FR3004537A1 - METHOD FOR MEASURING A SURFACE PLASMON RESONANCE INTEREST MEDIUM AND SYSTEM THEREOF - Google Patents

METHOD FOR MEASURING A SURFACE PLASMON RESONANCE INTEREST MEDIUM AND SYSTEM THEREOF Download PDF

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FR3004537A1 FR1353239A FR1353239A FR3004537A1 FR 3004537 A1 FR3004537 A1 FR 3004537A1 FR 1353239 A FR1353239 A FR 1353239A FR 1353239 A FR1353239 A FR 1353239A FR 3004537 A1 FR3004537 A1 FR 3004537A1
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Abstract

Procédé de mesure d'un milieu d'intérêt (100) par résonance de plasmon de surface, comprenant : - éclairer par une source lumineuse (200) une première surface d'une couche métallique entre le milieu d'intérêt (100) et la source (200), - produire, au niveau d'une deuxième surface de la couche métallique, à une interface avec le milieu d'intérêt (100), un premier champ électromagnétique (460) évanescent de plasmon de surface, - soumettre le premier champ (460) à un milieu diffusant ou luminescent comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence dans le milieu d'intérêt (100) un deuxième champ électromagnétique (480) fonction du premier champ (460), - réaliser une mesure de résonance de plasmon de surface par un capteur (500) du deuxième champ (480), - obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission à partir du deuxième champ (480).A method of measuring a medium of interest (100) by surface plasmon resonance, comprising: - illuminating with a light source (200) a first surface of a metal layer between the medium of interest (100) and the source (200) - producing, at a second surface of the metal layer, at an interface with the medium of interest (100), a first evanescent electromagnetic field (460) of surface plasmon, - subjecting the first field (460) to a diffusing or luminescent medium comprising diffusing or luminescent elements stably distributed therein, so as to diffuse or emit by luminescence into the medium of interest (100) a second electromagnetic field (480) according to of the first field (460), - performing a surface plasmon resonance measurement by a sensor (500) of the second field (480), - obtaining a transmission surface plasmon imaging map from the second field (480) ).

Description

Procédé de mesure d'un milieu d'intérêt par résonance de plasmon de surface et système associé Domaine de l'invention L'invention concerne un procédé et un système de mesure d'un milieu d'intérêt par résonance de plasmon de surface. Etat de l'art Les biocapteurs présentent de nombreux domaines d'application. Ils sont ainsi utilisés pour la quantification de biomolécules. Certains biocapteurs reposent sur des techniques de lecture optique. Les techniques par fluorescence présentent une grande sensibilité de mesure mais nécessitent un marquage préalable des molécules à analyser. Il en résulte un surcoût associé important et un temps de préparation considérable. Elles modifient aussi la structure des molécules à analyser ce qui peut introduire un biais. Le plasmon de surface (SP) est un mode d'oscillation d'électrons de conduction d'un métal à l'interface avec un diélectrique. Il se manifeste sous la forme d'une onde qui se propage le long de l'interface, l'onde étant associée à un champ électromagnétique évanescent, c'est-à-dire qu'il est confiné à la surface (décroissance exponentielle). Une technique développée pour les biocapteurs et utilisant des SP est désignée sous le nom de SPR (pour « Surface Plasmon Resonance »). La configuration standard comprend une couche métallique séparant 2 milieux diélectriques : le milieu d'intérêt et un milieu d'indice de réfraction plus élevé. Une première surface du film métallique à l'interface avec le milieu d'indice élevé est éclairée par une onde lumineuse incidente. Lorsque les conditions de résonance plasmonique sont réunies, un SP se propage à l'interface entre la couche métallique et 1 le milieu d'intérêt, au niveau d'une deuxième surface de la couche métallique opposée à la première surface. L'onde lumineuse traverse par exemple un prisme afin d'assurer un couplage entre l'onde incidente et le plasmon de surface se propageant à l'interface couche métallique et milieu d'intérêt. La deuxième surface peut être fonctionnalisée ; elle peut ainsi présenter des biomolécules fixées, les biomolécules pouvant s'associer sélectivement avec une molécule d'intérêt dont on veut mesurer la présence dans le milieu d'intérêt. Au couplage entre la lumière incidente et le SP est associé un angle d'incidence de résonance OSP. A cet angle de résonance OSP correspond une baisse abrupte et un minimum de l'intensité du faisceau réfléchi par la première surface issu de la lumière incidente. Cette valeur OSP dépend fortement de l'indice optique du milieu d'intérêt au voisinage de la deuxième surface, et donc de la concentration en molécules au niveau de la deuxième surface, et donc de l'association entre les biomolécules fixées et les molécules d'intérêt. A partir de l'évolution de l'intensité réfléchie en fonction de l'angle d'incidence, on mesure la variation temporelle de l'indice de réfraction local proche de l'interface métal/milieu d'intérêt. Ceci permet de quantifier les molécules d'intérêt qui se sont liées à la surface et de suivre leur dynamique d'association et de dissociation avec l'interface fonctionnalisée. Il est ainsi possible de mesurer la présence de molécules d'intérêt dans le milieu d'intérêt sans réaliser de marquage préalable de ces molécules. A ce jour, la lecture optique des systèmes SPR peut se faire de différentes façons : La première propose de balayer l'angle d'incidence afin de reconstituer le pic d'absorption et de mesurer la variation de la position angulaire du maximum d'absorption OSP ou bien la variation de la position angulaire de la pente maximale du pic d'absorption 2 Une autre méthode propose de se fixer à une position angulaire proche de la résonnance qui maximise la variation de la réflectivité en fonction de la concentration en biomolécules. On mesure alors la variation d'intensité de la réflectivité. Cette méthode possède l'avantage d'être plus rapide car elle ne nécessite pas de balayage. On se place en général au niveau de la pente maximale du pic d'absorption en fonction de l'angle d'incidence, ce qui maximise la sensibilité du capteur. il est aussi possible d'utiliser une source lumineuse polychromatique et d'étudier le décalage spectral de la résonance. Certaines configurations, dites SPRi (pour imagerie SPR) proposent d'effectuer une imagerie SPR permettant un multiplexage, c'est-à-dire plusieurs mesures en parallèle, en cartographiant un champ électromagnétique réfléchi. Il est ainsi possible de mesurer plusieurs interactions en des zones différentes de la couche métallique. Le système SPRi-PIexTM de la société Genoptics, est un exemple commercial de ce type de configuration. Cependant dans ces systèmes basés sur la lecture optique du faisceau réfléchi, la parallélisation des mesures est limitée par une faible résolution latérale due à la présence du prisme qui ne permet pas de s'approcher de l'interface couche métallique/milieu d'intérêt ; ceci limite l'ouverture numérique du système de collection. Augmenter la résolution spatiale de ces systèmes nécessite d'élargir la dispersion angulaire du faisceau réfléchi. Cette dispersion est liée à celle du faisceau incident. Or, la sensibilité à la variation de l'indice de réfraction dépend, au premier ordre, de l'inverse de la dispersion angulaire. La résolution spatiale et la sensibilité de la cartographie SPR sont donc deux paramètres complémentaires.FIELD OF THE INVENTION The invention relates to a method and a system for measuring a medium of interest by surface plasmon resonance. State of the art Biosensors have many fields of application. They are thus used for the quantification of biomolecules. Some biosensors rely on optical reading techniques. Fluorescence techniques have high measurement sensitivity but require prior labeling of the molecules to be analyzed. This results in a significant additional cost and a considerable preparation time. They also modify the structure of the molecules to be analyzed, which can introduce a bias. Surface plasmon (SP) is a mode of electron oscillation of conduction of a metal at the interface with a dielectric. It is manifested as a wave that propagates along the interface, the wave being associated with an evanescent electromagnetic field, that is, it is confined to the surface (exponential decay) . A technique developed for biosensors using SP is referred to as SPR (for "Surface Plasmon Resonance"). The standard configuration comprises a metal layer separating 2 dielectric media: the medium of interest and a medium of higher refractive index. A first surface of the metal film at the interface with the high index medium is illuminated by an incident light wave. When the plasmon resonance conditions are joined, an SP propagates at the interface between the metal layer and the medium of interest, at a second surface of the metal layer opposite to the first surface. For example, the light wave passes through a prism in order to ensure a coupling between the incident wave and the surface plasmon propagating at the metal layer and medium of interest interface. The second surface can be functionalized; it can thus present fixed biomolecules, the biomolecules being able to associate selectively with a molecule of interest whose presence in the medium of interest is to be measured. The coupling between the incident light and the SP is associated with an OSP resonance incidence angle. At this OSP resonance angle corresponds an abrupt drop and a minimum of the intensity of the beam reflected by the first surface resulting from the incident light. This OSP value strongly depends on the optical index of the medium of interest in the vicinity of the second surface, and therefore on the concentration of molecules at the level of the second surface, and therefore on the association between the fixed biomolecules and the molecules of the 'interest. From the evolution of the reflected intensity as a function of the angle of incidence, the temporal variation of the local refractive index near the metal / medium interface of interest is measured. This makes it possible to quantify the molecules of interest that are bound to the surface and to follow their dynamics of association and dissociation with the functionalized interface. It is thus possible to measure the presence of molecules of interest in the medium of interest without performing preliminary labeling of these molecules. To date, the optical reading of the SPR systems can be done in different ways: The first proposes to scan the angle of incidence to reconstruct the absorption peak and measure the variation of the angular position of the absorption maximum OSP or the variation of the angular position of the maximum slope of the absorption peak 2 Another method proposes to be fixed at an angular position close to the resonance which maximizes the variation of the reflectivity as a function of the concentration of biomolecules. The intensity variation of the reflectivity is then measured. This method has the advantage of being faster because it does not require scanning. In general, the maximum slope of the absorption peak is set as a function of the angle of incidence, which maximizes the sensitivity of the sensor. it is also possible to use a polychromatic light source and to study the spectral shift of the resonance. Some configurations, called SPRi (for SPR imaging) propose to perform an SPR imaging allowing multiplexing, that is to say several measurements in parallel, by mapping a reflected electromagnetic field. It is thus possible to measure several interactions in different zones of the metal layer. The SPRi-PIexTM system from Genoptics is a commercial example of this type of configuration. However, in these systems based on the optical reading of the reflected beam, the parallelization of the measurements is limited by a low lateral resolution due to the presence of the prism that does not allow to approach the metal layer interface / medium of interest; this limits the numerical aperture of the collection system. To increase the spatial resolution of these systems requires to widen the angular dispersion of the reflected beam. This dispersion is linked to that of the incident beam. Now, the sensitivity to the variation of the refractive index depends, in the first order, on the inverse of the angular dispersion. The spatial resolution and the sensitivity of the SPR map are therefore two complementary parameters.

