FR2980211A1 - METHOD OF ANALYZING GENOMIC DNA - Google Patents

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Abstract

La présente invention se rapporte à une séquence d'acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1, ainsi qu'à son utilisation pour une analyse d'ADN génomique humain, notamment en tant que calibreur interne universel. Elle se rapporte également à un procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité génomique d'un gène cible, et à l'utilisation de ce procédé pour diverses applications : évaluer la qualité d'un ADN humain, réaliser une analyse moléculaire de tumeur, déterminer l'effet d'une substance ou d'un traitement physique et/ou biologique sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon, rechercher dans un test de criblage de substances, celles qui régulent positivement ou négativement ce nombre de copies de gènes cibles, ou effectuer un test de criblage de tumeurs. La présente se rapporte également à un kit d'analyse d'ADN génomique humain comprenant notamment des amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 et une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1 produits.The present invention relates to a nucleic acid sequence of sequence SEQ ID NO: 1, as well as to its use for human genomic DNA analysis, in particular as a universal internal calibrator. It also relates to an in vitro method for analyzing the variation of the genomic quantity of a target gene, and the use of this method for various applications: to evaluate the quality of a human DNA, to perform a molecular analysis of tumor, determine the effect of a substance or physical and / or biological treatment on the number of copies of a target gene in a sample, search in a screening test of substances, those that regulate positively or negatively this number of copies of target genes, or perform a tumor screening test. The present invention also relates to a human genomic DNA analysis kit comprising notably sense and antisense primers for amplifying the sequence SEQ ID NO: 1 and a fluorescent probe making it possible to quantify the amplicons of SEQ ID NO: 1 products .

Description

METHODE D'ANALYSE D'ADN GENOMIQUE Domaine technique La présente invention se rapporte à une séquence d'acide nucléique, ainsi qu'à son utilisation pour une analyse d'ADN génomique humain, notamment en tant que calibreur interne universel. Elle se rapporte également à un procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité génomique d'un gène cible, et à l'utilisation de ce procédé pour diverses applications : évaluer la qualité d'un ADN humain, réaliser une analyse moléculaire de tumeur, déterminer l'effet d'une substance ou d'un traitement physique et/ou biologique sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon, rechercher dans un test de criblage de substances, celles qui régulent positivement ou négativement ce nombre de copies de gènes cibles, ou effectuer un test de criblage de tumeurs. La présente invention se rapporte également à un kit d'analyse d'ADN génomique humain. Elle trouve des applications dans le domaine des biotechnologies, par exemple pour le contrôle de la qualité d'ADNs distribués par des 2 0 biobanques, pour l'analyse moléculaire des tumeurs, pour tester la toxicité et la génotoxicité des molécules à usage cosmétologiques ou pharmacologiques, ou pour le criblage à la recherche de médicaments. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (11) renvoient à la liste des références présentées à la fin des exemples. 25 Etat de la technique La variabilité du nombre de copies d'un gène est une forme particulière du polymorphisme. Elle correspond au fait que le nombre de copies d'un même gène dans le génome est variable entre les individus 30 d'une même espèce. On estime à ce jour que plus de 12% du génome humain est concerné par ce type de polymorphisme (Redon et al. « Global 2 9 8 0 2 1 1 2 variation in copy number in the human genome », Nature, vol. 444, 2006, p. 444-454 [1]). Le nombre de copies d'un gène cible peut aussi varier de manière pathologique dans le cas de certaines tumeurs et peut leur donner, alors, 5 un « marquage » particulier. Pouvoir mesurer ce nombre, peut également servir d'outil de criblage de molécules, pour permettre de rechercher l'activité bénéfique ou néfaste d'une substance. Il permet aussi de cribler des tumeurs pour réaliser des corrélations entre le nombre de copie de gènes et des traitements thérapeutiques. Enfin, il permet aussi de mesurer 10 directement dans un ADN donné la dégradation naturelle ou artificielle de cet ADN. La variation du nombre de copies d'un gène cible peut être notamment un puissant marqueur génétique pour le diagnostic d'un grand nombre de maladies génétiques, telle que la trisomie, ou de cancers voir 15 de résistance à des cancers (cancer du sein et amplification de CerB2). La variation du nombre de copies d'un gène cible peut également permettre de mesurer la variation du nombre de mitochondries et donc la variation d'activité métabolique d'une cellule. Elle peut être ainsi un indicateur toxicologique. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nucleic acid sequence, as well as to its use for human genomic DNA analysis, in particular as a universal internal calibrator. It also relates to an in vitro method for analyzing the variation of the genomic quantity of a target gene, and the use of this method for various applications: to evaluate the quality of a human DNA, to perform a molecular analysis of tumor, determine the effect of a substance or physical and / or biological treatment on the number of copies of a target gene in a sample, search in a screening test of substances, those that regulate positively or negatively this number of copies of target genes, or perform a tumor screening test. The present invention also relates to a human genomic DNA analysis kit. It finds applications in the field of biotechnology, for example for the quality control of DNAs distributed by biobanks, for the molecular analysis of tumors, for testing the toxicity and genotoxicity of cosmetological or pharmacological molecules. , or for screening for drugs. In the description below, references in square brackets (11) refer to the list of references at the end of the examples. State of the art The variability of the number of copies of a gene is a particular form of polymorphism. It corresponds to the fact that the number of copies of the same gene in the genome is variable between individuals of the same species. It is estimated that more than 12% of the human genome is affected by this type of polymorphism (Redon et al., "Global 2 9 8 0 2 1 1 2 variation in the human genome", Nature, vol 444 2006: 444-454 [1]). The number of copies of a target gene may also vary pathologically in the case of certain tumors and may give them, then, a particular "tagging". Being able to measure this number, can also serve as a tool for screening molecules, to enable one to search for the beneficial or harmful activity of a substance. It also makes it possible to screen tumors for correlations between the number of gene copies and therapeutic treatments. Finally, it also makes it possible to measure directly in a given DNA the natural or artificial degradation of this DNA. The variation in the number of copies of a target gene may be in particular a powerful genetic marker for the diagnosis of a large number of genetic diseases, such as trisomy, or cancers or even resistance to cancers (breast cancer and amplification of CerB2). The variation in the number of copies of a target gene can also make it possible to measure the variation in the number of mitochondria and therefore the variation in the metabolic activity of a cell. It can thus be a toxicological indicator.

Elle peut également être un indicateur de chances de réponses à un traitement thérapeutique ou un indicateur de l'évolution d'une maladie, tel qu'un cancer, pendant un traitement thérapeutique. L'ordonnance de l'union européen REACH (« enRegistrement, Evaluation et Autorisation des substances Chimiques »), entrée en vigueur en juin 2007, obligent notamment les industries chimiques, cosmétiques et pharmacologiques, à fournir les données de sûreté sanitaire et environnementale sur toutes les substances qu'elles produisent. La fourniture de ces données peut notamment passer par l'utilisation de méthodes d'analyse d'ADN. It can also be an indicator of the chances of responses to a therapeutic treatment or an indicator of the evolution of a disease, such as cancer, during a therapeutic treatment. The European Union's REACH ("Registration, Evaluation and Authorization of Chemicals") Ordinance, which entered into force in June 2007, obliges the chemical, cosmetic and pharmacological industries to provide health and environmental safety data on all the substances they produce. The provision of these data may include the use of DNA analysis methods.

Les méthodes actuellement utilisées pour quantifier un ADN sont la mesure de densité optique et l'électrophorèse en gel agarose. Ces méthodes sont grossières et ne permettent pas d'apprécier la qualité de l'ADN et en particulier ses dégradations minimes. Plus récemment, des essais ont été proposés pour quantifier l'ADN double brin par intercalage de Syber green (marque déposée). Toutefois les résultats obtenus sont très instables. Une autre méthode utilisée est la spectrométrie UV. Cependant cette méthode pose également des problèmes d'interprétation des résultats en raison de la différence d'absorption significative entre des ADN simples brins et doubles brins. Par ailleurs, pour analyser de l'ADN génomique, les méthodes actuellement utilisées sont le Fish (« hybridation in situ en fluorescence »), l'allélotypage, la CGH array (« puce d'hybridation génomique comparative ») et éventuellement le séquençage massif. Ces méthodes nécessitent l'utilisation d'équipement coûteux et de personnel hyperspécialisé pour l'interprétation des résultats. En outre, les résultats obtenus par ces méthodes ne sont pas quantitatifs. Il existe donc de réels besoins de mettre au point de nouveaux outils pour l'analyse d'ADN génomique, notamment de nouvelles méthodes, palliant les défauts, inconvénients et obstacles précités de l'art antérieur. En particulier, il est nécessaire de mettre au point un procédé facile à mettre en oeuvre, peu couteux, adapté au haut débit et ayant une bonne sensibilité ainsi qu'une bonne spécificité. The methods currently used to quantify a DNA are optical density measurement and agarose gel electrophoresis. These methods are crude and do not allow to appreciate the quality of the DNA and in particular its minimal degradation. More recently, trials have been proposed to quantify double-stranded DNA by intercalating Syber green (registered trademark). However, the results obtained are very unstable. Another method used is UV spectrometry. However, this method also poses problems of interpretation of the results because of the significant difference in absorption between single-stranded and double-stranded DNAs. Moreover, to analyze genomic DNA, the methods currently used are fish ("fluorescence in situ hybridization"), allelotyping, CGH array ("comparative genomic hybridization chip") and possibly massive sequencing. . These methods require the use of expensive equipment and hyperspecialized personnel for the interpretation of the results. In addition, the results obtained by these methods are not quantitative. There are therefore real needs to develop new tools for genomic DNA analysis, including new methods, overcoming the defects, disadvantages and obstacles mentioned above in the prior art. In particular, it is necessary to develop a process easy to implement, inexpensive, suitable for broadband and having good sensitivity and good specificity.

Description de l'invention La présente invention répond précisément à ces besoins en fournissant un procédé qui permet de mesurer la quantité génomiques intactes, par exemple le nombre de copies, d'un gène cible quelconque par rapport à un calibreur interne universel, ainsi que les moyens nécessaires pour la mise en oeuvre de ce procédé. 2 9 8 0 2 1 1 4 Ainsi, la présente invention à notamment pour objet un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1. Elle a également pour objet l'utilisation de l'acide nucléique SEQ ID NO : 1 pour une analyse d'ADN génomique humain. 5 Selon l'invention, l'acide nucléique SEQ ID NO : 1 peut être utilisé par exemple comme calibreur pour une analyse d'ADN génomique humain. Dans la présente, on entend par « calibreur », toute séquence d'acide nucléique permettant de normaliser les résultats d'une analyse 10 d'ADN génomique. Le terme « calibrateur » peut également être utilisé. Les inventeurs de la présente sont les tous premiers à avoir identifié la séquence SEQ ID NO : 1 comme étant un acide nucléique très conservé chez l'homme, c'est-à-dire extrêmement stable, c'est-à-dire sans variation du nombre de copies, dans le génome humain. Cette séquence 15 est située dans la région RXRB dans le premier intron du Chromosome 6. Cette séquence a été désignée par les inventeurs comme « calibreur interne universel ». On entend par séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1, une séquence constitué par la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence 20 ayant la même fonction et présentant au moins 60 % d'homologie avec SEQ ID NO : 1, par exemple au moins 70%, par exemple au moins 80%, par exemple au moins 90%, par exemple au moins 95%, par exemple au moins 99%. Par ailleurs, les inventeurs ont constaté que le nombre de copies 25 de cette séquence dans le génome humain est constant, à savoir environ 330 copies haploïdes/ng d'ADN. Dans la présente, l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1 peut être également appelée « gène RXRB », « gène RXRbéta », « bétastan », « calibreur selon l'invention », « calibrateur interne, ou encore 30 « calibrateur interne universel ». 2 9 802 1 1 5 Dans la présente, on entend par « ADN génomique humain », l'ensemble comprenant le génome chromosomique humain et le génome mitochondrial humain. On entend par « génome chromosomique humain », l'ensemble du 5 matériel génétique contenu dans les chromosomes d'un être humain. On entend par « génome mitochondrial humain », l'ensemble du matériel génétique contenu dans les mitochondries d'un être humain. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro 10 d'analyse d'ADN génomique humain utilisant l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1. Le procédé selon l'invention peut être notamment un procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 comprenant l'utilisation d'un acide nucléique de séquence 15 SEQ ID NO : 1. Par exemple, le procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 comprendre une étape de comparaison de la quantité du gène cible dans un échantillon à tester avec la quantité du gène cible dans un échantillon de référence. 20 Par exemple, l'étape de comparaison de la quantité du gène cible dans un échantillon à tester avec la quantité du gène cible dans un échantillon de référence peut être réalisée en utilisant la méthode du AA de Ct. La méthode du AA de Ct est une méthode bien connue de l'homme 25 du métier (C A Heid, J Stevens, K J Livak, and P M Williams. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996. 6: 986-994 [2]; Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR 30 experiments. Clin Chem. 2009, 55(4):611-22 [3]; Weglarz L, Molin I, Orchel A, Parfiniewicz B, Dzierzewicz Z. Quantitative analysis of the level of p53 and p21(WAF1) mRNA in human colon cancer HT-29 cells treated with inositol hexaphosphate. Acta Biochim Pol. 2006;53(2):349-56 [4] . Elle utilise la relation mathématique suivante : La méthode du AACt est bien connue de l'homme du métier pour mesurer la quantité d'un ADNc dans un échantillon donné relativement à un ADNc de référence. Nous avons adapté cette technologie pour mesurer le nombre de copies génomiques d'un gène cible donné par rapport au nombre de copies génomiques d'un gène calibreur qui a la particularité d'être très stable. Description of the Invention The present invention specifically addresses these needs by providing a method for measuring the intact genomic amount, e.g., the number of copies, of any target gene relative to a universal internal calibrator, as well as the means necessary for the implementation of this method. Thus, the subject of the present invention is in particular a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1. It also relates to the use of the nucleic acid SEQ ID NO: 1 for a nucleic acid analysis. Human genomic DNA. According to the invention, the nucleic acid SEQ ID NO: 1 can be used, for example, as a calibrator for human genomic DNA analysis. As used herein, the term "calibrator" refers to any nucleic acid sequence that makes it possible to normalize the results of a genomic DNA assay. The term "calibrator" can also be used. The inventors of the present are the first to have identified the sequence SEQ ID NO: 1 as being a nucleic acid highly conserved in humans, that is to say extremely stable, that is to say without variation number of copies, in the human genome. This sequence is located in the RXRB region in the first intron of Chromosome 6. This sequence has been designated by the inventors as "universal internal calibrator". By nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 is meant a sequence consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence having the same function and having at least 60% homology with SEQ ID NO: 1, by at least 70%, for example at least 80%, for example at least 90%, for example at least 95%, for example at least 99%. On the other hand, the inventors have found that the copy number of this sequence in the human genome is constant, namely about 330 haploid copies / ng of DNA. In the present invention, the nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1 may also be called "RXRB gene", "RXRbeta gene", "betastan", "calibrator according to the invention", "internal calibrator, or else" calibrator universal internal ". In the present, the term "human genomic DNA", the group comprising the human chromosomal genome and the human mitochondrial genome. By "human chromosomal genome" is meant the entire genetic material contained in the chromosomes of a human being. The term "human mitochondrial genome" means all the genetic material contained in the mitochondria of a human being. The subject of the present invention is also an in vitro method for analyzing human genomic DNA using the nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1. The method according to the invention may especially be an in vitro method for the analysis of human genomic DNA. the variation of the amount of a target gene different from SEQ ID NO: 1 comprising the use of a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1. For example, the in vitro method for analyzing the variation of the amount of a target gene different from SEQ ID NO: 1 comprising a step of comparing the amount of the target gene in a test sample with the amount of the target gene in a reference sample. For example, the step of comparing the amount of the target gene in a test sample with the amount of the target gene in a reference sample can be performed using the AA method of Ct. The AA method of Ct is a method well known to those skilled in the art (CA Heid, Stevens J, KJ Livak, and PM Williams, Real time quantitative PCR, Genome Res 1996. 6: 986-994 [2], Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR 30 experiments Clin Chem. 2009, 55 (4): 611-22 [3], Weglarz L, Molin I, Orchel A, Parfiniewicz B, Dzierzewicz Z. Quantitative analysis of the level of p53 and p21 (WAF1) mRNA in human colon cancer HT-29 cells treated with inositol hexaphosphate, Acta Biochim Pol 2006; 53 (2): 349-56 [4], using the following mathematical relationship: AAC method It is well known to those skilled in the art to measure the amount of a cDNA in a given sample relative to a reference cDNA. We have adapted this technology to measure the number of genomic copies of a given target gene compared to the number of genomic copies of a calibrator gene that has the particularity of being very stable.

La formule développée est la suivante ACt(échantillon à tester) = Ct(gène cible dans échantillon à tester) - Ct(gène calibreur dans échantillon à tester) et ACt(échantillon d'ADN contrôle) = Ct(gène cible dans échantillon d'ADN contrôle) - Ct(gène calibreur dans échantillon contrôle). The structural formula is as follows: ACt (test sample) = Ct (target gene in test sample) - Ct (calibrator gene in test sample) and ACt (control DNA sample) = Ct (target gene in test sample DNA control) - Ct (calibrator gene in control sample).

Le principe de la qPCR, son protocole opératoire, les différents paramétrages du thermocycleur sont présentés par exemple dans le document « Relative Quantification: Data Management & Analysis Settings », Ray Meng, [5] (accessible en ligne sur http://genome.hku.hk/portal/files/GRC/Events/Seminars/2009/20090512/rel 20 ative°/020quantification_date/020managemenC/020`)/020analysis%20setting s.pdf). Les notions principales et particulières, applicables au procédé d'analyse de la variation du nombre de copies génomiques d'un gène cible quelconque dans un échantillon sont les suivantes : 25 Le Ct (« Cycle treshold » en anglais) est le point, le cycle, de la courbe d'amplification de l'échantillon de référence où la fluorescence détectée devient supérieure au bruit de fond. Le Ct est déterminé automatiquement par l'appareil de qPCR utilisé mais il doit, de temps en temps, être ajusté manuellement sur 30 certains thermocycleurs. The principle of qPCR, its operating protocol, the various settings of the thermal cycler are presented, for example, in the document "Relative Quantification: Data Management & Analysis Settings", Ray Meng, [5] (available online at http://genome. hku.hk/portal/files/GRC/Events/Seminars/2009/20090512/rel 20 ative ° / 020quantification_date / 020managemenC / 020`) / 020analysis% 20setting s.pdf). The main and particular concepts applicable to the method of analyzing the variation in the number of genomic copies of any target gene in a sample are as follows: Ct (Cycle treshold) is the point, the cycle , the amplification curve of the reference sample where the detected fluorescence becomes greater than the background noise. The Ct is automatically determined by the qPCR apparatus used but it must, from time to time, be manually adjusted on some thermal cyclers.

Le seuil utilisé (« Treshold » en anglais) est fixé de manière à couper toutes les courbes de fluorescence au niveau de la phase exponentielle de la qPCR. Dans ce cas, la valeur de Ct représente bien la quantité initiale de matrice ADN présente dans l'échantillon. The threshold used ("threshold" in English) is set so as to cut all the fluorescence curves at the exponential phase of the qPCR. In this case, the value of Ct represents the initial amount of DNA template present in the sample.

Le Ct moyen de référence, est calculé à l'aide d'une gamme de dilution d'ADN de référence et va servir ensuite à homogénéiser des mesures faites éventuellement sur d'autres plaques de PCR. En effet et pour chaque nouvelle plaque de qPCR, les points 100, 50 et 25 ng d'une gamme ADN de référence du laboratoire sont toujours analysés en triplicatas pour un gène cible donné. Ces points servent à s'assurer de la bonne efficacité de la qPCR duplex concernée et permettent la normalisation et donc la comparaison des résultats obtenus de manipulation en manipulation pour des milliers d'échantillons. Le Ct moyen de référence obtenu avec une gamme initiale de dilution d'ADN adéquate seront, en effet, toujours repris pour toutes les manipulations ultérieures pour le gène cible concerné. Les ADN de référence contiennent idéalement, des quantités de gène cible et de gène calibreur normales soit environ, 330 copies de génome haploïdes/ng chacun. The mean reference Ct is calculated using a reference DNA dilution range and will then be used to homogenize measurements possibly made on other PCR plates. Indeed and for each new qPCR plate, the points 100, 50 and 25 ng of a reference DNA range of the laboratory are always analyzed in triplicate for a given target gene. These points are used to ensure the effectiveness of the duplex qPCR concerned and allow the standardization and therefore the comparison of the results obtained handling manipulation for thousands of samples. The average reference Ct obtained with an initial range of adequate DNA dilution will in fact always be used for all subsequent manipulations for the target gene concerned. The reference DNAs ideally contain normal target gene and calibrator gene amounts of approximately 330 copies of haploid genome / ng each.

