FR3017877A1 - Materiau pour la culture des cellules, procedes de preparation et ses utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention porte sur un matériau tridimensionnel à double porosité, comprenant un support constitué d'un polymère biorésorbable dont la surface comporte des charges positives et est fonctionnalisée par des molécules bioactives comportant des charges négatives et adaptées à augmenter la prolifération de cellules eucaryotes. Elle porte également sur son procédé de préparation ainsi que sur ses utilisations pour fixer et stimuler la prolifération de cellules eucaryotes in vitro, ex-vivo ou in vivo.

Description

MATERIAU POUR LA CULTURE DES CELLULES, PROCEDES DE PREPARATION ET SES UTILISATIONS DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se rapporte à des matériaux double porosité comprenant un support constitué d'un polymère biorésorbable dont la surface est fonctionnalisée par des molécules bioactives, ainsi qu'à leurs procédés de préparation et leurs utilisations pour fixer et faire proliférer des cellules eucaryotes.

ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION Au cours des vingt dernières années, divers types de supports, permettant la culture de cellules eucaryotes, ont été peu à peu développés dans le but de créer des dispositifs destinés essentiellement à l'étude des comportements cellulaires et à l'ingénierie tissulaire. On connaît, par exemple, des supports de type hydrogels. Cependant, les hydrogels dérivés de molécules qui sont compatibles avec le développement de cellules in vivo ont une disponibilité réduite. De plus, la plupart des hydrogels sont soit désagrégés par les fluides corporels, soit incapables de maintenir de bonnes propriétés mécaniques pendant la durée nécessaire à la régénération tissulaire. On connaît également des supports de type céramiques 25 poreuses. Cependant, les céramiques poreuses sont très rigides et sont difficiles à mettre en forme. L'utilisation de biopolymères tels que le collagène, la fibrine, l'alginate ou le chitosane est également décrite pour fabriquer des supports destinés à la culture de cellules eucaryotes. Ces biopolymères ont l'avantage de posséder de bonnes propriétés biologiques, d'être biocompatibles et biodégradables. Cependant, si leurs propriétés physiques de surface sont intéressantes, leurs propriétés mécaniques d'ensemble sont généralement faibles, même après réticulation chimique, ce qui limite leur champ d'application. La conception de supports adaptés doit répondre à de nombreuses exigences qui peuvent cependant être modulées selon les applications envisagées. Le support doit, avant tout, permettre l'adhésion des cellules à sa surface. Il doit aussi permettre la prolifération et la survie des cellules, ce qui suppose que les cellules puissent, d'une part, accéder aux nutriments et à divers facteurs de croissance et, d'autre part, éliminer les déchets. Aussi, selon les types cellulaires considérés, le support doit également permettre le changement de forme des cellules, leur migration, voire leur différenciation. Le support doit par conséquent posséder des propriétés chimiques et physiques appropriées. Du point de vue des propriétés chimiques, le support doit avant tout être biocompatible et non immunogène. Il peut aussi être nécessaire que le support soit biodégradable. Sa vitesse de biodégradation doit être adaptée à l'application visée et les produits issus de ce processus doivent être non-toxiques. En outre, la composition chimique de la surface du support doit permettre l'adhésion des cellules. Les propriétés physiques du support peuvent concerner le support dans son ensemble, comme par exemple la rigidité d'une prothèse osseuse ou la souplesse d'un capillaire ou d'un fil de suture. Elles concernent également et spécifiquement la surface du support. En effet, la rugosité ainsi que la porosité du support peuvent jouer un rôle déterminant dans l'adhésion et la prolifération des cellules. Les propriétés mécaniques de la surface du support jouent quant à elles un rôle vis-à-vis de l'aptitude des cellules à changer de morphologie et à migrer. A ces propriétés chimiques et physiques s'ajoutent d'autres critères tels que la facilité de préparation du support, ses possibilités de mise en forme, la possibilité de le stériliser, son aisance d'utilisation ou encore son coût. Avantageusement, le support pourra être obtenu à partir de matériaux biosourcés et être susceptibles d'être produit à grande échelle. Dans ce contexte, les inventeurs ont mis au point un support en polymère biorésorbable à double porosité, caractéristique essentielle pour permettre aux cellules de s'organiser sous la forme de tissus et pour assurer la vascularisation et la résorption de l'implant. Les surfaces interne et externe de ce support sont totalement fonctionnalisées avec des biomolécules par une technique simple et douce qui préserve la structure et les fonctions des biomolécules. EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet un matériau tridimensionnel à double porosité, comprenant un support constitué d'un polymère biorésorbable dont la surface comporte des charges positives et est fonctionnalisée par des molécules bioactives comportant des charges négatives et adaptées à augmenter la prolifération de cellules eucaryotes.

La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication du matériau selon la présente invention comportant les étapes successives suivantes : 1- la mise en forme du polymère biorésorbable pour 5 obtenir un support bi- ou tridimensionnel à double porosité, 2- le traitement de la surface du support de manière à lui conférer des charges positives, 3- la fonctionnalisation du support ainsi traité par des 10 molécules bioactives. Un autre objet de l'invention est l'utilisation du matériau selon la présente invention pour fixer et stimuler la prolifération de cellules eucaryotes in vitro, ex-vivo ou in vivo. 15 DESCRIPTION DETAILLEE DE MODES DE REALISATION Le matériau objet de la présente invention comprend un support en polymère biorésorbable. La surface dudit support est traitée de façon à y apporter des charges positives. Des molécules bioactives comportant des 20 charges négatives sont immobilisées sur la surface dudit support par interactions électrostatiques avec les charges positives. Les molécules bioactives sont notamment adaptées à augmenter la prolifération de cellules eucaryotes. Il s'agit de molécules pouvant 25 interagir avec des cellules eucaryotes, telles que notamment des molécules de la matrice extracellulaire des tissus. Selon un mode de réalisation particulier du matériau, le support en polymère biorésorbable est un support en 30 polyester.

