FR2988604A1 - Use of fermentation broth of Burkholderia caribensis composition comprising Burkholderia caribensis strain, bacterial culture medium and polysaccharide, for preparing composition containing oligosacchrides with cosmetic properties - Google Patents
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Classifications
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Abstract
Description
COMPOSITIONS D'OLIGOSACCHARIDES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS UTILISATIONS La présente invention a pour objet des compositions d'oligosaccharides, leur procédé de préparation et leurs utilisations, notamment en cosmétique. La couche la plus superficielle de la peau est appelée Stratum Corneum et se caractérise par la différenciation terminale des kératinocytes provenant des kératinocytes prolifératifs issus de la couche basale. L'hydratation de la couche cornée est essentielle pour la peau et dépend de nombreux facteurs comme la composition en lipides extracellulaires (céramides, cholestérol, acides gras libres) sécrétés par les corps lamellaires des kératinocytes, de la teneur en NMF (Facteurs Naturels d'Hydratation) provenant de la filaggrine, et dépend également du gradient de pH cutané, élément important dans le fonctionnement général du Stratum Corneum. Tous ces facteurs sont altérés et diminués avec l'âge. Dans la peau, la filaggrine est un marqueur de différenciation tardif impliqué dans l'hydratation et la fonction barrière de l'épiderme. La filaggrine « filament-aggregating protein » interagit avec les filaments de kératine du stratum corneum et contribue ainsi à former une matrice de kératine (après action des transglutaminases) insoluble à laquelle les protéines de l'enveloppe cornée et les lipides peuvent s'attacher. La profilaggrine contenue dans les granules de keratohyaline est le précurseur de la filaggrine. Au cours de la différenciation la profilaggrine est clivée en monomères de filaggrine. La filaggrine a une double fonctionnalité au sein du stratum corneum. Elle catalyse la formation des ponts disulfures entre les filaments de kératine puis génère, à l'intérieur des cornéocytes moyens et superficiels, un pool concentré d'acides aminés libres et de dérivés qui constituent les NMF (facteur naturel d'hydratation). Ceux-ci offrent des sites de fixation pour les molécules d'eau et établissent de véritables ponts entre les kératines et l'eau, maintenant ainsi un minimum d'hydratation des couches moyennes et supérieures du stratum corneum. Les aquaporines (AQP) sont une classe de protéines membranaires qui forment des pores perméables aux molécules d'eau et au glycérol dans les membranes biologiques. The present invention relates to oligosaccharide compositions, to a process for their preparation and to their uses, in particular in cosmetics. The most superficial layer of the skin is called Stratum Corneum and is characterized by the terminal differentiation of keratinocytes from proliferative keratinocytes from the basal layer. The hydration of the stratum corneum is essential for the skin and depends on many factors such as the composition of extracellular lipids (ceramides, cholesterol, free fatty acids) secreted by the lamellar bodies of keratinocytes, the content of NMF (Natural Factors of Hydration) from filaggrin, and also depends on the skin pH gradient, an important element in the general functioning of the Stratum Corneum. All of these factors are altered and diminished with age. In the skin, filaggrin is a marker of late differentiation involved in the hydration and barrier function of the epidermis. The filaggrin filament-aggregating protein interacts with the keratin filaments of the stratum corneum and thus contributes to forming an insoluble keratin matrix (after transglutaminase action) to which the proteins of the horny envelope and lipids can attach. The profilaggrine contained in keratohyaline granules is the precursor of filaggrin. During differentiation profilaggrin is cleaved into filaggrin monomers. Filaggrin has a dual function within the stratum corneum. It catalyzes the formation of disulfide bridges between the keratin filaments and then generates, within the medium and superficial corneocytes, a concentrated pool of free amino acids and derivatives which constitute the NMFs (natural factor of hydration). These offer binding sites for water molecules and establish real bridges between keratin and water, thus maintaining a minimum of hydration of the middle and upper layers of the stratum corneum. Aquaporins (AQP) are a class of membrane proteins that form pores permeable to water and glycerol molecules in biological membranes.
Dans la peau, l'aquaporine 3 (AQP3) est localisée dans les kératinocytes. Les souris dont le gène de l'aquaporine 3 a été invalidé présentent une perte d'élasticité de l'épiderme, une altération de la barrière cutanée ainsi qu'une diminution de la quantité d'eau contenue dans le stratum corneum à l'origine d'une sécheresse prononcée de la peau. L'ensemble de ces observations plaide en faveur d'un rôle de l'aquaporine 3 dans l'homéostasie hydrique de l'épiderme. En outre, une étude suggère que l'aquaporine 3, par sa perméabilité au glycérol et en interagissant avec la phospholipase D, pourrait également intervenir dans les mécanismes de prolifération et de différenciation des kératinocytes. Ainsi, un but de la présente invention consiste à fournir des compositions d'oligosaccharides permettant de stimuler l'expression de la filaggrine et/ou de l'aquaporine- 3. Un autre but de l'invention consiste à fournir des compositions comprenant des oligosaccharides pour leur utilisation en cosmétique, notamment pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière et l'hydratation. In the skin, aquaporin 3 (AQP3) is localized in keratinocytes. The mice whose aquaporin 3 gene was invalidated show a loss of elasticity of the epidermis, an alteration of the cutaneous barrier as well as a decrease in the quantity of water contained in the stratum corneum at the origin a pronounced dryness of the skin. All these observations argue in favor of a role of aquaporin 3 in the water homeostasis of the epidermis. In addition, one study suggests that aquaporin 3, through its permeability to glycerol and interacting with phospholipase D, could also be involved in the proliferation and differentiation mechanisms of keratinocytes. Thus, an object of the present invention is to provide oligosaccharide compositions for stimulating the expression of filaggrin and / or aquaporin-3. Another object of the invention is to provide compositions comprising oligosaccharides for their use in cosmetics, in particular for improving and / or reinforcing the barrier function and hydration.
L'invention a par conséquent pour objet l'utilisation d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, comprenant : - des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, - un milieu de culture desdites bactéries, et - une composition contenant des polysaccharides, produite par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture, lesdits polysaccharides étant de formule I suivante : f3-Kdop 2 3 ->3)-(3-D-Glcp-(1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1-> 2 (0Ac) 25 dans laquelle : Glc représente le glucose ; 6dTal représente le 6-déoxy-talose ; Kdo représente l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique ; 30 n est un nombre entier compris de 700 à 800 ; la concentration en polysaccharides dans ladite composition de moût de fermentation variant de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L ; ladite composition de moût de fermentation étant hydrolysée, pour la préparation d'une composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire 35 allant de 1 à 30 KDa ayant des propriétés cosmétiques.20 De manière inattendue, la demanderesse a maintenant trouvé que des compositions d'oligosaccharides, susceptibles d'être obtenues à partir de moûts de fermentation comprenant des polysaccharides, des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, et un milieu de culture desdites bactéries, avaient des propriétés cosmétiques, notamment l'amélioration et/ou le renforcement de la fonction barrière et l'hydratation. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite composition de moût de fermentation est hydrolysée et neutralisée. Selon un autre mode de réalisation avantageux, ladite composition de moût de fermentation est hydrolysée, éventuellement neutralisée et purifiée. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, lesdites bactéries sont de la souche Burkholderia caribensis MWAP71 ARD, déposée auprès de la CNCM le 09 février 2012 sous le numéro I-4598. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa, à partir d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, ladite composition de moût de fermentation comprenant : - des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, - un milieu de culture desdites bactéries, et - une composition contenant des polysaccharides, produit par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture, lesdits polysaccharides étant de formule I suivante : f3-Kdop 2 3 ->3)-(3-D-Glcp-(1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1-> 2 dans laquelle : (0Ac) Glc représente le glucose ; 6dTal représente le 6-déoxy-talose ; Kdo représente l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique ; n est un nombre entier compris de 700 à 800 ; la concentration en polysaccharides dans ladite composition de moût de fermentation variant de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L ; ledit procédé comprenant une étape d'hydrolyse de ladite composition de moût de 5 fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat. Par composition de moût de fermentation, on entend une composition comprenant des bactéries, un milieu de culture approprié à leur prolifération et au moins un métabolite produit par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture. 10 On entend par « milieu de culture » une solution aqueuse contenant des éléments nutritifs, en particulier une source de carbone, une source d'azote, une source d'oligoéléments et une source de facteurs de croissance, nécessaires au métabolisme bactérien. Dans le cas de bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, ledit métabolite est ladite composition contenant 15 des polysaccharides. Le moût de fermentation comprend ainsi des bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, la composition contenant des polysaccharides, et le milieu de culture à l'issue de l'étape de croissance des bactéries et de production de la composition contenant les 20 polysaccharides, c'est-à-dire une solution aqueuse dans laquelle sont présents les éléments nutritifs et des métabolites (autres que la composition contenant des polysaccharides) éventuellement excrétés par la souche. Par « milieu de culture approprié à leur prolifération», on entend un milieu de culture adapté aux bactéries de l'espèce considérée, en particulier aux bactéries de la souche 25 considérée, c'est-à-dire un milieu de culture contenant les éléments nutritifs, organiques et minéraux, nécessaires à la synthèse de biomasse bactérienne. Par biomasse bactérienne, on entend la masse totale des bactéries présentes, à un moment donné, dans ledit moût de fermentation. Par hydrolyse, on entend une réaction à l'issue de laquelle au moins la chaîne 30 principale desdits polysaccharides, constituée par l'enchaînement du motif [->3)-3-D-Glcp- (1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1->], est coupée de façon à obtenir des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 Kda, préférentiellement de 1 à 15 KDa. The subject of the invention is therefore the use of a fermentation broth composition of Burkholderia caribensis, comprising: bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the Burkholderia caribensis strain MWAP71; culturing said bacteria, and - a polysaccharide-containing composition, produced by said bacteria in said culture medium, said polysaccharides being of the following formula I: ## STR3 ## (3-D-Glcp- (1) -> 4) - (3-D-Glcp- (1-> 4) -α-6dTalp- (1-> 2 (0Ac) 25 in which: Glc represents glucose; 6dTal represents 6-deoxy-talose; Kdo represents 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid, n is an integer from 700 to 800, the concentration of polysaccharides in said fermentation wort composition ranging from 3.5 to 20 g / L, preferably between 5 and 15 g / L, said fermentation beverage composition being hydrolysed, for the preparation of A composition containing oligosaccharides of molecular weight ranging from 1 to 30 KDa having cosmetic properties Unexpectedly, the Applicant has now found that oligosaccharide compositions, obtainable from fermenting mashes comprising: polysaccharides, bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, and a culture medium of said bacteria, had cosmetic properties, in particular the improvement and / or the reinforcement of the barrier function and hydration. According to an advantageous embodiment, said fermentation must composition is hydrolysed and neutralized. According to another advantageous embodiment, said fermentation must composition is hydrolysed, optionally neutralized and purified. According to a particularly advantageous embodiment, said bacteria are of the strain Burkholderia caribensis MWAP71 ARD, deposited with the CNCM on February 9, 2012 under the number I-4598. The invention also relates to a process for the preparation of a composition containing oligosaccharides with a molecular mass ranging from 1 to 30 KDa, from a fermentation broth composition of Burkholderia caribensis, said fermentation broth composition comprising: bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, a culture medium for said bacteria, and a composition containing polysaccharides, produced by said bacteria in said culture medium, said polysaccharides being of following formula I: -3-Kdop 2 3 → 3) - (3-D-Glcp- (1 → 4) - (3-D-Glcp- (1 → 4) -αL-6dTalp- (1->) 2 in which: (0Ac) Glc is glucose, 6dTal is 6-deoxy-talose, Kdo is 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic, n is an integer from 700 to 800 the concentration of polysaccharides in said fermentation must composition ranging from 3.5 to 20 g / L, preferably from 5 to 15 g / L; said method comprising a step of hydrolyzing said Burkholderia caribensis fermentation mash composition to obtain a hydrolyzate. By composition of fermentation wort is meant a composition comprising bacteria, a culture medium suitable for their proliferation and at least one metabolite produced by said bacteria in said culture medium. By "culture medium" is meant an aqueous solution containing nutrients, in particular a carbon source, a nitrogen source, a source of trace elements and a source of growth factors, necessary for bacterial metabolism. In the case of bacteria of the species Burkholderia caribensis, particularly Burkholderia caribensis strain MWAP71, said metabolite is said composition containing polysaccharides. The fermentation wort thus comprises bacteria of the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, the composition containing polysaccharides, and the culture medium at the end of the stage of growth of the bacteria and of producing the polysaccharide-containing composition, i.e., an aqueous solution in which nutrients and metabolites (other than the polysaccharide-containing composition) optionally excreted by the strain are present. By "culture medium suitable for their proliferation" is meant a culture medium adapted to the bacteria of the species in question, in particular to the bacteria of the strain in question, that is to say a culture medium containing the elements nutrients, organic and mineral, necessary for the synthesis of bacterial biomass. Bacterial biomass means the total mass of bacteria present at a given moment in said fermentation must. By hydrolysis is meant a reaction at the end of which at least the main chain of said polysaccharides constituted by the sequence of the [-> 3) -3-D-Glcp- (1-> 4) - (3 -D-Glcp- (1-> 4) -αL-6dTalp- (1->) is cut to obtain oligosaccharides with a molecular mass ranging from 1 to 30 Kda, preferably from 1 to 15 KDa.
