FR3007037A1

FR3007037A1 - Modele d'epiderme reconstruit presentant des caracteristiques des taches de vieillesse

Info

Publication number: FR3007037A1
Application number: FR1355723A
Authority: FR
Inventors: Olivier Courtin
Original assignee: Laboratoires Clarins SAS
Current assignee: Laboratoires Clarins SAS
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2014-12-19
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: FR3007037B1

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un épiderme reconstruit mimant les caractéristiques des taches pigmentaires dues au vieillissement, aussi appelées taches de vieillesse ou lentigo sénile ; elle se rapporte également au modèle d'épiderme reconstruit reproduisant des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles du lentigo sénile et à son utilisation pour identifier des inhibiteurs de tout ou partie des manifestations des taches de vieillesse.

Description

Modèle d'épiderme reconstruit présentant des caractéristiques des taches de vieillesse La présente invention a pour objectif la mise au point d'un modèle tridimensionnel (type épiderme reconstruit) mimant les caractéristiques des taches pigmentaires dues au vieillissement (ces taches sont également appelées taches de vieillesse, lentigo sénile ou lentigo solaire) notamment dans le but de tester des actifs permettant de diminuer l'aspect disgracieux de ces taches ; elle se rapporte ainsi à un modèle d'épiderme reconstruit reproduisant des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles du lentigo sénile ; à un procédé permettant la préparation de ce modèle d'épiderme et à son utilisation pour identifier des inhibiteurs de tout ou partie des manifestations des taches de vieillesse.

La peau peut être affectée par différents facteurs et notamment par une exposition aux rayons ultraviolets (UV) qui entraîne une réponse à court tenue (coups de soleil) et une réponse à long terme (cancer, photo-vieillissement) (Bernerd et al. 1998). Une peau exposée chroniquement aux UV subit des changements majeurs tels qu'une désorganisation des fibres de collagène entrainant la formation de rides, un aplatissement de la JDE entraînant une perte d'élasticité et un amincissement cutané dermique et épidermique (Goyarts et al. 2007). Le vieillissement cutané est donc une conséquence de dommages intrinsèques (vieillissement chronologique) et de dommages extrinsèques liés à l'environnement (photo-vieillissement) ou au style de vie.

Lorsque les mécanismes de pigmentation sont altérés par une exposition chronique au soleil, des taches hyperpigmentées peuvent apparaître sur les zones les plus exposées (visage, cou, mains, etc.), on parle de taches de vieillesse ou « lentigo solaire » (Noblesse et al. 2006). Elles affectent 90 % des personnes caucasiennes de plus de 50 ans. Les taches de vieillesse, dont la couleur varie de marron jaune à noire de façon dépendante du phototype, sont bien décrites dans la littérature et ont été étudiées sur des biopsies de peau, en particulier par comparaison d'une zone saine, d'une zone périlésionnelle et d'une zone lésionnelle (Skin ultrastructure in senile lentigo, E. Noblesse et al., Skin pharmacology and physiology, 2006 ; Perilesional versus lesional skin changes in senile lentigo, M. Caria-André et al., Journal of cutaneous pathology, 2004 ; Gene expression profiling analysis of solar lentigo in relation to immunohistochemical characterisis, H. Aoki et al., British journal of dermatology, 2007). Les taches de vieillesses sont caractérisées par : - une augmentation de l'épaisseur de l'épiderme ; - des invaginations importantes de l'épiderme dans le derme ; une accumulation de la mélanine dans les couches basale et suprabasale de l'épiderme ainsi qu'une augmentation du nombre de mélanocytes au niveau des invaginations ; une discontinuité de la couche cornée avec un défaut de différenciation (décrit au niveau de la filaggrine et de l'involucrine). Les taches hyperpigmentées étant souvent inesthétiques, la plupart des femmes souhaitent les effacer ; il existe donc un fort intérêt au développement d'outil permettant d'identifier de nouveaux actifs capables de prévenir et/ou de traiter les taches de vieillesse.

A ce jour, les épidermes reconstruits mélanisés sont très bien décrits (Bessou et al. 1995), mais ne permettent pas d'étudier ce phénomène de taches et son apparition. Le but de la présente invention est donc de mettre au point un modèle d'épiderme reconstruit recréant des caractéristiques des taches hyperpigmentées liées au vieillissement pour étudier l'effet de différents acteurs sur la pigmentation et la morphologie des épidermes reconstruits. La Demanderesse a développé un modèle d'épiderme reconstruit reproduisant des caractéristiques du lentigo sénile ; cet épiderme reconstruit comporte un équivalent d'épiderme composé de kératinocytes et de mélanocytes cultivés sur un deime mort désépidermisé traité par l'association d'un milieu de différenciation classique avec un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis. L'originalité de ce modèle provient du support qui permet la mise en place de structures caractéristiques du lentigo sénile ; une augmentation de la longueur de jonction dermo-épideunique (JDE) qui reproduit les «rete ridges » ou invaginations de l'épiderme dans le demie présentes dans les zones de lentigos séniles ; une augmentation de la quantité de mélanocytes présents au niveau de la lame basale et plus particulièrement au niveau des invaginations ; un défaut de différenciation au niveau de la continuité du marquage de la loricrine (marqueur de différenciation tardive de l'épiderme) ; et une accumulation de la mélanine. Ce modèle permet la visualisation des caractéristiques de taches dans un délai compatible avec l'expérimentation in vitro, c'est-à-dire environ 2 semaines ; il permet l'évaluation d'actifs atténuant le développement des taches ou limitant l'apparition de celles- ci.

