FR2978774A1

FR2978774A1 - Detecting proinflammatory contaminants in glucose polymers, comprises testing in vitro inflammatory response using cell line enabling inflammatory response factor to be detected, where cell line is macrophage-differentiated cell line

Info

Publication number: FR2978774A1
Application number: FR1157073A
Authority: FR
Inventors: Pierre Lanos; Gherbi Hela Hacine; Fabrice Allain; Mathieu Carpentier; Agnes Denys
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 2011-08-02
Filing date: 2011-08-02
Publication date: 2013-02-08
Anticipated expiration: 2031-08-02
Also published as: FR2978774B1

Abstract

Detecting proinflammatory contaminants in glucose polymers, where the contaminants are capable of triggering an inflammatory reaction, comprises testing at least one in vitro inflammatory response using a cell line enabling at least one inflammatory response factor to be detected, where the cell line is either a macrophage or a macrophage-differentiated cell line, or a cell expressing one or more toll-like receptors (TLRs) or nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptors such as TLR2, TLR4 or NOD2 and enabling the responses of the receptors to be detected.

Description

METHODES DE DETECTION DES CONTAMINANTS DES CIRCUITS DE PRODUCTION DE POLYMERES DE GLUCOSE METHODS FOR DETECTING CONTAMINANTS IN GLUCOSE POLYMER PRODUCTION CIRCUITS

La présente est invention est relative à des méthodes de détection des contaminants des circuits de production de polymères de glucose, plus particulièrement ceux destinés à la dialyse péritonéale. Par extension, ce procédé permet également la détection des contaminants des circuits de production de polymères de glucose destinés à la nutrition entérale et parentérale, voire à la nutrition des nouveaux nés. The present invention relates to methods for detecting contaminants in glucose polymer production circuits, particularly those for peritoneal dialysis. By extension, this process also allows the detection of contaminants in glucose polymer production circuits for enteral and parenteral nutrition, or even for the nutrition of newborns.

L'invention a également pour objet les moyens d'identification des contaminants pro-inflammatoires. The invention also relates to the means for identifying pro-inflammatory contaminants.

Arrière-plan technologique de l'invention La société Demanderesse a choisi de développer son invention dans un domaine connu pour la dangerosité des contaminants susceptibles d'être amenés par les polymères de glucose, contaminants à l'origine de réactions inflammatoires très néfastes pour la santé humaine : celui de la dialyse péritonéale. La dialyse péritonéale est un type de dialyse qui a pour objectif d'éliminer les déchets tels que l'urée, la créatinine, l'excès de potassium ou l'excédent d'eau que les reins ne parviennent pas ou plus à épurer du plasma sanguin. Ce traitement médical est indiqué en cas d'insuffisance rénale chronique terminale. C'est une épuration intracorporelle qui utilise le péritoine comme membrane de dialyse. Les déchets toxiques du sang traversent la membrane semi-perméable du péritoine, vers une solution appelée dialysat. Le dialysat est introduit dans la cavité péritonéale par un cathéter permanent. II existe deux types de dialyse péritonéale : - La DPCA (dialyse péritonéale continue ambulatoire), traitement qui se base sur le passage de 4 poches de dialysat par jour selon prescription médicale - La DPA (dialyse péritonéale automatisée), traitement nocturne continu qui correspond à environ 15 litres de dialysat par 8 heures selon prescription médicale. BACKGROUND OF THE INVENTION The Applicant Company has chosen to develop its invention in a field known for the dangerousness of contaminants that may be brought by glucose polymers, contaminants that cause inflammatory reactions that are very harmful to health. human: that of peritoneal dialysis. Peritoneal dialysis is a type of dialysis that aims to eliminate waste such as urea, creatinine, excess potassium or excess water that the kidneys fail to purify or plasma blood. This medical treatment is indicated for chronic end stage renal failure. It is an intracorporeal treatment that uses the peritoneum as a dialysis membrane. Toxic waste from the blood passes through the semipermeable membrane of the peritoneum to a solution called dialysate. The dialysate is introduced into the peritoneal cavity by a permanent catheter. There are two types of peritoneal dialysis: - DPCA (continuous ambulatory peritoneal dialysis), treatment that is based on the passage of 4 bags of dialysate per day according to medical prescription - DPA (automated peritoneal dialysis), continuous night treatment that corresponds to approximately 15 liters of dialysate per 8 hours as prescribed by the doctor.