L'augmentation du multiplexage se fait donc au détriment de la sensibilité du biocapteur. Pour s'affranchir du désavantage du prisme, il 3 est possible de le substituer par un objectif à grande ouverture numérique à immersion dans l'huile dans une configuration en réflexion totale interne. De la même façon qu'en imagerie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF), l'angle d'incidence 0 du faisceau dépend de la position p du faisceau dans le plan focal arrière de l'objectif (pupille de l'objectif). B = asin(fla) , avec le paramètre géométrique a dépendant de l'objectif et de l'indice de l'huile. Cette géométrie est utilisée en imagerie SPR pour cartographier en particulier des membranes cellulaires. Cependant la sensibilité à l'indice optique de cette configuration est bien plus faible car la dispersion angulaire du faisceau incident dépend de la taille 4p du faisceau focalisé dans le plan focal arrière. Op At9 = ,\11 - (D2 La dispersion angulaire devient ainsi de plus en plus conséquente lorsque l'on s'approche des grands angles d'incidence nécessaires aux conditions d'excitation du SP. De plus, en pratique, le réglage du faisceau incident, et notamment la maitrise de sa dispersion angulaire, lors de son passage par l'objectif s'avère très délicat. Les documents W02009078511 et W02011105692 décrivent des systèmes de mesure par marquage fluorescent et imagerie de fluorescence, l'intensité du rayonnement produit par les marqueurs fluorescents associés aux biomolécules fixées sur un support étant augmentée en soumettant ces molécules à un champ électromagnétique par SPR. Ces systèmes présentent les inconvénients liés au marquage cités précédemment. Le document W03091713 décrit un système permettant de réaliser en parallèle une mesure par marquage fluorescent et une mesure par imagerie SPR de réflexion. L'imagerie par marquage fluorescent fournit 4 des informations quantitatives uniquement par le nombre de molécules marquées détectées est reste donc peu précise par rapport à l'imagerie SPR. L'imagerie SPR présente les mêmes inconvénients décrits ci-avant de diminution de la précision lors d'une mise en parallèle.The increase in multiplexing is therefore to the detriment of the sensitivity of the biosensor. In order to overcome the disadvantage of the prism, it is possible to substitute it with a high numerical aperture objective for immersion in the oil in a total internal reflection configuration. In the same way as in total internal reflection fluorescence (TIRF) imaging, the angle of incidence 0 of the beam depends on the position p of the beam in the rear focal plane of the objective (pupil of the objective). . B = asin (fla), with the geometric parameter a depending on the objective and the index of the oil. This geometry is used in SPR imaging to map in particular cell membranes. However, the sensitivity to the optical index of this configuration is much lower because the angular dispersion of the incident beam depends on the size 4p of the focused beam in the rear focal plane. Op At9 =, \ 11 - (D2 The angular dispersion thus becomes more and more consistent when one approaches the large angles of incidence necessary for the conditions of excitation of the SP. In addition, in practice, the adjustment of the incident beam, and especially the control of its angular dispersion, during its passage through the lens proves very delicate.W02009078511 and W02011105692 documents fluorescent labeling and fluorescence imaging measurement systems, the intensity of the radiation produced by the fluorescent markers associated with the biomolecules fixed on a support being increased by subjecting these molecules to an electromagnetic field by SPR These systems have the drawbacks relating to the labeling mentioned above WO09191713 discloses a system for carrying out in parallel a measurement by marking fluorescent and SPR imaging reflection imaging Fluorescent labeling provides 4 Quantitative responses only by the number of labeled molecules detected is therefore not accurate compared to SPR imaging. The SPR imaging has the same disadvantages described above of reducing the accuracy during a paralleling.