Ladite hydrolyse peut par exemple être acide, basique, thermique, acide et thermique, basique et thermique, enzymatique, ou enzymatique et thermique. Par hydrolyse acide, on entend une réaction d'hydrolyse réalisée en milieu aqueux acide, ladite réaction étant catalysée par les ions H+ présents dans ledit milieu. Said hydrolysis may for example be acidic, basic, thermal, acidic and thermal, basic and thermal, enzymatic, or enzymatic and thermal. Acidic hydrolysis is understood to mean a hydrolysis reaction carried out in an acidic aqueous medium, said reaction being catalyzed by the H + ions present in said medium.
Par hydrolyse basique, on entend une réaction d'hydrolyse réalisée en milieu aqueux basique. Par hydrolyse thermique, on entend une réaction d'hydrolyse réalisée en milieu aqueux, ledit milieu aqueux étant chauffé à une température supérieure à la température ambiante. By basic hydrolysis is meant a hydrolysis reaction carried out in a basic aqueous medium. By thermal hydrolysis is meant a hydrolysis reaction carried out in an aqueous medium, said aqueous medium being heated to a temperature above room temperature.
Par hydrolyse enzymatique, on entend une réaction d'hydrolyse catalysée par des enzymes. L'espèce Burkholderia caribensis, en particulier la souche Burkholderia caribensis MWAP71, a été isolée d'un échantillon de vertisol prélevé dans le sud-est de l'île de la Martinique. By enzymatic hydrolysis is meant an enzyme catalyzed hydrolysis reaction. The species Burkholderia caribensis, in particular the Burkholderia caribensis strain MWAP71, was isolated from a vertisol sample collected in the south-east of Martinique Island.
La souche Burkholderia caribensis MWAP71 a été classée par le biais des outils de génétique moléculaire comme appartenant au genre Burkholderia et a été déposée le 09/02/12 auprès de la CNCM selon le traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement I-4598. Ladite souche a été identifiée après séquençage de son gène rrs qui code pour l'ADN ribosomal 16S et par hybridation ADN:ADN comme étant une Burkholderia caribensis sp. 20 nov. Cette souche présente les caractéristiques biochimiques décrites dans le tableau 1 ci-dessous : Test Résultat Etat Frais Bacilles mobiles Coloration de Gram Gram-négatif Oxydase + Catalase + NO3 (nitrate réductase) - N2 (nitrate réductase) - Glucose (ferm) - Arginine dihydrolase - Uréase - Hydrolyse de l'esculine - Gélatinase - Glucose (assimilation) + Arabinose (assimilation) + Mannose (assimilation) + Mannitol (assimilation) + N acétylglucose amine (assimilation) + Maltose (assimilation) - Gluconate (assimilation) + Caprate (assimilation) + Adipate (assimilation) - Malate (assimilation) + Tableau 1 : Caractéristiques biochimiques de la souche MWAP71 Sur milieu solide type PCA (Biomérieux France) et après 30 heures d'incubation à 30°C, la souche MWAP71 forme des colonies de couleur blanche, de type S et d'un diamètre 5 de 5 à lOmm. Le milieu de culture PCA (Plate Count Agar) est bien connu de l'homme du métier pour les dénombrements de flore totale aérobie. Sa composition est la suivante : peptones 5 g/1, extrait de levure 2,5 g/1, glucose 1 g/1, agar 15 g/l. L'observation microscopique (x100) d'une coloration de Gram d'une colonie de 10 MWAP71 ayant été cultivée sur milieu solide PCA (Biomérieux France) pendant 30 heures à 30°C, fait état d'un bacille court à Gram négatif. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite hydrolyse est acide. Un acide est alors ajouté à ladite composition de moût de fermentation. Ledit acide est un acide minéral ou organique soluble ou partiellement soluble dans l'eau. 15 Selon un autre mode de réalisation avantageux, ladite hydrolyse est thermique. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite hydrolyse est thermique et acide. Ledit acide est alors ajouté à ladite composition de moût de fermentation et ladite composition est chauffée avant, pendant, ou après l'ajout dudit acide, à une température 20 supérieure à la température ambiante. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite étape d'hydrolyse, l'hydrolyse étant acide ou acide et thermique, est réalisée à un pH allant de 0 à 3, en particulier de 1 à 2. Selon un autre mode de réalisation avantageux, ladite étape d'hydrolyse, l'hydrolyse étant thermique, est réalisée à une température allant de la température ambiante à 100°C, de 25 préférence à une température allant de 80 à 100°C. The Burkholderia caribensis strain MWAP71 was classified using molecular genetic tools as belonging to the genus Burkholderia and was filed on 09/02/12 with the CNCM under the Budapest Treaty under registration number I-4598. Said strain was identified after sequencing its rrs gene which codes for 16S ribosomal DNA and by DNA: DNA hybridization as Burkholderia caribensis sp. Nov. 20 This strain has the biochemical characteristics described in Table 1 below: Test Result Status Fresh Gram-negative Gram-negative Gram-negative bacid Oxidase + Catalase + NO3 (nitrate reductase) - N2 (nitrate reductase) - Glucose (ferm) - Arginine dihydrolase - Urease - Hydrolysis of esculin - Gelatinase - Glucose (assimilation) + Arabinose (assimilation) + Mannose (assimilation) + Mannitol (assimilation) + N acetylglucose amine (assimilation) + Maltose (assimilation) - Gluconate (assimilation) + Caprate (assimilation) + Adipate (assimilation) - Malate (assimilation) + Table 1: Biochemical characteristics of the MWAP71 strain On PCA solid medium (Biomérieux France) and after 30 hours of incubation at 30 ° C., the MWAP71 strain forms colonies of white color, type S and a diameter of 5 to 10 mm. PCA (Plate Count Agar) culture medium is well known to those skilled in the art for aerobic total flora counts. Its composition is as follows: peptones 5 g / l, yeast extract 2.5 g / l, glucose 1 g / l, agar 15 g / l. The microscopic observation (x100) of a Gram stain of a 10 MWAP71 colony having been cultured on PCA solid medium (Biomérieux France) for 30 hours at 30 ° C., reports a short gram-negative bacillus. According to an advantageous embodiment, said hydrolysis is acidic. An acid is then added to said fermentation must composition. Said acid is an inorganic or organic acid which is soluble or partially soluble in water. According to another advantageous embodiment, said hydrolysis is thermal. According to a particularly advantageous embodiment, said hydrolysis is thermal and acidic. Said acid is then added to said fermentation must composition and said composition is heated before, during, or after the addition of said acid to a temperature above room temperature. According to an advantageous embodiment, said hydrolysis step, the hydrolysis being acidic or acidic and thermal, is carried out at a pH ranging from 0 to 3, in particular from 1 to 2. According to another advantageous embodiment, said The hydrolysis step, wherein the hydrolysis is thermal, is carried out at a temperature of from room temperature to 100 ° C, preferably at a temperature of from 80 to 100 ° C.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans lequel ladite étape d'hydrolyse, l'hydrolyse étant acide et thermique, est réalisée à une température allant de la température ambiante à 100°C, de préférence à une température allant de 70 à 90°C. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'hydrolyse est enzymatique. According to another advantageous embodiment, wherein said hydrolysis step, the hydrolysis being acidic and thermal, is carried out at a temperature ranging from room temperature to 100 ° C., preferably at a temperature ranging from 70 to 90 ° C. vs. According to another advantageous embodiment, the hydrolysis is enzymatic.
