FR2980376A1 - Regenerating an enzymatic catalyst arranged in reactor, comprises detaching enzymes by solvation by scavenging a catalyst, and reattaching active enzymes by scavenging a purified support with solution of active enzymes - Google Patents
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Abstract
Description
PROCEDE DE REGENERATION D'UN CATALYSEUR ENZYMATIQUE La présente invention concerne un procédé de régénération d'un catalyseur enzymatique par décrochage/accrochage d'une enzyme sur un support, la dite enzyme étant utilisée accrochée sur son support dans une réaction catalytique. De nos jours de plus en plus de procédés font intervenir la catalyse enzymatique. Ces procédés nécessitent dans la vaste majorité des cas la fixation de l'enzyme sur un support solide particulaire, soit pour des réactions en batch, c'est-à-dire par lot, soit pour des réactions en lit fixe de catalyseur. Cependant, la durée de vie des enzymes est limitée dans le temps et la régénération du catalyseur contenant l'enzyme délicate comparée aux catalyseurs traditionnels. La régénération du catalyseur consiste à décrocher l'enzyme usée puis à accrocher une enzyme active sur le support. Cette opération est souvent compliquée, notamment à l'échelle industrielle où les quantités d'enzymes mises en jeu sont importantes et dont le coût est répercuté directement dans le prix des produits fabriqués. En effet, jusqu'à présent, la régénération du catalyseur à base d'enzymes nécessite de vider les réacteurs du dit catalyseur, de traiter le support du dit catalyseur pour éliminer l'enzyme usée par exemple par traitement chimique et/ou par calcination, puis de recharger le support dans le réacteur et enfin de raccrocher une nouvelle enzyme active sur celui-ci pour reformer le catalyseur actif. Un tel procédé est lourd et coûteux car il allonge très fortement le temps d'inactivité du réacteur. La présente invention vise à remédier à ces inconvénients en proposant un procédé qui ne nécessite pas de décharger le catalyseur pour changer l'enzyme, ni de vider le réacteur qui le contient, ce qui réduit le temps d'inactivité du réacteur. La présente invention a donc pour objet un procédé de régénération d'un catalyseur enzymatique disposé dans un 5 réacteur comprenant un support minéral à base d'oxyde alcalin et/ou alcalino-terreux et au moins d'une enzyme caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de décrochage des enzymes du support par solvatation par balayage du catalyseur au moyen d'au moins un surfactant 10 ionique jusqu'à élimination des enzymes usées, et au moins une étape de raccrochage d'enzymes actives par balayage du dit support épuré par au moins une solution d'enzymes actives, ces deux étapes se faisant in-situ au sein du réacteur. 15 Ce procédé permet de gagner non seulement du temps par rapport aux opérations de manutentions et de traitement du support, mais aussi un gain financier découlant d'une meilleure optimisation de l'utilisation des catalyseurs enzymatiques. Il présente en outre l'avantage d'être 20 applicable à tous types d'enzymes supportées et toutes applications utilisant des enzymes supportées dans des réactions par catalyse enzymatique. On entend par enzyme, une molécule permettant d'abaisser l'énergie d'activation d'une réaction et 25 d'accélérer les réactions chimiques se déroulant dans le milieu sans modifier l'équilibre formé. Elles présentent aussi l'avantage d'être utilisables à température ambiante. L'étape de décrochage des enzymes comprend le balayage du catalyseur par une solution aqueuse de surfactant ionique 30 dit amphiphile, ce surfactant étant choisi dans le groupe constitué par les sels d'alkyls sulfonates, les sels d'alkyls sulfates, les sels d'alkyls sulfosuccinates, les sels d'alkyls phosphates esters, les sels d'alkylbenzène sulfonates, des sels d'ammonium quaternaires pris seuls ou en mélange. Les sels d'ammonium sont généralement choisis parmi les sels de formule N R1R2R3R4+ dans laquelle RI, R2, R3 et R4 sont des groupements alkyles, aryles, aralkyles ou cycloalkyles comprenant de un à 30 atomes de carbone. Parmi ceux-ci