FR2998179A1 - Nanostructure a base de titanate pour la regeneration et l'ingenierie tissulaire - Google Patents

Abstract

Une nanostructure à base de nanorubans de titanate est décrite. Les nanorubans de titanate présentent en surface des agents bioactifs greffés par l'intermédiaire d'un polymère bifonctionnel, de préférence un polymère hétérobifonctionnel. Le polymère bifonctionnel présente à une extrémité un groupement fonctionnel lui permettant d'être greffé de manière covalente en surface des nanorubans de titanate et à l'autre extrémité un groupement fonctionnel lui permettant d'être greffé de manière covalente aux agents bioactif. Les nanostructures à base de nanorubans de titanate, sur lesquelles sont greffées des protéines d'adhésion (plus particulièrement les protéines de la matrice extracellulaire telles que les collagènes, la fibronectine, la laminine, l'élastine ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières, par exemple le peptide RGD), présentent un intérêt tout particulier pour favoriser les processus de cicatrisation et de régénération des tissus lésés.

Description

NANOSTRUCTURE A BASE DE TITANATE POUR LA REGENERATION ET L'INGENIERIE TISSULAIRE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine des matériaux utilisés en médecine régénérative et ingénierie tissulaire. Elle concerne tout particulièrement une nanostructure à base de nanorubans de titanate. Les nanostructures à base de nanorubans de titanate, sur lesquelles sont greffées des protéines d'adhésion (plus particulièrement les protéines de la matrice extracellulaire telles que les collagènes, la fibronectine, la laminine, l'élastine ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières, par exemple le peptide RGD), présentent un intérêt tout particulier pour favoriser les processus de cicatrisation et de régénération des tissus lésés. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION La médecine régénérative et l'ingénierie tissulaire ont pour but d'élaborer des substituts biologiques permettant la reconstruction des tissus endommagés et le développement de nouveaux tissus sains.

Actuellement, les principaux agents utilisés pour la régénération tissulaire sont constitués de protéines provenant de la matrice extracellulaire (MEC). Ils se présentent sous forme d'un réseau de nanofibres pouvant provenir de nombreux tissus d'origine principalement animale et entrent notamment dans la composition des valves cardiaques, des vaisseaux sanguins, de la peau, des nerfs, des tendons, des ligaments, du foie, de la vessie, du petit intestin ou bien encore des muscles. Les réseaux de MEC sont constitués de molécules structurales et fonctionnelles sécrétées par les cellules de tissus ou d'organes. Ces molécules s'agencent en une structure 3D complexe et unique présentant des propriétés structurales et biologiques proches du tissu source.

Les réseaux de polymères sont également utilisés pour la reconstruction tissulaire et la médecine régénérative. Ces structures à base de fibres permettent l'auto-régénération des tissus tout en limitant les risques de rejet et de transmission de maladies fortement présents lors d'une greffe d'un tissu prélevé sur une partie saine du corps. Le réseau de polymère doit agir comme une matrice extracellulaire en présentant un design particulier permettant l'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaire. De plus, il doit présenter la particularité d'être poreux pour permettre la croissance des cellules. La nature du polymère constituant le réseau a également de l'importance. Il doit être biocompatible et doit se dégrader le moins possible. Pour être plus efficaces, ces réseaux de nanofibres sont souvent « dopés » avec des matériaux en céramique comme les phosphates de calcium ou l'hydroxyapatite (HA) présentant la particularité d'être très proches des minéraux osseux en augmentant la biocompatibilité ainsi que l'ostéoconductivité de la structure de nanofibres. Généralement, ces réseaux sont constitués de nanofibres de poly(acide lactique-co- glycolique) (PLGA), de poly(L-acide lactique) (PLLA), de poly(caprolactone) (PCL) (Engelhardtet al. 2011), de poly(oxyde d'éthylène) connu également sous le nom de polyéthylène glycol (PEO ou PEG), de poly(vinyl d'alcool) (PVA) (Hartwellet al. 2011), de poly(ester uréthane) uréa (PEUU), de gélatine, de collagène, de protéines ou de fibrinogène.

II a également été proposé d'utiliser des fibres inorganiques, telles que des nanotubes et nanofibres de carbone (Tran et al. 2009), des nanofibres de TiO2 (Wang et al. 2012) ou des nanofils d'or (Fan et al. 2010) pour la reconstruction tissulaire et la médecine régénérative. Néanmoins, ces structures sont de forme cylindrique, avec des dimensions (longueur et largeur) plus faibles que celles des nanorubans de la présente invention et une chimie de surface également différente, ne permettant pas les mêmes approches de greffage. L'utilisation de produits à base d'éléments biologiques d'origine humaine ou animale ou à base de polymère en médecine régénérative ou pour la reconstruction tissulaire n'est pas sans risque. L'utilisation de produits à base d'éléments biologiques d'origine humaine ou animale entraine souvent des réactions secondaires, des embolies, des allergies, des infections, des dommages au niveau des nerfs et des tissus, des transmissions de maladies et de virus, la formation de caillots sanguins, des chocs toxiques et anaphylactiques, la nécrose de certains tissus, etc... Les produits commerciaux constitués de polymère engendrent, quant à eux, la compression des nerfs, la détérioration des tissus, des inflammations, des dommages rénaux et neurologiques, des fuites de liquide cérébrospinal, etc.

Un besoin existe donc pour un nouveau matériau pouvant être utilisé en médecine régénérative et pour l'ingénierie tissulaire qui ne présente pas les inconvénients listés ci-dessus.

BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention porte sur une nanostructure à base de nanorubans de titanate, lesdits nanorubans de titanate présentant en surface des agents bioactifs greffés par l'intermédiaire d'un polymère bifonctionnel, de préférence un polymère hétérobifonctionnel, ledit polymère bifonctionnel présentant à une extrémité un groupement fonctionnel lui permettant d'être greffé de manière covalente en surface des nanorubans de titanate et à l'autre extrémité un groupement fonctionnel lui permettant d'être greffé de manière covalente aux agents bioactif. La présente invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant une nanostructure selon la présente invention.

La présente invention porte également sur un implant médical comprenant une nanostructure selon la présente invention. Enfin, la présente invention porte sur un procédé de fabrication d'une nanostructure selon la présente invention qui comprend les étapes de fonctionnalisation d'un nanoruban de titanate par greffage covalent d'un polymère bifonctionnel en surface dudit nanoruban et greffage covalent d'un agent bioactif sur le nanoruban fonctionnalisé par l'extrémité libre dudit polymère bifonctionnel. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 représente de manière schématique une nanostructure selon la présente invention. La figure 2 représente des clichés (a) MET et (b) MEB des nanorubans de titanates synthétisés par traitement hydrothermal (440 mg TiO2P25, 110 mL solution de soude 10M, étape de sonication (30 min, 375 W), 180°C, 20h, 7 bar, 150 tours.min-1).

La figure 3 représente de manière schématique un procédé de préparation d'une nanostructure selon la présente invention. La figure 4 représente de manière schématique une composition pharmaceutique comprenant une nanostructure selon la présente invention.