Les dialysats les plus couramment utilisés sont composés d'une solution tampon (du lactate ou du bicarbonate) à pH acide (5,2 - 5,5) ou physiologique (7,4) à laquelle sont ajoutés des électrolytes (sodium, calcium, magnésium, chlore) et un agent osmotique (du glucose ou un polymère de glucose, tel que l'« icodextrine » présent dans la solution pour dialyse péritonéale ambulatoire EXTRANEAL commercialisée par la société BAXTER). The dialysates most commonly used are composed of a buffer solution (lactate or bicarbonate) at acid pH (5.2-5.5) or physiological (7.4) to which electrolytes (sodium, calcium, magnesium, chlorine) and an osmotic agent (glucose or a glucose polymer, such as "icodextrin" present in the EXTRANEAL ambulatory peritoneal dialysis solution marketed by BAXTER).

Le polymère de glucose, tel l'icodextrine mentionné ci-avant, est préféré au glucose comme agent osmotique, car en raison de sa petite taille, le glucose qui traverse rapidement le péritoine mène à la perte de gradient osmotique dans les 2 à 4 heures d'infusion. Les polymères de glucose standard sont produits par hydrolyse acide ou enzymatique d'amidon de céréales ou de tubercules. L'hydrolyse acide de l'amidon, totalement aléatoire, ou son hydrolyse enzymatique un peu plus ordonnée, fournissent des mélanges de glucose (monomère) et des chaînes de glucose qui comportent des molécules très courtes (oligomères), de faible Degré de Polymérisation (ou D.P.), aussi bien que des molécules très longues (polymères), de D.P. élevé. The glucose polymer, such as the icodextrin mentioned above, is preferred to glucose as an osmotic agent because, because of its small size, the glucose that rapidly passes through the peritoneum leads to the loss of osmotic gradient within 2 to 4 hours. infusion. Standard glucose polymers are produced by acid or enzymatic hydrolysis of starch from cereals or tubers. The totally random acid hydrolysis of starch, or its somewhat more orderly enzymatic hydrolysis, provide mixtures of glucose (monomer) and glucose chains which have very short molecules (oligomers), low degree of polymerization ( or DP), as well as very long molecules (polymers), of high DP.

Les polymères de glucose ont par ailleurs un poids moléculaire extrêmement varié. Dans le domaine plus particulier de l'utilisation des polymères du glucose destinés à la dialyse péritonéale continue et ambulatoire, il est très vite apparu que ces hydrolysats d'amidon (mélange de glucose, d'oligomères et de polymères de glucose) ne pouvaient pas être utilisés tels quels. Glucose polymers also have an extremely varied molecular weight. In the more particular field of the use of glucose polymers for continuous and ambulatory peritoneal dialysis, it quickly became clear that these starch hydrolysates (a mixture of glucose, oligomers and glucose polymers) could not be used as is.

La demande de brevet européen EP 207.676 enseigne qu'il est préféré des polymères de glucose formant des solutions limpides et incolores à 10 % dans l'eau, ayant un poids moléculaire moyen en poids (Mw) de 5.000 à 100.000 daltons et un poids moléculaire moyen en nombre (Mn) inférieur à 8.000 daltons. De tels polymères de glucose comprennent aussi de façon préférée au moins 80 % de polymères du glucose dont le poids moléculaire est compris entre 5.000 et 50.000 daltons, peu ou pas de glucose ou de polymères du glucose de DP inférieur ou égal à 3 (poids moléculaire 504) et peu ou pas de polymères de glucose de poids moléculaire supérieur à 100.000 (DP voisin de 600). En d'autres termes, les polymères de glucose préférés sont des polymères de glucose de faible indice de polymolécularité (valeur obtenue en calculant le rapport Mw/Mn). Les procédés proposés dans cette demande de brevet EP 207.676 pour obtenir ces polymères de glucose de faible indice de polymolécularité à partir d'hydrolysats d'amidon consistent : - soit à effectuer une précipitation fractionnée d'une maltodextrine à l'aide d'un solvant miscible à l'eau, - soit à effectuer une filtration moléculaire de cette même maltodextrine au travers de différentes membranes possédant un seuil de coupure ou d'exclusion adéquat. Dans les deux cas, ces procédés visent à éliminer à la fois les polymères de très haut poids moléculaire et les monomères ou oligomères de faible poids moléculaire. European Patent Application EP 207,676 teaches that glucose polymers forming clear, colorless, 10% solutions in water having a weight average molecular weight (Mw) of 5,000 to 100,000 daltons and a molecular weight are preferred. number average (Mn) less than 8,000 daltons. Such glucose polymers also preferably comprise at least 80% of glucose polymers having a molecular weight of between 5,000 and 50,000 daltons, little or no glucose or glucose polymers of less than or equal to 3 (molecular weight 504) and little or no glucose polymers of molecular weight greater than 100,000 (DP close to 600). In other words, the preferred glucose polymers are glucose polymers of low polymolecularity index (value obtained by calculating the Mw / Mn ratio). The methods proposed in this patent application EP 207.676 for obtaining these glucose polymers of low polymolecularity index from starch hydrolysates consist of: either to carry out a fractional precipitation of a maltodextrin using a solvent miscible with water, or to perform a molecular filtration of the same maltodextrin through different membranes having an appropriate cut-off or exclusion threshold. In both cases, these processes aim at removing both very high molecular weight polymers and low molecular weight monomers or oligomers.