sont préférés les sels de tétraméthylammonium, de tétraéthylammonium, de tétrapropylammonium, de tétrabutylammonium, de tétrapenthylammonium, de Tétra-hexylammonium, de benzyltriméthylammonium, benzyltriéthylammonium et d'hexamethionium. Les sels de phosphonium correspondent structurellement en tous points aux sels d'ammonium précédemment cités. The present invention relates to a method for regenerating an enzymatic catalyst by stalling / hooking an enzyme on a support, said enzyme being used suspended on its support in a catalytic reaction. Nowadays more and more processes involve enzymatic catalysis. These processes require in the vast majority of cases the attachment of the enzyme on a particulate solid support, either for batch reactions, that is to say batch, or for fixed bed reactions of catalyst. However, the life of the enzymes is limited in time and the regeneration of the catalyst containing the delicate enzyme compared to conventional catalysts. Regeneration of the catalyst consists of removing the used enzyme and then attaching an active enzyme to the support. This operation is often complicated, especially on an industrial scale where the quantities of enzymes involved are significant and the cost is reflected directly in the price of manufactured products. Indeed, up to now, the regeneration of the enzyme-based catalyst requires emptying the reactors of said catalyst, treating the support of said catalyst to remove the used enzyme for example by chemical treatment and / or by calcination, then reload the support in the reactor and finally hang up a new active enzyme on it to reform the active catalyst. Such a process is cumbersome and expensive because it greatly extends the inactivity time of the reactor. The present invention aims to remedy these drawbacks by proposing a process which does not require the catalyst to be unloaded to change the enzyme, nor to empty the reactor which contains it, which reduces the idle time of the reactor. The subject of the present invention is therefore a process for the regeneration of an enzymatic catalyst placed in a reactor comprising an inorganic support based on alkaline and / or alkaline earth oxide and at least one enzyme characterized in that it comprises at least one stalling step of the carrier enzymes by solvating by sweeping the catalyst with at least one ionic surfactant until the spent enzymes are removed, and at least one step of reattaching active enzymes by sweeping the said support purified by at least one active enzyme solution, these two steps being in-situ in the reactor. This process saves not only time compared to operations of handling and treatment of the support, but also a financial gain resulting from a better optimization of the use of enzymatic catalysts. It further has the advantage of being applicable to all types of supported enzymes and any applications using enzymes supported in enzyme catalysis reactions. The term "enzyme" is intended to mean a molecule making it possible to lower the activation energy of a reaction and to accelerate the chemical reactions taking place in the medium without modifying the equilibrium formed. They also have the advantage of being usable at room temperature. The step of stalling enzymes comprises flushing the catalyst with an aqueous solution of so-called amphiphilic ionic surfactant, said surfactant being selected from the group consisting of alkyl sulphonate salts, alkyl sulphate salts, alkylsulfosuccinates, alkyl ester phosphate salts, alkylbenzene sulfonate salts, quaternary ammonium salts alone or in admixture. The ammonium salts are generally chosen from the salts of formula N R 1 R 2 R 3 R 4 + in which R 1, R 2, R 3 and R 4 are alkyl, aryl, aralkyl or cycloalkyl groups comprising from 1 to 30 carbon atoms. Among these are preferred salts of tetramethylammonium, tetraethylammonium, tetrapropylammonium, tetrabutylammonium, tetrapenthylammonium, tetrahexylammonium, benzyltrimethylammonium, benzyltriethylammonium and hexamethionium. The phosphonium salts structurally correspond in all respects to the ammonium salts mentioned above.
