FR2986133A1

FR2986133A1 - Device, useful for preserving corneal sample, comprises arrangements that present reception and imprisonment units sealingly trap flange of sclera that surrounds cornea to separately delimit endothelial and epithelial chambers

Info

Publication number: FR2986133A1
Application number: FR1250832A
Authority: FR
Inventors: Philippe Gain; Gilles Thuret; Acquart Sophie Laverne; Sebastien Soubaigne
Original assignee: Francais du Sang Ets; Universite Jean Monnet Saint Etienne; Ecole Nationale dIngenieurs de Saint Etienne ENISE
Current assignee: Francais du Sang Ets; Universite Jean Monnet Saint Etienne; Ecole Nationale dIngenieurs de Saint Etienne ENISE
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2012-01-30
Publication date: 2013-08-02
Anticipated expiration: 2032-01-30
Also published as: FR2986133B1

Abstract

Device for preserving a corneal sample, comprises units for receiving and imprisonment of a corneal sample (3), fixed with a unit for creating a pressure gradient with overpressure of an endothelial side and with a unit for circulating a preservation liquid in arrangements that present the reception and imprisonment units. The arrangements presenting the reception and imprisonment units sealingly trap a flange of sclera that surrounds cornea to separately delimit an endothelial chamber and an epithelial chamber in which the liquid circulates with the overpressure in the endothelial chamber.

Description

- 1 - L'invention se rattache au secteur technique des dispositifs médicaux destinés soit à la conservation longue durée d'une cornée, en vue d'une greffe notamment, soit à l'expérimentation ex vivo sur cornée humaine ou animale. The invention relates to the technical field of medical devices intended either for the long-term preservation of a cornea, with a view to a graft in particular, or to ex vivo experimentation on human or animal cornea.

Selon l'état de la technique, les greffons cornéens sont conservés dans le monde principalement de deux façons : soit à +4°C pendant une courte durée (maximum 10 jours) dans une technique appelée « conservation à froid (cold storage) », soit selon la technique dite d'organoculture à une température allant de +31°C à +37°C. L'organoculture utilise un milieu nutritif dérivé des milieux de culture cellulaire qui permet une conservation de longue durée, jusqu'à cinq semaines. Il s'agit d'une technique séquentielle comprenant une première partie pendant laquelle la cornée devient oedémateuse (son épaisseur double, passant de 500-600 !am à 1000-1200 !am) et se plisse au niveau de sa face postérieure, et une seconde partie durant de 12 à 72 heures pendant laquelle le greffon est immergé dans le même milieu d'organoculture mais additionné d'une macromolécule (Dextran T500 ou poloxamer 188) qui exerce une déturgescence du greffon pour réduire son épaisseur et diminuer le plissement postérieur juste avant la greffe. Dans ces deux techniques les greffons sont immergés soit dans de simples flacons de verre ou de matière plastique dans lesquels la cornée est libre, soit dans des boites où la cornée est partiellement immobilisée dans une cage ou un panier (tel un étuis de lentille de contact). Dans les deux cas, il n'y a ni circulation de milieu de conservation, ni maintien d'un gradient de pression de part et d'autre de la cornée. Or, pour être conservé de façon optimale, le greffon doit l'être dans des conditions similaires à celles rencontrées dans son environnement 30 physiologique. Les paramètres physiologiques à reproduire sont notamment - 2 - ceux de la chambre antérieure de l'oeil, à savoir, une pression intra-oculaire qui est de l'ordre de 18 millimètres de mercure (mmHg) et une température de l'ordre de 31 à 37° C par exemple pour un oeil humain, et une circulation d'un liquide de conservation de la cornée à la fois du coté endothélial (mimant le renouvellement permanent de l'humeur aqueuse) et du coté épithélial (mimant la circulation permanente des larmes). Si ces conditions ne sont pas reproduites, les cellules de la cornée meurent de façon accélérée en particulier dans les zones de plis postérieurs et le stroma cornéen devient oedémateux et perd temporairement sa transparence. According to the state of the art, the corneal grafts are conserved in the world mainly in two ways: either at + 4 ° C for a short time (maximum 10 days) in a technique called "cold storage", either according to the so-called organoculture technique at a temperature ranging from + 31 ° C to + 37 ° C. Organoculture uses a nutrient medium derived from cell culture media that allows long-term storage up to five weeks. This is a sequential technique comprising a first part during which the cornea becomes oedematous (its double thickness, from 500-600 μm to 1000-1200 μm) and folds at its posterior surface, and second part during 12 to 72 hours during which the graft is immersed in the same organoculture medium but added with a macromolecule (Dextran T500 or poloxamer 188) which exerts a deturgescence of the graft to reduce its thickness and reduce posterior folding right before the transplant. In both these techniques, the grafts are immersed either in simple glass or plastic bottles in which the cornea is free, or in boxes where the cornea is partially immobilized in a cage or basket (such as a contact lens case). ). In both cases, there is no circulation of preservation medium, nor maintenance of a pressure gradient on either side of the cornea. However, to be optimally conserved, the graft must be kept in conditions similar to those encountered in its physiological environment. The physiological parameters to be reproduced are in particular those of the anterior chamber of the eye, namely, an intraocular pressure which is of the order of 18 millimeters of mercury (mmHg) and a temperature of the order of 31 to 37 ° C for example for a human eye, and a circulation of a corneal conservation fluid both on the endothelial side (mimicking the permanent renewal of the aqueous humor) and on the epithelial side (mimicking the permanent circulation tears). If these conditions are not reproduced, the corneal cells die in an accelerated manner especially in the posterior fold zones and the corneal stroma becomes edematous and temporarily loses its transparency.

Le brevet américain US 5,789,240 décrit un dispositif de montage de cornées simulant la chambre antérieure de l'oeil. Ce dispositif permet de reproduire les paramètres de pression intra-oculaire, de température et de circulation de liquide intraoculaire mais est destiné uniquement à l'expérimentation de laboratoire pour réaliser des tests de pénétration de médicaments. Ce dispositif ne permet pas la conservation des greffons cornéens avant une greffe de cornée chez un patient. En particulier, il ne permet pas une circulation stérile du liquide conservateur sur les deux côtés de la cornée, c'est-à-dire, à la fois du côté épithélial et endothélial. Il n'est pas transparent de part en part pour permettre une analyse de la cornée sans ouvrir le dispositif. Ainsi la durée de survie de la cornée est obligatoirement courte et incompatible avec une utilisation pour une greffe de cornée. Le brevet français 2944185 décrit une « chambre de perfusion » pour cornée destinée à être en position verticale uniquement, pour mimer l'écoulement des larmes. Cette chambre de perfusion est destinée elle aussi à l'expérimentation de laboratoire, notamment aux études de toxicité précliniques mais pas à la conservation des greffons cornéens avant greffe. Elle comporte un compartiment endothélial destiné à être rempli de gel pour maintenir la forme de la cornée mais ne comporte pas de circulation de - 3 - liquide nutritif du coté endothélial. Elle ne comporte pas de système de maintien d'un gradient de pression de part et d'autre de la cornée. Elle n'est pas transparente de part en part. US Pat. No. 5,789,240 discloses a cornea mounting device simulating the anterior chamber of the eye. This device makes it possible to reproduce intraocular pressure, temperature and intraocular fluid circulation parameters but is intended only for laboratory experimentation to perform drug penetration tests. This device does not allow the preservation of corneal grafts before a corneal transplant in a patient. In particular, it does not allow sterile circulation of the preservative fluid on both sides of the cornea, i.e., both epithelial and endothelial. It is not transparent right through to allow an analysis of the cornea without opening the device. Thus the survival time of the cornea is necessarily short and incompatible with use for a corneal transplant. French Patent 2944185 describes a "perfusion chamber" for cornea intended to be in a vertical position only, to mimic the flow of tears. This perfusion chamber is also intended for laboratory experimentation, especially for preclinical toxicity studies but not for preservation of corneal grafts before grafting. It has an endothelial compartment intended to be filled with gel to maintain the shape of the cornea but does not include nutrient fluid circulation on the endothelial side. It does not include a system for maintaining a pressure gradient on either side of the cornea. It is not transparent from one side to the other.