Des enzymes sont alors ajoutées à la composition de moût de fermentation, afin de catalyser la réaction d'hydrolyse. L'hydrolyse enzymatique peut être une hydrolyse enzymatique et thermique dans le cas où ladite composition est chauffée avant, pendant, ou après l'ajout desdites enzymes, à une température supérieure à la température ambiante. Enzymes are then added to the fermentation must composition to catalyze the hydrolysis reaction. The enzymatic hydrolysis may be enzymatic and thermal hydrolysis in the case where said composition is heated before, during, or after the addition of said enzymes, to a temperature above room temperature.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'hydrolyse est réalisée en présence d'enzymes choisies dans le groupe comprenant les protéases et les glycosidases, en particulier les amylases. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite étape d'hydrolyse enzymatique est réalisée à une température allant de la température ambiante à 70°C. According to another advantageous embodiment, the hydrolysis is carried out in the presence of enzymes chosen from the group comprising proteases and glycosidases, in particular amylases. According to a particularly advantageous embodiment, said enzymatic hydrolysis step is carried out at a temperature ranging from room temperature to 70 ° C.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: - hydrolyse acide et éventuellement thermique de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, et - neutralisation dudit hydrolysat pour obtenir un hydrolysat neutralisé. According to another advantageous embodiment, the process according to the invention comprises the following stages: acid hydrolysis and optionally thermal hydrolysing of said fermentation broth composition of Burkholderia caribensis, and neutralization of said hydrolyzate to obtain a neutralized hydrolyzate .
Par neutralisation, on entend que le pH est ajusté à la fin de l'hydrolyse, de telle façon que la réaction d'hydrolyse acide soit arrêtée. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat pour obtenir un hydrolysat neutralisé, et - purification dudit hydrolysat, éventuellement neutralisé, pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides, de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. By neutralization, it is meant that the pH is adjusted at the end of the hydrolysis, so that the acid hydrolysis reaction is stopped. According to another advantageous embodiment, the process according to the invention comprises the following steps: - hydrolysis of said fermentation broth composition of Burkholderia caribensis to obtain a hydrolyzate, - optionally neutralization of said hydrolyzate to obtain a neutralized hydrolyzate, and - purification of said hydrolyzate, optionally neutralized, to obtain said composition containing oligosaccharides, with a molecular mass ranging from 1 to 30 KDa.
Par purification de l'hydrolysat, on entend que ledit hydrolysat est débarrassé des bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, ainsi que du milieu de culture desdites bactéries, c'est-à-dire qu'il contient moins de 0,01 % en masse de bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, et/ou moins de 0,5% en masse du milieu de culture. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: - hydrolyse acide et éventuellement thermique de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - neutralisation dudit hydrolysat pour obtenir un hydrolysat neutralisé, et - purification dudit hydrolysat neutralisé pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides, de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. By purification of the hydrolyzate, it is understood that said hydrolyzate is freed from the bacteria of the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, as well as from the culture medium of said bacteria, that is to say it contains less than 0.01% by mass of bacteria of the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, and / or less than 0.5% by weight of the culture medium. According to another advantageous embodiment, the process according to the invention comprises the following steps: acid and optionally thermal hydrolysis of said fermentation broth composition of Burkholderia caribensis to obtain a hydrolyzate, neutralization of said hydrolyzate to obtain a neutralized hydrolyzate, and purifying said neutralized hydrolyzate to obtain said composition containing oligosaccharides, with a molecular mass ranging from 1 to 30 KDa.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: - hydrolyse thermique ou enzymatique de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - purification dudit hydrolysat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides, de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le pH à l'issue de ladite étape neutralisation va de 6 à 8, en particulier de 7 à 8. According to another advantageous embodiment, the process according to the invention comprises the following steps: thermal or enzymatic hydrolysis of said composition of fermentation mash of Burkholderia caribensis to obtain a hydrolyzate, purification of said hydrolyzate to obtain said composition containing oligosaccharides with a molecular weight ranging from 1 to 30 KDa. According to a particularly advantageous embodiment, the pH at the end of said neutralization step is from 6 to 8, in particular from 7 to 8.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite purification se fait par au moins une filtration. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite purification se fait par au moins une filtration tangentielle. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite purification comprend les étapes suivantes : - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,0ûm, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle dudit hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat 30 sur une membrane allant de 10 à 30 KDa, de préférence une membrane de 10 KDa, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Par « surnageant, débarrassé desdites bactéries », on entend que le surnageant contient moins de 0,01% en masse de bactéries. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite purification comprend les étapes suivantes : - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle dudit hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat sur une membrane allant de 10 à 30 KDa, de préférence une membrane de 10 KDa, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 15 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite composition contient des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 15 KDa. 20 Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé comprend les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, 25 - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir 30 respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. According to a particularly advantageous embodiment, said purification is by at least one filtration. According to an advantageous embodiment, said purification is done by at least one tangential filtration. According to an advantageous embodiment, said purification comprises the following steps: centrifugation of said hydrolyzate to obtain a supernatant, freed of said bacteria; optionally filtering said supernatant, optionally neutralized, on a cellulosic plate, preferably with a porosity of 0.3-1.0 μm, to obtain a first permeate; tangential filtration of said hydrolyzate, optionally neutralized, or said first permeate on a membrane ranging from 10 to 30 KDa, preferably a membrane of 10 KDa, to obtain respectively a first or a second permeate, tangential filtration of said first or second permeate on a membrane of 1 to 5 Kda, preferably a membrane of 1Kda, to obtain a third permeate comprising the culture medium of said bacteria and a retentate, and recovery of said retentate to obtain said composition containing oligosaccharides of molecular weight ranging from 1 to 30 KDa. By "supernatant, free of said bacteria" is meant that the supernatant contains less than 0.01% by mass of bacteria. According to a particularly advantageous embodiment, said purification comprises the following steps: centrifugation of said hydrolyzate to obtain a supernatant, freed of said bacteria; filtration of said supernatant, optionally neutralized, on a cellulosic plate, preferably with a porosity of 0.3-1.01 μm, to obtain a first permeate, tangential filtration of said hydrolyzate, optionally neutralized or said first permeate, on a membrane ranging from at 30 KDa, preferably a membrane of 10 KDa, to obtain respectively a first or a second permeate, tangential filtration of said first or second permeate on a membrane of 1 to 5 Kda, preferably a membrane of 1 Kda, to obtain a third permeate comprising the culture medium of said bacteria and a retentate, and recovery of said retentate to obtain said composition containing oligosaccharides of molecular weight ranging from 1 to 30 KDa. According to an advantageous embodiment, said composition contains oligosaccharides with a molecular mass ranging from 1 to 15 KDa. According to an advantageous embodiment, the process comprises the following steps: hydrolysis of said composition of fermentation mash of Burkholderia caribensis to obtain a hydrolyzate; optionally neutralization of said hydrolyzate obtained at the end of the preceding step to obtain a hydrolyzate; neutralized hydrolyzate; centrifugation of said hydrolyzate to obtain a supernatant, freed of said bacteria; optionally filtration of said supernatant, optionally neutralized, on a cellulosic plate, preferably with a porosity of 0.3-1.01 μm, to obtain a first permeate, tangential filtration of the hydrolyzate, optionally neutralized or of said first permeate, on a membrane ranging from 10 to 30 Kda, preferably a membrane of 10 Kda, to obtain respectively a first or a second permeate, tangential filtration of said first or second permeate on a membrane of 1 to 5 Kda, preferably a membrane of 1Kda , to obtain a third permeate comprising the culture medium of said bacteria and a retentate, and recovery of said retentate to obtain said composition containing oligosaccharides of molecular mass ranging from 1 to 30 KDa.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé comprend les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,0ûm, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 15 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé comprend les étapes suivantes : 20 - éventuellement revivification de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, pour obtenir des bactéries revivifiées, - culture de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, éventuellement revivifiées, dans un 25 milieu de culture approprié à leur prolifération, pour obtenir une première composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - éventuellement inoculation d'un fermenteur par ladite première composition de moût de fermentation obtenu à l'étape précédente, et fermentation, au cours de laquelle le fermenteur est mis en conditions propices à la croissance des bactéries et à la production de 30 polysaccharides de formule I, pour obtenir une deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - hydrolyse de ladite première ou deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Ledit retentat contient moins de 0,5% en masse de milieu de culture. Ladite composition de moût de fermentation peut être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes : - éventuellement revivification de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier la souche Burkholderia caribensis MWAP71, pour obtenir des bactéries revivifiées, - culture de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier la souche 20 Burkholderia caribensis MWAP71, éventuellement revivifiées, dans un milieu de culture approprié à leur prolifération, pour obtenir un premier moût de fermentation de Burkholderia caribensis comprenant une composition contenant des polysaccharides de formule I, - éventuellement inoculation d'un fermenteur contenant un milieu de production par ledit premier moût de fermentation obtenu à l'étape précédente, et fermentation, au cours de 25 laquelle le fermenteur est mis en conditions propices à la croissance des bactéries et à la production de polysaccharides de formule I, pour obtenir un deuxième moût de fermentation de Burkholderia caribensis comprenant une composition contenant des polysaccharides de formule I. Par revivification, on entend le fait de remettre les cellules bactériennes dans un été 30 physiologique permettant leur croissance, grâce à des conditions de culture adaptées, par opposition à leurs conditions de conservation, qui ne permettent pas leur croissance, par exemple en cryobanque à -80°C, ou dans du glycérol. Par « milieu de production », on entend un milieu de culture permettant la synthèse de biomasse bactérienne et la production de polysaccharides au sein du fermenteur. According to a particularly advantageous embodiment, the process comprises the following steps: - hydrolysis of said fermentation broth composition of Burkholderia caribensis to obtain a hydrolyzate, - neutralization of said hydrolyzate obtained at the end of the preceding step to obtain a hydrolyzate neutralized, centrifugation of said hydrolyzate to obtain a supernatant, freed of said bacteria; filtration of said supernatant, optionally neutralized, on a cellulosic plate, preferably with a porosity of 0.3-1.0 μm, to obtain a first permeate, tangential filtration of the hydrolyzate, optionally neutralized or of said first permeate, on a membrane of from 10 to 30 Kda, preferably a membrane of 10 Kda, to respectively obtain a first or a second permeate, - tangential filtration of said first or second permeate on a membrane ranging from 1 to 15 Kda, preferably a membrane of 1Kda, for obtaining a third permeate comprising the culture medium of said bacteria and a retentate, and recovering said retentate to obtain said composition containing oligosaccharides of molecular weight ranging from 1 to 30 KDa. According to an advantageous embodiment, the process comprises the following steps: - optionally revivification of bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, to obtain revived bacteria, - culture of bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, possibly revived, in a growth medium suitable for their proliferation, to obtain a first fermentation broth composition of Burkholderia caribensis, - optionally inoculation of a fermentor by said first fermentation must composition obtained in the preceding step, and fermentation, during which the fermenter is placed in conditions conducive to the growth of bacteria and to the production of polysaccharides of formula I, to obtain a second composition of must of f erosion of Burkholderia caribensis, - hydrolysis of said first or second fermentation must composition of Burkholderia caribensis to obtain a hydrolyzate, - optionally neutralization of said hydrolyzate obtained at the end of the preceding step to obtain a neutralized hydrolyzate, - centrifugation of said hydrolyzate to obtain a supernatant, freed of said bacteria; optionally filtration of said supernatant, optionally neutralized, on a cellulosic plate, preferably with a porosity of 0.3-1.01 μm, to obtain a first permeate, tangential filtration of the hydrolyzate, optionally neutralized or of said first permeate, on a membrane ranging from 10 to 30 Kda, preferably a membrane of 10 Kda, to obtain respectively a first or a second permeate, tangential filtration of said first or second permeate on a membrane ranging from 1 to 5 Kda, preferably a 1Kda membrane, to obtain a third permeate comprising the culture medium of said bacteria and a retentate, and recovery of said retentate to obtain said composition containing oligosaccharides of molecular mass ranging from 1 to 30 KDa. Said retentate contains less than 0.5% by weight of culture medium. Said fermentation must composition can be obtained by a process comprising the following steps: - optionally revivification of bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular the strain Burkholderia caribensis MWAP71, to obtain revived bacteria, - culture of bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular the strain Burkholderia caribensis MWAP71, possibly revived, in a culture medium suitable for their proliferation, to obtain a first fermentation broth of Burkholderia caribensis comprising a composition containing polysaccharides of formula I, optionally inoculation of a fermentor containing a production medium with said first fermentation wort obtained in the preceding step, and fermentation, during which the fermenter is placed in conditions conducive to the growth of the bacteria and the production of polysaccharides of formula I, to obtain a second fermentation broth of Burkholderia caribensis comprising a composition containing polysaccharides of formula I. By revivification, it is meant to return the bacterial cells in a physiological summer for their growth, thanks to adapted culture conditions , as opposed to their storage conditions, which do not allow their growth, for example cryobank at -80 ° C, or in glycerol. By "production medium" is meant a culture medium for the synthesis of bacterial biomass and the production of polysaccharides within the fermenter.