Le polyester peut notamment être choisi parmi les homopolymères et copolymères d'hydroxyacides, tels que l'acide polylactique (PLA), l'acide polyglycolique (PGA), les copolymères d'acides lactique et glycolique (PLGA), le poly(3-hydroxybutyrate), le poly(4-hydroxybutyrate), le poly(3-hydroxyvalérate), le poly(5-hydroxyvalérate), le poly(3-hydroxypropionate), le poly(3- hydroxyhexanoate), le poly(3-hydroxyoctanoate), le poly(3-hydroxyoctodécanoate) et la polycaprolactone.

Selon un mode de réalisation préféré, le polyester est l'acide polylactique (PLA). Ce polymère synthétique est connu pour sa biocompatibilité et sa biodégradabilité. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le polyester est un PLA comprenant au moins 95% d'énantiomère L et au plus 5% d'énantiomères D. En effet, le poly(acide L-lactique) est dégradé in vivo en acide L- lactique, espèce naturellement métabolisée par l'organisme humain. Reconnu et approuvé de ce point de vue par la plupart des autorités sanitaires, notamment par la « Food and Drug Administration » aux Etats-Unis, le PLA est actuellement utilisé pour la fabrication de différents implants et fils de suture. De plus, il peut faire l'objet de divers types de mise en forme. Les molécules bioactives immobilisées sur le support peuvent notamment être choisies parmi les polysaccharides tels que le hyaluronane, les chondroïtines sulfates, le chitosane et l'héparine ; les protéines tels que le fibrinogène ; les peptides tels que ceux connus pour leur pouvoir d'adhésion cellulaire comme, par exemple, ceux contenant la séquence arginine-glycine-acide aspartique (RGD) ou arginine-glycine-acide aspartique-sérine (RGDS) ; et leurs mélanges. La gélatine n'est pas une molécule bioactive au sens de la présente invention car elle n'interagit pas avec les cellules eucaryotes. Selon un mode de réalisation préféré, les molécules bioactives sont des molécules d'hyaluronane ou acide 5 hyaluronique (HA). En effet, le HA est un constituant majeur de la matrice extracellulaire des tissus humains. C'est un glycosaminoglycane de haute masse molaire (1.106 - 10.106 g.mo1-1), constitué de la répétition d'unités disaccharidiques acide-D-glucuronique-P(1,3)-N-acétyl-D10 glucosamine liées entre elles par des liaisons glycosidiques P(1,4). De par ses propriétés biophysicochimiques uniques (viscoélasticité, haute capacité de rétention d'eau, capacité à interagir spécifiquement ou non avec diverses protéines), le HA 15 joue un rôle fondamental dans l'organisation et l'homéostasie de la matrice extracellulaire. Aussi, il est établi que les propriétés physicochimiques et les fonctions biologiques du HA sont fortement dépendantes de sa taille de chaîne. Par exemple, tandis que le HA de 20 haute masse molaire est anti-angiogénique et inhibe l'inflammation, les oligosaccharides de HA stimulent l'angiogenèse et activent la réponse immunitaire innée. Ainsi, il est possible de moduler les propriétés des supports en jouant sur la taille des chaînes de HA 25 utilisées pour leur fonctionnalisation. Le matériau objet de la présente invention présente une double porosité, c'est-à-dire qu'il présente un réseau de pores de deux tailles différentes. Le matériau peut notamment comprendre des micropores et des macropores 30 interconnectés. Les micropores peuvent notamment avoir un diamètre de moins de 10 pm, de préférence moins de 5 pm. Les micropores permettent un transport rapide des nutriments et des gaz aux cellules qui prolifèrent sur le support ainsi que l'évacuation des déchets. Les macropores peuvent notamment avoir un diamètre de 30 à 200 pm, de préférence de 60 à 170 pm. Les macropores permettent de recevoir les cellules afin de les faire proliférer sur une grande surface interne du support tout en permettant leur récupération à l'état vivant. Au sens de la présente invention, par « diamètre des pores » on entend le diamètre moyen des pores tel que 10 mesuré selon la méthode décrite ici. Selon un mode de réalisation particulier, le support en polymère biorésorbable ne présente pas une structure nanofibreuse. Le support du matériau objet de la présente invention 15 peut notamment présenter une forme pleine, creuse ou microsphérique. De préférence, le support présente une forme pleine. Par « le support présente une forme pleine » ou « support plein » on entend, au sens de la présente invention, que 20 le support est un solide plein, c'est-à-dire une figure géométrique à trois dimensions délimitée par des surfaces planes ou courbes, tel que notamment un polyèdre ou un corps rond. De préférence, le support plein est un support plan, tel que notamment un disque. 25 Par « le support présente une forme creuse » ou « support creux » on entend, au sens de la présente invention que le support est un solide creux et ouvert à au moins deux extrémités, tel que notamment un support tubulaire ou un tube. Le terme "tubulaire" ne signifie pas nécessairement 30 que le conduit intérieur ait une section circulaire. En effet, toutes les formes peuvent être envisagées pour la section du tube, telles que carrée, rectangulaire, ovale, etc. De plus, la forme et/ou la surface de la section du tube ne sont pas nécessairement homogène sur toute la longueur du tube. De plus, le tube peut comprendre un ou plusieurs coudes. Par « le support présente une forme microsphérique » ou « support microsphérique » on entend, au sens de la présente invention que le support est une sphère ayant un diamètre moyen inférieur à 1 mm.