Ces procédés ne donnent toutefois pas satisfaction tant du point de vue de leur mise en oeuvre que du point de vue des rendements et de la qualité des produits qu'ils permettent d'obtenir. Soucieuse de mettre au point un procédé de fabrication d'un polymère de glucose complètement soluble dans l'eau et de faible indice de polymolécularité préférentiellement inférieur à 2,5, ayant de préférence un Mn inférieur à 8.000 daltons et possédant un Mw compris entre 12.000 et 20.000 daltons, procédé qui soit dépourvu des inconvénients de l'art antérieur, la société Demanderesse, s'est attachée à résoudre ce problème dans son brevet EP 667.356, en partant d'un amidon hydrolysé, plutôt que d'une maltodextrine. These methods, however, are unsatisfactory both from the point of view of their implementation and from the point of view of the yields and the quality of the products which they make it possible to obtain. Desirous of developing a process for producing a glucose polymer which is completely soluble in water and has a low polymolecularity index preferably less than 2.5, preferably having a Mn of less than 8,000 daltons and having a Mw of between 12,000. and 20,000 daltons, a process which is devoid of the drawbacks of the prior art, the applicant company has endeavored to solve this problem in its patent EP 667,356, starting from a hydrolysed starch, rather than a maltodextrin.

Le polymère de glucose obtenu par fractionnement chromatographique contient alors de préférence moins de 3 % de glucose et de polymères de glucose de DP inférieur ou égal à 3 et moins de 0,5 % de polymères de glucose de DP supérieur à 600. II est finalement désormais admis par les experts du domaine de la dialyse péritonéale que ces polymères de glucose, utilisés pour leur pouvoir osmotique, donnent toute satisfaction. II est cependant à déplorer des risques de contamination microbienne de ces préparations destinées à la dialyse péritonéale. II est en effet connu que les circuits de production des polymères de glucose peuvent être contaminés par des microorganismes, ou par des substances pro-inflammatoires contenus dans lesdits microorganismes. II est par exemple décrit en amidonnerie la contamination des amidons de maïs ou de blé par des microorganismes de type levures, moisissures et bactéries, et plus particulièrement par des bactéries acidothermophiles de type Alicyclobacillus acidocaldarius (bactéries extrémophiles qui se développent dans les zones chaudes et acides du circuit). The glucose polymer obtained by chromatographic fractionation then preferably contains less than 3% of glucose and glucose polymers of DP less than or equal to 3 and less than 0.5% of glucose polymers of DP greater than 600. It is finally now admitted by the experts in the field of peritoneal dialysis that these glucose polymers, used for their osmotic power, give full satisfaction. However, there is a risk of microbial contamination of these preparations for peritoneal dialysis. It is known that the circuits for producing glucose polymers can be contaminated by microorganisms, or by pro-inflammatory substances contained in said microorganisms. It is for example described in starch manufacture the contamination of corn or wheat starches by microorganisms of the yeast, mold and bacteria type, and more particularly by acidophilophilic bacteria of the Alicyclobacillus acidocaldarius type (extremophilic bacteria which develop in hot and acidic zones). of the circuit).

Le risque majeur pour le patient qui reçoit ces produits contaminés est alors la péritonite. Le soupçon clinique de la péritonite est diagnostiqué lors du développement d'un trouble dans le dialysat associé avec les manifestations cliniques variables que sont la douleur abdominale, la nausée, le vomissement, la diarrhée et la fièvre. The major risk for the patient receiving these contaminated products is peritonitis. The clinical suspicion of peritonitis is diagnosed during the development of a disorder in the dialysate associated with the variable clinical manifestations of abdominal pain, nausea, vomiting, diarrhea and fever.

Ces épisodes de péritonite sont provoqués par des infections bactériennes intrapéritonéales, et le diagnostic est habituellement facilement établi par les cultures positives de dialysat. La « péritonite stérile », également décrite en tant que péritonite aseptique, chimique, ou culture-négative, est quant à elle typiquement provoquée par un irritant chimique ou un corps étranger. These episodes of peritonitis are caused by intraperitoneal bacterial infections, and diagnosis is usually easily established by positive dialysate cultures. "Sterile peritonitis", also described as aseptic, chemical, or culture-negative peritonitis, is typically caused by a chemical irritant or foreign body.