Bien que les bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, possèdent naturellement la capacité de synthétiser ladite composition contenant des polysaccharides, elles ne la produisent qu'en faible quantité lorsqu'elles sont mises en culture sur boîtes de milieu solide. Although bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the Burkholderia caribensis strain MWAP71, naturally have the capacity to synthesize said polysaccharide-containing composition, they produce only a small amount when they are used. culture on solid medium dishes.
Il est donc indispensable de développer un milieu de culture et des conditions opératoires permettant de maximiser la production de ladite composition par l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier de la souche Burkholderia caribensis MWAP71. Par « maximiser la production de ladite composition », on entend obtenir une composition de moût de fermentation dans laquelle la concentration en polysaccharide varie de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L. Le rapport entre le carbone et l'azote (C/N) présent dans le milieu de culture est un paramètre important du comportement de la souche face à une carence en éléments carbonés ou azotés. Avantageusement, le choix d'un ratio de la concentration massique de la source de carbone dans le milieu de culture, par exemple le glucose, sur la concentration massique de la source d'azote dans le milieu de culture, par exemple un extrait de levure, compris de 7 à 15 permet de maximiser la production de la composition contenant des polysaccharides de formule I. Le milieu de culture est de façon très avantageuse composé d'extrait de levure à 3 g/1 et de 23 g/1 de glucose soit un ratio de 7,6. It is therefore essential to develop a culture medium and operating conditions that make it possible to maximize the production of said composition by the species Burkholderia caribensis, in particular of the strain Burkholderia caribensis MWAP71. By "maximizing the production of said composition" is meant to obtain a fermentation must composition in which the concentration of polysaccharide ranges from 3.5 to 20 g / l, preferably between 5 and 15 g / l. The ratio between the carbon and the nitrogen (C / N) present in the culture medium is an important parameter of the behavior of the strain in the face of a deficiency of carbon or nitrogen elements. Advantageously, the choice of a ratio of the mass concentration of the carbon source in the culture medium, for example glucose, on the mass concentration of the nitrogen source in the culture medium, for example a yeast extract , ranging from 7 to 15 makes it possible to maximize the production of the composition containing polysaccharides of formula I. The culture medium is very advantageously composed of yeast extract containing 3 g / l and 23 g / l of glucose, a ratio of 7.6.
Selon un mode de réalisation avantageux, la température du milieu de production varie de la température ambiante à 40°C, en particulier de 28 à 32°C. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le pH du milieu de production est régulé de façon à varier de 6 à 7,5, en particulier de 6,5 à 7. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le milieu de production est tel que la pression partielle en oxygène dans ledit milieu est supérieure ou égale à 20%, en particulier supérieure ou égale à 30%. Par pression partielle en oxygène, on entend la concentration en oxygène (02) dissous dans la phase liquide. Cette pression partielle s'exprime en % de la concentration saturante en oxygène dans les conditions de travail considérées, telles que, de façon non limitative, la température, la pression, l'agitation. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé comprend les étapes suivantes : - revivification de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, pour obtenir des bactéries revivifiées, - culture de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, éventuellement revivifiées, dans un milieu de culture approprié à leur prolifération, pour obtenir une première composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - inoculation d'un fermenteur par ladite première composition de moût de fermentation obtenu à l'étape précédente, et fermentation, au cours de laquelle le fermenteur est mis en conditions propices à la croissance des bactéries et à la production de polysaccharides de formule I, pour obtenir une deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - hydrolyse de ladite première ou deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,0pm, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. According to an advantageous embodiment, the temperature of the production medium varies from ambient temperature to 40.degree. C., in particular from 28.degree. To 32.degree. According to another advantageous embodiment, the pH of the production medium is regulated so as to vary from 6 to 7.5, in particular from 6.5 to 7. According to another advantageous embodiment, the production medium is such that that the partial pressure of oxygen in said medium is greater than or equal to 20%, in particular greater than or equal to 30%. By oxygen partial pressure is meant the oxygen concentration (O 2) dissolved in the liquid phase. This partial pressure is expressed in% of the saturating oxygen concentration in the working conditions under consideration, such as, without limitation, temperature, pressure, agitation. According to an advantageous embodiment, the process comprises the following steps: - revivification of bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, to obtain revived bacteria, - culture of bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, possibly revived, in a culture medium suitable for their proliferation, to obtain a first composition of fermenting must of Burkholderia caribensis, - inoculation of a fermenter by said first fermentation must composition obtained in the previous step, and fermentation, during which the fermenter is placed in conditions conducive to the growth of bacteria and the production of polysaccharides of formula I, to obtain a second composition of must of fermentation of Burkholderia caribensis, - hydrolysis of said first or second fermentation broth composition of Burkholderia caribensis to obtain a hydrolyzate, - neutralization of said hydrolyzate obtained at the end of the preceding step to obtain a neutralized hydrolyzate, - centrifugation of said hydrolyzate to obtain a supernatant, freed of said bacteria; filtration of said supernatant, optionally neutralized, on a cellulosic plate, preferably with a porosity of 0.3-1.0 μm, to obtain a first permeate, tangential filtration of the hydrolyzate, optionally neutralized or of said first permeate, on a membrane of from 10 to 30 Kda, preferably a membrane of 10 Kda, to obtain respectively a first or a second permeate, tangential filtration of said first or second permeate on a membrane of 1 to 5 Kda, preferably a membrane of 1Kda, to obtain a third permeate comprising the culture medium of said bacteria and a retentate, and recovery of said retentate to obtain said composition containing oligosaccharides of molecular weight ranging from 1 to 30 KDa.
Selon un mode de réalisation avantageux, lesdites bactéries sont de la souche Burkholderia caribensis MWAP71 ARD, déposée auprès de la CNCM le 09 février 2012 sous le numéro I-4598. L'invention concerne également un hydrolysat d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis susceptible d'être obtenu par le procédé décrit 30 précédemment. L'invention concerne également un hydrolysat neutralisé d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis susceptible d'être obtenu par le procédé décrit précédemment. According to an advantageous embodiment, said bacteria are of the strain Burkholderia caribensis MWAP71 ARD, deposited with the CNCM on February 9, 2012 under the number I-4598. The invention also relates to a hydrolyzate of a fermentation broth composition of Burkholderia caribensis obtainable by the method described above. The invention also relates to a neutralized hydrolyzate of a fermentation broth composition of Burkholderia caribensis obtainable by the method described above.