Lorsque le support présente une forme pleine, le matériau peut notamment être une membrane asymétrique poreuse, c'est-à-dire que la porosité de chaque face de la membrane est différente. Ainsi, une des faces de la membrane peut présenter des micropores pouvant arrêter toutes les espèces cellulaires et virales tout en étant perméables à l'eau, aux sels dissous, aux solutés organiques moléculaires et aux macromolécules. Lorsque le support présente une forme microsphérique, le matériau peut notamment être une microbille ayant un 20 diamètre moyen compris entre 50 et 200 pm, de préférence entre 100 et 160 pm. Procédé de fabrication du matériau Le matériau objet de la présente invention peut notamment être obtenu par un procédé comportant les étapes 25 successives suivantes : 1- la mise en forme du polymère biorésorbable pour obtenir un support bi- ou tridimensionnel à double porosité, 2- le traitement de la surface du support de manière à 30 lui conférer des charges positives, 3- la fonctionnalisation du support ainsi traité par des molécules bioactives. Le polymère biorésorbable et les molécules bioactives entrant dans le procédé objet de l'invention peuvent 5 notamment être tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulier, l'étape de mise en forme est effectuée en soumettant une solution du polymère biorésorbable à un procédé d'inversion de phase, ladite solution comprenant ledit polymère biorésorbable 10 et éventuellement au moins un agent porogène et/ou au moins un composé organique ou inorganique tel qu'un actif pharmaceutique. L'étape de mise en forme est réalisée de manière différente selon que le support présente une forme 15 pleine, creuse ou microsphérique. Selon un mode de réalisation particulier permettant l'obtention d'un support plein ou creux, la solution de polymère biorésorbable renfermant un solvant du polymère qui est miscible à l'eau est déposée sur un substrat 20 plein ou creux, et l'inversion de phase est réalisée par immersion dudit substrat dans un bain constitué d'eau et éventuellement d'au moins un autre solvant miscible à l'eau. Le solvant du polymère miscible à l'eau peut notamment être le N,N-diméthylformamide, la N-méthyl 25 pyrrolidone, le diméthylacétamide et leurs mélanges. Avantageusement, la solution de polymère biorésorbable est visqueuse pour faciliter son dépôt sur le substrat et former une couche ayant une épaisseur contrôlée. Ainsi, la concentration du polymère biorésorbable dans la 30 solution de polymère peut notamment être comprise entre 4 et 25% en poids, de préférence entre 6 et 12% en poids.

Le substrat plein ou creux peut notamment être en verre ou en métal. Lorsqu'on immerge ledit substrat recouvert de polymère dans le bain d'eau, le solvant du polymère étant miscible à l'eau, il y a progressivement formation d'un film de polymère par coagulation. Le support plein ou creux prend ainsi la forme du substrat sur lequel il est déposé. Puisque la vitesse de coagulation est différente à la surface en contact avec l'eau et à la surface en contact avec le substrat, on assiste à la formation de pores de tailles différentes. Ainsi, les pores de la surface en contact avec le substrat présentent un diamètre plus large que les pores de la surface en contact avec l'eau. On peut avantageusement modifier la taille des pores de manière contrôlée en ajoutant un agent porogène dans la solution de polymère. Des exemples d'agents porogènes utilisables selon la présente invention sont les poly(éthylène glycol) et les poly(vinyl pyrrolidone) ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 600 et 500 000 g.mo1-1, de préférence un poly(éthylène glycol) ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 5 000 et 10 000 g.mo1-1. La concentration en agent porogène dans la solution de polymère biorésorbable peut notamment être comprise entre 10% et 100%, de préférence entre 20% et 80%, en poids, par rapport au poids du polymère biorésorbable. On peut avantageusement immerger le substrat portant le film de polymère dans plusieurs bains d'eau successifs. Une fois que le support plein ou creux est obtenu, ledit support est lavé pour éliminer toutes traces du solvant du polymère. Selon un autre mode de réalisation particulier permettant l'obtention d'un support microsphérique, la solution de polymère biorésorbable renferme au moins un solvant volatil peu miscible à l'eau et l'inversion de phase est réalisée par introduction de ladite solution dans une solution aqueuse comprenant un agent tensioactif, suivie de l'évaporation dudit solvant volatil. Des exemples de solvants volatils peu miscibles à l'eau sont l'acétate d'éthyle, le dichlorométhane et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation préféré, le polymère biorésorbable est en solution dans un mélange de solvants volatils comprenant un bon solvant du polymère, tel que le dichlorométhane ou l'acétate d'éthyle et un ou plusieurs mauvais solvants du polymère tels que le propan-l-ol, le butan-l-ol, l'hexane et leurs mélanges. Un exemple d'agent tensioactif utilisable selon la présente invention est l'alcool polyvinylique. La concentration en tensioactif dans la solution aqueuse peut notamment être comprise entre 1 et 30 g.L-1. La solution aqueuse comprenant le tensioactif est avantageusement maintenue sous agitation contrôlée dès l'introduction de la solution de polymère jusqu'à l'évaporation complète du solvant volatil. Une fois que le solvant volatil est évaporé, la solution contenant les supports microsphériques est filtrée et les supports sont lavés à l'eau afin d'éliminer le tensioactif. Le diamètre des supports microsphériques est contrôlé par la vitesse d'agitation et la concentration en tensioactif. Lorsque la solution de polymère biorésorbable soumise au procédé d'inversion de phase comprend un composé organique ou inorganique tel qu'un actif pharmaceutique, ce dernier se retrouve dans la matrice du matériau sous la forme de particules fines. Des exemples de composés organiques pouvant être introduits dans la solution de polymère biorésorbable sont des agents antibiotiques et des agents anti-inflammatoires. Un exemple de composé inorganique pouvant être introduit dans la solution de polymère biorésorbable est l'hydroxyapatite. Une fois que le support a été obtenu et lavé à l'eau, il peut éventuellement être stocké avant d'être introduit dans la deuxième étape du procédé. Le support peut notamment être stocké à l'état sec ou bien dans l'eau comprenant éventuellement un agent aseptisant. Les supports obtenus suite à la première étape du procédé objet de l'invention présentent une double porosité telle 10 que définie ci-dessus. Une fois que le support a été mis en forme, la deuxième étape du procédé objet de l'invention consiste à traiter la surface du support de manière à lui conférer des charges positives. 15 Selon un mode de réalisation préféré, le traitement de surface est réalisé par réaction d'aminolyse du polymère biorésorbable à l'aide d'une solution d'au moins une ce,wdiamine aliphatique. La réaction d'aminolyse peut notamment être réalisée par immersion du support en 20 polymère biorésorbable dans une solution d'au moins une a,w-diamine aliphatique, suivie d'un rinçage, par exemple avec de l'eau ultrapure. Selon un mode de réalisation préféré, la oc,w-diamine aliphatique est la 1,6-hexanediamine. 25 Au cours de la réaction d'aminolyse, des liaisons esters du support sont rompues et forment des liaisons amides avec une des deux fonctions amine de l'a,c-diamine aliphatique. La deuxième fonction amine reste libre sous forme d'un ammonium quaternaire. Le support comprend ainsi des charges positives à sa surface dans une large gamme de pH. L'a,w-diamine aliphatique peut notamment être en solution dans un solvant choisi parmi les alcools, l'eau et leurs mélanges, notamment le propan-l-ol ou l'eau, de préférence l'eau. En effet, lorsque la réaction d'aminolyse est réalisée dans l'eau, on obtient plus de fonctions amines libres sur la surface du support et la surface du support est plus rugueuse.