L'article du British Journal of Ophthalmology 2001;85:450-3 «A simple corneal perfusion chamber for drug penetration and toxicity studies» divulgue une chambre en polycarbonate développée pour recevoir une cornée humaine mais a été testée uniquement avec des cornée de cochons et de chats. Elle comprend une circulation en circuit fermé du liquide mis en mouvement par une pompe péristaltique. Le maintien d'un gradient de pression de 18 mmHg est obtenu par gravité (flacon contenant le liquide de perfusion mis en hauteur). L'épithélium cornéen est en contact avec l'air et le compartiment épithélial n'est pas étanche. Elle n'est pas transparente de part en part. Cette chambre de perfusion n'est pas non plus destinée à la conservation des prélèvements cornéens avant greffe De plus aucun des dispositifs de l'art antérieur ne permettent d'applanir la cornée pour permettre la réalisation d'usinage LASER du tissu cornéen ou de faciliter l'observation des cellules endothéliales sur une surface plane. Dans l'état de l'art actuel, les cornées sont découpées au LASER femtoseconde sur des supports spécifiques qui ne sont pas ceux aptes à assurer la conservation des greffons. Dans l'état de l'art antérieur, les greffons doivent être extraits de leur milieu de conservation, placés manuellement sur un support spécifique exposé à l'air libre et placés ensuite sous le système de découpe LASER. Pour aplanir la cornée, il est nécessaire d'utiliser un autre dispositif rattaché au LASER lui même et non pas au support du prélèvement cornéen. Enfin, aucun des dispositifs de l'art antérieur ne revendique la possibilité de réalisation d'une thérapie cellulaire du greffon.30 - 4 - Concernant l'utilisation des dispositifs de l'art antérieur pour l'expérimentation ex vivo portant sur la pénétration de molécules et les études de toxicité, aucun ne réunit les caractéristiques suivantes : permettre la conservation de façon stérile des cornées humaines ou animales sur le très long terme (plusieurs semaines), comporter un gradient de pression du coté endothélial, comporter une circulation de liquide des deux cotés de la cornée, être transparent de part en part, avoir un dispositif d'applanation de la cornée. The British Journal of Ophthalmology 2001: 85: 450-3 "A simple corneal perfusion chamber for drug penetration and toxicity studies" discloses a polycarbonate chamber developed to receive a human cornea but has been tested only with pig cornea and of cats. It comprises a closed circuit circulation of the liquid set in motion by a peristaltic pump. The maintenance of a pressure gradient of 18 mmHg is obtained by gravity (vial containing the perfusion fluid raised). The corneal epithelium is in contact with the air and the epithelial compartment is not waterproof. It is not transparent from one side to the other. This perfusion chamber is also not intended for the preservation of corneal specimens before grafting. Furthermore, none of the devices of the prior art allow the cornea to be made to applaud to allow LASER machining of the corneal tissue to be performed or to facilitate the observation of endothelial cells on a flat surface. In the current state of the art, the corneas are cut at the femtosecond LASER on specific supports that are not those able to ensure the preservation of the grafts. In the state of the prior art, the grafts must be extracted from their preservation medium, placed manually on a specific support exposed to the open air and then placed under the LASER cutting system. To flatten the cornea, it is necessary to use another device attached to the LASER itself and not to support the corneal removal. Finally, none of the devices of the prior art claims the possibility of carrying out a graft cell therapy. Concerning the use of the devices of the prior art for ex vivo experimentation on the penetration of molecules and toxicity studies, none has the following characteristics: allow the sterile preservation of human or animal corneas over the very long term (several weeks), have a pressure gradient on the endothelial side, include a liquid circulation of two sides of the cornea, be transparent from side to side, have a corneal applanation device.

L'invention s'est fixée pour but de remédier à ces inconvénients d'une manière simple, sûre, efficace et rationnelle. Le problème que se propose de résoudre l'invention est donc de réaliser un dispositif de conservation longue durée d'une cornée humaine qui permette : - une circulation stérile d'un liquide de conservation des deux côtés de la cornée, en créant un gradient de pression entre les deux cotés de la cornée avec une surpression coté endothélial, - une inspection de part en part de la cornée, - une applanation du dôme cornéen sans ouvrir le bioréacteur, c'est à dire compromettre la stérilité du prélèvement cornéen. Le but recherché est donc de maintenir la cornée ex vivo dans un état quasi physiologique afin d'améliorer la conservation des greffons cornéens 25 avant greffe et accessoirement pour la réalisation d'expérimentations ex vivo fondamentales et/ou pré-cliniques. Le dispositif n'est, bien entendu, pas limité à la conservation de la cornée ou l'expérimentation sur la cornée, dans l'espèce humaine. Il permet aussi l'expérimentation sur cornée de tout espèce animale dont le diamètre 30 cornéen diffère de l'humain. La géométrie du bioréacteur (principalement - 5 - diamètre du logement central de la cornée), ainsi que les conditions de températures, de pressions et de compositions du liquide de conservation étant variables à souhait en fonction de l'espèce animale de la cornée à conserver. The object of the invention is to remedy these disadvantages in a simple, safe, effective and rational manner. The problem to be solved by the invention is thus to provide a device for long-term preservation of a human cornea which allows: a sterile circulation of a preservation liquid on both sides of the cornea, by creating a gradient of pressure between the two sides of the cornea with an endothelial pressure-side, - a corneal inspection, - an applanation of the corneal dome without opening the bioreactor, ie compromising the sterility of the corneal sample. The aim is therefore to maintain the cornea ex vivo in an almost physiological state in order to improve the preservation of the corneal grafts before grafting and incidentally for carrying out ex vivo fundamental and / or pre-clinical experiments. The device is, of course, not limited to the preservation of the cornea or the experiment on the cornea, in the human species. It also allows corneal experimentation of any animal species whose corneal diameter differs from humans. The geometry of the bioreactor (mainly - diameter of the central housing of the cornea), as well as the conditions of temperatures, pressures and compositions of the preservation liquid being variable at will according to the animal species of the cornea to be preserved .

Pour résoudre un tel problème, il a été conçu et mis au point un dispositif pour la conservation d'une cornée comprenant - - des moyens de réception et d'emprisonnement du prélèvement cornéen, assujettis à des moyens de mise sous pression de celle-ci, à une pression réglable, - des moyens d'injection d'un liquide de conservation dans des agencements que présentent les moyens de réception et d'emprisonnement de la cornée, - des moyens d'applanation du dôme cornéen, - des moyens de prélèvements de milieu de conservation à des fins d'analyses microbiologique et/ou biochimique, et - des moyens d'injection de substances dans le bioréacteur sans avoir à l'ouvrir. To solve such a problem, it has been designed and developed a device for the preservation of a cornea including - means for receiving and imprisoning the corneal sample, subject to means for pressurizing it at an adjustable pressure, means for injecting a preservation liquid into arrangements provided by means for receiving and imprisoning the cornea, means for applanating the corneal dome, sampling means preservation medium for microbiological and / or biochemical analyzes, and means for injecting substances into the bioreactor without having to open it.