Depuis l'introduction de l'icodextrine pour la préparation de solutions de dialyse péritonéale, des cas isolés de péritonite aseptique ont été rapportés, pouvant être liés à des causes diverses et notamment l'induction par des substances pro-inflammatoires potentiellement présentes. Since the introduction of icodextrin for the preparation of peritoneal dialysis solutions, isolated cases of aseptic peritonitis have been reported which may be related to various causes including induction by pro-inflammatory substances potentially present.

Les épisodes inflammatoires aseptiques sont donc des complications majeures observées après injections de solutions de dialyse. Si une partie de ces épisodes inflammatoires est liée à un problème d'ordre chimique (injection accidentelle de contaminants chimiques ou mauvais dosages de certains composés), la majorité des cas est directement associée à la présence de contaminants d'origine microbienne présents dans les solutions servant à la préparation des solutions de dialyse. Les lipopolysaccharides (LPS) et les peptidoglycanes (PGN) sont les principaux contaminants d'origine microbienne présentant un risque élevé de déclencher une inflammation lorsqu'ils sont présents à l'état de trace. Les tests standards préconisés par la Pharmacopée permettent théoriquement d'écarter les lots chargés en contaminants de ce type et présentant donc un risque sanitaire. Toutefois, ces tests ne sont pas satisfaisants, puisque des épisodes inflammatoires aseptiques sont encore reportés, alors que les solutions avaient été déclarées saines. Ainsi, malgré l'attention constante des acteurs du domaine pour diminuer le risque de contaminations, notamment en améliorant sa détection, il reste toujours un besoin d'améliorer les performances de la détection de contaminants pouvant induire une inflammation. Aseptic inflammatory episodes are therefore major complications observed after injections of dialysis solutions. Although some of these inflammatory episodes are related to a chemical problem (accidental injection of chemical contaminants or incorrect dosages of certain compounds), the majority of cases are directly associated with the presence of microbial contaminants present in the solutions. used for the preparation of dialysis solutions. Lipopolysaccharides (LPS) and peptidoglycans (PGN) are the main microbial contaminants with a high risk of initiating inflammation when present in trace amounts. The standard tests recommended by the Pharmacopoeia theoretically make it possible to discard batches loaded with contaminants of this type and thus presenting a health risk. However, these tests are not satisfactory, since aseptic inflammatory episodes are still reported, while the solutions were declared healthy. Thus, despite the constant attention of stakeholders in the field to reduce the risk of contaminations, including improving its detection, there is still a need to improve the performance of the detection of contaminants that can induce inflammation.

Description détaillée de l'invention II est du mérite de la société Demanderesse d'avoir pris en compte la présence de molécules susceptibles d'exacerber la réponse inflammatoire induite par d'autres contaminants, en particulier le LPS ou les PGN, notamment par un mécanisme de coopération entre les TLRs et les récepteurs NOD. En effet, la seule considération de l'effet des contaminants isolés sur l'inflammation est réductrice. Contrairement au LPS qui est un ligand reconnu par les récepteurs de type TLR4 (acronyme anglo-saxon de Toi/ Like Receptor) des lymphocytes, le PGN (mais également de nombreux glycolipides et lipopeptides) est un ligand reconnu par les récepteurs de type TLR2 qui induit une réponse inflammatoire faible dans les modèles in vitro et in vivo, ce qui implique que ces molécules doivent être présentes à des concentrations plus importantes pour être détectées. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION It is the merit of the applicant company to have taken into account the presence of molecules capable of exacerbating the inflammatory response induced by other contaminants, in particular LPS or PGNs, in particular by a mechanism cooperation between TLRs and NOD receivers. Indeed, the sole consideration of the effect of isolated contaminants on inflammation is reductive. In contrast to LPS, which is a ligand recognized by TLR4-type receptors of lymphocytes, PGN (but also many glycolipids and lipopeptides) is a ligand recognized by TLR2 receptors. induces a weak inflammatory response in the in vitro and in vivo models, implying that these molecules must be present at higher concentrations to be detected.

Ainsi, dans des modèles utilisant des cellules mononucléaires (PBMC, monocytes/macrophages primaires ou lignées monocytaires), le LPS induit une réponse significative pour des concentrations de l'ordre du ng/mL, alors que des concentrations 100 fois plus élevées en PGN sont nécessaires pour obtenir une réponse similaire (ratio p/p). Thus, in models using mononuclear cells (PBMC, primary monocytes / macrophages or monocyte lines), LPS induces a significant response for concentrations of the order of ng / mL, whereas concentrations 100 times higher in PGN are necessary to obtain a similar answer (ratio p / p).