La quantité de gène cible pour la gamme des échantillons de référence du laboratoire est « rentrée » dans le logiciel d'un thermocycleur comme contenant 25, 50 ng et 100 ng de gène cible. Le calibreur a été indiqué comme « calibreur ». Les échantillons sont indiqués comme « standard » ou contrôle. Ces paramètres ont été choisis afin de pouvoir utiliser en l'état les logiciels de thermocycleur qui ne sont pas faits pour cela. On peut par exemple utiliser le logiciel CFX manager en utilisant la relation mathématique suivante : AACt = ACt(échantillon à tester) - ACt(échantillon 30 Standard/contrôle) Dans cette formule, ACt(échantillon à tester) = Ct(gène cible dans échantillon à tester) - Ct(gène calibreur dans échantillon à tester) et ACt(échantillon d'ADN Standard/contrôle) = Ct(gène cible dans échantillon d'ADN Standard/contrôle) - Ct(gène calibreur dans échantillon Standard/contrôle). Les valeurs obtenues sont transformées en logarithmes de la concentration d'ADN pour les comparer et les représenter sous forme graphique comme sur la figure 1 pour créer une gamme standard qui permet de lire le Ct moyen calculé par la machine, la pente de la courbe et donc l'efficacité de la qPCR duplex gène cible/calibreur universel. Des échantillons à analyser peuvent être ajoutés et seront analysés en même temps et sur la même plaque et les résultats obtenus seront calculés de la même façon en incluant si nécessaire un ADN contrôle positif voir négatif de l'expérience qui a généré les ADN. The amount of target gene for the range of laboratory reference samples is "fed back" into the thermal cycler software as containing 25, 50 ng and 100 ng of target gene. The calibrator has been indicated as "calibrator". Samples are indicated as "standard" or control. These parameters have been chosen in order to be able to use the thermal cycler software that is not made for this purpose. For example, the CFX manager software can be used using the following mathematical relationship: AACt = ACt (test sample) - ACt (standard sample / control) In this formula, ACt (test sample) = Ct (target gene in sample to test) - Ct (calibrator gene in test sample) and ACt (standard DNA sample / control) = Ct (target gene in standard DNA sample / control) - Ct (calibrator gene in standard sample / control). The obtained values are transformed into logarithms of the DNA concentration to compare and represent them graphically as in Figure 1 to create a standard range that reads the average Ct calculated by the machine, the slope of the curve and therefore the efficiency of the qPCR duplex gene target / universal calibrator. Samples to be analyzed can be added and analyzed at the same time and on the same plate and the results obtained will be calculated in the same way by including if necessary a control DNA positive or negative of the experiment that generated the DNAs.

Les résultats obtenus seront transformés automatiquement en 2- mct pour comparaison et enfin exprimés en histogrammes automatisés. Les histogrammes indiquent en abscisses : le nom de l'échantillon et en ordonnées le nombre de fois [augmenté (amplification) ou diminué (délétion)] de copies du gène cible par rapport au nombre de copies du gène cible mesuré dans l'ADN contrôle spécifique de l'expérience. Les résultats sont normalisés par le calibreur. Usuellement, les logiciels de quantification des machines de qPCR sont adaptés pour mesurer des concentrations d'ADNc en utilisant la méthode du AACt et leur conversion en 2-'8"8c. Les résultats sont exprimés 2 5 relativement à un gène (ADNc) de référence dont l'expression ne varie pas. Le gène de référence est mesuré dans chaque échantillon par rapport à un échantillon contrôle dont la quantité d'ADNc est indiquée au logiciel. Une dilution en cascade de ce contrôle sert à s'assurer des paramètres d'efficacité de la qPCR. Les résultats sont des concentrations d'ADNc. 30 Pour utiliser ce logiciel en l'état pour mesure de l'ADN génomique, le gène de référence utilisé est le calibreur selon l'invention. L'échantillon contrôle, dont la concentration est connue, est l'ADN standard/contrôle. Par exemple, la fluorescence de la sonde du gène de référence, c'est-à-dire du gène calibreur est orange. Le calibreur permet de normaliser tous les résultats obtenus pour chaque gène cible. Par exemple, la fluorescence de la seconde sonde, qui s'hybride au gène cible, est jaune. Ces fluorescences seront mesurées à la fin de chaque cycle par le thermocycleur (mesure en temps réel) En utilisant la méthode du AACt décrite ci-dessus et la conversion en 2-'8"8c, le « rapport de fluorescence » (par exemple jaune sur orange), de la qPCR duplex, c'est-à-dire du gène cible sur le calibreur interne, est le plus souvent égal à 1 dans l'ADN de référence et dans toutes ses dilutions car c'est le rapport de l'intensité de fluorescence jaune sur orange qui est chiffré. Il l'est aussi dans les ADN contrôles. Ceci avec une tolérance de plus ou moins 5 % ; tous les échantillons avec Ct de calibreur supérieur à 28 sont éliminés et retestés. La méthode du AA de Ct est également présentée dans l'Exemple 1 ci-dessous. Selon l'invention, la quantité de gène est avantageusement un nombre de copie de gène. On entend par « nombre de copie d'un gène », la quantité relative ou absolue d'un gène dans le génome. Dans la présente, on entend par « échantillon », toute solution comprenant un ADN. Il peut s'agir par exemple d'une solution comprenant un ADN préalablement extrait d'un individu. The results obtained will be automatically transformed into 2- mct for comparison and finally expressed in automated histograms. The histograms indicate on the abscissa: the name of the sample and on the ordinate the number of times [increased (amplification) or decreased (deletion)] of copies of the target gene compared to the number of copies of the target gene measured in the control DNA specific experience. The results are normalized by the calibrator. Usually, the quantization software of the qPCR machines is adapted to measure cDNA concentrations using the AACt method and their conversion to 2 -18 ° C. The results are expressed relative to a cDNA gene. reference whose expression does not vary The reference gene is measured in each sample with respect to a control sample, the amount of cDNA of which is indicated in the software, and a cascade dilution of this control is used to ascertain the parameters of the reference gene. Efficacy of qPCR The results are cDNA concentrations To use this software as is for the measurement of genomic DNA, the reference gene used is the calibrator according to the invention. the concentration of which is known is the standard / control DNA.For example, the fluorescence of the reference gene probe, that is to say the calibrator gene, is orange.The calibrator makes it possible to normalize all the results obtained. For example, the fluorescence of the second probe, which hybridizes to the target gene, is yellow. These fluorescences will be measured at the end of each cycle by the thermocycler (real time measurement). Using the AACt method described above and the conversion to 2 -8 "8c, the" fluorescence ratio "(for example yellow on orange), the duplex qPCR, that is to say the target gene on the internal calibrator, is most often equal to 1 in the reference DNA and in all its dilutions because it is the ratio of the yellow-on-orange fluorescence intensity, which is quantified, and also in the control DNAs, with a tolerance of plus or minus 5%, all samples with a calibrator greater than 28 are eliminated and retested. AA of Ct is also presented in Example 1 below, According to the invention, the amount of gene is advantageously a gene copy number.The term "number of copies of a gene" is the relative amount or of a gene in the genome. "any solution comprising a DNA. It may be for example a solution comprising a DNA previously extracted from an individual.

On entend par « échantillon de référence », tout échantillon comprenant de l'ADN préalablement prélevé chez un individu de référence. On entend par « échantillon à tester » ou « échantillon à analyser », tout échantillon comprenant de l'ADN préalablement prélevé chez un individu à tester. The term "reference sample" means any sample comprising DNA previously taken from a reference individual. The term "sample to be tested" or "sample to be analyzed" means any sample comprising DNA previously taken from an individual to be tested.

On entend par « individu », une ou plusieurs cellules, un tissu, un organe ou un être vivant. Par exemple, l'individu peut être toute cellule comprenant de l'ADN. Par exemple, l'individu peut être une cellule HepG2, une cellule hépatique normale, une cellule cardiaque normale, une cellule tumorale, une cellule foetale, une cellule souche, une cellule modifiée par génie génétique. Il peut également s'agit d'un tissu reconstitué in vitro, par exemple, il peut s'agir d'un expiant cutané ou un expiant oculaire, d'un organe ou d'un fragment d'organe. On entend par « individu de référence », tout individu que l'on choisi comme référence ou contrôle. Il peut s'agir par exemple de tout individu dont on connait le nombre de copies d'un gène cible donné. En effet, un individu de référence pour un gène cible A n'est pas forcément un individu de référence pour un gène cible B. On entend par « individu à tester », tout individu dont on souhaite connaitre la variation du nombre de copies d'un gène cible donné. Dans la présente, on entend par « gène cible », toute séquence d'ADN comprise dans un génome. Un gène cible peut être déterminé par sa séquence ou par des séquences d'amorces sens et antisens qui permettent d'amplifier la séquence du gène cible. Selon l'invention, dans le procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1, l'échantillon de référence et l'échantillon à tester peuvent provenir d'un seul individu ou de deux individus, voire de plus de deux individus. Ainsi, selon la présente invention l'individu de référence et l'individu à tester peuvent être le même individu. Lorsque l'échantillon de référence et l'échantillon à tester proviennent de deux individus, la mise en oeuvre du procédé selon l'invention permet d'analyser à un instant donné la variation au cours du temps du nombre de copies intactes d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1. Lorsque l'échantillon de référence et l'échantillon à tester proviennent d'un seul individu, l'échantillon de référence et l'échantillon à tester peuvent par exemple avoir préalablement été prélevés sur un même individu et être analysés à deux, voire plusieurs, instants différents. L'échantillon de référence et l'échantillon à tester peuvent également avoir subit des traitements différents. Dans ce cas, la mise en oeuvre du procédé selon l'invention permet d'analyser la variation au cours du temps du nombre de copies d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 chez un même individu. Le procédé selon l'invention permet une quantification vraie du nombre de copies génomiques intactes de gènes cibles en utilisant des machines et des logiciels existants. "Individual" means one or more cells, a tissue, an organ or a living being. For example, the individual may be any cell comprising DNA. For example, the individual may be a HepG2 cell, a normal liver cell, a normal heart cell, a tumor cell, a fetal cell, a stem cell, a genetically engineered cell. It may also be an in vitro reconstituted tissue, for example, it may be a skin explant or an ocular explant, an organ or an organ fragment. Reference person refers to any individual who is chosen as a reference or control. It may be for example any individual whose known number of copies of a given target gene is known. Indeed, a reference individual for a target gene A is not necessarily a reference individual for a target gene B. The term "individual to be tested" means any individual whose number of copies of a given target gene. As used herein, the term "target gene" is intended to mean any DNA sequence included in a genome. A target gene can be determined by its sequence or by sense and antisense primer sequences which make it possible to amplify the sequence of the target gene. According to the invention, in the in vitro method for analyzing the variation of the amount of a target gene different from SEQ ID NO: 1, the reference sample and the sample to be tested may come from a single individual. or two individuals, or even more than two individuals. Thus, according to the present invention, the reference individual and the individual to be tested may be the same individual. When the reference sample and the sample to be tested come from two individuals, the implementation of the method according to the invention makes it possible to analyze at a given moment the variation over time of the number of intact copies of a gene. target different from SEQ ID NO: 1. When the reference sample and the test sample come from a single individual, the reference sample and the sample to be tested may, for example, have previously been taken from the same individual and be analyzed at two or more different times. The reference sample and the sample to be tested may also have undergone different treatments. In this case, the implementation of the method according to the invention makes it possible to analyze the variation over time of the number of copies of a target gene different from SEQ ID NO: 1 in the same individual. The method according to the invention allows a true quantification of the number of intact genomic copies of target genes using existing machines and software.

Le procédé selon la présente invention peut par exemple être réalisé par qPCR (pour « quantitative polymerase chain reaction » en anglais), également appelée RT-PCR (pour « real time polymerase chain reaction » en anglais), PCR en temps réel ou PCR quantitative. La qPCR est une technique bien connue de l'homme du métier. 15 Elle nécessite l'utilisation d'amorces sens et antisens permettant d'amplifier une séquence, ainsi que l'utilisation d'une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons produits lors de la qPCR. Les amorces sens et antisens et la sonde fluorescentes sont des séquences d'acide nucléique qui sont avantageusement spécifiques de la 20 séquence à amplifier. Par ailleurs, la sonde fluorescente peut par exemple posséder un fluorochrome. Avantageusement, ce fluorochrome est stable, résistant au pH et aux variations de températures et ne modifie pas la température de demi-dénaturation (« Tm ») de la sonde. Le fluorochrome peut par 25 exemple être choisi pour ses propriétés d'absorbtion/émission d'énergie, en accordance avec les capacités de détection des machines de qPCR. Par exemple, le fluorochrome peut être choisi dans le groupe comprenant les cyanines, les rhodamines, les coumarines. Par exemple le fluorochrome peut être choisi dans le groupe comprenant le Texas red 30 (marque déposée), le Cascade Blue (marque déposée), Alexa Fluor (marque déposée), le VIC (marque déposée), le FAM (marque déposée), Yakima yellow (marque déposée) ), le TET, (marque déposée), le JOE (marque déposée), le HEX (marque déposée), le ATTO 550 (marque déposée), le Tamra (Tetramethylrhodamin) et le ROX (marque déposée). Un fluorochrome, également appelé fluorophore, est une molécule qui émet une fluorescence. Elle provient d'un groupe fonctionnel qui dans cette molécule absorbe l'énergie électromagnétique d'une longueur d'onde donnée et la réémet à une autre longueur d'onde spécifique. L'homme du métier est à même de déterminer quelle longueur d'onde appliquer en fonction du fluorochrome utilisé. La fluorescence émise est mesurée en ligne à la fin de chaque cycle de qPCR. La sonde fluorescente peut avantageusement posséder à la fois un fluorochrome et un inhibiteur de fluorescence, appelé également extincteur ou « quencher », l'un étant disposé en 5' de la séquence de la sonde fluorescente, l'autre étant disposé en 3' de cette même séquence. The process according to the present invention may for example be carried out by qPCR (for "quantitative polymerase chain reaction" in English), also called RT-PCR (for "real time polymerase chain reaction" in English), real-time PCR or quantitative PCR. . QPCR is a technique well known to those skilled in the art. It requires the use of sense and antisense primers to amplify a sequence, as well as the use of a fluorescent probe to quantify the amplicons produced during the qPCR. The sense and antisense primers and the fluorescent probe are nucleic acid sequences which are advantageously specific for the sequence to be amplified. Moreover, the fluorescent probe may for example have a fluorochrome. Advantageously, this fluorochrome is stable, resistant to pH and temperature variations and does not modify the half-denaturation temperature ("Tm") of the probe. The fluorochrome may for example be selected for its energy absorbing / emitting properties, in accordance with the detection capabilities of the qPCR machines. For example, the fluorochrome may be selected from the group consisting of cyanines, rhodamines, coumarins. For example, the fluorochrome may be selected from the group consisting of Texas red 30 (registered trademark), Cascade Blue (registered trademark), Alexa Fluor (registered trademark), VIC (registered trademark), FAM (registered trademark), Yakima yellow (registered trademark)), TET (registered trademark), JOE (registered trademark), HEX (registered trademark), ATTO 550 (registered trademark), Tamra (Tetramethylrhodamin) and ROX (registered trademark). A fluorochrome, also called fluorophore, is a molecule that emits fluorescence. It comes from a functional group that in this molecule absorbs the electromagnetic energy of a given wavelength and re-emits it at another specific wavelength. The skilled person is able to determine what wavelength to apply depending on the fluorochrome used. The fluorescence emitted is measured online at the end of each qPCR cycle. The fluorescent probe may advantageously have both a fluorochrome and a fluorescence inhibitor, also called extinguisher or "quencher", one being arranged in 5 'of the sequence of the fluorescent probe, the other being arranged in 3' of this same sequence.

Un extincteur est une entité moléculaire, ou une espèce chimique, capable de désactiver un état excité créé dans une entité moléculaire par transfert d'énergie, d'électron ou par un mécanisme chimique. Ainsi un quencher est une molécule qui permet d'inhiber la fluorescence d'un fluorochrome. Le quencher peut par exemple être choisi dans le groupe comprenant le BHQ1 (« Black Hole Quencher 1 (marque déposée) », en anglais), le BHQ2 (« Black Hole Quencher 2 (marque déposée) », en anglais), le Dabsyl (dimethylaminoazosulfonic acid), les Dark Quencher Eclipse (marque déposée) avec le BBQ650 (marque déposée), le TAMRA (Tetramethylrhodamin), les Qxl quenchers (marque déposée), le iow black FQ Iowa (marque déposée) et le black RQ IRDye QC-1 (marque déposée). Par exemple, la sonde fluorescente peut être une sonde TaqMan (marque déposée). Avant la qPCR, lorsqu'aucune amplification n'a eu lieu et que la sonde fluorescente est intacte, le quencher inhibe la fluorescence du fluorochrome. Seule une fluorescence résiduelle peut être observée. Au cours de la qPCR, les sondes fluorescentes hybridées sur les amplicons synthétisés, sont hydrolysées lors de chaque étape d'élongation des amorces. Le fluorochrome est alors libéré loin de l'extincteur et sa fluorescence n'est plus inhibée par celui ci. An extinguisher is a molecular entity, or chemical species, capable of deactivating an excited state created in a molecular entity by energy, electron or chemical transfer. Thus a quencher is a molecule that can inhibit the fluorescence of a fluorochrome. The quencher may for example be selected from the group comprising BHQ1 ("Black Hole Quencher 1 (registered trademark)", the BHQ2 ("Black Hole Quencher 2 (registered trademark)", in English), Dabsyl ( dimethylaminoazosulfonic acid), Dark Quencher Eclipse (trademark) with BBQ650 (registered trademark), TAMRA (Tetramethylrhodamin), Qxl quenchers (registered trademark), iow black FQ Iowa (registered trademark) and black RQ IRDye QC- 1 (registered trademark). For example, the fluorescent probe may be a TaqMan (trademark) probe. Before qPCR, when no amplification has taken place and the fluorescent probe is intact, the quencher inhibits fluorochrome fluorescence. Only residual fluorescence can be observed. During qPCR, the fluorescent probes hybridized on the synthesized amplicons are hydrolyzed during each stage of elongation of the primers. The fluorochrome is then released far from the extinguisher and its fluorescence is no longer inhibited by it.

L'émission de la fluorescence libérée peut alors être mesurée à la fin de chaque cycle de qPCR. Cette mesure permet de définir une valeur de « Ct » (« cycle threshold » en anglais ou « cycle seuil ») correspondant au nombre de cycles de qPCR nécessaires pour que la valeur de l'intensité de fluorescence soit alors significativement différente du bruit de fond, c'est-à-dire différente de la fluorescence initiale éventuelle. Le procédé de la présente invention peut être réalisé à toute température permettant d'analyser un ADN génomique. Lorsque le gène cible à analyser est le génome mitochondrial, voire un gène transfecté, il est possible d'améliorer le procédé de l'invention, par exemple en utilisant des températures réactionnelles plus défavorables pour ces gènes cibles parce qu'ils sont en excès par rapport au calibreur et saturent les possibilités de détection de la machine de qPCR. A titre d'exemple, on peut utiliser une température d'appariement des amorces comprise entre 58 et 64°C, par exemple de 63°C. The emission of the fluorescence released can then be measured at the end of each qPCR cycle. This measurement makes it possible to define a value of "Ct" ("cycle threshold" in English or "threshold cycle") corresponding to the number of qPCR cycles necessary so that the value of the fluorescence intensity is then significantly different from the background noise. that is to say different from the initial initial fluorescence. The method of the present invention can be performed at any temperature to analyze genomic DNA. When the target gene to be analyzed is the mitochondrial genome, or even a transfected gene, it is possible to improve the method of the invention, for example by using reaction temperatures which are more unfavorable for these target genes because they are in excess by report to the calibrator and saturate the detection capabilities of the qPCR machine. For example, a primer pairing temperature of between 58 and 64 ° C, for example 63 ° C, may be used.

La qPCR peut être réalisée en simplex, dans des tubes/puits différents c'est-à-dire qu'une seule cible est amplifiée par réaction de qPCR, ou en duplex, c'est-à-dire que deux cibles différentes sont amplifiées en une seule réaction qPCR. Elle peut également être réalisée en triplex ou en quadruplex, c'est-à-dire que respectivement deux ou trois cibles sont amplifiées en une seule réaction de qPCR en plus du calibreur universel. De préférence, les amorces et sondes utilisés sont conçues et validées pour donner, ensemble, des qPCR spécifiques et d'efficacités comparables. The qPCR can be carried out in simplex, in different tubes / wells, that is to say that a single target is amplified by reaction of qPCR, or in duplex, that is to say that two different targets are amplified in a single qPCR reaction. It can also be realized in triplex or quadruplex, that is to say that respectively two or three targets are amplified in a single reaction of qPCR in addition to the universal calibrator. Preferably, the primers and probes used are designed and validated to give, together, specific qPCRs and comparable efficiencies.