Selon l'invention ce dispositif est remarquable en ce que les agencements que présentent les moyens de réception et d'emprisonnement de la cornée immobilisent la cornée en pinçant la collerette de sclère qui l'entoure, ce qui permet le contact entre le liquide de conservation et les deux faces de la cornée. Sont ainsi délimités deux espaces appelés chambre endothéliale et chambre épithéliale. Avantageusement, dans le dispositif selon l'invention, le liquide de conservation est à une température comprise entre 1 et 40° C couvrant la gamme des températures utilisées pour la conservation des cornées à travers le monde.30 - 6 - Avantageusement et pour permettre une inspection à tout moment de part en part, de l'état de la cornée, les agencements que présentent les moyens de réception et d'emprisonnement de la cornée comprennent des moyens d'inspection de part en part de la cornée basés sur la transparence des pièces du bioréacteur qui entourent la cornée. Dans une forme de réalisation préférentielle de l'invention, le dispositif comporte trois parties : - une première partie dénommée pièce intermédiaire servant à la réception et au support du prélèvement cornéen et participant à son emprisonnement avec la seconde partie dénommée couvercle endothélial. La pièce intermédiaire comporte un trou central du diamètre de la cornée (variable selon l'espèce animale). Les bords de ce trou se prolongent par une gorge circulaire destinée à recevoir la sclère. Le prélèvement cornéen est déposée, épithélium vers le bas, sur ce trou et est maintenue par sa collerette de sclère qui repose sur cette gorge. Il existe, au bord de cette gorge, un rebord circulaire qui empêche la cornée de se déplacer latéralement et de sortir du logement ainsi délimité La cornée est ainsi automatiquement centrée sur le trou de la pièce intermédiaire. - une deuxième partie dénommée couvercle endothélial, destinée à venir s'emboiter dans la face supérieure de la pièce intermédiaire. Ce couvercle endothélial peut lui-même être formé de deux pièces solidaires qui délimitent un espace, dénommé chambre endothéliale, dans lequel circule le milieu de conservation au contact de la face endothéliale de la cornée. La partie inférieure de ce couvercle est percée d'un trou du même diamètre que celui de la pièce intermédiaire. Les bords de ce trou comportent un relief circulaire destiné à venir correspondre avec la gorge de la pièce intermédiaire pour écraser la sclère de manière à rendre le contact - 7 - étanche au niveau de la sclère et à bien séparer les chambres endothéliales et épithéliales. La cornée est ainsi solidement emprisonnée entre la pièce intermédiaire et le couvercle endothélial. La partie supérieure du couvercle endothélial est transparente afin de permettre une observation de la cornée sans avoir à ouvrir la chambre endothéliale du bioréacteur. Le couvercle endothélial comporte une large encoche sur le bord, destinée à permettre le passage d'un objectif de microscope optique droit, d'un microscope spéculaire, d'un tomographe par cohérence optique (OCT) d'un LASER ou de tout autre instrument destiné à l'analyse ou au traitements de la cornée et qui nécessite de s'approcher au plus proche de la cornée. Entre le couvercle endothélial et la pièce intermédiaire, un système de blocage progressif par deux glissières inclinées (une sur le couvercle endothélial, une sur la pièce intermédiaire) permet de réaliser un écrasement optimal de la collerette sclérale quelle que soit l'épaisseur de celle-ci. Ces glissières sont micro-crénelées à leur surface, ce qui augmente le frottement entre elles et évite un déblocage intempestif lors des manipulations du bioréacteur. - une troisième partie, dénommée couvercle épithélial, vient se visser dans la face inférieure de la pièce intermédiaire pour former un compartiment étanche du coté de l'épithélium cornéen, formant ainsi une chambre épithéliale. Ce couvercle peut être rapproché de la face épithéliale de la cornée de façon réglable, permettant ainsi de réaliser une applanation contrôlée de la cornée. La surface d'applanation peut être plane ou courbe. Le couvercle épithélial peut être en position non applané (sans contact avec l'épithélium) ou en position d'applanation par un dispositif de réglage pas à pas ou progressif Le couvercle épithélial est également transparent pour permettre une observation de la cornée sans ouvrir le couvercle épithélial du bioréacteur. Le couvercle peut être enlevé lors de l'utilisation expérimentale - 8 - (et non lors de la conservation de prélèvements cornéens pour greffe), par exemple lors de tests d'instillation de collyre, de pénétration de molécules à travers la cornée. Cette ouverture du couvercle épithélial ne perturbe pas le maintien de la surpression dans la chambre endothéliale. According to the invention this device is remarkable in that the arrangements that the means of receiving and imprisoning the cornea immobilize the cornea by pinching the sclera collar that surrounds it, allowing the contact between the liquid conservation and both sides of the cornea. Two areas called endothelial chamber and epithelial chamber are thus delimited. Advantageously, in the device according to the invention, the storage liquid is at a temperature between 1 and 40 ° C covering the range of temperatures used for the preservation of corneas throughout the world. Advantageously and to allow a inspection at any time from one end to the other, of the state of the cornea, the arrangements presented by the means for receiving and imprisoning the cornea comprise means of inspection through the cornea based on the transparency of the cornea. parts of the bioreactor surrounding the cornea. In a preferred embodiment of the invention, the device comprises three parts: a first part called intermediate piece for receiving and supporting the corneal sample and participating in its imprisonment with the second part called endothelial cover. The intermediate piece has a central hole of the diameter of the cornea (variable depending on the animal species). The edges of this hole are extended by a circular groove intended to receive the sclera. The corneal sample is deposited, epithelium down, on this hole and is maintained by its sclera collar which rests on this groove. There is, at the edge of this groove, a circular rim that prevents the cornea from moving laterally and out of the housing thus defined The cornea is thus automatically centered on the hole of the intermediate piece. - A second part called endothelial cover, intended to fit into the upper face of the intermediate piece. This endothelial cover may itself be formed of two integral parts which define a space, called an endothelial chamber, in which the conservation medium circulates in contact with the endothelial face of the cornea. The lower part of this lid is pierced with a hole of the same diameter as that of the intermediate piece. The edges of this hole comprise a circular relief intended to correspond with the groove of the intermediate piece to crush the sclera so as to make the sealing contact at the level of the sclera and to well separate the endothelial and epithelial chambers. The cornea is thus securely trapped between the intermediate piece and the endothelial cover. The upper part of the endothelial cover is transparent to allow observation of the cornea without having to open the endothelial chamber of the bioreactor. The endothelial cover has a large notch on the edge, to allow the passage of a right optical microscope objective, a specular microscope, an optical coherence tomograph (OCT) of a LASER or any other instrument intended for the analysis or the treatment of the cornea and which requires to approach the nearest to the cornea. Between the endothelial cover and the intermediate part, a progressive blocking system by two inclined slides (one on the endothelial cover, one on the intermediate part) makes it possible to achieve an optimal crushing of the scleral collar, whatever the thickness of the latter. this. These slides are micro-notched at their surface, which increases the friction between them and avoids untimely release during handling of the bioreactor. - A third part, called epithelial cover, is screwed into the underside of the intermediate piece to form a sealed compartment on the side of the corneal epithelium, thus forming an epithelial chamber. This lid can be brought closer to the epithelial face of the cornea in an adjustable manner, thus making it possible to achieve controlled applanation of the cornea. The applanation surface may be flat or curved. The epithelial cover may be in the non-applauded position (without contact with the epithelium) or in the applanation position by a stepwise or progressive adjustment device. The epithelial cover is also transparent to allow observation of the cornea without opening the cover epithelial bioreactor. The lid may be removed during experimental use (and not when storing corneal specimens for graft), for example, in eye drop instillation tests, penetration of molecules through the cornea. This opening of the epithelial lid does not disturb the maintenance of the overpressure in the endothelial chamber.

Entre ces trois parties, des joints de différentes natures, notamment torique ou quadrilobe, en matériaux biocompatibles assurent l'étanchéité et le maintien de la stérilité Avantageusement, les deux faces transparentes du couvercle endothélial et du couvercle épithélial sont alignées avec les trous des pièces intermédiaires et du couvercle endothélial. Elles permettent ainsi le passage sans obstacle, de part en part de la cornée, de la lumière, sans avoir à ouvrir le bioréacteur. Il peut s'agir de la lumière visible pour la réalisation des contrôles visuels ou instrumentaux de la cornée par un observateur. A titre d'exemples non limitatifs : analyse de la transparence de la cornée (par exemple par la lampe à fente usuelle des ophtalmologistes), comptage des cellules en particulier endothéliales, recherche d'interface enfouies de chirurgie réfractives. Il peut également s'agir de rayons ultra violets, par exemple pour réaliser le cross-linking du collagène du greffon cornéen. Il peut enfin s'agir de faisceaux LASER destinés à l'analyse (par exemple imagerie par tomographie en cohérence optique), à la thérapie cellulaire (le LASER activant des processus biologiques à l'intérieur de la cornée), ou à la thérapie tissulaire (le LASER découpant la cornée) Enfin, d'autres longueurs d'onde de la lumière sont également susceptibles d'être utilisées à travers le bioréacteur. Avantageusement, les deux faces du couvercle endothélial et du couvercle épithélial sont réalisées dans un matériau peu réflectif aux ultrasons pour permettre l'analyse échographie de la cornée (par exemple - 9 - mesure d'épaisseur avant et après découpe LASER) sans ouvrir le bioréacteur. La chambre endothéliale et la chambre épithéliale comprennent 5 plusieurs orifices. Il existe au minimum et de manière non limitative, au moins trois orifices dans chaque compartiment : un orifice d'entrée de milieu de conservation, un orifice de sortie de milieu de conservation et un orifice supplémentaire dit « technique » (pour prélèvement d'échantillons de milieu ou injection de substances). Le couvercle endothélial comprend 10 également un orifice destiné à recevoir un capteur de pression. Le couvercle épithélial peut également en comporter un. Les moyens de mise sous pression et de contrôle de celle-ci sont réalisés via ces orifices. L'orifice d'entrée de liquide dans le couvercle endothélial se prolonge à l'intérieur de la chambre par une gouttière qui oblige le milieu frais à se déverser au plus 15 près de l'endothélium cornéen. Les orifices d'entrée/sortie, présents dans les deux chambres, permettent de pouvoir faire circuler le liquide de conservation et de le renouveler pour optimiser la conservation de la cornée. 20 Ces orifices permettent également de faire varier la pression à l'intérieur des compartiments de manière à avoir continuellement du coté endothélial une surpression. Celle-ci peut être égale à la pression que rencontre la cornée de façon physiologique du coté endothélial ou tout autre pression choisie. Par exemple 12 à 20 mmHg pour une cornée humaine. 25 Cette surpression peut être obtenue en contrôlant le volume injecté dans la chambre endothéliale et le volume de liquide qui en sort. Par exemple, le milieu de conservation est contenu dans un réservoir sous pression, notamment un infuseur à membrane élastomérique ou à ressort ou à gaz sous pression. La pression peut également être générée par 30 une pompe de type péristaltique ou autre. - 10 - Dans un premier exemple de réalisation, le milieu sous pression traverse un limiteur de débit de type capillaire en verre, puis une micro-électrovanne et est injecté dans la chambre endothéliale. L'ouverture et la fermeture de la micro-électrovanne sont contrôlées par un contrôleur 5 électronique selon une consigne prédéterminée par l'utilisateur (par exemple 18 mmHg) et ajustée selon la pression mesurée par un capteur électronique de pression placée dans la chambre endothéliale. Le liquide sortant de la chambre endothéliale traverse un second limiteur de débit avant de traverser la chambre épithéliale puis de se déverser dans un 10 réservoir dit « poubelle » mis en contact avec la pression atmosphérique au travers d'un filtre garantissant la stérilité. Dans un second exemple de réalisation, le contrôle de la pression est passif : le liquide sous pression est injecté dans la chambre endothéliale. Il ressort et traverse une valve de contrôle dite soupape ou « check valve » 15 choisie pour s'ouvrir à la pression choisie, ainsi la pression dans la chambre endothéliale est maintenue au niveau de la pression d'ouverture de la valve tant que le milieu est injecté. Les deux orifices « techniques » (celui de la chambre endothéliale et 20 celui de la chambre épithéliale) permettent également de prélever un échantillon du liquide de conservation pour analyse microbiologique (contrôle de stérilité) ou biochimique (modifications des caractéristiques du milieu, notamment du pH), ou bien d'injecter un quelconque produit durant la phase de conservation, tel un colorant (bleu trypan pour le contrôle de la 25 mortalité des cellules) ou un médicament, ou un gène par exemple, sans nécessiter l'ouverture d'un quelconque compartiment, ni manipulation de la cornée. Ceci peut permettre la réalisation d'une thérapie cellulaire du greffon par exemple par injection de réactifs dans la chambre endothéliale, destinés à modifier le comportement biologique des cellules de la cornée 30 (thérapie génique par exemple). Between these three parts, seals of different natures, in particular toric or quadrilobe, made of biocompatible materials ensure the sealing and the maintenance of the sterility. Advantageously, the two transparent faces of the endothelial cover and the epithelial cover are aligned with the holes of the intermediate pieces. and the endothelial lid. They allow the passage without obstacle, right through the cornea, light, without having to open the bioreactor. This may be visible light for performing visual or instrumental checks of the cornea by an observer. By way of nonlimiting examples: analysis of the transparency of the cornea (for example by the conventional slit lamp of ophthalmologists), counting of cells, in particular endothelial cells, search for buried refractive surgery interfaces. It can also be ultraviolet rays, for example to achieve the cross-linking of collagen corneal graft. Finally, there may be LASER beams for analysis (for example, optical coherence tomography imaging), cell therapy (LASER activating biological processes within the cornea), or tissue therapy. (Finally, other wavelengths of light are also likely to be used through the bioreactor. Advantageously, the two faces of the endothelial cover and the epithelial cover are made of a material with low ultrasound reflectivity to allow ultrasound analysis of the cornea (for example - thickness measurement before and after LASER cutting) without opening the bioreactor. . The endothelial chamber and the epithelial chamber comprise several orifices. There is at least one, but not limited to, three orifices in each compartment: a preservation medium inlet, a preservation medium outlet, and an additional "technical" port (for sampling medium or injection of substances). The endothelial cover also includes an orifice for receiving a pressure sensor. The epithelial lid may also include one. The pressurizing means and control thereof are performed via these orifices. The liquid inlet port in the endothelial cover extends into the chamber through a gutter that forces the fresh medium to flow at most near the corneal endothelium. The inlet / outlet ports, present in both chambers, allow to circulate the liquid conservation and renew it to optimize the conservation of the cornea. These orifices also make it possible to vary the pressure inside the compartments so as to have a continuous overpressure on the endothelial side. This may be equal to the physiological pressure of the cornea on the endothelial side or any other chosen pressure. For example 12 to 20 mmHg for a human cornea. This overpressure can be obtained by controlling the volume injected into the endothelial chamber and the volume of liquid that leaves it. For example, the preservation medium is contained in a pressure tank, in particular an elastomeric membrane or spring or pressurized gas infuser. The pressure can also be generated by a peristaltic pump or the like. In a first exemplary embodiment, the pressurized medium passes through a glass capillary-type flow restrictor, then a micro-solenoid valve and is injected into the endothelial chamber. The opening and closing of the micro-solenoid valve are controlled by an electronic controller according to a predetermined user instruction (for example 18 mmHg) and adjusted according to the pressure measured by an electronic pressure sensor placed in the endothelial chamber. The liquid exiting the endothelial chamber passes through a second flow restrictor before passing through the epithelial chamber and then pouring into a so-called "bin" placed in contact with the atmospheric pressure through a filter guaranteeing sterility. In a second exemplary embodiment, the pressure control is passive: the liquid under pressure is injected into the endothelial chamber. It emerges and passes through a valve called valve or "check valve" 15 chosen to open at the chosen pressure, and the pressure in the endothelial chamber is maintained at the opening pressure of the valve as the medium is injected. The two "technical" orifices (that of the endothelial chamber and that of the epithelial chamber) also make it possible to take a sample of the preservation liquid for microbiological (sterility control) or biochemical analysis (changes in the characteristics of the medium, especially the pH ), or to inject any product during the preservation phase, such as a dye (trypan blue for the control of cell death) or a drug, or a gene for example, without requiring the opening of a any compartment, nor manipulation of the cornea. This may allow the realization of a graft cell therapy for example by injection of reagents into the endothelial chamber, intended to modify the biological behavior of the cells of the cornea (gene therapy for example).

