèrent qu'il y a eu un transfert de gènes des bactéries marines vers les bactéries de la flore intestinale des populations japonaises. Ceci peut s'expliquer par le régime alimentaire traditionnel de ces populations, riche en algues marines, notamment du type porphyra (nori), à la base de la préparation des makis, et que l'ingestion des bactéries marines se fasse via l'ingestion d'algues non stériles. Les bactéries de la flore intestinale permettant à l'homme d'assimiler notamment des polysaccharides issus de son régime en plantes terrestres, un transfert de gènes de bactéries marines chez les populations japonaises suggère pour ces derniers la possibilité de digérer les polysaccharides issus de leur régime enrichi en algues marines. Ce gain conduit à un avantage nutritionnel avantageux pour l'homme du fait des bénéfices bioactifs reconnus des oligosaccharides issus de la digestion des polysaccharides d'algues. La présente invention permet donc de proposer aux populations occidentales le même bénéfice nutritionnel en valorisant les oligo-porphyranes générés comme compléments d'aliments fonctionnels dans le domaine de la nutraceutique. Ce concept est également valable pour la nutrition animale ou des applications dans le domaine de la cosmétique. Ainsi, certains composés de la fraction d'oligosaccharides en mélange obtenue ici pourraient être développés comme nouveaux agents texturants pour l'agroalimentaire et la cosmétique. Ainsi, la présente invention se rapporte également à un additif alimentaire ou à un aliment ou à un produit cosmétique comprenant un oligoporphyrane susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention qui présente des propriétés pré-biotiques de modulation de la flore intestinale ou des propriétés anti-oxydantes et anti-vieillissement. Il peut aussi s'agir par exemple d'additifs alimentaires destinés à l'homme ou à l'animal, dans 2 0 le but de stimuler les défenses immunitaires. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 25 Brève description des figures Figure 1 : résultats d'analyse par chromatographie d'exclusion de taille des oligo-porphyranes obtenus par hydrolyse enzymatique du porphyrane par la beta-AgaB suivant le procédé de la présente invention. 30 Figure 2: résultats d'analyse en FACE des oligo-porphyranes obtenus par digestion du porphyrane par l'enzyme AgaB suivant le procédé de la présente invention. 3 02 12 1 9 8 Figure 3 : photographies d'observation microscopique de monocytes THP-1 après traitement au PMA pour leur différenciation en macrophages. Les flèches indiquent les extensions cytoplasmiques (grossissement x200). 5 Figure 4: photographies d'observation microscopique de la morphologie des macrophages THP-1 après 24 heures de traitement avec les oligo-porphyranes. (grossissement x200). Figure 5: graphique de régression linéaire du logarithme de l'absorbance (ordonnées) en fonction du logarithme de la 10 concentration de TNF-alpha (abscisses). Figure 6 : graphique d'étude de l'effet des oligo-agaroses (oligo-aga) et des oligo-porphyranes (oligo-por) sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1. Figure 7: effet de doses croissantes d'oligo-porphyranes sur la 15 sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1. Les concentrations d'oligo-porphyranes sont indiquées en g/I. Figure 8 : 1H RMN (500 MHz) spectre des oligosaccharides L6S-GLA-G-L6S-G non-méthylé (A) et méthyle (B), tel que comparé à la fraction haut poids moléculaire des oligosaccharides hybrides (C), et du neo-agarotetraose (D). EXEMPLES Exemple 1 : Préparation d'oligo-porphyranes A. Production et purification de l'enzyme beta-agarase B (beta-AgaB) de Zobellia galactanivorans Cette enzyme est produite sous forme recombinante selon le procédé décrit dans le document FR 2 779 738 [1] publié le 17 décembre 1999.According to the invention, the other medicinal active principle may for example be a molecule also acting on the immunity, or immunomodulator, of a patient or on the cause or causes producing undesired variation of immunity. It may be, for example: an antiviral or a mixture of antivirals, for example chosen from adamantans or neuramidinase inhibitors, a cancer treatment active agent, for example chemotherapy agents such as taxotere, doxorubicin, cisplatin or monoclonal antibodies, - an active ingredient used as an antimicrobial vaccine, for example based on live attenuated or dead micro-organisms or new protein or conjugate or genetically engineered vaccines, - an active ingredient for the treatment of allergies, for example based on histamines or corticosteroids. Thus, the present invention not only makes it possible to prepare active molecules which can be implemented at the pre-industrial and industrial stage, but also provides its prepared molecules which can be used as active ingredient, active ingredient mixture or active principle (s). associable with one or more other active ingredients, with the full range of applications in the fields of immunomodulation in human and animal health, for example among those mentioned above. The inventors demonstrate, through the experiments presented below, that the porphyran-derived porphyran oligomers according to the present invention exhibit immunomodulatory activity on an in vitro animal cell model, in particular a human monocyte line. These oligo-porphyrans are obtained by an innovative process of enzymatic hydrolysis of polysaccharides by Agarase B, in accordance with the process of the present invention. The inventors are the first to demonstrate that Agarase B can be used on another substrate than that usually described in the prior art, this new substrate being porphyran, in order to produce biologically active compounds. One of the major innovative aspects of the present invention relies on the enzymatic hydrolysis process which makes it possible to preserve this state of sulfation, contrary to conventional methods of chemical hydrolysis of polysaccharides. The experimental results described below suggest an important role for the sulfation state of the oligosaccharides of the present invention. The immunomodulatory effect of the oligo-porphyrans of the present invention comprises in particular the stimulation of the monocyte differentiating characters into macrophages, essential players in the immunity and the inflammatory response, as well as the stimulation of the secretion of the pro-inflammatory cytokine. TNF-alpha by these cells. These results are a reflection of an extracellular response of macrophages in a context of activation of the immune and inflammatory process. Finally, another originality of the present invention comes from the type of molecules that the inventors value through the process of the invention: oligo-porphyranes. These can be released from marine algae porphyran by a family of enzymes expressed by certain bacteria associated with these algae, porphyranases. Recent studies have shown that a number of genes coding for these and other assimilated enzymes are frequently found in the genome of bacteria isolated from the intestinal flora of Japanese populations, whereas this is not the case for populations, among others , North American. These results suggest that there has been a transfer of genes from marine bacteria to the intestinal flora bacteria of Japanese populations. This can be explained by the traditional diet of these populations, rich in marine algae, especially of the porphyra (nori) type, at the base of makis preparation, and that the ingestion of marine bacteria is via ingestion. of non-sterile algae. Bacteria of the intestinal flora allowing humans to assimilate polysaccharides derived from its diet in terrestrial plants, a transfer of genes from marine bacteria in Japanese populations suggests for them the possibility of digesting the polysaccharides from their diet enriched with marine algae. This gain leads to a nutritional advantage that is advantageous for humans because of the recognized bioactive benefits of oligosaccharides resulting from the digestion of algal polysaccharides. The present invention therefore makes it possible to offer Western populations the same nutritional benefit by valuing the oligo-porphyrans generated as functional food supplements in the field of nutraceuticals. This concept is also valid for animal nutrition or applications in the field of cosmetics. Thus, certain compounds of the mixed oligosaccharide fraction obtained here could be developed as novel texturizing agents for the food industry and cosmetics. Thus, the present invention also relates to a food additive or a food or a cosmetic product comprising an oligoporphyran obtainable by the process of the invention which has pre-biotic properties for modulating the intestinal flora or anti-oxidant and anti-aging properties. It may also be for example food additives intended for humans or animals, in order to stimulate the immune defenses. Other advantages may still appear to those skilled in the art on reading the examples below, illustrated by the appended figures, given for illustrative purposes. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1: size exclusion chromatography analysis results of the porphyran oligomers obtained by enzymatic hydrolysis of porphyran by beta-AgaB according to the method of the present invention. FIG. 2: FACE analysis results of the oligo-porphyrans obtained by digestion of the porphyran with the AgaB enzyme according to the method of the present invention. FIG. 3: Microscopic observation photographs of THP-1 monocytes after treatment with PMA for their differentiation into macrophages. Arrows indicate cytoplasmic extensions (x200 magnification). Figure 4: Microscopic observation photographs of THP-1 macrophage morphology after 24 hours of treatment with oligo-porphyrans. (x200 magnification). Figure 5: Linear regression plot of the logarithm of absorbance (ordinates) versus logarithm of TNF-alpha concentration (abscissa). Figure 6: graph of study of the effect of oligo-agaroses (oligo-aga) and oligo-porphyrans (oligo-por) on the secretion of TNF-alpha by macrophages THP-1. Figure 7: Effect of increasing doses of oligo-porphyrans on TNF-alpha secretion by THP-1 macrophages. The concentrations of oligo-porphyranes are indicated in g / I. Figure 8: 1H NMR (500 MHz) spectrum of unmethylated (A) and methyl (B) L6S-GLA-G-L6S-G oligosaccharides, as compared to the high molecular weight fraction of the hybrid oligosaccharides (C), and neo-agarotetraosis (D). EXAMPLES Example 1 Preparation of oligo-porphyrans A. Production and purification of the enzyme beta-agarase B (beta-AgaB) from Zobellia galactanivorans This enzyme is produced in recombinant form according to the process described in the document FR 2 779 738 [ 1] published on December 17, 1999.