Selon un mode de réalisation préféré, la concentration de l'a,w-diamine aliphatique en solution est comprise entre 1 et 300 g.L-1, de préférence entre 2 et 60 g.L-1. Selon un autre mode de réalisation préféré, la réaction d'aminolyse est effectuée à une température inférieure à 30°C, de préférence inférieure à 25°C, plus préférentiellement à une température proche de 22°C. Cela permet en effet d'éviter la dégradation du support. La réaction d'aminolyse peut notamment être réalisée pendant une durée comprise entre 5 et 90 minutes, de 20 préférence entre 10 et 60 minutes. Une fois que la surface du support a été traitée pour être chargée positivement, la troisième étape du procédé objet de l'invention consiste à fonctionnaliser le support par des molécules bioactives. 25 L'étape de fonctionnalisation du procédé objet de l'invention peut notamment être effectuée par immersion du support dans une solution de molécules bioactives, suivie d'un rinçage, par exemple avec de l'eau ultrapure.

La durée de l'immersion du support dans la solution de molécules bioactives peut notamment être comprise entre 1 et 120 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes. La concentration de molécules bioactives dans la solution 5 dans laquelle le support est immergé peut notamment être comprise entre 0,1 et 20 g.L-1, de préférence entre 1 et 5 g.L-1. Les molécules bioactives présentent des charges négatives dans leur structure lorsqu'elles sont en solution. 10 Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les molécules bioactives sont des molécules de HA. Le HA peut notamment avoir une masse molaire moyenne en poids comprise entre 20 000 et 10 000 000 g.mo1-1. De telles molécules de HA peuvent être obtenues à partir de 15 HA de haute masse molaire par dégradation à l'aide d'espèces réactives de l'oxygène telles que le peroxyde d'hydrogène. Alternativement, le HA peut avoir une masse molaire moyenne en poids comprise entre 800 et 20 000 g.mo1-1. De 20 telles molécules de HA peuvent être obtenues à partir de HA de haute masse molaire par hydrolyse enzymatique, par exemple en présence de hyaluronidase. Le pH de la solution de molécules bioactives dans laquelle est immergé le support est compris entre 1 et 9. 25 Lorsque les molécules bioactives sont des polysaccharides, le pH de la solution de molécules bioactives varie selon la masse molaire moyenne en poids et le pKa des molécules bioactives. Lorsque les molécules bioactives ont une masse molaire moyenne en poids supérieure à 20 000 g.mo1-1, le pH de la solution de molécules bioactives est de préférence inférieur au pKa des molécules bioactives, plus préférentiellement inférieur à pKa -0,5. Lorsque les molécules bioactives ont une masse molaire moyenne en poids inférieure à 20 000 g.mo1-1, le pH de la solution de molécules bioactives est de préférence supérieur au pKa des molécules bioactives, plus préférentiellement supérieur à pKa +2.

Lorsque les molécules bioactives sont des molécules de HA ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 20 000 et 10 000 000 g.mo1-1, le pH de la solution de HA est préférentiellement compris entre 1 et 2,9, de préférence entre 1,5 et 2,5. En effet, le choix d'un pH inférieur au pKa du HA limite le nombre de charges négatives sur la molécule de HA et donc la répulsion électrostatique des longues chaînes de HA entre elles. Lorsque les molécules bioactives sont des molécules de HA ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 800 et 20 000 g.mo1-1, le pH de la solution de HA est préférentiellement compris entre 4 et 8, de préférence entre 5 et 7. En effet, le problème de répulsions de chaînes de HA entre elles n'est plus un problème pour des molécules de HA de faible masse molaire. Ainsi, le choix d'un pH largement supérieur au pKa du HA maximise le nombre de charges négatives sur la molécule de HA et donc les interactions électrostatiques avec les charges positives du support. Lorsque la molécule bioactive est une protéine ou un 30 peptide, le pH de la solution de molécules bioactives est fonction du pi (point isoélectrique) de la molécule bioactive. Le pH de la solution de molécules bioactives est préférentiellement compris entre 2 et 11, plus préférentiellement il est supérieur à pI -2. Selon un mode de réalisation particulier, on peut mettre en oeuvre deux étapes de fonctionnalisation successives avec des molécules bioactives différentes. Par exemple, lorsque le support est plein ou creux et qu'il présente des macropores sur l'une de ses faces et des micropores sur l'autre face, il est possible de fonctionnaliser une face avec un type de molécules bioactives et l'autre face avec d'autres molécules bioactives. La face à fonctionnaliser est mise en contact avec la solution contenant la molécule bioactive, l'autre face étant masquée en l'isolant de la solution par un joint sur la périphérie.

Utilisation du matériau Le matériau objet de la présente invention peut être utilisé pour fixer et stimuler la prolifération de cellules eucaryotes in vitro, ex-vivo ou in vivo. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les cellules eucaryotes qui sont fixées sur le matériau sont des cellules souches, des fibroblastes, des cellules endothéliales ou des cellules cancéreuses. Par exemple, les cellules souches peuvent être des cellules souches mésenchymateuses. Les cellules souches mésenchymateuses peuvent notamment se différencier en chondrocytes en présence du facteur de croissance TGFbeta-3. Les cellules endothéliales peuvent être des cellules endothéliales vasculaires humaines. Les cellules cancéreuses peuvent être des cellules épithéliales de cancer du côlon (lignées CaCo-2, HT-29 et DLD1).