Avantageusement, dans le dispositif selon l'invention, la pièce intermédiaire et le couvercle endothélial comprennent des moyens complémentaires de verrouillage de l'un avec l'autre, permettant de maintenir les compartiments en position solidarisée. Ces moyens complémentaires de verrouillage et de déverrouillage se présentent par exemple comme des glissières en biais permettant d'assurer la compression progressive des deux pièces (couvercle endothélial et pièce intermédiaire) afin de bloquer la cornée de façon optimale par écrasement progressif et contrôlé de la collerette sclérale. Un tel dispositif est apte à rester fermé depuis le prélèvement de la cornée sur le donneur, jusqu'à la greffe par le chirurgien par exemple. Il est ouvert uniquement au bloc opératoire pour libérer la cornée pour la chirurgie. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront clairement de la description qui en est faite ci-après, à titre indicatif et nullement limitatif, en référence aux figures annexées. Advantageously, in the device according to the invention, the intermediate piece and the endothelial cover comprise complementary means for locking one with the other, to maintain the compartments in a secured position. These additional means of locking and unlocking are for example as slider slides to ensure the progressive compression of the two parts (endothelial cover and intermediate piece) to block the cornea optimally by progressive crushing and controlled collar scleral. Such a device is able to remain closed since the removal of the cornea from the donor, until the transplant by the surgeon for example. It is open only in the operating room to release the cornea for surgery. Other features and advantages of the invention will emerge clearly from the description which is given below, by way of indication and in no way limiting, with reference to the appended figures.

