FR2986802A1

FR2986802A1 - Handling and treating cells comprises trapping cells in a network of dielectrophoretic traps that are microfabricated on a substrate, and treating the cells by an electric field applied to the electrodes traps

Info

Publication number: FR2986802A1
Application number: FR1251340A
Authority: FR
Inventors: Eric Bourillot; Eric Lesniewska
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Bourgogne
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Bourgogne
Priority date: 2012-02-13
Filing date: 2012-02-13
Publication date: 2013-08-16

Abstract

Handling and treating cells comprises trapping cells in a network of dielectrophoretic traps (10-14) that are microfabricated on a substrate, and treating the cells by an electric field applied to the electrodes traps. An independent claim is included for a cell handling and treatment device, comprising: network of traps having electrodes located on a substrate, where end size of the electrode is less than 1 mm.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE DE MANIPULATION ET TRAITEMENT DE CELLULES PAR CHAMP ELECTRIQUE L'invention porte sur la manipulation et le traitement de cellules par un champ électrique. Une application est la thérapie cellulaire. The invention relates to the manipulation and treatment of cells by an electric field. An application is cell therapy.

Le processus de thérapie cellulaire est divisé en 5 phases principales : le prélèvement des cellules, la réception des cellules, le traitement des cellules, la distribution, l'administration et le suivi. Chacune de ces étapes présente divers enjeux spécifiques. L'invention concerne précisément le traitement cellulaire par champ électrique, en particulier l'électroporation, la transfection et l'électrofusion pour lesquelles des difficultés techniques persistent. Les différents effets d'un champ électrique sur une cellule sont montrés dans la figure 1. L'optimisation des conditions de transfection et la recherche de nouveaux mécanismes d'action de molécules accessibles par l'insertion ou l'inhibition de l'expression d'un gène, reste dans la biologie et la biotechnologie une question cruciale pour la qualité ainsi que pour la quantité produite et la stabilité des lignes cellulaires. Les limites de toutes les actions menées sur les cellules eucaryotes ou procaryotes sont liées à la barrière chimique induite par la membrane plasmique des cellules et sa grande sélectivité. Ainsi, seules les molécules hydrophobes traversent la membrane passive (transport passif), tandis que d'autres molécules comme les sucres ou les ions nécessitent l'intervention de protéines transnriernbranaires (transport actif). Toutefois, il est important de pouvoir introduire des molécules extracellulaires qui normalement ne pénétreraient pas la membrane cellulaire. Les méthodes classiques de transfert moléculaire utilisent des vecteurs viraux, l'électroporation, la fusion des liposomes, micro-injection, etc. Ces méthodes n'ont pas la capacité de sélectionner et de manipuler les cellules d'intérêt particulier. En général, elles utilisent une grande quantité de cellules sans sélectivité du traitement, en comptant sur l'effet statistique du nombre de transfection cellulaire. Cependant, dans de nombreux cas, leur efficacité est 1 réduite car il n'y a aucun contrôle sur cette quantité de cellules et le contrôle des agents externes permettant la transfection. L'électroporation fait partie de ces méthodes de transfection, utilisées dans la thérapie génie et la biologie moléculaire. Cette technique consiste à appliquer à une grande quantité de cellules des impulsions électriques d'amplitude importante (kVicm), ce qui rend la membrane plasmique perméable et permet le passage des macromolécules externes à l'intérieur de la cellule. Ce processus est généralement réversible. Cependant, deux problèmes majeurs résident dans l'application de cette technique à une grande quantité de cellules. Beaucoup de cellules sont détruites par l'utilisation de forts potentiels et beaucoup sont peu ou pas concernées par la transfection au cours du processus. Il en résulte une réduction significative du ratio d'efficience du nombre de gènes transfectés. Dans ce cas, la solution consiste à réduire la quantité de cellules traitées et à diminuer la tension appliquée pour éviter tout stress possible et pour augmenter les performances. La fusion cellulaire permet la formation in vitro d'une cellule hybride par l'union de deux cellules de lignées différentes mises en contact. La cellule hybride résultante renferme le contenu des deux cellules initiales au sein d'une membrane unique. Les techniques classiques de fusion utilisent des agents chimiques présentant des inconvénients (toxicité, faible rendement de fusion de l'ordre de 15-20%). L'électrofusion est une alternative qui comporte trois étapes mise en contact des cellules à fusionner par diélectrophorèse, application d'un champ électrique pulsé intense pour initier le processus de fusion, maintien en contact des cellules pendant la maturation des membranes fusionnées. Cette technique est complémentaire de la technique d'électroporation. Dans ce document, la manipulation des cellules est distinguée du traitement en ce que la manipulation concerne des opérations qui n'altèrent pas les propriétés biochimiques des cellules, comme par exemple leur déplacement, leur regroupement dans un piège, le contrôle de la 2 2 9 86 802 population d'un groupement. Le traitement de cellules désigne ainsi des procédés de transfection, perméabilisation, de fusion. Avec le développement des moyens de micro et nanofabrication, il est possible de miniaturiser les dispositifs de manipulation 5 et de traitement. Par exemple, l'article « Cell Reactions to Dielectrophoretic Manipulation », Biochemical and Biophysical Research Communications 257, 687-698 (1999) décrit un dispositif microfabriqué de piégeage diélectrophorétique de cellules. L'étude se porte notamment sur les effets de diélectrophorèse positive ou négative. La diélectrophorèse est dite positive 10 lorsque les objets déplacés sont attirés vers les zones ou le champ électrique est fort. Inversement, elle est dite négative lorsque les objets sont attirés par les zones de champ faible. Il est intéressant de noter que cet article rapporte que la diélectrophorèse de cellules est négative à basse fréquences, et devient positive au-delà du MHz. 15 Un autre dispositif microfabriqué pour piéger des cellules est décrit dans le document EP 1438140. Ce dispositif permet de piéger dans un réseau d'électrodes et de traiter des cellules en appliquant un champ électrique avec les mêmes électrodes. Parce que tous les pièges du réseau sont reliés aux mêmes potentiels, ce dispositif ne permet pas de gérer 20 plusieurs groupes de cellules à traiter sur un substrat, tout autant qu'il offre des moyens limités pour augmenter les rendements des traitements cellulaires. Par ailleurs, ce dispositif ne permet que le piégeage de cellules non-adhérentes. Ces dernières années, de nombreux dispositifs miniaturisés 25 d'électrodes ont vu le jour pour l'électroporation cellule par cellule, à faible tension, et avec un faible stress cellulaire. Tous ces dispositifs, plus ou moins complexes à fabriquer, comprennent et intègrent une microfluidique par des techniques de microfabrication en vue de manipuler de manière plus ou moins sophistiquée des cellules. Les références suivantes illustrent par des 30 réalisations particulières certaines de ces techniques. 3 2 986 802 Un dispositif combinant un traitement par champ électrique avec un moyen de manipulation cellulaire microfluidique est décrit dans l'article de Kim et al., Anal. Chem. 79, 7761-7766 (2007). Si ce dispositif permet d'électroporer un flux contrôlé de cellules, il ne permet de contrôler 5 des groupes de cellules sur un substrat. En outre, lors de l'électroporation les cellules ne sont pas immobilisées ; il faut donc adapter leur vitesse de déplacement au temps d'électroporation, ce qui n'est pas toujours facile. Par ailleurs, rien ne garantit l'homogénéité de l'électroporation. Un autre dispositif combinant traitement cellulaire par champ 10 électrique et manipulation microfluidique est décrit dans le document WO 2006004558. Les électrodes de cette invention servent non seulement à appliquer un champ électrique à des cellules mais aussi à réaliser un canal microfluidique. De plus, elles ont la particularité d'être munies de cavités, ce qui permet de créer (i) des zones de champ électrique fort et des zones de 15 champ faible, et (ii) des zones de flux microfluidique fort et des zones de flux faible. C'est ainsi que ce dispositif permet d'isoler avec un flux microfluidique fort des cellules confinées dans un champ électrique fort. Si ce dispositif permet de trier des cellules entre elles, il ne permet pas la gestion de groupes de cellules sur un substrat. En outre, aucune visualisation des cellules n'est 20 possible, et il n'est même pas possible de garantir leur présence. Un autre dispositif combinant manipulation microfluidique et électroporation est illustré dans le film joint aux informations supplémentaires de l'article de Valero et al,. Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device, Lab Chip 8, 62-67 25 (2008). Ce dispositif ne permet pas non plus de manipuler simplement des groups de cellules. En outre, lors de l'électroporation les cellules ne sont pas immobilisées ; il faut donc adapter leur vitesse de déplacement au temps d'électroporation, ce qui n'est pas toujours facile. Par ailleurs, rien ne garantit l'homogénéité de l'électroporation. 30 Palier à ces inconvénients de l'état de l'art est un objectif de l'invention. 4 Un autre objectif de l'invention est de pouvoir réaliser des traitements cellulaires séquentiels ou parallèles sur une même lignée cellulaire ou sur différentes lignées cellulaires pour comparaison. Un autre objectif est de pouvoir, avec une seule alimentation électrique, manipuler et traiter individuellement une pluralité de groupes de cellules. Un autre objectif est de pouvoir changer simplement la forme d'un groupement de cellules pour optimiser le traitement par champ électrique. The cell therapy process is divided into 5 main phases: cell harvesting, cell reception, cell processing, distribution, administration and follow-up. Each of these stages presents various specific issues. The invention specifically relates to the electric field cell treatment, in particular electroporation, transfection and electrofusion for which technical difficulties persist. The different effects of an electric field on a cell are shown in FIG. 1. The optimization of the transfection conditions and the search for new mechanisms of action of molecules accessible by the insertion or the inhibition of the expression of 'a gene, remains in biology and biotechnology a crucial issue for the quality as well as for the quantity produced and the stability of the cell lines. The limits of all the actions carried out on eukaryotic or prokaryotic cells are related to the chemical barrier induced by the plasma membrane of cells and its high selectivity. Thus, only hydrophobic molecules cross the passive membrane (passive transport), while other molecules such as sugars or ions require the intervention of trans-transboundary proteins (active transport). However, it is important to be able to introduce extracellular molecules that normally would not penetrate the cell membrane. Conventional molecular transfer methods use viral vectors, electroporation, liposome fusion, microinjection, and so on. These methods do not have the ability to select and manipulate cells of particular interest. In general, they use a large amount of cells without treatment selectivity, relying on the statistical effect of the number of cell transfections. However, in many cases, their effectiveness is reduced because there is no control over this amount of cells and the control of external agents for transfection. Electroporation is one of these methods of transfection, used in engineering therapy and molecular biology. This technique consists in applying large amplitude electrical pulses (kVicm) to a large number of cells, which makes the plasma membrane permeable and allows the passage of external macromolecules inside the cell. This process is usually reversible. However, two major problems lie in the application of this technique to a large amount of cells. Many cells are destroyed by the use of strong potentials and many are little or not involved in transfection during the process. This results in a significant reduction in the efficiency ratio of the number of transfected genes. In this case, the solution is to reduce the amount of cells treated and reduce the applied voltage to avoid possible stress and increase performance. Cell fusion allows in vitro formation of a hybrid cell by the union of two cells of different lineages brought into contact. The resulting hybrid cell contains the contents of the two initial cells within a single membrane. Conventional fusion techniques use chemical agents with disadvantages (toxicity, low melting efficiency of the order of 15-20%). Electrofusion is an alternative that involves three steps bringing the cells into contact to be fused by dielectrophoresis, applying an intense pulsed electric field to initiate the melting process, keeping the cells in contact during the maturation of the fused membranes. This technique is complementary to the electroporation technique. In this document, the manipulation of the cells is distinguished from the treatment in that the manipulation relates to operations that do not alter the biochemical properties of the cells, such as for example their displacement, their grouping in a trap, the control of the cells, and the control of the cells. 86 802 population of a group. The treatment of cells thus designates methods of transfection, permeabilization, fusion. With the development of micro and nanofabrication means, it is possible to miniaturize handling and processing devices. For example, the article "Cell Reactions to Dielectrophoretic Manipulation", Biochemical and Biophysical Research Communications 257, 687-698 (1999) discloses a microfabricated device for dielectrophoretic cell trapping. The study focuses on the effects of positive or negative dielectrophoresis. Dielectrophoresis is said to be positive when moved objects are attracted to areas where the electric field is strong. Conversely, it is called negative when the objects are attracted by the weak field areas. It is interesting to note that this article reports that cell dielectrophoresis is negative at low frequencies, and becomes positive beyond the MHz. Another microfabricated device for trapping cells is described in EP 1438140. This device allows trapping in an array of electrodes and treating cells by applying an electric field with the same electrodes. Because all the traps of the network are connected to the same potentials, this device does not make it possible to manage several groups of cells to be treated on a substrate, as much as it offers limited means for increasing the yields of the cellular treatments. Moreover, this device only allows the trapping of non-adherent cells. In recent years, many miniaturized electrode devices have emerged for cell-by-cell electroporation at low voltage and with low cellular stress. All these devices, more or less complex to manufacture, include and integrate a microfluidic by microfabrication techniques to manipulate more or less sophisticated cells. The following references illustrate particular embodiments of some of these techniques. A device combining an electric field treatment with a microfluidic cell handling means is described in the article by Kim et al., Anal. Chem. 79, 7761-7766 (2007). If this device makes it possible to electropore a controlled flow of cells, it can not control groups of cells on a substrate. In addition, during electroporation the cells are not immobilized; it is necessary to adapt their speed of movement to the electroporation time, which is not always easy. Moreover, nothing guarantees the homogeneity of the electroporation. Another device combining electric field cell processing and microfluidic manipulation is described in WO 2006004558. The electrodes of this invention serve not only to apply an electric field to cells but also to realize a microfluidic channel. In addition, they have the particularity of being provided with cavities, which makes it possible to create (i) strong electric field zones and weak field areas, and (ii) zones of strong microfluidic flux and zones of weak field. low flow. Thus this device can isolate with a strong microfluidic flow of the cells confined in a strong electric field. If this device makes it possible to sort cells together, it does not allow the management of groups of cells on a substrate. In addition, no visualization of the cells is possible, and it is not even possible to guarantee their presence. Another device combining microfluidic manipulation and electroporation is illustrated in the film attached to the additional information of the article by Valero et al. Gene transfer and protein dynamics in a cell using single cell electroporation in a microfluidic device, Lab Chip 8, 62-67 (2008). This device also does not allow to simply manipulate groups of cells. In addition, during electroporation the cells are not immobilized; it is necessary to adapt their speed of movement to the electroporation time, which is not always easy. Moreover, nothing guarantees the homogeneity of the electroporation. Bearing these disadvantages of the state of the art is an objective of the invention. Another object of the invention is to be able to perform sequential or parallel cell treatments on the same cell line or on different cell lines for comparison. Another objective is to be able, with a single power supply, to manipulate and individually process a plurality of groups of cells. Another objective is to be able to simply change the shape of a group of cells to optimize the electric field treatment.