En outre, alors que les PGN solubles (MM 125 kDa) induisent une réponse inflammatoire via l'activation de TLR2, les dérivés de petite taille, unités monomériques et muramyl-dipeptide (MDP), interagissent avec des récepteurs intracellulaires de type NOD. Ces dérivés, considérés isolément, sont peu inflammatoires in vitro et donnent une réponse significative pour des valeurs» 1 µg/mL. In addition, while soluble PGNs (MM 125 kDa) induce an inflammatory response via TLR2 activation, the small derivatives, monomeric units and muramyl dipeptide (MDP), interact with intracellular NOD receptors. These derivatives, considered in isolation, are not very inflammatory in vitro and give a significant response for values of 1 μg / mL.

Par contre, la présence de ces molécules a un effet synergique sur la réponse inflammatoire, par un mécanisme de coopération entre les TLRs et les récepteurs NOD, et ce quelque soit le modèle expérimental utilisé (souris, lignées de monocytes/macrophages, cellules mononucléaires du sang). En plus du MDP et des molécules apparentées, les peptides microbiens de type f-MLP (tripeptide formyl-Met-Leu-Phe) ont également une activité synergique importante. A l'origine, ces peptides ont été identifiés pour leur activité chimio-attractante sur les leucocytes, alors qu'ils sont incapables d'induire une réponse cytokinique perse. Cependant, lorsqu'ils sont associés à des agonistes des TLRs, ils contribuent à augmenter la production de cytokines en sensibilisant les cellules cibles. On the other hand, the presence of these molecules has a synergistic effect on the inflammatory response, by a cooperation mechanism between the TLRs and the NOD receptors, whatever the experimental model used (mice, monocyte / macrophage lines, mononuclear cells of the blood). In addition to MDP and related molecules, f-MLP (tripeptide formyl-Met-Leu-Phe) microbial peptides also have significant synergistic activity. Originally, these peptides were identified for their chemo-attracting activity on leukocytes, while they are unable to induce a Persian cytokine response. However, when combined with TLR agonists, they help increase cytokine production by sensitizing target cells.

II est donc important de ne pas négliger ces "petites molécules", car elles peuvent rendre compte indirectement des épisodes inflammatoires aseptiques en exacerbant les effets de traces de PGN et/ou de LPS. Ces dernières années, de nombreux tests utilisant des cellules primaires se sont développés pour remplacer les modèles animaux dans les tests de réponse inflammatoire. It is therefore important not to neglect these "small molecules" because they can account indirectly for aseptic inflammatory episodes by exacerbating the effects of traces of PGN and / or LPS. In recent years, many tests using primary cells have developed to replace animal models in inflammatory response tests.

Toutefois, ces modèles in vitro sont sujets à une importante variabilité inter- individuelle, ce qui peut être responsable de biais expérimentaux. A l'inverse, les lignées cellulaires monocytaires donnent des réponses constantes, ce qui explique pourquoi les tests actuellement en développement utilisent de plus en plus ce type de cellules en culture. However, these in vitro models are subject to significant inter-individual variability, which may be responsible for experimental biases. Conversely, monocyte cell lines give consistent responses, which is why tests currently under development are increasingly using this type of cells in culture.

II est également important de noter que la réponse inflammatoire exacerbée est visible pour les cytokines de la phase aiguë de l'inflammation, telles que TNP-Cc, l'IL-113 et les chimiokines telles que CCLS/RANTES, mais pas ou peu pour l'IL-6. Ainsi, les méthodes basées sur la production de cette dernière ne sont adaptées pour détecter des contaminants en mélange dans une solution. It is also important to note that the exacerbated inflammatory response is visible for cytokines of the acute phase of inflammation, such as TNP-Cc, IL-113 and chemokines such as CCLS / RANTES, but not or little for IL-6. Thus, methods based on the production of the latter are not suitable for detecting mixed contaminants in a solution.