Présentation générale de l'invention Un but de l'invention est de fournir un procédé et un système de mesure qui ne présente pas les inconvénients des systèmes décrits ci- avant. Un but de l'invention est ainsi de présenter une plus grande résolution latérale en conservant une grande sensibilité. Un autre but de l'invention est de proposer un procédé et un système de mesure présentant ces avantages sans impliquer une 15 augmentation de la complexité du système ou du procédé associé. A cet effet, il est prévu un procédé de mesure d'un milieu d'intérêt par résonance de plasmon de surface, le procédé comprenant des étapes consistant à : - éclairer par une source lumineuse une première surface d'une 20 couche métallique d'un support disposé entre le milieu d'intérêt et la source lumineuse, - produire, au niveau d'une deuxième surface de la couche métallique, à une interface avec le milieu d'intérêt, un premier champ électromagnétique évanescent de plasmon de surface, 25 - soumettre le premier champ électromagnétique évanescent à un milieu diffusant ou luminescent comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence dans le milieu d'intérêt un deuxième champ électromagnétique fonction 30 du premier champ électromagnétique, 5 - réaliser une mesure de résonance de plasmon de surface, par un capteur de lumière, du deuxième champ électromagnétique diffusé ou émis par luminescence, - obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission à partir du deuxième champ électromagnétique mesuré. L'invention peut être avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises seules ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles - la cartographie obtenue est une cartographie de la variation d'une concentration moléculaire à l'interface, - la cartographie obtenue est une cartographie de variation de densité de matière à l'interface, - la cartographie obtenue est une cartographie d'indice optique à l'interface, - l'imagerie de plasmon de surface est une imagerie de plasmon de surface plein champ, - dans lequel le milieu diffusant ou luminescent est une couche diffusante ou luminescente solide du support, - une couche en un matériau diélectrique est disposée entre la couche métallique et la couche diffusante ou luminescente solide, - une étape de fonctionnalisation par un traitement une surface de la couche diffusante ou luminescente solide destinée à être mise en contact avec le milieu d'intérêt, - la couche diffusante ou luminescente solide est obtenue par un traitement chimique superficiel de la couche métallique, - la couche diffusante ou luminescente solide est obtenue par dépôt de fluorochromes et/ou de boîtes quantiques, 6 - la couche diffusante ou luminescente solide est obtenue par dépôt d'une couche de polymères luminescents ou de chaînes carbonées luminescentes, - le milieu diffusant ou luminescent comprend un état de rugosité d'une surface, - le milieu diffusant ou luminescent est un milieu liquide dans lequel sont dissouts les éléments diffusants ou luminescents. L'invention concerne également un système de mesure par résonance de plasmon de surface d'un milieu d'intérêt adapté pour mettre 10 en oeuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système comprenant : - un support en contact avec le milieu d'intérêt, le support comprenant une couche métallique, - une source lumineuse, le support étant disposé entre le milieu 15 d'intérêt et la source lumineuse, pour éclairer une première surface de la couche métallique selon un angle ; la source lumineuse et le support étant adaptés pour produire, au niveau d'une deuxième surface de la couche métallique, à une interface avec le milieu d'intérêt, un premier champ électromagnétique 20 évanescent de plasmon de surface, - un milieu diffusant ou luminescent, le milieu diffusant ou luminescent comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence un deuxième champ 25 électromagnétique fonction du premier champ électromagnétique à partir du premier champ électromagnétique évanescent transmis aux éléments diffusants ou luminescent, - un capteur de lumière disposé de sorte à mesurer le deuxième champ électromagnétique diffusé ou émis par luminescence, 30 - des moyens de traitement de données de plasmon de surface du deuxième champ électromagnétique, les données étant 7 issues des mesures du capteur de lumière, les moyens de traitement de données étant adaptés pour obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission. L'invention concerne en outre l'utilisation d'un tel procédé ou d'un 5 tel système pour une cartographie d'imagerie de plasmon surface d'une membrane cellulaire fonctionnalisée disposée dans le milieu d'intérêt. Présentation des figures 10 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront lors de la description ci-après d'un mode de réalisation. Aux dessins annexés : - la figure 1 représente un système selon un exemple de mode de 15 réalisation de l'invention, - la figure 2 représente un support d'un système selon un exemple de mode de réalisation de l'invention, - la figure 3 représente un support fonctionnalisé d'un système selon un exemple de mode de réalisation de l'invention, 20 - la figure 4 illustre une utilisation pour l'imagerie membranaire d'un système ou d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention, - la figure 5 représente sous forme d'un graphique des données mesurées au cours d'un procédé selon un exemple de mode de 25 réalisation de l'invention en fonction de l'angle d'excitation d'une solution eau-éthanol, - la figure 6 représente sous forme d'un graphique l'évolution de l'indice optique d'une solution eau-éthanol en fonction du temps obtenue par un procédé selon un exemple de mode de réalisation 30 de l'invention, 8 - la figure 7 représente sous forme d'un graphique une tomographie d'un motif lithographié de silice obtenu par un procédé selon un exemple de mode réalisation de l'invention, - la figure 8 représente sous forme d'un organigramme un procédé selon un exemple de mode de réalisation de l'invention. Description de l'invention Système de mesure En référence à la figure 1, un système de mesure par résonance de plasmon de surface d'un milieu d'intérêt 100 est décrit. Le milieu d'intérêt est par exemple un milieu liquide dont on veut mesurer une concentration moléculaire, ou la concentration moléculaire en un certain élément cible, par exemple une biomolécule. Support En référence à la figure 2, le système comprend un support 300 en zo contact avec le milieu d'intérêt 100. Le support 300 comprend une couche métallique 310. La couche métallique présente une première surface 312 et une deuxième surface 314. La couche métallique peut comprendre une couche mince d'or ou d'argent, ou d'un autre métal ou alliage métallique adapté. La couche 25 métallique peut avoir une épaisseur de 20 à 100 nm, par exemple une épaisseur de 40 à 65 nm, par exemple une épaisseur de 50 nm. Ainsi, la couche métallique est par exemple une couche mince d'or ou d'argent de 30 à 80 nm d'épaisseur. Le support peut comprendre une couche de substrat 320. La 30 couche de substrat 320 peut être réalisée en un matériau transparent, par exemple en un verre, par exemple en silice. La couche de substrat 320 9 peut être réalisée en un matériau transparent possédant un indice de réfraction supérieur à celui du milieu d'intérêt. La couche de substrat 320 est par exemple une lame de verre ou un prisme, un dépôt métallique pouvant être directement réalisé sur un prisme. La couche métallique peut 5 avoir été déposée sur la couche de substrat 320. La couche de substrat 320 peut être réalisée de sorte à assurer la robustesse du support 300, par exemple pour renforcer la couche métallique 310 et assurer une meilleure durabilité du support 300. La couche de substrat 320 peut présenter une épaisseur supérieure à celle de la couche métallique 310. 10 La couche de substrat a par exemple une épaisseur comprise entre 100 et 500 nm. L'interface substrat 320 / couche métallique 310 peut être située sur la première surface 312 de la couche métallique. En outre, une sous-couche dite d'adhésion peut être disposée entre la couche métallique 310, 15 présentant les propriétés plasmoniques, et le substrat 320 afin d'assurer l'adhésion de la couche métallique 310. La sous-couche mesure par exemple quelques nanomètres. La sous-couche peut être par exemple en chrome ou titane. zo Source lumineuse Le système comprend une source lumineuse 200. Le support 300 est disposé entre le milieu d'intérêt 100 et la source lumineuse 200. La couche de substrat 320 est par exemple disposée entre la couche métallique 310 et la source lumineuse 200. 25 La source lumineuse 200 peut être une source d'un faisceau lumineux incident 420, par exemple d'un rayonnement monochromatique. La source lumineuse 200 est par exemple une source d'un rayonnement monochromatique cohérent, par exemple de type laser. La source lumineuse 200 est par exemple une source d'un rayonnement 30 monochromatique non cohérent, par exemple une diode électroluminescente. 10 La source lumineuse 200 et le support 300 sont adaptés pour produire au niveau de la deuxième surface 314 de la couche métallique 310 un premier champ électromagnétique 460 évanescent de plasmon de surface.GENERAL OVERVIEW OF THE INVENTION An object of the invention is to provide a method and a measurement system which does not have the disadvantages of the systems described above. An object of the invention is thus to present a greater lateral resolution while maintaining a high sensitivity. Another object of the invention is to provide a method and a measurement system having these advantages without involving an increase in the complexity of the associated system or method. To this end, there is provided a method for measuring a medium of surface plasmon resonance interest, the method comprising the steps of: - illuminating with a light source a first surface of a metallic layer of a support arranged between the medium of interest and the light source, - producing, at a second surface of the metal layer, at an interface with the medium of interest, a first evanescent electromagnetic field of surface plasmon, 25 subjecting the first evanescent electromagnetic field to a diffusing or luminescent medium comprising diffusing or luminescent elements stably distributed therein, so as to diffuse or emit by luminescence into the medium of interest a second electromagnetic field which is a function of the first electromagnetic field, 5 - perform a measurement of surface plasmon resonance, by a light sensor, of the second electromagnetic field Ethereal scattered or emitted by luminescence, - obtain a surface plasmon imaging mapping in transmission from the second measured electromagnetic field. The invention may be advantageously completed by the following characteristics, taken alone or according to any of their technically possible combinations - the mapping obtained is a mapping of the variation of a molecular concentration at the interface, - the mapping obtained is a mapping of density of matter at the interface, - the mapping obtained is an optical index mapping at the interface, - the surface plasmon imaging is a full field surface plasmon imaging, - in which the diffusing or luminescent medium is a solid diffusing or luminescent layer of the support, - a layer made of a dielectric material is disposed between the metal layer and the solid diffusing or luminescent layer, - a step of functionalization by a treatment of a surface of the diffusing layer or luminescent solid intended to be brought into contact with the medium of interest, - the diffusing layer or lumen solid inescente is obtained by a superficial chemical treatment of the metal layer, - the solid diffusing or luminescent layer is obtained by deposition of fluorochromes and / or quantum boxes, 6 - the solid diffusing or luminescent layer is obtained by deposition of a layer of luminescent polymers or luminescent carbon chains, the diffusing or luminescent medium comprises a roughness state of a surface, the diffusing or luminescent medium is a liquid medium in which the diffusing or luminescent elements are dissolved. The invention also relates to a surface plasmon resonance measurement system of a medium of interest adapted to implement a method according to any one of the preceding claims, the system comprising: a support in contact with the medium of interest, the medium comprising a metal layer; a light source, the medium being disposed between the medium of interest and the light source, for illuminating a first surface of the metal layer at an angle; the light source and the support being adapted to produce, at a second surface of the metal layer, at an interface with the medium of interest, a first evanescent electromagnetic field of surface plasmon, - a diffusing or luminescent medium , the diffusing or luminescent medium comprising diffusing or luminescent elements stably distributed therein, so as to diffuse or emit by luminescence a second electromagnetic field which is a function of the first electromagnetic field from the first evanescent electromagnetic field transmitted to the diffusing elements or luminescent, - a light sensor arranged to measure the second electromagnetic field scattered or emitted by luminescence, - the surface plasmon data processing means of the second electromagnetic field, the data being 7 from the measurements of the sensor of light, the means of data processing adapted to obtain a transmission surface plasmon imaging map. The invention further relates to the use of such a method or system for imaging plasmon imaging of a functionalized cell membrane disposed in the medium of interest. Other features and advantages of the invention will become apparent from the following description of an embodiment. In the accompanying drawings: FIG. 1 represents a system according to an exemplary embodiment of the invention, FIG. 2 represents a support of a system according to an exemplary embodiment of the invention, FIG. 3 shows a functionalized support of a system according to an exemplary embodiment of the invention; FIG. 4 illustrates a use for membrane imaging of a system or method according to an embodiment of the invention. FIG. 5 shows graphically the data measured in a method according to an exemplary embodiment of the invention as a function of the excitation angle of a water-water solution. ethanol; FIG. 6 represents in graphical form the evolution of the optical index of a water-ethanol solution as a function of time obtained by a method according to an exemplary embodiment of the invention, FIG. 7 represents in the form of a graph a tomography of a lithographed silica pattern obtained by a method according to an exemplary embodiment of the invention; FIG. 8 represents in the form of a flowchart a method according to an exemplary embodiment of the invention. Description of the Invention Measuring System With reference to FIG. 1, a surface plasmon resonance measurement system of a medium of interest 100 is described. The medium of interest is for example a liquid medium for which a molecular concentration is to be measured, or the molecular concentration of a certain target element, for example a biomolecule. Support With reference to FIG. 2, the system comprises a support 300 in contact with the medium of interest 100. The support 300 comprises a metal layer 310. The metal layer has a first surface 312 and a second surface 314. The layer metal may comprise a thin layer of gold or silver, or other suitable metal or metal alloy. The metal layer may have a thickness of 20 to 100 nm, for example a thickness of 40 to 65 nm, for example a thickness of 50 nm. Thus, the metal layer is for example a thin layer of gold or silver 30 to 80 nm thick. The support may comprise a substrate layer 320. The substrate layer 320 may be made of a transparent material, for example a glass, for example silica. The substrate layer 320 9 may be made of a transparent material having a refractive index greater than that of the medium of interest. The substrate layer 320 is for example a glass slide or a prism, a metal deposit that can be directly made on a prism. The metal layer may have been deposited on the substrate layer 320. The substrate layer 320 may be made so as to ensure the robustness of the support 300, for example to reinforce the metal layer 310 and to ensure a better durability of the support 300. The substrate layer 320 may have a thickness greater than that of the metal layer 310. For example, the substrate layer has a thickness of between 100 and 500 nm. The substrate interface 320 / metal layer 310 may be located on the first surface 312 of the metal layer. In addition, a so-called adhesion sub-layer may be disposed between the metal layer 310, having the plasmonic properties, and the substrate 320 to ensure the adhesion of the metal layer 310. The sub-layer measures for example a few nanometers. The underlayer may be for example chromium or titanium. zo Light source The system comprises a light source 200. The support 300 is disposed between the medium of interest 100 and the light source 200. The substrate layer 320 is for example disposed between the metal layer 310 and the light source 200. The light source 200 may be a source of an incident light beam 420, for example a monochromatic radiation. The light source 200 is for example a source of coherent monochromatic radiation, for example of the laser type. The light source 200 is for example a source of non-coherent monochromatic radiation, for example a light-emitting diode. The light source 200 and the support 300 are adapted to produce at the second surface 314 of the metal layer 310 a first evanescent electromagnetic field 460 of surface plasmon.