Au cours de l'étape de décrochage des enzymes, on mesurera la quantité d'enzymes entraînées dans l'effluent de sortie du réacteur en mesurant en continu ou en discontinu son absorbance à une longueur d'onde caractéristique de l'enzyme recherchée par spectrométrie UV. Typiquement, les longueurs d'ondes correspondant aux enzymes varient de 280 nm (nanomètres) à 420 nm. Dans le cas, où l'enzyme utilisée est l'hémoglobine, la longueur d'onde caractéristique est de 404nm. La quantité d'enzymes va diminuer dans l'effluent de sortie tout le long de l'étape de décrochage. La fin de cette étape sera atteinte lorsque la mesure différentielle de l'absorbance UV entre l'effluent de sortie et l'effluent d'entrée dans le réacteur, devient nulle. During the enzyme release step, the amount of enzyme entrained in the reactor outlet effluent will be measured by continuously or discontinuously measuring its absorbance at a wavelength characteristic of the desired enzyme by spectrometry. UV. Typically, the wavelengths corresponding to the enzymes vary from 280 nm (nanometers) to 420 nm. In the case where the enzyme used is hemoglobin, the characteristic wavelength is 404 nm. The amount of enzymes will decrease in the outlet effluent throughout the stall phase. The end of this step will be reached when the differential measurement of the UV absorbance between the outlet effluent and the inlet effluent in the reactor becomes zero.
Parmi les surfactants ioniques, les sels de métaux alcalins et alcalino-terreux des alkyls sulfates sont préférés. Ils sont choisis parmi les sels d'alkyls sulfates dont chaque groupement alkyl comprend de 6 à 20 atomes de carbone dans une chaîne paraffinique linéaire ou ramifiée, la dite chaîne comprenant de préférence de 10 à 16 atomes de carbone. De préférence, le sel d'alkyl sulfate est un sel de sodium du sulfate de lauryl encore appelé sodium dodecylsulfate (SDS). Le ou les surfactants ioniques sont introduits dans le réacteur en mélange avec de l'eau, leur concentration variant préférentiellement de 1 à 50 g/L, préférablement de 1 à 20 g/L. Le procédé de l'invention permet le décrochage 15 d'enzymes faisant partie du groupe constitué par les six classes d'enzymes, c'est-à-dire les hydrolases, les transférases, les oxydoréductases, les isomérases, les lyases ou décarboxylases et les lycases. Parmi ces enzymes, le procédé est particulièrement 20 adapté au décrochage des oxydoréductases, particulièrement des hémoprotéines et plus particulièrement de l'hémoglobine. Les supports permettant le décrochage d'enzymes selon le procédé de l'invention, sont des supports minéraux 25 amorphes ou cristallins à base d'oxydes de métaux alcalin et/ou alcalino-terreux de surface spécifique variant de 200 à 1000 m2/g, de préférence à partir de silice et/ou d'alumine de surface spécifique variant de 200 à 600 m2/g. Selon le procédé de l'invention, le raccrochage des 30 enzymes après l'opération de décrochage décrite précédemment est obtenue par balayage du support épuré par une solution d'enzyme jusqu'à ce que la concentration en enzyme, c'est-à-dire son absorbance mesurée à une longueur d'onde caractéristique de l'enzyme recherchée par spectrométrie UV, augmente dans l'effluent de sortie, pour atteindre la même absorbance que dans l'effluent entrant. L'étape de raccrochage se fait soit immédiatement soit plus tard, avec le même type d'enzyme ou un type d'enzyme différent. L'étape de raccrochage des enzymes est terminée lorsque la mesure différentielle de l'absorbance mesurée dans l'effluent d'entrée et dans l'effluent de sortie de réacteur, devient nulle. En effet la concentration de la solution d'enzymes en sortie est identique à celle de la solution entrant dans le réacteur, c'est-à-dire qu'elles présentent une absorbance identique. On ne sortirait pas du cadre de l'invention si 15 plusieurs enzymes de nature différente mais compatibles entre elles étaient introduites sur le support, ces enzymes étant introduites ensemble ou séquentiellement. Dans un mode préféré de l'invention, le procédé comprend entre l'étape de décrochage