La flavobactérie marine Zobellia galactanivorans utilisée a été acquise auprès de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH, Leibniz, Allemagne) sous la référence DSMZ-12802.The Zobellia galactanivorans marine flavobacterium used was purchased from DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH, Leibniz, Germany) under the reference DSMZ-12802.

Le protocole de production de l'enzyme est celui décrit dans l'exemple 3 du document [1], E. coli BL21DE3 ayant été transformé avec le gène codant pour l'agaB de Zobellia galactanivorans.The production protocol of the enzyme is that described in Example 3 of document [1], E. coli BL21DE3 having been transformed with the gene coding for agab of Zobellia galactanivorans.

B. Purification du porphyrane de Porphyra umbilicalis L'algue rouge Porphyra umbilicalis est récoltée sur la zone intertidale de la baie de Perharidy (Roscoff, France). Elle est rincée à l'eau douce afin de la débarrasser du sable et autres débris contaminants. L'excès d'eau est éliminé par essorage puis par pressage de l'algue entre plusieurs couches de papier absorbant. L'algue est ensuite séchée en la plaçant 2 jours à 35°C. Le rendement de masse sèche obtenu est de 20% de la masse initiale d'algue essorée. L'algue est alors réduite en poudre à l'aide d'un robot « blender » broyeur à bille commercialisé par la société Retsch (De) sous la référence MM200. La poudre obtenue est incorporée en une quantité représentant 2% en poids à de l'eau distillée, % exprimé par rapport au poids de l'eau distillée utilisée, et le mélange est autoclave 1 heure à 105 Pa (1 bar) à 115°C afin d'extraire les polysaccharides d'intérêt. Le mélange est ensuite refroidi à la température du laboratoire (25°C) puis filtré à travers une membrane de nylon présentant une taille de pore de 0.5 mm afin d'éliminer les résidus d'algue les plus gros. Le filtrat résultant contient les polysaccharides de la présente invention. Il est clarifié par centrifugation pendant 20 minutes à 20 000 G pour éliminer les résidus indésirables plus petits. L'extrait clarifié est concentré 5 fois par évaporation en utilisant un rotavapor. Les polysaccharides sont alors précipités par ajout de 4 volumes d'éthanol absolu pour un volume d'extrait clarifié. Le précipité polysaccharidique obtenu est filtré et lavé à l'éthanol absolu dans un Büchner. Le précipité est ensuite séché à 30°C toute la nuit (10 heures).B. Purification of porphyria of Porphyri umbilicalis The red alga Porphyra umbilicalis is harvested from the intertidal zone of Perharidy Bay (Roscoff, France). It is rinsed with fresh water to rid it of sand and other contaminating debris. The excess water is removed by wringing and then pressing the seaweed between several layers of absorbent paper. The seaweed is then dried by placing it for 2 days at 35 ° C. The yield of dry mass obtained is 20% of the initial mass of dewatered seaweed. The alga is then reduced to powder using a robot "blender" ball mill marketed by Retsch (De) under the reference MM200. The powder obtained is incorporated in an amount representing 2% by weight of distilled water, expressed as a percentage of the weight of the distilled water used, and the mixture is autoclaved for 1 hour at 105 Pa (1 bar) at 115 ° C. C to extract the polysaccharides of interest. The mixture is then cooled to laboratory temperature (25 ° C) and filtered through a nylon membrane with a pore size of 0.5 mm to remove larger algae residues. The resulting filtrate contains the polysaccharides of the present invention. It is clarified by centrifugation for 20 minutes at 20,000 G to remove smaller undesirable residues. The clarified extract is concentrated 5 times by evaporation using a rotavapor. The polysaccharides are then precipitated by addition of 4 volumes of absolute ethanol to a volume of clarified extract. The polysaccharide precipitate obtained is filtered and washed with absolute ethanol in a Buchner. The precipitate is then dried at 30 ° C overnight (10 hours).

Ce protocole permet d'obtenir un rendement en polysaccharide selon l'invention de 15% de la masse traitée d'algue sèche initiale, soit 3% de la masse initiale d'algue essorée.This protocol makes it possible to obtain a yield of polysaccharide according to the invention of 15% of the treated mass of initial dry algae, ie 3% of the initial mass of dewatered seaweed.