La source lumineuse 200 permet d'éclairer la première surface 312 de la couche métallique 310. Cet éclairage est réalisé selon un angle de sorte produire, au niveau de la deuxième surface 314 de la couche métallique 310, le premier champ électromagnétique 460 évanescent de plasmon de surface. L'angle est par exemple un angle d'incidence 10 spécifique de plasmon de surface correspondant à une réflexion totale du champ propagatif correspondant, correspondant ainsi à un pic d'absorption de lumière réfléchie, par exemple du faisceau réfléchi 440. Le premier champ électromagnétique 460 évanescent est produit à une interface avec le milieu d'intérêt 100. Par interface entre la deuxième 15 surface 314 et le milieu d'intérêt, on entend la zone les séparant. L'interface peut ainsi se réduire à une surface d'interaction entre les deux, ou comprendre une zone d'une épaisseur donnée non nulle. L'interface est d'une épaisseur suffisamment faible pour que le premier champ électromagnétique 460 évanescent dépende du milieu d'intérêt, en 20 particulier de l'indice optique du milieu d'intérêt au voisinage de la deuxième surface 324. Une telle influence est typiquement sensible sur une profondeur de l'ordre de 100 nm, qui correspond à l'ordre de grandeur de pénétration du premier champ électromagnétique 460 évanescent. Le système peut comprendre un prisme 350. Le prisme 350 est par 25 exemple un prisme en verre. Le support 300 peut être posé sur le prisme 350. La continuité d'indice entre le support 300 et le prisme 350 peut être assuré par un fluide de couplage, par exemple de l'huile. Alternativement, le support peut reposer et être en contact avec un fluide de couplage tel que de l'huile, le fluide de couplage se substituant alors au prisme. Un 30 milieu diélectrique peut ainsi être formé et comprendre le prisme 350 et/ou l'huile et/ou la couche de substrat. 11 Milieu diffusant ou luminescent Le système comprend un milieu diffusant ou luminescent 330. Le milieu diffusant ou luminescent 330 comprend des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci. Les éléments diffusants ou luminescents sont répartis de sorte à diffuser ou émettre par luminescence un deuxième champ électromagnétique 480 fonction du premier champ électromagnétique 460. Le deuxième champ électromagnétique 480 est un champ Io électromagnétique propagatif. Par stable on entend que la répartition est conservée durant une période de temps déterminée durant laquelle une étape de mesure est réalisée. La stabilité n'implique pas nécessairement que les éléments diffusants ou luminescents soient immobiles. La stabilité de la répartition 15 peut être obtenue par exemple par un système de microfluidique permettant de conserver une répartition locale stationnaire même si les éléments diffusants ou luminescents sont en mouvement. Le deuxième champ électromagnétique 480 est diffusé ou émis à partir du premier champ électromagnétique 460 évanescent transmis aux zo éléments diffusants ou luminescents. La profondeur de pénétration du premier champ électromagnétique 460 évanescent étant typiquement de l'ordre de 100 nm, une partie du milieu diffusant ou luminescent 330 est par exemple disposé dans un tel voisinage de la couche métallique 310. Le premier champ électromagnétique 460 peut par exemple exciter et 25 détecter les éléments diffusants ou luminescents situés dans ce voisinage, qui correspond par exemple à l'interface entre la deuxième surface 314 et le milieu d'intérêt 100. Contrairement aux techniques de marquage par luminescence, en particulier par fluorescence selon l'art antérieur, il n'est pas nécessaire de 30 marquer les molécules d'intérêt. Le marquage constitue une étape coûteuse aussi bien par le temps nécessaire au marquage que par le coût 12 élevé des marqueurs. Le marquage peut perturber, par ailleurs, la structure des molécules à analyser et introduire un biais dans la mesure. Ces raisons justifient l'utilisation des techniques de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur par rapport aux techniques de marquage selon l'art antérieur, en dépit de la plus faible sensibilité des premières par rapport aux deuxièmes. Dans le système décrit, le milieu diffusant ou luminescent ne constitue pas un marquage, ce qui permet de limiter le coût d'utilisation tout en bénéficiant d'une grande résolution latérale, offrant en particulier une bonne capacité de multiplexage.The light source 200 makes it possible to illuminate the first surface 312 of the metal layer 310. This illumination is produced at an angle so as to produce, at the level of the second surface 314 of the metal layer 310, the first evanescent electromagnetic field 460 of plasmon. of surface. The angle is, for example, a specific incidence angle of surface plasmon corresponding to a total reflection of the corresponding propagating field, thus corresponding to a peak of absorption of reflected light, for example from the reflected beam 440. The first electromagnetic field 460 evanescent is produced at an interface with the medium of interest 100. By interface between the second surface 314 and the medium of interest is meant the area separating them. The interface can thus be reduced to an interaction surface between the two, or comprise an area of a given non-zero thickness. The interface is of a sufficiently small thickness that the first evanescent electromagnetic field 460 depends on the medium of interest, in particular on the optical index of the medium of interest in the vicinity of the second surface 324. Such an influence is typically sensitive to a depth of the order of 100 nm, which corresponds to the order of magnitude of penetration of the first electromagnetic field 460 evanescent. The system may include a prism 350. The prism 350 is for example a glass prism. The support 300 can be placed on the prism 350. The index continuity between the support 300 and the prism 350 can be provided by a coupling fluid, for example oil. Alternatively, the support can rest and be in contact with a coupling fluid such as oil, the coupling fluid then substituting for the prism. A dielectric medium can thus be formed and include the prism 350 and / or the oil and / or the substrate layer. Diffuser or luminescent medium The system comprises a diffusing or luminescent medium 330. The diffusing or luminescent medium 330 comprises diffusing or luminescent elements stably distributed therein. The diffusing or luminescent elements are distributed so as to diffuse or emit by luminescence a second electromagnetic field 480 which is a function of the first electromagnetic field 460. The second electromagnetic field 480 is a propagating electromagnetic field Io. By stable is meant that the distribution is maintained for a period of time during which a measurement step is performed. Stability does not necessarily imply that diffusing or luminescent elements are immobile. The stability of the distribution can be obtained for example by a microfluidic system making it possible to maintain a stationary local distribution even if the diffusing or luminescent elements are in motion. The second electromagnetic field 480 is scattered or emitted from the first evanescent electromagnetic field 460 transmitted to the zo diffusing or luminescent elements. Since the penetration depth of the first evanescent electromagnetic field 460 is typically of the order of 100 nm, part of the diffusing or luminescent medium 330 is, for example, disposed in such a vicinity of the metal layer 310. The first electromagnetic field 460 may, for example exciting and detecting diffusing or luminescent elements located in this vicinity, which corresponds for example to the interface between the second surface 314 and the medium of interest 100. In contrast to the techniques of luminescence labeling, in particular by fluorescence according to the In the prior art, it is not necessary to label the molecules of interest. Marking is a costly step both in the time required for marking and in the high cost of the markers. The labeling can disturb, moreover, the structure of the molecules to be analyzed and introduce a bias in the measurement. These reasons justify the use of surface plasmon resonance techniques according to the prior art compared to marking techniques according to the prior art, despite the lower sensitivity of the former compared to the second. In the system described, the diffusing or luminescent medium does not constitute a marking, which makes it possible to limit the cost of use while benefiting from a high lateral resolution, in particular offering a good multiplexing capability.

