FR3013049A1

FR3013049A1 - ANALOGUE OF INSULIN GLARGINE

Info

Publication number: FR3013049A1
Application number: FR1361127A
Authority: FR
Inventors: Corine Vialas; Maximilien Blas; You-Ping Chan
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-05-15
Anticipated expiration: 2033-11-14
Also published as: WO2015071368A1; FR3013049B1

Abstract

La présente invention concerne un analogue de l'insuline glargine, qui est la LysB29(Nε-His)GlyA21ArgB31ArgB32-insuline humaine.The present invention relates to an insulin glargine analog, which is LysB29 (Nε-His) GlyA21ArgB31ArgB32-human insulin.

Description

ANALOGUE DE L'INSULINE GLARGINE La présente invention concerne un nouvel analogue de l'insuline glargine basale permettant de traiter le diabète, sa préparation et son utilisation. La prévalence du diabète constitue un problème de santé majeur dans le monde, et on s'attend à une augmentation importante du nombre de cas dans le futur.The present invention relates to a novel basal insulin glargine analog for treating diabetes, its preparation and its use. The prevalence of diabetes is a major health problem worldwide, and a significant increase in the number of cases is expected in the future.

Des analogues de l'insuline ont été conçus dans le but d'améliorer le traitement. Des insulines à action rapide, à action intermédiaire et à action prolongée (basale) ont été développées et autorisées pour une utilisation chez l'homme. La finalité du traitement est de mimer l'insuline prandiale et/ou basale. L'effet secondaire le plus courant d'une insulinothérapie est l'hypoglycémie quand une quantité trop importante d'insuline est présente, qui résulte de l'injection d'une quantité trop importante d'insuline ou d'un pic de concentration dû à la variabilité de la vitesse d'absorption à partir d'un tissu sous-cutané. Ce dernier cas est particulièrement vrai pour les insulines à action intermédiaire ou prolongée qui forment un dépôt ou se trouvent sous une forme cristalline au niveau du site d'injection.Insulin analogues have been designed to improve treatment. Fast-acting, intermediate-acting and long-acting (basal) insulins have been developed and approved for use in humans. The purpose of treatment is to mimic prandial and / or basal insulin. The most common side effect of insulin therapy is hypoglycaemia when too much insulin is present, resulting from the injection of too much insulin or a peak concentration due to the variability of the rate of absorption from a subcutaneous tissue. This last case is particularly true for intermediate or long-acting insulins that form a deposit or are in a crystalline form at the injection site.

L'insuline est l'une des protéines les plus étudiées en termes de propriétés structurelles et de modifications chimiques, et d'implications sur les propriétés physiologiques. L'insuline humaine est composée de deux chaînes de 21 (chaîne A) et de 30 (chaîne B) acides aminés, liées par l'intermédiaire de deux ponts disulfure inter-chaînes et un pont disulfure intra-chaîne. L'insuline humaine possède un poids moléculaire de 5807 et un point isoélectrique d'environ 5,3. En solution à pH neutre, l'insuline présente une capacité d'auto-assemblage dépendant de la concentration en dimères et en hexamères : voir Brange dans Galenics of Insulin Springer Verlag 1987. La forme hexamère est la forme la plus stable, mais c'est le monomère qui est biologiquement actif.Insulin is one of the most studied proteins in terms of structural properties and chemical modifications, and implications for physiological properties. Human insulin is composed of two chains of 21 (A-chain) and 30 (B-chain) amino acids, linked through two inter-chain disulfide bridges and an intra-chain disulfide bridge. Human insulin has a molecular weight of 5807 and an isoelectric point of about 5.3. In neutral pH solution, insulin has a self-assembly capacity depending on the concentration of dimers and hexamers: see Brange in Galenics of Insulin Springer Verlag 1987. The hexameric form is the most stable form, but it is the monomer that is biologically active.

Les produits insuliniques les plus efficaces actuellement utilisés sont des analogues de l'insuline (voir, Oiknine et al. Drugs 2005, 65, 325-340 pour une vue d'ensemble). Les insulines à action rapide sont des insulines basées sur des analogues avec lesquels la formation des structures dimères et/ou hexamères n'est pas favorisée, de sorte que la forme monomère est rapidement disponible après l'administration. Celles-ci sont commercialisées sous les noms commerciaux d'Humalog® (insuline lispro), de Novolog® (insuline aspart) et d'ApieraC) (insuline glulisine) ; le nom commun de l'analogue d'insuline est donné entre parenthèses. Parmi les insulines basales à action prolongée, on trouve le Lantus® (insuline glargine) qui possède un point isoélectrique d'environ 7 et qui précipite sur le site d'injection, ce qui permet la libération lente des monomères à partir du site d'injection, et le Levemir® (detemir) qui contient un acide gras greffé sur la chaîne B qui lui confère une action prolongée due à son adsorption sur l'albumine en circulation. Ces deux insulines à action prolongée ne procurent pas une couverture complète pendant 24 heures chez tous les patients. En outre, dans le cas du detemir, l'activité thérapeutique de l'insuline a été réduite d'un facteur quatre à cause de la modification chimique, ce qui nécessite davantage de protéines pour le même effet : voir Kurtzhals et al. Diabetes, 2000, 49, 999-1005. L'obtention de meilleures insulines à action prolongée, c'est-à-dire à profil plat (sans pic), pour réduire les évènements hypoglycémiques nocturnes est encore hautement souhaitable pour améliorer le contrôle de la glycémie et ce domaine de recherche est très actif.The most effective insulin products currently used are insulin analogues (see Oiknine et al., Drugs 2005, 65, 325-340 for an overview). Fast-acting insulins are analog-based insulins with which the formation of dimeric and / or hexameric structures is not favored, so that the monomeric form is readily available after administration. These are marketed under the trade names Humalog® (insulin lispro), Novolog® (insulin aspart) and ApieraC) (insulin glulisine); the common name of the insulin analogue is given in parentheses. Long-acting basal insulins include Lantus® (insulin glargine), which has an isoelectric point of about 7 and precipitates at the injection site, allowing slow release of monomers from the site. injection, and Levemir® (detemir) which contains a fatty acid grafted on the B chain which gives it a prolonged action due to its adsorption on circulating albumin. These two long-acting insulins do not provide complete coverage for 24 hours in all patients. In addition, in the case of detemir, the therapeutic activity of insulin has been reduced by a factor of four due to chemical modification, which requires more protein for the same effect: see Kurtzhals et al. Diabetes, 2000, 49, 999-1005. Obtaining better long-acting insulins, ie flat-profile (no peak), to reduce nocturnal hypoglycaemic events is still highly desirable for improving glycemic control and this area of research is very active. .

Récemment, le Tresiba® (insuline degludec) a été autorisé en Europe et au Japon. Cette insuline contient un acide hexadécanedioïque greffé sur la Lys B29 par l'intermédiaire d'un espaceur gamma-L-glutamyle. Cette modification entraîne la formation de multi-hexamères dans les tissus sous-cutanés, ce qui permet à l'insuline de se libérer lentement au cours du temps et d'avoir une forte affinité de liaison vis- à-vis de l'albumine. Globalement, la durée d'action est supérieure à 24 heures. La synthèse et la description de cette molécule sont données dans le brevet US 7 615 532 et dans Jonassen et al. Pharm. Res. 2012, 29, 2104-2114. L'insuline glargine (protéine active du Lantus®) est particulièrement importante pour la présente invention, l'insuline glargine étant décrite dans le brevet US 5 656 772. Dans la molécule de l'insuline glargine, l'asparagine A21 est remplacée par une glycine et deux arginines ont été ajoutées à la position B30 terminale. La molécule est appelée GlyA2I-ArgB31-ArgB32-insuline humaines ou, plus couramment, insuline glargine. Elle est formulée à pH 4 et précipite à pH neutre, son point isoélectrique étant d'environ 7,0. La protéine est préparée par mutagenèse dirigée dans E. Coli. D'autres approches visant à obtenir des insulines à action prolongée ont été décrites dans la littérature, mais aucune n'a permis jusqu'à présent d'obtenir des produits commerciaux. En effet, les conditions requises pour obtenir le profil pharmacocinétique d'une véritable insuline basale qui répond aux besoins des patients sont très strictes. Certains exemples basés sur des modifications de l'insuline sont donnés ci-dessous. Le brevet US 6 221 837 décrit des analogues de l'insuline contenant 1 à 5 histidines en position B30. Ces produits sont capables de se lier à davantage de zinc et présentent un profil à libération modifiée après injection sous-cutanée. La prolongation de la durée jusqu'à 14 heures chez les chiens nécessite un excès de zinc (généralement 80 mg/mi pour une formulation d'insuline de 40 UT/mi). La durée d'une formulation sans zinc des mêmes composés est similaire à celle de l'insuline humaine et est d'environ 6 à 8 heures. D'une manière similaire, le brevet US 6 686 177 décrit des analogues de l'insuline contenant 1 à 5 histidines en position BO pour augmenter la liaison au zinc, et la durée est prolongée jusqu'à 16 heures chez le chien. Philipps et al. J. Biological Chemistry 2010, 285, 11755-11759 décrivent des analogues de l'insuline dans lesquels deux histidines sont présentes aux positions A4 et A8. L'objectif est ici de créer des hexamères fixée au zinc et donc d'améliorer le profil de durée d'action. Dans une étude effectuée sur le rat, il a été trouvé que la durée était similaire à celle du Lantus®. Dans une autre publication de Kohn et al. Peptides 2007, 28, 935-048, les auteurs décrivent une stratégie pour prolonger la durée en augmentant le point isoélectrique de l'insuline par l'ajout de lysines et/ou d'arginines positivement chargées. Des résultats satisfaisants sont obtenus quand une arginine est ajoutée à l'extrémité N-terminale de la chaîne A et que deux arginines sont ajoutées à l'extrémité C-terminale de la chaîne B. Le point isoélectrique mesuré est de 7,3 par rapport à 7,0 pour l'insuline glargine. Cependant, leurs activités biologiques sont bien inférieures à celle de l'insuline glargine. La molécule est également décrite dans la demande de brevet US 2006/0 217 290. Le brevet US 2005/0 014 679 décrit l'ajout d'acides aminés basiques, tels que l'arginine ou la lysine, à l'insuline afin d'obtenir des formulations à action prolongée.Recently, Tresiba® (insulin degludec) has been approved in Europe and Japan. This insulin contains a hexadecanedioic acid grafted on the Lys B29 via a gamma-L-glutamyl spacer. This modification results in the formation of multi-hexamers in the subcutaneous tissues, which allows insulin to slowly release over time and have a high binding affinity for albumin. Overall, the duration of action is greater than 24 hours. The synthesis and description of this molecule are given in US Pat. No. 7,615,532 and in Jonassen et al. Pharm. Res. 2012, 29, 2104-2114. Insulin glargine (active protein of Lantus®) is particularly important for the present invention, insulin glargine being described in US Pat. No. 5,656,772. In the insulin glargine molecule, asparagine A21 is replaced by glycine and two arginines were added at the terminal B30 position. The molecule is called human GlyA2I-ArgB31-ArgB32-insulin or, more commonly, insulin glargine. It is formulated at pH 4 and precipitates at neutral pH, its isoelectric point being about 7.0. The protein is prepared by site-directed mutagenesis in E. coli. Other approaches to long-acting insulins have been described in the literature, but none to date has resulted in commercial products. Indeed, the conditions required to obtain the pharmacokinetic profile of a true basal insulin that meets the needs of patients are very strict. Some examples based on changes in insulin are given below. U.S. Patent 6,221,837 discloses insulin analogues containing 1 to 5 histidines at position B30. These products are able to bind to more zinc and have a modified release profile after subcutaneous injection. Extending the duration to 14 hours in dogs requires an excess of zinc (usually 80 mg / mi for an insulin formulation of 40 UT / mi). The duration of a zinc-free formulation of the same compounds is similar to that of human insulin and is about 6 to 8 hours. Similarly, US 6,686,177 discloses insulin analogs containing 1 to 5 histidines in the BO position to enhance zinc binding, and the duration is prolonged to 16 hours in dogs. Philipps et al. J. Biological Chemistry 2010, 285, 11755-11759 describe insulin analogs in which two histidines are present at positions A4 and A8. The goal here is to create zinc hexamers and thus improve the duration of action profile. In a rat study, it was found that the duration was similar to that of Lantus®. In another publication by Kohn et al. Peptides 2007, 28, 935-048, the authors describe a strategy for extending the duration by increasing the isoelectric point of insulin by the addition of lysines and / or positively charged arginines. Satisfactory results are obtained when an arginine is added to the N-terminus of the A-chain and two arginines are added at the C-terminus of the B-chain. The measured isoelectric point is 7.3 relative to at 7.0 for insulin glargine. However, their biological activities are well below that of insulin glargine. The molecule is also described in patent application US 2006/0 217 290. US Patent 2005/0 014 679 describes the addition of basic amino acids, such as arginine or lysine, to insulin for obtain long-acting formulations.