C. Hydrolyse enzymatique du porphyrane L'enzyme beta-AgaB présente une spécificité d'hydrolyse du substrat agarose au niveau de la liaison beta-1,4 entre le beta-Dgalactopyranose (motif G) et le 3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranose (motif LA). La structure des motifs G et LA constitutifs de l'agarose est représentée ci-dessous. L'enzyme béta-AgaB hydrolyse la liaison entre ces deux motifs. G Le porphyrane naturel extrait est un polysaccharide hétérogène constitué d'une alternance entre ces motifs disaccharidiques G-LA et des motifs G-L6S où L6S correspond à l'alpha-L-galactose-6-sulfate lié en 4 au motif G comme représenté ci-dessous : AgaB 3 0 2 1 2 1 9 11 L'enzyme béta-AgaB peut hydrolyser la liaison entre ces deux motifs. L'enzyme béta-AgaB accepte la présence de motifs L6S au niveau de certains de ses sous-sites de liaison à son substrat. Ainsi cette 5 enzyme peut générer des oligosaccharides hybrides avec enchainements variables de motifs G-LA et de motifs G-L6S. Le substrat porphyrane est préparé à 1 % en poids dans l'eau distillée (`)/0 exprimé par rapport au poids de l'eau distillée utilisée). La digestion enzymatique est effectuée par ajout de l'enzyme 10 AgaB en une concentration de 1pg/mlfinal et incubation 24 heures à 30°C. D. Purification et analyse des oligo-porphyranes La purification des oligosaccharides est effectuée par ultrafiltrations successives de l'hydrolysat sur membrane de seuil de 15 filtration fixé à 30 kDa puis sur deuxième membrane au seuil fixé à 10 kDa. Les membranes utilisées sont disponibles en vente dans le catalogue Millipore, sous la référence Centricon Catalog no. 4206 (10 kDa) et 4209 (30 kDa), commercialisé par la société Millipore. A l'issue de ces étapes de filtrations, selon la masse molaire théorique moyen du porphyrane hybride (400 Da pour un disaccharide), le profil théorique du mélange oligosaccharidique correspond à des oligosaccharides d'un degré de polymérisation (DP) inférieur à 25 répétitions disaccharidiques (DP50). L'analyse du profil est effectuée par chromatographie d'exclusion de taille en injectant une solution oligosaccharidique à 0,4% dans l'eau mQ sur un appareillage Dionex ultimate (marque déposée) 3000 commercialisé par la société DIONEX (Sunnyvale, Californie) et une colonne Superdex peptide (marque déposée) 10/300 commercialisé sous la référence GE17-5176-01 dans le catalogue SIGMA-ALDRICH. La séparation s'effectue en 60 minutes sous éluant nitrate de lithium (LiNO3) à 100 mM. D'autres analyses sont menées par séparation électrophorétique des oligosaccharides préalablement marqués par un 3 0 2 1 2 1 9 12 fluorophore. La comparaison de ce mélange d'oligo-porphyranes avec des oligo-agaroses de l'art antérieur a été effectuée par la technique d'électrophorèse de saccharides assistée par un fluorophore (technique FACE) (« FACE » pour « Fluorophore-Assisted Carbohydrate 5 Electrophoresis » ; par le procédé décrit dans le document Studies on the hydrolytic condition of beta-1,3 glucan from yeast by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, Huang, G. L., Liu, M. X., and Mei, X. Y. (2005), Anal. Lett. 38, 477-485 ou dans le document "The analysis of oligosaccharides derived from different sources by fluorophore-assisted 10 carbohydrate electrophoresis", Huang, G. L., Zhang, H. C., and Wang, P. G. (2007), Food Chem. 101, 392-396 [2]. Les inventeurs ont utilisé deux types de marqueurs fluorescents. Un premier marqueur, l'ANTS (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate), qui apporte une charge globalement négative aux oligosaccharides permettant 15 ainsi leur migration. Un deuxième marqueur, l'AMAC (2-aminoacridone), qui n'est pas chargé comme représenté ci-dessous. Dans ce cas, seuls les oligosaccharides intrinsèquement chargés peuvent migrer et se séparent alors selon leurs masses et de leurs charges respectives. 0- Na+ NH2 H_N ^-s- Na+ i I ° 0- 0 I Na+ 20 Formule chimique de l'ANTS Formule chimique de l'AMAC Les résultats d'analyse par chromatographie d'exclusion de taille obtenus sont représentés sous forme de chromatogramme sur la figure 1 annexée. Ce chromatogramme permet de faire une première analyse visuelle du profil du mélange d'oligo-porphyranes purifiés. Ceux-ci se répartissent de façon assez homogène sur une échelle de tailles allant jusqu'aux oligosaccharides d'un degré de polymérisation de 20 (DP20). Par ailleurs, on peut constater la présence d'un oligosaccharide majoritaire éluant à 32,3 minutes. Comme indiqué ci-dessus, les résultats d'analyse FACE permettent de comparer, sur une même expérience, les profils de migration de différents mélanges oligosaccharidiques entre eux. Ces résultats sont présentés sur la figure 2 annexée. Sur cette figure, on analyse en FACE des oligo-porphyranes obtenus par digestion du porphyrane par l'enzyme AgaB (Panel A : marquage ANTS, panel B : marquage AMAC. Les parties grisées ne sont pas exploitées ici mais conservées afin de ne pas tronquer l'image du gel d'électrophorèse. L'analyse du gel d'électrophorèse des oligosaccharides marqués à l'ANTS montre des profils de migration très différents entre le mélange d'oligo-agaroses et le mélange d'oligo-porphyranes, tous deux issus d'une digestion avec l'enzyme AgaB (sur l'agarose panel A, ligne 3, et sur le porphyrane ligne 4). Le deuxième présente en effet une migration électrophorétique plus importante, suggérant que dans ce cas, l'enzyme AgaB a libéré des oligosaccharides hybrides contenant des motifs porphyranes chargés. Ces résultats sont confortés par l'analyse des profils de migration des oligosaccharides marqués à l'AMAC. Ce fluorophore n'étant pas chargé, seuls les oligosaccharides intrinsèquement chargés peuvent migrer en électrophorèse. On constate en effet que le mélange d'oligo- agaroses ne migre pas (panel B, ligne 1) alors que le mélange d'oligosaccharides issu de la digestion de porphyrane avec AgaB est séparé par cette technique (panel B, ligne 2). On peut donc conclure qu'il s'agit bien dans ce cas d'un mélange d'oligosaccharides hybrides contenant des motifs porphyranes L6S-G. Ce mélange est qualitativement et quantitativement différent du mélange d'oligo-porphyranes obtenus après digestion du porphyrane par la porphyranase A. Cette enzyme hydrolyse en effet spécifiquement le porphyrane au niveau des motifs G- L6S, expliquant l'enrichissement en oligosaccharides de petite taille (panels A et B, cercles bleus). Le profil oligosaccharidique du mélange obtenu par digestion du porphyrane par AgaB indique par ailleurs la présence d'un composé majoritaire (panel A, flèche rouge). En marquage ANTS, ce composé migre à une hauteur comparable à celle du néoagarotétraose (panel A, ligne 2, DP4). Ce composé majoritaire est également retrouvé dans le profil de migration du même mélange marqué avec l'AMAC (panel B, flèche rouge). Ceci suggère donc que ce composé majoritaire ne correspond pas à de l'agarose auquel cas il ne pourrait pas migrer dans cette expérience. Il est en outre intéressant de voir qu'après marquage à l'ANTS, ce composé migre à une distance comparable de celle observée pour des hexasaccharides préalablement identifiés, H1-Me et H3, respectivement de composition L6S-G(Me)_LA-G_L6S-G et L6S-G_L6S-G_LA-G (panel A, lignes 6 et 7, respectivement H1-Me et H3). Ceci suggère donc que ce composé majoritaire correspond à un hexasaccharide de porphyrane. La comparaison des migrations sur gel après marquage à I'AMAC montre une co-migration des hexasaccharides H1-Me et H3 (panel B, lignes 4 et 5, respectivement H1-Me et H3) alors que le composé majoritaire du mélange d'intérêt montre avec cette technique un retard de migration. Ce retard est classiquement observé pour un hexasaccharide de type H2 de composition L6S-G LA-G LA-G du fait de la présence d'un seul motif sulfaté contre deux pour H1 et H3. La masse moléculaire de H2 est de 1 128 g/mol. Ces résultats suggèrent donc que le composé majoritairement produit dans le mélange oligosaccharidique issu de la digestion de porphyrane avec AgaB est un hexasaccharide de porphyrane de type H2. Ces oligo-porphyranes ont été obtenus par un processus d'hydrolyse enzymatique du porphyrane par l'enzyme agarolytique beta Agarase B.C. Enzymatic hydrolysis of porphyran The beta-AgaB enzyme has a specificity of hydrolysis of the agarose substrate at the beta-1,4 bond between beta-Dgalactopyranose (motif G) and 3,6-anhydro-alpha- L-galactopyranose (LA motif). The structure of the motifs G and LA constituting the agarose is shown below. The beta-AgaB enzyme hydrolyzes the bond between these two motifs. The extracted natural porphyran is a heterogeneous polysaccharide consisting of an alternation between these G-LA disaccharide units and G-L6S units where L6S corresponds to the 4-alpha-L-galactose-6-sulfate linked to the G-motif as shown. below: AgaB 3 0 2 1 2 1 9 11 The beta-AgaB enzyme can hydrolyze the bond between these two motifs. The beta-AgaB enzyme accepts the presence of L6S motifs at some of its substrate binding sub-sites. Thus, this enzyme can generate hybrid oligosaccharides with variable sequences of G-LA motifs and G-L6S motifs. The porphyran substrate is prepared at 1% by weight in distilled water (°) / 0 expressed relative to the weight of the distilled water used). Enzymatic digestion is performed by adding the AgaB enzyme at a concentration of 1 μg / ml final and incubating for 24 hours at 30 ° C. D. Purification and Analysis of the Oligoporphyrans The purification of the oligosaccharides is carried out by successive ultrafiltration of the hydrolyzate on a filtration threshold membrane fixed at 30 kDa and then on the second membrane at the threshold set at 10 kDa. The membranes used are available for sale in the Millipore catalog under the reference Centricon Catalog no. 4206 (10 kDa) and 4209 (30 kDa), marketed by Millipore. At the end of these filtration steps, according to the average theoretical molecular weight of the hybrid porphyran (400 Da for a disaccharide), the theoretical profile of the oligosaccharide mixture corresponds to oligosaccharides with a degree of polymerization (DP) of less than 25 repetitions disaccharide (DP50). The analysis of the profile is carried out by size exclusion chromatography by injecting a 0.4% oligosaccharide solution into mQ water on a Dionex ultimate (trademark) 3000 apparatus marketed by DIONEX (Sunnyvale, California) and a Superdex peptide (trademark) 10/300 marketed under the reference GE17-5176-01 in the SIGMA-ALDRICH catalog. The separation is carried out in 60 minutes under eluent lithium nitrate (LiNO3) at 100 mM. Other analyzes are carried out by electrophoretic separation of oligosaccharides previously labeled with a fluorophore. The comparison of this oligo-porphyran mixture with oligo-agaroses of the prior art was carried out by the technique of fluorophore-assisted saccharide electrophoresis (FACE technique) ("FACE" for "Fluorophore-Assisted Carbohydrate 5 Electrophoresis by the method described in Studies on the hydrolytic condition of beta-1,3 glucan from yeast by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, Huang, GL, Liu, MX, and Mei, XY (2005), Anal. 38, 477-485 or in the document "The analysis of oligosaccharides derived from different sources by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis", Huang, GL, Zhang, HC, and Wang, PG (2007), Food Chem., 101, 392 The inventors have used two types of fluorescent markers: A first marker, ANTS (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate), which provides a generally negative charge to oligosaccharides thus enabling their migration. A second mark AMAC (2-aminoacridone), which is not charged as shown below. In this case, only the oligosaccharides intrinsically charged can migrate and then separate according to their masses and their respective charges. 0 - Na + NH 2 H + N + Na + I I 0 + 0 I Na + 20 ANTS Chemical Formula AMAC Chemical Formula The size exclusion chromatographic analysis results obtained are shown in the form of a chromatogram. in Figure 1 attached. This chromatogram makes it possible to make a first visual analysis of the profile of the mixture of purified oligo-porphyrans. These are distributed fairly homogeneously on a scale of sizes up to oligosaccharides with a degree of polymerization of 20 (DP20). Moreover, it can be seen the presence of a majority oligosaccharide eluting at 32.3 minutes. As indicated above, the FACE analysis results make it possible to compare, on the same experiment, the migration profiles of different oligosaccharide mixtures with each other. These results are presented in the appended FIG. In this figure, we analyze in FACE porphyran oligomers obtained by digestion of porphyran by the enzyme AgaB (Panel A: ANTS marking, panel B: AMAC marking) The shaded parts are not exploited here but preserved in order not to truncate electrophoresis gel image Analysis of the electrophoresis gel of ANTS labeled oligosaccharides shows very different migration profiles between the oligo-agarose mixture and the oligo-porphyran mixture, both from digestion with the enzyme AgaB (on the agarose panel A, line 3, and on the porphyran line 4) The second has indeed a greater electrophoretic migration, suggesting that in this case, the enzyme AgaB hybrid oligosaccharides containing charged porphyran units, which are supported by the analysis of the migration profiles of AMAC-labeled oligosaccharides.This fluorophore is not charged, only the oligosaccharides intrinsically t loaded can migrate in electrophoresis. It can be seen that the oligo-agarose mixture does not migrate (panel B, line 1) whereas the mixture of oligosaccharides resulting from the digestion of porphyran with AgaB is separated by this technique (panel B, line 2). It can thus be concluded that it is indeed in this case a mixture of hybrid oligosaccharides containing L6S-G porphyran units. This mixture is qualitatively and quantitatively different from the oligo-porphyran mixture obtained after porphyran digestion by porphyranase A. This enzyme specifically hydrolyzes the porphyran at the G-L6S units, explaining the enrichment of small oligosaccharides ( panels A and B, blue circles). The oligosaccharide profile of the mixture obtained by digestion of the porphyran with AgaB also indicates the presence of a major compound (panel A, red arrow). In ANTS labeling, this compound migrates at a height comparable to that of neoagarotetraosis (panel A, line 2, DP4). This major compound is also found in the migration profile of the same mixture labeled with AMAC (panel B, red arrow). This suggests that this major compound does not correspond to agarose in which case it could not migrate in this experiment. It is also interesting to see that, after labeling with ANTS, this compound migrates at a distance comparable to that observed for previously identified hexasaccharides, H1-Me and H3, respectively of composition L6S-G (Me) _LA-G_L6S -G and L6S-G_L6S-G_LA-G (panel A, lines 6 and 7, respectively H1-Me and H3). This suggests that this major compound corresponds to a porphyran hexasaccharide. The comparison of the gel migrations after labeling with AMAC shows a co-migration of hexasaccharides H1-Me and H3 (panel B, lines 4 and 5, respectively H1-Me and H3) whereas the majority compound of the mixture of interest shows with this technique a migration delay. This delay is conventionally observed for a type H hexasaccharide L6S-G LA-G LA-G composition due to the presence of a single sulfated unit against two for H1 and H3. The molecular weight of H2 is 1128 g / mol. These results therefore suggest that the compound mainly produced in the oligosaccharide mixture resulting from the digestion of porphyran with AgaB is a type H2 porphyran hexasaccharide. These oligo-porphyrans were obtained by a process of enzymatic hydrolysis of porphyran by the agarolytic enzyme beta Agarase B.