Le milieu diffusant ou luminescent peut être un milieu diffusant. Le milieu diffusant ou luminescent peut être un milieu luminescent. Par luminescence, on entend un phénomène de type fluorescence ou phosphorescence. Le milieu luminescent peut être un milieu fluorescent ou un milieu phosphorescent.The diffusing or luminescent medium may be a diffusing medium. The diffusing or luminescent medium may be a luminescent medium. Luminescence means a phenomenon of fluorescence or phosphorescence type. The luminescent medium may be a fluorescent medium or a phosphorescent medium.

Le milieu diffusant ou luminescent peut être une couche diffusante ou luminescente 330 solide du support 300. La couche diffusante ou luminescente 330 peut être disposée entre la couche métallique 310 et le milieu d'intérêt 100. La couche diffusante ou luminescente 330 solide peut être obtenue par un traitement chimique superficiel de la couche métallique 310, par exemple par oxydation superficielle. Le milieu diffusant ou luminescent peut comprendre un état de rugosité d'une surface 314. La couche métallique 310 est par exemple une couche d'argent, la couche diffusante résultante étant alors une couche d'oxyde d'argent. En effet, une telle couche d'oxyde d'argent présente typiquement une surface diffusante. La couche diffusante ou luminescente 330 solide peut être obtenue par dépôt de fluorochromes et/ou de boîtes quantiques. La surface d'une telle couche tournée vers le milieu d'intérêt 100 forme ainsi une surface fluorescente.The diffusing or luminescent medium may be a solid diffusing or luminescent layer 330 of the support 300. The diffusing or luminescent layer 330 may be disposed between the metal layer 310 and the medium of interest 100. The solid diffusing or luminescent layer 330 may be obtained by a superficial chemical treatment of the metal layer 310, for example by surface oxidation. The diffusing or luminescent medium may comprise a roughness state of a surface 314. The metal layer 310 is for example a silver layer, the resulting diffusing layer then being a silver oxide layer. Indeed, such a silver oxide layer typically has a diffusing surface. The solid diffusing or luminescent layer 330 may be obtained by deposition of fluorochromes and / or quantum dots. The surface of such a layer facing the medium of interest 100 thus forms a fluorescent surface.

La couche diffusante ou luminescente 330 solide peut être obtenue par dépôt d'une couche de polymères luminescents ou de chaînes 13 carbonées luminescentes. Une telle couche est par exemple ancrée à la deuxième surface de la couche métallique. Une couche en un matériau diélectrique (non représentée) peut être disposée entre la couche métallique 310 et la couche diffusante ou luminescente 330 solide. Une telle couche en matériau diélectrique peut ainsi permettre d'éviter des phénomènes de désactivation, par exemple de photo-blanchiment, ou d'extinction de luminescence (« quenching » en terminologie anglo-saxonne). Une surface de la couche diffusante ou luminescente 330 solide destinée à être mise en contact avec le milieu d'intérêt 100 peut être fonctionnalisée par un traitement. Une telle fonctionnalisation peut être réalisée en vue de mesures biochimiques ou d'observations biologiques. Cette fonctionnalisation peut être réalisée juste avant la mesure. La surface de la couche diffusante ou luminescente 330 peut être 15 biofonctionnalisée par avance. En référence à la figure 3, il est décrit un exemple de support 300 d'un tel système comprenant par exemple une couche diffusante ou luminescente 330 fonctionnalisée de sorte à présenter des biomolécules formant des ligands 332 ancrés à sa surface. Ces ligands 332 peuvent par exemple se lier avec certaines biomolécules 20 d'intérêt 110 que l'on veut quantifier dans le milieu d'intérêt 100. L'imagerie par plasmon de surface telle que mise en oeuvre par le système permet en effet une grande sensibilité vis-à-vis de la concentration moléculaire à l'interface entre le support 300 et le milieu d'intérêt 100. 25 En référence à la figure 4, il est décrit un exemple de support 300 d'un tel système pour l'imagerie cellulaire. L'absence de marquage de fluorescence est un atout. Un tel marquage peut en effet induire une perturbation de la biochimie cellulaire. Une cellule 120 peut présenter une membrane qui a partiellement au moins adhéré à la surface du support 30 300, par exemple à la surface de la couche diffusante ou luminescente 14 0 et peut ainsi être observée grâce au confinement du premier champ électromagnétique 460 évanescent. Le milieu diffusant ou luminescent peut-être issu de l'état de rugosité d'une surface 314 sans nécessairement impliquer la formation d'une nouvelle couche. Il est ainsi possible d'utiliser l'état de rugosité de la couche métallique augmentée ou non par un traitement corrosif de la deuxième surface 314 de la couche métallique 310. Le milieu diffusant ou luminescent peut être un milieu liquide dans lequel sont dissouts les éléments diffusants ou luminescents. Les éléments diffusants ou luminescents sont alors répartis de manière stable dans le milieu diffusant ou luminescent. En particulier, le milieu diffusant ou luminescent liquide peut ainsi être réparti dans le milieu d'intérêt 100, par exemple par dissolution, en conservant la répartition stable des éléments diffusants ou luminescents.The solid diffusing or luminescent layer 330 can be obtained by depositing a layer of luminescent polymers or carbon-13 chains. Such a layer is for example anchored to the second surface of the metal layer. A dielectric material layer (not shown) may be disposed between the metal layer 310 and the solid diffusing or luminescent layer 330. Such a layer of dielectric material can thus prevent deactivation phenomena, for example photo-whitening, or quenching quenching ("quenching" in English terminology). A surface of the solid diffusing or luminescent layer 330 intended to be brought into contact with the medium of interest 100 may be functionalized by a treatment. Such functionalization can be performed for biochemical measurements or biological observations. This functionalization can be performed just before the measurement. The surface of the scattering or luminescent layer 330 may be biofunctionalized in advance. Referring to Figure 3, there is described an example of support 300 of such a system comprising for example a diffusing or luminescent layer 330 functionalized so as to present biomolecules forming ligands 332 anchored to its surface. These ligands 332 may, for example, bind with certain biomolecules of interest 110 that it is desired to quantify in the medium of interest 100. The surface plasmon imaging as implemented by the system allows a great deal of sensitivity with regard to the molecular concentration at the interface between the support 300 and the medium of interest 100. With reference to FIG. 4, an example of a support 300 of such a system for the cellular imaging. The absence of fluorescence labeling is an asset. Such labeling may indeed induce a disturbance of cellular biochemistry. A cell 120 may have a membrane which has at least partially adhered to the surface of the support 300, for example at the surface of the diffusing or luminescent layer 140 and can thus be observed by virtue of the confinement of the first evanescent electromagnetic field 460. The diffusing or luminescent medium may be derived from the roughness state of a surface 314 without necessarily involving the formation of a new layer. It is thus possible to use the state of roughness of the metal layer increased or not by a corrosive treatment of the second surface 314 of the metal layer 310. The diffusing or luminescent medium may be a liquid medium in which the elements are dissolved. diffusing or luminescent. The diffusing or luminescent elements are then stably distributed in the diffusing or luminescent medium. In particular, the diffusing or liquid luminescent medium can thus be distributed in the medium of interest 100, for example by dissolution, while maintaining the stable distribution of the diffusing or luminescent elements.