De préférence, la qPCR est réalisée en duplex. En effet, la réalisation de la qPCR en duplex permet notamment d'économiser les réactifs puisque les deux qPCR ont lieu simultanément dans le même tube. Cela permet également d'éliminer les variations dues aux erreurs de manipulation puisque les deux qPCR ont lieu simultanément dans le même tube. Preferably, the qPCR is carried out in duplex. Indeed, the realization of duplex qPCR allows in particular to save the reagents since both qPCR occur simultaneously in the same tube. This also eliminates variations due to handling errors since both qPCRs occur simultaneously in the same tube.

Lorsque la qPCR est réalisée en duplex, deux sondes fluorescentes marquées respectivement avec deux fluorochromes différents doivent être utilisées pour différencier les amplicons produits lors de la qPCR. Selon la présente invention, lorsque la qPCR est réalisée en duplexe, elle inclue toujours le même calibreur universel, à savoir la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1. Lorsque deux sondes fluorescentes sont marquées respectivement avec deux fluorochromes différents, il peut s'agir de tout polyplexe de fluorophores qui donne des détections bien séparées des fluorescences. Il peut s'agir par exemple des couples de fluorochromes choisis dans le groupe comprenant Texas red (marque déposée) /VIC (marque déposée), Texas red (marque déposée) /Yakima yellow (marque déposée), Texas red (marque déposée) /TET yellow (marque déposée), Texas red (marque déposée) /HEX (marque déposée), Texas red (marque déposée) /JOE (marque déposée). When the qPCR is performed in duplex, two fluorescent probes labeled respectively with two different fluorochromes must be used to differentiate the amplicons produced during the qPCR. According to the present invention, when the qPCR is carried out in duplex, it always includes the same universal sizer, namely the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1. When two fluorescent probes are respectively labeled with two different fluorochromes, it can be used. act of any polyplex of fluorophores which gives detections well separated from the fluorescences. It may be, for example, pairs of fluorochromes selected from the group consisting of Texas red (registered trademark) / VIC (trademark), Texas red (registered trademark) / Yakima yellow (registered trademark), Texas red (registered trademark) / TET yellow (registered trademark), Texas red (registered trademark) / HEX (registered trademark), Texas red (registered trademark) / JOE (registered trademark).

De préférence, on utilise deux fluorochromes ayant des rendements quantiques proches, par exemple le couple de fluorophores : Texas red (marque déposée) /Yakima yellow (marque déposée). Plusieurs applications industrielles sont possibles, notamment en fonction de la nature et des jeux du ou des gènes cibles choisis, le calibreur interne universel restant le même, à savoir la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1. Par exemple, des jeux de gènes cibles ont été identifiés par les inventeurs, parce qu'ils présentent, seuls ou ensembles, un intérêt en diagnostique et/ou en pronostique. En fonction des gènes cibles analysés, il est donc possible, par exemple : d'évaluer la dégradation d'un ADN. Cette application est dénommée « DNAqual » dans la présente. Elle permet par exemple de tester la qualité des ADNs tels des ADNs extraits d'individus, distribués par des biobanques ou de quantifier la dégradation d'un ADN causée par des phénomènes physiques, biologiques ou chimiques, directs ou indirects. Ainsi, on entend par « évaluation de la qualité d'un ADN », l'évaluation de l'intégralité d'un ADN, de son niveau de dégradation éventuel. DNAqual permet également de suivre les quantités de lésions causées par un traitement ou une substance ou par un déficit cellulaire en enzymes capables de réparer l'ADN génomique. de mesurer le nombre de copies de génome mitochondrial et donc le nombre de mitochondries présentes dans une cellule ou un tissu à un instant donné ou à des instants différents. Cette application est dénommée « MITOC » dans la présente. Elle permet également de montrer la toxicité d'une molécule donnée ou d'un traitement donné en montrant les variations du nombre de copies de génome mitochondrial dans le temps. de montrer la génotoxicité induite par une molécule déterminée ou un traitement donné lorsque les gènes cibles utilisés bordent des sites fragiles de l'ADN, et d'autres comme par exemple des sites choisis dans le groupe comprenant P16, GRID2, LRP1B, FHIT et ADAMTS18. Un gène cible choisi dans le groupe comprenant EGFR1 humain, TNFRSF10A (trail receptor 4) humain, TNFRSF1OB (TRAIL- R2 - CDC262) humain, TPBG humain, ERBB3 humain et ERBB4 humain peut être utilisé comme contrôle négatif. Cette application est dénommée « Genotox » dans la présente. Par exemple, l'application Genotox peut être réalisée sur des extraits de cellules ou tissus dans le but d'évaluer leurs niveaux d'intoxication. Genotox peut également être réalisé à partir de cellules ou de tissus modèles traités par un ou des phénomènes physiques, chimiques ou biologiques (comme par exemple une protéine) potentiellement toxiques afin d'apprécier l'éventuel effet mutagène du phénomène testé sur le génome des cellules. En effet, un effet mutagène se manifeste par une réplication infidèle de l'ADN lésé par le produit toxique et donc des variations de nombre de copies de ces gènes que ce soit des délétions ou des amplifications. En théorie, elles frappent plus volontiers l'ADN des sites fragiles. Par exemple, Genotox peut être utilisé dans un test de criblage de substances qui pourrait avoir un effet toxique sur un individu. Par exemple Genotox peut être utilisé dans un test de criblage de cellules ou tissus ayant été soumis à différents traitements pour évaluer la toxicité de ces traitements. Dans un autre exemple, Genotox peut être utilisé dans un test sur cellules ou tissus ayant été soumis à différents traitements pour classifier ces cellules ou tissus selon leur degré de résistance à ces traitements. de permettre une catégorisation moléculaire de pathologies, par exemples des tumeurs, dans le cadre de la médecine personnalisée, pour par exemple, mieux indiquer une thérapeutique en mesurant le nombre de copies de gènes cibles pour lesquels il existe une thérapeutique ciblant ces gènes, leurs protéines ou voies cellulaires correspondantes. Par exemple il existe des thérapies ciblant une ou plusieurs molécules, comme par exemple des récepteurs impliqués dans la maladie, par le biais d'anticorps monoclonaux ou de petites molécules chimiques. Pour prédire, suive ou comprendre la résistance des tumeurs aux thérapies comme par exemples des thérapies ciblées ou des chimiothérapies parce que ces tumeurs présentent des amplifications des gènes impliqués dans une telle résistance (par exemple : MDR, Topo 1 et 2) en mesurant le nombre de copies de ces gènes de résistance. Pour prédire, suivre ou comprendre le caractère agressif d'une pathologie, par exemple une tumeur, et les chances de réponses à un traitement en détectant les signatures d'agressivité de cette pathologie, par exemple une tumeur. Cette application est dénommée « Copycount » dans la présente. Copycount pourrait donc avoir une utilité dans le cadre de kit de diagnostics et/ou théranostics, afin d'aider à identifier le meilleur traitement et de suivre la maladie pendant le traitement (test compagnon de traitement). On entend par « théranostic », l'association d'un test diagnostique à une thérapie. Par exemple, Copycount pourrait être utilisé dans un test de criblage de tumeurs. Preferably, two fluorochromes having close quantum yields are used, for example the pair of fluorophores: Texas red (registered trademark) / Yakima yellow (registered trademark). Several industrial applications are possible, in particular depending on the nature and the games of the target gene or genes chosen, the universal internal calibrator remaining the same, namely the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1. Target genes have been identified by the inventors because they present, alone or together, an interest in diagnosis and / or prognosis. Depending on the target genes analyzed, it is therefore possible, for example: to evaluate the degradation of a DNA. This application is referred to as "DNAqual" herein. It allows for example to test the quality of DNAs such as DNAs extracted from individuals, distributed by biobanks or to quantify the degradation of a DNA caused by physical, biological or chemical phenomena, direct or indirect. Thus, the term "evaluation of the quality of a DNA", the evaluation of the entirety of a DNA, its possible level of degradation. DNAqual also tracks the amount of damage caused by a treatment or a substance or a cell deficit in enzymes that can repair genomic DNA. to measure the number of copies of mitochondrial genome and thus the number of mitochondria present in a cell or a tissue at a given time or at different times. This application is referred to as "MITOC" herein. It also shows the toxicity of a given molecule or treatment by showing changes in the number of mitochondrial genome copies over time. to show the genotoxicity induced by a given molecule or a given treatment when the target genes used border fragile sites of the DNA, and others such as for example sites selected from the group comprising P16, GRID2, LRP1B, FHIT and ADAMTS18 . A target gene selected from the group consisting of human EGFR1, human TNFRSF10A (trail receptor 4), human TNFRSF1OB (TRAIL-R2-CDC262), human TPBG, human ERBB3, and human ERBB4 can be used as a negative control. This application is referred to as "Genotox" herein. For example, the Genotox application can be performed on extracts of cells or tissues in order to evaluate their levels of intoxication. Genotox can also be produced from cells or model tissues treated by one or more potentially toxic physical, chemical or biological phenomena (such as a protein) in order to appreciate the possible mutagenic effect of the phenomenon tested on the genome of the cells. . Indeed, a mutagenic effect is manifested by an unfaithful replication of the DNA damaged by the toxic product and therefore variations in the number of copies of these genes, whether deletions or amplifications. In theory, they are more likely to strike the DNA of fragile sites. For example, Genotox can be used in a screening test for substances that could have a toxic effect on an individual. For example Genotox can be used in a screening test of cells or tissues that have been subjected to different treatments to evaluate the toxicity of these treatments. In another example, Genotox can be used in a test on cells or tissues that have been subjected to different treatments to classify these cells or tissues according to their degree of resistance to these treatments. to allow a molecular categorization of pathologies, for example tumors, in the context of personalized medicine, for example, to better indicate a therapeutic by measuring the number of copies of target genes for which there is a therapeutic targeting these genes, their proteins or corresponding cellular pathways. For example, there are therapies targeting one or more molecules, for example receptors involved in the disease, by means of monoclonal antibodies or small chemical molecules. To predict, follow or understand the resistance of tumors to therapies such as targeted therapies or chemotherapies because these tumors have amplifications of the genes involved in such resistance (eg MDR, Topo 1 and 2) by measuring the number copies of these resistance genes. To predict, follow or understand the aggressive nature of a pathology, for example a tumor, and the chances of responding to a treatment by detecting the aggressiveness signatures of this pathology, for example a tumor. This application is referred to as "Copycount" herein. Copycount could therefore have utility as part of diagnostic kit and / or theranostics, to help identify the best treatment and monitor the disease during treatment (companion treatment test). By "theranostics" is meant the combination of a diagnostic test with a therapy. For example, Copycount could be used in a tumor screening test.

Cribler les tumeurs avec Copycount permet, par exemple, d'évaluer le lien entre l'efficacité d'un traitement thérapeutique et les nombres de copies des gènes codant pour la cible biologique du traitement thérapeutique. - de quantifier les résultats des expériences de transfection d'un plasmide luciférase dans des cellules ou tissus modèles. Cette application est dénommée « Luciola » dans la présente. - de mesurer des signatures d'agressivité tumorale et d'ethnicité. Tumor screening with Copycount, for example, makes it possible to evaluate the link between the effectiveness of a therapeutic treatment and the copy numbers of the genes coding for the biological target of the therapeutic treatment. to quantify the results of transfection experiments of a luciferase plasmid in model cells or tissues. This application is referred to as "Luciola" in this. - to measure signatures of tumor aggressiveness and ethnicity.

Par ailleurs, les inventeurs ont mis au point des amorces sens et antisens, ainsi que des sondes fluorescentes spécifiques de chacun de ces gènes cibles. Ces gènes cibles, amorces sens et antisens et sondes fluorescentes sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Les séquences des amorces sens et antisens mises au point par les inventeurs pour amplifier le calibreur de séquence SEQ ID NO : 1 sont respectivement les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO: 3. La sonde fluorescente spécifique mise au point par les inventeurs pour détecter les amplicons produits de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1, a pour séquence SEQ ID NO : 4. In addition, the inventors have developed sense and antisense primers, as well as fluorescent probes specific for each of these target genes. These target genes, sense and antisense primers and fluorescent probes are shown in Table 1 below. The sequences of the sense and antisense primers developed by the inventors for amplifying the calibrator of sequence SEQ ID NO: 1 are respectively the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. The specific fluorescent probe developed by the inventors for detecting the amplicons produced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, has the sequence SEQ ID NO: 4.

Tableau 1 : Applications possibles en fonctions des gènes cibles analysés Application Gène cible visé Amorce sens Amorce Sonde antisens SEQ ID NO DNAqual EGFR1 humain 9 10 11 Copycount EGFR1 humain 9 10 11 humain CERB-B2 humain 12 13 14 ERBB3 humain 15 16 17 ERBB4 humain 18 19 20 TOP I humain 21 22 23 TOPO 2 ALPHA humain 24 25 26 MDR humain 27 28 29 MET humain 30 31 32 IGFR1 humain 33 34 35 SDMAD4 humain 36 37 38 TNFRSF10A (TRAIL R 39 40 41 4) humain TNFRSF1OB (TRAIL-R2 - CDC262) humain 42 43 44 TPBG humain 45 46 47 (trophoblast glycoprotein) VEGR2-KDR-FLK1 48 49 50 humain GENOTOX CDKN2-P16 humain 51 52 53 humain ADAMTS18 humain 54 55 56 LRP1B humain 57 58 59 GRID2 humain 60 61 62 FHIT humain 63 64 65 MITOC - 66 67 68 Humain La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus pour évaluer la qualité d'un ADN humain. Dans la présente on entend par « évaluer la qualité d'un ADN », le fait de quantifier la dégradation d'un ADN engendré par des phénomènes 10 physiques et/ou biologiques et/ou chimiques. Par exemple, les phénomènes physiques peuvent être une irradiation UV des ADNs, une lyophilisation préalable des tissus, un chauffage des ADNs, etc... Les phénomènes biologiques peuvent être par exemple une dégradation d'ADN causée par un microorganisme, par exemple une bactérie ou par une enzyme. Les phénomènes chimiques peuvent être par exemple tout phénomène causé par une substance, une molécule dans une cellule/tissus modèles, etc. Il peut s'agir également d'une combinaison de ces phénomènes. Il peut également s'agir d'une dégradation causée par une manipulation de l'ADN, par exemple lors de son extraction à partir d'une cellule. Table 1: Possible applications according to the target genes analyzed Application Target target gene Sense primer Primer Antisense probe SEQ ID NO DNAqual EGFR1 human 9 10 11 Human EGFR1 copycount 9 10 11 human CERB-B2 human 12 13 14 human ERBB3 15 16 17 human ERBB4 18 19 TOP 21 human 21 22 23 TOPO 2 human ALPHA 24 25 26 human MDR 27 28 29 human MET 30 31 32 human IGFR1 33 34 35 human SDMAD4 36 37 38 TNFRSF10A (TRAIL R 39 40 41 4) human TNFRSF1OB (TRAIL) R2 - CDC262) human 42 43 44 human TPBG 45 46 47 (trophoblast glycoprotein) VEGR2-KDR-FLK1 48 49 50 human GENOTOX CDKN2-P16 human 51 52 53 human ADAMTS18 human 54 55 56 human LRP1B 57 58 59 human GRID2 60 61 62 Human FHIT 63 64 65 MITOC - 66 67 68 Human The present invention also relates to the use of the in vitro method for analyzing the variation of the amount of a target gene different from SEQ ID NO: 1 defined above. to evaluate the quality of a human DNA. As used herein, the term "assaying the quality of a DNA" is intended to quantify the degradation of DNA generated by physical and / or biological and / or chemical phenomena. For example, the physical phenomena can be a UV irradiation of the DNAs, a prior lyophilization of the tissues, a heating of the DNAs, etc. The biological phenomena can be for example a DNA degradation caused by a microorganism, for example a bacterium or by an enzyme. The chemical phenomena can be for example any phenomenon caused by a substance, a molecule in a cell / model tissues, etc. It can also be a combination of these phenomena. It can also be a degradation caused by manipulation of the DNA, for example during its extraction from a cell.

De préférence, pour évaluer la qualité d'un ADN humain, le gène cible utilisé est EGFR1 humain. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus pour déterminer l'effet d'une substance et/ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus pour déterminer la toxicité d'une substance et/ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. Dans la présente, on entend par « effet d'un traitement sur le nombre de copie d'un gène cible », l'effet provoqué par des phénomènes physiques et/ou biologiques et/ou chimiques sur le nombre de copie du gène cible. Par exemple, les phénomènes physiques peuvent être une irradiation UV des ADNs, une lyophilisation préalable des tissus, un chauffage des ADNs, etc. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus dans un test de criblage. Preferably, to evaluate the quality of a human DNA, the target gene used is human EGFR1. The subject of the present invention is also the use of the in vitro method for analyzing the variation of the quantity of a target gene different from SEQ ID NO: 1 defined above for determining the effect of a substance and / or a treatment on the number of copies of a target gene in a sample. The present invention also relates to the use of the in vitro method for analyzing the variation of the amount of a target gene different from SEQ ID NO: 1 defined above for determining the toxicity of a substance and / or of a treatment on the number of copies of a target gene in a sample. In the present context, the term "effect of a treatment on the number of copies of a target gene" means the effect caused by physical and / or biological and / or chemical phenomena on the number of copies of the target gene. For example, the physical phenomena may be UV irradiation of the DNAs, prior lyophilization of the tissues, heating of the DNAs, etc. The present invention also relates to the use of the in vitro method for analyzing the variation of the amount of a target gene different from SEQ ID NO: 1 defined above in a screening test.