Les produits décrits, par exemple ArgA0GlyA21Lys-(1\e-Arg)B29, présentent un profil de durée d'action similaire à celui du Lantus®. Dans ce contexte, la modification de l'insuline par diverses manières (principalement, par le greffage d'acides gras et la modification des séquences de la chaîne A et/ou de la chaîne B pour augmenter le point isoélectrique) peut permettre d'obtenir de meilleures propriétés, comme une liaison à l'albumine ou une précipitation induite par le pH, mais parfois au détriment de l'activité thérapeutique et/ou en induisant des modifications de propriétés pharmacologiques qui excluent un usage clinique à vie. L'obtention d'une insuline basale véritable sujette à de très faibles fluctuations de concentration avec une ou moins d'une injection par jour pour améliorer le traitement des patients reste un défi. Les inventeurs ont découvert que les propriétés pharmacocinétiques de l'insuline glargine (protéine active du Lantus®) peuvent être significativement améliorées par le greffage d'une seule histidine sur le résidu de N-epsilon lysine en position B29 de l'insuline glargine par l'intermédiaire d'une liaison amide, appelée LysB29 (-.. TE_ His) insuline glargine ou LysB29(NE-His)GlyA2lArgB31ArgB32-insuline humaine dans la suite du présent document. Sur le plan de la structure, cette nouvelle molécule est différente des molécules de l'art antérieur décrites ci-dessus, dans lesquelles une ou plusieurs histidines sont insérées dans la chaîne A ou B principale ou dans les chaînes teiminales. Avec ce nouvel analogue de l'insuline, des formulations à action prolongées ont été obtenues sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un excès de zinc ou d'effectuer une conversion pour obtenir des suspensions cristallines. L'ajout d'une histidine, comme décrit dans le présent document, n'a aucun impact sur les caractéristiques structurelles et le point isoélectrique du précurseur de l'insuline glargine. L'amélioration envisagée est un profil de libération plus long et plus plat par rapport à celui du Lantus , pour ainsi réduire le nombre d'événements hypoglycémiques et hyperglycémiques avec seulement une injection par jour ou moins.The described products, for example ArgA0GlyA21Lys- (1 \ e-Arg) B29, have a duration of action profile similar to that of Lantus®. In this context, the modification of insulin by various means (mainly by the grafting of fatty acids and the modification of the A chain and / or B chain sequences to increase the isoelectric point) can make it possible to obtain better properties, such as albumin binding or pH-induced precipitation, but sometimes to the detriment of therapeutic activity and / or by inducing changes in pharmacological properties that preclude clinical use for life. Obtaining a true basal insulin subject to very small fluctuations in concentration with one or less than one injection per day to improve the treatment of patients remains a challenge. The inventors have discovered that the pharmacokinetic properties of insulin glargine (active Lantus® protein) can be significantly improved by the grafting of a single histidine on the N-epsilon lysine residue at the B29 position of insulin glargine by intermediate of an amide bond, called LysB29 (-. TE_He) insulin glargine or LysB29 (NE-His) GlyA2lArgB31ArgB32-human insulin in the following. In terms of structure, this new molecule is different from the molecules of the prior art described above, in which one or more histidines are inserted in the main A or B chain or in the teiminal chains. With this novel insulin analog, long-acting formulations have been obtained without the need to use excess zinc or to convert to obtain crystalline suspensions. The addition of histidine, as described herein, has no impact on the structural features and isoelectric point of the insulin glargine precursor. The envisioned improvement is a longer and flatter release profile compared to that of Lantus, thus reducing the number of hypoglycemic and hyperglycemic events with only one injection per day or less.

Par conséquent, un premier aspect de l'invention concerne un analogue de l'insuline glargine qui est la Lys B29His)GlyA2lArgB3lArgB32-insuline humaine. Dans un second aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un analogue de l'insuline glargine qui est la LysB29(1\eHis)GlyA2 I ArgB31Arg832- insuline humaine.Accordingly, a first aspect of the invention relates to an insulin glargine analog which is human B12His) GlyA21ArgB31ArgB32 Lys. In a second aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an insulin glargine analog which is LysB29 (1HeI) GlyA2I ArgB31Arg832- human insulin.

La présente invention concerne également un analogue de l'insuline glargine ou une composition pharmaceutique selon l'invention utilisable dans un traitement thérapeutique d'un humain ou d'animaux.The present invention also relates to an insulin glargine analogue or a pharmaceutical composition according to the invention for use in a therapeutic treatment of a human or animals.

En particulier, la présente invention concerne l'analogue de l'insuline glargine ou la composition pharmaceutique, tels que décrits ci-dessus, pour une utilisation dans le traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie. La présente invention concerne également un procédé de préparation de l'analogue de l'insuline glargine selon l'invention, comprenant l'étape de greffage d'une histidine protégée sur l'insuline glargine à un pH de 10 et 11, puis une étape de déprotection. Telle qu'utilisée dans le présent document et sauf indication contraire, l'expression « acide aminé » fait référence aux acides aminés naturels ou non 10 naturels, sous forme de stéréoisomères D et L pour les acides aminés chiraux. Il est entendu qu'elle fait référence à la fois aux acides aminés et aux résidus d'acides aminés correspondants, comme ceux que l'on trouve, par exemple, dans une structure peptidyle. Les acides aminés naturels et non naturels sont bien connus dans l'art. Les acides aminés naturels communs comprennent, mais sans s'y limiter, 15 l'alanine (Ala), l'arginine (Arg), l'asparagine (Asn), l'acide aspartique (Asp), la cystéine (Cys), la glutamine (Gin), l'acide glutamique (Glu), la glycine (Gly), l'histidine (His), l'isoleucine (Ile), la leucine (Leu), la lysine (Lys), la méthionine (Met), la phénylalanine (Phe), la proline (Pro), la sérine (Ser), la thréonine (Thr), le tryptophane (Trp), la tyrosine (Tyr) et la valine (Val). Dans les protéines d'origine 20 naturelle, des acides aminés sont tous des stéréoisomères L. La présente invention concerne un analogue de l'insuline glargine qui est la LysB29(-. His)GlyA2lArgB31Arg1332_insuline humaine. La LysB29(1\r His)GlyA21_ ArgB3lArgB32_insuline humaine est également appelée ci-après dans le présent document LysB29(NE-His) insuline glargine. 25 L'expression « analogue de l'insuline glargine » fait référence à un analogue de l'insuline glargine ou, plus précisément, dans le contexte de l'invention, à une insuline glargine chimiquement modifiée. Comme mentionné ci-dessus, l' insuline glargine est un composé bien connu qui est décrit dans le brevet US 5 656 772 et commercialisé sous le nom de Lantus®. 30 Dans la molécule d'insuline glargine, l'asparagine A21 est remplacée par une glycine et deux arginines ont été ajoutées à la position B30 terminale par rapport à l'insuline humaine native. La molécule est appelée GIyA21ArgB31_Args32_instiline humaine, ou plus couramment insuline glargine.In particular, the present invention relates to the insulin glargine analog or pharmaceutical composition, as described above, for use in the treatment of diabetes and / or hyperglycemia. The present invention also relates to a process for the preparation of the insulin glargine analogue according to the invention, comprising the step of grafting a protected histidine on insulin glargine at a pH of 10 and 11, then a step deprotection. As used herein and unless otherwise indicated, the term "amino acid" refers to naturally occurring or non-naturally occurring amino acids in the form of D and L stereoisomers for chiral amino acids. It is understood that it refers to both amino acids and corresponding amino acid residues, such as those found, for example, in a peptidyl structure. Natural and unnatural amino acids are well known in the art. The common naturally occurring amino acids include, but are not limited to, alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gin), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met) ), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr) and valine (Val). In the naturally occurring proteins, amino acids are all L stereoisomers. The present invention relates to an insulin glargine analog which is human LysB29 (-. His) GlyA21ArgB31Arg1332. Human LysB29 (1Hr) GlyA21_ ArgB3lArgB32_insulin is hereinafter also referred to herein as LysB29 (NE-His) insulin glargine. The term "insulin glargine analogue" refers to an insulin glargine analogue or, more specifically, in the context of the invention, chemically modified insulin glargine. As mentioned above, insulin glargine is a well-known compound which is described in US Patent 5,656,772 and marketed as Lantus®. In the insulin glargine molecule, asparagine A21 is replaced by glycine and two arginines have been added at the terminal B30 position relative to native human insulin. The molecule is called human GIyA21ArgB31_Args32_instiline, or more commonly insulin glargine.