La présente invention se rapporte ainsi à un procédé de préparation d'un modèle d'épiderme reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse, caractérisé en ce qu'il comprend : la préparation d'un modèle d'épiderme composé de kératinocytes et de mélanocytes cultivés sur un derme mort désépidermisé ; le traitement dudit modèle au cours de sa différenciation avec un milieu de différenciation choisi parmi un milieu de différenciation classique mélangé à un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis et un milieu de différenciation classique enrichi avec au moins du FGF.

Les caractéristiques des taches de vieillesse comprennent les manifestations suivantes : une augmentation de la longueur de jonction dermo-épidermique (JDE) qui reproduit les « rete ridges » ou invaginations de l'épiderme dans le derme ; une augmentation de la quantité de mélanocytes présents au niveau de la lame basale et de préférence au niveau des invaginations ; un défaut de différenciation au niveau de la continuité du marquage de la loricrine ; et une accumulation de la mélanine ; ledit modèle obtenu par le procédé selon l'invention reproduit de préférence toutes les 20 manifestations qui précèdent. La mise en évidence de ces manifestations peut être réalisée comme décrit dans la partie expérimentale qui suit. La préparation des cellules épidermiques, kératinocytes et mélanocytes, se fait selon les techniques connues de l'homme du métier et décrites dans la littérature ; un exemple de mode de préparation est décrit dans la partie expérimentale. 25 Dans le cadre des essais qu'elle a conduit, la Demanderesse a réussi à préparer un tel modèle grâce à l'utilisation d'un milieu de différenciation classique auquel est ajouté un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis par passages successifs puis irradiés ; elle a également mis en évidence que des molécules biologiques, le FGF en particulier, ajoutées à un milieu de différenciation classique pouvaient à elles seules provoquer la mise en 30 place de ces manifestations caractéristiques du lentigo sénile dans le modèle d'épiderme reconstruit. Par milieu de différenciation classique, on entend un milieu composé d'un milieu de base, comprenant par exemple de l'Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM disponible commercialement), additionné de sérum, tel que du sérum de veau foetal (SVF) et un milieu dans lequel poussent les kératinocytes dont les proportions peuvent être, sans caractère limitatif, 2/3 d'IMDM en volume et 1/3 volume du milieu de croissance des kératinocytes) ; un exemple de mode de préparation du milieu est décrit dans la partie expérimentale.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le milieu de différenciation utilisé pour la préparation de l'épiderme reconstruit comprend un milieu de différenciation classique auquel est ajouté entre 5 et 15 ng/ml de FGF ; optionnellement, ce milieu comprend en outre entre 1 et 10 ng/ml de KGF et/ou entre 1 et 3 ng/ml d'IL-la et/ou au moins une cytokine choisie parmi IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 et TNFa ; ces cytokines, lorsqu'elles sont présentes, peuvent être ajoutées à une concentration comprise entre 1 et 3 ng/ml. Selon un autre mode de réalisation, le milieu de différenciation est composé de 30 à 70% en poids d'un milieu de différenciation classique tel que défini plus haut et de 30 à 70% en poids d'un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis. Au sens de la présente invention, un fibroblaste vieilli désigne un fibroblaste vieilli artificiellement par 2 à 10 passages successifs (P2 à P10), de préférence P6 à P10, plus préférentiellement à P8, puis traité par irradiation ; un passage étant obtenu par trypsination d'une culture à confluence de fibroblastes ; l'irradiation est réalisée par application d'UVA d'une puissance comprise entre 5 à 15 J/cm2, de préférence 10 J/cm2. La préparation du milieu conditionné peut être réalisée comme suit : les fibroblastes ayant subi le nombre de passage souhaité sont ensemencés à une concentration comprise entre 104 et 105 cellules, de préférence 1,5.105, par boite de Pétri (diamètre 100mm) dans un milieu liquide de croissance de fibroblastes classique, connu de l'homme du métier. Lorsque les cellules ont adhéré au support, environ 24 à 48h après l'ensemencement, elles sont irradiées ; pour cela, le milieu de croissance est versé dans un récipient annexe ; les cellules sont immergées dans un milieu transparent isotonique (du PBS par exemple) ; l'ensemble est ensuite irradié ; le milieu transparent isotonique est alors retiré et le milieu de croissance conservé dans le récipient annexe est ajouté aux cellules. Cette opération est répétée encore deux fois à 24 heures d'intervalle. 24 heures après la dernière irradiation, le milieu de croissance est récupéré pour être utilisé comme milieu conditionné qui sera ajouté, mélangé à un milieu de différenciation classique, au modèle d'épiderme afin d'induire sa différenciation en modèle de lentigo sénile ; s'il n'est pas utilisé après sa préparation, le milieu conditionné peut être congelé pour être utilisé ultérieurement. L'origine des fibroblastes n'a pas une importance dételininante pour la préparation du modèle d'épiderme de l'invention, on peut donc indifféremment utiliser des fibroblastes de donneurs jeunes ou âgés ; toutefois, afin de faciliter la mise en oeuvre de la présente invention, on utilisera de préférence des cellules ayant une bonne prolifération issues de donneur âgé, c'est-à-dire d'au moins 45 ans. La préparation du modèle d'épiderme reconstruit selon l'invention est conduite selon les méthodes classiques de l'état de la technique ; elle peut par exemple comprendre l'ensemencement des kératinocytes et des mélanocytes sur un derme mort désépidelinisé nourri avec un milieu de différenciation classique ; les cellules épidermiques vont adhérer au support pendant environ 24 heures puis se multiplier pendant environ 72 heures lorsque les cellules sont mises en immersion dans le milieu.