Un autre objectif est_ de pouvoir aligner des cellules pour optimiser la transfection ou la fusion cellulaire. Un autre objectif est de pourvoir déplacer simplement des groupes de cellules entre plusieurs régions. Un autre objectif est d'accroitre le rendement d'un traitement cellulaire par une simple manipulation. Un autre objectif est de pouvoir réaliser un traitement cellulaire sur une cellule unique. Un autre objectif est de pouvoir réaliser des électroporations cellulaires sur une pluralité de groupes de cellules. Another objective is to be able to align cells to optimize transfection or cell fusion. Another objective is to be able to simply move groups of cells between several regions. Another objective is to increase the yield of a cellular treatment by simple manipulation. Another objective is to be able to perform a cell treatment on a single cell. Another objective is to be able to perform cellular electroporations on a plurality of groups of cells.

Un autre objectif est de pouvoir réaliser un calibrage de l'électroporation dans des conditions répétables et reproductibles. Un autre objectif est de pouvoir calibrer les formes d'ondes appliquées pour l'électroporation dans des conditions aussi reproductibles et répétables que possibles. Another objective is to be able to calibrate the electroporation in repeatable and reproducible conditions. Another objective is to be able to calibrate the waveforms applied for electroporation under conditions as reproducible and repeatable as possible.

Un autre objectif est de pouvoir réaliser une électroporation homogène des cellules. Un autre objectif est d'avoir un levier de contrôle sur l'électroporation qui est indépendant de la forme d'onde des potentiels appliqués. Another objective is to be able to perform homogeneous electroporation of the cells. Another objective is to have a control lever on the electroporation which is independent of the waveform of the applied potentials.

Un autre objectif est de pouvoir réaliser efficacement la transfection sur des groupes de cellules individuels. 5 Un autre objectif est de pouvoir réaliser la fusion cellulaire sur des groupes individuels de cellules. Un autre objectif est de pouvoir avoir des groupements de cellules individuels et robustes. Another objective is to efficiently perform transfection on groups of individual cells. Another objective is to be able to perform cell fusion on individual groups of cells. Another objective is to be able to have individual and robust cell groupings.