E. Analyses RMN Une analyse 1H RMN (500 MHz) spectre des oligosaccharides L6S-G-LA-G-L6S-G non-methylé (A) et methylé (B), tel que comparé à la fraction haut poids moléculaire des oligosaccharides hybrides (C), et du neo-agarotetraose (D) est réalisée suivant le procédé décrit dans les documents [3] et [4] indiqués ci-dessous. Les résultats d'analyse sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous, et sur la figure 8 annexée. Tableau 1 : 1H RMN signaux en (Ô) ppm des unités L6S et G, observé à 25°C tel que dans le disaccharide (L6S-G), tetrasaccharide (L6S-G)2 et le polymère (L6S-G)n. Tableau 1 (L6S-G) (L6S-G)2 (L6S-G)n (L6S-G) (L6S-G)2 (L6S-G)n Gra H-1 5.29 5.30 L6SCa H-1 5.25 5.30 GrI3 H-1 4.65 4.65 L6SCI3 H-1 5.24 5.30 Gnr' H-1 - 4.49 L6Snr H-1 5.25 G H-1 - 4.50 L6S H-1 5.33 Gra H-2 3.99 4.00 L6SCa H-2 3.84 3.90 GrI3 H-2 3.66 3.68 L6SCI3 H-2 3.84 3.90 Gnr' H-2 - 3.76 L6Snr H-2 3.84 G - - 3.76 L6S H-2 3.92 Gra H-3 3.94 3.95 L6SCa H-3 3.95 3.98 GrI3 H-3 3.73 3.75 L6SCI3 H-3 3.95 3.98 Gnr' H-3 - 3.75 L6Snr H-3 3.95 G - - 3.76 L6S H-3 3.98 Gra H-4 4.25 4.26 L6SCa H-4 4.05 4.31 GrI3 H-4 4.19 4.20 L6SCI3 H-4 4.05 4.31 Gnr' H-4 - 4.20 L6Snr H-4 4.06 G - - 4.21 L6S H-4 4.31 Gra H-5 4.12 4.13 L6SCa H-5 4.31 4.42 GrI3 H-5 3.72 3.76 L6SCI3 H-5 4.31 4.42 Gnr' H-5 - 3.74 L6Snr H-5 4.30 G - - 3.82 L6S H-5 4.42 Gra H-6a 3.75 3.78 L6SCa H-6a 4.16 4.32 GrI3 H-6a 3.75 3.76 L6SCI3 H-6a 4.16 4.32 Gnr' H-6a - 3.74 L6Snr H-6a 4.16 G - - 3.78 L6S H-6a 4.31 Gra H-6b 3.77 3.78 L6SCa H-6b 4.23 4.32 GrI3 H-6b 3.77 3.76 L6SCI3 H-6b 4.23 4.32 Gnr' H-6b - 3.74 L6Snr H-6b 4.23 G - - 3.78 L6S H-6b 4.31 Structure des oligosaccharides hybrides L6S-G/LA-G : Pour la mesure des spectres en RMN du proton, tous les échantillons ont été solubilisés en D20 et deux fois échangés. Les spectres ont été enregistrés sur un spectromètre 500 MHz Bruker NMR (Service de RMN, Université Bretagne10 Occidentale, Brest, France). Les spectres d'oligosaccharide ont été enregistrés à 25°C avec 16 scans. Les déplacements chimiques sont indiqués en ppm par rapport à un standard externe TSP (trimethylsilylpropionic acid). Tous les signaux RMN des protons et carbones ont pu être entièrement attribués en utilisant des spectres COSY (doublequantum-filtered correlation spectroscopy), HMQC (heteronuclear multiple quantum correlation) et HMBC (heteronuclear multiple bond correlation). D'autres oligosaccharides peuvent donc être caractérisés en comparaison avec ces structures obtenues sur les oligo-porphyranes pures (Correc G., Hehemann J.H., Czjzek M., Helbert W. (2011) Structural analysis of the degradation products of porphyran digested by Zobellia galactanivorans 13-porphyranase A. Carbohydrate Polymers 83, 277-283) [3]. D'autres structures ont été caractérisées par les mêmes techniques et en comparaison avec la structure obtenue pour le disaccharide porphyrane. Les spectres 1H-NMR des hexa-oligosaccharides hybride H2 et H3, produits par l'enzyme AgaB de la figure 8 démontrent les caractéristiques de la présence des oligosaccharides L6S-G, tels que décrits et attribués selon Correc et al. Nous avons ainsi pu identifier les signaux qui 2 0 correspondent à ceux des protons a-anomeric des terminaisons non- réductrice (L6S-H1nr) dans la partie la plus éloignée du spectre (vers les 5.3 ppm). En revanche, les protons I3-anomeric du côté réducteur des chaînes hexa-saccharidiques sont ceux du LAT et G (Lar-H1= 5.13 ppm GrI3-H1= 4.65 ppm), comparables à ceux déterminés pour l'agarose décrite 25 dans Kazlowski, B.,Pan,C.L.,&Ko,Y.T.(2008).Separation and quantification of neoagaro- and agaro-oligosaccharide products generated from agarose digestion by beta-agarase and HCI in liquid chromatography systems. Carbohydrate Research, 343, 2443-2450 [4]. Le spectre du hexasaccharide H2 contient les signaux du H1-LA interne alors que le 3 0 spectre du H3 des signaux du H1-L65 interne. En conclusion, nous pouvons en déduire que le H2 est le hexasaccharide Po-Ag-Ag et le hexasaccharide H3 Po-Po-Ag. 3 0 2 1 2 1 9 17 Exemple 2: Mesure de l'activité immunostimulante in vitro sur cellules 2.1 Préparation du composé à tester sur cellules A l'issue des étapes d'ultrafiltration du digestat obtenu à 5 l'exemple 1, le filtrat obtenu est lyophilisé. Le composé obtenu est alors repris à 40 g/I dans du tampon phosphate salin (PBS). Cette solution « mère » permet de préparer les dilutions successives qui sont testées sur les cellules. Dans cet exemple, des concentrations de 0,4 g/I, 0,2 g/I et 0,1 g/I d'oligoporphyrane ont été testées. 10 2.2. Mesure de la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages Les inventeurs démontrent ici que les oligoporphyranes de la présente invention stimulent, chez les macrophages, la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF-alpha (« Tumor Necrosis factor alpha ») à 15 des niveaux comparables à ceux communément observés lors d'une stimulation par le lipopolysaccharide bactérien (LPS). Les tests sont effectués in vitro sur des cellules humaines en culture. 2 0 2.2.1. Culture cellulaire Les cellules utilisées dans cet exemple sont les monocytes THP-1 isolés à partir du sang d'un enfant âgé d'un an atteint d'une leucémie monocytaire aigüe, comme décrit dans le document « Establishment and characterization of a human acute monocytic 25 leukemia cell line (THP-1) », Tsuchiya S. et al., Int J Cancer 26 : 171-176 (1980) [5]. Elles sont disponibles sous la référence ATCC TIB 202TM (American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108 USA, www.atcc.org Elles sont cultivées dans le milieu de culture RPMI 1640 + 30 Glutamax (marque déposée) (Life technologies) supplémenté avec 10% en volume de sérum de veau foetal (s-RPMI), à 37°C sous une atmosphère enrichie à 5% en volume de CO2 par rapport au volume d'air initial.E. NMR Assays 1H NMR (500 MHz) spectrum analysis of non-methylated (A) and methylated (B) L6S-G-LA-G-L6S-G oligosaccharides, as compared to the high molecular weight fraction of hybrid oligosaccharides (C), and neo-agarotetraose (D) is carried out according to the method described in documents [3] and [4] indicated below. The results of analysis are shown in Table 1 below, and in Figure 8 attached. Table 1: 1H NMR signals in (δ) ppm units L6S and G, observed at 25 ° C as in the disaccharide (L6S-G), tetrasaccharide (L6S-G) 2 and the polymer (L6S-G) n. Table 1 (L6S-G) (L6S-G) 2 (L6S-G) n (L6S-G) (L6S-G) 2 (L6S-G) n Gra H-1 5.29 5.30 L6SCa H-1 5.25 5.30 GrI3 H 4.65 L6SCI3 H-1 5.24 5.30 Gnr H-1 - 4.49 L6Snr H-1 5.25 G H-1 - 4.50 L6S H-1 5.33 Gra H-2 3.99 4.00 L6SCa H-2 3.84 3.90 GrI3 H-2 3.66 3.68 L6SCI3 H-2 3.84 3.90 Gnr H-2 - 3.76 L6Snr H-2 3.84 G - - 3.76 L6S H-2 3.92 Gra H-3 3.94 3.95 L6SCa H-3 3.95 3.98 GrI3 H-3 3.73 3.75 L6SCI3 H-3 3.95 3.98 Gnr H-3 - 3.75 L6Snr H-3 3.95 G - - 3.76 L6S H-3 3.98 Gra H-4 4.25 4.26 L6SCa H-4 4.05 4.31 Grl3 H-4 4.19 4.20 L6SCI3 H-4 4.05 4.31 Gnr H -4 - 4.20 L6Snr H-4 4.06 G - - 4.21 L6S H-4 4.31 Gra H-5 4.12 4.13 L6SCa H-5 4.31 4.42 GrI3 H-5 3.72 3.76 L6SCI3 H-5 4.31 4.42 Gnr H-5 - 3.74 L6Snr H-5 4.30 G - - 3.82 L6S H-5 4.42 Gra H-6a 3.75 3.78 L6SCa H-6a 4.16 4.32 GrI3 H-6a 3.75 3.76 L6SCI3 H-6a 4.16 4.32 Gnr H-6a - 3.74 L6Snr H-6a 4.16 G - - 3.78 L6S H-6a 4.31 Gra H-6b 3.77 3.78 L6SCa H-6b 4.23 4.32 Grl3 H-6b 3.77 3.76 L6SCI3 H-6b 4.23 4.32 Gnr H-6b - 3.74 L6Snr H-6b 4.23 G - - 3.78 L6S H -6b 4.31 Structure of L6S-G / LA-G hybrid oligosaccharides: For the measurement of the proton NMR spectra, all the samples were solubilized in D20 and twice exchanged. The spectra were recorded on a 500 MHz Bruker NMR spectrometer (NMR service, Bretagne Bretagne Ouest University, Brest, France). Oligosaccharide spectra were recorded at 25 ° C with 16 scans. The chemical shifts are indicated in ppm relative to an external standard TSP (trimethylsilylpropionic acid). All proton and carbon NMR signals could be fully assigned using doublequantum-filtered correlation spectroscopy (COHC), heteronuclear multiple quantum correlation (HMQC), and heteronuclear multiple bond correlation (HMBC). Other oligosaccharides can therefore be characterized in comparison with these structures obtained on pure oligosporphyranes (Correc G., Hehemann JH, Czjzek M., Helbert W. (2011) Structural analysis of the degradation products of porphyran digested by Zobellia galactanivorans 13-Porphyranase A. Carbohydrate Polymers 83, 277-283) [3]. Other structures have been characterized by the same techniques and in comparison with the structure obtained for the porphyran disaccharide. The 1H-NMR spectra of hybrid H 2 and H 3 hexa-oligosaccharides produced by the AgaB enzyme of Figure 8 demonstrate the characteristics of the presence of L6S-G oligosaccharides, as described and assigned according to Correc et al. We were able to identify the signals corresponding to those of the α-anomeric protons of the non-reducing termini (L6S-H1nr) in the furthest part of the spectrum (towards the 5.3 ppm). On the other hand, the I3-anomeric protons on the reducing side of the hexasaccharide chains are those of LAT and G (Lar-H1 = 5.13 ppm GrI3-H1 = 4.65 ppm), comparable to those determined for the agarose described in Kazlowski. B., Pan, CL, & Ko, YT (2008) .Separation and quantification of neoagaro- and agaro-oligosaccharide products produced from agarose digestion by beta-agarase and HCI in liquid chromatography systems. Carbohydrate Research, 343, 2443-2450 [4]. The H2 hexasaccharide spectrum contains the internal H1-LA signals while the H3 spectrum of the internal H1-L65 signals. In conclusion, we can deduce that H2 is the Po-Ag-Ag hexasaccharide and the H3 Po-Po-Ag hexasaccharide. EXAMPLE 2 Measurement of In Vitro Immunostimulatory Activity on Cells 2.1 Preparation of the Test Compound on Cells After the ultrafiltration steps of the digestate obtained in Example 1, the filtrate obtained is lyophilized. The compound obtained is then taken up in 40 g / l in phosphate buffered saline (PBS). This "mother" solution makes it possible to prepare the successive dilutions that are tested on the cells. In this example, concentrations of 0.4 g / I, 0.2 g / I and 0.1 g / I of oligoporphyran were tested. 2.2 2.2. Measurement of the Secretion of TNF-alpha by Macrophages The inventors here demonstrate that the oligoporphyrans of the present invention stimulate, in macrophages, the secretion of the pro-inflammatory cytokine TNF-alpha ("Tumor Necrosis factor alpha") at 15%. levels comparable to those commonly observed during bacterial lipopolysaccharide (LPS) stimulation. The tests are carried out in vitro on human cells in culture. 2.2.1. Cell Culture The cells used in this example are THP-1 monocytes isolated from the blood of a one-year-old child with acute monocytic leukemia, as described in the document "Establishment and Characterization of a Human Monocytic". Leukemia cell line (THP-1) ", Tsuchiya S. et al., Int J Cancer 26: 171-176 (1980) [5]. They are available under the reference ATCC TIB 202TM (American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108 USA, www.atcc.org They are grown in culture medium RPMI 1640 + 30 Glutamax (registered trademark) (Life Technologies) supplemented with 10 % by volume of fetal calf serum (s-RPMI) at 37 ° C under an atmosphere enriched to 5% by volume of CO2 relative to the initial volume of air.