La figure 5 représente la mesure de la viabilité cellulaire des fibroblastes incubés en présence de diverses concentrations (2 à 70 mg.mL-1) et doses (1 à 3) de nanorubans. * : différences significatives à p < 0,05 par rapport au contrôle. La figure 6 représente la mesure de la viabilité cellulaire des cardiomyocytes de rats nouveaux nés incubés en présence de diverses concentrations (2 à 70 mg.mL-1) et doses (1 à 3) de nanorubans. * : différences significatives à p < 0,05 par rapport au contrôle. La figure 7 représente l'adhésion cellulaire de fibroblastes pulmonaires sur une nanostructure selon l'invention (à savoir nanorubans fonctionnalisés avec Si-PEG-NHS et passivés avec mPEG-Si recouverts de collagène de type I). Dix pg/mL de collagène de type I (Horm) ont été utilisés pour l'étape de greffage sur les nanorubans fonctionnalisés avec Si-PEG-NHS et passivés avec mPEG-Si. Les valeurs sont exprimées par rapport à l'adhésion des cellules sur du collagène de type I utilisé à 10 pg/mL, considérée comme égale à 100 %. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis au point de nouvelles nanostructures pouvant être utilisées en médecine régénérative ou en ingénierie tissulaire. Ces nouvelles nanostructures présentent l'avantage de se présenter sous la forme d'une matrice 3D recouverte de peptide ou de protéines capables d'induire l'adhésion cellulaire, permettant une augmentation de la surface de contact avec les cellules. Cette grande surface va permettre une meilleure adhésion et organisation des cellules adhérentes favorisant la cicatrisation et/ou la régénération tissulaire. Ces nouvelles nanostructures peuvent également être utilisées pour délivrer des molécules d'intérêt biologique, telles que des principes actifs, dans l'organisme. Les nanostructures de la présente invention sont constituées de nanorubans de titanate, sur lesquels sont greffés en surface des agents bioactifs. Les agents bioactifs sont greffés sur les nanorubans de titanate par l'intermédiaire de polymères bifonctionnels qui jouent le rôle de linkers entre les nanorubans et les agents bioactifs. Ainsi, les nanostructures de la présente invention résultent de l'assemblage entre des nanorubans de titanate, des polymères bifonctionnels et des agents bioactifs. Elles peuvent être représentées par la structure suivante : TiON R-P-AB dans laquelle : - TiONR désigne les nanorubans de titanate ; - P désigne un polymère ; - AB désigne un agent bioactif. Les liaisons entre le polymère P et les nanorubans de titanate TiONR et entre le polymère P et l'agent bioactif AB sont des liaisons covalentes. Dans la description de la présente invention, le polymère P est désigné par le terme « polymère bifonctionnel » même s'il doit être compris qu'à l'issue de l'assemblage de la nanostructure, les groupements fonctionnels initialement portés par les polymères bifonctionnels ont réagi avec des groupements appropriés portés par les nanorubans et les agents bioactifs pour former des liaisons covalentes. Un exemple de nanostructure selon la présente invention est illustré de manière schématique à la figure 1 : la nanostructure (1) comprend des nanorubans de titanate (2) sur lesquels sont greffés en surface des agents bioactifs (3) par l'intermédiaire de polymères bifonctionnels (4). La nanostructure de la figure 1 comprend également des polymères passivants (5) greffés en surface des nanorubans de titanate. Les nanorubans de titanate sont une forme particulière de nanoparticules d'oxyde de titane. Les nanoparticules d'oxyde de titane peuvent exister sous la forme de nanosphères, de nanotubes, de nanofils ou nanofibres, de nanofeuilles ou de nanorubans, chaque morphologie présentant des caractéristiques particulières.

Les nanorubans de titanate se distinguent des autres formes de nanoparticules par une morphologie en forme de longs parallélépipèdes. Leur longueur varie typiquement de 500 nm à plusieurs dizaines de micromètres, telles que de 0.5 pm à80 pm. Leur largeur varie typiquement de 50 à 600 nm, plus particulièrement de 100 à 200 nm. Leur épaisseur varie typiquement de 3 à 60 nm.

Les titanates sont des oxydes de titane mixtes. Ils se composent d'ions titane engagés dans un polyèdre de coordination avec formation de liaisons iono-covalentes avec les ions oxygène. Cet assemblage joue le rôle d'anion. Cet anion se combine avec un autre cation, tel que Na+, H+ pour former les titanates. La composition chimique des nanorubans peut être la suivante NayH2_yTin02'1, xH2O. Les valeurs de y, n et x varient typiquement de 0 à 2 pour y, de 2 à 5 pour n et de 0 à 3 pour x. Les nanorubans de titanate (TiONRs) sont des matériaux connus qui jusqu'alors étaient développés pour des applications en photocatalyse (Hafez 2009, Jitputti et al. 2008), pour les batteries au lithium (Beuvier et al. 2010), en optique (Feng et al. 2010), comme cellules solaires et photovoltaïques (Pan et al. 2007) et comme biocapteurs (Liu 2008). Il a été proposé de les utiliser en médecine régénérative, tout particulièrement pour le traitement d'implants et de prothèses en titane afin de conférer à leurs surfaces des propriétés nouvelles (Wu et al. 2008). Les TiONRs sont alors obtenus par croissance directe sur le support en titane, ils ne s'organisent pas en réseau 3D, et aucune molécule organique (en particulier aucun polymère) ou biologique n'a été greffée sur leur surface. Les nanorubans de titanate présentent l'avantage de s'organiser en formant une matrice en trois dimensions. Cette matrice mime la structure et l'architecture de la matrice extracellulaire. De par cette organisation, les nanorubans de titanate présentent un grand intérêt pour des applications en nanomédecine et notamment pour la régénération et l'ingénierie tissulaire. En effet, les nanorubans de titanate constituent un support adapté sur lequel les cellules peuvent proliférer et régénérer un tissu endommagé. La figure 2 représente des clichés (a) MET et (b) MEB des nanorubans de titanate synthétisés par traitement hydrothermal tel que décrit dans la section « exemples ». De plus, de manière avantageuse, les nanorubans de titanate présentent un grand nombre de groupements hydroxyles en surface. Ce nombre est supérieur au nombre de groupements hydroxyles en surface des nanotubes de titanate et des sphères de TiO2. Les groupements hydroxyles sont absents en surface des nanotubes de carbone. La présence de ce grand nombre de groupements hydroxyles rend ces nanorubans facilement fonctionnalisables. Ainsi, la structure matricielle des nanorubans de titanate ne forme pas uniquement un support physique sur lequel les cellules peuvent proliférer mais lorsque des agents bioactifs appropriés sont greffés sur ces nanorubans, tels que des agents permettant l'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaire, la structure assure un biomimétisme complet.

Les nanorubans de titanate peuvent être préparés par toute méthode adaptée. Ainsi les nanorubans de titanate peuvent être préparés par traitement hydrothermal d'un précurseur pulvérulent de TiO2 en milieu fortement basique (Yuan et al. 2002). Par cette voie de synthèse, la solution de soude, de concentration variable, et les particules de TiO2 sont introduits dans un autoclave et subissent un traitement de 180 à 240°C pendant une durée de 24 à 48h. Cette technique permet d'obtenir des nanorubans de titanates de 30 à 500 nm de large pour une longueur de plusieurs dizaines de micromètres.

Des agents bioactifs sont greffés en surface des nanorubans de titanate. Les agents bioactifs ne sont pas greffés directement en surface des nanorubans (pas de liaison covalente « nanorubans-agents bioactifs ») mais ils sont greffés en surface des nanorubans par l'intermédiaire de polymères bifonctionnels. Le polymère bifonctionnel permet de fonctionnaliser les nanorubans de titanate et à terme joue le rôle de linker entre les nanorubans de titanate et les agents bioactifs. Le polymère bifonctionnel présente à l'une de ses extrémités un groupement fonctionnel lui permettant de se greffer de manière covalente en surface des nanorubans de titanate, et à l'autre extrémité, un groupement fonctionnel lui permettant de se greffer de manière covalente aux agents bioactifs. De préférence, le polymère bifonctionnel est un polymère hétérobifonctionnel. La présence de deux groupements fonctionnels différents permet de limiter les couplages non désirés, tels que le greffage des deux extrémités du polymère sur les nanorubans de titanate. De préférence, l'affinité entre les groupements fonctionnels terminaux du polymère est également faible afin de limiter l'auto-condensation du polymère par interaction entre ces deux extrémités. Différents types de polymères bifonctionnels peuvent être utilisés pour fonctionnaliser les nanorubans. Ainsi, les polymères bifonctionnels peuvent être choisis parmi les polyéthylène glycols (PEG), les poly(acide lactique-coglycolique) (PLGA), les poly(caprolactone) (PLCL), les poly(acide lactique) (PLA), les polymères de glycolide (PGA), les chitosan et dextran, etc. De préférence, le polymère est un polyéthylène glycol bifonctionnel, de préférence hétérobifonctionnel. Le PEG est un polymère linéaire qui présente des propriétés uniques d'hydrophilicité, de flexibilité, de haut volume d'exclusion, de non toxicité et de non immunogénicité. Il possède également des propriétés remarquables de pharmacocinétique et de biodistribution. La fonctionnalisation par le PEG favorise la stabilité des suspensions et la dispersion des nanostructures dans les solvants aqueux et organiques. Enfin, la fonctionnalisation par le PEG rend les nanoparticules furtives. Elles ne seront pas reconnues par les anticorps et les macrophages et ne seront donc pas éliminées par le système immunitaire. En effet, en présence de ce polymère, le processus biochimique d'opsonisation, permettant la reconnaissance et l'éviction de particules par les phagocytes, est évité. La masse moléculaire du polymère varie généralement de 500 Da à 10 000 Da, de préférence de 2000 à 8000 Da, de préférence aux alentours de 5000 Da.