Un autre objectif est de pouvoir avoir un contrôle optique de l'état de plusieurs groupes de cellules. Un autre objectif est de pourvoir visualiser au microscope à champ proche des groupements de cellules particuliers. Conformément à l'invention, au moins un des buts précités peut être atteint par un procédé de manipulation et de traitement de cellules comprenant une étape de piégeage de cellules dans un réseau de pièges diélectrophorétiques ayant des électrodes microfabriquées sur un substrat, et une étape de traitement cellulaire par un champ électrique appliqué par les électrodes des pièges, et caractérisé en ce que lesdits pièges ont un adressage électrique qui est individuel. Selon des modes de réalisation avantageux du procédé de l'invention : - Le procédé peut comprendre un multiplexage des potentiels appliqués aux électrodes des pièges. - La manipulation cellulaire peut comprendre une modification de l'adressage électrique pour contrôler la forme d'un groupement cellulaire. - La manipulation cellulaire peut comprendre une étape d'alignement des cellules. - La manipulation cellulaire peut comprendre un déplacement de cellules entre une pluralité de pièges ; - La manipulation cellulaire peut comprendre un ajustement du nombre de cellules piégées dans un piège au moyen d'un contrôle de la durée du champ diélectrophorétique appliqué, et/ou d'un contrôle de sa valeur crête à crête, et/ou d'un microscope optique, et/ ou d'un ajustement de la taille du piège. 6 - Le traitement cellulaire peut comprendre l'électroporation de cellules. - Le procédé peut comprendre une étape de calibrage du produit durée * amplitude des impulsions de potentiels qui sont appliquées pour réaliser le traitement cellulaire par champ électrique. - L'électroporation peut être réalisée par une pluralité d'impulsions qui ont des amplitudes positives et négatives. Le procédé peut comprendre une étape d'ajustement de la concentration d'ions pour contrôler la taille des pores des cellules au cours de l'électroporation. - Le traitement cellulaire peut comprendre la transfection de cellules. - Le traitement cellulaire peut comprendre l'électrofusion de cellules. - La manipulation ou le traitement cellulaire peut comprendre un contrôle de l'état des cellules par microscopie à champ proche. - La manipulation ou le traitement cellulaire peut comprendre un contrôle de l'état des cellules avec un microscope optique par transmission grâce à la mise en oeuvre d'un substrat transparent. - La manipulation ou le traitement cellulaire peut comprendre un contrôle de l'état des cellules par mesure d'un courant entre les électrodes. Un autre objet de l'invention apportant des solutions aux problèmes précités est un dispositif pour manipuler et traiter des cellules par champ électrique comprenant un réseau de pièges diélectrophorétiques ayant des électrodes, dont les extrémités ont une taille inférieure au millimètre, sur un substrat, et caractérisé en ce que les pièges ont un adressage électrique qui est individuel. Another objective is to have optical control of the state of several groups of cells. Another objective is to provide visualization with the microscope near field specific cell groups. According to the invention, at least one of the aforementioned objects can be achieved by a method of handling and treating cells comprising a step of trapping cells in a dielectrophoretic trap array having microfabricated electrodes on a substrate, and a step of cellular treatment by an electric field applied by the electrodes of the traps, and characterized in that said traps have an electrical addressing which is individual. According to advantageous embodiments of the method of the invention: the method may comprise a multiplexing of the potentials applied to the electrodes of the traps. Cellular manipulation may include a modification of the electrical addressing to control the shape of a cell group. Cellular manipulation may comprise a step of aligning the cells. Cell manipulation may include moving cells between a plurality of traps; Cell manipulation may include adjusting the number of cells trapped in a trap by controlling the duration of the applied dielectrophoretic field, and / or controlling its peak-to-peak value, and / or optical microscope, and / or an adjustment of the size of the trap. Cell treatment may include electroporation of cells. The method may comprise a step of calibrating the product duration * amplitude of the potential pulses which are applied to carry out the cellular treatment by electric field. Electroporation can be performed by a plurality of pulses that have positive and negative amplitudes. The method may include a step of adjusting the ion concentration to control cell pore size during electroporation. Cell treatment may include transfection of cells. Cell treatment may include electrofusion of cells. Cell manipulation or processing may include control of cell status by near-field microscopy. The manipulation or the cellular treatment may comprise a control of the state of the cells with a transmission optical microscope thanks to the implementation of a transparent substrate. The manipulation or the cellular treatment may comprise a control of the state of the cells by measuring a current between the electrodes. Another object of the invention providing solutions to the aforementioned problems is a device for manipulating and treating cells by an electric field comprising a network of dielectrophoretic traps having electrodes, the ends of which are less than one millimeter in size, on a substrate, and characterized in that the traps have electrical addressing which is individual.

Selon des modes de réalisation avantageux du dispositif de l'invention : 7 - Le dispositif peut comprendre un multiplexeur connecté aux électrodes des pièges. - Les extrémités des électrodes d'un piège peuvent s'arranger selon les côtés d'un parallélogramme. - Le dispositif peut comprendre un microscope optique ou de champ proche pour contrôler l'état des cellules dans les pièges. - Le substrat peut être transparent. - Le dispositif peut comprendre un moyen de mesure du courant circulant entre les électrodes. - Le dispositif peut comprendre une solution aqueuse et un moyen de contrôle de sa concentration d'ions pour ajuster la cinétique du traitement cellulaire par champ électrique. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins suivants donnés à titre d'exemple : - La figure 1 montre un schéma des différents effets du champ électrique sur une cellule ; - La figure 2 montre une vue d'artiste d'un piège diélectrophorétique et un de ses procédés de fabrication ; - La figure 3 illustre le principe du piégeage diélectrophorétique, et les résultats de 4 expériences de piégeage diélectrophorétique réalisées selon l'invention ; - La figure 4 montre 8 photographies de 8 géométries d'électrodes pouvant réaliser un piège diélectrophorétique ; - La figure 5 montre un adressage individuel d'une pluralité de pièges diélectrophorétiques ; La figure 6 illustre un multiplexage entre une pluralité de pièges diélectrophorétiques et une alimentation ; - La figure 7 montre un déplacement de cellules entre une pluralité de pièges diélectrophorétiques ; 8 - La figure 8 montre deux vues de piéges diélectrophorétiques de tailles différentes qui contiennent peu de cellules, ou une cellule, ce qui peut permettre d'améliorer le rendement d'un traitement cellulaire ; - La figure 9 montre une modification de la forme d'un groupement de cellules par la modification de l'adressage des électrodes ; - La figure 10 montre un alignement de cellules par un contrôle de la forme et de la population d'un groupement de cellules ; - La figure 11 montre une forme d'onde élémentaire des potentiels électriques des électrodes à l'origine du traitement par champ électrique - l'électroporation, la transfection ou l'électrofusion ; - La figure 12 montre trois mesures en microscopie confocale de cellules transfectées par des molécules fluorescentes où l'électroporation est réalisée avec des impulsions de potentiel de durée croissante ; - La figure 13 montre la lyse (celle des cellules marquées par un cercle) induite par l'application d'impulsions de potentiels dont la durée ou l'amplitude est trop forte ; - La figure 14 illustre d'une part la méthode de calibrage des formes d'ondes de potentiel appliqué sur les électrodes, et montre d'autre part des rendements de survie et de transfection cellulaire ; - La figure 15 montre une forme d'onde de potentiel appliqué aux électrodes limitant la lyse ; - La figure 16 montre une forme d'onde de potentiel appliqué qui homogénéise l'électroporation des cellules entre cathode et anode ; - La figure 17 illustre un résultat de l'invention par l'observation en microscopie confocale de la transfection de nanoparticules relativement grosses ; - La figure 18 décrit un procédé de thérapie cellulaire comprenant une étape de d'électrofusion. 9 Un piège diélectrophorétique microfabriqué est montré dans la figure 2 a. Des électrodes 4 reposent sur un substrat 2. Ces électrodes ont des plots de contact 1 qui permettent de les connecter à un potentiel électrique établit par une alimentation électrique. La zone 3 délimite un piège diélectrophorétique. Un potentiel électrique appliqué sur les électrodes créé un champ électrique qui possède un extremum, un maximum ou un minimum, dans la zone 3. Ceci permet, lorsque le substrat est en présence d'une solution contenant des cellules, de préférence un milieu physiologique, de regrouper des cellules au sein de la zone 3, comme illustré dans la figure 3 a. According to advantageous embodiments of the device of the invention: The device may comprise a multiplexer connected to the electrodes of the traps. - The ends of the electrodes of a trap can be arranged along the sides of a parallelogram. The device may include an optical or near-field microscope for monitoring the state of the cells in the traps. - The substrate can be transparent. The device may comprise means for measuring the current flowing between the electrodes. The device may comprise an aqueous solution and a means of controlling its concentration of ions to adjust the kinetics of the cellular treatment by electric field. Other features, details and advantages of the invention will emerge on reading the description made with reference to the following drawings given by way of example: FIG. 1 shows a diagram of the different effects of the electric field on a cell; FIG. 2 shows an artist's view of a dielectrophoretic trap and one of its manufacturing processes; FIG. 3 illustrates the principle of dielectrophoretic trapping, and the results of 4 dielectrophoretic trapping experiments carried out according to the invention; FIG. 4 shows 8 photographs of 8 electrode geometries capable of forming a dielectrophoretic trap; FIG. 5 shows an individual addressing of a plurality of dielectrophoretic traps; Figure 6 illustrates a multiplexing between a plurality of dielectrophoretic traps and a power supply; FIG. 7 shows a displacement of cells between a plurality of dielectrophoretic traps; FIG. 8 shows two views of dielectrophoretic traps of different sizes that contain few cells, or a cell, which can make it possible to improve the efficiency of a cellular treatment; FIG. 9 shows a modification of the shape of a group of cells by the modification of the addressing of the electrodes; Figure 10 shows an alignment of cells by a control of the shape and population of a cell group; FIG. 11 shows a basic waveform of the electrical potentials of the electrodes at the origin of the electric field treatment - electroporation, transfection or electrofusion; FIG. 12 shows three measurements in confocal microscopy of cells transfected with fluorescent molecules where the electroporation is carried out with potential pulses of increasing duration; FIG. 13 shows the lysis (that of cells marked by a circle) induced by the application of pulses of potentials whose duration or amplitude is too strong; FIG. 14 illustrates, on the one hand, the calibration method of potential waveforms applied to the electrodes, and on the other hand shows survival and cell transfection efficiencies; FIG. 15 shows a potential waveform applied to the electrodes limiting the lysis; FIG. 16 shows an applied potential waveform that homogenizes the electroporation of the cells between the cathode and the anode; FIG. 17 illustrates a result of the invention by observation in confocal microscopy of the transfection of relatively large nanoparticles; Figure 18 depicts a cell therapy method comprising an electrofusion step. A microfabricated dielectrophoretic trap is shown in Figure 2a. Electrodes 4 rest on a substrate 2. These electrodes have contact pads 1 which make it possible to connect them to an electrical potential established by a power supply. Zone 3 delimits a dielectrophoretic trap. An electric potential applied to the electrodes creates an electric field that has an extremum, a maximum or a minimum, in zone 3. This allows, when the substrate is in the presence of a solution containing cells, preferably a physiological medium, to group cells within zone 3 as shown in Figure 3a.