Les cellules présentent une morphologie ronde et croissent en suspension avec formation de grappes (figure 3, panel de gauche). L'ensemencement se fait à 1 105 cellules/ml et la culture est diluée lorsque que la concentration cellulaire atteint 1x106 cellules/ml. 2.2.2. Obtention des macrophages Les macrophages sont obtenus par différenciation des monocytes THP-1 avec le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme décrit dans le document « Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester », Tsuchiya S. et al., Cancer Res 42 : 1530-1536 (1982) [6]. Les monocytes sont lavés et repris à 1 106 cellules/ml dans le milieu de culture RPMI 1640 + Glutamax (marque déposée) non supplémenté en sérum auquel est ajouté 200nM de PMA (Sigma Aldrich).The cells have a round morphology and grow in suspension with cluster formation (Figure 3, left panel). Seeding is at 10 cells / ml and the culture is diluted when the cell concentration reaches 1x106 cells / ml. 2.2.2. Obtaining macrophages Macrophages are obtained by differentiation of THP-1 monocytes with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) as described in the document "Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester", Tsuchiya S. et al., Cancer Res 42: 1530-1536 (1982) [6]. The monocytes are washed and taken up to 1 × 10 6 cells / ml in the RPMI 1640 + Glutamax (registered trademark) non-supplemented serum culture medium to which 200nM of PMA (Sigma Aldrich) is added.