Les cellules eucaryotes sont placées en suspension dans un milieu de culture approprié. Le matériau selon la présente invention est avantageusement stérilisé par immersion dans de l'éthanol pendant quelques minutes.

Après évaporation de l'éthanol, le matériau est immergé dans la suspension de cellules eucaryotes et l'ensemble est mis à incuber à 37°C en atmosphère contrôlée. Les cellules eucaryotes qui sont fixées sur le support et qui y prolifèrent peuvent avantageusement migrer et 10 établir des interactions cellule-cellule dans une coculture. Des exemples d'utilisation du matériau avec des cellules eucaryotes in vitro sont notamment : - l'étude des comportements cellulaires et des 15 interactions entre les cellules et leur environnement ; - le développement et les tests de principes actifs tels que des médicaments ou des produits cosmétiques, - le développement et les tests d'outils thérapeutiques 20 tels que les rayonnements ; - les études toxicologiques pour des allergènes ou des polluants ; - le criblage moléculaire. Des exemples d'utilisation du matériau avec des cellules 25 eucaryotes ex vivo, c'est-à-dire des cellules eucaryotes prélevées chez un patient, sont notamment : - la réalisation de diagnostics ; - les tests d'efficacité de principes actifs et d'autres moyens thérapeutiques ; 30 - la préparation d'autogreffes.

Des exemples d'utilisation du matériau avec des cellules eucaryotes in vivo sont notamment : - l'implantation d'un support colonisé pour la réparation tissulaire (osseuse, cartilagineuse, dentaire, gingivale) ; - l'enduction de prothèses (articulaires, cardiovasculaires) ; - l'injection de microbilles colonisées pour la vectorisation cellulaire ; - l'application du support sur la peau sous la forme d'un pansement pour réparer des lésions et/ou apporter un traitement cutané. L'utilisation du matériau selon l'invention in vivo est notamment rendue possible de par ses bonnes propriétés mécaniques, son absence de cytotoxicité et sa biorésorption progressive. En effet, l'implantation sous-cutanée du matériau selon l'invention colonisé avec des cellules souches mésenchymateuses a été testée avec succès chez le rat Fischer. Le support est progressivement dégradé par les enzymes secrétées par les cellules souches mésenchymateuses. Ces dernières ont colonisé le support et sont entrées dans un processus de différentiation. Cela permet d'envisager des traitements des lésions traumatiques du cartilage et la prévention de l'arthrose, en créant un substitut cellulaire pour une reconstruction cartilagineuse tout en empêchant une cicatrisation conjonctive ou une ossification des lésions. Les cellules vivantes ayant proliféré sur le support 30 peuvent avantageusement être récupérées intactes grâce à un traitement doux par contact avec une solution d'enzymes, comme par exemple un mélange de trypsine et de collagénase. On peut également envisager que le support comprenant des cellules vivantes puisse être utilisé pour réaliser des coupes fines au microtome destinées aux analyses histologiques, cytologiques et immunohistochimiques ou pour réaliser des coupes ultrafines à l'ultra-microtome pouvant être analysées par observation en microscopie électronique à transmission.

L'invention sera maintenant illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLES FIGURES La Figure la est une image au microscope électronique à 15 balayage (MEB) de la face dense du support plein en PLA préparé à l'exemple 1. La Figure lb est une image MEB de la tranche du support plein en PLA préparé à l'exemple 1. La Figure le est une image MEB à fort grossissement de la 20 face poreuse du support plein en PLA préparé à l'exemple 1. La Figure ld est une image MEB de la face poreuse du support plein en PLA préparé à l'exemple 1. La Figure 2 est une image MEB du support microsphérique 25 en PLA préparé à l'exemple 4. La Figure 3 représente l'évolution de l'angle de contact de l'eau avec le support plein de PLA de l'exemple 5 en fonction du temps de dépôt de HA à pH 2 et à pH 6. La Figure 4 représente la densité optique d'un support en 30 PLA à double porosité (PLA), d'un support en PLA à double porosité chargé positivement par réaction d'aminolyse (PLA aminolysé), d'un support en PLA à double porosité chargé positivement par réaction d'aminolyse puis fonctionnalisé par du HA (PLA fonctionnalisé HA) et d'un contrôle négatif (CN), chaque support étant mis en culture avec des cellules souches mésenchymateuses humaines selon l'exemple 6. METHODES DE MESURE Le diamètre des pores du support a été mesuré selon la technique suivante. Des images ont été prises sous microscopes optiques ou électroniques avec échelles de tailles correspondantes et analysées avec un logiciel (ImageJ) de traitement d'images. L'angle de contact de l'eau à la surface du support a été mesuré avec un goniomètre Ramé-Hart (modèle 100-00). Pour chaque échantillon de support analysé, 3 gouttes d'eau Milli-Q ont été déposées sur l'échantillon de support et les valeurs des angles de contact formés à gauche et à droite de chaque goutte ont été mesurées. A partir de ces données, sont calculés pour chaque échantillon de support la valeur moyenne de l'angle de contact de l'eau ainsi que l'écart-type. La quantité de HA immobilisé à la surface du support a été mesurée par microbalance à cristal de quartz, QCM-D (Q-Sense, modèle D300). Le film dense de PLA a été directement déposé sur le capteur QCM-D puis modifié par aminolyse avec une solution de HDA. Après rinçage à l'eau Milli-Q, le film chargé positivement par aminolyse a été mis en contact avec une solution aqueuse de HA et les fréquences du capteur sont suivies dans le temps. Les déplacements de fréquences du capteur de quartz ont été traduits en variations de masse dues au dépôt de molécules par interactions sur le film dense grâce à l'équation de Sauerbrey. La masse surfacique de HA hydraté immobilisé à la surface du support a été mesurée après 120 min de dépôt de HA puis lavage avec une solution de chlorure de sodium à 0,05 mol.L-1.