L'invention concerne également une composition contenant des oligosaccharides susceptible d'être obtenue par le procédé décrit précédemment. Ladite composition correspond audit hydrolysat, éventuellement neutralisé, purifié, c'est-à-dire débarrassé des bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en 5 particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, et du milieu de culture desdites bactéries. Ladite composition peut éventuellement être mise en solution dans l'eau, pour son utilisation ultérieure. La solution ainsi obtenu peut éventuellement être décolorée, par exemple à l'aide de 10 charbon actif, en particulier par passage sur une plaque de charbon actif. Le taux de matière sèche de ladite solution est préférentiellement compris entre 0,1 et 10%, en particulier entre 0,5 et 2%. La matière sèche de ladite solution peut être déterminée par la mesure de la perte en masse de l'échantillon après passage à l'étuve. 15 Le pH de ladite solution est préférentiellement compris entre 3 et 8, en particulier entre 4 et 7. Le taux de glucose de ladite solution, mesuré après hydrolyse acide totale des oligosaccharides, par HPLC, est préférentiellement compris entre 0,1 g/1 et 15 g/1, en particulier entrel g/1 et 10g/1. 20 L'invention concerne également une composition comprenant des oligosaccharides issus de bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, dans laquelle : - le taux de matière sèche est préférentiellement compris entre 0,1 et 10%, en particulier entre 0,5 et 2% ; 25 - le pH est compris entre 3 et 8, en particulier entre 4 et 7 ; - le taux de glucose de ladite solution, après hydrolyse acide totale des oligosaccharides, est préférentiellement compris entre 0,1 g/1 et 15 g/1, en particulier entrel g/1 et 10g/1. L'invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat d'une composition de 30 moût de fermentation de Burkholderia caribensis décrite précédemment pour la préparation d'une composition cosmétique. L'invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat neutralisé d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis décrite précédemment pour la préparation d'une composition cosmétique. The invention also relates to a composition containing oligosaccharides obtainable by the method described above. Said composition corresponds to said hydrolyzate, optionally neutralized, purified, that is to say rid of bacteria of the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, and the culture medium of said bacteria. Said composition may optionally be dissolved in water, for its subsequent use. The solution thus obtained may optionally be discolored, for example with the aid of activated charcoal, in particular by passing through an activated charcoal plate. The solids content of said solution is preferably between 0.1 and 10%, in particular between 0.5 and 2%. The dry matter of said solution can be determined by measuring the mass loss of the sample after passage in the oven. The pH of said solution is preferably between 3 and 8, in particular between 4 and 7. The glucose level of said solution, measured after total acid hydrolysis of the oligosaccharides, by HPLC, is preferably between 0.1 g / l. and 15 g / l, in particular between g / 1 and 10 g / l. The invention also relates to a composition comprising oligosaccharides derived from bacteria of the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, in which: the solids content is preferably between 0.1 and 10. %, in particular between 0.5 and 2%; The pH is between 3 and 8, in particular between 4 and 7; the glucose level of said solution, after total acid hydrolysis of the oligosaccharides, is preferably between 0.1 g / l and 15 g / l, in particular between g / 1 and 10 g / l. The invention also relates to the use of a hydrolyzate of a Burkholderia caribensis fermentation wort composition described above for the preparation of a cosmetic composition. The invention also relates to the use of a neutralized hydrolyzate of a Burkholderia caribensis fermentation must composition described above for the preparation of a cosmetic composition.
L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment pour la préparation d'une composition cosmétique. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour la préparation d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer la fonction barrière de la peau, tel que mesurée selon un test de perte insensible en eau. Il est bien connu de l'homme du métier qu'un test de perte insensible en eau est un bon indicateur de la fonction barrière de la peau. The invention also relates to the use of a composition comprising or containing oligosaccharides described above for the preparation of a cosmetic composition. The invention also relates to the use of a composition comprising or containing oligosaccharides described above, for the preparation of a cosmetic composition intended to improve and / or strengthen the barrier function of the skin, as measured according to a loss test. insensitive to water. It is well known to those skilled in the art that an insensitive water loss test is a good indicator of the barrier function of the skin.
La perte insensible en eau peut être déterminée à l'aide d'un évaporimètre, mesurant la quantité d'eau évaporée. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour la préparation d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau. The insensitive loss of water can be determined using an evaporimeter, measuring the amount of water evaporated. The invention also relates to the use of a composition comprising or containing oligosaccharides described above, for the preparation of a cosmetic composition intended to improve and / or enhance the hydration of the skin.
Il est bien connu de l'homme du métier qu'un produit irritant va augmenter la perte insensible en eau alors qu'un produit hydratant va la diminuer. L'hydratation de la peau est ainsi une fonction biologique liée à la fonction barrière, et est liée aux résultats d'un test de perte insensible en eau. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour la préparation d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer la fonction barrière et l'hydratation de la peau. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière de la peau. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière et l'hydratation de la peau. L' invention concerne également l'utilisation une composition cosmétique comprenant à titre de principe actif une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment. It is well known to those skilled in the art that an irritating product will increase the insensible loss of water while a moisturizer will reduce it. The hydration of the skin is thus a biological function related to the barrier function, and is linked to the results of an insensitive water loss test. The invention also relates to the use of a composition comprising or containing oligosaccharides described above, for the preparation of a cosmetic composition intended to improve and / or strengthen the barrier function and the hydration of the skin. The invention also relates to the use of a composition comprising or containing oligosaccharides described above, for improving and / or reinforcing the barrier function of the skin. The invention also relates to the use of a composition comprising or containing oligosaccharides described above, for improving and / or enhancing the hydration of the skin. The invention also relates to the use of a composition comprising or containing oligosaccharides described above, for improving and / or reinforcing the barrier function and hydration of the skin. The invention also relates to the use of a cosmetic composition comprising as active principle a composition comprising or containing oligosaccharides described above.
Les compositions cosmétiques mentionnés plus haut sont par exemples des solutions, telles que des lotions, des émulsions liquides ou semi-liquides telles que des laits ou des émulsions de consistance molle telles que des crèmes ou des gels, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse ou inversement, des suspensions de consistance liquide, semi-liquide ou molle, ou des poudres. Ces compositions sont adaptées et préparées selon les méthodes usuelles connues de l'homme de l'art. Parmi les véhicules utilisés de façon usuelle dans les compositions cosmétiques mentionnées ci-dessus, on peut citer les tensio-actifs, les colorants, les parfums, les agents conservateurs, les émulsionnants, les stabilisateurs d'émulsion, les émollients, les hydratants, les cires naturelles ou synthétiques, les épaississants et/ou gélifiants, les humectants, les véhicules liquides tels que l'eau, des corps gras tels que les huiles naturelles ou synthétiques destinées à constituer la phase grasse des laits ou des crèmes, et leurs mélanges. L'invention concerne également une méthode de traitement cosmétique comprenant l'application par voie topique d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment dans un véhicule cosmétologiquement acceptable. The cosmetic compositions mentioned above are, for example, solutions, such as lotions, liquid or semi-liquid emulsions such as milks or emulsions of soft consistency such as creams or gels, obtained by dispersion of a fatty phase in an aqueous phase or vice versa, suspensions of liquid, semi-liquid or soft consistency, or powders. These compositions are adapted and prepared according to the usual methods known to those skilled in the art. Among the vehicles used in the usual manner in the cosmetic compositions mentioned above, mention may be made of surfactants, dyes, perfumes, preserving agents, emulsifiers, emulsion stabilizers, emollients, moisturizers, natural or synthetic waxes, thickeners and / or gelling agents, humectants, liquid vehicles such as water, fatty substances such as natural or synthetic oils intended to constitute the fatty phase of milks or creams, and mixtures thereof. The invention also relates to a cosmetic treatment method comprising the topical application of a composition comprising or containing oligosaccharides previously described in a cosmetologically acceptable vehicle.
DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 est un graphique représentant l'évolution de la densité optique corrigée à 600 nm au cours du temps d'un milieu de préculture inoculé par la souche MWAP71. La densité optique corrigée correspond à la densité optique à 600 nm (D0600), à laquelle on retranche la densité optique du milieu initial avant inoculation : D0600 corrigée = D0600(échantillon) - D0600(milieu de culture avant inoculation) La figure 2 est un graphique représentant l'évolution de la densité optique corrigée à 600 nm (losanges), de la viscosité mesurée à l'aide d'un rhéomètre RM 100 de la société LAMY (module 1, vitesse 25,8 s-1) (en cps, triangles) et de la concentration en glucose (en g/kg, carrés) au cours du temps, du moût de fermentation dans le fermenteur. DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 is a graph showing the evolution of the corrected optical density at 600 nm over time of a preculture medium inoculated with the MWAP71 strain. The corrected optical density corresponds to the optical density at 600 nm (D0600), which is subtracted from the optical density of the initial medium before inoculation: D0600 corrected = D0600 (sample) - D0600 (culture medium before inoculation) Figure 2 is a graph showing the evolution of the corrected optical density at 600 nm (diamonds), the viscosity measured using an RM 100 rheometer from LAMY (module 1, speed 25.8 s-1) (in cps , triangles) and the concentration of glucose (in g / kg, squares) over time, the fermentation must in the fermenter.
PARTIE EXPERIMENTALE La composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, comprenant : - des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de 5 la souche Burkholderia caribensis MWAP71, - un milieu de culture desdites bactéries, et - une composition contenant des polysaccharides, produite par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture, lesdits polysaccharides étant de formule I suivante : f3-Kdop 10 2 3 ->3)-(3-D-Glcp-(1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1-> 2 15 (0Ac) dans laquelle : Glc représente le glucose ; 20 6dTal représente le 6-déoxy-talose ; Kdo représente l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique ; n est un nombre entier compris de 700 à 800 ; la concentration en polysaccharide dans ladite composition de moût de fermentation variant de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L ; 25 peut être obtenue comme illustré ci-après. La préparation de ladite composition de moût de fermentation peut être réalisée par voie biotechnologique en fermenteur. Le procédé comprend alors deux étapes : la production de cellules bactériennes en fioles de petit volume, cette première culture, appelée pré-culture, servant ensuite à inoculer le fermenteur proprement dit où est réalisée la production de la 30 composition. La chaîne de pré-culture comprend deux étapes, la première étant la revivification de la souche bactérienne conservée dans une cryobanque à -80°C et la deuxième une étape de prolifération cellulaire dans le but d'inoculer le fermenteur. La revivification est réalisée en fioles de 500 ml à baffles contenant 50 ml de milieu de 35 culture appelé « milieu de pré-culture » dont la composition est la suivante (tableaux 2, 3 et 4) : Glucose 10 g/1 Extrait de levure 3 g/1 Solution minérale* 70 m1/1 Struktol® SB2020 0,1 g/1 Tableau 2: Composition du milieu de pré-culture Struktol® SB2020 (Schills Seilacher, Hamburg, Germany) est un agent anti-mousse. MgSO4,7H20 4 g/1 FeSO4,7H20 0,44 g/1 Solution Oligo- éléments** 20 m1/1 Tableau 3 : *Solution minérale H3B03 2,80 g/1 MnSO4,H20 1,30 g/1 Na2Mo04,2H20 0,75 g/1 ZnSO4,7H20 0,43 g/1 CoSO4,7H20 0,070 g/1 CuSO4 0,023 g/1 Tableau 4 : * *Solution Oligo-éléments Après une incubation d'une durée de 8h à 30°C sous une agitation de 110 RPM, 7 ml de cette culture sont transférés dans des fioles de 3 litres à baffles contenant 500 ml de « milieu de pré-culture » pour l'étape de prolifération cellulaire (production de l'inoculum pour le fermenteur). Ces fioles sont incubées pendant 14h à 30°C sous une agitation de 110 RPM. A chaque transfert, un contrôle bactériologique est effectué par une observation microscopique à l'état frais et par une coloration de Gram. Le profil de croissance de la souche MWAP71 en milieu de pré-culture et en fioles de petit volume est présenté en figure 1. EXPERIMENTAL PART The fermenting must composition of Burkholderia caribensis, comprising: bacteria belonging to the species Burkholderia caribensis, in particular bacteria of the strain Burkholderia caribensis MWAP71, a culture medium of said bacteria, and a composition containing polysaccharides produced by said bacteria in said culture medium, said polysaccharides having the following formula I: ## STR3 ## -Glcp- (1-> 4) -α-6dTalp- (1-> 2) (0Ac) wherein: Glc is glucose, 6dTal is 6-deoxy-talose, Kdo is 3-deoxy-deoxy- D-manno-oct-2-ulosonic, n is an integer from 700 to 800, the polysaccharide concentration in said fermentation wort composition ranging from 3.5 to 20 g / L, preferably between 5 and 15 g / L; L 25 can be obtained as illustrated below.The preparation of said fermentation must composition can be be made by biotechnological fermenter. The process then comprises two steps: the production of bacterial cells in small volume vials, this first culture, called pre-culture, then serving to inoculate the actual fermenter where the production of the composition is carried out. The pre-culture chain comprises two steps, the first being the revivification of the bacterial strain stored in a cryobank at -80 ° C and the second a cell proliferation step for the purpose of inoculating the fermenter. The revivification is carried out in 500 ml baffled flasks containing 50 ml of culture medium called "pre-culture medium" whose composition is as follows (Tables 2, 3 and 4): Glucose 10 g / 1 Yeast Extract 3 g / 1 Mineral solution * 70 m1 / 1 Struktol® SB2020 0.1 g / 1 Table 2: Composition of preculture medium Struktol® SB2020 (Schills Seilacher, Hamburg, Germany) is an antifoaming agent. MgSO 4 · 7H 2 O 4 g / 1 FeSO 4 · 7H 2 O 0.44 g / 1 Oligonucleic acid solution ** 20 ml / l Table 3: * Mineral solution H3B03 2.80 g / l MnSO4, H20 1.30 g / l Na2MoO4, 2H20 0.75 g / 1 ZnSO4.7H2O 0.43 g / 1 CoSO4.7H2O 0.070 g / 1 CuSO4 0.023 g / 1 Table 4: * * Solution Trace elements After incubation for 8 hours at 30 ° C. with a stirring of 110 RPM, 7 ml of this culture are transferred to 3-liter baffled flasks containing 500 ml of "pre-culture medium" for the cell proliferation step (production of the inoculum for the fermenter) . These flasks are incubated for 14 h at 30 ° C. with a stirring of 110 RPM. At each transfer, a bacteriological control is carried out by a microscopic observation in the fresh state and by a Gram stain. The growth profile of the MWAP71 strain in pre-culture medium and small volume vials is presented in FIG.