Les cellules sont alors rapidement transférées dans des plaques de culture cellulaires 12 puits dans lesquels seront effectués les traitements par les oligo-porphyranes de la présente invention. Chaque puit (3,8 cm2) est ensemencé par 1 ml de la suspension cellulaire (1 106 cellules) et les cellules sont incubées pendant 24 à 48 heures à 37°C sous 5% de CO2. A l'issue de cette période de différenciation, la majorité des cellules adhère au fond des puits de culture et les cellules adoptent une morphologie de type macrophage, ce qui est observable sur la figure 3 (panel de droite).The cells are then rapidly transferred to 12-well cell culture plates in which the oligo-porphyran treatments of the present invention will be carried out. Each well (3.8 cm 2) is inoculated with 1 ml of the cell suspension (1 106 cells) and the cells are incubated for 24 to 48 hours at 37 ° C. under 5% of CO2. At the end of this period of differentiation, the majority of the cells adhere to the bottom of the culture wells and the cells adopt a macrophage type morphology, which can be seen in FIG. 3 (right panel).

Les monocytes en culture sont observables sous formes de cellules rondes en suspension dans le milieu de culture, avec formation de grappes (figure 3, gauche). Le traitement au PMA à une concentration de 200 nM entraîne rapidement l'adhésion des cellules au fond du puits de culture. Les cellules deviennent plus granuleuses et adoptent une forme plus allongée avec des extensions cytoplasmiques (figure 3, droite). Ces caractères morphologiques indiquent, pour ce type cellulaire, une différenciation des monocytes en macrophages. 3 0 2 1 2 1 9 19 Sur cette figure 3, Les flèches indiquent les extensions cytoplasmiques (grossissement x200, observation à 30 heures après traitement au PMA pour la photographie de droite). 5 2.2.3. Traitement des macrophages Le milieu de différenciation est éliminé et les cellules lavées dans 1m1 de PBS puis 1m1 de s-RPMI afin d'éliminer le PMA ainsi que les cellules non adhérentes. Les cellules adhérées au fond des puits sont reprises dans 1 ml 10 de milieu s-RPMI pour les traitements. Les cellules sont traitées pour une durée de 24 heures par les oligo-porphyranes aux concentrations de 0,4 g/I, 0,2 g/I et 0,1 g/I. Le témoin négatif correspond aux cellules incubées sans ajout de composé. Six puits sont utilisés pour chaque concentration testée. 15 Les cellules sont observées au microscope après 24 heures de traitement avec les oligo-porphyranes, avant traitement secondaire au LPS La photographie de gauche de la figure 4 annexée présente l'une de ces observations. A l'issue de cette étape, pour chaque concentration testée, 3 20 puits sont utilisés afin de poursuivre l'incubation des cellules en présence de lipopolysaccharides bactériens à la concentration de 0,1 pg/ml (LPS d'Escherichia coli sérotype 0111:B4, réf. L2630 Sigma Aldrich) pendant 6 heures suivant le procédé décrit dans le document, Takashiba et al., Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for 25 lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kappaBj 1999, Infect. & Immun. Nov.67(11) 5573-8 [7]. Le LPS est reconnu pour stimuler la sécrétion de TNF-alpha chez ces cellules, comme décrit dans le document, Wright et al., CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS Binding protein, sept. 1990, Science 30 Vol.249:4975 pp 1431-1433 [8]. Ainsi, chaque condition est testée en triplicata indépendants. La photographie de droite de la figure 4 présente l'une des observations faites à l'issue de cette étape. En comparaison avec les macrophages non traités (figure 4, gauche), on remarque une accentuation des caractères morphologiques caractéristiques des macrophages, notamment une proportion plus grande de cellules allongées avec extensions cytoplasmiques (figure 4, droite).The monocytes in culture are observable in the form of round cells suspended in the culture medium, with the formation of clusters (FIG. 3, left). PMA treatment at a concentration of 200 nM rapidly causes the cells to adhere to the bottom of the culture well. The cells become more granular and adopt a more elongated shape with cytoplasmic extensions (Figure 3, right). These morphological characters indicate, for this cell type, a differentiation of monocytes into macrophages. In this figure 3, the arrows indicate the cytoplasmic extensions (x200 magnification, observation at 30 hours after PMA treatment for the right photograph). 5 2.2.3. Macrophage Treatment The differentiation medium is removed and the cells washed in 1m1 PBS and then 1m1 s-RPMI to remove PMA as well as non-adherent cells. The cells adhered to the bottom of the wells are taken up in 1 ml of s-RPMI medium for the treatments. The cells are treated for a period of 24 hours with the oligo-porphyranes at concentrations of 0.4 g / I, 0.2 g / I and 0.1 g / I. The negative control corresponds to the cells incubated without addition of compound. Six wells are used for each concentration tested. The cells are observed under a microscope after 24 hours of treatment with the oligo-porphyrans, before secondary treatment with LPS. The left-hand photograph of the appended FIG. 4 shows one of these observations. At the end of this step, for each concentration tested, 3 wells are used in order to continue the incubation of the cells in the presence of bacterial lipopolysaccharides at a concentration of 0.1 μg / ml (Escherichia coli LPS serotype 0111: B4, ref L2630 Sigma Aldrich) for 6 hours following the method described in the document, Takashiba et al., Differentiation of monocytes to macrophage premium cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kappaBj 1999, Infect. & Immun. Nov.67 (11) 5573-8 [7]. LPS is known to stimulate TNF-alpha secretion in these cells, as described in Wright et al., CD14, receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein, Sept. 1990, Science 30 Vol. .249: 4975 pp 1431-1433 [8]. Thus, each condition is tested in independent triplicates. The right-hand photograph of Figure 4 presents one of the observations made at the end of this step. In comparison with untreated macrophages (Figure 4, left), we notice an accentuation of morphological characteristics characteristic of macrophages, including a greater proportion of elongated cells with cytoplasmic extensions (Figure 4, right).