Des cellules 5 au voisinage du piège formé par les électrodes 4 se déplacent au centre du piège 6 sous l'effet de la force de diélectrophorèse. Les résultats de quatre essais montrant l'efficacité de cet effet sont montrés dans la figure 3 b. Les inserts 1, 3, 5 et 7 montrent une vue prise au microscope optique avant application d'un potentiel électrostatique sur les électrodes. Les inserts 2, 4, 6 et 8 montrent une vue prise après. Les cellules au voisinage du piège s'y sont regroupées. Les 4 réalisations avant / après montrées ici diffèrent principalement par les concentrations et positions initiales de cellules. Elles illustrent de plus la fiabilité de l'opération. Les électrodes planaires sont réalisées par des techniques de microfabrication ; par exemples celles qui sont mises en oeuvre en salle blanche pour la fabrication de dispositifs micromécaniques ou à semiconducteurs. Le substrat est de préférence constitué d'un isolant électrique. Il a de préférence une faible réactivité chimique ou électrochimique avec une solution de cellules. Il peut aussi être transparent pour pouvoir le contrôler à l'aide d'un microscope optique par transmission. Les électrodes sont réalisées dans un matériau conducteur, comme un métal ou un semi-conducteur dopé ; certains métaux comme le cuivre étant sujets à corrosion, il peut être opportun de les protéger au moyen d'une couche organique, par exemple un polymère biocompatique tel que m- PEG (methoxypoly(éthylèneglycol)). Il est également possible de greffer des molécules protectrices des électrodes comme la caféine, la puridine ou 10 2 986 802 l'adénine. La résistance de ces électrodes doit être inférieure à celle du substrat et de la solution. Les électrodes (références 4 sur la figure 2a) peuvent présenter une longueur comprise entre 10 pm et 1 mm, et de préférence entre 150 et 300 pm ; leur largeur peut également être comprise 5 entre 10 pm et 1 mm, et de préférence être de l'ordre de 50 prn. Bien que les électrodes soient qualifiées de « planaires », elles présentent une épaisseur non nulle. Il a été observé que cette épaisseur doit de préférence être supérieure ou égale à 1,5 pm ; dans le cas contraire, les cellules sont trop sensibles au mouvements convectifs du milieu, et leur 10 piégeage n'est pas satisfaisant. Les électrodes ont des extrémités qui s'arrangent selon les côtés d'un parallélogramme. Un carré est montré à titre d'exemple dansla figure 3. Ceci permet d'avoir un extremum local de champ électrique stable, et confère au piégeage de cellules de la robustesse. 15 En variante, d'autres réalisations possibles sont montrées dans la figure 4. Des études de piégeage diélectrophorétique de cellules dans de telles configurations suggèrent que le piégeage dans des électrodes symétriques deux à deux, comme celles de la figure 3, est bien plus stable. Selon encore une autre variante, la géométrie des extrémités 20 des électrodes peut bénéficier des idées développées dans le document EP0946709 pour optimiser la forme des lignes de champ. Par exemple, des géométries en forme de flèche sont décrites pour améliorer la stabilité du piège diélectrophorétique de cellule. Un exemple de procédé de fabrication particulier est illustré 25 dans la figure 2b. Les électrodes planaires, constituées par un mélange de Cr / Cu (chrome / cuivre), sont fabriquées sur des substrats transparents (par exemple une lame de verre) en utilisant une technique de dépôt de couches standard (PVD) et la photolithographie comme le montre la figure 4 b). La couche de chrome a pour fonction de promouvoir l'adhésion. Après un spin- 30 coating de la résine photosensible positive S1813 (Shipley), l'exposition aux UVs est effectuée à l'aide d'un aligneur de masque (type MJB21 Karl Süss). 11 2 986 802 La résine photosensible est ensuite développée avec de l'hydroxyde de tétraméthylammonium (MF319). Enfin, une gravure chimique est effectuée pour le Cu avec une solution de peroxodisulfate de sodium (Na2S2O8) et une gravure physique pour Cr. Le masque des électrodes est conçu et modifiable 5 à volonté par lithographie par faisceau d'électrons. Par ailleurs, l'épaisseur de métal afin d'assurer le bon fonctionnement du dispositif doit être supérieure à 1 pm. Les flans des électrodes doivent être parfaitement perpendiculaires au substrat de manière à ce que les lignes de champ électrique soient parallèles au substrat sur une hauteur suffisante pour piéger les cellules. 10 Selon une variante, les aires actives peuvent être fonctionnalisées individuellement pour aider au maintien des contacts intercellulaires lors du processus d'électrofusion. La fonctionnalisation peut être obtenue en déposant, dans l'aire comprise entre les électrodes, un dépôt d'or ayant une épaisseur de quelques nanornètres, qui est ensuite 15 fonctionnalisée par une solution diluée de protéines telle que l'albumine de sérum bovin (ABS, ou BSA en anglais) ou l'ovalbumine (OVA). La couche d'or est nécessaire, au moins dans le cas d'un substrat en silice, car elle présente des interactions hydrophobes, ce qui n'est pas le cas de la silice. Les cellules portant des anticorps anti-OVA ou anti-X vont se fixer dans l'aire 20 fonctionnalisée après adressage de l'ensemble des cellules. Puis, par un simple rinçage ou par adressage d'autres électrodes, on évacue les cellules qui ne sont pas fixées. Ainsi, seules les cellules d'intérêt restent dans l'être des électrodes, et peuvent subir un traitement, par exemple (voir la figure 18) une électrofusion avec des cellules mutantes de myélome. Un tel procédé 25 garantit que presque 100% des cellules fusionnées produiront des anticorps anti-X. Un réseau de piège diélectrophorétique est illustré dansla figure 5. Ce réseau est composé de cinq pièges (références 10 à 14), chacun composé de quatre électrodes. Les sources de potentiel V11 à V45 sont des 30 sources de potentiel indépendantes. Un autre réseau de pièges est montré 12 dans la figure 7. Il comporte deux pièges de 4 électrodes. De manière générale, un réseau de pièges est constitué d'au moins deux pièges. Selon l'invention, chaque piège d'un réseau possède des bornes électriques dont les potentiels peuvent être adressés individuellement ; une borne peut également être connectée à une haute impédance, de telle sorte que le potentiel de l'électrode correspondante est flottant. Dans le cadre de l'exemple de la figure 5, 20 bornes d'alimentation sont disponibles et peuvent être connectées à 20 potentiels électriques différents. Dans l'exemple de la figure 7, 8 bornes sont disponibles. Ainsi, chaque piège et chaque électrode de chaque piège peuvent être adressés électriquement individuellement. L'avantage est donc que chaque piège peut réaliser des traitements séquentiels ou parallèles sur une même lignée cellulaire ou sur différentes lignées cellulaire pour comparaison. Cells 5 in the vicinity of the trap formed by the electrodes 4 move in the center of the trap 6 under the effect of the dielectrophoresis force. The results of four trials showing the effectiveness of this effect are shown in Figure 3b. Inserts 1, 3, 5 and 7 show a view taken under an optical microscope before application of an electrostatic potential on the electrodes. Inserts 2, 4, 6 and 8 show a view taken after. The cells in the vicinity of the trap have regrouped there. The 4 before / after achievements shown here differ mainly in the initial cell concentrations and positions. They further illustrate the reliability of the operation. Planar electrodes are made by microfabrication techniques; for example those which are implemented in clean room for the manufacture of micromechanical devices or semiconductor. The substrate is preferably an electrical insulator. It preferably has a low chemical or electrochemical reactivity with a cell solution. It can also be transparent to be able to control it using a transmission optical microscope. The electrodes are made of a conductive material, such as a doped metal or semiconductor; Since some metals such as copper are subject to corrosion, it may be appropriate to protect them by means of an organic layer, for example a biocompatible polymer such as m-PEG (methoxypoly (ethylene glycol)). It is also possible to graft electrode protecting molecules such as caffeine, puridine or adenine. The resistance of these electrodes must be lower than that of the substrate and the solution. The electrodes (references 4 in Figure 2a) may have a length of between 10 pm and 1 mm, and preferably between 150 and 300 pm; their width may also be between 10 μm and 1 mm, and preferably be of the order of 50 μm. Although the electrodes are called "planar", they have a non-zero thickness. It has been observed that this thickness should preferably be greater than or equal to 1.5 μm; in the opposite case, the cells are too sensitive to the convective motions of the medium, and their trapping is unsatisfactory. The electrodes have ends that arrange along the sides of a parallelogram. A square is shown by way of example in FIG. 3. This makes it possible to have a local extremum of stable electric field, and gives cell trapping robustness. Alternatively, other possible embodiments are shown in FIG. 4. Dielectrophoretic trapping studies of cells in such configurations suggest that entrapment in symmetrical two-by-two electrodes, such as those in FIG. 3, is much more stable. . According to yet another variant, the geometry of the ends 20 of the electrodes can benefit from the ideas developed in the document EP0946709 to optimize the shape of the field lines. For example, arrow-shaped geometries are described to improve the stability of the cell dielectrophoretic trap. An example of a particular manufacturing process is illustrated in Figure 2b. Planar electrodes, consisting of a mixture of Cr / Cu (chromium / copper), are manufactured on transparent substrates (for example a glass slide) using a technique of deposition of standard layers (PVD) and photolithography as shown Figure 4 b). The function of the chromium layer is to promote adhesion. After spin-coating of the S1813 positive photoresist (Shipley), UV exposure is performed using a mask aligner (Karl Süss MJB21 type). The photosensitive resin is then developed with tetramethylammonium hydroxide (MF319). Finally, a chemical etching is carried out for Cu with a solution of sodium peroxodisulfate (Na2S2O8) and a physical etching for Cr. The electrode mask is designed and modifiable at will by electron beam lithography. In addition, the thickness of metal to ensure the proper operation of the device must be greater than 1 pm. The blanks of the electrodes must be perfectly perpendicular to the substrate so that the electric field lines are parallel to the substrate to a height sufficient to trap the cells. Alternatively, the active areas can be individually functionalized to help maintain intercellular contacts during the electrofusion process. Functionalization can be obtained by depositing, in the area between the electrodes, a gold deposit having a thickness of a few nanometers, which is then functionalized with a dilute protein solution such as bovine serum albumin (ABS). , or BSA in English) or ovalbumin (OVA). The gold layer is necessary, at least in the case of a silica substrate, because it has hydrophobic interactions, which is not the case of silica. Cells carrying anti-OVA or anti-X antibodies will bind in the functionalized area after addressing all cells. Then, by a simple rinsing or by addressing other electrodes, the cells that are not fixed are removed. Thus, only the cells of interest remain in the being of the electrodes, and may undergo treatment, for example (see Fig. 18) electrofusion with mutant myeloma cells. Such a method ensures that nearly 100% of the fused cells will produce anti-X antibodies. A dielectrophoretic trap network is illustrated in FIG. 5. This network is composed of five traps (references 10 to 14), each composed of four electrodes. Potential sources V11 to V45 are independent sources of potential. Another trap array is shown in Figure 7. It has two traps of 4 electrodes. In general, a trap network consists of at least two traps. According to the invention, each trap of a network has electrical terminals whose potentials can be addressed individually; a terminal can also be connected to a high impedance, so that the potential of the corresponding electrode is floating. In the context of the example of FIG. 5, 20 supply terminals are available and can be connected to 20 different electrical potentials. In the example of Figure 7, 8 terminals are available. Thus, each trap and each electrode of each trap can be electrically addressed individually. The advantage is therefore that each trap can perform sequential or parallel treatments on the same cell line or on different cell lines for comparison.