La densité optique (D.O.) a été mesurée avec le test de prolifération cellulaire WST-1 (Water Soluble Tetrazolium) qui est un test colorimétrique basé sur la transformation par les cellules viables d'un sel de tétrazolium en un composé coloré soluble : le formazan.

Le réactif WST-1 provient de chez Roche Applied Sciences (France). A l'issue du test, les échantillons sont placés dans les puits d'une plaque de 96 puits et leur D.O. est mesurée à 420 nm avec un lecteur de plaque Powerwave X, Bio-tek instruments (France).

Exemple 1: Préparation d'un support plein en PLA Le PLA a été fourni par la société Nature Plast (Caen, France) sous la référence commerciale PLE 005. Il était composé de 96% d'énantiomère L et 4% d'énantiomère D. Sa masse molaire moyenne en poids (MW) et sa masse molaire moyenne en nombre (Mn) ont été déterminées par HPLC-SECMALLS-RI et étaient respectivement égales à 145.103 g.mo1-1 et 60.103 g.mo1-1. Les granulés de PLA ont été dissous dans du N,N-diméthylformamide (DMF) à une concentration de 7% massique sous agitation à 70°C. On a ajouté à la solution de PLA dans le DMF du poly(éthylène glycol) (PEG) ayant une masse molaire moyenne en poids (MW) de 8 000 g.mo1-1 de façon à obtenir une concentration de PEG dans la solution de 7% massique. La solution ainsi obtenue a été déposée sur une plaque en verre et étalée pour former un film à l'aide d'un couteau de type Gardner. L'épaisseur du film a été ajustée grâce à des cales de façon à obtenir des supports plus ou moins épais. La coagulation du support a été réalisée par immersion de la plaque de verre portant le film dans 3 bains d'eau Milli-Q (Millipore, résistivité de 18 f-2. cm-1) successifs à température ambiante (20 à 25°C). La durée 5 d'immersion était de 30 min pour le premier bain et 15 min pour les deux bains suivants. On a obtenu un support plein en PLA à dimensions variables selon la largeur du couteau, l'épaisseur des cales et la longueur du film étalé sur la plaque de 10 verre. Le support présentait une face poreuse et une face dense. Des images prises au microscope électronique à balayage montrent que la face poreuse présentait des macropores ayant un diamètre de 160 pm (Figure 1d) et que la face dense présentait des micropores ayant un diamètre 15 de 1 pm (Figure la). Les micropores et les macropores étaient interconnectés comme le montrent les images de la tranche (Figure lb) et de la face poreuse (Figure 1c) du support. Exemple 2: Fonctionnalisation du support plein en PLA par 20 HA Le support en PLA de l'exemple 1 a été immergé dans une solution de 1,6-hexanediamine (HDA) dans le propan-l-ol à 5 g.L-1 pendant 30 min à température ambiante. Le support a été abondamment rincé à l'eau Milli-Q (Millipore, 25 résistivité de 18 Q.cm-1) pour éliminer le propan-l-ol et la HDA qui n'a pas réagi. Le support chargé positivement a ensuite été fonctionnalisé par du HA ayant une masse molaire moyenne en poids de 3 000 000 g.mo1-1 qui provenait de la société 30 HTL Biotechnologies (Javené, France, lot du 01/2009). Pour cela, le support a été immergé pendant 15 minutes -I dans une solution aqueuse de HA à 1 g.L dont le pH a été ajusté à 2 par addition d'acide chlorhydrique. Le pH a été mesuré avec une électrode de verre (Radiometer Analytical, XC161) connectée à un pH-mètre (Metrohm, 632). Le support fonctionnalisé a ensuite été rincé à l'eau Milli-Q pour éliminer le HA qui ne s'est pas fixé. Exemple 3: Utilisation du support plein fonctionnalisé par HA in vivo Le support en PLA fonctionnalisé par HA de l'exemple 2 a été stérilisé avec un mélange éthanol/eau à 70 % (v/v) puis placé dans un puits de culture. Le support membranaire a été ensemencé par des cellules souches mésenchymateuses de rat (CSMr), isolées de la moelle osseuse de la tête fémorale de rat puis transfectées à la Green Fluorescent Protein (GFP), à raison de 500.103 cellules par support. Le milieu de prolifération était composé du milieu de base a-MEM supplémenté de glutamine (2 mM), de sérum de veau foetal (SVF) décomplémenté à 56°C pendant 30 min (10 %), de Pénicilline (100 IU.mL-1) et de Streptomycine (100 pg.mL-1). Après 2 jours d'incubation dans le milieu de prolifération, le support a été implanté en sous-cutané chez un rat Fisher. Après 6 semaines d'implantation, le support de PLA colonisé par des CSMr a été récupéré sous anesthésie générale (Kétamine/Largactil) avec une partie de la peau.

L'échantillon récupéré a été directement immergé dans le paraformaldéhyde dilué à 4% pour fixation pendant 48 h. Ensuite, chaque échantillon a été enrobé dans la paraffine et coupé à l'aide d'un microtome pour en faire des coupes sériées de 5 }gym d'épaisseur. Les coupes ont ensuite été observées sous microscope à fluorescence (Leica) pour révéler la présence des CSMr - GFP. On observait tout d'abord une diminution du diamètre du support ensemencé de 2,8 cm à 1,2 cm, ce qui traduisait un processus de dégradation significatif du support par les enzymes secrétées par les CSMr. L'observation sous microscope à fluorescence des coupes de 5 }gym issues de la récupération du support implanté chez le rat montrait que, après 6 semaines d'implantation sous cutanée, les CSMr restaient viables et adhérentes au support. En outre, les cellules présentaient une morphologie différente de celle observée avant l'implantation : les cellules avaient une allure sphérique. De plus, les cellules s'étaient regroupées en amas sur toute la profondeur des pores. Exemple 4 : Préparation d'un support microsphérique en PLA Des granulés de PLA (1 g) identiques à ceux de l'exemple 1 ont été dissous dans du dichlorométhane (20 g) et de l'hexane (4 mL) à une température de 40°C. On a introduit cette solution de PLA dans 120 mL d'une solution aqueuse comprenant de l'alcool polyvinylique de masse molaire 23 000 g.mo1-1 à une concentration de 8 g.L-1 sous agitation. On a maintenu l'ensemble sous agitation jusqu'à l'évaporation complète des solvants volatils après 24 heures. Les supports microsphériques ont été récupérés par filtration et lavés à l'eau afin d'éliminer le tensioactif. Une image prise au microscope électronique à balayage montre que le diamètre des supports microsphériques était d'environ 160 pm (Figure 2) . Ces supports microsphériques ont ensuite été fonctionnalisés avec du HA selon le mode opératoire 30 décrit à l'exemple 2.