Une possibilité est d'utiliser un système d'écoulement microfluidique du milieu d'intérêt pour assurer une stabilité de répartition. Le système permet donc l'utilisation de supports 300 nécessitant un coût du même ordre que celui des supports utilisés dans les systèmes de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur. L'ajout possible d'une couche diffusante ou luminescente 330 n'implique en effet pas de modification significative de coût de fabrication. Par ailleurs, des éléments diffusants ou luminescents utilisés pour un milieu diffusant ou luminescent liquide, tels que des colorants fluorescents, présentent un faible coût. De même, un traitement chimique permettant de produire une rugosité de surface, tel qu'une oxydation chimique, implique également un faible coût voire un coût nul si la rugosité obtenue lors de la fabrication de la couche, par exemple lors du dépôt métallique est suffisante.One possibility is to use a microfluidic flow system of the medium of interest to provide distribution stability. The system therefore makes it possible to use supports 300 requiring a cost of the same order as that of the supports used in surface plasmon resonance systems according to the prior art. The possible addition of a scattering or luminescent layer 330 does not imply any significant change in manufacturing cost. Moreover, diffusing or luminescent elements used for a diffusing or liquid luminescent medium, such as fluorescent dyes, have a low cost. Likewise, a chemical treatment making it possible to produce a surface roughness, such as chemical oxidation, also implies a low cost or even a zero cost if the roughness obtained during the manufacture of the layer, for example during metal deposition, is sufficient. .

Capteur 15 Le système comprend un capteur de lumière 500. Le capteur de lumière 500 est disposé de sorte à mesurer le deuxième champ électromagnétique 480 diffusé ou émis par luminescence. Le capteur de lumière 500 est par exemple un objectif de microscope, par exemple un objectif de microscope à grande ouverture numérique. Le système décrit permet une amélioration du rendement par rapport aux techniques de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur car il permet d'accroître de plusieurs ordres de grandeur les possibilités de multiplexage.Sensor 15 The system comprises a light sensor 500. The light sensor 500 is arranged to measure the second electromagnetic field 480 diffused or emitted by luminescence. The light sensor 500 is for example a microscope objective, for example a microscope objective with a large numerical aperture. The described system allows an improvement of the yield compared to surface plasmon resonance techniques according to the prior art because it makes it possible to increase by several orders of magnitude the possibilities of multiplexing.

Moyens de traitement Le système comprend des moyens de traitement 600 de données relatives au premier champ électromagnétique 460 évanescent, en particulier relatives aux plasmons de surface, les données étant issues de la collection du deuxième champ électromagnétique 480. Les données en entrée des moyens de traitement 600 sont issues des mesures du capteur de lumière 500. Les moyens de traitement 600 de données sont adaptés pour obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en zo transmission. Les moyens de traitement donnent, en sortie, une cartographie de la concentration moléculaire proche de la deuxième surface par imagerie de plasmon de surface en transmission. 25 Procédé En référence à la figure 8, il est décrit un procédé de mesure d'un milieu d'intérêt 100 par résonance de plasmon de surface. Le procédé de mesure est par exemple mis en oeuvre au moyen du système 30 précédemment décrit. 16 Le procédé peut comprendre une première étape 700 de fonctionnalisation par un traitement de la surface du support -ou de la couche diffusante ou luminescente 330 solide- destinée à être mise en contact avec le milieu d'intérêt 100.Processing means The system comprises data processing means 600 relating to the first evanescent electromagnetic field 460, in particular relating to the surface plasmons, the data being taken from the collection of the second electromagnetic field 480. The input data of the processing means 600 are derived from the measurements of the light sensor 500. The data processing means 600 are adapted to obtain a mapping of surface plasmon imaging in zo transmission. The processing means give, at the output, a mapping of the molecular concentration close to the second surface by transmission surface plasmon imaging. Process With reference to FIG. 8, there is described a method of measuring a medium of interest 100 by surface plasmon resonance. The measurement method is for example implemented by means of the system 30 previously described. The method may comprise a first step 700 of functionalization by a treatment of the surface of the support or the solid diffusing or luminescent layer 330 intended to be brought into contact with the medium of interest 100.

Le procédé comprend une deuxième étape consistant à éclairer 710 par la source lumineuse 200 la première surface 312 de la couche métallique 310 du support 300 disposé entre le milieu d'intérêt 100 et la source lumineuse 200. Le procédé comprend une troisième étape consistant à produire 10 720, au niveau d'une deuxième surface 314 de la couche métallique 310, à une interface avec le milieu d'intérêt 100, un premier champ électromagnétique 460 évanescent de plasmon de surface. Le procédé comprend une quatrième étape consistant à soumettre 730 le premier champ électromagnétique 460 évanescent à un milieu 15 diffusant ou luminescent 330 comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence dans le milieu d'intérêt 100 un deuxième champ électromagnétique 480, par exemple propagatif, fonction du premier champ électromagnétique 460. 20 Le procédé comprend une cinquième étape consistant à réaliser 740 une mesure de résonance de plasmon de surface par un capteur de lumière 500 du deuxième champ électromagnétique 480 diffusé ou émis par luminescence. Le procédé comprend une sixième étape consistant à obtenir 750 25 une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission à partir du deuxième champ électromagnétique 480 mesuré. On peut ainsi effectuer une cartographie en transmission des variations à l'interface entre le support 300 et le milieu d'intérêt 100, en particulier entre la deuxième surface 314 et le milieu d'intérêt, et donc une imagerie en 30 diffusion ou en luminescence de type résonance de plasmon de surface en transmission. 17 Un tel procédé et/ou un tel système permet(tent) d'améliorer la résolution latérale sans perte de sensibilité vis-à-vis des variations d'indice optique. En effet, l'imagerie de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur nécessite de collecter le signal réfléchi sur la première surface 312 de la couche métallique 310. Lorsque la mesure selon l'art antérieur est réalisée à l'aide d'un prisme d'indice élevé, le champ excitateur est une onde plane. Une telle mesure implique une faible résolution spatiale car la présence du prisme empêche de s'approcher suffisamment près de la première surface 312 et l'ouverture numérique lors de la mesure est ainsi réduite. Lorsque l'excitation selon l'art antérieur est réalisée à l'aide d'un objectif à grande ouverture numérique immergé dans l'huile, l'onde incidente présente une dispersion angulaire due à la taille finie du faisceau focalisé dans le plan focal arrière de l'objectif. Il en résulte une faible sensibilité à la variation de l'indice optique. Par ailleurs, le procédé et le système décrits permettent d'obtenir une cartographie plus précise et plus fidèle du premier champ électromagnétique 460 évanescent. En effet, l'imagerie utilisant la résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur induit des effets d'interférences lumineuses dans le signal réfléchi. Il en résulte un bruit supplémentaire. A l'inverse, dans le procédé décrit, lorsque le signal est émis, par exemple par luminescence sous la forme du deuxième champ électromagnétique 480, celui-ci est incohérent et ne présente pas un tel inconvénient. Le procédé peut permettre la collecte d'un signal avec une ouverture numérique limitée uniquement par le capteur de lumière 200 utilisé. En effet, le procédé se distingue de l'imagerie en résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur, qui nécessite la collecte d'un signal en réflexion de la première surface 312 de la couche métallique, par exemple le faisceau lumineux réfléchi 440. Ainsi, dans l'art antérieur, 18 l'ouverture numérique est considérablement réduite du fait de la difficulté à s'approcher suffisamment près de la première surface 312 de la couche métallique 310. Par ailleurs, la cartographie décrite permet d'étudier en une seule mesure les effets d'un facteur variable. En particulier, il est possible d'obtenir un gradient de concentration latérale du facteur à étudier grâce à un système impliquant un écoulement microfluidique du milieu d'intérêt. La microfluidique permet un contrôle de la quantité introduite au cours du temps.The method comprises a second step of illuminating 710 by the light source 200 the first surface 312 of the metal layer 310 of the support 300 disposed between the medium of interest 100 and the light source 200. The method comprises a third step of producing 720, at a second surface 314 of the metal layer 310, at an interface with the medium of interest 100, a first evanescent electromagnetic field 460 of surface plasmon. The method comprises a fourth step of subjecting the first evanescent electromagnetic field 460 to a scattering or luminescent medium 330 comprising diffusing or luminescent elements stably distributed therein, so as to diffuse or luminesce in the medium. of interest 100 a second electromagnetic field 480, for example propagative, a function of the first electromagnetic field 460. The method comprises a fifth step of performing a surface plasmon resonance measurement 740 by a light sensor 500 of the second electromagnetic field 480 diffused or emitted by luminescence. The method comprises a sixth step of obtaining 750 surface transmission plasmon imaging mapping from the measured second electromagnetic field 480. It is thus possible to carry out a transmission mapping of the variations at the interface between the support 300 and the medium of interest 100, in particular between the second surface 314 and the medium of interest, and thus diffusion or luminescence imaging. of surface plasmon resonance type in transmission. Such a method and / or system makes it possible to improve lateral resolution without loss of sensitivity to optical index variations. Indeed, surface plasmon resonance imaging according to the prior art requires collecting the signal reflected on the first surface 312 of the metal layer 310. When the measurement according to the prior art is carried out using a prism of high index, the exciter field is a plane wave. Such a measurement implies a low spatial resolution because the presence of the prism prevents getting close enough to the first surface 312 and the numerical aperture during the measurement is thus reduced. When the excitation according to the prior art is carried out using a high numerical aperture lens immersed in the oil, the incident wave has an angular dispersion due to the finite size of the focused beam in the rear focal plane of the goal. This results in a low sensitivity to the variation of the optical index. Moreover, the method and the system described make it possible to obtain a more accurate and faithful mapping of the first evanescent electromagnetic field 460. Indeed, imaging using surface plasmon resonance according to the prior art induces effects of light interference in the reflected signal. This results in additional noise. Conversely, in the described method, when the signal is emitted, for example by luminescence in the form of the second electromagnetic field 480, it is incoherent and does not have such a disadvantage. The method may allow the collection of a signal with numerical aperture limited only by the light sensor 200 used. Indeed, the method differs from prior art surface plasmon resonance imaging, which requires the collection of a signal in reflection from the first surface 312 of the metal layer, for example the reflected light beam 440. Thus, in the prior art, the numerical aperture is considerably reduced because of the difficulty of approaching sufficiently close to the first surface 312 of the metal layer 310. Furthermore, the mapping described makes it possible to study only one measure the effects of a variable factor. In particular, it is possible to obtain a lateral concentration gradient of the factor to be studied by means of a system involving a microfluidic flow of the medium of interest. The microfluidic allows a control of the quantity introduced over time.