Un autre avantage de l'invention est que les mêmes électrodes assurent la manipulation cellulaire et le traitement cellulaire par champ électrique. Ceci permet d'augmenter le rendement de transfection cellulaire parce que le groupe de cellules manipulé est confiné dans une région de l'espace où le champ électrique est relativement significatif et homogène. En d'autres termes, toutes les cellules traitées sont regroupées dans un piège et peuvent, par suite, être manipulées. Le multiplexage entre les alimentations externes et un réseau de pièges est illustré dans la figure 6. Le multiplexeur est un module indépendant dont les bornes sont connectées aux bornes d'adressage des pièges diélectrophorétiques fabriquées sur le substrat. Le multiplexeur interconnecte alors des sources de potentiels électriques à une pluralité de pièges d'un réseau. Ceci permet d'adresser une pluralité de pièges avec une seule alimentation électrique, ou un seul ensemble d'alimentations électriques. Another advantage of the invention is that the same electrodes provide cellular manipulation and cellular treatment by electric field. This makes it possible to increase the cell transfection efficiency because the manipulated cell group is confined to a region of the space where the electric field is relatively significant and homogeneous. In other words, all the treated cells are pooled in a trap and can, therefore, be manipulated. The multiplexing between the external power supplies and a trap network is illustrated in FIG. 6. The multiplexer is an independent module whose terminals are connected to the addressing terminals of the dielectrophoretic traps fabricated on the substrate. The multiplexer then interconnects sources of electrical potentials to a plurality of traps of a network. This makes it possible to address a plurality of traps with a single power supply, or a single set of power supplies.

Selon une variante, le multiplexeur peut échanger les potentiels appliqués entre différents pièges. Cela permet, par exemple, de 13 déplacer des groupes de cellules entre différents pièges, comme d'écrit ci-dessous à l'occasion de la description de la figure 7. Selon une autre variante, le multiplexeur peut échanger les potentiels appliqués aux électrodes d'un piège. Cela permet, par exemple, d'homogénéiser l'électroporation, ou changer la forme du groupement de cellule, comme décrit ci-dessous. Selon une autre variante, le multiplexeur est commandé par un opérateur qui pilote par l'intermédiaire d'un programme informatique le déroulement de la manipulation cellulaire ou du traitement cellulaire. Cela permet d'ajuster le déroulement de la manipulation ou du traitement cellulaire. Selon une autre variante, le multiplexeur peut additionner les potentiels d'une pluralité de sources de potentiels et diriger le résultat sur une électrode particulière. Il peut par exemple additionner un signal continu avec un signal alternatif, ou encore additionner une pluralité de trains d'impulsions différentes. Selon une autre variante, le multiplexage applique des impulsions de potentiel aux électrodes à partir de sources de potentiel constant. Ceci permet de réaliser des impulsions à partir d'une source de tension continue partagée entre différents pièges. According to one variant, the multiplexer can exchange the potentials applied between different traps. This makes it possible, for example, to move groups of cells between different traps, as written below in connection with the description of FIG. 7. According to another variant, the multiplexer can exchange the potentials applied to the electrodes. of a trap. This makes it possible, for example, to homogenize the electroporation, or to change the shape of the cell group, as described below. According to another variant, the multiplexer is controlled by an operator who controls, via a computer program, the progress of the cellular manipulation or the cellular processing. This makes it possible to adjust the course of the manipulation or the cellular treatment. According to another variant, the multiplexer can add the potentials of a plurality of potential sources and direct the result on a particular electrode. It can for example add a continuous signal with an alternating signal, or add a plurality of different pulse trains. According to another variant, the multiplexing applies potential pulses to the electrodes from sources of constant potential. This allows pulses to be generated from a DC voltage source shared between different traps.

La manipulation de cellules, selon l'invention, consiste non seulement à piéger des cellules dans un piège diélectrophorétique, mais aussi à modifier les propriétés d'un groupement de cellules, sans altérer l'état des cellules elles même. En d'autres termes, la manipulation de cellules comprend des opérations visant à déplacer sur le substrat la position des groupes de cellules, visant à modifier le nombre de cellules qui sont dans un groupe, et visant à contrôler la forme d'un groupe de cellule. Ces différentes opérations ont pour intérêt d'améliorer le traitement cellulaire - comme la transfection par électroporation ou l'électrofusion, ou de permettre de gérer plusieurs groupements cellulaires sur un unique substrat. The manipulation of cells according to the invention consists not only of trapping cells in a dielectrophoretic trap, but also of modifying the properties of a group of cells, without altering the state of the cells themselves. In other words, the manipulation of cells includes operations to move the position of the cell groups on the substrate, aiming at modifying the number of cells that are in a group, and aimed at controlling the shape of a group of cells. cell. These different operations have the advantage of improving the cellular treatment - such as electroporation or electrofusion transfection, or to allow to manage several cell groups on a single substrate.