La différenciation du modèle d'épiderme selon l'invention se déroule sur une durée d'environ 15 jours à compter de l'émersion du modèle d'épiderme reconstruit, avec un changement de milieu de différenciation espacé d'1/2 à 3 jours ; entre les jours 5 et 11, le milieu de différenciation classique est remplacé par un milieu de différenciation induisant l'apparition des caractéristiques du lentigo sénile, choisi parmi un milieu de différenciation classique mélangé à un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis et un milieu de différenciation classique enrichi avec au moins du FGF de préférence, le traitement du modèle d'épiderme avec le milieu conditionné est réalisé en une ou plusieurs fois entre les jours 5 et 11. De préférence, lorsque le milieu de différenciation utilisé est le milieu de 20 différenciation classique enrichi avec au moins du FGF, il est utilisé en remplacement du milieu de différenciation classique à partir du Sème jour de différenciation et est renouvelé deux fois (de préférence, les Sème et 11 ème jours) ; lorsque le milieu de différenciation utilisé est le milieu de différenciation classique mélangé à un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis, il est utilisé en remplacement du milieu de différenciation classique à partir du 8ème 25 jour de différenciation et est renouvelé une fois, de préférence, le llème jour. La présente invention se rapporte également à l'utilisation du milieu de différenciation choisi parmi un milieu de différenciation classique mélangé à un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis et un milieu de différenciation classique enrichi en au moins du FGF tel que défini précédemment pour traiter un modèle d'épiderme reconstruit 30 comprenant des kératinocytes et des mélanocytes cultivés sur un derme mort désépidermisé et induire une différenciation telle que ledit épiderme présente au moins une des manifestations caractéristiques du lentigo sénile ou tache de vieillesse choisies parmi : une augmentation de la longueur de jonction dermo-épidermique (JDE) qui reproduit les « rete ridges » ou invaginations de l'épiderme dans le derme ; une augmentation de la quantité de mélanocytes présents au niveau de la lame basale et de préférence au niveau des invaginations ; un défaut de différenciation au niveau de la continuité du marquage de la loricrine ; et une accumulation de la mélanine. La présente invention se rapporte encore à un modèle d'épiderme reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, ledit modèle comprenant un équivalent d'épiderme composé de kératinocytes et de mélanocytes cultivés sur un derme mort désépidermisé et ledit modèle d'épiderme étant caractérisé en ce qu'il reproduit au moins une caractéristique des taches de vieillesse choisie parmi une augmentation de la longueur de jonction dermo-épidermique (JDE) avec des invaginations de l'épiderme dans le derme ; une augmentation de la quantité de mélanocytes présents au niveau de la lame basale et de préférence au niveau des invaginations ; un défaut de différenciation au niveau de la continuité du marquage de la loricrine ; et une augmentation de la quantité de mélanine. Ce modèle permet la visualisation des caractéristiques des taches de vieillesse dans un délai compatible avec l'expérimentation in vitro. Il peut donc avantageusement servir à l'évaluation d'actifs atténuant ou retardant l'apparition des taches de vieillesse.

La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'un modèle d'épiderme reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse pour tester l'activité inhibitrice d'un composé sur la formation de tache de vieillesse. L'invention se rapporte également à un procédé d'identification d'actifs capables de prévenir et/ou de traiter les taches de vieillesse comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'un premier modèle d'épiderme par le procédé qui précède ; b) préparation d'un second modèle d'épiderme par le procédé qui précède tel que le milieu de différenciation utilisé est le même que celui utilisé pour préparer le ledit premier modèle et qu'il comprend également une molécule à tester ; c) comparaison des caractéristiques des modèles d'épiderme obtenus aux étapes a) et b) et sélection des molécules capables d'empêcher l'apparition d'au moins une manifestation caractéristique des taches de vieillesse.

FIGURES La Figure 1 est le schéma d'un exemple de mesure de la longueur de la JDE et de la longueur de l'épiderme sur une photographie d'épiderme marqué par un anticorps anti-collagène IV.