LysB29(. His) signifie qu'un acide aminé histidine est greffé sur le groupe amine N-epsilon du résidu de lysine en position B29 de l'insuline glargine (ou Gly`21ArgB31ArgB32-insuline humaine) par l'intermédiaire d'une liaison amide. En particulier, l'analogue de l'insuline glargine de l'invention ne comprend aucune arginine ou aucun résidu d'acide aminé équivalent en position A0. Dans un mode de réalisation, l'histidine de (NE-His), c'est-à-dire l'acide aminé histidine qui est greffé sur le groupe amine N-epsilon du résidu de lysine en position B29 de l'insuline glargine, est choisie dans le groupe constitué de la L-histidine, de la D-histidine et de la D,L-histidine.LysB29 (. His) means that a histidine amino acid is grafted onto the N-epsilon amine group of the lysine residue at the B29 position of insulin glargine (or Gly`21ArgB31ArgB32-human insulin) via a binding amide. In particular, the insulin glargine analogue of the invention does not comprise any arginine or equivalent amino acid residue in the AO position. In one embodiment, the histidine of (NE-His), i.e. the histidine amino acid which is grafted on the N-epsilon amine group of the lysine residue at position B29 of insulin glargine is selected from the group consisting of L-histidine, D-histidine and D, L-histidine.

De préférence, l'histidine de (N8-His) est la L-histidine. Dans un second aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant l'analogue de l'insuline glargine décrit ci-dessus. L'analogue de l'insuline glargine est formulé de façon à obtenir une composition pharmaceutique qui est acceptable cliniquement pour être administrée à 15 un humain ou à un animal. Par conséquent, la composition pharmaceutique comprend l'analogue de l'insuline glargine et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Des véhicules ou excipients pharmaceutiques sont connus de l'homme du métier. Ceux-ci seront le plus souvent des véhicules ou excipients classiques 20 permettant d'administrer des compositions aux humains, notamment des solutions telles que l'eau stérile, une solution physiologique et les solutions tamponnées au pH physiologique. Les compositions peuvent également être administrées par voie orale, intramusculaire ou sous-cutanée, ou sous la forme d'un aérosol. Les compositions peuvent être administrées selon les procédures standards utilisées par l'homme du 25 métier. Les excipients pharmaceutiques peuvent être des épaississants, des diluants, des tampons, des conservateurs, des agents tensioactifs et équivalents, en plus de la molécule de choix. Des descriptions de certains de ces excipients ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être trouvées dans The Handbook of Pharmaceutical Excipients, publié par l'American Pharmaceutical Association et la 30 Pharmaceutkal Society of Great Britain. Remington : the Science and Practice of Pharmacy 20ème édition (2000), décrit des compositions et des formulations appropriées pour l'administration pharmaceutique des analogues de l'insuline glargine de l'invention, sous la forme de solutions aqueuses, de formulations lyophilisées ou d'autres formulations sèches. En plus des supports biologiquement neutres, les compositions pharmaceutiques à administrer peuvent contenir des quantités minimes de substances auxiliaires non toxiques, tels que des agents mouillants ou émulsifiants, des conservateurs et des agents tampons de pH et équivalents. Les compositions phaimaceutiques peuvent également comprendre un ou plusieurs principes actifs supplémentaires. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est une solution aqueuse. Traditionnellement, l'excipient pharmaceutiquement acceptable est l'eau. Dans un mode de réalisation préféré, la concentration de l'analogue de l'insuline glargine est de 1 mg/ml à 20 mg/ml. On suppose que l'activité thérapeutique du composé est similaire à l'activité thérapeutique du Lantus®. Dans ce cas, 100 UI seront équivalents à 600 nmol ou 3,7 mg. Il est envisagé que les formulations pharmaceutiques puissent contenir 40 à 500 Ul/ml, ce qui est équivalent à 1,49 à 18,6 mg de protéine, respectivement. De préférence, la formulation contient 40 à 300 UI/ml ou, par exemple, entre 3,5 mg/ml et 4 mg/ml. La composition pharmaceutique peut comprendre traditionnellement un sel divalent, une base, un acide, un agent d'isotonicité, des conservateurs et/ou de l'eau stérile. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique 20 comprend des ions de métal divalent choisis dans le groupe constitué des ions de zinc, de magnésium, de cuivre et de calcium. De préférence, les ions de métal divalent sont des ions de zinc. Les sels de zinc sont de préférence le chlorure de zinc, le sulfate de zinc, l'oxyde de zinc ou l'acétate de zinc. La concentration en ions de zinc est de préférence de 0,3 à 3 équivalents par mole de l'analogue de l'insuline glargine, 25 et de manière davantage préférée de 0,5 à 1,5 équivalent par mole de l'analogue de l'insuline glargine. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique possède un pH de 3,5 à 4,5. Formulée à un pH de 3,5 à 4,5, la formulation est un liquide limpide qui est injectable grâce à de petites aiguilles de 30 à 32 G. De préférence, le 30 pH est environ de 4. Les acides et les bases utilisées pour ajuster le pH peuvent être, par exemple, l'hydroxyde de sodium et l'acide chlorhydrique, et pour assurer les propriétés tampons, un phosphate, un acétate ou un citrate peut être utilisé.Preferably, the histidine of (N8-His) is L-histidine. In a second aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the insulin glargine analog described above. The insulin glargine analog is formulated to provide a pharmaceutical composition which is clinically acceptable for administration to a human or animal. Therefore, the pharmaceutical composition comprises the insulin glargine analog and at least one pharmaceutically acceptable excipient. Pharmaceutical carriers or excipients are known to those skilled in the art. These will most often be conventional vehicles or excipients for administering compositions to humans, including solutions such as sterile water, physiological solution and buffered solutions at physiological pH. The compositions may also be administered orally, intramuscularly or subcutaneously, or in the form of an aerosol. The compositions can be administered according to standard procedures used by those skilled in the art. The pharmaceutical excipients may be thickeners, diluents, buffers, preservatives, surfactants and the like, in addition to the molecule of choice. Descriptions of some of these pharmaceutically acceptable excipients or carriers can be found in The Handbook of Pharmaceutical Excipients, published by the American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Society of Great Britain. Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition (2000) describes compositions and formulations suitable for the pharmaceutical administration of the insulin glargine analogs of the invention, in the form of aqueous solutions, freeze-dried formulations or other dry formulations. In addition to the biologically neutral carriers, the pharmaceutical compositions to be administered may contain minor amounts of nontoxic auxiliary substances, such as wetting or emulsifying agents, preservatives and buffers of pH and the like. The phaimaceutical compositions may also comprise one or more additional active ingredients. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition is an aqueous solution. Traditionally, the pharmaceutically acceptable excipient is water. In a preferred embodiment, the concentration of the insulin glargine analogue is from 1 mg / ml to 20 mg / ml. It is assumed that the therapeutic activity of the compound is similar to the therapeutic activity of Lantus®. In this case, 100 IU will be equivalent to 600 nmol or 3.7 mg. It is contemplated that the pharmaceutical formulations may contain 40 to 500 IU / ml, which is equivalent to 1.49 to 18.6 mg of protein, respectively. Preferably, the formulation contains 40 to 300 IU / ml or, for example, between 3.5 mg / ml and 4 mg / ml. The pharmaceutical composition may typically comprise a divalent salt, a base, an acid, an isotonicity agent, preservatives and / or sterile water. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition comprises divalent metal ions selected from the group consisting of zinc, magnesium, copper and calcium ions. Preferably, the divalent metal ions are zinc ions. The zinc salts are preferably zinc chloride, zinc sulfate, zinc oxide or zinc acetate. The concentration of zinc ions is preferably from 0.3 to 3 equivalents per mole of the insulin glargine analogue, and more preferably from 0.5 to 1.5 equivalents per mole of the insulin glargine. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition has a pH of 3.5 to 4.5. Formulated at a pH of 3.5 to 4.5, the formulation is a clear liquid which is injectable by small needles of 30 to 32 G. Preferably, the pH is about 4. The acids and bases used to adjust the pH may be, for example, sodium hydroxide and hydrochloric acid, and to ensure the buffering properties, a phosphate, an acetate or a citrate may be used.

La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un conservateur. Le conservateur qui est nécessaire pour des fioles ou cartouches à multi-usage peut être choisi dans le groupe constitué des dérivés du phénol, comme le phénol, le m-crésol, le chlorocrésol, l'alcool benzylique et leur mélange. De préférence, le conservateur peut être choisi dans le groupe constitué du phénol, du m-crésol et d'un mélange de ceux-ci. Un mélange de phénol et de m-crésol ou le m-crésol seul est préféré. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un agent d'isotonicité. Par exemple, l'agent d'isotonicité peut être le glycérol (glycérine), le chlorure de sodium, le tréhalose, le mannitol ou le dextrose. Pour une injection sous- cutanée, l'osmolalité est habituellement ajustée à environ 290 à 330 mOsm/kg. La quantité va d'environ 1,6 % à 2,6 % en poids/poids. L'agent d'isotonicité est de préférence le glycérol ou le chlorure de sodium, et de manière davantage préférée le glycérol. En outre, un tensioactif servant à réduire ou à empêcher une adsorption en surface peut être ajouté, comme décrit dans l'art antérieur : Development and manufacture of protein pharmaceuticals Eds. Nail et al. Chapitre 2, 2002, Kulwer Academic/plenum publishers, NY. Dans un mode de réalisation spécifique, la composition pharmaceutique comprend : - un analogue de l'insuline glargine à une concentration située entre 3,5 mg/m1 et 4,0 mg,/ml, de préférence à une concentration de 3,7 mg/ml, - des ions de zinc à une concentration de 20 pg/m1 à 50 pg/ml, - du m-crésol à une concentration de 25 mmo1/1 à 30 mmo1/1, - du glycérol à un taux d'environ 1,6 % à 2,5 % en poids/poids, et son pH est d'environ 4. Un autre objet de l'invention concerne l'analogue de l'insuline glargine ou la composition pharmaceutique, tel que décrit ci-dessus, pour une utilisation dans un traitement thérapeutique chez les humains ou les animaux. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de traitement comprenant 30 l'administration à un sujet en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace de l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition pharmaceutique, tel que décrit ci-dessus.The pharmaceutical composition may further comprise a preservative. The preservative that is required for multi-purpose vials or cartridges may be selected from the group consisting of phenol derivatives, such as phenol, m-cresol, chlorocresol, benzyl alcohol, and mixtures thereof. Preferably, the preservative may be selected from the group consisting of phenol, m-cresol and a mixture thereof. A mixture of phenol and m-cresol or m-cresol alone is preferred. The pharmaceutical composition may further comprise an isotonicity agent. For example, the isotonicity agent may be glycerol (glycerin), sodium chloride, trehalose, mannitol or dextrose. For subcutaneous injection, the osmolality is usually adjusted to about 290 to 330 mOsm / kg. The amount is from about 1.6% to 2.6% w / w. The isotonicity agent is preferably glycerol or sodium chloride, and more preferably glycerol. In addition, a surfactant for reducing or preventing surface adsorption can be added, as described in the prior art: Development and manufacture of protein pharmaceuticals Eds. Nail et al. Chapter 2, 2002, Kulwer Academic / Plenum Publishers, NY. In a specific embodiment, the pharmaceutical composition comprises: - an insulin glargine analogue at a concentration of between 3.5 mg / ml and 4.0 mg / ml, preferably at a concentration of 3.7 mg / ml, - zinc ions at a concentration of 20 μg / ml to 50 μg / ml, - m-cresol at a concentration of 25 mmol / l to 30 mmol / l, - glycerol at a rate of about 1.6% to 2.5% w / w, and its pH is about 4. Another object of the invention is the insulin glargine analogue or the pharmaceutical composition as described above. , for use in a therapeutic treatment in humans or animals. Another object of the invention is a method of treatment comprising administering to a subject in need of a therapeutically effective amount of the insulin glargine analog or pharmaceutical composition as described above. .