des enzymes usées et 20 l'étape d'accrochage des enzymes actives, une étape de lavage du support dans le réacteur par de l'eau. Pendant cette étape de lavage, on mesurera l'absorbance par spectrométrie UV à la longueur d'onde de du SDS (260-280 nm) parce qu'il est préférable d'enlever la 25 totalité de SDS servant au décrochage, avant le raccrochage des enzymes. La mesure différentielle de l'absorbance entre l'effluent de sortie et l'effluent entrant restera élevée tant que du surfactant seul ou en mélange avec de l'enzyme usé sera détecté dans la solution de lavage en sortie du 30 dit réacteur. De ce fait, l'étape de lavage prendra fin quand la mesure différentielle de l'absorbance entre les deux effluents deviendra nulle, que ce soit au niveau de l'absorbance UV du SDS ou de celle des enzymes décrochées. Of the ionic surfactants, the alkali metal and alkaline earth metal salts of the alkyl sulfates are preferred. They are chosen from alkyl sulphate salts of which each alkyl group comprises from 6 to 20 carbon atoms in a linear or branched paraffinic chain, said chain preferably comprising from 10 to 16 carbon atoms. Preferably, the alkyl sulfate salt is a sodium salt of lauryl sulfate also called sodium dodecyl sulfate (SDS). The ionic surfactant (s) are introduced into the reactor in a mixture with water, their concentration preferably ranging from 1 to 50 g / l, preferably from 1 to 20 g / l. The method of the invention allows the release of enzymes from the group consisting of the six classes of enzymes, i.e. hydrolases, transferases, oxidoreductases, isomerases, lyases or decarboxylases and the lycases. Among these enzymes, the method is particularly suitable for stalling oxidoreductases, particularly hemoproteins and more particularly hemoglobin. The supports enabling the release of enzymes according to the process of the invention are amorphous or crystalline inorganic supports based on alkali metal and / or alkaline earth metal oxides with a specific surface area ranging from 200 to 1000 m 2 / g, preferably from silica and / or alumina with a specific surface area ranging from 200 to 600 m 2 / g. According to the method of the invention, the on-hooking of the enzymes after the stall operation described above is obtained by scanning the purified support with an enzyme solution until the enzyme concentration, ie its absorbance, measured at a characteristic wavelength of the desired enzyme by UV spectrometry, increases in the outlet effluent to reach the same absorbance as in the incoming effluent. The on-hooking step is either immediately or later, with the same type of enzyme or a different type of enzyme. The enzyme recovery step is terminated when the differential measurement of the absorbance measured in the inlet effluent and in the reactor outlet effluent becomes zero. Indeed, the concentration of the enzyme solution at the outlet is identical to that of the solution entering the reactor, that is to say that they have an identical absorbance. It would not be departing from the scope of the invention if several enzymes of different but compatible nature were introduced on the support, these enzymes being introduced together or sequentially. In a preferred embodiment of the invention, the process comprises between the step of stalling the spent enzymes and the step of attachment of the active enzymes, a step of washing the support in the reactor with water. During this washing step, the absorbance will be measured by UV spectroscopy at the wavelength of SDS (260-280 nm) because it is preferable to remove all of the SDS for stalling, before the hang-up. enzymes. The differential measurement of the absorbance between the outlet effluent and the incoming effluent will remain high as long as surfactant alone or in mixture with spent enzyme will be detected in the washing solution at the outlet of said reactor. Therefore, the washing step will end when the differential measurement of the absorbance between the two effluents will become zero, either at the UV absorbance of the SDS or that of the unhooked enzymes.