Pour une meilleure compréhension de l'invention il est fait référence à plusieurs schémas dont les parties numérotées sont invariables quel que soit le schéma. Par simplification, les parties ou éléments d'une forme de réalisation qui se retrouvent de manière identique ou similaire dans une autre forme de réalisation seront identifiés par les mêmes références numériques et ne seront pas à nouveau décrits. - 12 - La figure 1 est une vue en perspective, éclatée des éléments constituant le dispositif : couvercle endothélial, pièce intermédiaire support du prélèvement cornéen, couvercle épithélial avec applanation réglable. Les figures 2a et 2b sont des vues en perspective respectivement en 5 vue supérieure et inférieure de la pièce intermédiaire support du prélèvement cornéen. Les figures 3a et 3b sont des vues en perspectives respectivement en vue supérieure et inferieure de l'assemblage des 2 pièces qui constituent le couvercle endothélial. 10 La figure 4 est une vue en perspective supérieur du couvercle épithélial Les figures 5a et 5b sont des vues en perspective respectivement en vue de face et en vue arrière du système complémentaire de fermeture entre le couvercle endothéliale et la pièce intermédiaire. 15 La figure 6 est une vue en perspective et en coupe du dispositif assemblé avec un prélèvement cornéen en place. La figure 7 est une vue en perspective du dispositif en position fermée avec un prélèvement cornéen en place. La figure 8 est un schéma de principe du mode de régulation de la 20 surpression dans la chambre endothéliale, utilisant un mode de contrôle électronique. La figure 9 est un schéma de principe du mode de régulation de la surpression dans la chambre endothéliale, utilisant un mode de contrôle passif sans apport électrique par valve de contrôle passive (soupape ou 25 check valve). En référence aux figures 1 et 7, le dispositif se présente sous forme d'un bioréacteur (1) comprenant une pièce intermédiaire (2) support du prélèvement cornéen (3), une pièce supérieure dénommée couvercle 30 endothélial (4) et une pièce inférieure dénommée couvercle épithélial (5). - 13 - En référence aux figures 2a et 2b, la pièce intermédiaire (2) comporte un trou central (6a) au diamètre de la cornée (3a), entouré d'une gorge circonférentielle (6b) et d'un rebord (6c) formant un logement destiné à recevoir la collerette de sclère (3b). Elle comporte également au moins 3 orifices (7a, 7b, 7c) permettant l'entrée ou la sortie du milieu de conservation ou de toute autre substance du coté épithélial de la cornée (3a). L'orifice (7a) peut servir à l'injection du milieu, le second (7b) à la sortie du milieu, et le troisième (7c) est un orifice dit technique pour l'injection ou le retrait de milieu ou substance supplémentaire sans avoir à interrompre le flux dans les deux premiers orifices. Sur ces orifices peuvent s'adapter des tuyaux de circulation de milieu de conservation ou des bouchons (obturant classiques ou obturant mais perforable par une aiguille stérile pour, par exemple, réaliser des prélèvements ou des injections de substances). Cette pièce intermédiaire comporte des moyens complémentaires de verrouillage (8) avec le couvercle endothélial (4). Ces moyens peuvent être trois glissières (8) placées à 120° sur la circonférence de la pièce intermédiaire (2) et destinées à recevoir un système de verrouillage (14b). Une des faces de la glissière est inclinée par rapport à l'horizontale et permet un serrage progressif du couvercle endothélial (4) sur la pièce intermédiaire (2). Ce serrage écrase la collerette de sclère (3b) qui réalise un véritable joint d'étanchéité entre ces deux pièces. Le plan incliné de la glissière (8) est micro-crénelées afin d'augmenter le frottement avec le plan incliné correspondant du système de verrouillage (14b). Ce frottement accru empêche un déblocage intempestif des 2 pièces lors des manipulations du bioréacteur (1). L'étanchéité avec le couvercle endothélial (4) est assurée au moyen d'un joint annulaire (15a) logé dans une gorge circulaire (15b). A titre d'exemple, ce joint peut être un joint torique (15b). L'étanchéité avec le couvercle épithélial (5) est assurée au moyen d'un joint annulaire (16a) logé dans une gorge circulaire (16b). A titre d'exemple ce joint peut être un - 14 - joint quadrilobe (16a) choisi pour ses bonnes performances en translation. La pièce intermédiaire comporte aussi un système permettant le réglage de l'applanation de la cornée par le couvercle épithélial (5), par exemple au moyen d'un pas de vis (9) permettant ainsi une applanation réglable. For a better understanding of the invention reference is made to several schemes whose numbered parts are invariable regardless of the scheme. For simplicity, parts or elements of an embodiment that are identical or similar in another embodiment will be identified by the same reference numerals and will not be described again. FIG. 1 is an exploded perspective view of the elements constituting the device: endothelial cover, intermediate support part of the corneal sample, epithelial cover with adjustable applanation. Figures 2a and 2b are perspective views respectively in top and bottom view of the intermediate support part of the corneal sample. Figures 3a and 3b are perspective views respectively in upper and lower view of the assembly of the two parts that constitute the endothelial cover. Figure 4 is a top perspective view of the epithelial cover. Figures 5a and 5b are perspective views respectively in front view and in rear view of the complementary closure system between the endothelial cover and the intermediate piece. Figure 6 is a perspective and sectional view of the device assembled with a corneal sample in place. Figure 7 is a perspective view of the device in the closed position with a corneal sample in place. Figure 8 is a block diagram of the mode of regulating the overpressure in the endothelial chamber, using an electronic control mode. Figure 9 is a block diagram of the mode of regulating the overpressure in the endothelial chamber, using a passive control mode without electrical input by passive control valve (valve or check valve). With reference to FIGS. 1 and 7, the device is in the form of a bioreactor (1) comprising an intermediate piece (2) supporting the corneal sample (3), a top piece called an endothelial cover (4) and a lower part. called epithelial cover (5). With reference to FIGS. 2a and 2b, the intermediate piece (2) comprises a central hole (6a) with a diameter of the cornea (3a), surrounded by a circumferential groove (6b) and a rim (6c). forming a housing for receiving the sclera collar (3b). It also comprises at least 3 orifices (7a, 7b, 7c) allowing the entry or exit of the preservation medium or any other substance from the epithelial side of the cornea (3a). The orifice (7a) can be used for injecting the medium, the second (7b) at the outlet of the medium, and the third (7c) is a so-called technical orifice for the injection or removal of medium or additional substance without have to interrupt the flow in the first two orifices. On these orifices can be adapted storage medium circulation pipes or plugs (closing conventional or obturating but perforable by a sterile needle for, for example, to take samples or injections of substances). This intermediate piece comprises complementary locking means (8) with the endothelial cover (4). These means may be three slides (8) placed at 120 ° on the circumference of the intermediate piece (2) and intended to receive a locking system (14b). One of the faces of the slide is inclined relative to the horizontal and allows a progressive tightening of the endothelial cover (4) on the intermediate piece (2). This tightening crushes the sclera collar (3b) which realizes a real seal between these two parts. The inclined plane of the slide (8) is micro-serrated to increase the friction with the corresponding inclined plane of the locking system (14b). This increased friction prevents inadvertent release of the two parts during handling of the bioreactor (1). The sealing with the endothelial cover (4) is ensured by means of an annular seal (15a) housed in a circular groove (15b). For example, this seal may be an O-ring (15b). Sealing with the epithelial cover (5) is provided by means of an annular seal (16a) housed in a circular groove (16b). By way of example, this seal may be a quadrilobe seal (16a) chosen for its good performance in translation. The intermediate piece also comprises a system for adjusting the applanation of the cornea by the epithelial cover (5), for example by means of a thread (9) allowing an adjustable applanation.

En référence aux figures 3a et 3b, le couvercle endothélial (4) est réalisé en deux parties. Une première partie (4a) faisant office de récipient cylindrique et une deuxième partie (4b) faisant office de couvercle transparent. Ces 2 pièces sont assemblées de façon étanche, par exemple par collage, et délimitent la chambre endothéliale (18 sur la FIG.6). La première partie (4a) comprend, sur son fond, un trou (10a) permettant l'accès du liquide à l'endothélium de la cornée (3a). Les bords (10b) de ce trou (10a) font saillie vers la pièce intermédiaire (3), pour correspondre à la gorge circonférentielle (6b) de manière à emprisonner le prélèvement cornéen en écrasant la sclère (3b) entre la pièce intermédiaire (2) et le couvercle endothélial (4), grâce au système de verrouillage complémentaire (8, 14a, 14b). Les trous de la pièce intermédiaire et du couvercle endothélial sont coaxiaux. La paroi latérale du couvercle endothélial (4a) présente des orifices d'entrée (11a) ou de sortie (1 lb) de liquide de conservation, destiné à être assujettis à des moyens de mise sous pression du bioréacteur (1), et un orifice « technique » (11c) pour la réalisation de prélèvements ou d'injection d'un milieu de conservation ou de tout autre substance, sans avoir à interrompre le flux dans les deux premiers. Sur ces orifices peuvent s'adapter des tuyaux de circulation de milieu de conservation ou des bouchons (classiques ou perforables). L'orifice (11a) d'injection du milieu de conservation dans la chambre endothéliale débouche dans une gouttière (12) qui dirige le milieu de conservation frais directement sur la face endothéliale de la cornée (3a). La paroi latérale de la pièce (4a) comprend aussi un orifice (13) destiné à recevoir un micro-capteur électronique de pression. Le couvercle endothélial comporte des moyens complémentaires - 15 - de verrouillage (14a) avec la pièce intermédiaire (2). Ces moyens peuvent être 3 rails (14a) placés à 120° sur la circonférence du couvercle endothélial (4), destinés à recevoir le système de verrouillage (14b). Ce système coulisse sur le rail. Il est décrit en détail Figure 5a et Figure 5b. Le couvercle endothélial (4) est apte à venir s'engager dans la pièce intermédiaire (2) de manière étanche pour délimiter un espace appelé chambre endothéliale (18) en emprisonnant le prélèvement cornéen (3). L'étanchéité est assurée au moyen de joints annulaire torique (15a) logé dans une gorge (15b) réalisée dans la pièce intermédiaire (2). Le couvercle endothélial comporte une large encoche (4c et 4d) sur le bord, destinée à permettre le passage d'un objectif de microscope optique droit, d'un microscope spéculaire, d'un tomographe par cohérence optique (OCT), d'un LASER ou de tout autre instrument destiné à l'analyse ou au traitement de la cornée et qui nécessite de s'approcher au plus proche de la cornée. En référence à la figure 4, le couvercle épithélial (5) est transparent. Il est apte à venir s'engager dans la pièce intermédiaire (2) de manière étanche pour délimiter un espace appelé chambre épithéliale (19 sur le FIG. 6). Il comporte un système permettant une applanation réglable de la cornée (3) en s'enfonçant dans la pièce intermédiaire. Ce système est par exemple un pas de vis (17) glissant dans le pas de vis complémentaire (9) de la pièce intermédiaire permettant ainsi une applanation précise et choisie à volonté. La surface entrant en contact avec la face épithéliale de la cornée (3a) peut être plane comme représenté ici ou courbe. En référence aux figures 5a et 5b, le système complémentaire de fermeture entre le couvercle endothélial (4) et la pièce intermédiaire (2) est composée d'une part de trois rails (14a) solidaires de la face externe de la 30 pièce 4a du couvercle endothélial sur sa circonférence et disposées à 120°, - 16 - et d'autre part de 3 systèmes de verrouillage (14b) qui coulissent sur les rails (14a). La partie supérieure du système de verrouillage (14b) comporte une gouttière en T (14d) apte à venir coulisser sur le rail (14a) de forme complémentaire. La partie inférieure du système de fermeture (14b) comporte une gouttière (14e) dont un des bords est réalisé en biais (14f). Cette partie en biais (14f) est apte à venir au contact d'un rail (8) lui aussi réalisé en biais et solidaire de la pièce intermédiaire (2), de sorte que la translation du système de fermeture (14b) sur le rail (14a) viennent affronter ces 2 surfaces en biais et provoque le serrage progressif du couvercle endothélial (4) sur le pièce intermédiaire (2). Ce serrage écrase la collerette de sclère (3b) entre les surfaces 6b et 10b qui bordent les trous 6a et 10a respectivement de la pièce intermédiaire (2) et du couvercle endothélial (4). Le serrage réalisé sur la sclère (3b) immobilise parfaitement le prélèvement cornéen (3) tout en respectant l'intégrité de la cornée (3a). Les deux parties en biais du rail (8) et du système de verrouillage (14b) sont microcrénelées afin de faciliter leur blocage l'une sur l'autre et empêcher un déblocage intempestif La partie externe (14c) du système de verrouillage est également micro crénelée pour faciliter la saisie entre les doigts. With reference to FIGS. 3a and 3b, the endothelial cover (4) is made in two parts. A first portion (4a) serving as a cylindrical container and a second portion (4b) acting as a transparent cover. These two parts are assembled tightly, for example by gluing, and delimit the endothelial chamber (18 in FIG.6). The first part (4a) comprises, on its bottom, a hole (10a) allowing access of the liquid to the endothelium of the cornea (3a). The edges (10b) of this hole (10a) project towards the intermediate piece (3), to correspond to the circumferential groove (6b) so as to trap the corneal sample by crushing the sclera (3b) between the intermediate piece (2). ) and the endothelial cover (4), thanks to the complementary locking system (8, 14a, 14b). The holes in the intermediate piece and the endothelial cover are coaxial. The side wall of the endothelial cover (4a) has inlet (11a) or outlet (1 lb) openings for holding liquid, to be subjected to means for pressurizing the bioreactor (1), and an orifice "Technique" (11c) for taking samples or injecting a preservation medium or any other substance, without having to interrupt the flow in the first two. On these orifices can fit conservation medium circulation pipes or plugs (conventional or perforable). The injection port (11a) of the preservation medium into the endothelial chamber opens into a gutter (12) which directs the fresh preservation medium directly onto the endothelial face of the cornea (3a). The side wall of the part (4a) also comprises an orifice (13) intended to receive an electronic pressure micro-sensor. The endothelial cover has complementary locking means (14a) with the intermediate piece (2). These means may be 3 rails (14a) placed at 120 ° on the circumference of the endothelial cover (4), intended to receive the locking system (14b). This system slides on the rail. It is described in detail in Figure 5a and Figure 5b. The endothelial cover (4) is adapted to engage in the intermediate piece (2) sealingly to define a space called the endothelial chamber (18) by trapping the corneal sample (3). Sealing is provided by means of annular ring seals (15a) housed in a groove (15b) made in the intermediate piece (2). The endothelial cover has a large notch (4c and 4d) on the edge, to allow the passage of a right optical microscope objective, a specular microscope, an optical coherence tomograph (OCT), a LASER or any other instrument intended for the analysis or treatment of the cornea and which requires to approach the nearest to the cornea. With reference to FIG. 4, the epithelial cover (5) is transparent. It is able to engage in the intermediate piece (2) sealingly to define a space called the epithelial chamber (19 in FIG 6). It comprises a system allowing adjustable applanation of the cornea (3) by sinking into the intermediate piece. This system is for example a screw thread (17) sliding in the complementary thread (9) of the intermediate piece thus allowing a precise applanation and chosen at will. The surface coming into contact with the epithelial surface of the cornea (3a) may be flat as shown here or curved. With reference to FIGS. 5a and 5b, the complementary closure system between the endothelial cover (4) and the intermediate piece (2) is composed on the one hand of three rails (14a) integral with the outer face of the piece 4a of the endothelial cover on its circumference and arranged at 120 °, and on the other hand 3 locking systems (14b) which slide on the rails (14a). The upper part of the locking system (14b) comprises a T-shaped gutter (14d) able to slide on the rail (14a) of complementary shape. The lower part of the closure system (14b) comprises a gutter (14e), one edge is made at an angle (14f). This angled portion (14f) is adapted to come into contact with a rail (8) also made obliquely and integral with the intermediate piece (2), so that the translation of the closure system (14b) on the rail (14a) come face these two surfaces at an angle and causes the progressive tightening of the endothelial cover (4) on the intermediate piece (2). This clamping crushes the sclera flange (3b) between the surfaces 6b and 10b which border the holes 6a and 10a respectively of the intermediate piece (2) and the endothelial cover (4). Clamping performed on the sclera (3b) perfectly immobilizes the corneal sample (3) while respecting the integrity of the cornea (3a). The two angled portions of the rail (8) and the locking system (14b) are microcrenelated to facilitate their blocking on one another and prevent inadvertent unlocking The outer portion (14c) of the locking system is also micro crenellated to facilitate grasping between the fingers.