Par exemple le test de criblage peut être un test de criblage d'une substance ou d'une tumeur. Un test de criblage peut permettre, par exemple, de détecter l'effet d'une substance ou d'un traitement sur le génome d'un individu. Le traitement peut être par exemple un traitement protecteur, positif, thérapeutique ou toxique. Par exemple, le traitement peut être choisi dans le groupe comprenant une exposition aux UV, une irradiation, l'application d'une molécule. Par exemple la molécule peut être choisie dans le groupe comprenant les anti-UV, les antioxydants, les antimutagènes, les antitoxiques et les protecteurs de l'ADN et de sa réplication. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus pour aider à déterminer et/ou adapter un traitement et/ou suivre l'évolution d'une maladie pendant son traitement. La présente invention a également pour objet un kit d'analyse d'ADN génomique humain comprenant des amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 du calibreur, et une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1 produits. Par exemple, les amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 du calibreur peuvent être respectivement de séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3. La sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1, produits peut être par exemple de séquence SEQ ID NO : 4. Cette sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1, produits peut être, par exemple, une sonde de séquence SEQ ID NO : 4. 2 9 8 0 2 1 1 21 Les inventeurs sont les premiers à avoir identifié que le gène EGFR1 humain (chr 7:55224226-55238906) peut être utilisé pour évaluer la qualité d'un ADN humain. Ils sont en outre les premiers à avoir identifié une méthode simple 5 et quantitative pour quantifier l'ADN génomique d'un gène impliqué dans des pathologies. Par exemple, les gènes impliqués dans des pathologies peuvent être choisis dans le groupe comprenant EGFR1 humain, EGFR2 humain, EGFR3 humain, EGFR4 humain, c-ERB-B2 humain, ERBB3 humain, ERBB4 humain, TOP I humain, TOPO 2 ALPHA humain, MDR 10 humain, MET humain, IGFR1 humain, SDMAD4 humain, TNFRSF10A (TRAIL R4) humain, TNFRSF1OB (TRAIL-R2 - CDC262), TPBG humain, VEGR2-KDR-FLK1 humain, MET humain et MDR humain. Cette méthode peut être utilisée pour mieux prédire et suivre l'efficacité d'un traitement utilisant par exemple un traitement ciblé, par exemple un anticorps 15 monoclonal, agissant sur l'un ou l'autre gène et pour évaluer l'éventuelle résistance aux thérapies, par exemple, les thérapies ciblées ou les chimiothérapies. Ils ont également identifié que l'utilisation d'une combinaison de ces gènes cibles peut être utilisée. Il peut par exemple s'agir de la 20 combinaison des gènes cibles choisis dans le groupe comprenant MITOC/Genotox présentés dans le tableau 1 ci-dessus, pour évaluer dans le temps les effets toxiques et mutagènes de substances administrées, notamment les substances administrées à très faibles doses, sur de longues périodes dans des systèmes modèles in vivo ou in vitro (explants 25 de tissus reconstitués, cellules modèles, modèles de tissus ou d'organes voire animaux modèles). Dans la présente, on entend par « gène MITOC », le gène amplifié par les séquences sens et antisens SEQ ID NO : 66 et SEQ ID NO : 67. Ils sont en outre les premiers à avoir identifié que les gènes cibles 30 choisis dans le groupe comprenant MITOC, CDKN2-P16 humain, ADAMTS18 humain, LRP1B humain, GRID2 humain et FHIT humain, 2 9 802 1 1 22 peuvent être utilisé pour montrer l'éventuelle toxicité chronique et/ou la génotoxicité induite par une substance déterminée, en examinant respectivement les variations du génome mitochondrial et les variations du génome chromosomique. De préférence, les variations du génome 5 mitochondrial et les variations du génome chromosomique sont observées à des endroits précis. Il s'agit par exemple des sites fragiles de l'ADN choisis dans le groupe comprenant LRP1B (chr 12:57,522,28257,543,841), FHIT (chr 3:59735421-61237133), P16 (chr 9:21,967,75221,975,038), ADAMTS18 (chr 16:77389837-77469011) et GRID2 10 (chr4:93225550-94693648). Un gène cible choisi par exemple dans le groupe comprenant EGFR1 humain, ERBB3 humain et ERBB4 humain peut être utilisé comme contrôle négatif. Les inventeurs ont également identifié une séquence d'acide 15 nucléique de séquence SEQ ID NO : 5. Cette séquence est, à l'instar de l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1 chez l'homme, très conservée chez la souris. L'acide nucléique SEQ ID NO : 5, peut être utilisée pour une analyse d'ADN génomique murin. 20 L'acide nucléique SEQ ID NO: 5, peut être utilisée comme calibreur pour une analyse d'ADN génomique murin Dans la présente, on entend par « ADN génomique murin », l'ensemble comprenant le génome chromosomique murin et le génome mitochondrial murin. 25 On entend par « génome chromosomique murin », l'ensemble du matériel chromosomique contenu dans les chromosomes d'une souris. On entend par « génome mitochondrial murin », l'ensemble du matériel chromosomique contenu dans les mitochondries d'une souris. La séquence SEQ ID NO : 5 peut être utilisée dans un procédé in vitro d'analyse d'ADN génomique, par exemple dans le procédé de l'invention ci-dessus dans lequel la séquence SEQ ID NO : 5 remplace la séquence SEQ ID NO : 1, et dans lequel le gène cible différent de SEQ ID NO : 5 remplace le gène cible différent de SEQ ID NO : 1. Cette séquence peut également être utilisée pour évaluer la qualité d'un ADN murin. For example, the screening test may be a screening test for a substance or a tumor. A screening test can, for example, detect the effect of a substance or a treatment on the genome of an individual. The treatment may be, for example, a protective, positive, therapeutic or toxic treatment. For example, the treatment may be selected from the group consisting of UV exposure, irradiation, application of a molecule. For example, the molecule may be chosen from the group comprising anti-UV agents, antioxidants, antimutagens, antitoxics and protectors of DNA and its replication. The subject of the present invention is also the use of the in vitro method for analyzing the variation of the amount of a target gene different from SEQ ID NO: 1 defined above to help determine and / or adapt a treatment and / or follow the evolution of a disease during its treatment. The present invention also relates to a human genomic DNA analysis kit comprising sense and antisense primers for amplifying the sequence SEQ ID NO: 1 of the calibrator, and a fluorescent probe for quantifying the amplicons of SEQ ID NO : 1 products. For example, the sense and antisense primers for amplifying the sequence SEQ ID NO: 1 of the calibrator can be respectively of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 sequences. The fluorescent probe for quantifying the amplicons of SEQ ID NO : 1, products may for example be of sequence SEQ ID NO: 4. This fluorescent probe for quantifying the amplicons of SEQ ID NO: 1, products may be, for example, a probe of sequence SEQ ID NO: 4. The inventors are the first to have identified that the human EGFR1 gene (chr 7: 55224226-55238906) can be used to evaluate the quality of human DNA. They are also the first to have identified a simple and quantitative method for quantifying the genomic DNA of a gene involved in pathologies. For example, genes involved in pathologies may be selected from the group consisting of human EGFR1, human EGFR2, human EGFR3, human EGFR4, human c-ERB-B2, human ERBB3, human ERBB4, human TOP I, human TOPO 2 ALPHA, Human MDR, human MET, human IGFR1, human SDMAD4, human TNFRSF10A (TRAIL R4), TNFRSF1OB (TRAIL-R2 - CDC262), human TPBG, human VEGR2-KDR-FLK1, human MET, and human MDR. This method can be used to better predict and monitor the efficacy of a treatment using, for example, a targeted treatment, for example a monoclonal antibody, acting on one or the other gene and to evaluate the possible resistance to therapies. for example, targeted therapies or chemotherapies. They have also identified that the use of a combination of these target genes can be used. It may for example be the combination of the target genes selected from the group comprising MITOC / Genotox presented in Table 1 above, to evaluate over time the toxic and mutagenic effects of substances administered, especially the substances administered to very low doses, over long periods of time in model systems in vivo or in vitro (explants of reconstituted tissues, model cells, models of tissues or organs or even animal models). In the present, the term "MITOC gene" is understood to mean the gene amplified by the sense and antisense sequences SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 67. They are also the first to have identified that the target genes selected in the US Pat. group comprising MITOC, human CDKN2-P16, human ADAMTS18, human LRP1B, human GRID2 and human FHIT, can be used to show possible chronic toxicity and / or genotoxicity induced by a given substance, by examining respectively the variations of the mitochondrial genome and the variations of the chromosomal genome. Preferably, variations of the mitochondrial genome and variations of the chromosomal genome are observed at specific locations. These are, for example, fragile DNA sites selected from the group comprising LRP1B (chr 12: 57,522,28257,543,841), FHIT (chr 3: 59735421-61237133), P16 (chr 9: 21,967,75221,975,038). ), ADAMTS18 (chr 16: 77389837-77469011) and GRID2 (chr4: 93225550-94693648). A target gene chosen for example from the group consisting of human EGFR1, human ERBB3 and human ERBB4 can be used as a negative control. The inventors have also identified a nucleic acid sequence of sequence SEQ ID NO: 5. This sequence is, like the nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1 in humans, very conserved in mice. . The nucleic acid SEQ ID NO: 5 may be used for murine genomic DNA analysis. The nucleic acid SEQ ID NO: 5, may be used as a calibrator for murine genomic DNA analysis. In the present context, the term "murine genomic DNA" means the ensemble comprising the murine chromosomal genome and the murine mitochondrial genome. . The term "murine chromosomal genome" means all the chromosomal material contained in the chromosomes of a mouse. The term "murine mitochondrial genome" means all the chromosomal material contained in the mitochondria of a mouse. The sequence SEQ ID NO: 5 can be used in an in vitro method of genomic DNA analysis, for example in the process of the invention above in which the sequence SEQ ID NO: 5 replaces the sequence SEQ ID NO : 1, and wherein the target gene different from SEQ ID NO: 5 replaces the target gene different from SEQ ID NO: 1. This sequence can also be used to evaluate the quality of murine DNA.

Elle peut également être utilisée pour déterminer l'effet d'une substance ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. Elle peut également être utilisée pour déterminer la toxicité d'une substance ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. Elle peut également être utilisée dans un test de criblage. Ce criblage peut être par exemple un criblage de substances ou de tumeurs. Elle peut également être utilisée pour aider à déterminer et/ou adapter un traitement et/ou suivre l'évolution d'une maladie pendant son traitement. Les expressions « qualité d'ADN », « effet d'une substance sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon » et « test de criblage de substance » ont la même définition que celle présenté ci-dessus, mais rapportée à la souris. Les différents tissus de la souris peuvent être alors analysés avec méthodes DNAqual, MITOC et Genotox présentées ci-dessus. Un kit d'analyse d'ADN génomique murin comprenant des amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 5 du calibreur, et une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 5 produits, a également été mis au point par les inventeurs. Dans ce kit, les amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 5 du calibreur peuvent être, par exemple, respectivement de séquences SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7. It can also be used to determine the effect of a substance or a treatment on the number of copies of a target gene in a sample. It can also be used to determine the toxicity of a substance or a treatment to the number of copies of a target gene in a sample. It can also be used in a screening test. This screening may be for example a screening of substances or tumors. It can also be used to help determine and / or adapt a treatment and / or monitor the progress of a disease during its treatment. The terms "DNA quality", "Effect of a substance on the number of copies of a target gene in a sample" and "Substance Screening Test" have the same definition as the one presented above, but reported with the mouse. The different tissues of the mouse can then be analyzed with DNAqual, MITOC and Genotox methods presented above. A murine genomic DNA assay kit comprising sense and antisense primers for amplifying the SEQ ID NO: 5 sequence of the calibrator, and a fluorescent probe for quantifying the amplicons of SEQ ID NO: 5 produced, was also developed by the inventors. In this kit, the sense and antisense primers for amplifying the sequence SEQ ID NO: 5 of the calibrator can be, for example, respectively of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 sequences.

La sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 5, produits peut être par exemple de séquence SEQ ID NO : 2 9 8 0 2 1 1 24 8. Cette sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 5, produits peut être par exemple une sonde de séquence SEQ ID NO : 8. Par ailleurs, les inventeurs ont mis au point des amorces sens et 5 antisens, ainsi que des sondes fluorescentes spécifiques de chacune de ces gènes cibles. Ces gènes cibles, amorces sens et antisens et sondes fluorescentes sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Dans ce tableau, figure également un exemple des séquences des amorces sens et antisens et d'une sonde fluorescente spécifique de l'acide nucléique de 10 séquence SEQ ID NO : 5. Tableau 2 : Applications possibles en fonctions des gènes cibles analysés Utilisations Gènes cibles Amorce sens Amorce Sonde antisens SEQ ID NO : DNAqual EGFR1 murin 69 70 71 GENOTOX CDKN2-P16 murin 72 73 74 Souris ADAMTS18 murin 75 76 77 LRP1B murin 78 79 80 GRID2 murin 81 82 83 FHIT murin 84 85 86 MITOC Souris - 87 88 89 15 Les inventeurs sont également les premiers à avoir identifié que le gène EGFR1 murin peut être utilisé pour évaluer la qualité d'un ADN murin. Ils sont en outre les premiers à avoir identifié qu'un gène cible choisi dans le groupe comprenant CDKN2-P16 murin, ADAMTS18 murin, 20 LRP1B murin, GRID2 murin et FHIT murin, peut être utilisé pour montrer la génotoxicité induite par une molécule déterminée. Le gène cible EGFR1 murin peut être utilisé comme contrôle négatif. En association avec la méthode MITOC, il devient aussi possible d'analyser les effets d'une intoxication chronique et/ou d'une génotoxicité d'un traitement ou d'une substance déterminée directement sur l'animal voir dans des cellules modèles. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, données à titre illustratif et non limitatif. Brève description des figures - La figure 1 représente une courbe de dilution standard d'ADN humain de référence du laboratoire générée par un thermocycleur CFX96 (Biorad) avec le logiciel CFX Manager Software. « A » représente la pente obtenu avec une sonde marquée par un fluorochrome Yakima yellow pour le gène cible EGFR1 avec les paramètres suivants : E=97,0`)/0, R2=0,994, pente (« slope » en anglais)=3,396. « B » représente la pente obtenue par le calibreur marqué avec un fluorochrome Texas Red avec les paramètres suivants : E=93,2%, R2=0,999, pente (« slope » en anglais)=3,497. « Ct » signifie « Cycle threshold », « Un » signifie « inconnu », « Std » signifie « standards » et « Log ADN (i) » signifie « logarithme de la quantité initiale d'ADN ». - La figure 2 représente un histogramme automatisé obtenu par un thermocycleur CFX96 (Biorad) avec le logiciel CFX Manager Software pour un test DNAqual qui permet de comparer des échantillons d'ADN avant et après irradiation aux UV. En abscisse figure le nom des échantillons d'ADNs. En ordonnée figure le nombre de copie du gène cible EGFR1 dans les différents échantillons. Ce nombre est exprimé « en nombre de fois » de la valeur obtenue pour l'ADN de référence du laboratoire (50 ng de chaque). Les résultats sont normalisés par le calibreur universel RXRbéta, et en comparant à chaque fois l'ADN brut (50ng) et le même ADN après irradiation aux UV (50 ng) représentés respectivement de gauche à droite : 05, 05UV, 06, 06UV, 07, 07UV, 08, 08UV, 09, 09UV, 11, 11UV, 12, 12UV, 13, 13UV, 14, 14UV, 16, 16UV, 18, 2 9 8 0 2 1 1 26 18UV, 19, 19UV, 20, 2OUV, 21, 21UV, 22, 22UV, 23, 23UV, 26, 26UV, 27, 27UV, 31, 31UV, 33, 33UV, 35, 35UV, 40, 40UV, 41, 41UV, 43, 43UV, 44, 44UV, 46, 46UV, 48, 48UV, 49, 49UV, 50, 50UV, 57, 57UV, 62, 62UV, 64, 64UV, STD100, STD50 et STD25. Chacun des numéros présentés dans 5 cette figure correspond à des échantillons traités ou non par des ultraviolets. « UV » est indiqué à coté de ce nombre lorsque l'échantillon d'ADN a été traité par des ultraviolets. STD100, STD50 et STD25 représentent respectivement les dilutions d'un ADN de référence du laboratoire (100 ng, 50 ng et 25 ng) qui servent pour cette expérience 10 d'ADN contrôle pour exprimer les résultats. Ils permettent de vérifier la bonne efficacité de chaque qPCR duplex utilisant RXRbéta comme calibreur de normalisation. - La figure 3A représente une photographie du résultat d'une électrophorèse d'ADNs humains (2 pl de chaque duplicata) sur gel 15 d'agarose 0,8% avant irradiation UV. Les numéros ont la même signification que pour la figure 2. La figure 3B représente une photographie du résultat d'une électrophorèse d'ADNs humain (2 pl de chaque duplicata) sur gel d'agarose 0,8% après irradiation UV de 120 mJoules/cm2 pendant 15 min dans l'appareil UV Stratalinker 1800 20 (Stratagene)(catalogue : N°400072). Les numéros ont la même signification que pour la figure 2. « M » signifie « marqueur de poids moléculaire ». - La figure 4 représente un histogramme obtenu par un thermocycleur CFX96 (Biorad) avec le logiciel CFX manager Software pour 25 un test DNAqual souris (50 ng) effectué sur des duplicatas d'ADN extraits de tissus lyophilisés par rapport à l'ADN extrait des mêmes tissus frais non lyophilisés. Cet histogramme représente en abscisse : le nom des échantillons et en ordonnée : le nombre de copies intactes du gène EGFR1, normalisé par le calibreur RXRbéta et par rapport au nombre de 30 copies intactes de l'EGFR1, mesuré dans l'ADN extrait de tissus frais. C2 représente l'ADN extrait de tissus frais, E1, E2, E3 et E4 représentent respectivement de l'ADN extrait 24 heures, 1 semaine, 1 mois et 3 mois après leur lyophilisation (duplicatas de C2). STD100, STD50 et STD25 représentent respectivement des dilutions d'ADN de référence de souris soit : 100 ng, 50 ng et 25 ng qui vérifient la bonne efficacité de la qPCR duplex. - La figure 5 représente une photographie du résultat d'une électrophorèse d'un échantillon dupliqué de 100 ng de ces mêmes ADNs de souris sur gel d'agarose. C2, El, E2, E3 et E4 ont la même signification que pour la figure 4. « M » signifie « marqueur de poids moléculaire », « C1 » signifie respectivement « contrôle 1 » soit un duplicata de C2, « A », « B » et « C » signifie respectivement « standards internes du laboratoire correspondants à des ADN murins non dégradés, de référence». - La figure 6 représente un histogramme obtenu avec un tableur Excel pour des tests : MTT, DNAqual et MITOC (représentés par les triplets de bâtons respectivement de gauche à droite). Le résultat MTT représente le pourcentage d'inhibition de la prolifération de cellules HEPG2 équipées enzymatiquement du cytochrome P450, en fonction de leur intoxication pendant 72 H par des substances numérotées 38, 133, 145, 158, 167, 170, 194, 198, 203, 211, 248 et 251 (toutes ont été diluées dans du DMSO puis dans du milieu de culture à la concentration finale de 15 pM). « DMSO » signifie « diméthylsulfoxyde » et « DMSO+ » correspond à des cellules traitées avec 0,01% de DMSO. Les tests MITOC et DNAqual, ont été réalisés sur l'ADN extraits des cellules traitées, après le test MTT, et leurs résultats ont été repris des histogrammes automatisés obtenus en suivant la même procédure que celle qui a été décrite précédemment. L'ADN contrôle est « DMSO+ ». - La figure 7 représente un histogramme obtenu avec un tableur Excel pour un test Copycount sur des couples de tissus tumoraux/sains prélevé chez 10 patients (représentés par les doublets de bâtons respectivement de gauche à droite). L'abscisse représente le numéro du 2 9 8 0 2 1 1 28 patient (1 à 10) avec le gène cible utilisé (EGFR1, IGFR1 ou ERBB3). L'ordonnée représente l'expression relative pour chaque gène cible normalisée par le gène calibreur. 5 EXEMPLES Exemple 1 : Matériel et méthode : Les expérimentations présentées dans les exemples ci-dessous ont été réalisées en utilisant le principe de la qPCR en duplex. 10 Elles ont été réalisées à l'aide d'un thermocycleur CFX96 (Biorad) utilisant un logiciel d'analyse CFX Manager software. L'extraction de l'ADN à partir de ces cellules a été réalisée selon le protocole décrit dans Sambrook J, Russel D. Molecular Cloning: A Laboratory Manuel. 3rd edition. Vol. 3. New York, NY, USA: Cold Spring 15 Harbor Laboratory Press; 2001 [6]. La qPCR a été réalisée sur des plaques 96 puits « hard-shell 96- Well Thin-Wall PCR Plates » de Biorad. Des mélanges réactionnels ont été préparés selon le tableau 3 ci- dessous. 20 Tableau 3 : Préparation du mix PCR Réactifs Volume Concentration (pour un finale puits) iQ supermix (marque de commerce) 7,5 pl 1X Biorad Amorce CALIBREUR Sens (10 pM) 0,45 pl 300 nM Amorce CALIBREUR AntiSens (10 pM) 0,45 pl 300 nM Sonde CALIBREUR (20 pM) 0,15 pl 200 nM Amorce GENE CIBLE Sens (10 pM) 0,45 pl 300 nM Amorce GENE CIBLE AntiSens (10 pM) 0,45 pl 300 nM Sonde GENE CIBLE (20 pM) 0,15 pl 200 nM Echantillon ADN variable (pl) variable (ng) Eau variable (pl) - Volume final 15p1 - 2 9 8 0 2 1 1 29 Les amorces et sondes du gène cible sont précisées dans chacun des exemples ci-dessous. De même, la quantité d'échantillon d'ADN et d'eau utilisés dans le mélange réactionnel sont précisés ci-après. Des triplicatas ont été réalisés pour chacune des mesures. 5 Chacun des puits de la plaque à 96 puits pour la qPCR a été rempli avec un volume réactionnel final de 15 pL. Le thermocycleur a été programmé de manière à obtenir les étapes d'amplifications suivantes : - dénaturation initiale : 10 o 3 min à 95°C. - cycles PCR (x 40) : o 10 secondes à 95°C ; o 20 secondes à 63°C ; o 30 secondes à 72° C (+collecte et analyse des données à 15 cette étape du cycle). Le gène de référence, c'est-à-dire le calibreur selon l'invention, a été amplifié à l'aide d'amorces sens de séquence SEQ ID NO: 2 et antisens de séquence SEQ ID NO : 3. Les amplicons produits ont été quantifiés à l'aide d'une sonde de séquence SEQ ID NO : 4 comprenant un 20 fluorochrome 1, ici le Texas red (marque déposée). On indique au logiciel de qPCR que ce fluorochrome 1 est le calibreur (« cal »). Le gène cible a été amplifié à l'aide d'amorces sens et antisens spécifiques et définies dans chacun des exemples ci-après. Les amplicons produits ont ensuite été quantifiés à l'aide d'une sonde comprenant un 25 fluorochrome 2, ici le Yakima yellow (marque déposée). On indique au logiciel de qPCR que ce fluorochrome 2 est la cible (« cible »). Une gamme correspondant à une cascade de dilution d'un ADN de référence du laboratoire allant de 25 ng à 100 ng a été réalisée et a servi 30 aussi d'échantillon contrôle pour exprimer les résultats. Chaque point de cette gamme est réalisé en triplicata. Cette gamme a permis de contrôler les paramètres de la qPCR. Les ct seuils de chaque fluorophore ont été ajustés manuellement pour obtenir la meilleure courbe de dilution connue d'ADN de référence : présentant des paramètres d'efficacité PCR optimum (pente, efficacité et R2) et des différences d'efficacité d'amplification comprises entre 0 et 5 % pour le gène cible donné et pour le gène calibreur. Ces constantes de ct ont été reprises pour l'interprétation des résultats de toutes les autres expériences ultérieures concernant ce gène cible donné. The fluorescent probe making it possible to quantify the amplicons of SEQ ID NO: 5, produced can be for example of sequence SEQ ID NO: 2 9 8 0 2 1 1 24 8. This fluorescent probe makes it possible to quantify the amplicons of SEQ ID NO: 5 The products may be, for example, a probe of sequence SEQ ID NO: 8. In addition, the inventors have developed sense and antisense primers, as well as fluorescent probes specific for each of these target genes. These target genes, sense and antisense primers and fluorescent probes are shown in Table 2 below. In this table, there is also an example of the sequences of the sense and antisense primers and of a fluorescent probe specific for the nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 5. Table 2: Possible Applications in Function of the Target Genes Analyzed Uses Target Genes Primer primer Primer Antisense probe SEQ ID NO: DNAqual EGFR1 murine 69 70 71 GENOTOX CDKN2-P16 murine 72 73 74 Mouse ADAMTS18 murine 75 76 77 LRP1B murine 78 79 80 mouse GRID2 81 82 83 mouse FHIT 84 85 86 MITOC Mouse - 87 88 89 The inventors are also the first to have identified that the murine EGFR1 gene can be used to evaluate the quality of murine DNA. They are also the first to have identified that a target gene selected from the group consisting of murine CDKN2-P16, murine ADAMTS18, murine LRP1B, murine GRID2 and murine FHIT, can be used to show the genotoxicity induced by a particular molecule. The murine EGFR1 target gene can be used as a negative control. In combination with the MITOC method, it is also possible to analyze the effects of chronic intoxication and / or genotoxicity of a treatment or a specific substance directly on the animal or in model cells. Other advantages may still appear to those skilled in the art on reading the examples below, illustrated by the appended figures, given for illustrative and non-limiting purposes. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 represents a standard laboratory human DNA dilution curve generated by a CFX96 (Biorad) thermocycler with CFX Manager software. "A" represents the slope obtained with a Yakima yellow fluorochrome-labeled probe for the EGFR1 target gene with the following parameters: E = 97.0 μ) / 0, R2 = 0.994, slope = 3,396 . "B" represents the slope obtained by the calibrator marked with a Texas Red fluorochrome with the following parameters: E = 93.2%, R2 = 0.999, slope = 3.497. "Ct" means "Cycle threshold", "One" means "unknown", "Std" means "standard" and "Log DNA (i)" means "logarithm of the initial amount of DNA". FIG. 2 represents an automated histogram obtained by a CFX96 (Biorad) thermocycler with the CFX Manager software for a DNAqual test that makes it possible to compare DNA samples before and after UV irradiation. The abscissa is the name of the DNA samples. On the ordinate is the number of copies of the EGFR1 target gene in the different samples. This number is expressed "in number of times" of the value obtained for the reference DNA of the laboratory (50 ng of each). The results are normalized by the universal calibrator RXRbeta, and by comparing each time the crude DNA (50ng) and the same DNA after irradiation with UV (50 ng) represented respectively from left to right: 05, 05UV, 06, 06UV, 07, 07UV, 08, 08UV, 09, 09UV, 11, 11UV, 12, 12UV, 13, 13UV, 14, 14UV, 16, 16UV, 18, 19UV, 19, 19UV, 20, 2OVER, 21, 21UV, 22, 22UV, 23, 23UV, 26, 26UV, 27, 27UV, 31, 31UV, 33, 33UV, 35, 35UV, 40, 40UV, 41, 41UV, 43, 43UV, 44, 44UV, 46, 46UV, 48, 48UV, 49, 49UV, 50, 50UV, 57, 57UV, 62, 62UV, 64, 64UV, STD100, STD50 and STD25. Each of the numbers presented in this figure corresponds to samples treated or not treated with ultraviolet light. "UV" is indicated next to this number when the DNA sample has been treated with ultraviolet light. STD100, STD50, and STD25 represent the dilutions of a laboratory reference DNA (100 ng, 50 ng, and 25 ng, respectively) that serve for this control DNA experiment to express the results. They make it possible to check the good efficiency of each duplex qPCR using RXRbeta as normalization calibrator. FIG. 3A shows a photograph of the result of electrophoresis of human DNAs (2 μl of each duplicate) on 0.8% agarose gel before UV irradiation. The numbers have the same meaning as in FIG. 2. FIG. 3B shows a photograph of the result of electrophoresis of human DNAs (2 μl of each duplicate) on 0.8% agarose gel after UV irradiation of 120 mJoules. / cm 2 for 15 min in the UV apparatus Stratalinker 1800 20 (Stratagene) (catalog: No. 400072). The numbers have the same meaning as in Figure 2. "M" means "molecular weight marker". FIG. 4 represents a histogram obtained by a CFX96 (Biorad) thermocycler with the CFX manager software for a DNAqual mouse test (50 ng) carried out on duplicates of DNA extracted from freeze-dried tissues relative to the DNA extracted from same fresh fabrics not freeze dried. This histogram represents on the abscissa: the name of the samples and on the ordinate: the number of intact copies of the EGFR1 gene, normalized by the calibrator RXRbeta and the number of intact copies of EGFR1, measured in DNA extracted from tissues fresh. C2 represents the DNA extracted from fresh tissues, E1, E2, E3 and E4 respectively represent DNA extracted 24 hours, 1 week, 1 month and 3 months after their lyophilization (duplicates of C2). STD100, STD50 and STD25 represent respectively mouse reference DNA dilutions of: 100 ng, 50 ng and 25 ng which verify the good efficiency of duplex qPCR. FIG. 5 represents a photograph of the result of an electrophoresis of a duplicate sample of 100 ng of these same mouse DNAs on agarose gel. C2, E1, E2, E3 and E4 have the same meaning as for Figure 4. "M" means "molecular weight marker", "C1" means respectively "control 1" or a duplicate of C2, "A", " B "and" C "respectively mean" laboratory internal standards corresponding to non-degraded, reference murine murine ". FIG. 6 represents a histogram obtained with an Excel spreadsheet for tests: MTT, DNAqual and MITOC (represented by the stick triplets respectively from left to right). The MTT result represents the percentage inhibition of the proliferation of HEPG2 cells equipped enzymatically with cytochrome P450, as a function of their intoxication for 72 hours with substances numbered 38, 133, 145, 158, 167, 170, 194, 198, 203 211, 248 and 251 (all were diluted in DMSO and then in culture medium at the final concentration of 15 μM). "DMSO" means "dimethylsulfoxide" and "DMSO +" corresponds to cells treated with 0.01% DMSO. The MITOC and DNAqual tests were performed on the DNA extracted from the treated cells, after the MTT test, and their results were taken from the automated histograms obtained following the same procedure as that described previously. The control DNA is "DMSO +". FIG. 7 represents a histogram obtained with an Excel spreadsheet for a Copycount test on tumor / healthy tissue pairs taken from 10 patients (represented by the doublets of sticks respectively from left to right). The abscissa represents the number of the patient (1 to 10) with the target gene used (EGFR1, IGFR1 or ERBB3). The ordinate represents the relative expression for each target gene normalized by the calibrator gene. EXAMPLES Example 1: Material and Method: The experiments presented in the examples below were carried out using the duplex qPCR principle. They were carried out using a CFX96 thermocycler (Biorad) using a CFX Manager software analysis software. Extraction of the DNA from these cells was performed according to the protocol described in Sambrook J, Russel D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition. Flight. 3. New York, NY, USA: Cold Spring 15 Harbor Laboratory Press; 2001 [6]. The qPCR was performed on Biorad 96-well hard-shell 96-Well Thin-Wall PCR Plates. Reaction mixtures were prepared according to Table 3 below. Table 3: PCR mix preparation Reagents Volume Concentration (for a final well) iQ supermix (trademark) 7.5 pl 1X Biorad Primer CALIBRER Sense (10 μM) 0.45 μl 300 nM SIZE CALIBRATOR AntiSense (10 μM) 0.45 μl 300 nM CALIBRATOR Probe (20 μM) 0.15 μl 200 nM Primer GENE TARGET Sense (10 μM) 0.45 μl 300 nM Primer GENE TARGET AntiSense (10 μM) 0.45 μl 300 nM Probe GENE TARGET ( 20 μM) 0.15 μl 200 nM Variable (pl) Variable DNA Sample (ng) Variable Water (μl) - Final Volume 15p1 - 2 9 8 0 2 1 1 29 The primers and probes of the target gene are specified in each of the examples below. Similarly, the amount of DNA sample and water used in the reaction mixture is specified below. Triplicates were made for each of the measurements. Each well of the 96-well plate for qPCR was filled with a final reaction volume of 15 μL. The thermal cycler was programmed to obtain the following amplification steps: initial denaturation: 10 ° C. for 3 min at 95 ° C. PCR cycles (x 40): 10 seconds at 95 ° C .; o 20 seconds at 63 ° C; o 30 seconds at 72 ° C (+ collection and analysis of the data at this stage of the cycle). The reference gene, that is to say the calibrator according to the invention, was amplified using primers sense sequence SEQ ID NO: 2 and antisense sequence SEQ ID NO: 3. The amplicons produced were quantified using a probe of sequence SEQ ID NO: 4 comprising a fluorochrome 1, here the Texas red (registered trademark). The qPCR software is told that this fluorochrome 1 is the calibrator ("cal"). The target gene was amplified using specific sense and antisense primers and defined in each of the examples below. The amplicons produced were then quantified using a probe comprising a fluorochrome 2, here Yakima yellow (registered trademark). The qPCR software is told that this fluorochrome 2 is the target ("target"). A range corresponding to a dilution cascade of a reference laboratory DNA ranging from 25 ng to 100 ng was performed and also served as a control sample to express the results. Each point of this range is made in triplicate. This range allowed to control the parameters of the qPCR. The thresholds of each fluorophore were manually adjusted to obtain the best known dilution curve of reference DNA: presenting optimum PCR efficiency parameters (slope, efficiency and R2) and differences in amplification efficiency between 0 and 5% for the given target gene and for the calibrator gene. These ct constants were used for the interpretation of the results of all subsequent experiments on this given target gene.