La masse moléculaire du polymère est typiquement choisie de manière à ce que lorsqu'une protéine est couplée aux nanorubans de titanate par l'intermédiaire du polymère bifonctionnel, la chaîne du polymère atteigne une longueur suffisante pour que les propriétés de la protéine telles que son activité et sa réactivité ne soient pas altérées par la présence de la nanostructure (Li et al. 2009). Lorsque le polymère est le polyéthylène glycol, la masse moléculaire du polymère sera au moins de 5000 Da. La surface des nanorubans de titanate étant recouverte de groupements hydroxyles, le greffage du polymère sur le nanoruban est de préférence réalisé via l'intermédiaire d'un groupement silane ou phosphonate introduit à l'une des extrémités du polymère. La liaison covalente ainsi formée est stable et forte. A l'autre extrémité du polymère sont introduits des groupements fonctionnels permettant le greffage des agents bioactifs. Ces groupements fonctionnels seront choisis en fonction de la nature de l'agent bioactif à greffer. Par exemple, lorsque l'agent bioactif à greffer comprend une fonction amine par laquelle peut se faire le greffage, le groupement fonctionnel introduit à l'autre extrémité du polymère peut être un groupement N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, NHS carbonate, aldéhyde, isocyanate, hydrazide oubenzotriazole. Ces groupements fonctionnels peuvent être particulièrement utiles pour greffer des peptides ou protéines via leur extrémité N-terminale ou via des résidus lysine. Lorsque l'agent bioactif comprend une fonction thiol par laquelle peut se faire le greffage, le groupement fonctionnel introduit à l'autre extrémité du polymère peut être un groupement maléimide, vinyl sulfone ou iodoacétamine. Ces groupements fonctionnels peuvent être particulièrement utiles pour greffer des peptides ou protéines via des résidus cystéines. Tout particulièrement lorsque le polymère bifonctionnel est le PEG et l'agent bioactif une protéine ou un peptide, le greffage entre le PEG et l'agent bioactif peut se faire entre un groupement maléimide introduit à l'extrémité du polymère et la fonction thiol d'une cystéine. Les cystéines sont connues pour avoir une forte affinité avec les groupements maléimides (Mal). Le couplage Mal-Cys se fait par formation d'un pont thioéther entre les groupements maléimides et les groupements -SH contenus dans la structure des cystéines. De manière alternative, le greffage peut également se faire entre un groupement N-hydroxysuccinimide (NHS) introduit à l'extrémité du polymère et les lysines.

L'introduction des groupements fonctionnels sur le polymère de manière à former un polymère bifonctionnel, de préférence hétérobifonctionnel, peut être réalisée par n'importe quelle méthode adaptée et bien connue de l'homme du métier. De préférence, le polymère bifonctionnel est un PEG hétérobifonctionnel de type Si-PEG-Mal ou Si-PEG-NHS. L'introduction du groupement silane sur le polymère peut être effectuée par n'importe quelle méthode adaptée. Par exemple, la formation des liaisons Ti-O-Si par l'intermédiaire d'un organoalcoxysilane peut se dérouler en plusieurs étapes. La première réaction qui a lieu est l'hydrolyse des groupements alcoxy conduisant à l'obtention de silanols réactifs. Cette étape, qui permet d'initier et d'activer le greffage, est suivie par une réaction de condensation intramoléculaire des silanols par formation de liaisons siloxanes Si-O-Si. Durant cette étape, deux réactions peuvent se produire : une réaction d'oxolation correspondant au départ de molécules d'eau ou une réaction d'alcoxolation correspondant au départ d'alcool. Enfin, les silanols libres vont se condenser sur les hydroxyles présents en surface des nanorubans par formation de liaisons covalentes (De Monredon 2004). Les nanorubans de titanate sont de préférence rendus inerte vis-à-vis des autres tissus par greffage d'un polymère passivant, tel qu'un PEG monofonctionnel, par exemple mPEG-Si. Le polymère passivant se greffe à la surface des nanorubans par le groupement fonctionnel présent à l'une de ses extrémités. La fonctionnalisation et la passivation des nanorubans de titanate peuvent alors se faire en faisant réagir un mélange de polymères contenant 5% de Si-PEG-Mal ou de Si-PEG-NHS (polymère hétérobifonctionnel) et 95% de mPEG-Si (polymère passivant) en proportions molaires. Un taux de greffage total de 1,2 chaîne de polymère par nm2 de rubans peut être obtenu. Ce nombre se décompose en 1,1 chaîne de mPEG-Si et 0,1 chaîne de PEG hétérobifonctionnel (Si-PEG-Mal ou Si-PEG-NHS). Le greffage du mPEG-Si limite les phénomènes d'adsorptions aspécifiques en surface des rubans.

Les nanorubans de titanate présentent typiquement une densité de greffage allant de 0,15 à 4, de préférence aux alentours de 1,2, chaînes polymériques par nm2 de rubans. Par « chaînes polymériques », on entend ici le mélange des chaînes polymériques des polymères bifonctionnel et passivant, par exemple le mélange des chaînes polymériques du PEG hétérobifonctionnel et du PEG monofonctionnel. Une fois les nanorubans de titanates fonctionnalisés au moyen des polymères bifonctionnels, des agents bioactifs peuvent être greffés de manière appropriée sur les nanorubans. Le greffage des agents bioactifs est réalisé par formation d'une liaison covalente entre l'agent bioactif et l'extrémité libre du polymère bifonctionnel. L'agent bioactif peut être toute molécule d'origine naturelle ou de synthèse qui présente un intérêt biologique, par exemple toute molécule d'origine naturelle ou de synthèse exerçant à titre curatif ou préventif une activité biologique. L'agent bioactif peut être une protéine, un peptide, un agent thérapeutique ou principe actif, un facteur de croissance, un acide nucléique ou leurs mélanges. Plus particulièrement, l'agent bioactif peut être une protéine de la matrice extracellulaire ou tout peptide ou protéine dérivé(e) des protéines de la matrice extracellulaire, tel que le peptide RGD. Les protéines de la matrice extracellulaire incluent les collagènes, la fibronectine, la laminine et l'élastine. Par l'expression « peptide ou protéine dérivé(e) des protéines de la matrice extracellulaire », on entend un fragment protéique d'une des protéines de la matrice extracellulaire, tel qu'un fragment de collagène, fibronectine, laminine ou d'élastine, ou une protéine issue de l'assemblage par ingénierie de motifs peptidiques d'intérêt présents dans les protéines de la matrice extracellulaire. La nanostructure à base de rubans de titanate ainsi formée peut être utilisée en tant que médicament. En particulier, la nanostructure ainsi formée peut être utilisée pour délivrer un principe actif dans l'organisme.

Plus particulièrement, la nanostructure de la présente invention peut être employée pour préparer des compositions pharmaceutiques comprenant la nanostructure de la présente invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients sont choisis parmi les excipients habituels connus de l'homme du métier en fonction de la forme pharmaceutique et du mode d'administration souhaités.