En référence à la figure 6, le bioréacteur (1) est transparent de part en part en regard de la cornée (3) grâce aux parois transparentes des couvercles endothélial (4) et épithélial (5), situées en face des deux trous coaxiaux (6a et 10a) respectivement des pièces intermédiaires (2) et du couvercle endothélial (4). Cette transparence permet le passage sans obstacle de la lumière visible (contrôles visuels ou instrumentaux de la cornée par un observateur), des rayons ultra violet (par exemple pour le cross-linking du collagène de la cornée), de faisceaux LASER destinés à l'analyse (par exemple imagerie par tomographie en cohérence optique), la thérapie cellulaire (activation de processus biologiques à l'intérieur de la cornée), ou la thérapie tissulaire (découpe de la cornée), ou de tout autre longueur 2 9 8 6 1 3 3 - 17 - d'onde de la lumière. L'ensemble de ces opérations peut être effectué à tout moment et sans avoir à ouvrir le bioréacteur. Le couvercle endothélial (4), une fois refermé sur la pièce intermédiaire (2) délimite la chambre endothéliale (18). L'espace entre la pièce intermédiaire (2) et le couvercle 5 épithélial (5) délimite la chambre épithéliale (19). En pratique, l'utilisation du bioréacteur (1) selon l'invention, en vue d'une greffe de cornée se décompose en trois étapes : étape 1 de prélèvement sur le donneur, étape 2 de conservation par la banque de 10 cornée puis étape 3 de greffe au bloc opératoire. Lors de l'étape 1 de prélèvement, la pièce intermédiaire (2) et le couvercle endothélial (4) sont désolidarisés alors que la pièce intermédiaire (2) et le couvercle épithélial (5) sont solidaires. Le prélèvement cornéen (3) 15 est déposé dans le logement formé par les rebords (6b) et (6c) du trou (6a) de la pièce intermédiaire (2). Le couvercle endothélial (4) est ensuite emboité dans la pièce intermédiaire (2), emprisonnant ainsi le prélèvement cornéen (3) entres deux pièces (2, 4) par écrasement de sa collerette sclérale (3b). La cornée (3a) se retrouve ainsi avec sa face endothéliale en 20 communication avec la chambre endothéliale (18) et avec sa face épithéliale en communication avec la chambre épithéliale (19). On ferme ensuite les moyens de verrouillages complémentaires en faisant coulisser avec les doigts les 3 systèmes de verrouillage (14b) sur les rails (14a). Les tuyaux de circulation de milieu de conservation sont alors branchés aux orifices (7a, 25 7b et 11a, 11b) de la pièce intermédiaire (2) et du couvercle endothélial (4). Dans une autre forme de réalisation, les tuyaux peuvent être d'emblée sertis sur le couvercle endothélial (4) et la pièce intermédiaire (2). Les orifices techniques (7c) et (11c) restent obturés par des bouchons obturant simple ou obturant mais perforables. Les tuyaux sont raccordés aux moyens de mise 30 en circulation du milieu de conservation et de création du gradient de - 18 - pression avec surpression dans la chambre endothéliale (décrits FIG.8 et FIG.9) Lors de l'étape 2 de conservation dans une banque de cornée, le bioréacteur permet le maintien de la viabilité des cellules de la cornée, évite l'oedème de la cornée source de perte de la transparence du tissu et limite les plis postérieurs, eux même responsables d'une surmortalité des cellules endothéliales de la cornée. Le bioréacteur peut être utilisé à n'importe quelle température entre 1 et 40° C, selon le type de milieu de conservation. Referring to FIG. 6, the bioreactor (1) is transparent from one side to the cornea (3) thanks to the transparent walls of the endothelial (4) and epithelial (5) lids situated opposite the two coaxial holes ( 6a and 10a) respectively of the intermediate pieces (2) and the endothelial cover (4). This transparency allows the unobstructed passage of visible light (visual or instrumental checks of the cornea by an observer), ultraviolet rays (for example for the cross-linking of corneal collagen), LASER beams intended for the analysis (eg optical coherence tomography imaging), cell therapy (activation of biological processes within the cornea), or tissue therapy (cutting of the cornea), or any other length 2 9 8 6 1 3 3 - 17 - wave of light. All of these operations can be performed at any time without having to open the bioreactor. The endothelial cover (4), once closed on the intermediate piece (2) delimits the endothelial chamber (18). The space between the intermediate piece (2) and the epithelial cover (5) delimits the epithelial chamber (19). In practice, the use of the bioreactor (1) according to the invention for corneal transplantation is broken down into three steps: step 1 of sampling on the donor, step 2 of preservation by the cornea bank and then step 3 of graft in the operating room. During the sampling step 1, the intermediate piece (2) and the endothelial cover (4) are disengaged while the intermediate piece (2) and the epithelial cover (5) are integral. The corneal sample (3) 15 is deposited in the housing formed by the flanges (6b) and (6c) of the hole (6a) of the intermediate piece (2). The endothelial cover (4) is then fitted into the intermediate piece (2), thereby trapping the corneal sample (3) between two pieces (2, 4) by crushing its scleral flange (3b). The cornea (3a) is thus found with its endothelial face in communication with the endothelial chamber (18) and with its epithelial surface in communication with the epithelial chamber (19). The additional locking means are then closed by sliding the three locking systems (14b) on the rails (14a) with the fingers. The storage medium circulation pipes are then connected to the orifices (7a, 7b and 11a, 11b) of the intermediate piece (2) and the endothelial cover (4). In another embodiment, the tubes can be immediately crimped on the endothelial cover (4) and the intermediate piece (2). The technical ports (7c) and (11c) are closed by plugs closing simple or obturating but perforable. The pipes are connected to the means for circulating the medium of conservation and creation of the pressure gradient with overpressure in the endothelial chamber (described in FIG. 8 and FIG. a cornea bank, the bioreactor allows the maintenance of corneal cell viability, avoids edema of the cornea, a source of loss of transparency of the tissue and limits posterior folds, themselves responsible for excess mortality of endothelial cells of the cornea. The bioreactor can be used at any temperature between 1 and 40 ° C, depending on the type of preservation medium.