La Figure 2 représente les effets des UVA et du vieillissement des fibroblastes (FHN) sur la morphologie des épidermes reconstruits selon l'invention, traités avec un milieu de différenciation comprenant du milieu conditionné de fibroblastes de donneurs âgés à P8 et irradié ou non de façon chronique par les UVA aux doses totales de 5 ou 10 J/cm2 ; le marquage est réalisé au trichrome de Masson.

La Figure 3 représente les effets des traitements KGF, FGF et/ou IL1 cc sur le collagène IV dans un épiderme reconstruit selon l'invention, traité avec: KGF, FGF et ILla seuls ou associés : panneau (A) : photographies des coupes d'épidermes reconstruits marquées avec un anticorps anti-collagène IV ; panneau (B) : analyse du marquage anti-collagène IV par mesure de la longueur de la JDE / longueur de l'épiderme. ** p < 0,01, * p < 0,05, NS : non significatif vs. témoin. La Figure 4 représente les effets des UVA et du vieillissement des fibroblastes (FHN) sur le collagène IV dans un épiderme reconstruit selon l'invention, traité avec des milieux conditionnés de fibroblastes de donneurs jeunes ou âgés à passages P2 ou P8 et irradiés ou non de façon chronique par des UVA aux doses totales de 5 ou 10 J/cm2 : panneau (A) : photographies des coupes d'épidermes reconstruits marquées avec un anticorps anti-collagène IV ; panneaux (B-C) : analyse du marquage anti-collagène IV par mesure de la longueur de la JDE / longueur de l'épiderme, *** p < 0,001, * p < 0,05, NS : non significatif vs. condition non irradiée correspondante. La Figure 5 représente les effets des traitements KGF, FGF et/ou IL 1 a sur le melan A dans un épiderme reconstruit selon l'invention, traité avec des molécules biologiques : KGF, FGF et IL1 cx seuls ou associés : panneau (A) : photographies des coupes d'épidermes reconstruits marquées avec un anticorps anti-melan A ; panneau (B) : analyse du marquage anti-melan A par mesure du nombre de cellules melan A positives / nombre de cellules totales (DAPI). *** p < 0,001, NS : non significatif vs. témoin.

La Figure 6 représente les effets des UVA et du vieillissement des fibroblastes (FHN) sur le melan A dans un épiderme reconstruit selon l'invention, traité avec des milieux conditionnés de fibroblastes de donneurs jeunes ou âgés à passages P2 et P8 et irradiés ou non de façon chronique par des UVA aux doses totales de 5 ou 10 J/cm2 : panneau (A) : photographies des coupes d'épidermes reconstruits marquées avec un anticorps antimelan A ; panneaux. (B-C) : analyse du marquage anti-melan A par mesure du nombre de cellules melan A positives / nombre de cellules totales (DAPI). *** p < 0,001, ** p < 0,01, * p < 0,05, NS : non significatif vs. condition non irradiée correspondante.

La Figure 7 représente les effets des UVA et du vieillissement des fibroblastes (FHN) sur la loricrine dans un épiderme reconstruit selon l'invention, traité avec des milieux conditionnés de fibroblastes de donneurs jeunes ou âgés à passages P2 et P8 et irradiés ou non de façon chronique par des UVA aux doses totales de 5 ou 10 J/cm2 : panneau (A) : photographies des coupes d'épidermes reconstruits marquées avec un anticorps anti- loricrine ; panneau (B) : analyse du marquage anti-loricrine par mesure du pourcentage de continuité. *** p < 0,001, ** p < 0,01, NS : non significatif vs. condition non irradiée correspondante. La Figure 8 représente les effets des UVA et du vieillissement des fibroblastes (FHN) sur la quantité de mélanine dans un épiderme reconstruit traité avec des 15 milieux conditionnés de fibroblastes de donneurs jeunes ou âgés à passages P2 ou P8 et irradiés ou non de façon chronique par des UVA aux doses totales de 5 ou 10 J/cm2. Mesure de la quantité de mélanine (pg de mélanine par pig de protéines totales) sur l'ensemble des résultats (A) et sur l'ensemble des résultats de (A) sans J15 FHN âgés P8 (B). EXEMPLE - PREPARATION D'UN MODELE D'EPIDERME SELON 20 L'INVENTION I. Matériels et méthodes 1.1. Epidermes reconstruits (ERC) a) Cultures primaires de kératinocytes et mélanocytes humains Les cultures primaires de kératinocytes et mélanocytes sont obtenues à 25 partir de peaux humaines issues de chirurgie plastique (mammoplastie ou prépuce), après consentement éclairé du donneur. La peau dégraissée est coupée en morceaux de 0,5 cm x 0,5 cm puis incubée à +4°C pour la nuit dans 6 ml de trypsine à 0,25% (Sigma). 24 heures après, la trypsine est inactivée par 6 ml de sérum de veau foetal (SVF - PAA) et les cellules de l'épidei nie sont séparées du derme dans du Hank's Balanced 30 Salt Solution (HBSS - Gibco) + P/S (pénicilline 10 000 U, streptomycine 10 mg/ml - Sigma). La suspension cellulaire est filtrée sur un tamis de 40 gm, comptées, puis centrifugée 5 minutes à 1000 rpm. Les cellules sont resuspendues dans du milieu kératinocytes (milieu Dermalife basal medium, L-glutamine 6 mM, extrait P 0,4%, épinéphrine 1,0 11.1\4, rh TGF-a 0,5 ng/ml, hydrocortisone hemisuccinate 100 ng/ml, rh insuline 51.1g/ml, apo-transferrine 5 P/S - Cell system) puis ensemencées à 5.105 cellules dans du milieu kératinocytes ou mélanocytes (milieu Dermalife basal medium, L-glutamine 6 mM, chloride calcium 1,5 mM, épinéphrine 1,0 uM, StiMe18Tm 1,0%, rh insuline 5 µg/ml, acide ascorbique 50 TM3, P/S - Cell system), favorisant la croissance du type cellulaire correspondant.