Après l'étape de raccrochage, si on souhaite utiliser le catalyseur enzymatique régénéré dans un milieu organique, on pourra avantageusement faire circuler dans le réacteur un mélange eau/solvant contenant une concentration 5 évolutive de 100 à 0% d'eau pour de 0 à 100% d'un solvant organique dans le dit mélange, entre le début et la fin du séchage, le séchage correspondant à une élimination complète de l'eau sur le support et éventuellement retirer le surplus d'enzymes non accrochées. Ce solvant 10 correspondra en général aux solvants choisis comme milieu réactionnel comme par exemple les cétones, les esters et les éthers. Un deuxième objet de l'invention est l'application de l'invention à tous les catalyseurs enzymatiques dans 15 lesquels les enzymes sont accrochées au support par des liaisons de faible énergie telles que des liaisons Van der Waals, des liaisons électrostatiques ou des liaisons hydrogène. Un troisième objet de l'invention est l'utilisation 20 en catalyse enzymatique des catalyseurs régénérés selon le procédé décrit précédemment. Les exemples et figures données ci-après visent à décrire l'invention dans certaines de ses formes particulières mais ne peuvent être considérées comme 25 limitant la portée de celle-ci. Exemple 1 Dans cet exemple, on prépare un catalyseur enzymatique frais. On introduit dans un réacteur 8.4 g de silice 30 Davicat®SI 1700 (Merck), de surface spécifique de 320 m2/g), puis une solution d'hémoglobine non modifiée (commercialisée par Vapran) à 10 g/1 dans une solution tampon à pH=5. Une pompe HPLC est réglée sur un débit de 1 ml/mn pour introduire la solution d'hémoglobine dans le réacteur et le chronomètre est déclenché au moment où la première goutte d'hémoglobine pénètre dans le réacteur. After the on-hooking step, if it is desired to use the regenerated enzymatic catalyst in an organic medium, it will be possible advantageously to circulate in the reactor a water / solvent mixture containing a progressive concentration of 100 to 0% water for from 0 to 100% of an organic solvent in said mixture, between the beginning and the end of the drying, the drying corresponding to a complete elimination of the water on the support and possibly removing the surplus of unhooked enzymes. This solvent will generally correspond to the solvents chosen as the reaction medium, such as, for example, ketones, esters and ethers. A second object of the invention is the application of the invention to all enzymatic catalysts in which the enzymes are attached to the carrier by low energy bonds such as Van der Waals bonds, electrostatic bonds or hydrogen bonds. . A third object of the invention is the use in enzymatic catalysis of regenerated catalysts according to the method described above. The examples and figures given below are intended to describe the invention in some of its particular forms but can not be construed as limiting the scope thereof. Example 1 In this example, a fresh enzymatic catalyst is prepared. 8.4 g of Davicat®SI 1700 (Merck) silica, with a specific surface area of 320 m 2 / g) are introduced into a reactor, followed by a solution of unmodified hemoglobin (marketed by Vapran) at 10 g / l in a buffer solution. at pH = 5. An HPLC pump is set at a flow rate of 1 ml / min to introduce the hemoglobin solution into the reactor and the timer is triggered as the first drop of hemoglobin enters the reactor.
Des prélèvements des effluents en entrée et en sortie du réacteur sont effectués régulièrement afin de mesurer la concentration en hémoglobine, pour déterminer par mesure différentielle entre l'effluent entrant et l'effluent sortant, la quantité d'hémoglobine adsorbée par la silice. Samples of the effluents entering and leaving the reactor are regularly carried out in order to measure the hemoglobin concentration, to determine, by differential measurement between the incoming effluent and the outgoing effluent, the quantity of hemoglobin adsorbed by the silica.
On mesure ainsi les absorbances de l'effluent entrant et de l'effluent de sortie par spectrophotométrie UV au moyen d'un spectromètre UV UVIKON XS commercialisé par Socoman à 404 nm, longueur d'onde correspondant à celle de l'hémoglobine. On suit ainsi la différence d'absorbance entre les deux effluents en fonction du temps d'injection. Bien entendu, le dit spectromètre UV a été préalablement étalonné, à partir de différentes solutions étalons d'hémoglobine dans l'eau à des concentrations différentes. La courbe étalon donnant la mesure d'absorbance UV en fonction de la concentration en hémoglobine de la solution d'hémoglobine utilisée par exemple pour l'accrochage (Voir Figure 1, la courbe d'étalonnage absorbance UV à 404 nm en fonction de la concentration de la solution d'hémoglobine). The absorbances of the incoming effluent and of the outlet effluent are thus measured by UV spectrophotometry using a UVIKON XS UV spectrometer marketed by Socoman at 404 nm, a wavelength corresponding to that of hemoglobin. The difference in absorbance between the two effluents is thus monitored as a function of the injection time. Of course, said UV spectrometer has been previously calibrated from different standard solutions of hemoglobin in water at different concentrations. The standard curve gives the UV absorbance measurement as a function of the hemoglobin concentration of the hemoglobin solution used, for example, for the attachment (see FIG. 1, the UV absorbance calibration curve at 404 nm as a function of the concentration. of the hemoglobin solution).