Le bioréacteur ayant l'avantage d'être transparent de part en part et réalisé dans un matériau compatible avec l'utilisation de sonde à ultrason, les contrôles de qualité de la cornée peuvent être réalisés sans ouvrir le bioréacteur. De plus, il est fonctionnel dans n'importe quelle position (horizontale ou verticale) et possède une large encoche dans le couvercle endothélial (4) pour faciliter le passage des instruments de mesure ou de traitement du greffon. A titre d'exemples non limitatifs, ces contrôles de qualités peuvent être : évaluation de la transparence (par examen à la lampe à fente des ophtalmologistes ou tout autre dispositif de quantification de la transparence, mesures d'épaisseur (du greffon entier ou du greffon découpé), comptage des cellules endothéliales soit par microscopie spéculaire sans préparation, soit par microscopie optique classique après préparation du greffon (les réactifs nécessaires à la préparation du greffon peuvent être injectés par l'orifice technique (11c) du couvercle endothélial (4). Par ailleurs, le bioréacteur ayant l'avantage d'être transparent de part en part permet avantageusement de réaliser à n'importe quel moment de cette étape 2 de conservation par la banque, une découpe du greffon par LASER. Celle-ci peut être réalisée indifféremment par la face endothéliale que par la face épithéliale. Elle peut être facilitée par l'applanation de la cornée par le couvercle épithélial (5). - 19 - Avantageusement, le bioréacteur peut être utilisé dans n'importe quel sens, mais lors de la position usuelle, le prélèvement cornéen est orienté épithélium vers le bas. Dans cette position, il est impossible aux éventuelles bulles d'air présentes dans le circuit de rester coincées sous le dôme cornéen, coté endothélial. Dans le cas contraire, ces bulles auraient en effet perturbé l'observation de la cornée et l'analyse de l'endothélium cornéen. Avantageusement le bioréacteur peut également être utilisé verticalement, pour, par exemple un contrôle de la cornée à la lampe à fente usuelle des ophtalmologistes. Since the bioreactor has the advantage of being transparent throughout and made of a material compatible with the use of an ultrasound probe, the cornea quality checks can be carried out without opening the bioreactor. In addition, it is functional in any position (horizontal or vertical) and has a large notch in the endothelial cover (4) to facilitate the passage of measuring instruments or graft processing. By way of nonlimiting examples, these quality controls may be: evaluation of transparency (by ophthalmologist slit lamp examination or any other device for quantifying transparency, thickness measurements (of the whole graft or graft) cut), counting endothelial cells either by specular microscopy without preparation, or by conventional optical microscopy after preparation of the graft (the reagents necessary for the preparation of the graft can be injected through the technical orifice (11c) of the endothelial cover (4). Furthermore, the bioreactor having the advantage of being transparent from one side to the other advantageously makes it possible, at any time during this storage step 2, to preserve by the bank a cutting of the graft by LASER, which can be carried out indifferently by the endothelial surface than by the epithelial surface.It can be facilitated by the applanation of the cornea by the The epithelial (5). Advantageously, the bioreactor can be used in any direction, but in the usual position, the corneal sample is oriented epithelium downwards. In this position, it is impossible for any air bubbles present in the circuit to remain stuck under the corneal dome, endothelial side. In the opposite case, these bubbles would indeed have disturbed the observation of the cornea and the analysis of the corneal endothelium. Advantageously, the bioreactor can also be used vertically, for example, for controlling the cornea with the conventional slit lamp of ophthalmologists.

Lors de l'étape 2 de conservation, l'observation de l'endothélium cornéen peut, à n'importe quel moment avantageusement être facilitée par l'applanation du dôme cornéen par le couvercle épithélial (5) en supprimant la courbure cornéenne source de difficulté de focalisation et d'erreur de parallaxe. During the stage 2 of preservation, the observation of the corneal endothelium can, at any time advantageously be facilitated by the applanation of the corneal dome by the epithelial lid (5) by removing the corneal curvature source of difficulty focus and parallax error.

Lors de l'étape 2 de conservation, les orifices techniques (7c) et (11c) peuvent permettre l'injection de réactifs nécessaires à la réalisation d'une modification des cellules du prélèvement cornéen afin de réaliser une thérapie cellulaire du greffon par exemple par transfection cellulaire par vecteurs viraux, chimiques, ou physico-chimiques. During step 2 of preservation, the technical orifices (7c) and (11c) may allow the injection of reagents necessary for performing a modification of the cells of the corneal sample in order to perform a graft cell therapy for example by cellular transfection by viral, chemical, or physicochemical vectors.

Lors de l'étape 2, ces orifices techniques peuvent permettre de prélever à n'importe quel moment, des échantillons de milieux de conservation pour réaliser des contrôles de stérilité microbiologique. Lors de l'étape 3 de greffe au bloc opératoire, si cela n'a pas été effectué à la banque de cornée, le prélèvement cornéen peut être découpé 25 par LASER directement au travers du bioréacteur (1) avec ou sans applanation du dôme cornéen par le couvercle épithélial (5). Lors de l'étape 3 de greffe au bloc opératoire, le bioréacteur (1) est ouvert au dernier moment avant réalisation de la greffe. Il s'agit du seul moment où le bioréacteur est ouvert. Pour cela les moyens de verrouillage 30 complémentaires (14b) sont déverrouillés par l'infirmière de bloc opératoire - 20 - pour permettre la séparation du couvercle endothélial (4) et de la pièce intermédiaire (2). Le prélèvement cornéen (3) reste ainsi niché dans la logette centrale de la pièce intermédiaire (2) et le chirurgien le saisi au moyen d'une pince chirurgicale stérile. In step 2, these technical ports can take samples of preservation media at any time to carry out microbiological sterility checks. In step 3 of the operating room transplant, if this was not done at the corneal bank, the corneal sample can be cut by LASER directly through the bioreactor (1) with or without corneal dome applanation. by the epithelial lid (5). During stage 3 of transplant in the operating room, the bioreactor (1) is open at the last moment before performing the transplant. This is the only time the bioreactor is open. For this, the complementary locking means (14b) are unlocked by the operating theater nurse to allow separation of the endothelial cover (4) and the intermediate piece (2). The corneal sample (3) remains thus nestled in the central stall of the intermediate piece (2) and the surgeon grasps it by means of a sterile surgical clip.