Les nanostructures de la présente invention et les compositions pharmaceutiques les renfermant peuvent être utilisées dans le traitement de diverses pathologies. L'application thérapeutique dépend de la nature de l'agent bioactif greffé.

Les compositions pharmaceutiques de la présente invention peuvent être administrées sous différentes formes. Par exemple, elles peuvent être sous forme de compositions injectables ou sous forme de compositions pour application topique ou intra-tissulaire. Elles peuvent être tout particulièrement formulées sous forme de gels, hydrogels ou hydrocolloïdes.

Les nanostructures de la présente invention peuvent également être utilisées pour préparer des dispositifs médicaux, tels des implants médicaux. En effet, les nanostructures de la présente invention peuvent du fait de leur organisation tridimensionnelle servir d'échafaudage ou de support sur lesquels les cellules peuvent proliférer. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'agent bioactif est une protéine de la matrice extracellulaire ou une protéine ou peptide dérivé(e) d'une protéine de la matrice extracellulaire. L'agent bioactif peut ainsi être du collagène, de la fibronectine, laminine, ou élastine, ou une protéine ou peptide dérivé(e) d'une de ces protéines, par exemple le peptide RGD. Dans un mode de réalisation de la présente invention, l'agent biactif est du collagène. Cette protéine, représentée par 28 types différents, est réputée pour ces propriétés de biodégradabilité et de biocompatibilité. Le collagène présente dans sa structure des motifs peptidiques qui permettent l'activation et l'adhésion de cellules, telles que les plaquettes, les fibroblastes et les cellules endothéliales, qui jouent un rôle essentiel dans le processus de cicatrisation. Plus largement, il permet l'attachement, la croissance, la différentiation et la prolifération cellulaire. Le couplage entre les nanorubans et le collagène par l'intermédiaire du polymère favorise la création d'un réseau de fibres de protéines. La formation de ce réseau permet d'augmenter la surface de contact entre le collagène et les cellules. La nanostructure ainsi formée va permettre l'adhésion et la prolifération cellulaire favorisant in fine la cicatrisation et la régénération tissulaire.

Les nanostructures à base de rubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières peuvent être utilisées en tant que médicaments. Des compositions pharmaceutiques comprenant des nanostructures à base de rubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable peuvent être formulées. Les nanostructures à base de rubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé de ces dernières et les compositions pharmaceutiques les renfermant peuvent être utilisées pour favoriser les processus de cicatrisation. Tout particulièrement, elles peuvent être utilisées en tant qu'agent cicatrisant ou agent hémostatique. Par « agent cicatrisant », on entend un agent capable de réparer un tissu après une lésion (coupure, brûlure, plaies diverses, nécrose de tissu,...), qu'elle soit interne ou externe. Dans le cas de plaies dites « externes », l'agent va être appliqué ou administré à l'interface environnement extérieur/organisme et va permettre la cicatrisation du tissu lésé à savoir la peau dans la majorité des cas (fermeture des plaies, disparition des lésions par le processus de cicatrisation). En revanche, dans le cas de plaies dites « internes », touchant principalement les organes tels que le coeur, les reins, les poumons,..., l'agent administré, en plus d'avoir un effet cicatrisant comme pour les plaies externes, possède un effet régénérant permettant à l'organe de retrouver ou conserver sa fonction d'origine (fonction cardiaque, rénale, pulmonaire,...). A noter que les étapes clés de ces deux contextes sont communes et font partie intégrante du domaine de la médecine régénérative.

Par « agent hémostatique », on entend un agent capable d'arrêter un saignement. Les nanostructures à base de rubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières et les compositions pharmaceutiques les renfermant peuvent être utilisées pour favoriser les différentes phases de la cicatrisation d'une plaie. Lorsque leur utilisation permet l'adhésion des plaquettes sanguines, elles jouent le rôle d'agent hémostatique. En revanche, lorsque leur présence permet la prolifération des fibroblastes, elles jouent le rôle d'agent cicatrisant. La présente invention concerne également l'utilisation de nanostructures à base de rubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières pour la préparation d'un médicament destiné à réparer un tissu après une lésion. La présente invention concerne également une méthode pour réparer un tissu après une lésion comprenant l'administration à un patient d'une dose efficace de nanostructures à base de nanorubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières ou d'une composition pharmaceutique les comprenant. De préférence, la composition pharmaceutique est administrée par voie topique, intra-dermale ou par injection. La présente invention concerne également l'utilisation de nanostructures à base de nanorubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières pour la préparation d'un médicament destiné à arrêter un saignement. La présente invention concerne également une méthode pour arrêter un saignement comprenant l'administration à un patient d'une dose efficace de nanostructures à base de nanorubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières ou d'une composition pharmaceutique les comprenant. De préférence, la composition pharmaceutique est administrée par voie topique, intra-dermale ou par injection. Les nanostructures à base de nanorubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières peuvent être employées en thérapie seules, ou en combinaison avec au moins un autre agent actif, tel qu'un autre agent cicatrisant ou un autre agent hémostatique. De tels agents actifs sont bien connus de l'homme du métier.

Les nanostructures à base de nanorubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières et les compositions pharmaceutiques les renfermant peuvent être utilisées en tant qu'agent induisant la régénération cellulaire (par exemple du tissu cardiaque). Par « agent induisant la régénération tissulaire », on entend un agent capable de permettre à un organe de retrouver ou conserver sa fonction d'origine (fonction cardiaque, rénale, pulmonaire,...). Les compositions pharmaceutiques comprenant des nanostructures à base de nanorubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières peuvent être administrées sous différentes formes. Par exemple, elles peuvent être sous forme de compositions injectables ou sous forme de compositions pour application topique ou intra-tissulaire. Les formes pharmaceutiques administrables par voie topique ou intra-tissulaire incluent les gels, hydrogels (gels comprenant au moins 70% en masse d'eau) ou hydrocolloïdes. Ces gels, hydrogels ou hydrocolloïdes comprenant des nanostructures à base de rubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou des protéines ou peptides dérivé(e)s de ces dernières peuvent être sous forme de pansements destinés à être appliqués sur une lésion pour permettre la cicatrisation ou la régénération tissulaire.

La figure 4 représente de manière schématique deux exemples de pansement (7) selon la présente invention. Le pansement peut comprendre une nanostructure (1) selon la présente invention dans laquelle des protéines d'adhésion sont greffées en surface des nanorubans de titanate par l'intermédiaire d'un polymère bifonctionnel. La nanostructure peut être formulée sous forme d'hydrogel. Le pansement peut alternativement comprendre cette nanostructure sur laquelle des cellules (6) ont été mises en culture. Après adhésion des cellules, l'ensemble cellules/nanostructure forme un pansement (7). Dans le cas d'une utilisation pour favoriser le processus de cicatrisation, la nanostructure de la présente invention est de préférence formulée sous forme d'un hydrogel, tout particulièrement sous forme d'un hydrogel d'alginate de calcium. Cette formulation permet une application directe sur les tissus lésés. De plus, les hydrogels d'alginates sont réputés pour présenter également des propriétés cicatrisantes car ils permettent de conserver un taux d'humidité élevé au sein de la plaie. La combinaison nanostructure/hydrogel d'alginate forme alors un nouveau médicament au pouvoir cicatrisant. Les nanostructures à base de rubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières peuvent également être utilisées en médecine régénérative ou pour l'ingénierie tissulaire. En particulier, des implants médicaux peuvent comprendre des nanostructures à base de rubans de titanate sur lesquels sont greffés des protéines de la matrice extracellulaire ou toute protéine ou peptide dérivé(e) de ces dernières. La nanostructure va permettre l'adhésion et la prolifération des cellules.

La présente invention concerne également une méthode de reconstruction des tissus endommagés comprenant l'application sur une lésion d'une composition pharmaceutique selon la présente invention. La présente invention concerne tout particulièrement une méthode de reconstruction d'un tissu cardiaque endommagé comprenant l'application sur la lésion d'une composition pharmaceutique selon la présente invention.