Le piégeage diélectrophorétique est avantageusement réalisé avec le dispositif décrit ci-dessus, notamment parce qu'il permet l'adressage 14 individuel de pièges. L'effet de diélectrophorèse dépend de la fréquence f des potentiels périodiques appliqués, de la durée d'excitation, de la valeur crête à crête du potentiel. De bons résultats sont typiquement obtenus avec une tension périodique (sinusoïdale ou carré) d'amplitude 5-10 V crête à crête et une gamme de fréquences autour du mégahertz. Il est important de noter que la fréquence de diélectrophorèse est propre à la lignée cellulaire. De plus, l'amplitude et la fréquence dépendent des paramètres du dispositif mis en oeuvre et du milieu physiologique utilisé. Ainsi, l'amplitude et la fréquence doivent être déterminées expérimentalement, par une étape dite de calibrage. Un avantage de l'invention est qu'en fonction de la durée du champ appliqué et de la valeur crête-crête du potentiel, le nombre de cellules biologiques introduites dans un piège peut être contrôlé à l'unité près à l'aide d'un microscope optique. Une fois que le champ cesse d'être appliqué, les cellules restent en position dans le piège. A titre d'exemple, pour adresser une centaine de cellules il faut en moyenne 2 à 3 minutes. Les cellules cessent presque instantanément de bouger lors de l'extinction du champ électrique et restent en place dans l'aire délimitée par les électrodes aussi longtemps qu'aucune action n'est exercée sur elles. The dielectrophoretic trapping is advantageously carried out with the device described above, in particular because it allows the individual addressing of traps. The effect of dielectrophoresis depends on the frequency f of the applied periodic potentials, the excitation duration, the peak-to-peak value of the potential. Good results are typically obtained with a periodic voltage (sinusoidal or square) of amplitude 5-10 V peak-to-peak and a frequency range around the megahertz. It is important to note that the frequency of dielectrophoresis is specific to the cell line. In addition, the amplitude and the frequency depend on the parameters of the device used and the physiological medium used. Thus, the amplitude and the frequency must be determined experimentally, by a so-called calibration step. An advantage of the invention is that depending on the duration of the applied field and the peak-to-peak value of the potential, the number of biological cells introduced into a trap can be controlled to the nearest unit with the help of an optical microscope. Once the field ceases to be applied, the cells remain in position in the trap. By way of example, to address a hundred cells it takes on average 2 to 3 minutes. The cells almost instantly stop moving when the electric field is extinguished and remain in the area bounded by the electrodes as long as no action is taken on them.

Le déplacement d'un groupement de cellules est illustré dans la figure 7. Lors de cette opération, des cellules en solution (insert a) sont d'abord piégées (insert b). Pour cela, les électrodes du piège de droite sont excitées par des potentiels électriques oscillants. Le potentiel peut être maintenu ou non : sans champ, les cellules restent en position pendant un moment. Ensuite, ce sont les électrodes de gauche qui sont excitées, tout en connectant les électrodes de droite à la masse, ou en les laissant à un potentiel flottant. Comme le montre la flèche de l'insert c, les cellules se sont déplacées. Cette méthode permet de déplacer des groupes de cellules sur un substrat entre plusieurs régions. Ceci permet aussi de réaliser des calibrages préalables dans des conditions comparables. Ceci permet de plus de traiter plusieurs de groupes de cellules sur un même substrat. L'avantage de ce 15 dernier point est qu'il permet de diviser le nombre total de cellules à traiter en groupes peu peuplés, ce qui améliore les rendements d'électroporation et d'électrofusion. Selon une variante, un groupement de cellules est déplacé entre une pluralité de pièges. Selon encore une autre variante, une pluralité de groupements de cellules sont déplacés entre une pluralité de pièges. Ces méthodes ont l'avantage de permettre d'isoler et de déplacer plusieurs groupes de cellules entre une pluralité de sites d'un substrat où peuvent être réalisés différents traitement cellulaire, séquentiellement ou simultanément. The displacement of a group of cells is illustrated in FIG. 7. During this operation, cells in solution (insert a) are first trapped (insert b). For this, the electrodes of the right trap are excited by oscillating electric potentials. The potential can be maintained or not: without a field, the cells remain in position for a moment. Then, the left electrodes are excited, while connecting the right electrodes to ground, or leaving them at a floating potential. As shown by the arrow of the insert c, the cells moved. This method makes it possible to move groups of cells on a substrate between several regions. This also makes it possible to carry out prior calibrations under comparable conditions. This also makes it possible to treat several groups of cells on the same substrate. The advantage of this last point is that it makes it possible to divide the total number of cells to be treated into sparsely populated groups, which improves the electroporation and electrofusion efficiencies. According to one variant, a group of cells is moved between a plurality of traps. According to yet another variant, a plurality of cell groups are moved between a plurality of traps. These methods have the advantage of allowing to isolate and move several groups of cells between a plurality of sites of a substrate where different cell processing can be performed, sequentially or simultaneously.