Ces observations démontrent que les oligo-porphyranes de la présente invention exacerbent le phénotype macrophagique des cellules. 2.2.4. Mesure du relargaqe de TNF-alpha par les macrophages : test ELISA La mesure de la sécrétion de TNF-alpha se fait dans le surnageant de culture des macrophages par un dosage en ELISA (« enzyme-linked immunosorbent assay »). Le protocole utilisé est celui décrit dans le document E. Engvall et P. Perlman, « Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G », Immunochemistry, vol. 8, pages 871-874, 1971. PMID : 5135623 [9]. Les conditions opératoires et matériel utilisé sont décrits ci-dessous. Ce test est effectué en plaques 96 puits. Brièvement, le fond des puits est enrobé d'un premier anticorps reconnaissant spécifiquement le TNF-alpha. Cet anticorps va permettre de capturer et d'isoler le TNF- alpha présent dans le surnageant de culture. Un deuxième anticorps biotinylé est ensuite ajouté afin de détecter les molécules de TNF-alpha préalablement capturées. Cet anticorps est alors spécifiquement détecté par l'ajout de la streptavidine couplée à une enzyme peroxydase (HRP). L'ajout d'un substrat chromogénique de la peroxydase permet alors de mesurer en spectrophotométrie la quantité de TNF-alpha initiale présente dans le surnageant testé. Ce calcul se fait par l'établissement, en parallèle, d'une courbe étalon à partir d'une gamme de concentrations de TNF-alpha recombinant allant de 15,6 pg/I à 2000 pg/ml (figure 8). Une mesure étalon est également réalisée en l'absence de TNF-alpha (TNF- alpah = 0 pg/ml). Cette gamme est utilisée afin de définir l'équation de proportionnalité entre les mesures d'absorbances effectuées à l'issue du dosage ELISA et les concentrations de TNF-alpha. La régression linéaire est obtenue en passant les valeurs de concentration de TNF-alpha et d'absorbance correspondantes en échelle log10. La figure 5 annexée montre la courbe étalon ainsi obtenue, de régression linéaire du logarithme de l'absorbance (ordonnées) en fonction du logarithme de la concentration de TNF-alpha (abscisses). La réaction chromogénique est stoppée par l'ajout d'acide sulfurique et la lecture est effectuée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 450nm avec une correction automatique à 540nm. Chaque surnageant de culture à l'issue de l'étape précédente a fait l'objet de deux tests ELISA indépendants. Ainsi, pour chaque condition de traitement nous avons obtenu 6 valeurs d'absorbance. Le matériel, les produits, les tampons, le temps d'incubation, les concentrations d'utilisation des différents réactifs, et les références pour cet exemple sont les suivants : - anticorps de capture (réf. MAB610, R&D Systems) : 2 pg/ml dans le PBS ; 100 pl par puits ; incubation sur la nuit à température ambiante ; - TNF-alpha recombinant (réf. 210-TA, R&D Systems) : dilution dans TBST-BSA ; 100 pl de chaque dilution dans les puits de la gamme étalon ; incubation 2 heures à température ambiante ; - Surnageants de culture : 100 pl par puits ; incubation 2 heures à température ambiante ; - anticorps de détection (réf. BAF210, R&D Systems) : 50 ng/ml dans le tampon Tris NaCI 0,1% BSA 0,05% Tween20 (TBST- BSA) ; 100 pl par puits ; incubation 2 heures à température ambiante ; - Streptavidine-HRP (réf. 43-4323, 1,25 mg/ml, Invitrogen) : utilisation au 1:20000è dans le TBST-BSA ; 100 pl par puits ; incubation de 20 minutes à température ambiante ; - Substrat chromogénique : 3,3',5,5'-Tétramethylbenzidine (TMB) (réf. T5525, Sigma) : dissolution à 0,1 mg/ml dans un tampon phosphate-citrate 0,05 M ; 100 pl par puits ; incubation 20-30 minutes à température ambiante ; - Acide sulfurique : 0,5 M ; 100 pl par puits ; - Lecteur de microplaques : Safire2 (marque de commerce), TECAN Ltd. 2.2.5 Effet des oligo-porphyranes sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages Les inventeurs de la présente on souhaité observer l'effet de la sulfatation des oligosaccharides sur leur activité biologique. Ainsi, ils ont comparé l'effet sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1 d'un traitement des macrophages aux oligo-porphyranes (oligo-por) à l'effet d'un traitement aux oligo-agaroses (oligo-aga), mélange de DP8 à DP22, dans les conditions opératoires décrites ci-dessus. Les traitements sont effectués à la concentration de 0,4 g/L. Le LPS est utilisé à 0,1 pg/m I. Les résultats de ces expérimentations sont présentés sur la figure 6 annexée. Ces résultats montrent qu'alors que des concentrations très discrètes de TNF-alpha sont détectables dans les surnageants de culture des macrophages non traités, un traitement au LPS induit une très forte augmentation de la sécrétion de TNF-alpha à des niveaux supérieurs à 1000 pg/m I de surnageant de culture.These observations demonstrate that the oligo-porphyrans of the present invention exacerbate the macrophage phenotype of the cells. 2.2.4. Measurement of TNF-alpha Relargaqe by Macrophages: ELISA Test The measurement of TNF-alpha secretion is carried out in the macrophage culture supernatant by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The protocol used is that described in E. Engvall and P. Perlman, "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G, Immunochemistry, vol. 8, pp. 871-874, 1971. PMID: 5135623 [9]. The operating conditions and equipment used are described below. This test is performed in 96-well plates. Briefly, the bottom of the wells is coated with a first antibody specifically recognizing TNF-alpha. This antibody will make it possible to capture and isolate the TNF-alpha present in the culture supernatant. A second biotinylated antibody is then added to detect the previously captured TNF-alpha molecules. This antibody is then specifically detected by the addition of streptavidin coupled to a peroxidase enzyme (HRP). The addition of a chromogenic substrate of the peroxidase then makes it possible to measure, in spectrophotometry, the amount of initial TNF-alpha present in the supernatant tested. This calculation is made by establishing, in parallel, a standard curve from a range of recombinant TNF-alpha concentrations ranging from 15.6 μg / l to 2000 μg / ml (FIG. 8). A standard measurement is also carried out in the absence of TNF-alpha (TNF-alpah = 0 μg / ml). This range is used to define the proportionality equation between the absorbance measurements made at the end of the ELISA assay and the TNF-alpha concentrations. The linear regression is obtained by passing the corresponding TNF-alpha concentration and absorbance values in log10 scale. The appended FIG. 5 shows the standard curve thus obtained, of linear regression of the logarithm of the absorbance (ordinates) as a function of the logarithm of the concentration of TNF-alpha (abscissa). The chromogenic reaction is stopped by the addition of sulfuric acid and the reading is carried out spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm with an automatic correction at 540 nm. Each culture supernatant at the end of the previous step was subjected to two independent ELISA tests. Thus, for each treatment condition we obtained 6 absorbance values. The material, the products, the buffers, the incubation time, the concentrations of use of the different reagents, and the references for this example are the following: capture antibody (ref MAB610, R & D Systems): 2 pg / ml in PBS; 100 μl per well; incubation on the night at room temperature; - recombinant TNF-alpha (ref 210-TA, R & D Systems): dilution in TBST-BSA; 100 μl of each dilution in the wells of the standard range; incubation for 2 hours at room temperature; - Culture supernatants: 100 μl per well; incubation for 2 hours at room temperature; detection antibody (ref BAF210, R & D Systems): 50 ng / ml in Tris 0.1% NaCl 0.1% BSA buffer Tween20 (TBST-BSA); 100 μl per well; incubation for 2 hours at room temperature; Streptavidin-HRP (ref 43-4323, 1.25 mg / ml, Invitrogen): 1: 20000 use in TBST-BSA; 100 μl per well; incubation for 20 minutes at room temperature; Chromogenic substrate: 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) (code T5525, Sigma): dissolution at 0.1 mg / ml in a 0.05 M phosphate-citrate buffer; 100 μl per well; incubation for 20-30 minutes at room temperature; - Sulfuric acid: 0.5 M; 100 μl per well; - Microplate reader: Safire2 (trademark), TECAN Ltd. 2.2.5 Effect of oligo-porphyrans on the secretion of TNF-alpha by macrophages The inventors of the present it is desired to observe the effect of sulfation of oligosaccharides on their biological activity. Thus, they compared the effect on the secretion of TNF-alpha by THP-1 macrophages from a treatment of macrophages with oligo-porphyrans (oligo-por) to the effect of a treatment with oligoagaroses (oligo-pores). -aga), a mixture of DP8 to DP22, under the operating conditions described above. The treatments are carried out at a concentration of 0.4 g / L. LPS is used at 0.1 μg / m I. The results of these experiments are presented in the attached FIG. These results show that while very discrete concentrations of TNF-alpha are detectable in the culture supernatants of untreated macrophages, treatment with LPS induces a very strong increase in the secretion of TNF-alpha at levels greater than 1000 μg. / m of culture supernatant.