La cartographie obtenue peut être une cartographie de la variation d'une concentration moléculaire à l'interface. La cartographie obtenue peut être une cartographie de variation de densité de matière à l'interface. La cartographie obtenue peut être une cartographie d'indice optique à l'interface. En référence aux figures 5 et 6, des résultats de mesures de l'évolution temporelle de l'indice optique d'un mélange eau/éthanol au cours d'un tel procédé sont décrits. L'éthanol possédant un indice optique plus élevé que l'eau, est également plus volatile. Ainsi, par évaporation, l'indice optique décroît au cours du temps.The mapping obtained can be a mapping of the variation of a molecular concentration at the interface. The map obtained can be a cartography of variation of density of matter at the interface. The mapping obtained can be an optical index mapping at the interface. With reference to FIGS. 5 and 6, results of measurements of the temporal evolution of the optical index of a water / ethanol mixture during such a process are described. Ethanol has a higher optical index than water and is also more volatile. Thus, by evaporation, the optical index decreases over time.

En référence à la figure 5, un graphique représentant l'intensité lumineuse collectée normalisée en fonction de l'angle de rotation en degré, à différents temps de mesure en minute, est décrit. La mesure a été réalisée par un système tel que décrit précédemment, présentant un milieu luminescent consistant en des molécules fluorescentes de rhodamine 700 dissoutes dans le mélange eau/éthanol. Les courbes marquées par des points représentent des données expérimentales tandis que les courbes continues représentent les ajustements gaussiens correspondants pour chaque temps de mesure. Ces ajustements ont été réalisés pour déterminer la position angulaire du centre des courbes. Les différents niveaux de gris représentent des mesures à des temps différents. Ainsi la courbe continue 900 correspond aux mesures 19 effectuées à l'instant initial t = 0 min, la courbe continue 920 correspond aux mesures effectuées à l'instant t = 20 min, la courbe continue 940 correspond aux mesures effectuées à l'instant t = 42 min, la courbe continue 960 correspond aux mesures effectuées à l'instant t = 68 min. Le décalage dans le temps du pic de résonance est dû à l'évaporation de l'éthanol. En référence à la figure 6, un graphique représentant l'indice optique de la solution eau/éthanol en fonction du temps est décrit. La courbe 802 représente l'évolution de l'indice optique mesurée à l'aide du système de mesure par résonance de plasmon de surface décrit. La conversion de l'angle de résonance correspondant au centre des courbes repose sur un modèle théorique sur la base des conditions de Fresnel pour une multicouche d'indices de réfraction. La précision des mesures, représentée par des barres d'erreur sur la courbe 802, est de l'ordre de 10-4 unité d'indice optique. Une telle sensibilité n'est limitée que par l'instabilité de puissance de la source lumineuse 200, ici du laser utilisé et par les fluctuations thermiques de la salle où est effectuée la mesure, lors de la mesure. La courbe 801 représente l'évolution de l'indice optique mesurée 20 par un réfractomètre commercial environ 10 minutes avant et 10 minutes après les mesures effectuées par le système décrit. Cette mesure initiale et cette mesure finale sont représentées par des points. L'imagerie de plasmon de surface peut être une imagerie de plasmon de surface plein champ. Il n'est ainsi pas nécessaire de recourir 25 à un balayage de surface, comme dans le cas de certaines techniques de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur. Une imagerie de plasmon de surface plein champ telle que celle décrite permet un rendement supérieur aux techniques de multiplexage de résonance de plasmon de surface selon l'art antérieur.With reference to FIG. 5, a graph representing the normalized light intensity as a function of the angle of rotation in degrees at different measurement times in minutes is described. The measurement was carried out by a system as described above, having a luminescent medium consisting of fluorescent molecules of rhodamine 700 dissolved in the water / ethanol mixture. The dotted curves represent experimental data while the continuous curves represent the corresponding Gaussian adjustments for each measurement time. These adjustments were made to determine the angular position of the center of the curves. The different gray levels represent measurements at different times. Thus the continuous curve 900 corresponds to the measurements 19 carried out at the initial moment t = 0 min, the continuous curve 920 corresponds to the measurements made at the instant t = 20 min, the continuous curve 940 corresponds to the measurements made at the instant t = 42 min, the continuous curve 960 corresponds to the measurements made at time t = 68 min. The time lag of the resonance peak is due to the evaporation of the ethanol. With reference to FIG. 6, a graph showing the optical index of the water / ethanol solution as a function of time is described. Curve 802 represents the evolution of the optical index measured using the surface plasmon resonance measurement system described. The conversion of the resonance angle corresponding to the center of the curves is based on a theoretical model based on the Fresnel conditions for a multilayer of refractive indices. The accuracy of the measurements, represented by error bars on the curve 802, is of the order of 10-4 optical index unit. Such sensitivity is limited only by the power instability of the light source 200, here the laser used and the thermal fluctuations of the room where the measurement is made, during the measurement. Curve 801 represents the evolution of the optical index measured by a commercial refractometer about 10 minutes before and 10 minutes after the measurements made by the described system. This initial measurement and this final measurement are represented by points. Surface plasmon imaging may be full-field surface plasmon imaging. It is thus not necessary to resort to surface scanning, as in the case of certain surface plasmon resonance techniques according to the prior art. Full-field surface plasmon imaging as described allows a higher yield than surface plasmon resonance multiplexing techniques according to the prior art.