Sans cette gamme de dilution, le logiciel de la qPCR ne nous montre pas l'efficacité des deux amplifications, ni leur pente, ni le coefficient de corrélation de Pearson R2. En effet, ce logiciel est fait pour mesurer une courbe standard de dilutions en cascade d'ADNc et fait du dosage relatif de copie d'ADNc cible par rapport à un ADNc de référence. Without this dilution range, the qPCR software does not show us the efficiency of the two amplifications, nor their slope, nor the correlation coefficient of Pearson R2. Indeed, this software is made to measure a standard curve of cDNA cascade dilutions and makes the relative target cDNA copy assay relative to a reference cDNA.

La courbe standard de dilution d'ADN génomique a été générée par le thermocycleur à partir de la gamme de dilution d'ADN de référence avec le « Ct obtenu » en ordonnée et le « log de la concentration en ADN de l'échantillon de référence » en abscisse. Cette courbe standard est représentée sur la figure 1. Les résultats obtenus avec les échantillons à tester sont indiqués par des XXX. Ils sont positionnés par rapport aux références 25, 50 et 100 ng et sont censés contenir, chacun, 50 ng d'ADN. Le logiciel calculera combien d'ADN chaque échantillon à tester contient réellement. Nous l'interprétons alors comme un nombre de copies d'ADN génomique par rapport au nombre de copies de calibreur et de gène cible indiqués pour l'ADN contrôle de l'expérience qui est ici aussi l'ADN de référence. L'équation de la régression linéaire avec le coefficient de corrélation de Pearson R2 a permis de constater une très bonne corrélation entre les valeurs de Ct et la quantité d'ADN présent dans les échantillons de référence (gamme de dilution). The standard genomic DNA dilution curve was generated by the thermocycler from the standard DNA dilution range with the "Ct obtained" on the ordinate and the log of the DNA concentration of the reference sample. On the abscissa. This standard curve is shown in FIG. 1. The results obtained with the samples to be tested are indicated by XXX. They are positioned relative to references 25, 50 and 100 ng and are each expected to contain 50 ng of DNA. The software will calculate how much DNA each sample to be tested actually contains. We then interpret it as a number of copies of genomic DNA relative to the number of calibrator and target gene copies indicated for the control DNA of the experiment which is here also the reference DNA. The linear regression equation with the Pearson R2 correlation coefficient showed a very good correlation between the Ct values and the amount of DNA present in the reference samples (dilution range).

La courbe standard obtenue en analysant les dilutions de l'ADN de référence a permis d'affirmer que toutes les conditions de qPCR choisies sont adéquates pour analyser la variation du nombre de copies d'un gène cible. Pour cela, les qPCR ont été réalisées sur des plaques à 96 puits et avec des mélanges réactionnels comprenant toujours la gamme d'ADN (de référence : 25 ng, 50 ng et 100 ng), en conservant les mêmes paramètres de Ct de plaque en plaque. Dans un ADN à tester, s'il y a amplification génique du gène cible, la sonde jaune sort avant l'orange (Ct précoce), c'est-à-dire qu'après application de la méthode du AACt et la conversion en 2-°°c, la valeur obtenue pour ce « rapport des fluorescences » est supérieure à 1 et supérieure à celle obtenue pour l'ADN de référence. Ce rapport peut atteindre 10 voir plus. C'est l'inverse s'il y a une délétion (Ct retardé). The standard curve obtained by analyzing the dilutions of the reference DNA made it possible to affirm that all the selected qPCR conditions are adequate for analyzing the variation in the number of copies of a target gene. For this purpose, the qPCRs were carried out on 96-well plates and with reaction mixtures still comprising the DNA range (reference: 25 ng, 50 ng and 100 ng), while retaining the same Ct plate parameters. plate. In DNA to be tested, if there is gene amplification of the target gene, the yellow probe leaves before orange (early Ct), that is to say, after application of the AACt method and conversion to 2- °° c, the value obtained for this "ratio of fluorescences" is greater than 1 and greater than that obtained for the reference DNA. This ratio can reach 10 see more. It is the opposite if there is a deletion (delayed Ct).

Dans les deux cas, le Ct du calibreur permet de « situer » correctement l'ADN sur la gamme de dilution des ADN de référence et de constater qu'il ne manque pas d'ADN matriciel de calibreur quand on le compare à l'ADN de référence (Ct < 28). S'il y a une diminution conjointe du nombre de copies intactes et du gène cible et du calibreur, le rapport ne change pas mais la quantité d'ADN est calculée par le logiciel comme inférieure à celle indiquée par rapport aux ADN de référence. Elle traduit ici un manque d'ADN matriciel intacte et signe pour nous une dégradation de l'ADN testé, comparé à l'ADN de référence (mesure de 50 ng d'ADN dans tous les cas). In both cases, the Ct of the calibrator makes it possible to correctly "locate" the DNA on the dilution range of the reference DNAs and to find that there is no lack of calibrator matrix DNA when compared to DNA. reference (Ct <28). If there is a joint decrease in the number of intact copies and the target gene and the calibrator, the ratio does not change but the amount of DNA is calculated by the software as less than that indicated relative to the reference DNAs. It reflects here a lack of intact matrix DNA and sign for us a degradation of the tested DNA, compared to the reference DNA (measurement of 50 ng of DNA in all cases).

Les mesures obtenues pour différents échantillons à tester peuvent figurer sur un histogramme automatisé comme un nombre de fois en plus ou en moins du nombre de copies (X) de gènes cibles observé pour l'échantillon testé par rapport au zéro. Une variante du logiciel permet de choisir, en plus, un échantillon d'ADN comme une référence interne et les résultats peuvent alors être sous la forme d'un histogramme différent, le zéro étant cet échantillon. 2 9 8 0 2 1 1 32 Cette méthode permet donc d'évaluer la qualité/intégrité de l'ADN en évaluant le nombre de copies intactes matriciels présents dans les échantillons à tester par comparaison au nombre normal de copies matricielles présentes dans l'ADN de référence. 5 Dans les exemples ci-dessous, des efficacités d'amplification voisines pour les deux gènes (calibreur et cible), à savoir entre 90 et 110 %, associées à des corrélations linéaires (R2) > 0,9, ainsi qu'à une large amplitude de détection, ont permis de déterminer dans de 25 à 50 ng de 10 l'échantillon d'ADN à analyser (échantillon test), le nombre de copies du gène cible par la méthode du ,8.8, de Ct, également appelée « Méthode de Livak ». Exemple 2 : DNAqual - Quantification du gène EGFR1 humain selon 15 le procédé de l'invention sur des ADN ayant subit une dégradation artificielle par un traitement physique soit irradiation par les UV Dans cet exemple, l'ADN à analyser provenait de cellules de poumon (Centre de ressources Biologiques de Lyon). Des duplicatas de chaque échantillon ont subit, ou non, une irradiation UV de 120 20 mJoules/cm2 pendant 15 minutes à l'aide d'un appareil UV Stratalinker 1800 (Stratagene N° du catalogue : 400072) avant d'être analysés par DNAqual et aussi par électrophorèse en gel d'agarose. L'expérience a été réalisée sur 32 échantillons d'ADN à analyser, extraits des cellules précitées. Ils sont dénommés respectivement : 05, 06, 2 5 07, 08, 09, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 31, 33, 35, 40, 41, 43, 44, 46, 48, 49, 50, 57, 62 et 64, et correspondent à des extractions d'ADN de différents échantillons tissulaires. Les échantillons STD100, STD50 et STD25 correspondent à des dilutions de la gamme de l'ADN de référence du laboratoire 30 (respectivement 100 ng, 50 ng et 25 ng) n'ayant pas subit une irradiation 2 9 802 1 1 33 UV. L'ADN contrôle qui sert à exprimer les résultats est le même que l'ADN de référence (50 ng) Les échantillons nommés avec un suffixe « UV » correspondent aux échantillons irradiés. Quand ce suffixe n'est pas indiqué, il s'agit des 5 échantillons appariés contrôles, c'est-à-dire, n'ayant pas été irradié par UV. Pour chacun de ces échantillons, 50 ng a été analysés. Les réactifs utilisés pour la qPCR étaient les suivants : iQ supermix (marque de commerce) (référence 1708862, Biorad), 10 amorce sens du calibreur (SEQ ID NO : 2) à 10 pM, amorce antisens du calibreur (SEQ ID NO : 3) à 10 pM, sonde calibreur (SEQ ID NO : 4) possédant un fluorochrome Texas red (marque déposé) en 5' et un quencher BHQ2 (marque déposée) en 3', à 20 pM 15 amorce sens d'EGFR1 (SEQ ID NO : 9) à 10 pM, amorce antisens D'EGFR1 (SEQ ID NO : 10) à 10 pM, sonde EGFR1 (SEQ ID NO : 11) possédant un fluorochrome Yakima yellow (marque déposé) en 5' et un quencher BHQ1 (marque déposée) en 3', à 20 pM. 20 Toutes les amorces et les sonde ont été fournies par Eurogenetec. Dans cet exemple le nombre de copies d'un gène cible (l'EGFR1 humain) a été quantifié en comparaison avec le nombre de copies intactes du calibreur selon l'invention de séquence SEQ ID NO : 1 présent dans 25 n'importe quel échantillon d'ADN humain. Chez un individu à tester, l'échantillon été préalablement quantifié par mesure de densité optique d'échantillon soit 50 ng/pL d'ADN. La même mesure a été réalisée sur un échantillon d'ADN de référence qui contient un nombre réduit de copies d'EGFR1 humain et un 30 nombre réduit de copies du calibreur RXRbéta (SEQ ID NO :1) du fait de leur dégradation par les UV. The measurements obtained for different samples to be tested may appear on an automated histogram as a number of times in addition to or less than the number of copies (X) of target genes observed for the tested sample relative to zero. A variant of the software makes it possible to choose, in addition, a DNA sample as an internal reference and the results can then be in the form of a different histogram, the zero being this sample. 2 9 8 0 2 1 1 32 This method therefore makes it possible to evaluate the quality / integrity of the DNA by evaluating the number of intact matrix copies present in the samples to be tested by comparison with the normal number of matrix copies present in the DNA. reference. In the examples below, similar amplification efficiencies for the two genes (calibrator and target), namely between 90 and 110%, associated with linear correlations (R2)> 0.9, as well as detection range, from 25 to 50 ng of the DNA sample to be analyzed (test sample), the copy number of the target gene was determined by the method of, 8.8, of Ct, also called " Livak's method ". Example 2 DNAqual - Quantification of the Human EGFR1 Gene According to the Method of the Invention on DNAs Having Undergone Artificial Degradation by Physical Treatment or UV Irradiation In this example, the DNA to be analyzed was from lung cells ( Biological Resource Center of Lyon). Duplicates of each sample were irradiated or not with UV irradiation of 120 mJoules / cm2 for 15 minutes using a UV Stratalinker 1800 (Stratagene Catalog # 400072) before being analyzed by DNAqual and also by agarose gel electrophoresis. The experiment was carried out on 32 DNA samples to be analyzed, extracted from the aforementioned cells. They are denoted respectively: 05, 06, 25, 08, 09, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 31, 33, 35, 40 , 41, 43, 44, 46, 48, 49, 50, 57, 62 and 64, and correspond to DNA extractions of different tissue samples. Samples STD100, STD50 and STD25 correspond to dilutions of the range of laboratory reference DNA (100 ng, 50 ng and 25 ng, respectively) that did not undergo UV irradiation. The control DNA used to express the results is the same as the reference DNA (50 ng) The samples named with a suffix "UV" correspond to the irradiated samples. When this suffix is not indicated, it is the 5 matched control samples, that is to say, not having been irradiated by UV. For each of these samples, 50 ng was analyzed. The reagents used for qPCR were: iQ supermix (trade mark) (reference 1708862, Biorad), 10 μM calibrator sense primer (SEQ ID NO: 2), calibrator antisense primer (SEQ ID NO: 3) ) at 10 μM, calibrator probe (SEQ ID NO: 4) having a 5'-fluorochrome Texas red (trademark) and a 3 'BHQ2 quencher (trademark) at 20 μM sense primer of EGFR1 (SEQ ID) NO: 9) at 10 μM, EGFR1 antisense primer (SEQ ID NO: 10) at 10 μM, EGFR1 probe (SEQ ID NO: 11) having a fluorochrome Yakima yellow (registered trademark) at 5 'and a quencher BHQ1 ( registered trademark) in 3 'at 20 μM. All primers and probes were provided by Eurogenetec. In this example, the number of copies of a target gene (human EGFR1) was quantified in comparison with the number of intact copies of the calibrator according to the invention of sequence SEQ ID NO: 1 present in any sample. of human DNA. In an individual to be tested, the sample was previously quantified by measuring the optical density of the sample, ie 50 ng / pL of DNA. The same measurement was made on a reference DNA sample which contains a reduced copy number of human EGFR1 and a reduced number of copies of the RXR beta calibrator (SEQ ID NO: 1) due to their UV degradation. .