En référence à la figure 7, le bioréacteur (1), en position assemblée, est un ensemble étanche renfermant un prélèvement cornée (3) fermement emprisonné entre la pièce intermédiaire (2) et le couvercle endothélial (4). Les orifices des pièces intermédiaires et du couvercle endothélial sont reliés aux moyens de circulation du milieu de conservation et de création du gradient de pression avec surpression du coté endothélial. Le bioréacteur (1) peut être utilisé et conserver ses propriétés dans n'importe quelle position. Il peut ainsi être disposé devant n'importe quel instrument optique : par exemple, en position verticale il peut être placé 15 devant une lampe à fente d'ophtalmologiste En référence à la figure 8, le bioréacteur (1) est connecté par des tuyaux au différents éléments qui assurent la circulation du milieu de conservation dans les deux chambres (endothéliales (18) et épithéliales 20 (19)) et le maintien du gradient de pression avec surpression dans la chambre endothéliale. Dans la figure 8, la pression est régulée de façon active par un dispositif électronique. La pression Po dans la chambre endothéliale (18) est supérieure à celle de la chambre épithéliale (19). Cette pression Po est réglable mais peut être typiquement la pression intraoculaire 25 physiologique de 12 à 20 mmHg. A titre d'exemple cette pression peut être régulée de la façon suivante : dans une forme de réalisation, le milieu de conservation est contenu dans un réservoir sous pression (20) (par exemple un infuseur à membrane élastomérique, à ressort ou gaz comprimé), dans une autre forme de réalisation, le milieu de conservation est injecté par une 30 pompe. Ce réservoir permet l'injection de liquide dans la chambre - 21 - endothéliale (18) du bioréacteur. L'injection est contrôlée (en durée et en fréquence) par une micro-électrovanne (21) selon la pression Po régnant dans la chambre endothéliale. Cette régulation est assurée par une boucle de contrôle comprenant un transducteur de pression (24) qui mesure en permanence ou selon une fréquence préétablie Po. Selon une consigne (23) déterminée par l'opérateur (par exemple 12 à 20 mmHg) le correcteur (22) donne l'ordre d'ouverture ou de fermeture de l'électrovanne. A la sortie de la chambre endothéliale, le liquide de conservation franchit une seconde valve passive (25) qui réduit le débit et évite l'effondrement brutal de Po lorsque l'électrovanne est fermée et qu'aucun liquide n'est injecté. Cette seconde valve peut être par exemple un fin capillaire de verre limiteur de débit ou une valve passive ne s'ouvrant qu'au delà d'une certaine pression (dite check-valve ou soupape). Le milieu de conservation est ensuite envoyé dans la chambre épithéliale (19) puis dans un réservoir servant de « poubelle » (26) et ouvert à la pression atmosphérique au travers d'un filtre (27) empêchant les contaminations microbiologiques rétrogrades. En référence à la figure 9, le gradient de pression peut également être régulé de façon passive. Le milieu de conservation est contenu dans un réservoir sous pression (20) par exemple un infuseur à membrane élastomérique, à ressort ou gaz comprimé, ou par une pompe. Ce réservoir permet l'injection de liquide dans la chambre endothéliale (18) du bioréacteur (1). A la sortie du réservoir (20), un limiteur de débit (27), par exemple un fin capillaire de verre, permet une injection lente et régulière dans la chambre endothéliale (18). A la sortie de la chambre endothéliale (18) est placée une ou plusieurs valve(s) de contrôle (dite Check valve ou soupape) (28) choisie(s) pour s'ouvrir lorsque Po atteint la pression souhaitée (par exemple 12 à 20 mmHg). Ainsi Po ne dépasse jamais la pression choisie et s'y maintien tant que le milieu est injecté dans la chambre endothéliale (18). Le milieu de conservation est ensuite envoyé - 22 - dans la chambre épithéliale puis dans un réservoir servant de poubelle (26) et ouvert à la pression atmosphérique au travers d'un filtre (27) empêchant les contaminations microbiologiques rétrogrades. Referring to Figure 7, the bioreactor (1), in the assembled position, is a sealed assembly containing a horny sample (3) firmly trapped between the intermediate piece (2) and the endothelial cover (4). The orifices of the intermediate parts and the endothelial cover are connected to the circulation means of the conservation medium and the creation of the pressure gradient with overpressure on the endothelial side. The bioreactor (1) can be used and retain its properties in any position. It can thus be arranged in front of any optical instrument: for example, in the vertical position it can be placed in front of an ophthalmologist slit lamp. With reference to FIG. 8, the bioreactor (1) is connected by pipes to the various elements which ensure the circulation of the preservation medium in the two chambers (endothelial (18) and epithelial (19)) and the maintenance of the pressure gradient with overpressure in the endothelial chamber. In Fig. 8, the pressure is actively regulated by an electronic device. The pressure Po in the endothelial chamber (18) is greater than that of the epithelial chamber (19). This pressure Po is adjustable but can typically be the physiological intraocular pressure of 12 to 20 mmHg. By way of example, this pressure can be regulated as follows: in one embodiment, the preservation medium is contained in a pressure tank (20) (for example an elastomeric membrane, spring or compressed gas infuser) in another embodiment, the preservation medium is injected by a pump. This reservoir allows the injection of liquid into the endothelial chamber (18) of the bioreactor. The injection is controlled (in duration and frequency) by a micro-solenoid valve (21) according to the pressure Po prevailing in the endothelial chamber. This regulation is ensured by a control loop comprising a pressure transducer (24) which measures permanently or at a predetermined frequency Po. According to a setpoint (23) determined by the operator (for example 12 to 20 mmHg) the corrector ( 22) gives the opening or closing order of the solenoid valve. At the exit of the endothelial chamber, the preservation liquid passes a second passive valve (25) which reduces the flow and avoids the sudden collapse of Po when the solenoid valve is closed and no liquid is injected. This second valve may for example be a capillary end of flow limiting glass or a passive valve opening only beyond a certain pressure (called check valve or valve). The preservation medium is then sent into the epithelial chamber (19) and then into a tank serving as "trash" (26) and opened at atmospheric pressure through a filter (27) preventing retrograde microbiological contaminations. With reference to FIG. 9, the pressure gradient can also be regulated passively. The preservation medium is contained in a pressure tank (20), for example an elastomeric membrane, spring or compressed gas infuser, or by a pump. This reservoir allows the injection of liquid into the endothelial chamber (18) of the bioreactor (1). At the outlet of the reservoir (20), a flow restrictor (27), for example a capillary end of glass, allows a slow and regular injection into the endothelial chamber (18). At the end of the endothelial chamber (18) is placed one or more valve (s) (Check valve or valve) (28) selected (s) to open when Po reaches the desired pressure (for example 12 to 20 mmHg). Thus Po never exceeds the chosen pressure and maintains it as long as the medium is injected into the endothelial chamber (18). The preservation medium is then sent into the epithelial chamber and into a trash container (26) and opened at atmospheric pressure through a filter (27) preventing retrograde microbiological contaminations.

Il va de soi que l'invention n'est pas limitée à la forme de réalisation décrite ci-dessus à titre d'exemple mais qu'elle s'étend à toutes les formes de réalisations couvertes par les revendications ci-annexées. L'intérêt biologique et l'intérêt de l'applanation peuvent être exposés 10 comme suit : Le dispositif revendiqué comprend des moyens (2, 4, 5). Le dispositif revendiqué permet de conserver en vie pendant plusieurs semaines, de manière stérile une cornée humaine en vue d'une greffe de 15 cornée chez un patient et de conserver en vie pendant plusieurs semaines, de manière stérile une cornée humaine ou animale en vue d'expérimentations ex vivo de laboratoire, de recherche fondamentale ou pré-cliniques.It goes without saying that the invention is not limited to the embodiment described above by way of example but that it extends to all embodiments covered by the appended claims. The biological interest and interest of applanation can be explained as follows: The claimed device comprises means (2, 4, 5). The claimed device makes it possible to keep a human cornea alive for several weeks in a sterile manner for the purpose of corneal transplantation in a patient and to keep a human or animal cornea alive for several weeks in a sterile manner. ex vivo laboratory, basic research or pre-clinical experiments.

20 Le gradient de pression réglable entre la face endothéliale et la face épithéliale, avec surpression du coté endothélial limite l'apparition de l'oedème du stroma cornéen, le fait régresser lorsque celui-ci est présent avant la mise en place du prélèvement cornéen dans le bioréacteur, limitant l'apparition des plis postérieurs de la cornée et améliorant la viabilité des 25 cellules de la cornée, en particulier les cellules endothéliales. Le bioréacteur cornéen peut être utilisé dans n'importe quelle position horizontalement ou verticalement notamment. Lorsqu'il est utilisé en position horizontale avec l'épithélium 30 cornéen dirigé vers le bas, les éventuelles bulles d'air présentes dans le - 23 - circuit ne peuvent s'accumuler sous le dôme cornéen et ne perturbent pas l'observation de la cornée. Le couvercle transparent du compartiment épithélial peut être 5 déplacé de façon précise et réglable pour venir en contact avec l'épithélium cornéen et aplatir (aplaner) le dôme cornéen par une surface plane (ou courbe), afin de faciliter les découpes cornéennes par des procédés LASER. Ce couvercle qui est réalisé dans une matière transparente et compatible avec le passage des ultrasons permet la réalisation 10 d'échographie ultrasonore, afin de pouvoir mesurer, sans ouvrir le bioréacteur, l'épaisseur de la cornée avant et/ou après découpe au LASER ou par une autre méthode. Le couvercle épithélial peut être enlevé tout en gardant la surpression dans le compartiment endothélial (18). Ceci peut permettre la 15 réalisation de découpes cornéennes par dissection manuelle ou par microkératome. Ceci peut aussi s'avérer utile dans les expérimentations ex vivo où une instillation de substances est nécessaire sur la face épithéliale de la cornée exposée à l'air environnant The adjustable pressure gradient between the endothelial face and the epithelial surface, with overpressure on the endothelial side, limits the appearance of edema of the corneal stroma, makes it regress when it is present before the introduction of the corneal sample in the bioreactor, limiting the appearance of posterior folds of the cornea and improving the viability of corneal cells, particularly endothelial cells. The corneal bioreactor can be used in any position horizontally or vertically in particular. When used in a horizontal position with the corneal epithelium directed downward, any air bubbles present in the circuit can not accumulate under the corneal dome and do not interfere with observation of the corneal epithelium. cornea. The transparent lid of the epithelial compartment can be accurately and adjustably moved to contact the corneal epithelium and flatten (flatten) the corneal dome with a flat (or curved) surface to facilitate corneal cuts by LASER. This cover, which is made of a transparent material and compatible with the passage of ultrasound, allows ultrasonic ultrasound to be performed, in order to be able to measure, without opening the bioreactor, the thickness of the cornea before and / or after cutting with LASER or by another method. The epithelial cover can be removed while keeping the overpressure in the endothelial compartment (18). This may allow corneal cuts to be made by manual dissection or microkeratome. This may also be useful in ex vivo experiments where instillation of substances is required on the epithelial surface of the cornea exposed to the surrounding air.