30 En référence à la figure 7, un graphique d'une tomographie d'un motif lithographié de silice obtenue à l'aide du système et/ou du procédé20 de mesure par résonance de plasmon de surface décrit. Le motif lithographié est une marche passant de 15 nm d'épaisseur à 18 nm d'épaisseur. Les distances selon X et Y sont représentées en pm, la distance selon Z étant représentée en nm. L'épaisseur est représentée en nuance de gris, l'échelle étant en nm. Dans cette configuration, le signal est produit par la diffusion de la couche métallique induite par la présence de rugosité de la surface lors du dépôt du métal. L'utilisation du procédé et du système technique n'est pas limitatif en termes d'imagerie. Une telle utilisation peut être combinée à d'autres techniques afin de réaliser une imagerie multimodale. Ceci est aisé car l'observation par le capteur de lumière 400 est directe et non inversée. Un couplage peut en particulier être réalisé avec des techniques de fluorescence, par exemple de type PALM/STORM ou TIRF. 21Referring to FIG. 7, a graph of a tomography of a lithographed silica pattern obtained using the described surface plasmon resonance measurement system and / or method. The lithographed pattern is a step from 15 nm thick to 18 nm thick. The distances along X and Y are shown in μm, the distance along Z being shown in nm. The thickness is represented in gray scale, the scale being in nm. In this configuration, the signal is produced by the diffusion of the metal layer induced by the presence of roughness of the surface during the deposition of the metal. The use of the method and the technical system is not limiting in terms of imaging. Such use can be combined with other techniques to achieve multimodal imaging. This is easy because the observation by the light sensor 400 is direct and not reversed. Coupling can in particular be carried out with fluorescence techniques, for example of the PALM / STORM or TIRF type. 21

Claims (10)

REVENDICATIONS1. Procédé de mesure d'un milieu d'intérêt (100) par résonance de plasmon de surface, le procédé comprenant des étapes consistant à : - éclairer (710) par une source lumineuse (200) une première surface (312) d'une couche métallique (310) d'un support (300) disposé entre le milieu d'intérêt (100) et la source lumineuse (200), - produire (720), au niveau d'une deuxième surface (314) de la Io couche métallique (310), à une interface avec le milieu d'intérêt (100), un premier champ électromagnétique (460) évanescent de plasmon de surface, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des étapes consistant à : - soumettre (730) le premier champ électromagnétique (460) 15 évanescent à un milieu diffusant ou luminescent (330) comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à diffuser ou émettre par luminescence dans le milieu d'intérêt (100) un deuxième champ électromagnétique (480) fonction du premier champ 20 électromagnétique (460), - réaliser (740) une mesure de résonance de plasmon de surface, par un capteur de lumière (500), du deuxième champ électromagnétique (480) diffusé ou émis par luminescence, - obtenir (750) une cartographie d'imagerie de plasmon de 25 surface en transmission à partir du deuxième champ électromagnétique (480) mesuré.REVENDICATIONS1. A method of measuring a medium of interest (100) by surface plasmon resonance, the method comprising the steps of: - illuminating (710) by a light source (200) a first surface (312) of a layer metal carrier (310) of a carrier (300) disposed between the medium of interest (100) and the light source (200); - producing (720) at a second surface (314) of the metal layer (310), at an interface with the medium of interest (100), a first evanescent electromagnetic field (460) of surface plasmon, characterized in that it further comprises the steps of: - subjecting (730) the first electromagnetic field (460) evanescent to a diffusing or luminescent medium (330) comprising diffusing or luminescent elements stably distributed therein, so as to diffuse or emit by luminescence into the medium of interest (100) a second electromagnetic field (480) according to the first electromagnetic pulse (460), - performing (740) a surface plasmon resonance measurement, by a light sensor (500), the second electromagnetic field (480) diffused or emitted by luminescence, - obtaining (750) a cartography surface plasmon imaging in transmission from the second measured electromagnetic field (480). 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cartographie obtenue est une cartographie de la variation d'une concentration 30 moléculaire à l'interface. 22 3004 53 72. The method of claim 1, wherein the mapping obtained is a mapping of the variation of a molecular concentration at the interface. 22 3004 53 7 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cartographie obtenue est une cartographie de variation de densité de matière à l'interface. 53. The method of claim 1, wherein the mapping obtained is a map of material density variation at the interface. 5 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cartographie obtenue est une cartographie d'indice optique à l'interface.4. The method of claim 1, wherein the mapping obtained is an optical index mapping at the interface. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'imagerie de plasmon de surface est une imagerie de 10 plasmon de surface plein champ.The method of any of the preceding claims, wherein the surface plasmon imaging is full field surface plasmon imaging. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le milieu diffusant ou luminescent est une couche diffusante ou luminescente (330) solide du support (300). 15The method of any of the preceding claims, wherein the diffusing or luminescent medium is a solid diffusing or luminescent layer (330) of the support (300). 15 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel une couche en un matériau diélectrique est disposée entre la couche métallique (310) et la couche diffusante ou luminescente (330) solide. 20The method of claim 6, wherein a layer of a dielectric material is disposed between the metal layer (310) and the solid diffusing or luminescent layer (330). 20 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, comprenant en outre une étape (705) de fonctionnalisation par un traitement une surface de la couche diffusante ou luminescente (330) solide destinée à être mise en contact avec le milieu d'intérêt (100). 25The method of any one of claims 6 or 7, further comprising a step (705) of functionalizing by treating a surface of the solid diffusing or luminescent layer (330) to be contacted with the medium of interest (100). 25 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel la couche diffusante ou luminescente (330) solide est obtenue par un traitement chimique superficiel de la couche métallique (310).9. A method according to any one of claims 6 to 8, wherein the solid diffusing or luminescent layer (330) is obtained by a surface chemical treatment of the metal layer (310). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans 30 lequel la couche diffusante ou luminescente (330) solide est obtenue par dépôt de fluorochromes et/ou de boîtes quantiques. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel la couche diffusante ou luminescente (330) solide est obtenue par dépôt d'une couche de polymères luminescents ou de chaînes carbonées 5 luminescentes. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le milieu diffusant ou luminescent comprend un état de rugosité d'une surface (314). 10 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le milieu diffusant ou luminescent est un milieu liquide dans lequel sont dissouts les éléments diffusants ou luminescents. 15 14. Système de mesure par résonance de plasmon de surface d'un milieu d'intérêt (100) adapté pour mettre en oeuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système comprenant : - un support (300) en contact avec le milieu d'intérêt (100), le support comprenant une couche métallique (310), 20 - une source lumineuse (200), le support (300) étant disposé entre le milieu d'intérêt (100) et la source lumineuse (200), pour éclairer une première surface (312) de la couche métallique (310) selon un angle, la source lumineuse (200) et le support (300) étant adaptés pour produire, au niveau d'une deuxième 25 surface (314) de la couche métallique (310), à une interface avec le milieu d'intérêt (100), un premier champ électromagnétique (460) évanescent de plasmon de surface, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : - un milieu diffusant ou luminescent (330), le milieu diffusant ou 30 luminescent (330) comprenant des éléments diffusants ou luminescents répartis de manière stable dans celui-ci, de sorte à 24diffuser ou émettre par luminescence un deuxième champ électromagnétique (480) fonction du premier champ électromagnétique (460) à partir du premier champ électromagnétique (460) évanescent transmis aux éléments diffusants ou luminescent, - un capteur de lumière (500) disposé de sorte à mesurer le deuxième champ électromagnétique (480) diffusé ou émis par luminescence, - des moyens de traitement (600) de données de plasmon de Io surface du deuxième champ électromagnétique (480), les données étant issues des mesures du capteur de lumière (500), les moyens de traitement (600) de données étant adaptés pour obtenir une cartographie d'imagerie de plasmon de surface en transmission. 15 15. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 13 ou d'un système selon la revendication 14 pour une cartographie d'imagerie de plasmon surface d'une membrane cellulaire fonctionnalisée disposée dans le milieu d'intérêt. 20 2510. A process according to any one of claims 6 to 8, wherein the solid diffusing or luminescent layer (330) is obtained by deposition of fluorochromes and / or quantum dots. 23. A method according to any one of claims 6 to 8, wherein the solid diffusing or luminescent layer (330) is obtained by depositing a layer of luminescent polymers or luminescent carbon chains. The method of any one of claims 1 to 8, wherein the diffusing or luminescent medium comprises a roughness state of a surface (314). The method of any one of claims 1 to 5, wherein the diffusing or luminescent medium is a liquid medium in which the diffusing or luminescent elements are dissolved. 14. A surface plasmon resonance measurement system of a medium of interest (100) adapted to implement a method according to any one of the preceding claims, the system comprising: - a support (300) in contact with the medium of interest (100), the support comprising a metal layer (310), - a light source (200), the support (300) being arranged between the medium of interest (100) and the light source ( 200) for illuminating a first surface (312) of the metal layer (310) at an angle, the light source (200) and the support (300) being adapted to produce at a second surface (314). of the metal layer (310), at an interface with the medium of interest (100), a first electromagnetic field (460) evanescent surface plasmon, characterized in that it further comprises: - a diffusing or luminescent medium (330), the diffusing or luminescent medium (330) comprising diffused elements luminescent or electrically dispersible electromagnetic field (480) according to the first electromagnetic field (460) from the first electromagnetic field (460) evanescent transmitted to the diffusing elements or a light sensor (500) arranged to measure the second electromagnetic field (480) scattered or emitted by luminescence, - means (600) for processing plasmon data of Io surface of the second electromagnetic field (480) , the data being derived from the measurements of the light sensor (500), the data processing means (600) being adapted to obtain a transmission surface plasmon imaging map. 15. Use of a method according to one of claims 1 to 13 or a system according to claim 14 for a mapping of plasmon imaging surface of a functionalized cell membrane disposed in the medium of interest. 20 25
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