Les cellules sont cultivées à 37°C + 5% CO2 jusqu'à 70% de confluence, puis une trypsination différentielle est faite afin de décrocher les mélanocytes (1 minute) puis les kératinocytes (8 minutes) et d'obtenir des cultures pures ; la trypsination intermédiaire (3 minutes), servant à éliminer les mélanocytes résiduels, est éliminée. Les épidermes reconstruits sont menés avec des cellules au passage 1 ou 2 préférentiellement mais jamais au- delà de trois passages. b) Préparation de dermes morts désépidermisés Les dermes désépidermisés (DDE) sont obtenus à partir d'abdoplasties humaines normales. La peau dégraissée est découpée à l'emporte pièce 018 mm puis incubée dans de l'HBSS + P/S pendant 30 minutes à 54°C. L'épiderme est ensuite retiré, la peau 15 incubée 2 minutes dans de l'éthanol 70% puis rincée deux fois dans de l'HBSS + PIS. Les morceaux de peau sont congelés dans de l'HBSS + P/S à -20°C et subissent 6 cycles minimum de congélation puis décongélation successives afin de tuer les fibroblastes et d'obtenir un « derme mort ». e) Reconstruction 20 Les DDE sont décongelés, épongés avec du papier stérile, puis disposés dans des plaques 6 puits. Un «biopsy punch » est inséré sur le DDE, dans lequel sont ensemencés 150 ul de mélange cellulaire à raison de 4.106 cellules/cm2 (95% kératinocytes et 5% mélanocytes). Les dermes sont nourris avec du milieu ERC contenant 2/3 d'Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM - Gibco) 10% SVF et 1/3 de milieu kératinocytes et 25 conservés à 37°C + 5% CO2 pour une phase d'adhésion de 24 h. Au tenue des 24 heures d'adhésion, les «biopsy punch » sont retirés et les dermes sont immergés dans du milieu ERC pour une phase de multiplication de 72 h. Au terme des 72 heures, les demies sont émergés sur grille, puis nourris avec du milieu ERC de façon à maintenir une interface air-liquide induisant la phase de 30 différenciation qui dure quinze jours (J1 à J15). Le milieu est changé tous les deux jours. 12. Traitement des épidermes reconstruits Les épidermes reconstruits sont traités avec des milieux conditionnés à J8 et J11 ou avec des références biologiques à J5, J8 et J11, puis récupérés à J15.