Exemple 5 : Influence du pH de la solution de molécules bioactives sur l'angle de contact de l'eau Cet exemple permet d'étudier l'influence du pH sur l'efficacité du dépôt de HA de haute masse molaire lors 5 de l'étape de fonctionnalisation du support. Pour des raisons de simplicité d'analyse, les expériences ont été réalisées sur des supports en PLA denses et non sur des supports en PLA à double porosité comme ceux de la présente invention. Néanmoins, les résultats obtenus sur 10 les supports en PLA denses sont transposables aux supports en PLA à double porosité. Le support en PLA dense a été préparé par un procédé d'évaporation de solvant. Le PLA utilisé était identique à celui de l'exemple 1. Des solutions de PLA ont été 15 préparées par dissolution des granulés de PLA dans le chloroforme à environ 35-40°C, sous agitation magnétique, pendant 4 à 5 heures. Le support a été préparé avec une solution de PLA à 6,66 % (m/m) obtenue en dissolvant 1 g de PLA dans 15 g de chloroforme. Après dissolution du 20 PLA, la solution a été coulée dans une boite de Pétri en verre, immédiatement recouverte afin d'éviter une évaporation trop rapide du chloroforme. Le support dense de PLA a été finalement obtenu après évaporation du solvant pendant 6 à 7 jours à température ambiante. Le 25 support présentait une épaisseur voisine de 120 }gym et a été stocké au dessiccateur à température ambiante. La réaction d'aminolyse a été réalisée en immergeant le support en PLA dans une solution de HDA à 10 g.L-1 dans le propan-l-ol pendant 60 min. Le support a ensuite été 30 abondamment rincé à l'eau Milli-Q (Millipore, résistivité de 18 n. cm-1) de façon à éliminer la HDA qui n'a pas réagi et le propan-l-ol. Après aminolyse, le support a été stocké au dessiccateur à température ambiante. Le support chargé positivement a ensuite été fonctionnalisé par un HA ayant une masse molaire moyenne en poids de 3 000 000 g.mo1-1 identique à celui utilisé dans l'exemple 2. Pour cela, le support a été immergé dans une solution aqueuse de HA à 1 g.L-1 dont le pH était ajusté à 2 ou 6 par addition d'acide chlorhydrique ou d'hydroxyde de potassium. Le pH a été mesuré avec une électrode de verre (Radiometer Analytical, XC161) connectée à un pH-mètre (Metrohm, 632). Le support fonctionnalisé a ensuite été rincé à l'eau Milli-Q pour éliminer le HA qui ne s'était pas fixé. Le support fonctionnalisé a été stocké au dessiccateur à température ambiante. Pour chaque support, l'angle de contact de l'eau à la surface du support fonctionnalisé a été mesuré selon la méthode décrite ici. La Figure 3 montre une diminution plus importante de la valeur de l'angle de contact de l'eau avec un support plein de PLA dense, lorsque la solution de HA est à pH 2 que lorsqu'elle est à pH 6. Cela traduit une augmentation plus importante du caractère hydrophile de la surface du support lors du dépôt à pH 2. Ainsi, le dépôt de HA se fait bien mieux à pH 2 qu'à pH 6. Des résultats similaires ont été obtenus avec du HA de masse molaire moyenne en poids de 350 000 g.mo1-1. En revanche, avec du HA de masse molaire moyenne en poids de 880 g.mo1-1, le dépôt de HA se fait mieux à pH 6 qu'à pH 2.

Exemple 6 : Influence du pH de la solution de molécules bioactives sur la quantité de molécules bioactives déposées Cet exemple permet également d'étudier l'influence du pH 5 sur l'efficacité du dépôt de HA de haute masse molaire lors de l'étape de fonctionnalisation du support. Pour des raisons de simplicité d'analyse, les expériences ont été réalisées sur des supports en PLA denses et non sur des supports en PLA à double porosité comme ceux de la 10 présente invention. Néanmoins, les résultats obtenus sur les supports en PLA denses sont transposables aux supports en PLA à double porosité. Le support en PLA dense a été préparé par spin-coating directement sur un capteur QCM-D en cristal de quartz. 15 Pour cela, un film dense homogène a été déposé à partir d'une solution à 1 % (m/m) de PLA dans de l'acétate d'éthyle puis le solvant a été évaporé sous forte rotation du capteur QCM-D en cristal de quartz. Le support obtenu a ensuite été chargé positivement par 20 aminolyse puis fonctionnalisé avec du HA à 2 valeurs de pH différentes tel que décrit dans l'exemple 5 en remplaçant, pour chaque essai, la concentration de HDA, la durée de l'aminolyse, la masse molaire en poids de HA et la concentration de HA par les valeurs respectives 25 données dans le tableau 1 ci-dessous. Pour chaque essai, la quantité de HA immobilisé à la surface du support a été mesurée selon la méthode décrite ici. Aminolyse Dépôt de HA [HDA] Durée MW du HA [HA] Masse surfacique de HA (g.L-1) (min) (g.mo1-1) (g.L-1) (ng.cm-2) à pH 2 à pH 6 10 3.106 0,1 1150 240 5 60 3.106 0,1 560 160 5 10 880 1 240 780 Tableau 1 Pour le support fonctionnalisé avec du HA de masse molaire moyenne en poids de 3 000 000 g.mo1-1, la masse surfacique de HA hydraté immobilisé à la surface du support en PLA était toujours nettement plus élevée à pH 2 qu'à pH 6. En revanche, avec du HA de masse molaire moyenne en poids de 880 g.mo1-1, la masse surfacique de HA hydraté immobilisé à la surface du support en PLA était plus importante à pH 6 qu'à pH 2.