Après environ 15 heures de croissance, c'est-à-dire en milieu de phase de croissance, lesdites fioles contiennent la première composition de moût de fermentation. Ladite première composition de moût de fermentation peut être utilisée pour inoculer un fermenteur de grande capacité : de 150 litres à plusieurs dizaines de mètres cubes. La production de la deuxième composition de moût de fermentation peut être effectuée 20 dans un fermenteur de 150L contenant 100L de « milieu de production » dont la composition est la suivante (tableaux 5, 6 et 7) : Glucose 23 g/1 Extrait de levure 3 g/1 Solution minérale* 70 m1/1 Struktol® SB2020 0,1 g/1 Tableau 5: Composition du milieu de pré-culture MgSO4,7H20 4 g/1 FeSO4,7H20 0,44 g/1 Solution Oligo- éléments** 20 m1/1 Tableau 6 : *Solution minérale H3B03 2,80 g/1 MnSO4,H20 1,30 g/1 Na2Mo04,2H20 0,75 g/1 ZnSO4,7H20 0,43 g/1 CoSO4,7H20 0,070 g/1 CuSO4 0,023 g/1 Tableau 7 : * *Solution Oligo-éléments Le milieu de culture sans glucose est stérilisé en place dans le fermenteur, puis une solution concentrée de glucose stérilisée à part par l'action de la chaleur est ajoutée stérilement de manière à obtenir la concentration initiale en glucose désirée (23 g/1). After about 15 hours of growth, that is to say in mid-growth phase, said flasks contain the first composition of fermentation must. Said first fermentation must composition can be used to inoculate a large capacity fermentor: from 150 liters to several tens of cubic meters. Production of the second fermentation must composition can be carried out in a 150L fermentor containing 100L of "production medium" whose composition is as follows (Tables 5, 6 and 7): Glucose 23g / 1 Yeast Extract 3 g / 1 Mineral solution * 70 m1 / 1 Struktol® SB2020 0.1 g / 1 Table 5: Composition of the preculture medium MgSO4,7H20 4 g / 1 FeSO4,7H20 0.44 g / 1 Oligonosal solution ** 20 ml / 1 Table 6: * Mineral solution H3B03 2.80 g / 1 MnSO4, H2O 1.30 g / 1 Na2MoO4.2H2O 0.75 g / 1 ZnSO4.7H2O 0.43 g / 1 CoSO4.7H2O 0.070 g / 1 CuSO4 0.023 g / 1 Table 7: * * Solution Trace elements The culture medium without glucose is sterilized in place in the fermenter, then a concentrated solution of glucose sterilized separately by the action of heat is added sterilely to obtain the desired initial glucose concentration (23 g / l).
L'inoculation du fermenteur est réalisée par transfert stérile du contenu de 4 à 8 fioles de pré-culture, soit un taux d'inoculation de 2 à 4% vol/vol. Les conditions de culture appliquées lors de la production en fermenteur sont les suivantes : - Température : 30°C - pH : 6,5 à 7,0 régulé par ajout de NaOH 6% - p02 > 30% Afin de maintenir une oxygénation suffisante du milieu de culture (p02>30%), l'aération du fermenteur est maintenue entre 0,5 et 1 VVM, l'agitation est comprise entre 200 et 500 RPM (soit entre 1,7 et 4,3 m/s) et une pression de couverture est maintenue entre 0,5 et 1 bar. Au cours de la production, le suivi de la production de la biomasse bactérienne est réalisé par mesure de la densité optique à 600 nm (D0600), à laquelle on retranche la densité optique du milieu initial avant inoculation : D0600 corrigée = D0600(échantillon) - D0600(milieu de culture avant inoculation) Le suivi de la production de polymère est réalisé par mesure de la viscosité du moût de 5 fermentation par un rhéomètre Rhéomat RM 100 de la société LAMY (module 1, vitesse 25,8 s-1). Enfin, le suivi de la consommation du glucose est réalisé par dosage sur un analyseur de glucose YSI 2700 SELECT de la société YSI Life Sciences. Lorsque la concentration en glucose résiduel atteint zéro, la production est terminée. 10 L'évolution du moût de fermentation au cours du temps est illustrée à la figure 2. L'augmentation de la viscosité du milieu de culture traduit l'apparition au sein du fermenteur de la composition contenant les polysaccharides produite par la souche. Lorsque le glucose est totalement consommé, la fermentation est considérée comme terminée. A l'issue de ce processus de fermentation sur un fermenteur de 150 litres, il est obtenu 15 la deuxième composition de moût de fermentation comprenant les éléments nutritifs non consommés par la souche, la biomasse bactérienne de la souche MWAP71 et les métabolites produits par la souche dont la composition contenant les polysaccharides. A l'issue de l'étape de fermentation industrielle, on obtient les résultats 20 suivants (Tableau 8) : Durée de la fermentation 33,5 h Durée de la phase de production de polysaccharides 16 5 h û max (taux de croissance de la souche) 0,3 fil dS/dt Consommation moyenne en glucose 0,7 g/l/h dP/dt Productivité moyenne en polysaccharides 60 mPa.s/h Concentration finale en polysaccharides 4,3 g/1 Concentration finale en cellules 12 g/1 Tableau 8 : Résultats de la production de la deuxième composition de moût de fermentation en fermenteur. Inoculation of the fermenter is carried out by sterile transfer of the contents of 4 to 8 pre-culture flasks, ie an inoculation rate of 2 to 4% vol / vol. The culture conditions applied during fermentation are as follows: - Temperature: 30 ° C - pH: 6.5 to 7.0 regulated by addition of 6% NaOH - pO 2> 30% In order to maintain sufficient oxygenation of the medium (pO 2> 30%), the aeration of the fermenter is maintained between 0.5 and 1 VVM, the stirring is between 200 and 500 RPM (ie between 1.7 and 4.3 m / s) and a cover pressure is maintained between 0.5 and 1 bar. During production, monitoring of bacterial biomass production is performed by measuring the optical density at 600 nm (D0600), which is subtracted from the optical density of the initial medium before inoculation: D0600 corrected = D0600 (sample) - D0600 (culture medium before inoculation) The monitoring of the polymer production is carried out by measuring the viscosity of the fermentation must by a Rhéomat RM 100 rheometer from the company LAMY (module 1, speed 25.8 s-1) . Finally, the glucose consumption is monitored by assaying on a YSI 2700 SELECT glucose analyzer from YSI Life Sciences. When the residual glucose concentration reaches zero, the production is complete. The evolution of the fermentation must over time is illustrated in FIG. 2. The increase in the viscosity of the culture medium reflects the appearance within the fermenter of the composition containing the polysaccharides produced by the strain. When glucose is completely consumed, fermentation is considered complete. At the end of this fermentation process on a 150 liter fermentor, the second fermentation must composition comprising the nutrients not consumed by the strain, the bacterial biomass of the MWAP71 strain and the metabolites produced by the strain are obtained. strain whose composition contains the polysaccharides. At the end of the industrial fermentation step, the following results are obtained (Table 8): Duration of the fermentation 33.5 hrs Duration of the phase of production of polysaccharides 16 5 h max (growth rate of the strain) 0.3 dS / dt yarn Average glucose consumption 0.7 g / l / h dP / dt Average polysaccharide productivity 60 mPa.s / h Final polysaccharide concentration 4.3 g / 1 Final concentration in 12 g cells Table 8: Results of the production of the second fermentor fermentation must composition.
La composition et les caractéristiques du moût de fermentation sont les suivantes (tableau 9) : Matière sèche du moût 1,65 % MS pH 6,5-7,0 DO 600nm finale 41,4 Viscosité finale (26 s1) 1030 mPa.s Tableau 9 : Composition et caractéristiques du moût de fermentation contenant le polymère natif. The composition and characteristics of the fermentation must are as follows (Table 9): Must dry matter 1.65% MS pH 6.5-7.0 OD 600nm final 41.4 Final viscosity (26 s1) 1030 mPa.s Table 9: Composition and characteristics of the fermentation must containing the native polymer.