Les milieux conditionnés sont réalisés à partir de fibroblastes humains nonnaux de donneurs d'âges différents à des passages différents (P2, P8) ensemencés à raison de 1,5.104 cellules par boite de Pétri 0100 mm dans du Minimal Essential Medium (MEM - Gibco) 10 SVF et conservés pendant 24 heures à 37°C + 5 % COQ. Les fibroblastes sont irradiés ou non de façon chronique (3 jours) par des UVA aux doses totales de 5 ou 10 J/cm2 (Vilbert Lourmat), dans du Phosphate Buffered Saline (PBS - PAA) ; les milieux de culture sont conservés puis remis après chaque irradiation. Les milieux sont prélevés 24 h après la dernière irradiation et conservés à -20°C. Pour le traitement des épidermes reconstruits, le milieu conditionné est ajouté au milieu ERC à un ratio 1:1. Dans le lentigo solaire, certains facteurs de croissance libérés par les fibroblastes du derme sont augmentés dans les zones lésionnelles, et notamment le KGF, l'ILla (Kovacs et al. 2010, Chen et al. 2009) et le FGF (Brenner et al. 2005). Bien que ces facteurs semblent être impliqués dans l'induction et le maintien des lésions du lentigo solaire, leurs effets n'ont été démontrés que sur des cultures de mélanocytes. Afin d'étudier les effets de ces molécules biologiques sur les épidermes reconstruits, ceux-ci ont été traités avec le KGF, le FGF et l'ILla seuls ou associés. Les molécules biologiques utilisées sont KGF 5 ng/ml (Tebu-Bio), FGF 10 ng/ml (Sigma), ILla 2 ng/ml (Sigma), FGF 10 ng/ml + KGF 5 ng/ml, ILla 2 ng/ml + KGF 20 5 ng/ml, FGF 10 ng/ml + ILla 2 ng/ml, FGF 10 ng/ml + KGF 5 ng/ml + ILla 2 ng/ml. 1.3. Immunohistochimie Les épidermes reconstruits sont fixés dans de la formaline 10% pendant 72h, puis déshydratés et inclus dans des blocs de paraffine, avant d'être coupés en sections de 5 iam. Les coupes sont déparaffinées puis démasquées (Tampon citrate pH 6 - Abcam) avant 25 d'être traitées avec 0,1% triton X-100 (Sigma) et Bovine Serum Albumine 2% (BSA - Sigma) pendant 10 minutes, afin de perméabiliser la membrane et saturer les sites de fixation. Les coupes sont ensuite incubées pendant 1h avec les anticorps primaires étudiés : anti-collagène IV (anticorps de lapin, 1/100e - Abcam), anti-melanA (anticorps de souris, 1/50° Tebu-Bio) ou anti-loricine (anticorps de lapin, 1/100e - Abcam). Après lavage 30 avec du PBS, les coupes sont incubées pendant 1 h avec les anticorps secondaires appropriés : anticorps de chèvre anti-IgG de lapin tetramethylrhodamine (1/100e - Invitrogen) ou fluorescéine FITC (1/100e - Invitrogen), anticorps de chèvre anti-souris rhodamine (1/50e - Abcys) ; et du 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI - Sigma) pour la coloration des noyaux.

Les photographies sont prises à l'aide d'un microscope de conversion de fluorescence (Nikon Eclipse 50i) et analysées avec le logiciel NIS-Elements associé ; 15 photos par condition. En parallèle, une coloration au trichrome de Masson est réalisée pour contrôler l'aspect histologique des épidermes reconstruits (Figure 2). 1.4. Dosage de la mélanine L'épiderme est décroché du derme puis transféré dans des tubes contenant des billes de céramique et 480 ul de tampon RIPA spécifique (NaOH 10 mM, NaC1 150 mM, acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) 5 mM, triton X100 2%, acide molybdique 5 JIM). Les tubes subissent trois cycles d'agitation au Précellys pendant 30 secondes à 6500 rpm, maintenus 5 minutes dans la glace entre chaque cycle. Ils sont ensuite centrifugés 5 minutes à 12000 rpm à 4°C ; le surnageant est récupéré et 5 ul de dodécylsulfate de sodium (SDS) 0,05%, 5 ul de sodium orthovanadate 1 mM (inhibiteur de phosphatase) et 10 ul de PMSF 2 mM (inhibiteurs de protéases) sont ajoutés. Les tubes sont centrifugés pendant 10 minutes à 12000 rpm à 4°C : le surnageant et le culot de mélanine sont récupérés et conservés séparément à -20°C. Les concentrations protéiques de chaque échantillon sont dosées grâce à un kit de dosage des protéines (bicinchroninic acid assay kit - Interchim). Les concentrations en mélanine de chaque échantillon sont dosées par dissolution dans 100 i.t1 de solvable (Perkin Elmer) puis lecture de l'absorbance à 485 nm. Une gamme de mélanine de synthèse est réalisée en parallèle (7 µg/ml à 1 mg/mi). Les résultats sont exprimés en lig de mélanine par lig de protéines totales. 15. Analyses statistiques Les résultats correspondent à la moyenne accompagnée de l'erreur standard 25 à la moyenne (ESM). Les données sont analysées par une ANOVA, suivie par un test de comparaison des moyennes de Tukey (logiciel JMP, SAS). Les valeurs ayant un p < 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives. IL Résultats Les essais ont été menés avec des dermes morts désépidermisés et cellules de 30 donneurs différents. 11.1. Immunomarquage des épidermes reconstruits a) Collagène IV Les zones lésionnelles du lentigo solaire sont caractérisées par une élongation des invaginations de l'épiderme dans le derme au niveau de la JDE (Caria-André et al. 2004). Le collagène IV, composant majoritaire de la JDE, constitue donc un bon marqueur de ces modifications. Des photos du marquage ont été prises (Figures 3A et 4A) puis analysées par mesure de la longueur de la JDE rapportée à la longueur de l'épideiine (Figure 1).