Les nanostructures à base de titanate selon la présente invention peuvent être préparées par un procédé comprenant les étapes de : a) fonctionnalisation d'un nanoruban de titanate par greffage covalent d'un polymère bifonctionnel en surface dudit nanoruban ; b) greffage covalent d'un agent bioactif sur le nanoruban fonctionnalisé par l'extrémité libre dudit polymère bifonctionnel. Le procédé de préparation des nanostructures à base de titanate peut également comprendre une étape de passivation du nanoruban de titanate par greffage covalent d'un polymère monofonctionnel en surface dudit nanoruban. Cette étape est de préférence concomitante à l'étape de fonctionnalisation du nanoruban de titanate. La fonctionnalisation du nanoruban de titanate est de préférence réalisée par greffage d'un polymère bifonctionnel présentant à une extrémité un groupement fonctionnel silane ou phosphonate. Le groupement fonctionnel silane ou phosphonate permet un greffage covalent du polymère en surface du nanoruban de titanate. A l'autre extrémité, le polymère bifonctionnel comprend de préférence un groupement fonctionnel maléimide ou Nhydroxysuccinimide. L'agent bioactif est greffé sur l'ensemble par formation d'une liaison covalente entre l'agent bioactif et le polymère. Le greffage est de préférence réalisé par formation d'une liaison covalente entre le groupement fonctionnel maléimide du polymère et une fonction amine portée par l'agent bioactif ou par formation d'une liaison covalente entre le groupement fonctionnel N-hydroxysuccinimide du polymère et une fonction thiol portée par l'agent bioactif. De préférence, le polymère bifonctionnel greffé est un PEG hétérobifonctionnel de type Si-PEG-Mal ou Si-PEG-NHS.

EXEMPLES Synthèse des nanorubans de titanates La synthèse des nanorubans de titanate par traitement hydrothermal se déroule en plusieurs étapes. La réaction en elle-même a lieu dans un autoclave de chez Parr Instrument. Les deux réactifs, 440 mg de précurseur pulvérulent de TiO2 de phase P25 (Degussa) et 110 mL d'une solution de soude à 10M (Sigma Aldrich), sont introduits dans un bol en Téflon après avoir subi une étape de sonication de 30 minutes à la canne à ultrasons (pulse de 2 secondes, puissance 375 Watt). Ce bol est ensuite placé dans le réacteur qui est fermé par un couvercle équipé d'un thermocouple, permettant de mesurer la température in situ au cours de la réaction, d'un système d'agitation mécanique par une hélice à quatre pâles, d'un serpentin de refroidissement du milieu réactionnel par circulation d'eau froide, d'un système de prélèvement in situ et d'un manomètre contrôlant la pression dans le réacteur. Le poste de commande permet d'imposer la température de réaction et la vitesse d'agitation. Lors des synthèses réalisées, il n'y a pas de contrôle sur la pression interne du réacteur, elle est autogène. Les conditions de réaction sont une température de 180°C, un temps de réaction de 20h, une agitation mécanique de 150 tours par minute et une pression autogène de 7 bar. Une fois la réaction terminée, la partie filandreuse du précipité formé est récupéré sur les éléments plongeants et séparé du surnageant de synthèse par un cycle de centrifugation de 10 minutes à 15 000 tours.min-1 (10 847 xg). Dans le but de revenir à un pH neutre, le précipité est ensuite lavé par dialyse pendant plusieurs jours. Cette technique de purification consiste à placer le précipité à laver dans une membrane microporeuse et semi-perméable de 3500 Da, puis de le plonger dans un bain d'eau déionisée changé régulièrement. Par effet d'osmose et d'agitation moléculaire, les ions résiduels (excès de base, contre-ions, etc.) vont être éliminés de manière à ce que les potentiels chimiques de part et d'autre de la membrane soient identiques. Les eaux de lavage sont renouvelées régulièrement jusqu'à ce que leur pH et leur conductivité atteignent les valeurs de l'eau déionisée (pH 6 et s = 10 pS). Enfin, pour obtenir une poudre qui pourra être caractérisée, le précipité en suspension dans l'eau est ensuite congelé dans l'azote liquide puis lyophilisé par sublimation de l'eau à une température de -80°C et une pression d'environ 19 Pa.

Synthèse du polymère hétérobifonctionnel : Si-PEG-Mal - ère étape greffage du groupement Mal Pour synthétiser le PEG hétérobifonctionnel Si-PEG-Mal, un PEG hétérobifonctionnel commercial a été utilisé : le HO-PEG5000-NH2 (Iris Biotech). Un groupement maléimide, possédant une forte affinité pour les cystéines présentes dans la séquence d'acides aminés de nombreuses protéines, est greffé sur l'extrémité amine du HO-PEG-NH2. L'apport du groupement maléimide se fait par l'intermédiaire du succinimido-4-maléimido benzoate. Pour le greffage du groupement maléimide, le succinimido-4-maléimido benzoate doit être introduit en excès par rapport au HO-PEG-NH2 (rapport molaire de 5:1). La réaction se déroule en présence d'un solvant : le dichlorométhane (500 pL pour 50 mg de PEG) pendant 16h, à température et pression ambiante (20°C, 1 bar) et sous une agitation magnétique vigoureuse. Une fois la réaction terminée, le solvant et évaporé et le produit obtenu HO-PEG5000-Mal est purifié par chromatographie flash (élimination du N-hydroxysuccinimide formé lors de la réaction et des produits n'ayant pas réagi). - 2nde étape : greffage du groupement silane La silanisation de l'hydroxy-PEG5000-Maléimide préalablement synthétisé est réalisée par l'intermédiaire du 3-isocyanatopropyltriéthoxysilane (IPTES) commercial provenant de Sigma Aldrich. L'IPTES est mis en excès (rapport molaire par rapport au PEG de 5: 1) pour favoriser le greffage du groupement silane et ainsi optimiser le taux de conversion du HOPEG5000-Mal en Si-PEG5000-Mal. Le greffage du groupement silane a été effectué en présence de dichlorométhane et avec une concentration de PEG de 100 mg.mL-1. Le milieu réactionnel est ainsi très concentré ce qui permet une cinétique de réaction plus rapide. Les conditions de silanisation ont été un temps de réaction de 5 jours, une agitation magnétique de 700 tours.min-1 permettant d'homogénéiser le milieu réactionnel et de favoriser le contact entre les différents réactifs, une température de 20°C et une atmosphère inerte hermétique à toutes trace d'eau grâce à un flux d'azote en continu. Une fois la réaction terminée, le dichlorométhane a été évaporé à l'aide d'un évaporateur rotatif (bain à 35°C et vitesse de rotation du ballon forte). Puis, l'ajout d'heptane couplé à un traitement aux ultrasons (1 min bain US) a permis de faire précipiter le PEG synthétisé. Plusieurs cycles de centrifugation (2 min à 4000 tours.min-1) ont enfin été réalisés pour laver et récupérer le polymère. Une dernière étape de séchage sous vide a permis d'obtenir le PEG sous forme de poudre. Synthèse du polymère hétérobifonctionnel : Si-PEG-NHS - Greffage du groupement silane La silanisation de l'hydroxy-PEG5000-succinimide commercial (HO-PEG5000-NHS) provenant de Jenkem Technology (USA) a été réalisée dans des conditions analogues à celle de la silanisation du HO-PEG5000-Mal et par l'intermédiaire des mêmes réactifs. Seule la température de réaction a été augmentée à 40°C par chauffage par bain d'huile thermostaté.