Un autre objet de l'invention concerne une utilisation de l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition phamiaceutique, tel que décrit ci-dessus, dans la préparation d'un médicament. En particulier, la présente invention concerne l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition pharmaceutique, tel que décrit ci-dessus, pour une utilisation dans le traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie. En particulier, la présente invention concerne un procédé de traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie, comprenant l'administration à un sujet en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace de l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition pharmaceutique, tel que décrit ci-dessus. En particulier, la présente invention concerne une utilisation de l'analogue de l'insuline glargine ou de la composition pharmaceutique dans la préparation d'un médicament destiné au traitement du diabète et/ou de l'hyperglycémie. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation de l'analogue de l'insuline glargine, tel que décrit ci-dessus, comprenant l'étape de greffage d'une histidine protégée sur l'insuline glargine à un pH de 10 à 11, puis une étape de déprotection. L'analogue de l'insuline glargine de l'invention est préparé de manière commode par le greffage d'un dérivé d'histidine protégée sur l'insuline glargine, qui est suivi d'une déprotection. Les techniques pouvant être utilisées sont similaires à celles utilisées pour l'acylation de l'insuline ou des analogues de l'insuline et sont connues de l'homme du métier. Par exemple, le brevet US 5 646 242 décrit une acylation, de préférence en position B29 (position de l'epsilon-lysine) à un pH supérieur à 10. L'histidine utilisée pour mettre en oeuvre cette réaction a sa fonction carboxylate activée par un N-hydroxysuccinimide (ester activé par NHS) et les azotes actifs protégés par des fonctions t-butyloxycarbonyle (Boc). Après la réaction d'acylation, les Boc sont éliminés avec de l'acide trifluoroacétique. L'ester de BocHis(Boc)-N-hydroxysuccinimide ou des composés similaires peuvent être préparés facilement selon des procédures décrites, par exemple, dans Greene's Protecting Groups in Organic Synthesis, Wuts et al. John Wiley and Sons ene Ed. 2007. L'histidine peut être la L-histidine, la D-histidine ou un mélange racémique. L'insuline glargine utilisée peut être produite par des techniques recombinantes classiques, par exemple dans E. Coli, Saccharomyses cerevisae ou Pichia pastoris. La synthèse de l'insuline glargine est décrite, par exemple, dans le brevet US 5 656 772 et les demandes de brevet US 2011/0 236 925 et 2012/0 214 965. L'invention va être davantage illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, les exemples et les figures ne doivent pas être interprétés d'une quelconque manière que ce soit comme une limite à la portée de la présente invention. FIGURES 10 Figurel. La figure 1 représente un gel après électrofocalisation pour déterminer le PI de l'insuline (puits 1), de la LysB29(1\r-His) insuline glargine (puits 2), de l'insuline glargine (puits 3) et de l'insuline glargine Lantus® (puits 4). M : marqueur de PI. 15 Figure 2. Les figures 2A et 2B représentent des thermogrammes de formulations de l'insuline glargine et de la LysB29(1\1E-His) insuline glargine. La figure 2A représente un thenuogramme d'une composition dans laquelle l'insuline glargine est à 3,6 mg/m1 et le pH est de 4. La figure 2B représente un thermogramme d'une composition dans laquelle la LysB29(1\e-His) insuline glargine est à 3,6 mg/m1 20 et le pH est de 4. Figure 3. Les figures 3A et 3B représentent des spectres en UV proche de formulations de l'insuline glargine et de la LysB29(1\r-His) insuline glargine. La figure 3A représente un spectre en UV proche d'une composition dans laquelle l'insuline glargine est à 3,6 mg/ml et le pH est de 4. La figure 3B représente un 25 spectre en UV proche d'une composition dans laquelle la LysB29(1\1E-His) insuline glargine est à 3,6 mg/ml et le pH est de 4. Figure 4. La figure 4 représente des profils moyens de pharmacocinétique après une seule administration SC de la formulation FT-2, décrite dans l'exemple 4 ci-dessous, et de Lantus®. 30 Exemples : Exemple 1 : synthèse de la LySB29(NE-His) insuline glargine Environ 600 mg d'insuline glargine (Biocon) ont été dissous dans un tampon au carbonate de sodium (50 mM, pH 10,2) pour obtenir une concentration en protéines de 20 g/l. L'ester de Boc-L-His(Boc)-N-hydroxysuccinimide (1 équivalent) a été dissous dans de l'acétonitrile (30 ml), puis ajouté à la solution de protéines. La solution a été laissée sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante, et la réaction a été soumise à un traitement final par l'ajout d'éthanolamine (12 équivalents, 6,1 ml, ajusté à pH 9,0 avec du HC1 0,1 N) et 120 ml d'eau. La conversion en protéine mono-acylée souhaitée a été estimée à environ 67 % par CLHP en phase inversée. Le mélange réactionnel a ensuite été lyophilisé et dissout dans de l'acide trifluoroacétique pur (12 ml) pour effectuer la déprotection des fragments BOC. Après 1 heure à température ambiante, de l'eau (108 ml) a été ajoutée lentement et le milieu a été lyophilisé, dissous à nouveau dans du HC1 0,01 N (100 ml) et lyophilisé une nouvelle fois. Ensuite, le produit a été dissous à 50 mg/m1 dans du HCl 0,01 N et purifié par CLHP préparative en phase inversée sur une colonne Chromolith® Prep RP-18e (100 x 25 mm, 3 itm, 120 À). La phase mobile était constituée de 0,1 % de TFA v/v dans de l'eau distillée (éluant A) et d'acétonitrile contenant 0,1 % de TFA v/v (éluant B). La phase mobile a été passée avec un gradient linéaire allant de 25 % à 28 % de l'éluant B pendant 6 minutes, puis avec 28 % d' éluant B pendant 6 minutes à un débit de 20 ml/minute, et l'absorbante UV a été suivie à 215 nm et 280 nm. Les fractions contenant le produit souhaité ont été regroupées et lyophilisées. Finalement, l'analogue de l'insuline glargine a été dessalé par dialyse contre du HC1 0,01 N et lyophilisé. La pureté du composé par CLHP en phase inversée était de 95 % avec un rendement de 33 %.Another subject of the invention relates to a use of the insulin glargine analog or the pharmaceutical composition, as described above, in the preparation of a medicament. In particular, the present invention relates to the insulin glargine analog or pharmaceutical composition, as described above, for use in the treatment of diabetes and / or hyperglycemia. In particular, the present invention relates to a method of treating diabetes and / or hyperglycemia, comprising administering to a subject in need of a therapeutically effective amount of the insulin glargine analogue or the composition thereof. pharmaceutical as described above. In particular, the present invention relates to a use of the insulin glargine analog or pharmaceutical composition in the preparation of a medicament for the treatment of diabetes and / or hyperglycemia. Another subject of the invention relates to a process for the preparation of the insulin glargine analogue, as described above, comprising the step of grafting a protected histidine on insulin glargine at a pH of 10. at 11, then a deprotection step. The insulin glargine analog of the invention is conveniently prepared by grafting a protected histidine derivative to insulin glargine followed by deprotection. The techniques that can be used are similar to those used for the acylation of insulin or insulin analogues and are known to those skilled in the art. For example, US Pat. No. 5,646,242 describes an acylation, preferably in position B29 (position of epsilon-lysine) at a pH greater than 10. The histidine used to carry out this reaction has its carboxylate function activated by an N-hydroxysuccinimide (NHS-activated ester) and the active nitrogens protected by t-butyloxycarbonyl (Boc) functions. After the acylation reaction, the Boc are removed with trifluoroacetic acid. BocHis (Boc) -N-hydroxysuccinimide ester or similar compounds can be readily prepared according to procedures described, for example, in Greene's Protecting Groups in Organic Synthesis, Wuts et al. John Wiley and Sons ene Ed. 2007. Histidine may be L-histidine, D-histidine or a racemic mixture. The insulin glargine used can be produced by conventional recombinant techniques, for example in E. Coli, Saccharomyses cerevisae or Pichia pastoris. The synthesis of insulin glargine is described, for example, in US Pat. No. 5,656,772 and US Patent Application Nos. 2011/0 236 925 and 2012/0 214 965. The invention will be further illustrated by the figures and examples. following. However, the examples and figures are not to be construed in any way as a limit to the scope of the present invention. FIGURES 10 Figurel. Figure 1 depicts a gel after electrofocusing to determine PI of insulin (well 1), LysB29 (1 \ r-His) insulin glargine (well 2), insulin glargine (well 3) and insulin glargine (well 2). insulin glargine Lantus® (well 4). M: PI marker. Figure 2. Figures 2A and 2B show thermograms of formulations of insulin glargine and LysB29 (1 \ 1E-His) insulin glargine. Figure 2A shows a thenuogram of a composition in which insulin glargine is 3.6 mg / ml and the pH is 4. Figure 2B shows a thermogram of a composition in which LysB29 (1 His) insulin glargine is 3.6 mg / ml and the pH is 4. Figure 3. Figures 3A and 3B show near UV spectra of formulations of insulin glargine and LysB29 (1). His) insulin glargine. FIG. 3A shows a near UV spectrum of a composition in which the insulin glargine is 3.6 mg / ml and the pH is 4. FIG. 3B represents a near UV spectrum of a composition in which LysB29 (1 \ 1E-His) insulin glargine is 3.6 mg / ml and the pH is 4. Figure 4. Figure 4 shows mean pharmacokinetic profiles after a single SC administration of the FT-2 formulation, described in Example 4 below, and Lantus®. Examples: Example 1: Synthesis of LySB29 (NE-His) insulin glargine About 600 mg of insulin glargine (Biocon) were dissolved in sodium carbonate buffer (50 mM, pH 10.2) to obtain a concentration in protein of 20 g / l. The Boc-L-His (Boc) -N-hydroxysuccinimide ester (1 equivalent) was dissolved in acetonitrile (30 ml) and added to the protein solution. The solution was stirred for 30 minutes at room temperature, and the reaction was subjected to a final treatment by the addition of ethanolamine (12 equivalents, 6.1 ml, adjusted to pH 9.0 with HCl). , 1 N) and 120 ml of water. The conversion to the desired mono-acylated protein was estimated at about 67% by reverse phase HPLC. The reaction mixture was then lyophilized and dissolved in pure trifluoroacetic acid (12 ml) to effect deprotection of the BOC fragments. After 1 hour at room temperature, water (108 ml) was added slowly and the medium was lyophilized, dissolved again in 0.01 N HCl (100 ml) and freeze-dried again. Then, the product was dissolved at 50 mg / ml in 0.01 N HCl and purified by reverse phase preparative HPLC on a Chromolith® Prep RP-18e column (100 x 25 mm, 3 μm, 120 Å). The mobile phase consisted of 0.1% TFA v / v in distilled water (eluent A) and acetonitrile containing 0.1% TFA v / v (eluent B). The mobile phase was passed with a linear gradient ranging from 25% to 28% of eluent B for 6 minutes, then with 28% eluent B for 6 minutes at a flow rate of 20 ml / minute, and the absorbent UV was monitored at 215 nm and 280 nm. Fractions containing the desired product were pooled and lyophilized. Finally, the insulin glargine analogue was desalted by dialysis against 0.01 N HCl and lyophilized. The purity of the compound by reverse phase HPLC was 95% with a yield of 33%.