Les deux gènes, RXRbéta (SEQ ID NO : 1) et EGFR1, ont été mesurés comme des amplicons synthétisés lors d'une qPCR en temps réel en duplex. La séquence du calibreur a été amplifiée à l'aide des amorces sens SEQ ID NO : 2 et antisens SEQ ID NO : 3. La séquence du gène EGFR1 a été amplifiée à l'aide des amorces sens SEQ ID NO : 9 et antisens SEQ ID NO : 10. Les amplicons produits ont été détectés par leur hybridation aux deux sondes spécifiques décrites ci-dessus mises en duplex. Le logiciel d'analyse a été programmé de manière à détecter la sonde calibreur marquée au Texas red (marque déposée) comme « calibreur », et la sonde EGFR1 comme « cible » et l'ADN de référence comme contrôle. Pour un ADN de référence pour le gène EGFR1 humain, le nombre de copies intactes du gène EGFR1 humain est identique à celui du gène RXRbéta, à savoir 660 copies diploïdes par ng d'ADN (soit 330 copies haploïdes). Ainsi, chez un individu de référence, le nombre de copies de l'EGFR1 et RXRbéta varie de à 1 +/- 5 %. Ainsi le nombre de copie du gène EGFR1 humain a théoriquement diminué. L'échantillon STD100 a été choisi comme échantillon de référence. Il a été noté indiqué comme « contrôle ou standard » dans le programme du thermocycleur. Tous les résultats ont été exprimés par rapport à l'ADN de référence STD100 (irradié par les UV) du laboratoire. L'ensemble des résultats est représenté sur la figure 2 et sur le tableau ci-dessous. Tableau 4 : Résultats expérimentaux du test DNAqual chez l'homme Cible Calibreur humain EGFR1 humain Expression Ech. Moy C(t) C(t) SEM Moy C(t) C(t) SEM Exp. Exp. SEM 5 27,4 0,02318 26,24 0,01309 3,66924 0,06889 05 UV 27,36 0,07419 28,5 0,05694 0,72107 0,0476 6 26,98 0,03062 25,35 0,01895 5,15549 0,13094 06 UV 27,39 0,03225 28,63 0,02866 0,6741 0,02054 7 28,1 0,02744 26,49 0,02644 5,04394 0,13581 07 UV 28,54 0,086 29,78 0,05445 0,66341 0,04764 8 27,74 0,1467 25,5 0,09182 7,91913 0,96682 08 UV 28,07 0,04776 29,44 0,08605 0,60569 0,04221 9 28,35 0,04453 26,49 0,06748 6,03317 0,34523 09 UV 28,27 0,03126 29,64 0,0597 0,60653 0,02895 11 26,85 0,00843 25,01 0,01452 5,96881 0,07094 11 UV 27,43 0,07957 28,68 0,06745 0,66162 0,04874 12 27,76 0,05285 25,9 0,07374 6,05175 0,38848 12 UV 28,38 0,07031 29,73 0,12071 0,6192 0,06124 13 27,06 0,05981 25,55 0,03257 4,72951 0,22712 13 UV 27,92 0,0199 29,2 0,01981 0,64547 0,01281 14 27,87 0,04584 25,98 0,10219 6,16115 0,48888 14 UV 28,45 0,06608 29,85 0,07029 0,59274 0,04042 16 27,35 0,01609 25,82 0,01787 4,77717 0,08122 16 UV 28,05 0,06742 29,34 0,06433 0,64383 0,04239 18 27,3 0,04712 25,91 0,09067 4,34503 0,31444 18 UV 27,91 0,06075 29,16 0,03099 0,66374 0,03191 19 28,08 0,06157 25,96 0,05055 7,22236 0,40625 19 UV 28,54 0,04343 30,08 0,04173 0,53628 0,02282 20 27,41 0,04159 26,02 0,0769 4,33398 0,26833 20 UV 28,23 0,02581 29,63 0,05687 0,59377 0,02627 21 27,78 0,14984 25,88 0,26152 6,20689 1,32459 21 UV 27,98 0,04963 29,34 0,01098 0,61037 0,02184 22 27,3 0,07329 25,74 0,0705 4,88582 0,35103 22 UV 27,89 0,03789 29,12 0,03966 0,66954 0,02596 23 26,82 0,0946 25,39 0,09151 4,46986 0,41567 23 UV 27,71 0,06397 29,05 0,00393 0,62312 0,02811 26 26,05 0,12279 24,42 0,08825 5,19679 0,5546 26 UV 24,8 0,05276 25,92 0,05275 0,73952 0,03899 27 26,6 0,03057 25,04 0,04926 4,91212 0,20158 27 UV 25,97 0,05777 27,24 0,06443 0,66176 0,04048 31 26,25 0,05711 25,02 0,11391 3,8909 0,35118 31 UV 25,84 0,01954 27,08 0,01003 0,67491 0,01045 33 25,99 0,13808 24,46 0,04542 4,81953 0,49348 33 UV 25,39 0,09012 26,51 0,08633 0,73895 0,06515 35 26,34 0,13858 24,76 0,13886 5,00667 0,69406 35 UV 25,06 0,04449 25,97 0,01718 0,85625 0,02877 40 26,45 0,06492 25,11 0,06322 4,19974 0,2689 40 UV 25,16 0,01152 26,17 0,02433 0,80007 0,01526 41 26,45 0,06258 25,11 0,14908 4,21165 0,48252 41 UV 26,69 0,04885 27,87 0,09019 0,70053 0,05088 43 27,64 0,13903 26,33 0,0677 4,09253 0,44613 43 UV 26,9 0,05811 27,94 0,05533 0,7787 0,04414 44 27,78 0,14671 25,48 0,14336 8,24431 1,19486 44 UV 27,28 0,10618 28,48 0,05606 0,69179 0,05856 46 26,65 0,07212 25,41 0,01719 3,9091 0,20408 46 UV 26,84 0,03251 28,1 0,03454 0,66414 0,02226 48 26,16 0,01007 25,07 0,04093 3,5274 0,10544 48 UV 25,78 0,02089 27,03 0,06463 0,66811 0,03217 49 26,72 0,04256 24,77 0,07539 6,48324 0,39744 49 UV 27,03 0,05727 28,17 0,04712 0,72097 0,03775 50 25,21 0,04301 24,34 0,00644 3,0359 0,09294 50 UV 25,25 0,02312 26,33 0,01546 0,75892 0,01489 57 25,7 0,02297 25,24 0,06377 2,26053 0,10859 57 UV 25,38 0,04469 26,51 0,0644 0,73659 0,04086 62 27,44 0,05574 26,34 0,04313 3,51752 0,17501 62 UV 27,63 0,03988 28,95 0,10344 0,63199 0,04965 64 26,32 0,02564 25,3 0,00947 3,34445 0,0644 64 UV 27,42 0,06883 28,25 0,05031 0,89459 0,05383 STD100 23,62 0,0687 24,33 0,06883 1 0,06872 STD25 25,6 0,04084 26,29 0,03063 1,00333 0,03615 STD50 24,69 0,06741 25,4 0,05195 0,98873 0,0594 Dans ce tableau « Ech. » signifie « Echantillon » « Moy Ct » signifie « moyenne de Ct », « SEM » signifie « erreur type » et « Exp. » signifie « expression ». The two genes, RXRbeta (SEQ ID NO: 1) and EGFR1, were measured as synthesized amplicons during a duplex real-time qPCR. The sequence of the calibrator was amplified using the primers sense SEQ ID NO: 2 and antisense SEQ ID NO: 3. The sequence of the EGFR1 gene was amplified using primers sense SEQ ID NO: 9 and antisense SEQ ID NO: 10. The amplicons produced were detected by their hybridization to the two specific probes described above put in duplex. The analysis software was programmed to detect the Texas red (registered trademark) calibrated probe as a "calibrator", and the EGFR1 probe as "target" and the reference DNA as a control. For a reference DNA for the human EGFR1 gene, the number of intact copies of the human EGFR1 gene is identical to that of the RXR beta gene, namely 660 diploid copies per ng of DNA (ie 330 haploid copies). Thus, in a reference individual, the number of copies of EGFR1 and RXRbeta varies from 1 +/- 5%. Thus the number of copies of the human EGFR1 gene has theoretically decreased. Sample STD100 was chosen as a reference sample. It has been noted indicated as "control or standard" in the thermocycler program. All results were expressed relative to the STD100 reference DNA (UV irradiated) of the laboratory. The overall results are shown in Figure 2 and in the table below. Table 4: Experimental results of the DNAqual test in humans Target Human EGFR1 Calibrator Expression Ech. Mean C (t) C (t) SEM Avg C (t) C (t) SEM Exp. Exp. SEM 5 27.4 0.02318 26.24 0.01309 3.66924 0.06889 05 UV 27.36 0.07419 28.5 0.05694 0.72107 0.0476 6 26.98 0.03062 25.35 0.01895 5.1549 0.13094 06 UV 27.39 0.03225 28.63 0.02866 0.6741 0.02054 7 28.1 0.02744 26.49 0.02644 5.04394 0.13581 07 UV 28.54 0.086 29.78 0.05445 0.66341 0.04764 8 27.74 0.1677 25.5 0.09182 7.91913 0.96682 08 UV 28.07 0.04776 29.44 0.08605 0 , 60569 0.04221 9 28.35 0.04453 26.49 0.06748 6.03317 0.34523 09 UV 28.27 0.03126 29.64 0.0597 0.60653 0.02895 11 26.85 0, 00843 25.01 0.01452 5.96881 0.07094 11 UV 27.43 0.07957 28.68 0.06745 0.66162 0.04874 12 27.76 0.05285 25.9 0.07374 6.05175 0 , 38848 12 UV 28.38 0.07031 29.73 0.12071 0.6192 0.06124 13 27.06 0.05981 25.55 0.03257 4.72951 0.22712 13 UV 27.92 0.0199 29 0.01981 0.64547 0.01281 14 27.87 0.04584 25.98 0.10219 6.16115 0.48888 14 UV 28.45 0.06608 29.85 0.07029 0.59274 0.04042 16 27.35 0.01609 25.82 0.01787 4.77717 0.08122 16 UV 28.05 0.06742 29.34 0.06433 0.64383 0.04239 18 27.3 0.04712 25.91 0 , 09067 4.34503 0.31444 18 UV 27.91 0.06075 29.16 0.03099 0.66374 0.03191 19 28.08 0.06157 25.96 0.05055 7.22236 0.40525 19 UV 28.54 0.04343 30.08 0.04173 0.53628 0.02282 20 27.41 0.04159 26.02 0.0769 4.33398 0.26833 20 UV 28.23 0.02581 29.63 0.05687 0.59377 0.02627 21 27 , 78 0.14984 25.88 0.26152 6.20689 1.32459 21 UV 27.98 0.04963 29.34 0.01098 0.61037 0.02184 22 27.3 0.07329 25.74 0.0705 4.88582 0.35103 22 UV 27.89 0.03789 29.12 0.03966 0.66954 0.02596 23 26.82 0.0946 25.39 0.09151 4.46986 0.41567 23 UV 27.71 0.06397 29.05 0.00393 0.62312 0.02811 26 26.05 0.12279 24.42 0.08825 5.19679 0.5546 26 UV 24.8 0.05276 25.92 0.05275 0, 73952 0.03899 27 26.6 0.03057 25.04 0.04926 4.91212 0.20158 27 UV 25.97 0.05777 27.24 0.06443 0.66176 0.04048 31 26.25 0.05711 25.02 0.1119 3.909 0.35118 31 UV 25.84 0.01954 27.08 0.01003 0.67491 0.01045 33 25.99 0.1880 24.46 0.04542 4.81953 0, 49348 33 UV 25.39 0.09012 26.51 0.08633 0.73895 0.06515 35 26.34 0.13858 24.76 0.13786 5.00667 0.69406 35 UV 25.06 0.04449 25, 97 0.01718 0.8 5625 0.02877 40 26.45 0.06492 25.11 0.06322 4.19974 0.2689 40 UV 25.16 0.01152 26.17 0.02433 0.80007 0.01526 41 26.45 0.06258 25.11 0.14908 4.21165 0.48252 41 UV 26.69 0.04885 27.87 0.09019 0.70053 0.05088 43 27.64 0.13903 26.33 0.0677 4.09253 0, 44613 43 UV 26.9 0.05811 27.94 0.05533 0.7787 0.04414 44 27.78 0.14671 25.48 0.14336 8.24431 1.19486 44 UV 27.28 0.101818 28 48 0.05606 0.69179 0.05856 46 26.65 0.07212 25.41 0.01719 3.9091 0.20408 46 UV 26.84 0.03251 28.1 0.03454 0.66414 0.02226 48 26.16 0.01007 25.07 0.04093 3.5274 0.10544 48 UV 25.78 0.02089 27.03 0.06463 0.66811 0.03217 49 26.72 0.04256 24.77 0, 07539 6.48324 0.39744 49 UV 27.03 0.05727 28.17 0.04712 0.72097 0.03775 50 25.21 0.04301 24.34 0.00644 3.0359 0.09294 50 UV 25, 0.02312 26.33 0.01546 0.75892 0.01489 57 25.7 0.02297 25.24 0.06377 2.26053 0.10859 57 UV 25.38 0.04469 26.51 0.0644 0 , 73659 0.04086 62 27.44 0.05574 26.34 0.04313 3.51752 0.17501 62 UV 27.63 0.03988 28.95 0.10344 0.63199 0.04965 64 26.32 0, 02564 25.3 0.009 47 3.34445 0.0644 64 UV 27.42 0.06883 28.25 0.05031 0.89459 0.05383 STD100 23.62 0.0687 24.33 0.06883 1 0.06872 STD25 25.6 0, 04084 26.29 0.03063 1.00333 0.03615 STD50 24.69 0.06741 25.4 0.05195 0.98873 0.0594 In this table "Ech. "Means" Sample "" Average Ct "means" Ct Average "," SEM "means" Standard Error "and" Exp. "Means" expression ".

La valeur correspondant à l'échantillon STD100 est de 1 car il s'agit de l'échantillon de référence, marqué comme standard dans le programme de la qPCR. Les valeurs correspondant aux échantillons STD50 et STD25 sont quasiment égales à 1, ce qui est normal car la dilution ne change pas le rapport de fluorescence du calibreur et du gène EGFR1 humain. Les valeurs correspondant aux échantillons non irradié par UV (05, 06, 07, ...) sont toutes supérieures à 1 et toutes supérieures aux valeurs correspondant aux échantillons irradié par UV (respectivement 05UV, 06UV, 07UV, ...). Cela signifie que le nombre de copie du gène EGFR1 2 9 8 0 2 1 1 37 humain est supérieur avant le traitement UV. Il y a en général 3 fois plus d'ADN matriciel avant irradiation qu'après. Il est à noter que l'ADN standard est dégradé par les UV dans les mêmes proportions. Ces résultats montrent une dégradation nette des ADN exposés 5 aux UV qui atteint 60% des contrôles non irradiés en moyenne Le procédé selon l'invention permet de détecter et quantifier efficacement la variation du nombre de copies intactes et donc amplifiables par qPCR du gène EGFR1, causée par un traitement UV. 10 Une étude de la variation du nombre de copies du gène EGFR1 avec des ADN extraits des cellules précitées et dans les mêmes conditions opératoires que celles décrites ci-dessus, a été réalisé avec une méthode d'analyse sur gel d'agarose. 6 pl de chaque échantillon d'ADN, avant et après irradiation, ont été déposés sur un gel d'agarose 0,8%. Le marqueur de poids moléculaire utilisé était du Smart Ladder : MW-1700-10 d'Eurogenetec. Les résultats obtenus et présentés aux figures 3A et 3B démontrent bien que cette méthode ne permet pas de quantifier le nombre de copies intactes du gène EGFR1 avant et après traitement UV. The value corresponding to sample STD100 is 1 because it is the reference sample, marked as standard in the qPCR program. The values corresponding to samples STD50 and STD25 are almost equal to 1, which is normal because the dilution does not change the fluorescence ratio of the calibrator and the human EGFR1 gene. The values corresponding to the UV non-irradiated samples (05, 06, 07, ...) are all greater than 1 and all higher than the values corresponding to the samples irradiated by UV (respectively 05UV, 06UV, 07UV, ...). This means that the number of copies of the human EGFR1 gene is greater before UV treatment. There is usually 3 times more matrix DNA before irradiation than after. It should be noted that standard DNA is degraded by UV in the same proportions. These results show a clear degradation of the UV-exposed DNAs which reaches 60% of the non-irradiated controls on average. The method according to the invention makes it possible to effectively detect and quantify the variation in the number of intact and therefore amplifiable copies by qPCR of the EGFR1 gene. caused by UV treatment. A study of the variation in the number of copies of the EGFR1 gene with DNAs extracted from the abovementioned cells and under the same operating conditions as those described above, was carried out using an agarose gel analysis method. 6 μl of each DNA sample, before and after irradiation, were deposited on a 0.8% agarose gel. The molecular weight marker used was Eurogenetec's Smart Ladder: MW-1700-10. The results obtained and presented in FIGS. 3A and 3B clearly demonstrate that this method does not make it possible to quantify the number of intact copies of the EGFR1 gene before and after UV treatment.