Ainsi, la société Demanderesse a abouti aux conclusions suivantes: (i) il est difficile de détecter des contaminants bactériens présents à l'état de traces dans des solutions biologiques, (ii) il est important de ne pas se limiter à la détection des PGN et du LPS, en raison des effets synergiques, et (iii) il est nécessaire de développer de nouvelles méthodes de détection sensibles et reproductibles. II est donc du mérite de la société Demanderesse d'avoir développé des méthodes sensibles et efficaces de détection des contaminants microbiens ayant une action pro- inflammatoire, en deçà du seuil de sensibilité des procédures actuellement utilisées et/ou décrites dans la littérature, et ultérieurement d'identifier la famille, voire la nature, des molécules pro-inflammatoires présentes sous formes de traces dans les lots provenant des circuits de production. En effet, une méthode très sensible de mesure des réponses inflammatoires in vitro permettra de retenir ou non des lots sur la base de taux de contamination "non significatifs", au sens où ces taux seront inférieurs aux niveaux actuellement mesurables par les tests de la Pharmacopée. Ces lots pourront être proposés pour entrer dans la composition de solutions à usage thérapeutique chez l'Homme (e.g. solutions de dialyse péritonéale). Thus, the Applicant Company has reached the following conclusions: (i) it is difficult to detect trace bacterial contaminants in biological solutions, (ii) it is important to not be limited to the detection of PGNs and LPS, because of the synergistic effects, and (iii) it is necessary to develop new sensitive and reproducible detection methods. It is therefore the merit of the applicant company to have developed sensitive and effective methods for detecting microbial contaminants having a pro-inflammatory action, below the sensitivity threshold of the procedures currently used and / or described in the literature, and subsequently to identify the family, or even the nature, of the pro-inflammatory molecules present in trace forms in the batches coming from the production circuits. Indeed, a very sensitive method of measuring inflammatory responses in vitro will allow to retain or not batches on the basis of contamination rates "insignificant", in the sense that these rates will be lower than levels currently measurable by the tests of the Pharmacopoeia . These batches may be proposed to enter the composition of solutions for therapeutic use in humans (e.g. peritoneal dialysis solutions).

De plus, l'identification des molécules responsables des réponses inflammatoires devra permettre de détecter les sources de contaminations au cours des procédés de fabrication, et d'apporter des modifications correctrices pour diminuer les niveaux de contaminants, voire les éliminer. In addition, the identification of the molecules responsible for inflammatory responses should make it possible to detect the sources of contamination during the manufacturing processes, and to make corrective changes to reduce contaminant levels, or even eliminate them.

Le procédé conforme à l'invention porte donc sur un procédé de détection des contaminants pro-inflammatoires des polymères de glucose, en particulier ceux destinés à la préparation de solution pour dialyse péritonéale, comprenant un test de réponse inflammatoire in vitro. Les polymères de glucose peuvent être destinés à la dialyse péritonéale, la nutrition entérale et parentérale et l'alimentation des nouveaux nés. Comme mentionné précédemment, certaines molécules d'origine bactérienne, tels que le MDP et le f-MLP, sont de faibles inducteurs inflammatoires, mais ils peuvent agir en combinaison ou en synergie et augmenter la réponse induite par d'autres contaminants. Cette propriété repose sur le fait que ces molécules agissent via l'entremise de récepteurs autres que les TLRs. The method according to the invention therefore relates to a method for detecting pro-inflammatory contaminants of glucose polymers, in particular those intended for the preparation of solution for peritoneal dialysis, comprising an in vitro inflammatory response test. Glucose polymers can be used for peritoneal dialysis, enteral and parenteral nutrition and infant feeding. As mentioned earlier, certain molecules of bacterial origin, such as MDP and f-MLP, are low inflammatory inducers, but they can act in combination or in synergy and increase the response induced by other contaminants. This property is based on the fact that these molecules act via receptors other than TLRs.