Les résultats obtenus lors des traitements avec KGF, FGF et/ou ILla (Figure 3B) montrent une augmentation significative de la longueur de la JDE dans les épidermes reconstruits en présence des associations FGF 10 ng/ml + ILla 2 ng/ml et ILla 2 ng/ml + KGF 5 ng/ml + FGF 10 ng/ml. Cette augmentation s'accompagne d'un aspect visuel de la JDE qui se rapproche des invaginations présentes dans le lentigo solaire (Figure 3A). Les résultats obtenus (Figure 4B et 4C) montrent que l'utilisation des milieux conditionnés issus de fibroblastes irradiés (notamment UVA 10 J/cm2 total) induit une augmentation de la longueur de la JDE dans les épidermes reconstruits et ce plus particulièrement avec les cellules vieillies artificiellement (P8) ou naturellement (issues de donneurs âgés). Cette augmentation s'accompagne d'un aspect visuel de la JDE qui se rapproche des invaginations présentes dans le lentigo solaire (Figure 4A). b) Melan A Les zones lésionnelles du lentigo solaire sont caractérisées par une couche basale hyperpigmentée due entre autre à une augmentation du nombre de mélanocytes (Noblesse et al. 2006). Le melan A est un marqueur membranaire des mélanocytes qui permet d'estimer le nombre de mélanocytes. Des photos du marquage ont été prises (Figures 5A et 6A) puis analysées par mesure du nombre de cellules melan A positives / nombre de cellules totales (DAPI). Les résultats obtenus lors des traitements avec KGF, FGF et/ou ILla (Figure 5B) montrent une augmentation significative du nombre de mélanocytes dans les reconstructions en présence de FGF 10 ng/ml seul ou des associations FGF 10 ng/ml + KGF 5 ng/ml et ILla 2 ng/ml + KGF 5 ng/ml + FGF 10 ng/ml, mais il n'y a pas de synergie entre le FGF et les molécules associées susceptibles de potentialiser l'effet du FGF. Cette augmentation est associée à la localisation des mélanocytes au niveau de la lame basale, et plus particulièrement au niveau des invaginations de l'épiderme dans le derme (Figure SA). Par contre, la présence d'ILI oc 2 ng/ml seul ou associé à FGF 10 ng/ml induit une diminution significative du nombre de mélanocytes.

Les résultats obtenus (Figures 6B et 6C) montrent que l'utilisation des milieux conditionnés issus de fibroblastes irradiés (notamment UVA 10 J/cm2 total) induit une augmentation de la quantité de mélanocytes et ce quelque soit l'âge des fibroblastes. De même que pour les références biologiques, les mélanocytes se situent dans la lame basale et plus particulièrement au niveau des invaginations de l'épiderme dans le derme (Figure 6A). c) Loricrine Les zones lésionnelles du lentigo solaire sont caractérisées par une diminution de l'involucrine provoquant un défaut de cornification (Aoki et al. 2007). La loricrine (représentant 75 % des protéines de la couche cornée) (Hitomi, 2005) est aussi un marqueur de la différenciation tardive. Le marquage de cette protéine donne une indication sur la continuité de l'enveloppe. Des photos du marquage ont été prises (Figure 7A) puis analysées par mesure du pourcentage de continuité. Pour cela, un profil d'intensités est donné par le logiciel NIS Element le long de la zone marquée. Pour chaque point du profil, une cotation égale à « 1 » est attribuée si l'intensité est supérieure à la valeur seuil déterminée par essai ; en dessous de cette valeur seuil, la cotation est de « 0 ». La somme des cotations de l'image est rapportée au nombre de valeurs du profil. Plus la moyenne obtenue est proche de « 1 », plus le marquage est continu. Les résultats obtenus (Figure 7B) montrent que l'utilisation des milieux conditionnés issus de fibroblastes irradiés (notamment UVA 10 J/cm2 total) provoque une discontinuité du marquage loricrine et ce plus particulièrement avec les cellules vieillies artificiellement (P8) ou naturellement (issues de donneurs âgés). Cette diminution met donc en évidence un défaut de différenciation terminale (Figure 7A). 11.2. Dosage de la mélanine Les zones lésionnelles du lentigo solaire sont caractérisées par une couche basale hyperpigmentée due à une augmentation de la quantité de mélanine (Noblesse et al. 2006). Les résultats obtenus montrent que l'utilisation des milieux conditionnés issus de fibroblastes irradiés (notamment UVA 10 J/cm2 total) provoque une augmentation de la quantité de mélanine et ce plus particulièrement avec les cellules vieillies artificiellement et naturellement (P8, issues de donneurs âgés) (Figure 8A).

Pour les autres conditions, les résultats obtenus sont les mêmes, avec une augmentation plus importante de la quantité de mélanine pour les épidermes reconstruits en présence de milieux conditionnés issus de fibroblastes irradiés avec UVA 5 J/cm2 total (Figure 8B).

III. Conclusions Ces résultats montrent, pour la première fois, que l'utilisation de milieux conditionnés issus de fibroblastes irradiés et vieillis (en remplacement du milieu de différenciation classique utilisé lors de la reconstruction) ou des références biologiques (KGF, FGF et IL1 a) seules ou associées permet de reproduire les caractéristiques majeures du lentigo solaire incluant une augmentation de la longueur de la jonction dermo-épidermique, une augmentation du nombre de mélanocytes associée à une augmentation de la quantité de mélanine et un défaut de différenciation terminale. Les résultats obtenus par analyse du collagène IV montrent une augmentation de la longueur de la JDE dans les épidermes reconstruits en présence des associations FGF + IL1 a et FGF + KGF + IL1 a. De plus, l'analyse du melan A, marqueur membranaire des mélanocytes, montre une augmentation significative du nombre de mélanocytes dans les reconstructions en présence de FGF seul ou des associations FGF + KGF et FGF + KGF + IL1 a.