Selon une autre variante, un groupement de cellules est déplacé pour diminuer le nombre de cellules le peuplant. Le contrôle du nombre de cellule dans un piège est illustré dans la figure 8. L'insert a) montre un piège d'une plus grande taille que celui de l'insert b), leurs tailles respectives sont en effet de 300 pm2 et de 150 pm2. 15 Plus le piège est petit, plus le nombre de cellules piégées par diélectrophorèse est faible. Dans l'insert a), un piège peuplé de quelques unités de cellules est obtenu. Un piège peuplé d'une unique cellule est obtenu dans l'insert b). Un contrôle non destructif simultané, par exemple au moyen d'un microscope optique facilite le contrôle de cette étape de procédé. 20 Le dispositif est adaptable sur des platines de microscope à champ proche pour l'imagerie cellulaire haute résolution en vue de faciliter significativement la localisation et la stabilité des objets à observer. On entend par « microscope à champ proche » tout appareillage pour la mise en oeuvre d'une technique de microscopie à sonde locale, comme la microscopie 25 optique en champ proche, la microscopie à force atomique, etc. Selon une variante, le nombre de cellules piégées est contrôlé en ajustant la durée d'application des potentiels permettant le piégeage diélectrophorétique. Plus les potentiels sont appliqués longtemps, plus le groupement de cellules piégées est peuplé. Un contrôle au microscope 30 optique ou au microscope à champ proche améliore la maîtrise de cette méthode. 16 Le contrôle de la forme d'un groupement de cellule est illustré dans la figure 9. Une réalisation avantageuse de l'invention consiste à avoir au moins 4 électrodes, et que ces électrodes soient symétriques deux à deux, c'est-à-dire que leurs extrémités forment un parallélogramme. Il est ainsi possible de contrôler la localisation des extrema de champ électrique soit aux somment du parallélogramme, soit au centre du parallélogramme. Ceci est simplement réalisé en échangeant l'adressage électrique des potentiels appliqués, éventuellement à l'aide d'un multiplexeur. Par exemple, dans la figure 9, le piège est constitué de 4 électrodes, et les extrémités des électrodes forment un losange. Dans l'insert a), les deux électrodes de gauche sont adressées avec un potentiel positif et les deux électrodes de droite avec un négatif. Dans ce cas, le minimum de champ électrique se situe selon l'axe de symétrie horizontal (selon 22, 25 et 24). Comme la diélectrophorèse est négative, les cellules du groupement piégé tendent alors à s'aligner selon cet axe. Dans l'insert b), les potentiels positifs et négatifs sont adressés respectivement sur les électrodes se faisant face. Dans ce cas, le minimum de champ électrique est localisé au centre 25 du losange (et le maximum en 21, 24, 23 et 22), tout comme le groupement de cellule. Au final, la modification de l'adressage entre les inserts a) et b) 20 permet une modification de la forme du groupement de cellules. Ceci est avantageusement réalisé à l'aide d'un multiplexeur. Selon une variante, le nombre de cellules et la forme d'un groupement piégé sont tous les deux contrôlés de sorte que les cellules sont alignées. Un exemple est illustré dans la figure 10. Un tel alignement permet 25 de contrôler un nombre plus réduit de cellules et donc, soit de gérer moins de cellules pour l'électroporation (dans le cas de cellules difficilement transfectables), soit de mieux contrôler les contactes cellulaires dans le cas de l'électrofusion. Le tri des cellules peut être réalisé au moyen du déplacement 30 entre des pièges. Différentes cellules ayant différents facteurs de Clausius- Mossotti au sein d'un piège répondent différemment à une étape de 17 déplacement cellulaire : certaines sont déplacées d'autres non. Ceci réalise un tri cellulaire séparant donc des cellules différentes ayant des propriétés physiques différentes. Le traitement cellulaire par champ électrique comprend 5 plusieurs opérations différentes qui sont résumées dans la figure 1. L'électroporation - un champ électrique de l'ordre du kV/cm appliqué à une cellule rend sa membrane perméable ou poreuse - est un effet précurseur de la lyse, la transfection ou la fusion cellulaire. L'électroporation peut être réalisée par un train d'impulsions 10 de potentiel appliqué aux électrodes. Une forme d'onde de potentiel en train d'impulsions est montrée dans la figure 11. Les impulsions sont caractérisées par une amplitude V, une durée ti et un taux de répétition. Par exemple, des impulsions d'une durée de 0,1 s et de 10 V 15 ayant une répétition de 10 s permettent une électroporation suffisante de cellules U937 pour introduire (c'est-à-dire réaliser une transfection) de molécules ayant une taille de l'ordre de deux nanomètres. La durée des impulsions a un effet sur la taille des pores induits par électroporation, comme illustré dans la figure 12. L'efficacité de la 20 transfection est mesurée par microscopie confocale : des molécules introduites dans les cellules fluorescent et révèlent que les pores étaient assez grands pour permettre leur introduction. Pour une impulsion de durée courte, les pores sont fermés : il existe un seuil de durée. Au dessus de ce seuil, le diamètre des pores s'ouvre sensiblement linéairement avec la durée, 25 à tension constante. A durée constante (et répétition constante), le diamètre évolue aussi sensiblement linéairement avec la tension au dessus d'un seuil. En fait, plus généralement, le diamètre des électropores est sensiblement proportionnel au produit durée * amplitude (V* -c) des impulsions, au dessus d'un seuil, et pour un taux de répétition fixé. 30 La détection des cellules ayant subi une électroporation par microscopie confocale est essentiellement utilisée en phase de calibrage et 18 vérification. Au cours de cette phase de calibrage, on mesure également le courant qui circule entre les électrodes ; initialement, ce courant est nul ou très faible, puis il augmente au fur et à mesure que des pores s'ouvrent. Ainsi, par la suite, il devient possible de contrôler le déroulement de l'électroporation 5 et/ou de l'électrofusion simplement au moyen de mesures électriques de tension et de courant, par des moyens de mesure conventionnels. La lyse cellulaire se produit pour des durées ou des amplitudes trop élevées. Par exemple, la figure 13 montre des cellules dont la membrane est irréversiblement altérée. Ces cellules sont marquées par un 10 cercle. Le calibrage de la forme d'onde des potentiels à appliquer pour réaliser le traitement cellulaire par champ électrique est une étape importante et délicate parce qu'il dépend de la géométrie des électrodes, des propriétés du milieu physiologique, et des propriétés du groupement de 15 cellules plongé dans le champ électrique. Le dispositif décrit plus tôt offre des conditions optimisées. Pour réaliser le calibrage, une méthode consiste à déterminer le seuil d'électroporation et de lyse du produit V* t, pour lesquels, respectivement, le diamètre 4pores des pores s'ouvrent et conduisent à la lyse, comme illustré dans l'insert a) de la figure 14. 20 Un exemple est montré dans l'insert b) de la figure 14. La survie des cellules est observée au microscope optique. Le rendement de transfection peut-être mesuré en microscopie confocale par fluorescence d'objets introduits dans les cellules. Cette méthode détermine une gamme de durée pour laquelle le rendement de transfection est conséquent (au-delà de 25 31) tout en limitant la lyse cellulaire (en deçà de 32). Les formes d'ondes des potentiels électriques sont ainsi calibrées pour améliorer le rendement de transfection tout en minimisant la lyse cellulaire. Selon une variante, cette étape pourra être avantageusement réalisée sur plusieurs groupes de cellules piégées et adressés 30 individuellement sur le même substrat, optimisant donc la reproductibilité des conditions d'électroporation entre plusieurs groupes de cellules. 19 Selon une autre variante, le train d'impulsions de potentiel appliqué pour réaliser le traitement cellulaire comporte des impulsions d'amplitudes de moins en moins fortes. Ceci est illustré dans la figure 15. L'avantage est de diminuer l'effet de lyse cellulaire. According to another variant, a group of cells is moved to reduce the number of cells populating it. The control of the number of cells in a trap is illustrated in FIG. 8. The insert a) shows a trap of a larger size than that of the insert b), their respective sizes are in fact 300 μm 2 and 150 pm2. The smaller the trap, the lower the number of cells trapped by dielectrophoresis. In insert a), a trap populated with a few cell units is obtained. A trap populated with a single cell is obtained in the insert b). Simultaneous non-destructive testing, for example by means of an optical microscope, facilitates the control of this process step. The device is adaptable to near-field microscope stages for high resolution cellular imaging in order to significantly facilitate the location and stability of objects to be observed. The term "near-field microscope" means any apparatus for the implementation of a local probe microscopy technique, such as near-field optical microscopy, atomic force microscopy, etc. According to one variant, the number of trapped cells is controlled by adjusting the duration of application of the potentials for dielectrophoretic trapping. The longer the potentials are applied, the more the trapped cell cluster is populated. Optical microscope or near-field microscope control improves control of this method. The control of the shape of a cell group is illustrated in FIG. 9. An advantageous embodiment of the invention consists in having at least 4 electrodes, and that these electrodes are symmetrical two by two, that is to say say that their extremities form a parallelogram. It is thus possible to control the location of the electric field extrema either at the top of the parallelogram or at the center of the parallelogram. This is simply done by exchanging the electrical addressing of the applied potentials, possibly using a multiplexer. For example, in Figure 9, the trap consists of 4 electrodes, and the ends of the electrodes form a diamond. In insert a), the two electrodes on the left are addressed with a positive potential and the two electrodes on the right with a negative. In this case, the minimum electric field is located along the horizontal axis of symmetry (according to 22, 25 and 24). Since the dielectrophoresis is negative, the cells of the trapped group then tend to align along this axis. In the insert b), the positive and negative potentials are addressed respectively on the electrodes facing each other. In this case, the minimum electric field is located at the center of the diamond (and the maximum at 21, 24, 23 and 22), just like the cell group. Finally, the modification of the addressing between inserts a) and b) allows a modification of the shape of the cell group. This is advantageously achieved using a multiplexer. Alternatively, the number of cells and the shape of a trapped group are both controlled so that the cells are aligned. An example is illustrated in FIG. 10. Such an alignment makes it possible to control a smaller number of cells and thus either to manage fewer cells for electroporation (in the case of cells that are difficult to transfect) or to better control the cell contact in the case of electrofusion. Cell sorting can be accomplished by moving between traps. Different cells having different Clausius-Mossotti factors within a trap respond differently to a cell displacement step: some are displaced others not. This performs cell sorting thus separating different cells having different physical properties. Cellular electric field treatment comprises several different operations which are summarized in FIG. 1. Electroporation - an electric field of the order of kV / cm applied to a cell renders its membrane permeable or porous - is a precursor effect of lysis, transfection or cell fusion. Electroporation can be performed by a pulse train of potential applied to the electrodes. A potential pulse waveform is shown in Figure 11. The pulses are characterized by an amplitude V, a duration ti and a repetition rate. For example, 0.1 s and 10 V pulses having a repetition of 10 s allow sufficient electroporation of U937 cells to introduce (i.e., perform transfection) size of the order of two nanometers. The duration of the pulses has an effect on the pore size induced by electroporation, as shown in FIG. 12. The efficiency of the transfection is measured by confocal microscopy: molecules introduced into the fluorescent cells and reveal that the pores were sufficiently great to allow their introduction. For a pulse of short duration, the pores are closed: there is a threshold of duration. Above this threshold, the pore diameter opens substantially linearly with the duration 25 at constant voltage. At constant duration (and constant repetition), the diameter also changes substantially linearly with the voltage above a threshold. In fact, more generally, the diameter of the electropores is substantially proportional to the product duration * amplitude (V * -c) of the pulses, above a threshold, and for a fixed rate of repetition. The detection of cells electroporated by confocal microscopy is essentially used in the calibration and verification phase. During this calibration phase, the current flowing between the electrodes is also measured; Initially, this current is zero or very weak, then it increases as pores open. Thus, subsequently, it becomes possible to control the progress of electroporation and / or electrofusion simply by means of electrical measurements of voltage and current by conventional measuring means. Cell lysis occurs for too long durations or amplitudes. For example, Figure 13 shows cells whose membrane is irreversibly altered. These cells are marked with a circle. The calibration of the waveform of the potentials to be applied to carry out the electric field cell treatment is an important and delicate step because it depends on the geometry of the electrodes, the properties of the physiological medium, and the properties of the cell group. cells immersed in the electric field. The device described earlier offers optimized conditions. To carry out the calibration, a method consists in determining the threshold of electroporation and lysis of the product V * t, for which, respectively, the diameter 4pores of the pores open and lead to the lysis, as illustrated in the insert a Fig. 14. An example is shown in insert b) of Fig. 14. The survival of the cells is observed under an optical microscope. The transfection yield can be measured by fluorescence confocal microscopy of objects introduced into the cells. This method determines a range of time for which the transfection yield is consistent (beyond 31) while limiting cell lysis (below 32). The waveforms of the electrical potentials are thus calibrated to improve the transfection efficiency while minimizing cell lysis. According to one variant, this step may advantageously be carried out on several groups of cells trapped and individually addressed on the same substrate, thus optimizing the reproducibility of the electroporation conditions between several groups of cells. According to another variant, the pulse train of potential applied to carry out the cellular processing comprises pulses of smaller and smaller amplitudes. This is illustrated in Figure 15. The advantage is to decrease the cell lysis effect.