Les exemples 1 à 4 qui suivent illustrent l'invention. EXEMPLES Exemple 1 : Préparation de la composition contenant des oligosaccharides. La composition contenant des oligosaccharides est obtenue selon le procédé suivant : - hydrolyse acide et thermique de la deuxième composition de moût de fermentation pendant 5 heures à 80°C à pH 1,6 par ajout d'acide chlorhydrique ; - neutralisation à pH = 7,4 par de la soude et refroidissement à 20°C ; - centrifugation à 4080 g pendant au moins 3 minutes pour séparer la biomasse bactérienne des oligosaccharides ; - filtration du surnageant de centrifugation sur une plaque cellulosique de porosité 0,3-1,0 µm; - filtration tangentielle sur une membrane de 10 Kda de surface de 1,02 m2 avec une pression transmembranaire (PTM) de 1 bar et récupération du permeat ; - filtration tangentielle sur une membrane de 1 Kda de surface de 1,02 m2 avec une pression transmembranaire (PTM) de 1 bar et récupération du retentat ; - décoloration du retentat par passage sur une plaque de charbon actif ; - dilution du produit à environ 1% de matière sèche. La composition contenant des oligosaccharides (principe actif) est obtenue sous la forme d'une solution aqueuse présentant les caractéristiques suivantes : pH : 6,86 (mesuré par méthode potentiomètrique à température ambiante). Examples 1 to 4 which follow illustrate the invention. EXAMPLES Example 1 Preparation of the Composition Containing Oligosaccharides The composition containing oligosaccharides is obtained according to the following process: acid and thermal hydrolysis of the second composition of fermentation broth for 5 hours at 80 ° C. to pH 1.6 by addition of hydrochloric acid; neutralization at pH = 7.4 with sodium hydroxide and cooling at 20 ° C .; centrifugation at 4080 g for at least 3 minutes to separate the bacterial biomass from the oligosaccharides; filtration of the centrifugation supernatant on a cellulose slab of porosity 0.3-1.0 μm; - Tangential filtration on a 10 Kda surface membrane of 1.02 m2 with a transmembrane pressure (PTM) of 1 bar and permeate recovery; - Tangential filtration on a 1 Kda surface membrane of 1.02 m2 with a transmembrane pressure (PTM) of 1 bar and recovery of the retentate; - discoloration of the retentate by passage on a plate of activated carbon; - dilution of the product to about 1% dry matter. The composition containing oligosaccharides (active ingredient) is obtained in the form of an aqueous solution having the following characteristics: pH: 6.86 (measured by potentiometric method at room temperature).
Matière sèche : 1,06% (la matière sèche peut être déterminée par la mesure de la perte en masse de l'échantillon en présence de sable de fontainebleau après passage à l'étuve 105°C pendant 12 heures). Taux de glucose : 5 g/1 (mesuré après hydrolyse acide totale des oligosaccharides, par HPLC ; l'hydrolyse totale peut être obtenue par ajout de TFA, de façon à obtenir une solution à 4M en TFA, puis chauffage à 100°C pendant 4 heures). Exemple 2 : Etudes in vitro Des kératinocytes humains normaux sont cultivés en monocouche pendant 5 jours (37°C et 5% CO2) en présence d'un milieu de culture comprenant 10 mg de la solution d'oligosaccharides à 1% en matière sèche (exemple 1), par ml de milieu de culture, ou du milieu de culture seul pour les conditions témoins. L'expression de la filaggrine est mise en évidence par un immunomarquage (immuno cyto chimique ICC) utilisant un anticorps monoclonal anti filaggrine (Filaggrin (AE21) Santa Cruz Biotechnology) dirigé et purifié contre de la filaggrine de cheveux humains. Cet anticorps est décrit pour des applications de détection de filaggrine d'origine humaine en immunofluorescence et immunohistochimie. Cet anticorps primaire est associé à un anticorps secondaire permettant une détection du signal en fluorescence type FITC. Dry matter: 1.06% (the dry matter can be determined by measuring the mass loss of the sample in the presence of fountain sand after passing in the oven 105 ° C for 12 hours). Glucose level: 5 g / l (measured after total acid hydrolysis of the oligosaccharides, by HPLC, the total hydrolysis can be obtained by adding TFA, so as to obtain a 4M solution in TFA, then heating at 100 ° C. for 4 hours). Example 2 In Vitro Studies Normal human keratinocytes are cultured in a monolayer for 5 days (37 ° C. and 5% CO 2) in the presence of a culture medium comprising 10 mg of the 1% solids oligosaccharide solution ( Example 1), per ml of culture medium, or culture medium alone for the control conditions. The expression of filaggrin is evidenced by immunostaining (ICC chemical immuno cyto) using an anti-filaggrin monoclonal antibody (Filaggrin (AE21) Santa Cruz Biotechnology) directed and purified against human hair filaggrin. This antibody is described for applications of detection of filaggrin of human origin in immunofluorescence and immunohistochemistry. This primary antibody is associated with a secondary antibody for FITC fluorescence signal detection.
L'expression de l'aquaporine-3 est mise en évidence par un immunomarquage (immuno cyto chimique ICC) utilisant un anticorps polyclonal anti AQP3 (AQP 3 (H-80) Santa Cruz Biotechnology) dirigé et purifié spécifiquement contre l'AQP3 d'origine humaine au niveau de la partie N-terminale de la protéine. Cet anticorps est décrit pour des applications de détection de l'AQP3 en immunofluorescence, western blot, immunoprécipitation et Elisa. Expression of aquaporin-3 is evidenced by immunostaining (ICC chemical immuno-cyto) using a polyclonal anti-AQP3 antibody (AQP 3 (H-80) Santa Cruz Biotechnology) specifically directed and purified against AQP3. human origin at the N-terminal portion of the protein. This antibody is described for applications of detection of AQP3 in immunofluorescence, western blot, immunoprecipitation and Elisa.
Cet anticorps primaire est associé à un anticorps secondaire permettant une détection du signal en fluorescence type Rhodamine. La quantification de l'intensité de marquage de la fillagrine et de l'aquaporine 3 dans des kératinocytes humains normaux induit par les oligosaccharides issus de Burkholderia caribensis est réalisée à l'aide du logiciel d'analyse d'image Histolab de la société Mi crovi sion. Les résultats obtenus sur l'expression de la filaggrine sont consignés dans le tableau 10: Témoin 10 mg/m1 solution d'oligosaccharides à 1% en matière sèche Intensité (UI) 362 3888 Ecart type 101 832 p / témoin 0,0057 Tableau 10 : Expression de la filaggrine en présence ou non de la composition contenant les oligosaccharides. La composition contenant les oligosaccharides de Burkholderia caribensis stimule de manière significative l'expression de filaggrine. Les résultats obtenus sur l'expression de l'aquaporine-3 sont consignés dans le tableau 11: Témoin 10 mg/m1 solution d'oligosaccharides à 1% en matière sèche Intensité (UI) 2077 14419 Moyenne 265 3140 p / témoin 0,017 Tableau 11 : Expression de l'aquaporine-3 en présence ou non de la composition contenant les oligosaccharides. La composition contenant les oligosaccharides de Burkholderia caribensis stimule de manière significative l'expression d' aquaporine-3. Exemple 3 : Test in vivo Deux formulations d'émulsion sont préparées, l'une constituant le placebo, l'autre selon l'invention, constituant la formulation comprenant des oligosaccharides. La composition des deux formulations est consignée dans le tableau 12 : 15 20 Emulsion CMWA 10-0 Emulsion CMWA 10-1 (placebo) (invention) Xyliance 5% 5% Caprylic capric triglycerides 12% 12% Phenonip XB 0,4% 0,4% Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 0% 1% Aqua QSP 100% QSP 100% Tableau 12: composition des deux formulations utilisées dans le test in vivo. L'étude est réalisée sur 19 volontaires sains de sexe féminin et masculin présentant une peau normale au niveau des bras. Les mesures de perte insensibles en eau (PIE) sont effectuées avec un Vapometer® (Delphin) muni d'une sonde qui mesure le gradient de vapeur d'eau se mettant en place entre la surface cutanée et l'air ambiant. Cette mesure donne une information sur la qualité de la fonction barrière de la peau. Le protocole de l'étude est décrit ci-après : - trois jours avant le début de l'étude, les volontaires n'appliquent aucune crème au niveau des bras ; - on définit deux zones sur les avants bras, une zone qui sera traitée par la formulation contenant des oligosaccharides de Burkholderia caribensis et l'autre zone qui sera traitée par la formulation ne contenant pas l'actif (placebo) ; - on mesure la PIE à l'aide du Vapometer® à Jl/TO ; - à J1, la zone de peau définie sur chaque avant-bras est soumise à un traitement spécifique par la technique de Stripping à l'aide de l'applicateur de disques adhésifs (piston D.Squame® réf. Monaderm PDSQ GOA), le stripping permet d'induire une légère diminution de l'effet de barrière naturelle des couches superficielles de l'épiderme (stratum corneum) en enlevant quelques cellules en surface, au contact de l'adhésif ; on mesure alors la PIE à l'aide du Vapometer® juste après stripping (J1/Immédiat) ; - on applique les formulations sur leurs zones spécifiques ; les formulations sont appliquées telles quelles, par la technicienne, à l'aide d'un doigtier par massage digital doux jusqu'à absorption sur une surface de peau délimitée d'environ 16 cm2, à raison de 2 mg/cm2 ; - on remesure la PIE une heure après application de chaque formulation (J1/T1h) ; - les formulations sont appliqués deux fois par jour pendant 3 jours ; - à J3, on répète l'opération. Les effets des deux formulations ont été comparés entre eux, aux temps (Ji/Tlh(Ji/Immédiat-Ji/TO)). La comparaison des données de zones traitées par chaque formulation entre elles s'effectue par un test de Student pour séries appariées ou test de rang de Wilcoxon pour séries appariées (en cas de distribution non normale des données). Les résultats sont donnés dans le tableau ci-après (tableau 13) : Jour 1 Jour 3 APTE = J1/T1h-(J1/T APTE = J3/T1h-(J3/T