Il ressort de ces essais que, contrairement à des études présentées dans la littérature (Chen et al. 2009), le KGF seul à une dose de 5 ng/ml ou associé à de l'IL 1 a 2 ng/ml ne permet pas d'augmenter le dépôt de mélanine in vitro sur cultures de mélanocytes. Les résultats obtenus lors des traitements avec les références biologiques suggèrent que le meilleur traitement pour reproduire des caractéristiques du lentigo solaire 20 serait l'association FGF 10 ng/ml + KGF 5 ng/ml + ILla 2 ng/ml.

Claims

REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un modèle d'épiderme reconstruit reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse, caractérisé en ce qu'il comprend : la préparation d'un modèle d'épiderme composé de kératinocytes et de mélanocytes cultivés sur un derme mort désépidermisé ; le traitement dudit modèle au cours de sa différenciation avec un milieu de différenciation choisi parmi un milieu de différenciation classique mélangé à un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis et un milieu de différenciation classique enrichi avec au moins du FGF.
2. Procédé de préparation d'un modèle d'épiderme reconstruit reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu de différenciation classique enrichi avec au moins du FGF est composé d'un milieu de différenciation classique et de 5 et 15 ng/ml de FGF.
3. Procédé de préparation d'un modèle d'épiderme reconstruit reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit milieu de différenciation classique enrichi avec au moins du FGF comprend en outre entre 1 et 10 ng/ml de KGF et/ou entre 1 et 3 mg/ml d' IL-1 a et/ou au moins une cytokine choisie parmi IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 et TNFa.
4. Procédé de préparation d'un modèle d'épiderme reconstruit reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu de différenciation classique mélangé à un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis est composé de 30 à 70% en poids d'un milieu de différenciation classique et entre 30 à 70% en poids d'un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis.
5. Procédé de préparation d'un modèle d'épiderme reconstruit reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdits fibroblastes vieillis sont obtenus par un nombre de passages successifs compris entre 2 et 10 (P2 à P10) et traité par irradiation UVA à une puissance comprise entre 5 et 15 J/cm2.
6. Procédé de préparation d'un modèle d'épiderme reconstruit reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse selon l'un quelconque des revendications qui précèdent, caractérisé en ce que ledit modèle d'épiderme est cultivé dans ledit milieu de différenciation à partir du jour 5 et jusqu'au jour 11 de la différenciation et en ce que ledit milieu de différenciation est éventuellement renouvelé une ou plusieurs fois entre les jours 5 et 11.
7. Modèle d'épiderme reconstruit reproduisant au moins une caractéristique des taches de vieillesse susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ledit modèle comprenant un équivalent d'épiderme composé de kératinocytes et de mélanocytes cultivés sur un derme mort désépidermisé, ledit modèle d'épiderme étant caractérisé en ce qu'il reproduit au moins une caractéristique des taches de vieillesse choisie parmi une augmentation de la longueur de jonction dermo-épidermique (JDE) avec des invaginations de l'épiderme dans le derme ; une augmentation de la quantité de mélanocytes présents au niveau de la lame basale et de préférence au niveau des invaginations ; un défaut de différenciation au niveau de la continuité du marquage de la 10 loricrine ; et une augmentation de la quantité de mélanine.
8. Utilisation d'un milieu de différenciation choisi parmi un milieu de différenciation classique mélangé à un milieu conditionné par des fibroblastes vieillis et un milieu de différenciation classique enrichi avec au moins du FGF pour traiter un épiderme reconstruit comprenant des kératinocytes et des mélanocytes cultivés sur un derme mort 15 désépidermisé et induire une différenciation telle que ledit épiderme présente au moins une des manifestations caractéristiques du lentigo sénile choisie parmi une augmentation de la longueur de jonction dermo-épidermique (JDE) et des invaginations de l'épiderme dans le derme ; une augmentation de la quantité de mélanocytes présents au niveau de la lame basale ; un défaut de différenciation au niveau de la continuité du marquage de la loricrine ; et une 20 accumulation de la mélanine.
9. Utilisation du modèle d'épiderme selon la revendication 7 pour évaluer l'activité inhibitrice d'un composé sur la formation de tache de vieillesse.
10. Procédé d'identification d'un actif capable de prévenir et/ou de traiter les taches de vieillesse comprenant les étapes suivantes : 25 a) préparation d'un premier modèle d'épiderme reconstruit par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ; b) préparation d'un second modèle d'épiderme reconstruit par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 tel que le milieu de différenciation utilisé est le même que celui utilisé pour préparer le ledit premier modèle et qu'il 30 comprend également une molécule à tester ; c) comparaison des caractéristiques des modèles d'épiderme obtenus aux étapes a) et b) et sélection des actifs capables d'empêcher l'apparition de manifestation caractéristique des taches de vieillesse.