En calculant la quantité d'hémoglobine introduite dans le réacteur avant que la mesure différentielle de l'absorbance entre l'entrée et la sortie ne devienne nulle, on peut déterminer la quantité maximale d'hémoglobine accrochée sur la silice. La Figure 2 montre l'évolution de la quantité d'hémoglobine, rapportée à la masse de silice introduite dans la réacteur, qui est accrochée sur la silice. La saturation de la silice en hémoglobine est ici de 100 mg/g de silice. By calculating the amount of hemoglobin introduced into the reactor before the differential measurement of absorbance between inlet and outlet becomes zero, the maximum amount of hemoglobin attached to the silica can be determined. Figure 2 shows the evolution of the amount of hemoglobin, relative to the mass of silica introduced into the reactor, which is attached to the silica. The saturation of the silica with hemoglobin is here 100 mg / g of silica.
L'hémoglobine étant soluble dans l'eau jusqu'à une concentration de 100g/1, il est possible de répéter cette expérience à concentration plus forte (par exemple 30 ou 50 g/1) afin de réduire le temps nécessaire à l'accrochage de l'hémoglobine sur la silice. Exemple 2 Cet exemple décrit l'effet du débit d'entrée de la solution d'hémoglobine sur la vitesse d'accrochage de celle-ci sur le support en silice pour apprécier les performances en adsorption du support pour un catalyseur enzymatique frais. Comme dans l'exemple 1, on utilise comme effluent d'entrée une solution d'hémoglobine à 10g/1 dans de l'eau qui est percolée dans le réacteur préalablement garni de 8.4 g de silice Davicat®SI 1700. Le débit de la pompe HPLC est réglée pour varier de 0,2 à 1 ml/mn selon les expériences (dans la Figure 3 ; 0,2 ml/minute ; 0,5 ml/minute ; 1 ml/minute), et pour chacune d'elles, le chronomètre est déclenché au moment où la première goutte de solution d'hémoglobine pénètre dans le réacteur. Since hemoglobin is soluble in water up to a concentration of 100 g / l, it is possible to repeat this experiment at a higher concentration (for example 30 or 50 g / l) in order to reduce the time required for hanging. hemoglobin on the silica. Example 2 This example describes the effect of the inlet flow rate of the hemoglobin solution on the rate of attachment thereof to the silica support to assess the adsorption performance of the carrier for a fresh enzymatic catalyst. As in Example 1, a solution of hemoglobin at 10 g / l in water which is percolated in the reactor previously packed with 8.4 g of Davicat®SI 1700 silica is used as inlet effluent. The flow rate of the HPLC pump is set to vary from 0.2 to 1 ml / min depending on the experiments (in Figure 3, 0.2 ml / minute, 0.5 ml / minute, 1 ml / minute), and for each of them the stopwatch is triggered when the first drop of hemoglobin solution enters the reactor.
Des prélèvements de l'effluent en sortie du réacteur sont effectués régulièrement afin de suivre l'évolution de la concentration en hémoglobine, donc la quantité d'hémoglobine qui est restée accrochée sur le support en 5 silice par rapport à la quantité d'hémoglobine dans l'effluent d'entrée du réacteur. Comme précédemment, la quantité d'hémoglobine adsorbée par la silice est obtenue à partir de la mesure différentielle entre les absorbances de l'effluent d'entrée toujours constant et celles des 10 effluents de sortie en fonction de la vitesse d'injection de la solution d'hémoglobine. La Figure 3 présente l'évolution de la quantité d'hémoglobine accrochée par gramme de silice, en fonction du débit de la pompe d'alimentation en solution 15 d'hémoglobine. On constate que la vitesse d'adsorption de l'hémoglobine sur la silice est d'autant plus importante que le débit de l'effluent en entrée du réacteur est grand. L'augmentation de débit permet de réduire le temps de saturation de la silice en hémoglobine. 