Exemple 2 : analyse structurelle et propriétés Spectrométrie de masse. La masse moléculaire de la LysB29(1\r-His) insuline glargine a été déteiminée par LC/ESI-MS TOF en mode positive (spectromètre de masse, LC/MSD TOF disponible chez Agilent, équipé d'une source d'ionisation par électropulvérisation et d'un analyseur à temps de vol, relié à un système CLHP HP1100 disponible chez Agilent). Un pic principal à 6200,0 Da a été mesuré (la valeur théorique est de 6200,1). Cartographie peptidique. Une cartographie peptidique de la LysB29(W-His) insuline glargine a été réalisée en utilisant une protéas xprovenant de la souche V8 (Glu-C) de Staphylococcus aureus. Quatre fragments sont attendus de cette digestion par la protéase qui clive sélectivement les liaisons peptidiques du côté carboxyle des résidus d'acide aspartique et d'acide glutamique. Une analyse par LC/ESI-MS TOF du produit de digestion a confirmé que le fragment III (B22-B32) avait été greffé avec une histidine, tandis que les autres fragments étaient identiques à ceux d'un produit de digestion de l'insuline glargine. La masse moléculaire mesurée du fragment III contenant l'histidine greffée est de 1565,8 Da (la valeur théorique est de 1565,9 Da). Les résultats de spectrométrie de masse obtenus avec le composé 1 et ses produits de digestion ont confirmé la position du greffage et la structure chimique.Example 2: Structural Analysis and Properties Mass Spectrometry. The molecular weight of LysB29 (1-r-His) insulin glargine was determined by LC / ESI-MS TOF in a positive mode (mass spectrometer, LC / MSD TOF available from Agilent, equipped with a source of ionization by electrospray and a time-of-flight analyzer, connected to an HP1100 HPLC system available from Agilent). A main peak at 6200.0 Da was measured (the theoretical value is 6200.1). Peptide mapping. Peptide mapping of LysB29 (W-His) insulin glargine was performed using a protease x from the V8 strain (Glu-C) of Staphylococcus aureus. Four fragments are expected from this digestion by the protease which selectively cleaves the peptide bonds on the carboxyl side of the aspartic acid and glutamic acid residues. LC / ESI-MS TOF analysis of the digest confirmed that fragment III (B22-B32) had been grafted with histidine, while the other fragments were identical to those of an insulin digestion product. glargine. The measured molecular mass of fragment III containing the grafted histidine is 1565.8 Da (the theoretical value is 1565.9 Da). The mass spectrometry results obtained with the compound 1 and its digestion products confirmed the position of the grafting and the chemical structure.

Teneur en zinc. La détermination du zinc dans la poudre lyophilisée finale de la LysB29(1\r-His) insuline glargine a été réalisée par le procédé spectrophotométrique conçu par Sâbel et al. Anal. Biochem. 2010, 397, 218-226. Ce procédé permet la détermination d'un faible taux d'ion de zinc en solution aqueuse au moyen du réactif colorimétrique Zincon (2-carboxy-2'-hydroxy-5'-sulfoformazylbenzène). Le complexe Zn2+-zincon formé est stable et présente une forte absorbante à 620 mn. La poudre de LysB29(NE-His) insuline glargine, obtenue après les étapes de synthèse de purification, contient une quantité négligeable de zinc (< 0,002 % en poids/poids). Liaison du zinc. La liaison maximale du zinc sur la LysB29(1\e-His) insuline glargine par rapport à celle obtenue avec insuline glargine a été évaluée par la détermination des isothermes d'adsorption associés. Dans les expériences mises en oeuvre, la concentration en zinc, sous la forme de chlorure de zinc, a été augmentée tout en maintenant la concentration en protéines (insuline glargine ou LysB29(NE-His) insuline glargine) constante à 1,0 mg/g de solution. Les formulations de Zn2+/protéines (insuline glargine ou LysB29(1\r-His) insuline glargine) ont tout d'abord été préparées à 3,5 mg/mi et à un pH de 4,0, puis diluées dans un tampon Tris-HC1 (25 mM, pH 7,4) par l'ajout de 300 pl de chaque échantillon à 700 pl de tampon. Un précipité s'est formé. Après 1 heure au repos à température ambiante, le zinc libre a été dosé par spectrophotométrie après une ultrafiltration du surnageant (pour séparer le Zn2+ libre du Zn2+ lié), comme précédemment décrit.Zinc content. The determination of zinc in the final freeze-dried powder of LysB29 (1-r-His) insulin glargine was performed by the spectrophotometric method designed by Sabel et al. Anal. Biochem. 2010, 397, 218-226. This method allows the determination of a low level of zinc ion in aqueous solution using the colorimetric reagent Zincon (2-carboxy-2'-hydroxy-5'-sulfoformazylbenzene). The Zn2 + -zincon complex formed is stable and has a high absorbency at 620 min. The LysB29 (NE-His) insulin glargine powder, obtained after the purification synthesis steps, contains a negligible amount of zinc (<0.002% w / w). Liaison of zinc. The maximum binding of zinc to LysB29 (1 e-His) insulin glargine compared to that obtained with insulin glargine was evaluated by the determination of the associated adsorption isotherms. In the experiments carried out, the concentration of zinc, in the form of zinc chloride, was increased while maintaining the protein concentration (insulin glargine or LysB29 (NE-His) insulin glargine) constant at 1.0 mg / ml. g of solution. Zn2 + / protein (insulin glargine or LysB29 (1 \ r-His) insulin glargine) formulations were first prepared at 3.5 mg / ml and pH 4.0, then diluted in Tris buffer. -HC1 (25 mM, pH 7.4) by adding 300 μl of each sample to 700 μl buffer. A precipitate has formed. After standing for 1 hour at room temperature, the free zinc was determined spectrophotometrically after ultrafiltration of the supernatant (to separate free Zn2 + from bound Zn2 +), as previously described.

Une liaison maximale d'environ 1,5 zinc par monomère de LysB29(1\r-His) insuline glargine et une liaison maximale d'environ 0,75 zinc par molécules de monomère d'insuline glargine sont mesurées.A maximum binding of about 1.5 zinc per monomer of LysB29 (1H-His) insulin glargine and a maximum binding of about 0.75 zinc per insulin glargine monomer molecules are measured.