Exemple 3 : DNAqual - Kit de quantification du gène EGFR1 humain Un kit pour la quantification du gène EGFR1 a été réalisé en et comprend les composants suivants décrits dans l'exemple 2 ci-dessus : 10p1 d'ADN de référence pour EGFR1 à 100 ng/pl, 10p1 d'ADN de référence pour EGFR1 à 50 ng/pl, 10p1 d'ADN de référence pour EGFR1 à 25 ng/pl, 770 pl de iQ supermix (marque de commerce) (référence 1708862, Biorad), 50 pl d'amorce sens du calibreur (SEQ ID NO : 2) à 10pM, 50 pl d'amorce antisens du calibreur (SEQ ID NO : 3) à 10pM, 2 9 802 1 1 38 16,5 pl de sonde calibreur (SEQ ID NO: 4) possédant un fluorochrome Texas red (marque déposé) en 5' et un quencher BHQ2 (marque déposée) en 3', à 20pM, 50 pl d'amorce sens d'EGFR1 (SEQ ID NO : 9) à 1 OpM, 5 50 pl d'amorce antisens D'EGFR1 (SEQ ID NO : 10) à 1 OpM, 16,5 pl de sonde EGFR1 (SEQ ID NO : 11) possédant un fluorochrome Yakima yellow (marque déposé) en 5' et un quencher BHQ1 (marque déposée) en 3', à 20pM. 10 Chacun de ces composants est conditionné séparément dans un tube plastique de 1,5 ml (Dutscher, réf catalogue : 045401). Exemple 4 : DNAqual - Quantification du gène EGFR1 murin selon le procédé de l'invention sur tissus de souris ayant subit ou non une 15 lyophilisation avant la purification de leurs ADNs L'expérience décrite dans l'exemple 2 a été réalisée sur des ADN provenant de cellules/tissus de souris présentés dans le tableau 5 ci-dessous. Cet exemple a été réalisé en utilisant les séquences SEQ ID NO : 20 6 et 7 comme amorce sens et antisens, et la séquence SEQ ID NO : 8 comme sonde pour amplifier et détecter le calibreur universel chez la souris. Les séquences SEQ ID NO : 69 et 70 comme amorce sens et antisens, et la séquence SEQ ID NO : 71 comme sonde pour amplifier et 25 détecter le gène cible EGFR1 murin. Tableau 5 : Cellules/tissus utilisées Numéro de Caractéristique de l'échantillon I 'échantil on C2 ADN extrait de foie de souris au temps 3 mois mais congelé au temps TO = témoin positif El ADN extrait de foie de souris, lyophilisé 2 9 802 1 1 39 au temps TO, mais purifié 24 heures après la lyophilisation E2 ADN extrait de foie de souris, lyophilisé au temps TO, mais purifié 1 semaine après la lyophilisation E3 ADN extrait de foie de souris, lyophilisé au temps TO, mais purifié 1 mois après lyophilisation E4 ADN extrait de foie de souris, lyophilisé au temps TO, mais purifié 3 mois après lyophilisation STD100 ADN de référence souris à 100 ng (non lyophilisé) STD25 ADN de référence souris à 50 ng (non lyophilisé) STD50 ADN de référence souris à 25 ng (non lyophilisé) La lyophilisation des tissus E1, E2, E3 et E4 a été réalisée à l'aide d'un lyophilisateur de paillasse MARTIN CHRIS de 2.5 kg, - 55 °C I ALPHA 1-2 / LDplus. 5 L'ADN des tissus lyophilisés E1, E2, E3 et E4 a été extrait respectivement 24 heures, 1 semaine, 1 mois et 3 mois après lyophilisation de ces tissus. L'ensemble des résultats est représenté sur la figure 4 et sur le 10 tableau 6 ci-dessous. Tableau 6 : Résultats expérimentaux du test DNAqual chez la souris Cible Calibreur murin EGFR1 murin Expression Ech. Moy C(t) C(t) SEM Moy C(t) C(t) SEM Exp. Exp. SEM STD100ng 32,66 0,05033 28,12 0,10642 1 0,07928 STD5Ong 33,82 0,01249 29,2 0,00911 1,04647 0,01083 STD25ng 34,74 0,29665 30,18 0,0459 1 0,20002 C2 32,42 0,12151 27,81 0,03445 1,05392 0,08876 El 29,13 0,06761 26,23 0,02212 0,34259 0,01626 E2 27,94 0,07898 25,1 0,00575 0,33135 0,01748 E3 28,77 0,10697 25,9 0,03635 0,33665 0,02537 E4 29,92 0,3524 26,66 0,11727 0,43142 0,10688 Dans ce tableau « Ech. » « Moy Ct », « SEM » et « Exp. » ont la même signification que précédemment. La valeur correspondant à l'échantillon STD100 est de 1 car il s'agit de l'échantillon de référence, marqué comme standard dans le programme de la qPCR. Les valeurs correspondant aux échantillons STD50 et STD25 sont quasiment égales à 1, ce qui est normal car la dilution ne change pas le rapport de fluorescence du calibreur murin et du gène EGFR1 murin. Example 3: DNAqual - Quantification Kit of the Human EGFR1 Gene A kit for the quantification of the EGFR1 gene was made in and comprises the following components described in Example 2 above: 10 μl of reference DNA for EGFR1 at 100 ng 10 μl of reference DNA for EGFR1 at 50 ng / μl, 10 μl of reference DNA for EGFR1 at 25 ng / μl, 770 μl of iQ supermix (trade mark) (reference 1708862, Biorad), 50 μl. primer sense of calibrator (SEQ ID NO: 2) at 10 μM, 50 μl of antisense primer of the calibrator (SEQ ID NO: 3) at 10 μM, 16,5 μl of calibrator probe (SEQ ID NO: 4) possessing a 5'-fluorochrome Texas red (registered trademark) and a 3 ', 20 μM quencher BHQ2 (registered trademark), 50 μl of the forward primer of EGFR1 (SEQ ID NO: 9) at 1 μM. 50 μl of 1 μM antisense primer EGFR1 (SEQ ID NO: 10), 16.5 μl of EGFR1 probe (SEQ ID NO: 11) having a Yakima yellow (registered trademark) 5 'fluorochrome and a quencher BHQ1 (registered trademark) in 3 'at 20pM. Each of these components is separately packaged in a 1.5 ml plastic tube (Dutscher, Cat. No. 045401). Example 4 DNAqual - Quantification of the murine EGFR1 gene according to the method of the invention on tissues of mice having or not lyophilized before the purification of their DNAs The experiment described in Example 2 was carried out on DNAs originating from mouse cells / tissues shown in Table 5 below. This example was carried out using the sequences SEQ ID NO: 6 and 7 as sense and antisense primer, and the sequence SEQ ID NO: 8 as a probe for amplifying and detecting the universal calibrator in the mouse. SEQ ID NOs: 69 and 70 as sense and antisense primer, and SEQ ID NO: 71 as a probe for amplifying and detecting the murine EGFR1 target gene. Table 5: Cells / Tissues Used Specimen Characteristic Number Sample C2 DNA Extracted from Mouse Liver at Time 3 Months but Frozen at Time TO = Positive Control El DNA Extracted from Mouse Liver, Freeze Dried 2 9 802 1 1 39 at time TO, but purified 24 hours after lyophilization E2 DNA extracted from mouse liver, lyophilized at time TO, but purified 1 week after lyophilization E3 DNA extracted from mouse liver, lyophilized at time TO, but purified 1 month after lyophilization E4 DNA extracted from mouse liver, lyophilized at time TO, but purified 3 months after freeze-drying STD100 Reference DNA mouse at 100 ng (non-freeze-dried) STD25 Reference DNA mouse at 50 ng (non-freeze-dried) STD50 reference DNA mouse at 25 ng (not freeze-dried) Lyophilization of E1, E2, E3 and E4 tissues was performed using a MARTIN CHRIS bench-top freeze-dryer of 2.5 kg, 55 ° CI ALPHA 1-2 / LDplus. The DNA of lyophilized tissues E1, E2, E3 and E4 was extracted 24 hours, 1 week, 1 month and 3 months, respectively, after lyophilization of these tissues. The overall results are shown in Figure 4 and Table 6 below. Table 6: Experimental Results of the DNAqual Test in the Mouse Target Murine EGFR1 Murine Expression Ech. Mean C (t) C (t) SEM Avg C (t) C (t) SEM Exp. Exp. SEM STD100ng 32.66 0.05033 28.12 0.10642 1 0.07928 STD5Ong 33.82 0.01249 29.2 0.00911 1.04647 0.01083 STD25ng 34.74 0.29665 30.18 0.0459 1 0.20002 C2 32.42 0.12151 27.81 0.03445 1.05392 0.08876 El 29.13 0.06761 26.23 0.02212 0.34259 0.01626 E2 27.94 0.07898 25 , 1 0.00575 0.33135 0.01748 E3 28.77 0.10697 25.9 0.03635 0.33665 0.02537 E4 29.92 0.3524 26.66 0.1727 0.43142 0.10688 In the range of this table "Ech. "Moy Ct", "SEM" and "Exp. Have the same meaning as before. The value corresponding to sample STD100 is 1 because it is the reference sample, marked as standard in the qPCR program. The values corresponding to samples STD50 and STD25 are almost equal to 1, which is normal because the dilution does not change the fluorescence ratio of the murine calibrator and the murine EGFR1 gene.

La valeur correspondant à l'échantillon C2 est proche de 1, ce qui signifie que le nombre de copie du gène EGFR1 murin est quasiment identique à celui de l'échantillon de référence. Les valeurs correspondant aux échantillons lyophilisés (E1, E2, E3 et E4 sont toutes inférieures à 1 et inférieures à la valeur correspondant à l'échantillon non lyophilisé. Cela signifie que le nombre de copie du gène EGFR1 murin est inférieur après lyophilisation. Ces résultats montrent que le procédé selon l'invention permet de détecter et quantifier efficacement la variation du nombre de copies du gène EGFR1 murin, causée par une lyophilisation. The value corresponding to sample C2 is close to 1, which means that the number of copies of the murine EGFR1 gene is almost identical to that of the reference sample. The values corresponding to the lyophilized samples (E1, E2, E3 and E4 are all less than 1 and less than the value corresponding to the non-freeze-dried sample, which means that the number of copies of the murine EGFR1 gene is lower after lyophilization. show that the method according to the invention makes it possible to effectively detect and quantify the variation in the number of copies of the murine EGFR1 gene, caused by lyophilization.

Une étude de la variation du nombre de copies du gène EGFR1 avec des ADN extraits des cellules/tissus précités et dans les mêmes conditions opératoires que celles décrites ci-dessus, a été réalisée avec une méthode d'analyse sur gel d'agarose. 6 pl de chaque échantillon d'ADN, ont été déposés sur un gel d'agarose 0,8%. Le marqueur de poids moléculaire utilisé était du Smart Ladder : MW-1700-10 d'Eurogenetec. Les résultats obtenus et présenté à la figure 5 démontrent bien que cette méthode ne permet pas de détecter les dégradations de l'ADN engendrées par une lyophilisation préalable des tissus. A study of the variation in the number of copies of the EGFR1 gene with DNAs extracted from the aforementioned cells / tissues and under the same operating conditions as those described above, was carried out using an agarose gel analysis method. 6 μl of each DNA sample were deposited on a 0.8% agarose gel. The molecular weight marker used was Eurogenetec's Smart Ladder: MW-1700-10. The results obtained and presented in FIG. 5 clearly demonstrate that this method does not make it possible to detect the degradation of the DNA generated by prior lyophilization of the tissues.

Exemple 5: MITOC - Vérification de la toxicité potentielle de candidats médicaments - Comparaison avec le test standard d'évaluation de la prolifération cellulaire « MTT » Dans cet exemple l'ADN de référence et l'ADN à analyser provenait de cellules modèles HEPG2 équipées enzymatiquement du cytochrome P450 (« CYP 450 »). L'ADN à analyser a été déterminé comme appartenant à des cellules intoxiquées avec une substance donnée pendant 72 heures. L'ADN de référence a été déterminé comme appartenant à des cellules non intoxiquées cultivées pendant 72 h en présence de 0,01 % de DMSO. Dans cet exemple, trois tests ont été réalisés : un test MTT afin de quantifier la viabilité des cellules traitées par des substances éventuellement anti prolifératives, un test DNAqual pour vérifier la qualité des ADN et un test MITOC pour quantifier le nombre de génome mitochondrial ou mitochondries contenues dans les cellules HEPG2 traitées ou non par des substances dont on cherche à déterminer, en plus de leur activité anti proliférative, leur éventuelle toxicité. Les informations obtenues sont comparées aux résultats obtenus avec le test MTT. Example 5: MITOC - Verification of the Potential Toxicity of Drug Candidates - Comparison with the Standard Test for Cell Proliferation "MTT" In this example the reference DNA and the DNA to be analyzed came from model cells HEPG2 equipped enzymatically cytochrome P450 ("CYP 450"). The DNA to be analyzed was determined to belong to cells intoxicated with a given substance for 72 hours. The reference DNA was determined to belong to non-intoxicated cells cultured for 72 h in the presence of 0.01% DMSO. In this example, three tests were performed: an MTT assay to quantify the viability of cells treated with possibly anti-proliferative substances, a DNAqual test to verify the quality of the DNA and a MITOC test to quantify the number of mitochondrial genomes or mitochondria. contained in the HEPG2 cells treated or not with substances whose purpose is to determine, in addition to their anti-proliferative activity, their possible toxicity. The information obtained is compared with the results obtained with the MTT test.

La figure 6 présente les résultats de cet exemple 5. Chaque triplet représente les résultats des tests MTT, DNAqual et MITOC respectivement pour chaque traitement. Par exemple, le ler triplet représente les résultats des tests MTT, DNAqual et MITOC pour le traitement au DMSO. FIG. 6 presents the results of this example 5. Each triplet represents the results of the MTT, DNAqual and MITOC tests respectively for each treatment. For example, the 1st triplet represents the results of MTT, DNAqual and MITOC tests for DMSO treatment.

Pour comparaison, toutes les valeurs obtenues avec le test MTT ont été converties en pourcentage par rapport au contrôle indiqué « DMSO+ » dont le pourcentage a été fixé à 0% (pour zéro % d'inhibition de la prolifération cellulaire). Ainsi, dans la figure 6, dans le 1 er triplet représentant les résultats avec le traitement au DMSO (« DMSO+ »), le 1 er bâton, qui représente le résultat du test MTT, est à zéro, pour « zéro % d'inhibition de la prolifération cellulaire ». 2 9 802 1 1 42 12 substances différentes, diluées dans le DMSO, ont été testées. Elles ont été ajoutées dans le milieu de culture des cellules HEPG2 qui ont étaient ainsi maintenues pendant 72 h avant analyse. 5 Pour cet exemple, les 12 substances testées sont numérotées 38, 133, 145, 158, 167, 170, 194, 198, 203, 211, 248, 251. Ce sont des analogues de nucléosides provenant de la chimiothèque de l'institut de chimie de Nice, Université de Nice Sophia Antipolis, France. Chacune de ces substances a été testées à une concentration de 15 pM. 10 Le contrôle a été réalisé avec du diméthylsulfoxyde (« DMSO ») sans substance à tester, à une concentration de 0,01%. Le test MTT a été réalisé selon le protocole décrit dans Hussain et al. (Hussain et al. « A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay », J Immunol Methods. 1993 Mar 15;160(1):89-96 [7]). 15 Le sel de tetrazoline MTT (« bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5- diphenyl tetrazolium »), inclus dans le kit Cell Titer 96 Non Radioactive Cell proliferation assay (catalogue Part#G4001 ; PROMEGA, France). Le test MTT a été réalisé, en plaques à 96 puits (Orange scientific : N° de catalogue 5530 100) avec le kit Cell Titer 96 Non Radioactive Cell 20 proliferation assay (catalogue Part#G4001), selon les indications du fabricant avec, au départ, 7500 cellules/puits. A la fin du test MTT, les plaques ont été vidées de leur liquide et les ADN ont été extraits des cellules des tripliquas de puits et mélangés avant d'être analysés par DNAqual et MITOC. Leurs résultats sont 25 exprimés en % par rapport aux résultats obtenus avec l'ADN contrôle « DMSO+ », fixé à 100 %. Pour le test DNAqual, le même protocole que celui décrit dans l'exemple 2 a été mis en oeuvre. 30 2 9 8 0 2 1 1 43 Pour le test MITOC, la variation du nombre de copies d'un gène cible mitochondrial a été mesurée selon le protocole décrit ci-dessus avec les amorces sens et antisens de séquences respectives SEQ ID NO : 66 et 67, et avec une sonde fluorescente de séquence SEQ ID 68. 5 Les cellules HEPG2 ont été choisies pour réaliser le test MITOC. Ce sont des cellules hépatiques équipées enzymatiquement du cytochrome P450 (« CYP 450 ») permettant la gestion des toxines. Les HEPG2 sont fréquemment utilisées pour vérifier la toxicité de substances dans les tests in vitro. 10 L'ensemble des résultats est représenté sur la figure 6 et sur le tableau 7 ci-dessous. Les tests de qPCR sont exprimés comme des % du contrôle. 15 Tableau 7 : Résultats expérimentaux des tests MITOC et DNAqual chez l'homme MTT DNA QUAL MITOC Ech. Prol. °A Inhibition Exp. Exp. °/0 Exp. Exp. SEM SEM DMSO+ 100 0 0,8856 0,0423 100 2,2535 0,0927 100 38 76 24 0,8179 0,0241 92 4,4904 0,3099 199 133 49 51 0,8028 0,0352 91 0,1192 0,0833 5 145 72 28 0,9061 0,0116 102 4,1596 0,2009 185 158 77 23 0,8790 0,0000 99 1,4499 0,0233 64 167 55 45 0,7642 0,0202 86 3,8378 0,1363 170 170 75 25 0,7022 0,0371 79 1,3742 0,0667 61 194 79 21 0,9172 0,0471 104 4,8860 0,4441 217 198 72 28 0,9871 0,0597 111 4,4231 0,1279 196 203 72 28 1,0528 0,0412 119 4,7148 0,0407 209 211 80 20 0,4054 0,0122 46 4,0350 0,0445 179 248 67 33 0,7909 0,0317 89 3,1334 0,0818 139 251 72 28 0,7855 0,0126 89 2,0017 0,0487 89 Dans ce tableau « Ech. » sianifie « Echantillon ». « Prol. » sianif « prolifération », « Inh. » signifie « inhibition », « SEM » signifie « erreur type » et « Exp. » signifie « expression ». , ie 20 2 9 8 0 2 1 1 44 Concernant le test MTT, les résultats montrent que les 12 substances testées possèdent un pouvoir antiprolifératif qui varie par rapport au contrôle (DMSO seul « DMSO+ »). Cet exemple 5 révèle que la substance 251 est la seule à ne pas 5 présenter de pouvoir de dégradation de l'ADN cellulaire des cellules traitées (bâton du milieu proche de 1) et, en même temps, à ne pas présenter de variation du nombre de copies de génome mitochondrial (bâton de droite également proche de 1) alors qu'elle inhibe la prolifération cellulaire de 25 % (bâton de gauche proche de 25%). 10 Les substances 145, 194, 198, 203 et 248 ont des pouvoirs antiprolifératifs voisins, d'environ 25 %, mais entrainent une augmentation du nombre de copies de génome mitochondrial (crise mitochondriale, bâtons de droite) indiquant ainsi, une forte activité métabolique des cellules ou une souffrance cellulaire quand ce chiffre diminue. 15 La substance 133 qui a le pouvoir antiprolifératif le plus important, de 50 %, a des effets toxiques prononcés puisque le nombre de mitochondries ou copie de génome mitochondrial diminue fortement (bâton de droite), faisant craindre l'apparition d'un effet toxique délétère en cas d'administration prolongée de cette substance. La substance 211 entraine, 20 à cette dose, une forte dégradation de l'ADN génomique et aussi une crise mitochondriale. Cet exemple 5 montre que les tests DNAqual et MITOC affinent les résultats d'un test MTT classique qui indique uniquement un nombre de cellules survivantes à l'intoxication par des substances sans donner 25 d'indication supplémentaire sur l'éventuelle toxicité mitochondriale ou sur un effet clastique sur l'ADN. Le test MITOC conforme au procédé de la présente invention, affine les résultats du test MTT en mettant en évidence l'effet toxique d'une substance donnée sur les mitochondries cellulaires. 30 Exemple 6 : Copycount - Criblage de tumeurs de colon humain Dans cet exemple, l'ADN de référence provient du laboratoire, il est aussi l'ADN contrôle (50 ng). L'ADN à analyser provient d'échantillons de tissus de patients opérés de cancer recto coliques. Ils sont à chaque fois appariés : tissus sains prélevés à distance de la tumeur sur la pièce de résection opératoire et les tissus tumoraux. Ils ont été fournis par la tumorothèque du Centre hospitalier régional de REIMS, (Patient 1-10, dans le tableau 8 ci-dessous et dans la figure 7). Les ADN ont été extraits comme dans les exemples précédant et des échantillons de 50 ng d'ADN ont été analysés en triplicatas pour mesurer le nombre de copies génomiques de EGFR1 humain, IGFR1 (« Insuline growth factor recepteur 1 ») humain et ERBB3 (« epidermal receptor 3 ») humain en comparant à chaque fois les tissus sains et les tissus tumoraux appariés pour chaque patient. For comparison, all the values obtained with the MTT test were converted to a percentage relative to the indicated control "DMSO +" whose percentage was fixed at 0% (for zero% inhibition of cell proliferation). Thus, in FIG. 6, in the first triplet representing the results with the DMSO treatment ("DMSO +"), the first stick, which represents the result of the MTT test, is at zero, for "zero% inhibition. of cell proliferation ". 2 9 802 1 1 42 12 different substances, diluted in DMSO, were tested. They were added to the culture medium of HEPG2 cells which were thus maintained for 72 hours before analysis. For this example, the 12 substances tested are numbered 38, 133, 145, 158, 167, 170, 194, 198, 203, 211, 248, 251. These are nucleoside analogs from the Institute of Chemicals library. Nice chemistry, University of Nice Sophia Antipolis, France. Each of these substances was tested at a concentration of 15 μM. The control was carried out with dimethylsulfoxide ("DMSO") without test substance at a concentration of 0.01%. The MTT test was performed according to the protocol described in Hussain et al. (Hussain et al., "Immunol Methods, 1993 Mar 15; 160 (1): 89-96 [7]). MTT tetrazoline salt ("3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide"), included in the kit Cell Titer 96 Non Radioactive Cell proliferation assay (catalog Part # G4001 PROMEGA, France). The MTT test was performed in 96-well plates (Orange scientific: Cat. No. 5530 100) with the kit Cell Titer 96 Non Radioactive Cell 20 proliferation assay (catalog Part # G4001), according to the manufacturer's indications with, at starting, 7500 cells / well. At the end of the MTT test, the plates were emptied of their liquid and the DNAs were extracted from the well triplicate cells and mixed before being analyzed by DNAqual and MITOC. Their results are expressed in% relative to the results obtained with the control DNA "DMSO +", fixed at 100%. For the DNAqual test, the same protocol as that described in Example 2 was implemented. For the MITOC assay, the variation in the number of copies of a mitochondrial target gene was measured according to the protocol described above with the sense and antisense primers of respective sequences SEQ ID NO: 66 and 67, and with a fluorescent probe of sequence SEQ ID 68. The HEPG2 cells were chosen to perform the MITOC test. These are hepatic cells equipped enzymatically with cytochrome P450 ("CYP 450") for the management of toxins. HEPG2 is frequently used to test the toxicity of substances in in vitro tests. The overall results are shown in Figure 6 and Table 7 below. QPCR tests are expressed as% of control. Table 7: Experimental Results of MITOC and DNAqual Tests in Men MTT DNA QUAL MITOC Ech. Prol. ° Inhibition Exp. Exp. ° / 0 Exp. Exp. SEM SEM DMSO + 100 0 0.8856 0.0423 100 2.2535 0.0927 100 38 76 24 0.8179 0.0241 92 4.4904 0.3099 199 133 49 51 0.8028 0.0352 91 0.1992 0 , 0833 5 145 72 28 0,9061 0,0116 102 4,1596 0,2009 185,158 77 23 0.8790 0.0000 99 1.4499 0.0233 64 167 55 45 0.7642 0.0202 86 3.8378 0.163 170 170 75 25 0.7022 0.0371 79 1.3742 0.0667 61 194 79 21 0.9172 0.0471 104 4.8860 0.4441 217 198 72 28 0.9871 0.0597 111 4, 4231 0.1279 203 203 72 28 1.0528 0.0412 119 4.7148 0.0407 209 211 80 20 0.4054 0.0122 46 4.0350 0.0445 179 248 67 33 0.7909 0.0317 89 3 , 1334 0.0818 139 251 72 28 0.7855 0.0126 89 2.0017 0.0487 89 In this table "Ech. "Sianifies" Sample ". "Prol. Sianif "proliferation", "Inh. "Means" inhibition "," SEM "means" standard error "and" Exp. "Means" expression ". On the MTT test, the results show that the 12 substances tested have an antiproliferative power which varies with respect to the control (DMSO only "DMSO +"). This example reveals that substance 251 is the only one which does not have the cell-cellular degradation power of the treated cells (medium stick close to 1) and, at the same time, does not show any variation in the number of cells. mitochondrial genome copies (right stick also close to 1) while inhibiting cell proliferation by 25% (left stick close to 25%). Substances 145, 194, 198, 203 and 248 have similar antiproliferative powers, about 25%, but lead to an increase in the number of mitochondrial genome copies (mitochondrial attack, right sticks) thus indicating a high metabolic activity. cells or cellular suffering when this figure decreases. The substance 133 which has the most important antiproliferative power, 50%, has pronounced toxic effects since the number of mitochondria or mitochondrial genome copy decreases sharply (right stick), raising the fear of the appearance of a toxic effect. deleterious in case of prolonged administration of this substance. The substance 211 causes, at this dose, a strong degradation of the genomic DNA and also a mitochondrial crisis. This example shows that the DNAqual and MITOC tests refine the results of a conventional MTT test which only indicates a number of cells surviving substance intoxication without giving any additional indication of the possible mitochondrial toxicity or clastic effect on DNA. The MITOC test according to the method of the present invention, refines the results of the MTT test by highlighting the toxic effect of a given substance on cellular mitochondria. Example 6: Copycount - Screening of human colon tumors In this example, the reference DNA comes from the laboratory, it is also the control DNA (50 ng). The DNA to be analyzed comes from tissue samples of patients operated for rectocolic cancer. They are paired each time: healthy tissue removed from the tumor on the operative resection room and tumor tissue. They were provided by the REIMS Regional Hospital Tumor Library, (Patient 1-10, in Table 8 below and Figure 7). The DNAs were extracted as in the preceding examples and samples of 50 ng of DNA were analyzed in triplicate to measure the number of genomic copies of human EGFR1, IGFR1 ("Insulin growth factor receptor 1") and ERBB3 (" epidermal receptor 3 ") by comparing healthy tissue and matched tumor tissue for each patient each time.