Greffage du polymère en surface des nanorubans Pour l'élaboration de la nanostructure, la fonctionnalisation des nanorubans de titanates se fait par un mélange de polymères contenant 5% de Si-PEG-Mal (ou de Si-PEG-NHS) et 95% mPEG-Si en proportions molaires. Un mélange de 30 mg de mPEG-Si et de 2 mg de Si-PEG-Mal (ou de Si-PEG-NHS) pur à 80% a été préparé. Dans le but d'avoir un rapport massique de polymère de 3 : 1, 10,6 mg de nanorubans de titanates ont été dispersés par agitation manuelle dans 100 mL de dichlorométhane. Puis, le mélange de polymère a été ajouté au milieu réactionnel. Les conditions de greffage ont été un temps de réaction de 48h, une agitation magnétique de 150 tours.min-1, une température de 20°C et une atmosphère inerte. Une fois la réaction terminée, le précipité a été lavé plusieurs fois par cycle de centrifugation en présence de dichlorométhane pour éliminer le polymère n'ayant pas réagi avant d'être séché sous vide. Couplage des protéines - Nanorubans fonctionnalisés avec le polymère Si-PEG-Mal Le greffage ciblé de peptides collagène-like de type (GPO)(10)-(GXY)-GPC et (GP0)(10)- (GXY)-G avec P pour proline, O pour hydroxyproline et X et Y tout type d'acides aminés par l'intermédiaire du couplage Mal/Cys se déroule en plusieurs étapes. Une étape de réduction des peptides ou des protéines contenant au moins une cystéine permettant de cliver les ponts dissulfures est nécessaire pour rendre les cystéines accessibles et réactives. Pour cela, les peptides ont été incubés 1h à 37°C en présence de (tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) dans un tampon contenant du PBS et de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) permettant de chélater les ions métalliques résiduels. Une fois l'incubation terminée, les réactifs étant placés dans un tube à fond conique muni d'une membrane filtrante, une étape de centrifugation d'une minute à 1000 tours.min-1 (930 xg) a permis de récupérer les protéines réduites contenues dans le filtrat. Les nanorubans de titanate, ont quant à eux, été passives par de l'albumine de sérum bovin à 3% (BSA) pour éviter tout greffage aspécifique sur leur surface. Pour cela, la suspension de nanorubans a été centrifugée 2 minutes à 2000 tours.min-1 (434 xg) pour éliminer le surnageant. Les nanorubans ont ensuite été dispersés dans de la BSA puis incubés pendant 30 minutes à 37°C sur une table vibrante (600 secousses.min-1). Un nouveau cycle de centrifugation a été réalisé pour éliminer la BSA pouvant perturber par la suite le test d'Ellman.

Les nanorubans en suspension dans l'eau déionisée ont ensuite été incubés en présence des peptides réduits pendant 30 minutes à température de 20°C sur une table vibrante (600 secousses.min-1). Les peptides ont été introduits en excès par rapport aux groupements maléimides avec un rapport molaire des réactifs de 5 : 1. Un cycle de centrifugation (2 minutes à 2000 tours.min-1 (434 xg)) a permis de séparer les nanostructures formées du surnageant. Enfin, le dosage des cystéines contenues dans le surnageant par un test d'Ellman permet de remonter à la quantité de protéines greffées en surface des nanorubans par l'intermédiaire du couplage Mal/Cys. - Nanorubans fonctionnalisés avec le polymère Si-PEG-NHS Le greffage ciblé de collagène de type I à 10 pg/mL (Horm de chez Nycomed), via un couplage par les amines (réaction d'une fonction NHS avec les amines d'une lysine), se déroule en une seule étape. Ainsi, les nanorubans sont remis en suspension dans un tampon phosphate de type PBS puis incubés immédiatement en présence du collagène pendant 30 minutes à une température de 20-22°C. Les deux acteurs ont été mis en présence dans un rapport de concentration 1 :5 (agent bioactif : nanorubans). La suspension est ensuite centrifugée 2 minutes à 4000 g pour éliminer le surnageant. Après un lavage par un tampon phosphate de type PBS, une nouvelle centrifugation est réalisée. Le culot est ensuite remis en suspension dans un tampon phosphate de type PBS. Formulation de la nanostructure Protocole de synthèse de l'hydrogel d'alginate de sodium à 7% La formation d'un hydrogel d'alginate de sodium est réalisée par simple dissolution de poudre d'alginate de sodium dans de l'eau déionisée à une température de 20°C (7 g de poudre d'alginate de sodium dans 100 mL d'eau). Sous l'effet de l'hydratation, la poudre va gonfler et former un gel. Pour obtenir un gel homogène, il est nécessaire de respecter un protocole de fabrication rigoureux. Avant d'introduire la poudre d'alginate, il est important que l'eau soit sous agitation mécanique vigoureuse (480 tours.min-1) de façon à créer un vortex. L'alginate est ensuite ajouté progressivement en le saupoudrant au-dessus du vortex pour éviter la formation de grumeaux. Le gel a été agité pendant une durée de 30 minutes pour assurer une dissolution complète de l'alginate puis il est stocké 24h au frigo pour éliminer les bulles d'air formées. Protocole d'incorporation des nanorubans au sein de l'hydrogel 10 mg de nanorubans lyophilisés et 3,5 g de poudre d'alginate de sodium ont été mélangés dans un mortier. Le mélange de poudre a ensuite été incorporé progressivement à 50 mL d'eau déionisée sous forte agitation mécanique (480 tours.min-1). L'ensemble a été laissé sous agitation pendant une durée de 5 minutes. * Etude de la toxicité des nanorubans de titanate par le test MTT Des tests de toxicité MTT réalisés sur deux populations de cellules (cardiomyocytes et fibroblastes) ont montré que, sur une gamme de concentration comprise entre 2 et 70 pg.mL1, les nanorubans de titanate en suspension présentent une toxicité acceptable puisque la viabilité cellulaire est supérieure à 80%. Cette étude a été réalisée sur une durée de 3 jours et en faisant varier le nombre de doses de nanoparticules appliquées aux cellules. Une application chronique de nanoparticules (3 doses) n'entraîne pas une toxicité plus importante que lorsqu'une seule et unique dose de nanorubans a été appliquée aux cellules le premier jour de l'étude. Les résultats des tests de toxicité sont présentés aux figures 5 et 6. * Etude de l'influence des nanorubans de titanate sur la fonction plaquettaire Dans l'optique d'utiliser la nanostructure en tant qu'agent hémostatique, des tests d'agrégation plaquettaire ont été réalisés sur les nanorubans nus. Ces tests ont été effectués sur du PRP (plasma riche en plaquettes) d'un donneur volontaire. Ce PRP a été préalablement analysé pour contrôler sa teneur en plaquette. Ce taux doit atteindre 350 millions de plaquettes par microlitre. Par la suite, 10 pL de solution de nanorubans ont été ajoutés à 290 pL de PRP de façon à obtenir une gamme de concentrations finales de nanoparticules variant de 1 à 100 pg.mL-1. Les suspensions ont été incubées sous agitation pendant 20 minutes à 37°C avant de réaliser des mesures.