Point isoélectrique. Une électrofocalisation (IEF) a été mise en oeuvre afin d'évaluer le point isoélectrique (PI) de la LysB29(M-His) insuline glargine par rapport à l'insuline humaine recombinante et à l'insuline glargine (précurseur de matière première et Lantus®). Le PI a été déterminé au moyen d'un gel Novex IEF de pH 3- 10 (Invitrogen, #EC6655) et par comparaison avec les PI de marqueurs connus allant de 4,45 à 9,6. Après une électrophorèse, les protéines ont été visualisées par l'incubation du gel dans une solution de coloration (bleu de Coomassie à 0,04 % et crocéine rouge à 0,05 % dans l'acide acétique à 10 % et l'isopropanol à 27 %). Le point isoélectrique de la LysB29(NE-His) insuline glargine a été mesuré à 7,0 et à 7,1 pour l'insuline glargine. Le point isoélectrique de l'insuline humaine a été mesuré à 6,0. Les résultats montrent que l'ajout du fragment histidine à l'insuline glargine ne modifie pas de manière significative son point isoélectrique. Les résultats sont présentés sur la figure 1. Microcalorimétrie. Les températures de fusion des protéines insuline glargine et LysB29(1\r-His) insuline glargine, en solution à pH 4, ont été mesurées par microcalorimétrie (microcalorimètre à balayage différentiel VP-DSC disponible chez Microcal, LLC). Les solutions ont été préparées à une concentration de 3,6 mg,/m1 par la mise en suspension de la poudre dans de l'eau et en portant le pH des solutions à 4 avec du HC1/NaOH 1 N. Du glycérol (2,3 %) et du m-crésol (25 mM) ont également été ajoutés. La quantité de Zn2+/monomère était de 0,75. La vitesse de balayage était de 1 °C/minute et une pression en excès de 28 psi a été appliquée. Les deux produits présentaient une transition de fusion monomodale à 73-74 °C. Cette température suggère que les deux protéines sont sous forme de dimère, comme l'insuline humaine dans les mêmes conditions (Huus, K. ; et al. Biochemistry. 2005, 44, 11171-11177). En outre, il a été trouvé que cette température de fusion n'était pas dépendante de la quantité de zinc dans la plage de 0 à 1,1 pour la LysB29(K-His) insuline glargine en solution, ce qui suggère également qu'il n'existe aucune liaison au zinc à pH 4,0. Les résultats sont présentés sur la figure 2. Dichroïsme circulaire. Une analyse dans l'UV proche (spectres enregistrés de 250 nm à 310 nm) a été réalisée dans une cuvette en quartz ayant une longueur de trajet de 1 cm, à 20 °C et à une vitesse de 50 nm/minute, en prenant un temps de réponse de 2 secondes et une largeur de bande de 1 nm. Chaque spectre était le résultat de la moyenne de 3 balayages répétés, corrigés par rapport au bruit de fond avec le spectre du tampon correspondant. Les signaux de CD ont ensuite été convertis en ellipticité molaire. Les formes spectrales identiques et les ellipticités molaires identiques de l'insuline glargine et de la LysB29(1\r-His) insuline glargine, formulées à pH 4 et à une concentration de 3,64 mg/ml avec une quantité de 5 0,75 Zn2+/monomère, impliquent que les structures tridimensionnelles des deux composés sont identiques. Les résultats sont présentés sur la figure 3. Exemple 3 : test de solubilité in vitro Un test in vitro a été développé afin d'évaluer la capacité de l'analogue de 10 l'invention à précipiter à pH neutre (étape A), et à se dissocier pour donner une forme soluble lors d'une dilution (étape B). Les formulations ont été préparées à pH 4 et à une concentration de 3,5 mg/ml, et contenaient également 30 pg,/m1 de Zn2+ (qui correspond à 0,75 Zn2+/monomère), 2,3 % de glycérol et 25 mM de m-crésol. Cette formulation a été comparée à une insuline glargine préparée dans les mêmes 15 conditions et qui possède la même composition que le Lantus® commercial. Les formulations ont ensuite été ajoutées à un milieu tamponné avec du Tris-HC1 25 mM, pH 7,4 (150 pl dans 350 pl, respectivement) et laissées au repos pendant une heure à température ambiante. Ensuite, chaque suspension a été centrifugée et le pourcentage de protéines solubilisées dans le surnageant a été mesuré par CLHP en phase 20 inversée. Afin d'évaluer la capacité de dissociation, les suspensions ont été diluées 50 fois dans le même tampon et traitées comme précédemment (centrifugation et dosage par CLHP) après une heure de repos à température ambiante. Les résultats comparant la LysB29(i\r-His) insuline glargine et l'insuline glargine sont présentés dans le tableau ci-dessous. 25 Composé % de protéines solubles : % de protéines solubles : étape A étape B Lys1329(l\e-His) insuline < la limite de détection < la limite de détection glargine (0,5 %) (0,5 %) Insuline glargine < la limite de détection 25 % (0,5 %) Le nouvel analogue précipite de manière quantitative à pH 7,4 comme l'insuline glargine et, lors de la dilution, ne libère aucune protéine en comparaison avec libération de 25 % pour l'insuline glargine. Un profil de libération plus lente in vivo est donc anticipé pour le nouvel analogue. Exemple 4 : propriétés in vitro Affinité in vitro pour le récepteur L'affinité de la LysB29(Nc-His) insuline glargine pour le récepteur de 10 l'insuline a été mesurée dans un essai de liaison compétitive. Des microplaques de tritration de 96 puits (Meso Scale Discovery, #L15XA-3) ont été recouvertes avec un anticorps monoclonal (clone 83-7, Millipore, #MAB1138) dirigé contre la sous-unité alpha soluble du récepteur de l'insuline (25 pl par puits d'une solution à 0,1 pg/m1 dans une solution physiologique tamponnée au phosphate 15 (PBS) : 10 mM de phosphate de sodium, pH 7,4, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1). La plaquette a été incubée pendant 3 heures à température ambiante (22 °C) avant l'étape de saturation avec de la BSA à 5 % dans le PBS pendant 1 heure sous agitation à température ambiante. Une dilution appropriée du fragment extracellulaire soluble purifié du récepteur de l'insuline (R&D Systems, #1544-IR) a 20 ensuite été ajoutée à un tampon de liaison (100 mM d'HEPES, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgC12, 0,02 % de Triton X-100) et incubée pendant 2 heures sous agitation à température ambiante. Après 3 lavages avec le tampon de liaison froid, la liaison a été mise en oeuvre par incubation pendant 16 heures à +5 °C avec 50 pl du tampon de liaison froid contenant un mélange d'insuline humaine biotinylée (IBT 25 Systems, #BioINS100) à 0,5 nM et différentes concentrations d'insuline humaine non marquée, d'insuline glargine ou de LysB29(Ns-His) insuline glargine. Après 3 lavages avec le tampon de liaison froid pour éliminer les peptides non liés, 25 pl de streptavidine conjuguée à l'étiquette Sulfo (Meso Scale Discovery, #R32AD) à 0,2 pg/ml dans le diluant 3 du Meso Scale Discovery (#R51BA) ont été ajoutés à 30 chaque puits pour révéler l'insuline biotinylée liée. Les plaques ont été de nouveau lavées 3 fois avec le tampon de liaison froid avant l'ajout de 150 pl de tampon de lecture 4X (Meso Scale Discovery, #R92TC) dilué 2 fois avec de l'eau. La quantité d'insuline biotinylée liée a été mesurée après la lecture du signal d'électroluminescence avec un SECTOR® Imager 2400 disponible chez Meso Scale Discovery. Les données de liaison ont été ajustées au moyen d'une analyse de régression non linéaire logistique à 4 paramètres afin de déterminer la CE50 pour les différents peptides de référence. Dans chaque essai, l'affinité relative pour le récepteur de l'insuline a été calculée en comparant la CE50 de l'analogue de l'insuline à la CE50 de l'insuline humaine. Les résultats comparant la Lys1329(1\e-His) insuline glargine et l'insuline glargine sont présentés dans le tableau ci-dessous. Protéine n CE50 (nM) Affinité pour le récepteur de l' insuline Insuline humaine 12 0,14 ± 0,04 100 Insuline glargine 10 0,18 ± 0,07 89 ± 42 LysB29(re-His) insuline 5 0,16 ± 0,03 94 ± 19 glargine Ces résultats montrent que l'affinité pour le récepteur de l'insuline est très similaire entre l'insuline glargine et la LysB29(1\e-His) insuline glargine. Propriété mitogénique in vitro L'activité mitogénique de la LysB29(NE-His) insuline glargine a été déterminée par la mesure de la prolifération de cellules épithéliales mammaires humaines (HMEC) en culture. Les HMEC ont été obtenues chez Lonza (Bâle, Suisse), sous la foime de cellules cryoconservées au passage 7 et elles ont été développées et congelées au passage 8. Une ampoule fraîche a été utilisée pour toutes les expériences qui ont été menées au passage 10. Les cellules HMEC ont été maintenues en culture en suivant les instructions du fournisseur dans un milieu de culture de cellules épithéliales mammaires (MEGM SingleQuot Kit, disponible chez Lonza ref CC-4136) contenant de l'insuline, un extrait pituitaire de bovin, de l'hydrocortisone, le facteur de croissance épideimique humain, de la gentamicine et de l'amphotéricine B. Afin de maintenir la culture cellulaire, le milieu de croissance a été changé tous les autres jours et les cellules ont été inspectées quotidiennement. Pour l'expérience de croissance, le milieu d'essai était le milieu de croissance sans insuline. Pour les expériences de mitogénicité, les cellules ont été introduites à une densité de 4 x 103 cellules/puits dans des plaques de 96 puits et incubées pendant environ 72 heures dans un milieu d'essai avec des doses graduées de la LysB29(1\eHis) insuline glargine, de l'insuline glargine, de l'insuline humaine recombinante et d'IGF-1, à une concentration finale allant de 0 nM à une concentration comprise entre 1000 nM et 5000 nM. Après environ 72 heures d'incubation, 20 pl de MTS (sel de 344,5 -diméthylthiazol-2-y1)-5-(3- c arbox yméthox yphény1)-2-(4 -sulfophény1)-2Htétrazolium) ont été ajoutés à chaque puits et les densités optiques ont été lues après 3 heures et 15 minutes ± 15 minutes à 490 nm.Isoelectric point. Electrofocusing (IEF) was performed to evaluate the isoelectric point (PI) of LysB29 (M-His) insulin glargine relative to recombinant human insulin and insulin glargine (precursor of raw material and Lantus). PI was determined using a Novex IEF gel of pH 3- (Invitrogen, # EC6655) and by comparison with PIs of known markers ranging from 4.45 to 9.6. After electrophoresis, the proteins were visualized by incubating the gel in a staining solution (0.04% Coomassie blue and 0.05% red crocene in 10% acetic acid and isopropanol. 27%). The isoelectric point of LysB29 (NE-His) insulin glargine was measured at 7.0 and at 7.1 for insulin glargine. The isoelectric point of human insulin was measured at 6.0. The results show that the addition of the histidine fragment to insulin glargine does not significantly modify its isoelectric point. The results are shown in Figure 1. Microcalorimetry. The melting temperatures of the insulin glargine and LysB29 (1-r-His) insulin glargine proteins, in solution at pH 4, were measured by microcalorimetry (VP-DSC differential scanning microcalorimeter available from Microcal, LLC). The solutions were prepared at a concentration of 3.6 mg / ml by suspending the powder in water and raising the pH of the solutions to 4 with 1N HCl / NaOH. 3%) and m-cresol (25 mM) were also added. The amount of Zn2 + / monomer was 0.75. The sweep rate was 1 ° C / minute and a pressure in excess of 28 psi was applied. Both products had a monomodal melting transition at 73-74 ° C. This temperature suggests that both proteins are in dimer form, such as human insulin under the same conditions (Huus, K. et al., Biochemistry, 2005, 44, 11171-11177). In addition, it was found that this melting temperature was not dependent on the amount of zinc in the range of 0 to 1.1 for LysB29 (K-His) insulin glargine in solution, which also suggests that there is no zinc binding at pH 4.0. The results are shown in Figure 2. Circular Dichroism. Near UV analysis (recorded spectra from 250 nm to 310 nm) was carried out in a quartz cuvette having a path length of 1 cm, at 20 ° C and at a speed of 50 nm / min, taking a response time of 2 seconds and a bandwidth of 1 nm. Each spectrum was the result of the average of 3 repeated sweeps, corrected for background noise with the spectrum of the corresponding buffer. The CD signals were then converted to molar ellipticity. The identical spectral shapes and identical molar ellipticities of insulin glargine and LysB29 (1-r-His) insulin glargine, formulated at pH 4 and at a concentration of 3.64 mg / ml with a quantity of 50, Zn2 + / monomer imply that the three-dimensional structures of the two compounds are identical. The results are shown in Figure 3. Example 3: In Vitro Solubility Test An in vitro test was developed to evaluate the ability of the analog of the invention to precipitate at neutral pH (Step A), and to dissociate to give a soluble form on dilution (step B). The formulations were prepared at pH 4 and at a concentration of 3.5 mg / ml, and also contained 30 μg / μl of Zn 2+ (which corresponds to 0.75 Zn 2 + / monomer), 2.3% glycerol and mM m-cresol. This formulation was compared to insulin glargine prepared under the same conditions and which has the same composition as commercial Lantus®. The formulations were then added to medium buffered with 25 mM Tris-HCl, pH 7.4 (150 μl in 350 μl, respectively) and allowed to stand for one hour at room temperature. Then, each suspension was centrifuged and the percentage of solubilized proteins in the supernatant was measured by reverse phase HPLC. In order to evaluate the dissociation capacity, the suspensions were diluted 50 times in the same buffer and treated as previously (centrifugation and HPLC assay) after one hour of rest at room temperature. The results comparing LysB29 (i-His) insulin glargine and insulin glargine are shown in the table below. Compound% soluble protein:% soluble protein: step A step B Lys1329 (l-e-His) insulin <limit of detection <limit of detection glargine (0.5%) (0.5%) Insulin glargine <detection limit 25% (0.5%) The new analogue quantitatively precipitates at pH 7.4 like insulin glargine and, upon dilution, releases no protein in comparison with 25% release for 1 insulin glargine. A slower release profile in vivo is therefore anticipated for the new analogue. Example 4: In vitro properties In vitro affinity for the receptor The affinity of LysB29 (Nc-His) insulin glargine for the insulin receptor was measured in a competitive binding assay. 96-well tritration microplates (Meso Scale Discovery, # L15XA-3) were overlaid with a monoclonal antibody (clone 83-7, Millipore, # MAB1138) against the soluble alpha subunit of the insulin receptor ( 25 μl per well of a 0.1 μg / ml solution in phosphate buffered saline (PBS): 10 mM sodium phosphate, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl ). The wafer was incubated for 3 hours at room temperature (22 ° C) before the saturation step with 5% BSA in PBS for 1 hour with stirring at room temperature. Appropriate dilution of the purified soluble extracellular fragment of the insulin receptor (R & D Systems, # 1544-IR) was then added to binding buffer (100 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.02% Triton X-100) and incubated for 2 hours with stirring at room temperature. After 3 washes with the cold binding buffer, the binding was carried out by incubation for 16 hours at +5 ° C. with 50 μl of the cold binding buffer containing a mixture of biotinylated human insulin (IBT Systems, # BioINS100 ) at 0.5 nM and different concentrations of unlabeled human insulin, insulin glargine or LysB29 (Ns-His) insulin glargine. After 3 washes with cold binding buffer to remove unbound peptides, 25 μl streptavidin conjugated to the Sulfo tag (Meso Scale Discovery, # R32AD) at 0.2 μg / ml in Meso Scale Discovery diluent 3 ( # R51BA) were added to each well to reveal bound biotinylated insulin. Plates were washed again 3 times with the cold binding buffer prior to the addition of 150 μl of 4X reading buffer (Meso Scale Discovery, # R92TC) diluted 2-fold with water. The amount of bound biotinylated insulin was measured after reading the electroluminescence signal with a SECTOR® Imager 2400 available from Meso Scale Discovery. Binding data were adjusted using 4 parameter logistic nonlinear regression analysis to determine the EC50 for the different reference peptides. In each assay, the relative affinity for the insulin receptor was calculated by comparing the EC50 of the insulin analogue with the EC50 of human insulin. The results comparing Lys1329 (1 \ e-His) insulin glargine and insulin glargine are shown in the table below. Protein n EC50 (nM) Affinity for the insulin receptor Insulin human 12 0.14 ± 0.04 100 Insulin glargine 10 0.18 ± 0.07 89 ± 42 LysB29 (re-His) insulin 5 0.16 ± 0.03 94 ± 19 glargine These results show that the affinity for the insulin receptor is very similar between insulin glargine and LysB29 (1 e-His) insulin glargine. In vitro mitogenic property The mitogenic activity of LysB29 (NE-His) insulin glargine was determined by measuring the proliferation of human mammary epithelial cells (HMEC) in culture. HMECs were obtained from Lonza (Basel, Switzerland) as cryopreserved cells at passage 7 and were developed and frozen at passage 8. A fresh ampoule was used for all the experiments that were conducted at passage 10. The HMEC cells were maintained in culture according to the supplier's instructions in a mammary epithelial cell culture medium (MEGM SingleQuot Kit, available from Lonza ref CC-4136) containing insulin, a pituitary extract of bovine, Hydrocortisone, Human Epidemic Growth Factor, Gentamicin and Amphotericin B. In order to maintain the cell culture, the growth medium was changed every other day and the cells were inspected daily. For the growth experiment, the test medium was the growth medium without insulin. For the mitogenicity experiments, the cells were introduced at a density of 4 x 103 cells / well in 96-well plates and incubated for about 72 hours in a test medium with graduated doses of LysB29 (1 \ eHis ) insulin glargine, insulin glargine, recombinant human insulin and IGF-1, at a final concentration ranging from 0 nM to a concentration between 1000 nM and 5000 nM. After about 72 hours of incubation, 20 ul of MTS (344.5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-arboxymethoxypiperidyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium salt) was added. at each well and the optical densities were read after 3 hours and 15 minutes ± 15 minutes at 490 nm.