Selon une autre variante, le train d'impulsions de potentiel appliqué pour réaliser le traitement cellulaire comporte des impulsions d'amplitudes positives et négatives, comme illustré dans l'insert b) de la figure 16. L'avantage est d'homogénéiser les tailles des pores des cellules entre la cathode et l'anode. En effet, lorsque des impulsions d'une unique polarité sont appliquées, les cellules sont préférentiellement perméabilisées près de la l'anode. Ceci est illustré dans l'insert a) de la figure 16 qui montre que la fluorescence des cellules proches de l'anode est plus forte. L'application d'impulsions positives et négatives améliore le rendement d'électroporation tout en minimisant la lyse cellulaire (homogénéisation de l'électroporation). According to another variant, the potential pulse train applied to carry out the cellular processing comprises pulses of positive and negative amplitudes, as illustrated in the insert b) of FIG. 16. The advantage is to homogenize the sizes pores of the cells between the cathode and the anode. Indeed, when pulses of a single polarity are applied, the cells are preferentially permeabilized near the anode. This is illustrated in the insert a) of Figure 16 which shows that the fluorescence of the cells near the anode is stronger. The application of positive and negative pulses improves the efficiency of electroporation while minimizing cell lysis (homogenization of electroporation).

Un autre avantage du calibrage de la forme d'onde des impulsions électriques est qu'il est possible de réaliser la transfection de cellules par des molécules de tailles variables. Par exemple, la figure 17 montre la mesure par fluorescence d'une transfection par des molécules d'un diamètre de l'ordre de 50 nrn. Another advantage of the calibration of the waveform of the electrical pulses is that it is possible to perform the transfection of cells with molecules of varying sizes. For example, Figure 17 shows the fluorescence measurement of a transfection by molecules of a diameter of the order of 50 nrn.

La concentration ionique du milieu de culture des cellules peut être ajustée par l'ajout d'ions (par exemple : ions Na+, K+...) pour augmenter l'efficacité d'électroporation ou d'électrofusion. En effet, le milieu physiologique contenant les cellules, influe sur le potentiel transmembranaire (DDP) de la cellule. Il a été montré que ce potentiel transmembranaire doit être en valeur absolue supérieur à 50 mV. Aussi, si l'application d'impulsions ne permet pas d'atteindre le seuil de perméabilité de la membrane, la concentration d'ions peut être augmentée afin d'atteindre une valeur de potentiel transmembranaire supérieur à celui de la membrane cellulaire. Un autre avantage du dispositif pour l'électroporation, est l'utilisation de faibles potentiels appliqués minimisant les effets thermiques, 20 usuellement présent dans les dispositifs classiques, et garantissant la viabilité des cellules après électroporation. Un autre avantage est que la combinaison de ces différentes manipulations - déplacement, groupement d'un nombre faible de cellule, optimisation de la forme du groupe - avec le calibrage décrit ci-dessus permet d'obtenir un rendement d'électroporation proche de 100%. Un autre avantage de l'invention est que la miniaturisation du dispositif et sa réalisation par des techniques de nano- et micro-fabrication autorisent son implantation au sein d'un système de diagnostique. The ionic concentration of the culture medium of the cells can be adjusted by the addition of ions (for example: Na +, K + ions) to increase the efficiency of electroporation or electrofusion. Indeed, the physiological medium containing the cells affects the transmembrane potential (DDP) of the cell. It has been shown that this transmembrane potential must be in absolute value greater than 50 mV. Also, if the application of pulses does not make it possible to reach the threshold of permeability of the membrane, the concentration of ions can be increased in order to reach a value of transmembrane potential greater than that of the cell membrane. Another advantage of the device for electroporation is the use of low applied potentials minimizing thermal effects, usually present in conventional devices, and ensuring cell viability after electroporation. Another advantage is that the combination of these different manipulations - displacement, grouping of a small number of cells, optimization of the shape of the group - with the calibration described above makes it possible to obtain an electroporation efficiency close to 100%. . Another advantage of the invention is that the miniaturization of the device and its implementation by nano- and micro-manufacturing techniques allow its implementation within a diagnostic system.

L'électrofusion cellulaire, comme l'électroporation cellulaire, bénéficie des étapes de procédé de manipulation cellulaire précitée. En particulier, l'efficacité de l'électrofusion s'améliore en diminuant le nombre de cellules par groupe, en les alignant, en assurant le contact entre les membranes des cellules au sein d'un groupe, et calibrant des impulsions de potentiels suffisamment fortes tout en limitant la lyse. De préférence, l'électrofusion est réalisée avec un groupement ayant une forme de ligne comme illustré dans la figure 9 a). Par exemple, l'électrofusion selon l'invention peut être mise en oeuvre pour réaliser l'électrofusion de cellules immortelles de myélomes dépourvues de HGPRT (SP2) et des cellules normales de rates. Ce procédé est illustré dans la figure 18. On injecte d'abord de l'antigène X à une souris. Puis on extrait des cellules dans la rate qui fabriquent un anticorps contre cet antigène X, pour les fusionner avec des cellules mutantes de myélome de souris. Ces dernières peuvent croître sur un milieu HAT (Hypoxanthine Aminopterine Thymidine). Grâce au procédé de manipulation et d'électrofusion décrit dans la présente demande, les cellules mutantes et les cellules ayant un anticorps sont fusionnées. Ces cellules ainsi fusionnées peuvent ainsi croitre sur un milieu HAT. On peut alors ensuite procéder à une recherche de l'anticorps dirigé contre l'antigène X. 21 Cell electrofusion, like cellular electroporation, benefits from the aforementioned cellular manipulation process steps. In particular, the efficiency of the electrofusion improves by decreasing the number of cells per group, aligning them, ensuring the contact between the membranes of the cells within a group, and calibrating pulses of sufficiently strong potentials. while limiting the lysis. Preferably, the electrofusion is performed with a group having a line shape as shown in Figure 9 a). For example, the electrofusion according to the invention can be implemented to perform the electrofusion of immortal cells of myeloma lacking HGPRT (SP2) and normal spleen cells. This process is illustrated in Figure 18. X antigen is first injected into a mouse. Spleen cells that produce an antibody against this X antigen are then extracted for fusion with mutant mouse myeloma cells. These can grow on HAT medium (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine). By the manipulation and electrofusion method described in the present application, the mutant cells and the cells having an antibody are fused. These cells thus merged can grow on a HAT medium. We can then proceed to a search for the antibody directed against the X antigen.

Claims

REVENDICATIONS1. A method of manipulating and treating cells by an electric field comprising a step of trapping cells in a dielectrophoretic trap array having microfabricated electrodes on a substrate, and a cell treatment step by an electric field applied by the traps electrodes, and characterized in that said traps have electrical addressing which is individual.

2. Method according to the preceding claim comprising a multiplexing potentials applied to the traps electrodes.

3. Method according to one of the preceding claims, wherein the cellular manipulation comprises a modification of the electrical addressing to control the shape of a cell group.

The method of claim 3 wherein the cellular manipulation comprises a cell alignment step.

5. Method according to one of the preceding claims, wherein the cellular manipulation comprises a displacement of cells between a plurality of traps.

Method according to one of the preceding claims, wherein the cellular manipulation comprises an adjustment of the number of cells trapped in a trap by means of a control of the duration of the applied dielectrophoretic field, and / or a control of its peak-to-peak value. , and / or optical microscope, and / or trap size adjustment.

7. Method according to one of the preceding claims, wherein the cellular treatment comprises the electroporation of cells. 22. The method of claim 7 comprising a step of calibrating the product duration * amplitude of the potential pulses that are applied to perform the cellular treatment by electric field. The method of claims 7 or 8 wherein the electroporation is performed by a plurality of pulses that have positive and negative amplitudes. The method of one of claims 7 to 9 including a step of adjusting the ion concentration to control the pore size of the cells during electroporation. 11. Method according to one of the preceding claims, wherein the cellular treatment comprises the transfection of cells. 12. Method according to one of the preceding claims, wherein the cell treatment comprises electrofusion of cells. 13. Method according to one of the preceding claims, wherein the manipulation or the cellular treatment comprises a control of the state of the cells by near-field microscopy. 14. Method according to one of the preceding claims, in which the manipulation or the cellular treatment comprises a control of the state of the cells with a transmission optical microscope thanks to the implementation of a transparent substrate. 15. Method according to one of the preceding claims, in which the cellular manipulation or treatment comprises a control of the state of the cells by measuring a current between the electrodes. An apparatus for manipulating and treating cells by an electric field comprising a dielectrophoretic trap array having electrodes, the ends of which are less than one millimeter in size, on a substrate, and characterized in that the traps have an electrical addressing 5 which is individual. 17. Device according to claim 16 comprising a multiplexer connected to the electrodes of the traps. 18. Device according to one of claims 16 or 17 wherein the ends of the electrodes of a trap arrange along the sides of a parallelogram. 19. Apparatus according to one of claims 16 to 18 comprising a near-field microscope for monitoring the state of the cells in the traps. 20. Device according to one of claims 16 to 19 wherein the substrate is transparent. 21. Device according to one of claims 16 to 20 comprising means for measuring the current flowing between the electrodes. 22. The device according to one of claims 16 to 21 comprising an aqueous solution and a means of controlling its concentration of ions to adjust the kinetics of the cell treatment by electric field. 24