Hormis le LPS qui réagit avec TLR4, la majorité des molécules à potentiel inflammatoire susceptibles d'être présents dans les lots sont des agonistes de TLR2. Ces contaminants sont difficilement détectables, car ils sont présents en faibles concentrations et la réponse inflammatoire qu'ils vont déclencher est le plus souvent proche du bruit de fond. Par conséquent, la présence de molécules à activité synergique peut exacerber la réponse inflammatoire induite par les ligands des TLR2, ce qui peut être mis à profit pour détecter de faibles doses de contaminants. Des échantillons contaminés en MDP (agoniste de NOD2), f-MLP (ligand d'un récepteur à peptide microbien), voire en LPS (pour déclencher une synergie TLR4/TLR2) vont de ce fait déclencher une réponse inflammatoire in vitro. Ainsi, les contaminants pro-inflammatoires détectés par le procédé de l'invention sont susceptibles de déclencher, séparément ou en combinaison, une réaction inflammatoire. De manière particulière, ces contaminants peuvent être, lorsqu'ils sont considérés séparément, de faibles inducteurs inflammatoires mais induire une réaction inflammatoire importante lorsqu'ils sont en combinaison. Le procédé selon l'invention permet de considérer l'effet de l'ensemble des contaminants présents dans la préparation de polymères de glucose considérée et pas uniquement l'effet particulier de chacun d'eux. Le procédé selon l'invention comprend au moins un test de réponse inflammatoire in vitro à l'aide d'une lignée cellulaire permettant de détecter au moins un facteur de la réponse inflammatoire. Selon un premier mode de réalisation, la lignée cellulaire utilisée dans le test de réponse inflammatoire est un macrophage ou une lignée cellulaire différenciée en macrophage. De manière particulier, la lignée cellulaire est productrice de TNF-a, de la chimiokine CCL5/RANTES et/ou de CXCL8/IL-8. De préférence, le test est réalisé avec des cellules THP-1 différenciées en macrophages. Le test de réponse inflammatoire in vitro peut être basé sur la production de TNF-OE, de la chimiokine CCL5/RANTES et/ou de CXCL8/IL-8 dans les cellules THP-1 différenciées en macrophages, étant donné que l'effet synergique (effet obtenu par la combinaison des différents contaminants) est surtout marqué pour les cytokines de la phase aiguë de l'inflammation (TNP-Cc, IL-113, chimiokines telles que CCL5/RANTES), mais pas pour des cytokines de la phase retardée, telles que l'IL-6. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le test de réponse inflammatoire consiste à mettre les cellules de la lignée cellulaire, de préférence des macrophages, en présence d'une préparation de polymères de glucose susceptibles de contenir des contaminants pro-inflammatoires et à mesurer la production de cytokines de la phase aigue de l'inflammation, notamment TNF-a, IL-113, IL-8 et/ou des chimiokines, notamment la CCL5/RANTES, la production de ces cytokines indiquant que la préparation contient des contaminants susceptibles de déclencher une réaction inflammatoire. Dans un mode de réalisation tout particulièrement préféré, le test comprend la mesure de la production de TNF-a et/ou de CCL5/RANTES, de préférence de CCL5/RANTES. Afin d'augmenter la réponse cellulaire induite par des contaminants pro-inflammatoires, par exemple des LPS et/ou des PGN, un composant permettant d'agir en synergie avec les contaminants peut être ajouté l'échantillon à tester. En effet, cela peut permettre de détecter de plus faible doses de contaminants. De préférence, ce composant peut être le MDP et des molécules apparentées, des peptides microbiens de type f-MLP et/ou le LPS. De manière encore plus préféré, ce composant est le MDP et/ou le LPS. Dans un mode de réalisation préféré, le MDP est ajouté à l'échantillon à une concentration de plus de 1 pg/mL, de préférence d'au moins 2, 5, 7,5 ou 10 pg/mL, par exemple à une concentration comprise entre 10 et 100 pg/mL. Dans un mode de réalisation tout particulièrement préféré, le MDP est ajouté à l'échantillon à une concentration de 10 pg/mL. Dans un autre mode de réalisation préféré, le f-MLP est ajouté à l'échantillon à une concentration de plus de 10 nM, de préférence d'au moins 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nM. Dans encore un autre mode de réalisation préféré, le LPS peut être ajouté à l'échantillon à une concentration d'au moins 10 pg/ml, par exemple à une concentration de 25 pg/mL. Dans un mode de réalisation préféré, la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de glucose de 5 à 50 mg/mL, de préférence entre 5 et 10, 20, 30 ou 40 mg/mL. Dans un mode de réalisation particulier, la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de glucose d'environ 5 mg/mL. Apart from LPS that reacts with TLR4, the majority of molecules with inflammatory potential that may be present in the batches are TLR2 agonists. These contaminants are difficult to detect because they are present in low concentrations and the inflammatory response they will trigger is usually close to the background. Therefore, the presence of synergistic molecules may exacerbate the TLR2 ligand-induced inflammatory response, which can be used to detect low doses of contaminants. Samples contaminated with MDP (NOD2 agonist), f-MLP (ligand of a microbial peptide receptor), or even with LPS (to trigger TLR4 / TLR2 synergy) will thus trigger an inflammatory response in vitro. Thus, the pro-inflammatory contaminants detected by the process of the invention are capable of triggering, separately or in combination, an inflammatory reaction. In particular, these contaminants can be, when considered separately, low inflammatory inducers but induce a significant inflammatory reaction when in combination. The process according to the invention makes it possible to consider the effect of all the contaminants present in the preparation of glucose polymers considered and not only the particular effect of each of them. The method according to the invention comprises at least one inflammatory response test in vitro using a cell line for detecting at least one factor of the inflammatory response. According to a first embodiment, the cell line used in the inflammatory response test is a macrophage or a macrophage-differentiated cell line. In particular, the cell line produces TNF-α, chemokine CCL5 / RANTES and / or CXCL8 / IL-8. Preferably, the test is performed with THP-1 cells differentiated into macrophages. The in vitro inflammatory response test may be based on the production of TNF-OE, the CCL5 / RANTES chemokine and / or CXCL8 / IL-8 in THP-1 cells differentiated into macrophages, since the synergistic effect (effect obtained by the combination of the different contaminants) is especially marked for the cytokines of the acute phase of inflammation (TNP-Cc, IL-113, chemokines such as CCL5 / RANTES), but not for cytokines of the delayed phase , such as IL-6. Thus, according to a particular embodiment, the inflammatory response test consists of putting the cells of the cell line, preferably macrophages, in the presence of a glucose polymer preparation which may contain pro-inflammatory contaminants and to be measured. the production of cytokines in the acute phase of inflammation, including TNF-α, IL-113, IL-8 and / or chemokines, including CCL5 / RANTES, the production of these cytokines indicating that the preparation contains contaminants likely to to trigger an inflammatory reaction. In a most preferred embodiment, the assay comprises measuring the production of TNF-α and / or CCL5 / RANTES, preferably CCL5 / RANTES. In order to increase the cellular response induced by pro-inflammatory contaminants, for example LPS and / or PGNs, a component allowing to act in synergy with the contaminants can be added the sample to be tested. Indeed, it can detect lower doses of contaminants. Preferably, this component may be MDP and related molecules, f-MLP microbial peptides and / or LPS. Even more preferably, this component is the MDP and / or the LPS. In a preferred embodiment, the MDP is added to the sample at a concentration of greater than 1 μg / mL, preferably at least 2.5, 7.5 or 10 μg / mL, for example at a concentration of between 10 and 100 μg / mL. In a most preferred embodiment, the MDP is added to the sample at a concentration of 10 μg / mL. In another preferred embodiment, the f-MLP is added to the sample at a concentration of greater than 10 nM, preferably at least 50, 100, 150, 200, 300, 400 or 500 nM. In yet another preferred embodiment, the LPS may be added to the sample at a concentration of at least 10 μg / ml, for example at a concentration of 25 μg / ml. In a preferred embodiment, the tested glucose polymer preparation has a glucose polymer concentration of 5 to 50 mg / mL, preferably between 5 and 10, 20, 30 or 40 mg / mL. In a particular embodiment, the tested glucose polymer preparation has a glucose polymer concentration of about 5 mg / mL.