Les données de concentration/réponse ont été ajustées par une régression de Marquadt à 4 paramètres (logiciel Magellan®). L'activité mitogénique relative (rapport des CE50) a été déteiminée en comparant la LysB29(1\e-His) insuline glargine à l'insuline humaine recombinante dans chaque expérience et la moyenne des activités relatives obtenues dans différentes expériences a été calculée. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous. CE50 (nm) Activité mitogénique relative (rapport des CE50) Insuline (n = 12) 72 ± 48 1 Insuline glargine (n = 3) 14 ± 6 4,6 ± 2,6 Lys1329(1\1E-His) insuline glargine (n = 5) 25 ± 9 3,9 ± 1,8 IGF-1 (n = 4) 1 ± 0 47 ± 26 Les résultats montrent que la LysB29(NE-His) insuline glargine et l'insuline glargine présentent des activités mitogéniques équivalentes.Concentration / response data were adjusted by a 4-parameter Marquadt regression (Magellan® software). The relative mitogenic activity (EC50 ratio) was determined by comparing LysB29 (1 \ e-His) insulin glargine with recombinant human insulin in each experiment and the average relative activity obtained in different experiments was calculated. The results are shown in the table below. EC50 (nm) Relative mitogenic activity (EC50 ratio) Insulin (n = 12) 72 ± 48 1 Insulin glargine (n = 3) 14 ± 6 4.6 ± 2.6 Lys1329 (1 \ 1E-His) insulin glargine ( n = 5) 25 ± 9 3.9 ± 1.8 IGF-1 (n = 4) 1 ± 0 47 ± 26 Results show that LysB29 (NE-His) insulin glargine and insulin glargine exhibit mitogenic activity equivalent.

Exemple 5 : préparation de formulations pour réaliser une étude animale Des formulations de LysB29(1\f-His) insuline glargine ont été préparées en mélangeant des solutions mères de tous les ingrédients pour atteindre les quantités souhaitées. Toutes les formulations contenaient environ 600 nmol de protéines par ml, 25 mM de m-crésol, 2,3 % de glycérol et du zinc ajouté sous la forme de chlorure de zinc. Le pH a été ajusté avec des solutions d'acide chlorhydrique et d'hydroxyde de sodium. Le pH, l'osmolalité et la teneur en zinc sont présentés dqus le tableau ci- dessous. Ces formulations ont été préparées de façon à être très similaires à la préparation Lantus® selon des données publiques. Seule la teneur en zinc est modifiée ; pour effectuer une comparaison, la formulation FT-2 contenait environ la même quantité de zinc par protéine que le Lantus®. Toutes les formulations ont été stérilisées par filtration et étaient limpides et incolores. La teneur en protéines dans toutes les formulations n'a pas changé après un stockage d'un mois à la fois à 25 °C et à 5 °C. Nom Teneur en API (mg/mi) Teneur en Zn pH Osmolarité (g g/m1)[2] (mOsm/kg) Lantus® [1] 3,64 30 (0,77) environ 4 - FT-1 3,70 13 (0,33) 4,2 306 FT-2 3,69 29 (0,75) 4,2 305 FT-3 3,71 42 (1,08) 4,2 311 [1] Composition donnée dans les informations de prescription du Lantus®. [2] Le chiffre entre parenthèses indique la quantité de zinc par monomère (rapport en mol/mol). Exemple 6 : étude pharmacocinétique chez le rat Les trois prototypes ont été utilisés dans une étude pharmacocinétique par échantillonnage limité parallèle sur des rats mâles atteints par un diabète induit par la streptozitocine. 40 animaux au total (10 rats par groupe, divisés en 2 sous-groupes de 5 rats) ont reçu un des trois prototypes ou le Lantus® en une seule injection sous-cutanée de 30 UI/kg. A tO, tous les rats utilisés dans l'étude présentaient une glycémie supérieure 20 ou égale à 300 mg/dl. L'induction du diabète chez les animaux a été réalisée par l'administration d'une solution de streptozotocine (STZ) à 40 mg/kg par voie intraveineuse, 3 jours avant le début de l'étude. Du sang a été collecté à partir de la veine jugulaire aux moments temporels suivants : 0 (pré-dose), 4 h, 12 h, 24 h, 36 h, 72 h post-dose pour un sous-groupe, 0 25 (pré-dose), 1 h, 8 h, 18 h, 30 h, 48 h, 96 h post-dose pour l'autre sous-groupe. Les échantillons de plasma ont été analysés par un essai ELISA développé pour la déteçmination des analogues de l'insuline sur la base du kit ELISA pour l'iso- insuline Mercodia #10-1128-01. Il a été vérifié que l'insuline glargine et la LysB29(1\e-His) insuline glargine possède la même réactivité avec le kit ELISA pour l'iso-insuline. Les paramètres phainiacocinétiques ont été déterminés en utilisant une analyse non compartimentée (sur un système Phoenix WinNonlin 6.3) et sont présentés dans le tableau ci-dessous. Les paramètres pharmacocinétiques moyens et entre parenthèses pour les concentrations : % de CV et le nombre de moments temporels utilisés pour le calcul. Quand cela n'est pas spécifié, n = 5. Groupe Cmax AUCo-36h C 1 h C8h C18h C24h C36h (mUI/1) (h*mUI/1) (mUI/1) (mUI/1) (mUI/1) (mUI/1) (mUI/1) 2190 2190 574 200 137 (46, 85 FT-1 14 728 (21) (47) (28) (15) n = 4) (n = 1) 532 532 395 319 220 111 (23, FT-2 11 055 (24) (54) (47) (66) (37) n = 3) 741 377 315 387 211 132 (26, FT-3 11 969 (41) (79) (33) (39) (38) n = 4) 1783 1783 563 370 95 98 Lantus® 16 561 (36) (80) (47) (69) (n = 1) (n = 1) Pour n inférieur à 5, les valeurs sont toutes inférieures à 80 mUI/1 (LLOQ) et ne sont pas prises en compte. Les formulations FT-2 et FT-3 ont donné des valeurs de Cmax plus basses et des profils pharmacocinétiques moyens plus longs que le Lantus®. Les concentrations en insuline 18 heures après l'administration étaient très proches, mais étaient plus élevées 24 heures et 36 heures après l'administration. Sur la figure 3, les courbes de pharmacocinétique pour F1'-2 et le Lantus® sont présentées à titre comparatif. FT-1 dont la teneur en zinc est inférieure à celle du Lantus® présente un profil similaire à ce dernier. Il est donc clair qu'une durée d'exposition plus longue chez l'homme peut être attendue avec le nouvel analogue. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention.Example 5: Preparation of Formulations to Conduct an Animal Study Formulations of LysB29 (1-His) insulin glargine were prepared by mixing stock solutions of all ingredients to achieve the desired amounts. All formulations contained about 600 nmol protein per ml, 25 mM m-cresol, 2.3% glycerol, and zinc added as zinc chloride. The pH was adjusted with hydrochloric acid and sodium hydroxide solutions. The pH, osmolality and zinc content are shown in the table below. These formulations were prepared to be very similar to the Lantus® preparation according to public data. Only the zinc content is changed; for comparison, the FT-2 formulation contained about the same amount of zinc per protein as Lantus®. All formulations were sterilized by filtration and were clear and colorless. Protein content in all formulations did not change after storage one month at a time at 25 ° C and 5 ° C. Name API content (mg / mi) Zn content pH Osmolarity (gg / m1) [2] (mOsm / kg) Lantus® [1] 3.64 30 (0.77) approximately 4 - FT-1 3.70 13 (0.33) 4.2 306 FT-2 3.69 29 (0.75) 4.2 305 FT-3 3.71 42 (1.08) 4.2 311 [1] Composition given in information of prescription of Lantus®. [2] The number in parentheses indicates the amount of zinc per monomer (ratio in mol / mol). Example 6: Pharmacokinetic Study in the Rat The three prototypes were used in a parallel limited-sample pharmacokinetic study in male rats with streptozitocin-induced diabetes. A total of 40 animals (10 rats per group, divided into 2 subgroups of 5 rats) received one of three prototypes or Lantus® in a single subcutaneous injection of 30 IU / kg. At t0, all rats used in the study had a blood glucose level greater than or equal to 300 mg / dl. The induction of diabetes in animals was achieved by administration of streptozotocin solution (STZ) at 40 mg / kg intravenously, 3 days before the start of the study. Blood was collected from the jugular vein at the following time points: 0 (pre-dose), 4 h, 12 h, 24 h, 36 h, 72 h post-dose for a subgroup, 0 25 (pre -dose), 1 h, 8 h, 18 h, 30 h, 48 h, 96 h post-dose for the other subgroup. Plasma samples were analyzed by an ELISA test developed for detecting insulin analogues based on the ELISA kit for Mercodia Insulin Insulin # 10-1128-01. Insulin glargine and LysB29 (1 \ e-His) insulin glargine have been shown to have the same reactivity with the ELISA kit for iso-insulin. Phainiacokinetic parameters were determined using non-compartmentalized analysis (on a Phoenix WinNonlin 6.3 system) and are presented in the table below. Mean pharmacokinetic parameters and parentheses for concentrations:% CV and the number of temporal moments used for the calculation. When not specified, n = 5. Cmax group AUCo-36h C 1h C8h C18h C24h C36h (mIU / 1) (h * mUI / 1) (mIU / 1) (mIU / 1) (mIU / 1) ) (mIU / 1) (mIU / 1) 2190 2190 574 200 137 (46, 85 FT-1 14 728 (21) (47) (28) (15) n = 4) (n = 1) 532 532 395 319 220 111 (23, FT-21255 (24) (54) (47) (66) (37) n = 3). 33) (39) (38) n = 4) 1783 1783 563 370 95 98 Lantus® 16 561 (36) (80) (47) (69) (n = 1) (n = 1) For n less than 5, the values are all less than 80 mIU / 1 (LLOQ) and are not taken into account. The FT-2 and FT-3 formulations gave lower Cmax values and longer average pharmacokinetic profiles than Lantus®. Insulin concentrations 18 hours after administration were very close, but were higher 24 hours and 36 hours after administration. In Figure 3, the pharmacokinetic curves for F1'-2 and Lantus® are presented for comparison. FT-1, whose zinc content is lower than that of Lantus®, has a profile similar to that of Lantus®. It is therefore clear that a longer exposure time in humans can be expected with the new analogue. Of course, the invention is not limited to the embodiments described above and shown, from which we can provide other modes and other embodiments, without departing from the scope of the invention. .