Les résultats montrent que la présence des nanorubans n'active pas la fonction plaquettaire puisqu'aucun agrégat n'est détecté après 11 minutes de réaction. Dans le but de déclencher volontairement l'agrégation des plaquettes, 5 pM d'ADP, un agoniste des récepteurs P2Y12 des plaquettes sanguines, ont été ajoutés au PRP. La proportion d'agrégat augmente alors en quelques secondes et passe de 0 à 70%. La présence des nanorubans n'inhibe donc pas le processus de coagulation. Les nanorubans de titanate sont neutres et passifs face au phénomène de l'agrégation plaquettaire, ce qui était recherché puisqu'ils sont là pour jouer le rôle de matrice et de support des molécules biologiques contrôlant l'agrégation. * Test d'adhésion TiONRs/protéines d'adhésion Une fois la nanostructure obtenue (greffage de l'agent bioactif sur les nanorubans), cette dernière est déposée dans des puits d'une plaque 96 de type Maxisorp (NUNC), dont la surface des puits a une capacité d'absorption des peptides et protéines supérieures à celle des plaques de culture classique, ceci pendant 2h à 37°C. Puis 2 lavages avec un tampon phosphate de type PBS sont réalisés afin d'éliminer la nanostructure qui n'aurait pas adhérée à la surface du puits. Ensuite, une étape de passivation est réalisée pendant 2h à 37°C avec une solution d'albumine de sérum bovin à 3% (BSA) diluée dans un tampon phosphate de type PBS pour éviter toute adhésion cellulaire aspécifique. Après saturation des puits, deux lavages avec un tampon phosphate de type PBS sont réalisés afin d'éliminer l'excès de BSA. En parallèle, les cellules d'intérêt en culture (MRC-5 : lignée de fibroblastes pulmonaires humains sont décollées de la boîte de culture par trypsination avec une solution de trypsineEDTA 1X pendant quelques minutes à 37°C puis centrifugées 5 minutes à 1300 g. Les culots cellulaires sont repris dans le milieu de culture de type DMEM ou EMEM et un comptage cellulaire est réalisé. Les cellules sont alors transférées dans les puits de la plaque 96 contenant la nanostructure à raison de 40 000 cellules MRC-5/100 pL/puits puis incubées 2h à 37°C. Le taux d'adhésion cellulaire est ensuite quantité par une coloration des cellules au Crystal violet. Ainsi, 2 lavages avec un tampon phosphate de type PBS sont réalisés pour éliminer les cellules non adhérées. Ensuite, les cellules adhérées sont fixées 10 minutes avec 100 pL/puits de méthanol froid (-20°C) puis colorées, après élimination du méthanol, avec 100 pL/puits d'une solution de Crystal violet 0.5% dans 20% de méthanol pendant 10 minutes. Après rinçage des puits sous l'eau du robinet et séchage sur une nuit, les cristaux de Crystal violet sont dissouts avec 100 pL/puits d'une solution de SDS 1%. La mesure de l'absorbance est réalisée à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Les résultats de la figure 7 montrent que : - les nanorubans fonctionnalisés et passivés avec Si-PEG-NHS et mPEG-Si, ou non, ne permettent pas l'adhésion cellulaire, - les nanorubans non fonctionnalisés et non passivés sur lesquels s'est adsorbé le collagène de type I permettent une adhésion d'environ 27 % des cellules comparés au collagène de type I utilisé à 10 pg/mL, - les nanorubans fonctionnalisés avec Si-PEG-NHS et passivés avec mPEG-Si sur lesquels est greffé le collagène de type I, correspondant à la nanostructure selon invention, permettent une adhésion des cellules équivalentes à celle obtenue avec le collagène de type I seul. Ceci confirme que le collagène incubé en présence des nanorubans fonctionnalisés avec Si-PEG- NHS et passivés avec mPEG-Si s'est bien greffé et que la nanostructure ainsi générée présente l'activité biologique recherchée. Dans la figure 7, « NR » désigne les nanorubans et « NR-PEG » désigne les nanorubans fonctionnalisés et passivés. * Etude in vivo du pouvoir cicatrisant des hydrogels d'alginate - Protocole pour la cicatrisation de plaies externes Pour évaluer le pouvoir cicatrisant de l'hydrogel d'alginate de sodium, des tests de cicatrisation in vivo ont été réalisés sur une population de 10 souris mâle de 30-40 g de modèle SWISS, selon le protocole suivant.

Deux plaies dorsales ont été réalisées sur chaque souris à l'aide d'un punch de 6 mm permettant d'éliminer les différentes couches de l'épiderme sans toucher la couche musculaire paniculus carsinosus. Pour favoriser une cicatrisation par ré-épithélialisation en évitant la rétractation des tissus et de la peau, une attelle en silicone (13 mm de diamètre) a été mise en place autour de chaque plaie. De plus, pour éviter tout contact entre les plaies et les souris, des collerettes ont été placées autour du cou de chaque sujet et les souris ont été hébergées individuellement dans les cages tout le long de l'expérimentation. Les plaies ont ensuite été recouvertes soit par un hydrogel commercial (Duoderm®), soit par un gel d'alginate de sodium à 7%. Pour servir de témoin, une partie des plaies n'a pas été traitée et une autre partie a été traitée par du PBS ne possédant aucun pouvoir cicatrisant. Le traitement a été renouvelé tous les 3 jours jusqu'à cicatrisation complète et totale des plaies. Pour éviter le dessèchement des gels et pour favoriser la protection contre les contaminants extérieurs, les plaies traitées ont été recouvertes par un pansement commercial (Tegaderm®). Cent mg/kg de paracétamol sont ajoutés à l'eau de boisson et donnés pendant 5 jours pour un effet antalgique. Le choix du paracétamol est lié au fait que c'est un antalgique dépourvu de propriété anti-inflammatoire et n'agissant pas sur l'agrégation plaquettaire. Il n'aura donc pas d'incidence sur le phénomène de cicatrisation. L'étude a montré que la cicatrisation est complète au bout de 17 jours quel que soit le traitement appliqué. Le gel d'alginate de sodium à 7% ne semble pas présenter un pouvoir cicatrisant puisque les plaies traitées par les différents agents ainsi que les plaies non traitées ont atteint le même niveau de cicatrisation. Lors de la formulation de la nouvelle nanostructure, l'hydrogel aura alors uniquement un rôle d'excipient. La cicatrisation ne sera favorisée que par la nanostructure jouant quant à elle le rôle de principe actif. L'analyse des tissus en histologie devra cependant être réalisée pour confirmer que l'hydrogel n'influe pas sur le processus de cicatrisation. Il est également important de noter que l'application du gel d'alginate de sodium à 7% n'induit pas de réaction inflammatoire ni d'infection au niveau des plaies. - Protocole pour la régénération cardiaque Les animaux (rats mâles Wistar de 250 g) sont endormis par anesthésie gazeuse sous isoflurane. L'exposition du coeur est réalisée après désinfection et rasage de la zone à inciser par thoracotomie via le elle espace intercostal puis le péricarde est sectionné. Une sonde en aluminium de 3 mm de diamètre, préalablement refroidie à -196°C dans de l'azote liquide, est appliquée pendant 10 secondes sur le ventricule gauche antérieur. La position exacte de la sonde est déterminée par le repérage de l'atrium gauche et de l'artère pulmonaire. Une fois le cryo-infarctus réalisé, la zone ciblée est rincée avec du sérum physiologique à température ambiante de manière à pouvoir retirer la sonde du tissu sans l'endommager. La nanostructure à tester est injectée au niveau de la lésion par de petites injections réparties sur toute la lésion (injections jusqu'à 100 pL finaux). Des sutures sont ensuite réalisées pour refermer l'espace intercostal et la peau. 100 mg/kg de paracétamol sont ajoutés à l'eau de boisson et donnés pendant 5 jours pour un effet antalgique. Le choix du paracétamol est lié au fait que c'est un antalgique dépourvu de propriété anti-inflammatoire et n'agissant pas sur l'agrégation plaquettaire. Il n'aura donc pas d'incidence sur le phénomène de cicatrisation.

Un antibiotique est injecté en sous-cutané tous les jours pendant 5 jours post-infarctus pour éviter les infections. De plus, pour éviter tout rejet de la nanostructure et/ou des constituants pouvant être co-injectés (réactions immunitaires), les animaux sont soumis à un traitement immunosuppresseur (ciclosporine à 5 mg/kg/j) jusqu'à la fin de l'expérimentation. Les paramètres de régénération du tissu cardiaque post-infarctus sont mesurés sur une période de 8 semaines après le cryo-infarctus par la mesure de marqueurs systémiques (marqueurs du turn-over du collagène, NT-proBNP, ...). Par ailleurs, une mesure de la fonction cardiaque est réalisée à différents temps par imagerie échographique (mesure de la fraction d'éjection du ventricule gauche), la mesure de la fibrose interstitielle étant réalisée par IRM (mesure par injection de gadolinium). Enfin, le coeur sera prélevé, après euthanasie de l'animal par injection létale de pentobarbital, à différents temps (0, 24h, 7j puis toutes les semaines) sur une période de 2 mois post-cryo-infarctus. Le coeur est fixé dans du formol afin de réaliser des analyses immunohistologiques.