20 Exemple 3 Le présent exemple décrit l'influence de la quantité de sodium lauryl sulfate ou SDS utilisé dans l'étape de décrochage de l'hémoglobine du support tel que préparé dans 25 l'exemple 1 sur l'absorbance mesurée dans la solution d'hémoglobine, soit en entrée soit en sortie du réacteur. Pour prendre en compte l'influence de la présence de SDS sur les mesures d'absorbance de la solution d'hémoglobine, nous avons effectué des mesures d'absorbance 30 au spectromètre UV entre 350-550 nm de solutions d'hémoglobine contenant de teneurs en SDS variables, afin d'étalonner l'appareil. Samples of the effluent leaving the reactor are regularly taken in order to follow the evolution of the hemoglobin concentration, therefore the amount of hemoglobin which has remained attached to the silica support relative to the amount of hemoglobin in the silica. reactor effluent. As before, the amount of hemoglobin adsorbed by the silica is obtained from the differential measurement between the absorbances of the inlet effluent, which is always constant, and that of the outlet effluents, as a function of the injection speed of the solution. hemoglobin. Figure 3 shows the change in the amount of hemoglobin hung per gram of silica, as a function of the flow rate of the hemoglobin solution feed pump. It is found that the rate of adsorption of hemoglobin on the silica is all the more important that the flow rate of the effluent at the inlet of the reactor is large. The increase in flow makes it possible to reduce the saturation time of the silica with hemoglobin. EXAMPLE 3 This example describes the influence of the amount of sodium lauryl sulfate or SDS used in the carrier hemoglobin drop step as prepared in Example 1 on the absorbance measured in the solution. hemoglobin, either at the inlet or at the outlet of the reactor. To take into account the influence of the presence of SDS on the absorbance measurements of the hemoglobin solution, we performed absorbance measurements at the UV spectrometer between 350-550 nm of hemoglobin solutions containing contents. in SDS variables, in order to calibrate the device.
Ces mesures ont été répétées pour deux concentrations en hémoglobine à 0,25g/1 et à 50g/l. Sur la Figure 4, quelle que soit la concentration d'hémoglobine dans l'eau dans l'effluent d'entrée, on 5 constate une diminution de l'absorbance UV caractéristique de l'hémoglobine à 404nm en présence de SDS. Cependant, cette modification est stable dans le temps. En effet, la concentration en SDS n'a que très peu d'influence sur l'absorbance de l'hémoglobine à 404 nm, et 10 d'autre part, la linéarité est bien respectée quelque soit la concentration en SDS. Exemple 4 15 Le présent exemple décrit l'étape de décrochage de l'hémoglobine accrochée sur la silice dans le cas du catalyseur préparé dans l'exemple 2. Ainsi, on dispose d'un catalyseur enzymatique contenant 93 mg/g d'hémoglobine absorbés sur de la silice. 20 Au cours de l'étape de décrochage, une solution aqueuse de SDS à 10g/1 est introduite dans le réacteur à un débit de 1 ml/mn via la pompe HPLC précédemment décrite. La quantité d'hémoglobine décrochée de la silice est mesurée en comparant les valeurs de l'absorbance dans 25 l'effluent d'entrée contenant que du SDS en solution et dans l'effluent de sortie contenant toujours du SDS mais aussi de l'hémoglobine. L'étalonnage du spectromètre UV a été fait comme décrit dans l'exemple 1 avec différentes solutions étalons 30 d'hémoglobine en présence de SDS. Les courbes étalons donnant la mesure d'absorbance correspondant à la concentration en hémoglobine de la solution étalon (voir Figure 4). These measurements were repeated for two hemoglobin concentrations at 0.25g / l and 50g / l. In FIG. 4, regardless of the concentration of hemoglobin in the water in the inlet effluent, there is a decrease in UV absorbance characteristic of hemoglobin at 404 nm in the presence of SDS. However, this change is stable over time. Indeed, the concentration of SDS has very little influence on the absorbance of hemoglobin at 404 nm, and on the other hand, the linearity is well respected regardless of the concentration of SDS. Example 4 This example describes the step of stalling hemoglobin attached to the silica in the case of the catalyst prepared in Example 2. Thus, an enzymatic catalyst containing 93 mg / g of absorbed hemoglobin is available. on silica. During the stalling step, an aqueous solution of SDS at 10 g / l is introduced into the reactor at a flow rate of 1 ml / min via the HPLC pump described above. The amount of hemoglobin removed from the silica is measured by comparing the absorbance values in the inlet effluent containing only SDS in solution and in the outlet effluent still containing SDS but also hemoglobin. . Calibration of the UV spectrometer was done as described in Example 1 with different standard solutions of hemoglobin in the presence of SDS. The standard curves give the absorbance measurement corresponding to the hemoglobin concentration of the standard solution (see Figure 4).