Références Tout au long de la présente demande, différentes références décrivent l'état de la technique à laquelle la présente invention se rapporte. Les descriptions de ces références sont incorporées à titre de référence à la présente description. Oiknine R, Bernbaum M, Mooradian AD. A critical appraisal of the role of insulin analogues in the management of diabetes mellitus. Drugs. 2005 ; 65(3) : 32540. Kurtzhals P, Schâffer L, Sørensen A, Kristensen C, Jonassen I, Schmid C, 10 Triib T. Correlations of receptor binding and metabolic and mitogenic potencies of insulin analogs designed for clinical use. Diabetes. Juin 2000 ; 49(6) : 999-1005. Jonassen I, Havelund S, Hoeg-Jensen T, Steensgaard DB, Wahlund PO, Ribel U. Design of the novel protraction mechanism of insulin degludec, an ultra-longacting basal insulin. Pharm. Res. Aout 2012 ; 29(8) : 2104-14. Epub 7 avril 2012.References Throughout the present application, various references describe the state of the art to which the present invention relates. The descriptions of these references are incorporated by reference in this specification. Oiknine R, Bernbaum M, Mooradian AD. A critical appraisal of the role of insulin analogues in the management of diabetes mellitus. Drugs. 2005; 65 (3): 32540. Kurtzhals P, Schäffer L, Sørensen A, Kristensen C, Jonassen I, Schmid C, Triib T. Correlations of receptor binding and metabolic and mitogenic potencies of insulin analogs designed for clinical use. Diabetes. June 2000; 49 (6): 999-1005. Jonassen I, Havelund S, Hoeg-Jensen T, DB Steensgaard, Wahlund PO, Ribel U. Design of the novel protraction mechanism of insulin degludec, an ultra-longacting basal insulin. Pharm. Res. August 2012 ; 29 (8): 2104-14. Epub April 7, 2012.

15 Phillips NB, Wan ZL, Whittaker L, Hu SQ, Huang K, Hua QX, Whittaker J, Ismail-Beigi F, Weiss MA. Supramolecular protein engineering : design of zincstapled insulin hexamers as a long acting depot. J Biol Chem. 16 avril 2010 ; 285(16) : 11755-9. Epub 24 février 2010. Kohn WD, Micanovic R, Myers SL, Vick AM, Kahl SD, 71-rang L, Strifler 20 BA, Li S, Shang J, Beals JM, Mayer JP, DiMarchi RD. pI-shifted insulin analogs with extended in vivo time action and favorable receptor selectivity. Peptides. Avril 2007 ; 28(4) : 935-48. Epub 25 janvier 2007. Development and manufacture of protein pharmaceuticals Eds. Nail et al. Chapitre 2, 2002, Kulwer Academic/plenum publishers, NY 25 Green's Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons 4ème Ed.Phillips NB, Wan ZL, Whittaker L, Hu SQ, Huang K, Hua QX, Whittaker J, Ismail-Beigi F, Weiss MA. Supramolecular protein engineering: Design of Zincstapled Insulin Hexamers as a long acting depot. J Biol Chem. April 16, 2010; 285 (16): 11755-9. Epub 24 February 2010. Kohn WD, Micanovic R, Myers SL, Vick AM, Kahl SD, 71-rank L, Strifler 20 BA, Li S, Shang J, JM Beals, Mayer JP, DiMarchi RD. pI-shifted insulin analogs with extended in vivo time action and favorable receptor selectivity. Peptides. April 2007; 28 (4): 935-48. Epub January 25, 2007. Development and manufacture of protein pharmaceuticals Eds. Nail et al. Chapter 2, 2002, Kulwer Academic / Plenum Publishers, NY 25 Green's Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons 4th Ed.

2007 Sâbel CE, Neureuther JM, Siemarm S A spectrophotometric method for the determination of zinc, copper, and cobalt ions in metalloproteins using Zincon. Anal Biochem. Février 2010 15 ; 397(2) : 218-26. Epub 2 octobre 2009 30 Huus K, Havelund S, Olsen HB, van de Weert M, Frokjaer S. Biochemistry. Thermal dissociation and unfolding of insulin. 23 aout 2005 ; 44(33) : 11171-7.2007 Sbel CE, Neureuther JM, Siemarm S A spectrophotometric method for the determination of zinc, copper, and cobalt ions in metalloproteins using Zincon. Anal Biochem. February 2010 15; 397 (2): 218-26. Epub October 2, 2009 Huus K, Havelund S, Olsen HB, van de Weert M, Frokjaer S. Biochemistry. Thermal dissociation and unfolding of insulin. August 23, 2005; 44 (33): 11171-7.

Claims

REVENDICATIONS1. Analogous insulin glargine which is the LysB29 (1 \ r-Flis) GiyA21ArgB31ArgB32_ human insulin.

2. A pharmaceutical composition comprising the insulin glargine analog of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

The pharmaceutical composition of claim 2 comprising divalent metal ions selected from the group consisting of zinc, magnesium, copper and calcium ions.

The pharmaceutical composition of claim 3, wherein said divalent metal ions are zinc ions, and the zinc ion concentration is 0.3 to 3 equivalents per mole of the insulin glargine analogue. .

5. Pharmaceutical composition according to any one of claims 2 to 4, having a pH of 3.5 to 4.5.

A therapeutic composition according to any one of claims 2 to 5, wherein the concentration of said insulin glargine analogue is from 1 mg / ml to 20 mg / ml.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 2 to 6, further comprising a preservative selected from the group consisting of phenol, m-cresol and a mixture thereof.

A phaiaaceutical composition according to any one of claims 2 to 7, further comprising an isotonicity agent which is glycerol or sodium chloride. 30

The pharmaceutical composition according to any one of claims 2 to 8, comprising: a. said insulin glargine analogue at a concentration of between 3.5 mg / ml and 4.0 mg / ml, for example at a concentration of 3.7 mg / ml b. zinc ions at a concentration of between 20 ggiml and 50 ug / ml c. m-cresol at a concentration of between 25 mmol / l and 30 mmol / l d. glycerol at a level of 1.6% to 2.5% w / w, for example 2.3% w / w e. and its pH is about 4. 10

An insulin glargine analog according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to any one of claims 2 to 9 for use in a therapeutic treatment of a human or animals. 15

An insulin glargine analog according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to any one of claims 2 to 9 for use in the treatment of diabetes and / or hyperglycemia.

A process for the preparation of the insulin glargine analogue according to claim 1, comprising the step of grafting a protected histidine on insulin glargine at a pH of between 10 and 11, followed by a deprotection step. .