2998 1 79 25 REFERENCES (Beuvier et aL 2010) T. Beuvier, M. Richard-Plouet, M. Mancini-Le Granvalet, T. Brousse, O. Crosnier, L. Brohan 5 TiO2 nanoribbons as negative electrode material for lithium ion batteries with high rate performance Inorg. Chem. 49 (2010) 8457-8464 (De Monredon 2004) Thèse de doctorat en Physique et Chimie des Matériaux de 10 Sophie De Monredon Interactions organosilanes/silice de précipitation du milieu hydro-alcoolique au milieu aqueux Soutenue le 7 décembre 2004 à l'Université Pierre et Marie Curie Paris VI (Engelhardt et aL 2011)E. M. Engelhardt, L. A. Micol, S. Houis, F. M. Wurm, J. Hilborn, J. A. Hubbell, P. Frey A collagen-poly(lactic-co-e-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration Biomaterials 32 (2011) 1-8 (Fan et al. 2010) Donglei Fan, Zhizhong Yin, Raymond Cheong, Frank Q. Zhu, Robert C. Cammarata, C. L. Chien, Andre Levchenko Subcellular-resolution delivery of a cytokine through precisely manipulated nanowires Nature Nanotechnology 5 (2010), 545-551 (Feng et al. 2010) M. Feng, H. Zhan, L. Miao Facile solubilization of titanate nanobelts for nonlinear optical investigations Nanotechnology 21 (2010) 185707 (6pp) (Hafez 2009) H.S. Hafez Synthesis of highly active single crystalline TiO2 nanorods and its application in environmental photocatalysis Mater. Letters 63 (2009) 1471-1474 (Hartwell etal. 2011) R. Hartwell, V. Leung, C. Chavez-Munoz, L. Nabai, H. Yang, F. Ko, A. Ghahary A novel hydrogel-collagen composite improves functionality an injectable extracellular matrix ActaBiomater. 7 (2011) 3060-3069 (Jitputti et al. 2008) J. Jitputti, Y. Suzuki, S. Yoshikawa Synthesis of TiO2 nanowires and their photocatalytic activity for hydrogen evolution Catal. Com. 9 (2008) 1265-1271 (Li etal. 2009) D.Li, H. Chen, W. G. McClung, J. L. Brash Lysine-PEG-modified polyurethane as a fibrinolytic surface: Effect of PEG chain length on protein interactions, platelet interactions and dot lysis ActaBiomater. 5 (2009) 1864-1871 (Liu 2008) A. Liu Towards development of chemosensors and biosensors with metal-oxide-based nanowires or 5 nanotubes Biosens. Bioelec. 24 (2008) 167-177 (Pan et al. 2007) K. Pan, Q. Zhang, Q. Wang, Z. Liu, D. Wang, J. Li, Y. Bai The photoelectrochemical properties of dye sensitized solar cell made with TiO2 nanoribbons 10 and nanorod Thin Solid Films 515 (2007) 4085-4091 (Tran et al. 2009) Phong A. Tran, Lijie Zhang, Thomas J. Webster Carbon nanofibers and carbon nanotubes in regenerative medicine 15 Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 1097-1114 (Yuan et al. 2002) Z.Y. Yuan, J.F. Colomer, B.L. Su Titanium oxide nanoribbons Chem. Phys. Letters 363 (2002) 362-366 20 (Wang et al. 2012) X. Wang, R. A. Gittens, R. Song, R. Tannenbaum, R. Olivares-Navarrete, Z. Schwartz, H. Chen, B. D. Boyan Effects of structural properties of electropsun TiO2 nanofiber meshes on their osteogenic potential 25 ActaBiomater. 8 (2012) 878-885 (Wu et al. 2008) Shuilin Wu, Xiangmei Liu, Tao Hu, Paul K. Chu, J. P. Y. Ho, Y. L. Chan, K. W. K. Yeung, C. L. Chu, T. F. Hung, K. F. Huo, C. Y. Chung, W. W. Lu, K. M. C. Cheung, and K. D. K. Luk 30 A Biomimetic Hierarchical Scaffold: Natural Growth of Nanotitanates on Three-Dimensional Microporous Ti-Based Metals Nano Lett., 2008, 8 (11), 3803-3808

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Nanostructure à base de nanorubans de titanate, lesdits nanorubans de titanate présentant en surface des agents bioactifs greffés par l'intermédiaire d'un polymère bifonctionnel, de préférence un polymère hétérobifonctionnel, ledit polymère bifonctionnel présentant à une extrémité un groupement fonctionnel lui permettant d'être greffé de manière covalente en surface des nanorubans de titanate et à l'autre extrémité un groupement fonctionnel lui permettant d'être greffé de manière covalente aux agents bioactif.
2. 2. Nanostructure selon la revendication précédente dans laquelle le polymère bifonctionnel est choisi parmi les polyéthylène glycols (PEG), les poly(acide lactiquecoglycolique) (PLGA), les poly(caprolactone) (PLCL), les poly(acide lactique) (PLA), les polymères de glycolide (PGA), les chitosan et dextran.
3. 3. Nanostructure selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le polymère bifonctionnel est un polyéthylène glycol fonctionnalisé à une extrémité par un groupement silane ou un groupement phosphonate permettant le greffage covalent dudit polymère en surface des nanorubans de titanate et fonctionnalisé à l'autre extrémité par un groupement maléimide ou N-hydroxysuccinimide permettant le greffage covalent dudit polymère aux agents bioactifs.
4. 4. Nanostructure selon l'une des revendications précédentes dans laquelle lesdits rubans de titanate ont une largueur variant de 50 à 600 nm, une longueur variant de 0.5 pm à 80 pm et une épaisseur variant de 3 à 60 nm.
5. 5. Nanostructure selon l'une des revendications précédentes dans laquelle les agents bioactifs sont choisis parmi les protéines, peptides, agents thérapeutiques, facteurs de croissance, acides nucléiques ou leurs combinaisons.
6. 6. Nanostructure selon l'une des revendications précédentes dans laquelle les agents bioactifs sont une protéine de la matrice extracellulaire ou un peptide ou protéine dérivé(e) d'une protéine de la matrice extracellulaire.
7. 7. Nanostructure selon la revendication 6 dans laquelle la protéine de la matrice extracellulaire est choisie parmi les collagènes, la fibronectine, la laminine et l'élastine.
8. 8. Nanostructure selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le polymère bifonctionnel est un polyéthylène glycol fonctionnalisé à une extrémité par un groupement silane ou phosphonate permettant le greffage covalent dudit polymère en surface des nanorubans de titanate et fonctionnalisé à l'autre extrémité par un groupement maléimide ou N-hydroxysuccinimide permettant le greffage covalent dudit polymère aux agents bioactifs et dans laquelle l'agent bioactif est une protéine de la matrice extracellulaire choisie parmi les collagènes, la fibronectine, la laminine et l'élastine ou un peptide ou protéine dérivé(e) des collagènes, de la fibronectine, de la laminine ou de l'élastine.
9. 9. Nanostructure selon l'une des revendications précédentes comprenant en outre un polymère passivant greffé de manière covalente en surface des nanorubans de titanate.
10. 10. Nanostructure selon l'une des revendications précédentes pour son utilisation en tant que médicament.
11. 11. Nanostructure selon la revendication 6, 7 ou 8 pour son utilisation en tant qu'agent cicatrisant, hémostatique ou agent induisant la régénération tissulaire.
12. 12. Composition pharmaceutique comprenant une nanostructure selon l'une des revendications 1 à 11 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
13. 13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, ladite composition étant sous forme de gel, hydrogel ou hydrocolloïde.
14. 14. Implant médical comprenant une nanostructure selon l'une des revendications 1 à 9.
15. 15. Procédé de fabrication d'une nanostructure selon l'une des revendications 1 à 9 comprenant les étapes de :a) fonctionnalisation d'un nanoruban de titanate par greffage covalent d'un polymère bifonctionnel en surface dudit nanoruban ; b) greffage covalent d'un agent bioactif sur le nanoruban fonctionnalisé par l'extrémité libre dudit polymère bifonctionnel.5