Exemple 7 : Influence de la fonctionnalisation par HA des supports poreux sur la prolifération de cellules Un support en PLA à double porosité tel que préparé dans l'exemple 1, un support de PLA modifié par aminolyse tel que décrit dans l'exemple 2 et un support de PLA modifié par aminolyse puis fonctionnalisé avec du HA tel que décrit dans l'exemple 2 ont été stérilisés avec un mélange éthanol/eau à 70 % (v/v) puis placés dans des puits de culture. Les supports ont été ensemencés par des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) à raison de 250.103 cellules par support. Le milieu de prolifération était composé du milieu de base a-MEM supplémenté de glutamine (2 mM), de sérum de veau foetal (SVF) décomplémenté à 56°C pendant 30 min (10 %), de Pénicilline (100 IU.mL-1) et de Streptomycine (100 pg.mL-1).

Les CSMh ont été cultivées pendant 7 jours à 37°C en présence de CO2 (5%). Après 7 jours de culture, 200 pL de réactif WST-1 ont été ajoutés dans chaque puits et après 4 heures d'incubation à 37°C en présence de CO2 (5%), une mesure de densité optique (D.O.) a été effectuée sur un échantillon de 70 pL prélevés dans chaque puits selon la méthode décrite ici. Cette D.O. est proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Le contrôle négatif (CN) correspondait à la prolifération de CSMh dans un puits de culture dépourvu de support. On observe sur la figure 4 qu'il y avait bien immobilisation de HA sur les supports poreux puisque la prolifération des CSMh était nettement plus élevée lorsque les supports poreux avaient été fonctionnalisés avec du HA. Ceci montre qu'avec des supports poreux il y a bien eu aminolyse puis immobilisation du HA jusqu'à l'intérieur des pores.

Claims (4)

1. REVENDICATIONS1. Matériau tridimensionnel à double porosité, comprenant un support constitué d'un polymère biorésorbable dont la surface comporte des charges positives et est fonctionnalisée par des molécules bioactives comportant des charges négatives et adaptées à augmenter la prolifération de cellules eucaryotes.
2. 2. Matériau selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère biorésorbable est choisi parmi les 10 polyesters.
3. 3. Matériau selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polyester est choisi parmi les homopolymères et copolymères d'hydroxyacides, tels que l'acide polylactique (PLA), l'acide polyglycolique (PGA), les 15 copolymères d'acides lactique et glycolique (PLGA), le poly(3-hydroxybutyrate), le poly(4-hydroxybutyrate), le poly(3-hydroxyvalérate), le poly(5-hydroxyvalérate), le poly(3-hydroxypropionate), le poly(3-hydroxyhexanoate), le poly(3-hydroxyoctanoate), le poly(3- 20 hydroxyoctodécanoate) et la polycaprolactone, de préférence le polyester est l'acide polylactique.
4. 4. Matériau selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les molécules bioactives sont choisies parmi les polysaccharides tels que le 25 hyaluronane, les chondroïtines sulfates, le chitosane et l'héparine ; les protéines tels que le fibrinogène ; les peptides tels que ceux connus pour leur pouvoir d'adhésion cellulaire comme par exemple ceux contenant la séquence arginine-glycine-acide aspartique (RGD) ou 30 arginine-glycine-acide aspartique-sérine (RGDS) ; et leurs mélanges, de préférence l'hyaluronane. . Matériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le matériau comprend des micropores et des macropores interconnectés, les micropores ayant un diamètre de moins de 10 pm et les 5 macropores ayant un diamètre de 30 à 200 pm. 6. Matériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support présente une forme pleine, creuse ou microsphérique, de préférence pleine. 7. Procédé de fabrication d'un matériau selon l'une 10 quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives suivantes : 1- la mise en forme du polymère biorésorbable pour obtenir un support bi- ou tridimensionnel à double porosité, 15 2- le traitement de la surface du support de manière à lui conférer des charges positives, 3- la fonctionnalisation du support ainsi traité par des molécules bioactives. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce 20 que l'étape de mise en forme est effectuée en soumettant une solution dudit polymère biorésorbable à un procédé d'inversion de phase, ladite solution comprenant ledit polymère biorésorbable et éventuellement au moins un agent porogène et/ou au moins un composé organique ou 25 inorganique tel qu'un actif pharmaceutique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la solution de polymère biorésorbable renferme un solvant du polymère qui est miscible à l'eau, tel que le DMF, et est déposée sur un substrat plein ou creux, et en 30 ce que l'inversion de phase est réalisée par immersion dudit substrat dans un bain constitué d'eau etéventuellement d'au moins un autre solvant miscible à l'eau, de manière à obtenir, respectivement, un support plein ou creux. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce 5 que la solution de polymère biorésorbable renferme au moins un solvant volatil peu miscible à l'eau et en ce que l'inversion de phase est réalisée par introduction de ladite solution dans une solution aqueuse comprenant un agent tensioactif, suivie de l'évaporation dudit solvant 10 volatil, de manière à obtenir un support microsphérique. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendication 7 à 10, caractérisé en ce que le traitement de surface est réalisé par réaction d'aminolyse du polymère biorésorbable à l'aide d'une solution d'au moins une a,co15 diamine aliphatique. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que l'étape de fonctionnalisation est effectuée par immersion du support dans une solution de molécules bioactives, suivie d'un rinçage. 20 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les molécules bioactives sont des molécules d'hyaluronane ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 20 000 et 10 000 000 g.mo1-1 et que le pH de la solution d'hyaluronane est compris entre 1 et 2,9, 25 de préférence entre 1,5 et 2,5. 14. Utilisation dû matériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour fixer et stimuler la prolifération de cellules eucaryotes in vitro ou ex-vivo.souches, des fibroblastes, 15. Utilisation selon la en ce que les cellules des cellules cancéreuses. revendication 14, caractérisée eucaryotes sont des cellules des cellules endothéliales,