Des échantillons de l'effluent de sortie sont prélevés à 10mn, 20 mn, 30 mn, 60 mn, 120mn, 240mn et 480 mn pour évaluer leur absorbance à 404nm et donc leur concentration en hémoglobine en sortie du réacteur. Le profil de désorption de l'hémoglobine lors de la phase de décrochage a été représenté dans la Figure 6 à partir de ces valeurs mesurées. A la fin cette étape de décrochage, 88 mg 10 d'hémoglobine/g de silice ont été décrochés et récupérés en sortie de réacteur, soit 95% de la quantité d'hémoglobine initialement absorbée sur la silice. Exemp_r_ 5 15 Le présent exemple décrit l'étape de raccrochage d'hémoglobine sur le support duquel on vient de décrocher l'hémoglobine selon l'exemple 4, après une étape de lavage ou de rinçage du réacteur à l'eau jusqu'à ce que plus de 20 SDS soit détecté dans l'effluent de sortie du réacteur. A la fin de cette étape, on réintroduit en continu comme décrit dans l'exemple 2 une solution d'hémoglobine à 10g/1 jusqu'à ce les absorbances UV de l'effluent en entrée de réacteur et celle de l'effluent en sortie de réacteur 25 soient identiques, la teneur en hémoglobine en entrée et en sortie étant égale. L'évolution de la quantité d'hémoglobine fixée est donnée dans la Figure 5, montrant les deux cycles d'accrochage. Le cycle 1 correspond à l'accrochage tel que 30 décrit dans l'exemple 2 et le cycle 2 au raccrochage effectué après les étapes de décrochage et de lavage du réacteur décrites dans le présent exemple et dans l'exemple 4. Samples of the outlet effluent are taken at 10 min, 20 min, 30 min, 60 min, 120 min, 240 min and 480 min to evaluate their absorbance at 404 nm and thus their hemoglobin concentration at the outlet of the reactor. The desorption profile of hemoglobin during the stall phase has been shown in Figure 6 from these measured values. At the end of this stalling step, 88 mg of hemoglobin / g of silica were removed and recovered at the reactor outlet, ie 95% of the amount of hemoglobin initially absorbed on the silica. EXAMPLE 5 This example describes the hemoglobin uptake step on the carrier from which the hemoglobin has just been withdrawn according to Example 4, after a step of washing or rinsing the reactor with water until more than 20 SDS is detected in the reactor effluent. At the end of this step, a solution of hemoglobin at 10 g / l is continuously reintroduced as described in Example 2 until the UV absorbances of the effluent at the reactor inlet and that of the effluent at the outlet of reactor 25 are identical, the hemoglobin content at the inlet and outlet being equal. The evolution of the amount of fixed hemoglobin is given in Figure 5, showing the two hooking cycles. Ring 1 corresponds to the hooking as described in Example 2 and cycle 2 to hang-up performed after the stall and wash steps of the reactor described in this example and in Example 4.
On constate que les profils d'immobilisation correspondant du premier cycle d'accrochage pour préparer du catalyseur frais et du second cycle après décrochage de l'enzyme se superposent. Le traitement au SDS pour le décrochage de l'hémoglobine de la silice n'entraine donc pas de diminution du potentiel d'absorption de l'hémoglobine sur la silice, en vue de son immobilisation. It is found that the corresponding immobilization profiles of the first attachment cycle to prepare fresh catalyst and the second cycle after stalling of the enzyme are superimposed. The treatment with SDS for the drop-out of the hemoglobin of the silica therefore does not involve a reduction of the absorption potential of the hemoglobin on the silica, with a view to its immobilization.
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