immédiat-J1/TO)) immédiat-J1/TO)) (g/m2.h) (g/m2.h) Crème CMWA 10-0 (placebo) 1,2 3,4 Crème CMWA 10-1 0,4 -0,1 P= 0,641 0,039 Tableau 13 : résultats du test in vivo L'effet réparateur obtenu avec le produit Emulsion CMWA 10-1 est plus important après 3 jours d'application répétée sur peau strippée par rapport à celui obtenu avec le produit Emulsion CMWA 10-0. En conséquence, les Oligosaccharides de Burkholderia caribensis permettent de réparer significativement la barrière cutanée. This primary antibody is associated with a secondary antibody for detection of the fluorescence signal Rhodamine type. Quantification of the labeling intensity of fillagrin and aquaporin 3 in normal human keratinocytes induced by oligosaccharides derived from Burkholderia caribensis is carried out using the Histolab image analysis software from the company Mi crovi if we. The results obtained on the expression of filaggrin are shown in Table 10: Control 10 mg / ml solution of oligosaccharides at 1% dry matter Intensity (IU) 362 3888 Standard deviation 101 832 p / control 0.0057 Table 10 : Expression of filaggrin in the presence or absence of the composition containing the oligosaccharides. The composition containing the oligosaccharides of Burkholderia caribensis significantly stimulates the expression of filaggrin. The results obtained on the expression of aquaporin-3 are shown in Table 11: Control 10 mg / ml solution of oligosaccharides at 1% dry matter Intensity (UI) 2077 14419 Average 265 3140 p / control 0.017 Table 11 : Expression of aquaporin-3 in the presence or absence of the composition containing the oligosaccharides. The composition containing the oligosaccharides of Burkholderia caribensis significantly stimulates the expression of aquaporin-3. Example 3 In Vivo Test Two emulsion formulations are prepared, one constituting the placebo and the other according to the invention, constituting the formulation comprising oligosaccharides. The composition of both formulations is reported in Table 12: Emulsion CMWA 10-0 Emulsion CMWA 10-1 (placebo) (invention) Xyliance 5% 5% Caprylic capric triglycerides 12% 12% Phenonip XB 0.4% 0, 4% 1% aqueous solution (dry matter) of Burkholderia caribensis oligosaccharides 0% 1% Aqua QSP 100% QSP 100% Table 12: composition of the two formulations used in the in vivo test. The study is performed on 19 healthy male and female volunteers with normal skin in the arms. Insensitive water loss measurements (PIE) are performed with a Vapometer® (Delphin) equipped with a probe that measures the gradient of water vapor set up between the skin surface and the ambient air. This measure gives information on the quality of the barrier function of the skin. The protocol of the study is described below: - three days before the start of the study, the volunteers do not apply any cream in the arms; two zones are defined on the forearms, one zone that will be treated with the formulation containing oligosaccharides of Burkholderia caribensis and the other zone that will be treated with the formulation that does not contain the active ingredient (placebo); the PIE is measured using the Vapometer® at Jl / TO; - On day 1, the skin area defined on each forearm is subjected to a specific treatment by the Stripping technique using the adhesive disc applicator (D.Squame® piston, ref Monaderm PDSQ GOA). stripping makes it possible to induce a slight decrease in the natural barrier effect of the superficial layers of the epidermis (stratum corneum) by removing a few cells at the surface, in contact with the adhesive; the PIE is then measured using the Vapometer® just after stripping (J1 / Immediate); the formulations are applied to their specific zones; the formulations are applied as such, by the technician, using a fingernail by gentle digital massage until absorption on a skin surface delimited by about 16 cm 2, at a rate of 2 mg / cm 2; the IEM is remeasured one hour after application of each formulation (J1 / T1h); the formulations are applied twice a day for 3 days; at J3, the operation is repeated. The effects of the two formulations were compared with one another at times (Ji / Tlh (Ji / Immediate-Ji / TO)). The comparison of the area data processed by each formulation is done by a Paired Pair Student or Wilcoxon Rank Matched Series Test (in case of non-normal data distribution). The results are given in the table below (Table 13): Day 1 Day 3 APTE = J1 / T1h- (J1 / T APTE = J3 / T1h- (J3 / T immediate-J1 / TO)) immediate-J1 / TO)) (g / m2.h) (g / m2.h) Cream CMWA 10-0 (placebo) 1,2 3,4 Cream CMWA 10-1 0,4 -0,1 P = 0,641 0,039 Table 13: results of the in vivo test The repairing effect obtained with the product Emulsion CMWA 10-1 is greater after 3 days of repeated application on skin stripped compared to that obtained with the product Emulsion CMWA 10-0. As a result, Burkholderia caribensis Oligosaccharides can significantly repair the skin barrier.
Exemple 4 : Formules Exemple 4.1 : Crème hydratante pour le corps La crème de formule suivante (tableau 14) :25 Phase Ingrédient % A Xyliance (Soliance) 4 Macadamia ternifolia seed oil 6 Kendi oil 0.5 Preservative QS B Aqua qsp 100 Soligel (Soliance) 0.1 Sodium Hyaluronate 2 C Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 1 D Manuka honey 0.5 Tableau 14: formule d'une crème hydratante pour le corps est obtenue comme suit : 1. Préparer séparément A et B, sous agitation et à 70°C. 2. Ajouter doucement B sur A sous émulseur à 3000 rpm. 5 3. Refroidir. 4. A 40°C ajouter C et D sous agitation lente à 40 rpm. Exemple 4.2 : Crème de jour La crème de formule suivante (tableau 15) : Phase Ingrédient % A Xyliance (Soliance) 3.5 Minerai oil 2 Caprylic/capric triglyceride 3 Isostearyl isostearate 3 Dimethicone 2 Prunus armeniaca (Apricot) Kernel oil 2 B Glyceryl stearate citrate 1,5 Preservative Qs Aqua qsp 100 Glycerin 2 Xanthan gum 0.7 C Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 1 D Parfum qs Tableau 15 : formule d'une crème de jour est obtenue comme suit : 1. Préparer séparément A et B, sous agitation et à 70°C. 2. Ajouter doucement B sur A sous émulseur à 3000 rpm. 3. Refroidir. 4. A 40°C ajouter C et D sous agitation lente à 40 rpm. Exemple 4.3 : Gel éclat visage Le gel de formule suivante (tableau 16) : Phase Ingrédient % A Aqua qsp 100 Tourmaline (Soliance) 1 Carbomer 0.7 Hydroxyethylcellulose 0.3 Preservative Qs B Sodium Hydroxyde Qs pH 7 C Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 1 Betaphroline 2 Tableau 16 : formule d'un gel éclat visage est obtenu comme suit : 1. Peser A et chauffer sous agitation lente à 70°C dans un Bain-Marie; 2. Ajuster le pH à 7 avec B; 3. Ajouter C dans AB sous agitation lente. Exemple 4.4 : Gel hydratant relaxant Le gel de formule suivante (tableau 17) :20 Phase Ingrédient % A Porphyraline (Soliance) qsp 100 Hydroxyethylcellulose 1 B Grevilline (Soliance) 5 Betaphroline 10 Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 1 Spring sea water 10 C Polysorbate 20 1,36 Parfum qs Preservative qs D Colorant CI 17200 qs Colorant CI 42090 qs Tableau 17 : formule d'un gel hydratant relaxant est obtenu comme suit : 1. Peser A et chauffer à 70°C sous agitation dans un Bain-Marie; 2. Laisser refroidir à température ambiante; 3. A 40°C, ajouter successivement les composés de B et agiter entre chaque ajout; 4. Peser C et mélanger jusqu'à homogénéisation parfaite; 5. A 35°C, ajouter C puis D et mélanger jusqu'à parfaite homogénéisation.10 Example 4: Formulas Example 4.1: Moisturizing cream for the body The cream of the following formula (Table 14): 25 Phase Ingredient% A Xyliance (Soliance) 4 Macadamia ternifolia seed oil 6 Kendi oil 0.5 Preservative QS B Aqua qs 100 Soligel (Soliance) 0.1 Sodium Hyaluronate 2 C 1% aqueous solution (dry matter) in Burkholderia caribensis oligosaccharides 1 D Manuka honey 0.5 Table 14: Moisturizing body cream formula is obtained as follows: 1. Prepare separately A and B, under stirring and at 70 ° C. 2. Gently add B to A under foaming at 3000 rpm. 3. Cool. 4. At 40 ° C add C and D with slow stirring at 40 rpm. Example 4.2: Day cream The cream of the following formula (Table 15): Phase Ingredient% A Xyliance (Soliance) 3.5 Ore oil 2 Caprylic / capric triglyceride 3 Isostearyl isostearate 3 Dimethicone 2 Prunus armeniaca (Apricot) Kernel oil 2 B Glyceryl stearate citrate 1.5 Preservative Qs Aqua qs 100 Glycerin 2 Xanthan gum 0.7 C 1% aqueous solution (dry matter) of Burkholderia caribensis oligosaccharides 1 D Perfume qs Table 15: formula of a day cream is obtained as follows: 1. Prepare separately A and B, with stirring and at 70 ° C. 2. Gently add B to A under foaming at 3000 rpm. 3. Cool. 4. At 40 ° C add C and D with slow stirring at 40 rpm. Example 4.3: Facial gel gel The following formula gel (Table 16): Phase Ingredient% A Aqua qs 100 Tourmaline (Soliance) 1 Carbomer 0.7 Hydroxyethylcellulose 0.3 Preservative Qs B Sodium Hydroxide Qs pH 7 C Aqueous solution at 1% (dry matter) in Burkholderia caribensis 1 Betaphroline 2 oligosaccharides Table 16: Face gel gel formula is obtained as follows: 1. Weigh A and heat with slow stirring at 70 ° C in a Bain-Marie; 2. Adjust the pH to 7 with B; 3. Add C to AB with slow stirring. Example 4.4: Relaxing moisturizing gel The gel of the following formula (Table 17): Phase Ingredient% A Porphyraline (Soliance) qs 100 Hydroxyethylcellulose 1 B Grevilline (Soliance) Betaphroline 10 1% aqueous solution (dry matter) of Burkholderia oligosaccharides caribensis 1 Spring sea water 10 C Polysorbate 20 1.36 Perfume qs Preservative qs D CI dye 17200 qs CI dye 42090 qs Table 17: Formula of a relaxing hydrating gel is obtained as follows: 1. Weigh A and heat to 70 ° C under agitation in a Bain-Marie; 2. Allow to cool to room temperature; 3. At 40 ° C, add successively the compounds of B and stir between each addition; 4. Weigh C and mix until perfect homogenization; 5. At 35 ° C, add C then D and mix until homogenous.
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