Les séquences d'amorces sens et antisens et les séquences de la sonde fluorescente utilisées pour amplifier et quantifier les gènes EGFR1, IGFR1 et ERBB3 étaient respectivement les suivantes : - EGFR1 : SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 11, - IGFR1 : SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35, et - ERBB3 : SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17. Les séquences d'amorces sens et antisens et la séquence de la sonde fluorescente utilisées pour amplifier et quantifier le calibreur selon l'invention (SEQ ID NO : 1) étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus. Les fluorochromes utilisés pour quantifier le calibreur (fluorochrome 1) et pour quantifier les gènes cibles (EGFR1, IGFR1 et ERBB3) (fluorochrome 2) étaient les mêmes que ceux décrits dans l'exemple 1. Dans cet exemple, la méthode « Copycount » a été utilisée pour cribler des tumeurs de colon humain en comparant à chaque fois des échantillons tumoraux appariés avec leurs tissus non tumoraux (tissus sains), selon le protocole décrit dans l'exemple 1. L'ensemble des résultats est représenté sur la figure 7 et sur le tableau 8 ci-dessous. i aoieau b : Kesu itats expenmentaux au test uopycount cnez rnomme Côlon tumoral Côlon sain Moyenne Sain Ech. Nom Exp. Exp. Expr. Exp. Expr. Exp. SEM SEM SEM EGFR1 1 Patient 1 2,1631 0,148 1,4606 0,0234 1,0734 0,0419 EGFR1 2 Patient 2 2,2238 0,1008 1,0557 0,0337 EGFR1 3 Patient 3 2,5032 0,0518 1,0134 0,0399 EGFR1 4 Patient 4 2,477 0,1036 1,072 0,0421 EGFR1 5 Patient 5 1,9792 0,1288 1 0,0631 EGFR1 6 Patient 6 2,3394 0,1152 1,1046 0,0226 EGFR1 7 Patient 7 2,21 0,0276 1,0446 0,0428 EGFR1 8 Patient 8 2,9304 0,1455 1,144 0,0559 EGFR1 9 Patient 9 2,9933 0,0758 0,8637 0,0318 EGFR1 10 Patient 10 1,8494 0,058 0,9757 0,0638 IGFRI 1 Patient 1 1,717 0,1665 1,3597 0,0713 1,023 0,0835 IGFRI 2 Patient 2 1,6022 0,0599 0,9354 0,0456 IGFRI 3 Patient 3 2,4781 0,0836 0,9036 0,0322 IGFRI 4 Patient 4 1,5032 0,1235 1,2716 0,052 IGFRI 5 Patient 5 1,7025 0,1315 1,0476 0,1246 IGFRI 6 Patient 6 1,7928 0,1231 1,1332 0,0778 IGFRI 7 Patient 7 1,5396 0,08 0,9095 0,0648 IGFRI 8 Patient 8 2,2002 0,2057 1,0312 0,2639 IGFRI 9 Patient 9 2,338 0,1707 0,7756 0,0171 IGFRI 10 Patient 10 1,3551 0,1196 0,863 0,0854 ERB3 1 Patient 1 1,625 0,6319 0,7878 0,0406 0,9815 0,0472 ERB3 2 Patient 2 4,495 0,5035 1,0027 0,0508 ERB3 3 Patient 3 0,2434 0,0171 0,9952 0,0685 ERB3 4 Patient 4 0,2664 0,0139 1,003 0,0505 ERB3 5 Patient 5 0,2095 0,0082 1 0,0864 ERB3 6 Patient 6 0,6471 0,0979 1,0162 0,016 ERB3 7 Patient 7 0,3828 0,0355 0,8575 0,0303 ERB3 8 Patient 8 1,5162 0,1087 0,8682 0,0348 ERB3 9 Patient 9 4,8464 0,2504 1,0366 0,0389 ERB3 10 Patient 10 0,7775 0,1419 1,2475 0,0549 Dans ce tableau « Ech. » signifie « Echantillon », « Moy Ct » signifie « moyenne de Ct », « SEM » signifie « erreur type » et « Exp. » signifie « expression ». The sense and antisense primer sequences and the sequences of the fluorescent probe used to amplify and quantify the EGFR1, IGFR1 and ERBB3 genes were respectively the following: EGFR1: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO 11, IGFR1: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35, and ERBB3: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17. Sense and antisense primers and the sequence of the fluorescent probe used to amplify and quantify the calibrator according to the invention (SEQ ID NO: 1) were the same as those described above. The fluorochromes used to quantify the calibrator (fluorochrome 1) and to quantify the target genes (EGFR1, IGFR1 and ERBB3) (fluorochrome 2) were the same as those described in Example 1. In this example, the "Copycount" method has was used to screen human colon tumors by comparing each time matched tumor samples with their non-tumor tissues (healthy tissue), according to the protocol described in Example 1. The set of results is shown in Figure 7 and in Table 8 below. i aeeau b: Experimental kesu ts for uopycount cnez rnomme Tumor colon Healthy colon Healthy Mean Ech. Name Exp. Exp. Expr. Exp. Expr. Exp. SEM SEM SEM EGFR1 1 Patient 1 2,1631 0.148 1.4606 0.0234 1.0734 0.0419 EGFR1 2 Patient 2 2.2238 0.1008 1.0557 0.0337 EGFR1 3 Patient 3 2.5032 0.0518 1 , 0134 0.0399 EGFR1 4 Patient 4 2.477 0.1036 1.072 0.0421 EGFR1 5 Patient 5 1.9792 0.1281 0.0631 EGFR1 6 Patient 6 2.3394 0.115 1.1046 0.0226 EGFR1 7 Patient 7 2.21 0.0276 1.0446 0.0428 EGFR1 8 Patient 8 2.9304 0.1451 1.144 0.0559 EGFR1 9 Patient 9 2.9933 0.0758 0.8637 0.0318 EGFR1 10 Patient 10 1.8494 0.058 0.9757 0.0638 IGFRI 1 Patient 1 1.717 0.165 1.3597 0.0713 1.023 0.0835 IGFRI 2 Patient 2 1.6022 0.0599 0.9354 0.0456 IGFRI 3 Patient 3 2.4781 0, 0836 0,9036 0.0322 IGFRI 4 Patient 4 1.5032 0.1235 1.2716 0.052 IGFRI 5 Patient 5 1.7025 0.1315 1.0476 0.11246 IGFRI 6 Patient 6 1.7928 0.13131 1.1322 0.0778 IGFRI 7 Patient 7 1.5396 0.08 0.9095 0.0648 IGFRI 8 Patient 8 2.2002 0.2057 1.0312 0.2639 IGFRI 9 Patient 9 2.338 0.1707 0.7756 0.0171 IGFRI Patient 10 1.3551 0.196 0.863 0.0854 ERB3 1 Patient 1 1.625 0.6319 0.7878 0.0406 0.9815 0.04 ERB3 2 Patient 2 4,495 0,5035 1,0027 0,0508 ERB3 3 Patient 3 0.2434 0.0171 0.9952 0.0685 ERB3 4 Patient 4 0.2664 0.0139 1.003 0.0505 ERB3 5 Patient 5 0 , 2095 0.0082 1 0.0864 ERB3 6 Patient 6 0.6471 0.0979 1.0162 0.016 ERB3 7 Patient 7 0.3828 0.0355 0.8575 0.0303 ERB3 8 Patient 8 1.5162 0.1087 0 , 8682 0.0348 ERB3 9 Patient 9 4.8464 0.2504 1.0366 0.0389 ERB3 10 Patient 10 0.7775 0.149 1.2475 0.0549 In this table "Ech. "Means" Sample "," Average Ct "means" average Ct "," SEM "means" standard error "and" Exp. "Means" expression ".

On constate que tous les tissus sains présentent un nombre de copies normales de chacun de ces récepteurs (quasiment égal à 1) et que les tissus tumoraux présentent bien tous des amplifications du gène EGFR1. On peut l'affirmer quand on compare les tissus sains et les tissus tumoraux. En ce qui concerne l'IGFR1, les mêmes observations sont possibles. Dans les tumeurs, il s'agit d'amplifications géniques qui ne sont pas présentes dans les tissus sains appariés des mêmes sujets. Par contre en ce qui concerne ERBB3, seuls les patients 1, 2, 8 et 9 ont des amplifications géniques de ERBB3, les autres présentent des délétions. Cet exemple démontre bien l'efficacité de la technologie pour identifier les variations du nombre de copies de gènes dans des tumeurs coliques. Ce test Copycount permet d'indiquer quels sont les thérapies spécifiques les mieux adaptées et aussi d'évaluer le niveau d'agressivité d'une tumeur. En effet, les variations géniques peuvent moduler l'agressivité d'une tumeur (croissance plus ou moins rapide, résistance aux traitements plus ou moins importante). Elles peuvent également affecter la réponse à une thérapie. Par exemple, une amplification génique suggère une augmentation de l'expression de la protéine correspondante. Cette protéine constitue alors une bonne cible thérapeutique. Le traitement thérapeutique ciblant spécifiquement cette protéine sera potentiellement le plus efficace. Par exemple, un anticorps monoclonal contre l'EGFR1 devrait donner une bonne réponse pour traiter un cancer exprimant fortement EGFR1. Cependant, si ERBB2 est également fortement exprimé, il est possible que la cellule cancéreuse utilise la voie de signalisation par ERBB2 pour compenser l'absence d'EGFR1, rendant alors le traitement anti-EGFR1 inefficace. Dans le cas de cette double amplification des gènes codant pour EGFR1 et ERBB2, un autre traitement, ciblant une tout autre voie de signalisation cellulaire, devrait alors être privilégiée. It is found that all the healthy tissues have a normal number of copies of each of these receptors (almost equal to 1) and that the tumor tissues all have amplifications of the EGFR1 gene. It can be said when we compare healthy tissue and tumor tissue. With regard to IGFR1, the same observations are possible. In tumors, these are gene amplifications that are not present in the paired healthy tissues of the same subjects. On the other hand, with regard to ERBB3, only patients 1, 2, 8 and 9 have gene amplifications of ERBB3, the others have deletions. This example demonstrates the effectiveness of the technology in identifying variations in the number of gene copies in colonic tumors. This Copycount test makes it possible to indicate which specific therapies are the most appropriate and also to evaluate the level of aggressiveness of a tumor. Indeed, gene variations can modulate the aggressiveness of a tumor (more or less rapid growth, resistance to more or less important treatments). They can also affect the response to a therapy. For example, gene amplification suggests an increase in the expression of the corresponding protein. This protein is a good therapeutic target. Therapeutic treatment specifically targeting this protein will potentially be the most effective. For example, a monoclonal antibody against EGFR1 should give a good response to treat a cancer expressing strongly EGFR1. However, if ERBB2 is also highly expressed, it is possible that the cancer cell uses the ERBB2 signaling pathway to compensate for the absence of EGFR1, thus rendering the anti-EGFR1 treatment ineffective. In the case of this double amplification of the genes coding for EGFR1 and ERBB2, another treatment, targeting an entirely different cell signaling pathway, should then be preferred.

L'universalité du calibreur permet la comparaison de toutes les mesures. L'essai peut être automatisé et réalisé à haut débit : toutes les mesures se font avec le même programme de qPCR. D'autres gènes que ceux utilisés dans cet exemple peuvent être criblés. 2 9 8 0 2 1 1 [1] 5 [2] [3] 10 [4] [5] [6] [7] 49 Listes des références Redon et al. « Global variation in copy number in the human genome », Nature, vol. 444, 2006, p. 444-454. C A Heid, J Stevens, K J Livak, and P M Williams. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996. 6: 986-994 Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009, 55(4):611-22. Weglarz L, Molin I, Orchel A, Parfiniewicz B, Dzierzewicz Z. Quantitative analysis of the level of p53 and p21(WAF1) mRNA in human colon cancer HT-29 cells treated with inositol hexaphosphate. Acta Biochim Pol. 2006;53(2):349-56. « Relative Quantification: Data Management & Analysis Settings », Ray Meng, (accessible en ligne sur http://genome.hku.hk/portal/files/GRC/Events/Seminars/2009/20090 512/relative°/020quantification_date/020managemenC/020`)/020analys is°/020settings.pdf). Sambrook J, Russel D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition. Vol. 3. New York, NY, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. Hussain et al. «A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay », J Immunol Methods.The universality of the calibrator allows the comparison of all measurements. The test can be automated and performed at high speed: all measurements are done with the same qPCR program. Other genes than those used in this example can be screened. 2 9 8 0 2 1 1 [1] 5 [2] [3] 10 [4] [5] [6] [7] 49 List of references Redon et al. "Global variation in the human genome", Nature, vol. 444, 2006, p. 444-454. C Heid, Stevens J, K Livak J, and Williams P M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996. 6: 986-994 Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009, 55 (4): 611-22. Weglarz L, Molin I, Orchel A, Parfiniewicz B, Dzierzewicz Z. Quantitative analysis of the level of p53 and p21 (WAF1) mRNA in human colon cancer HT-29 cells treated with inositol hexaphosphate. Acta Biochim Pol. 2006; 53 (2): 349-56. "Relative Quantification: Data Management & Analysis Settings," Ray Meng, (available online at http://genome.hku.hk/portal/files/GRC/Events/Seminars/2009/20090 512 / relative / 020quantification_date / 020managemenC / 020`) / 020analys is ° / 020settings.pdf). Sambrook J, Russel D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition. Flight. 3. New York, NY, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. Hussain et al. "A new approach for measuring cytotoxicity using colorimetric assay", J Immunol Methods.

1993 Mar 15;160(1):89-96.30 1993 Mar 15; 160 (1): 89-96.30

Claims (14)

REVENDICATIONS1. Acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1. REVENDICATIONS1. Nucleic acid of SEQ ID NO: 1 sequence. 2. Utilisation de l'acide nucléique SEQ ID NO: 1 pour une analyse d'ADN génomique humain. 2. Use of the nucleic acid SEQ ID NO: 1 for human genomic DNA analysis. 3. Utilisation de l'acide nucléique SEQ ID NO: 1 selon la revendication 2, comme calibreur pour une analyse d'ADN génomique humain. Use of the nucleic acid SEQ ID NO: 1 according to claim 2 as a calibrator for human genomic DNA analysis. 4. Procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1, comprenant l'utilisation d'un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:1, et une étape de comparaison de la quantité du gène cible dans un échantillon à tester avec la quantité du gène cible dans un échantillon de référence. 4. In vitro method for analyzing the variation of the quantity of a target gene different from SEQ ID NO: 1, comprising the use of a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1, and a step of comparison of the amount of the target gene in a test sample with the amount of the target gene in a reference sample. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'étape de comparaison de la quantité du gène cible dans un échantillon à tester avec la quantité du gène cible dans un échantillon de référence est réalisée en utilisant la méthode du AA de Ct. The method of claim 4, wherein the step of comparing the amount of the target gene in a test sample with the amount of the target gene in a reference sample is performed using the AA method of Ct. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel l'échantillon de référence et l'échantillon à tester proviennent d'un seul individu ou de deux individus. The method of claim 4 or 5, wherein the reference sample and the test sample are from a single individual or two individuals. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, dans lequel la quantité du gène est un nombre de copie du gène. The method of any one of claims 4 to 6, wherein the amount of the gene is a copy number of the gene. 8. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, pour évaluer la qualité d'un ADN humain. 8. Use of the method according to any one of claims 4 to 7 for evaluating the quality of a human DNA. 9. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, pour déterminer l'effet d'une substance et/ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. 9. Use of the method according to any one of claims 4 to 7 for determining the effect of a substance and / or a treatment on the copy number of a target gene in a sample. 10. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, pour déterminer la toxicité d'une substance et/ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. The use of the method according to any one of claims 4 to 7 for determining the toxicity of a substance and / or a treatment on the copy number of a target gene in a sample. 11. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, dans un test de criblage. 11. Use of the method according to any one of claims 4 to 7, in a screening test. 12. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, pour aider à déterminer et/ou adapter un traitement et/ou suivre l'évolution d'une maladie pendant son traitement. 12. Use of the method according to any one of claims 4 to 7, to help determine and / or adapt a treatment and / or follow the evolution of a disease during its treatment. 13. Kit d'analyse d'ADN génomique humain comprenant des amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 du calibreur, et une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1 produits. 13. Kit for human genomic DNA analysis comprising sense and antisense primers for amplifying the sequence SEQ ID NO: 1 of the calibrator, and a fluorescent probe for quantifying the amplicons of SEQ ID NO: 1 produced. 14. Kit selon la revendication 13, dans lequel les amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 du calibreur sont respectivement de séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3, et la sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1 produits est de séquence SEQ ID NO : 4. 14. Kit according to claim 13, wherein the sense and antisense primers for amplifying the sequence SEQ ID NO: 1 of the calibrator are respectively of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, and the fluorescent probe for quantifying the amplicons of SEQ ID NO: 1 products is of sequence SEQ ID NO: 4.
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