Ces contrôles internes à l'expérience montrent que cette approche expérimentale est utilisable pour étudier l'effet de composés sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages. On constate qu'un traitement aux oligo-agaroses entraîne une stimulation de la sécrétion de TNF-alpha. Cet effet est beaucoup plus marqué lorsque les macrophages sont incubés en présence d'oligo- porphyranes. Dans le cas d'un traitement simultané des macrophages avec les oligo-porphyranes et le LPS, il est intéressant de constater que la stimulation de la sécrétion de TNF-alpha est amplifiée en comparaison d'un traitement au LPS seul. Ce résultat paraîssent indiquer que les oligo- porphyranes et le LPS agissent de façon additive ou synergique, suggérant l'activation de voies de signalisations intracellulaires identiques ou complémentaires.These internal controls show that this experimental approach can be used to study the effect of compounds on the secretion of TNF-alpha by macrophages. It is found that a treatment with oligo-agaroses causes a stimulation of the secretion of TNF-alpha. This effect is much more marked when the macrophages are incubated in the presence of oligopepyrranes. In the case of simultaneous treatment of macrophages with oligo-porphyrans and LPS, it is interesting to note that the stimulation of TNF-alpha secretion is amplified compared to a treatment with LPS alone. This result suggests that oligopeptiphines and LPS act additively or synergistically, suggesting the activation of identical or complementary intracellular signaling pathways.

En conclusion, ces résultats indiquent que les oligo-porphyranes sont capables d'activer une réponse de type inflammatoire chez les macrophages par la stimulation de la sécrétion de TNF-alpha. Par ailleurs, la forte différente de stimulation induite par les oligo-porphyranes par rapport à celle qui est induite par les oligo-agaroses suggère un rôle important joué par les motifs sulfatés présents dans les oligo-porphyranes. Afin de prouver la spécificité de cette stimulation, les inventeurs ont testé l'effet de doses croissantes d'oligo-porphyranes sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1. Les résultats obtenus correspondants sont représentés sur la figure 7 annexée sur laquelle les concentrations d'oligo-porphyranes sont indiquées en g/I. Ces résultats confirment que les oligo-porphyranes stimulent la sécrétion de TNF-alpha chez les macrophages, et ce, de façon proportionnelle à la dose de composés utilisée pour effectuer les traitements. En outre, dans cette expérience, dans le cas de co-traitement, malgré les barres d'erreur, nous observons une fluctuation de la réponse des macrophages en fonction des doses croissantes d'oligo-porphyranes testées. Ces variations viennent renforcer le fait que les oligo-porphyranes agissent probablement via des voies de signalisation associées ou identiques. Les activités biologiques que les inventeurs ont pu mettre en évidence seraient le fait d'une molécule unique. Les résultats expérimentaux montrent en effet qu'il pourrait bien correspondre au composé majoritaire mis en évidence dans l'exemple 1, visible sur les analyses électrophorétiques de la figure 2 annexée. Ce composé n'est en effet pas présent dans d'autres fractions d'oligo-porphyranes qui semblent ne pas présenter d'activité biologique dans d'autres tests préliminaires en comparaison avec le mélange étudié ici.In conclusion, these results indicate that oligo-porphyrans are able to activate an inflammatory response in macrophages by stimulating TNF-alpha secretion. Moreover, the strong difference in stimulation induced by oligo-porphyrans compared to that which is induced by the oligo-agaroses suggests an important role played by the sulphated units present in the oligo-porphyrans. In order to prove the specificity of this stimulation, the inventors tested the effect of increasing doses of oligo-porphyrans on the secretion of TNF-alpha by macrophages THP-1. The corresponding results obtained are shown in the appended FIG. 7, in which the concentrations of oligo-porphyrans are indicated in g / l. These results confirm that oligo-porphyrans stimulate the secretion of TNF-alpha in macrophages, in a manner proportional to the dose of compounds used to perform the treatments. Moreover, in this experiment, in the case of co-treatment, despite the error bars, we observe a fluctuation of the macrophage response as a function of the increasing doses of oligo-porphyrans tested. These variations reinforce the fact that the oligo-porphyrans probably act via associated or identical signaling pathways. The biological activities that the inventors were able to highlight would be the fact of a single molecule. The experimental results show indeed that it could well correspond to the majority compound demonstrated in Example 1, visible on the electrophoretic analyzes of Figure 2 attached. This compound is in fact not present in other fractions of oligo-porphyrans which seem not to exhibit biological activity in other preliminary tests in comparison with the mixture studied here.

3 02 12 1 9 24 Listes des références [1] FR 2 779 738 déposée par GOEMAR SA LAB, France. [2] Huang, G. L., Liu, M. X., and Mei, X. Y., "Studies on the hydrolytic 5 condition of beta-1,3 glucan from yeast by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis", (2005), Anal. Lett. 38, 477-485 ou dans le document The analysis of oligosaccharides derived from different sources by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, Huang, G. L., Zhang, H. C., and Wang, P. G. (2007), 10 Food Chem. 101, 392-396. [3] Correc G., Hehemann J.H., Czjzek M., Helbert W. (2011) Structural analysis of the degradation products of porphyran digested by Zobellia galactanivorans p-porphyranase A. Carbohydrate Polymers 83, 277-283. 15 [4] Kazlowski, B.,Pan,C.L.,&Ko,Y.T.(2008).Separation and quantification of neoagaro- and agaro-oligosaccharide products generated from agarose digestion by beta-agarase and HCI in liquid chromatography systems. Carbohydrate Research, 343, 2443-2450. [5] Tsuchiya S. et al., "Establishment and characterization of a human 20 acute monocytic leukemia cell line (THP-1)", Int J Cancer 26 : 171- 176 (1980). [6] Tsuchiya S. et al., "Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester", Cancer Res 42: 15301536 (1982). 25 [7] kappaBj, Takashiba et al., "Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor", 1999, Infect. & Immun. Nov.67(11) 5573-8. [8] Wright et al., "CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide 30 (LPS) and LPS Binding protein", Sept. 1990, Science Vol.249: 4975 pp 1431-1433. [9] E. Engvall et P. Perlman, « Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G », Immunochemistry, vol. 8, pages 871-874, 1971. PMID : 5135623.353 02 12 1 9 24 List of references [1] FR 2 779 738 filed by GOEMAR SA LAB, France. [2] Huang, G. L., Liu, M. X., and Mei, X. Y., "Studies on the hydrolytic condition of beta-1,3 glucan from yeast by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis", (2005), Anal. Lett. 38, 477-485 or in The analysis of oligosaccharides derived from different sources by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, Huang, G.L., Zhang, H.C., and Wang, P.G. (2007), Food Chem. 101, 392-396. [3] Correc G., Hehemann J.H., Czjzek M., Helbert W. (2011) Structural analysis of the degradation products of porphyran digested by Zobellia galactanivorans p-porphyranase A. Carbohydrate Polymers 83, 277-283. [4] Kazlowski, B., Pan, C.L., & Ko, Y.T. (2008) .Separation and quantification of neoagaro- and agaro-oligosaccharide products produced from agarose digestion by beta-agarase and HCI in liquid chromatography systems. Carbohydrate Research, 343, 2443-2450. [5] Tsuchiya S. et al., "Establishment and Characterization of a Human Monocytic Leukemia Cell Line (THP-1)", Int J Cancer 26: 171-176 (1980). [6] Tsuchiya S. et al., "Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester", Cancer Res 42: 15301536 (1982). [7] kappaBj, Takashiba et al., "Differentiation of monocytes to macrophage premium cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor", 1999, Infect. & Immun. Nov.67 (11) 5573-8. [8] Wright et al., "CD14, receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS Binding Protein", Sept. 1990, Science Vol.249: 4975 pp 1431-1433. [9] E. Engvall and P. Perlman, "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G, Immunochemistry, vol. 8, pp. 871-874, 1971. PMID: 5135623.35

Claims

REVENDICATIONS1. A process for producing an oligo-porphyran, said process comprising a step (a) of enzymatic hydrolysis of porphyran by means of beta-agarase B.

The process according to claim 1, wherein the beta-agarase B is beta-agarase B expressed by the marine bacterium Zobellia galactanivorans.

3. Process according to claim 1 or 2, in which the porphyran is extracted from the wall of the marine red algae Porphyra sp ..

4. Process according to any one of claims 1 to 3, in which the porphyran is a heterogeneous polysaccharide having alternating beta-D-galactopyranose- (1,4) -3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranoside ( G-LA motif) and beta-D-galactopyranose- (1-4) -alphaL-galactose-6-sulfate (G-L6 motif).

5. The process according to claim 1, further comprising a step (b) of purifying the oligo-porphyran by successive ultrafiltration of the membrane hydrolyzate.

6. An oligosporphyran obtainable by the process as defined in any one of claims 1 to 5.

7. An oligosporphyran according to claim 6, said Oligoporphyrane having a molecular weight of 780 to 1600 g / mol.

8. Oligo-porphyran as a medicine.

9. Oligo-porphyran as a medicine for modulating immunity.

10. Oligo-porphyran as a medicine to stimulate immunity.