Selon un second mode de réalisation, la lignée cellulaire utilisée pour réaliser le test d'inflammation in vitro, est une lignée permettant de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée. De manière particulière, cette lignée cellulaire peut être obtenue par transfection stable avec un ou plusieurs vecteurs codant pour un ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée. L'activité d'un récepteur de l'immunité innée peut être détectée, par exemple, en utilisant un gène rapporteur qui est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée audit récepteur. De manière préférée, ce gène rapporteur code pour une protéine colorée ou fluorescente ou pour une protéine dont l'activité peut être mesurée avec ou sans substrat. De manière particulière, le gène rapporteur code pour une phosphatase alcaline. De manière préférée, la lignée cellulaire permet de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs TLR ou NOD, tels que le récepteur TLR2, 3, 4, 5, 7, 8 ou 9 ou NOD2. De préférence, la lignée cellulaire permet de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs choisis parmi TLR2, TLR4 et NOD2. Les lignées cellulaires utilisées peuvent être par exemple des lignées HEK-BIueTM (commercialisée par la société InvivoGen), modifiées par transfection stable avec des vecteurs codant pour des récepteurs de l'immunité innée. Ces cellules peuvent être également co-transfectées avec un gène rapporteur produisant, par exemple, une forme sécrétée de la phosphatase alcaline (acronyme anglo-saxon SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase), dont la synthèse est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au(x) récepteur(s) exprimé(s) dans la même lignée cellulaire. Les lignées cellulaires peuvent, par exemple, être choisies dans le groupe constitué de la lignée HEK-BIueTM hTLR2 (lignée qui répond spécifiquement aux agonistes du TLR2), la lignée HEK-BIueTM hNOD2 (lignée qui répond efficacement au MDP et molécules apparentées) et la lignée Raw-BIueTM (lignée de macrophages de souris transfectée pour exprimer une phosphatase alcaline). Ces lignées sont détaillées plus avant dans cette description. L'utilisation de telles lignées permet donc de remplacer les dosages des cytokines par un test enzymatique (activité phosphatase), et de cibler certaines familles de molécules d'origine bactérienne en fonction du(es) récepteur(s) exprimé(s) par la lignée. En outre, ces lignées permettent de détecter des contaminants à des seuils très bas, notamment pour les agonistes de TLR2 (PGN, LTA, LM, ...) et NOD2 (MDP et molécules apparentées). Selon ce second mode de réalisation, le test de réponse inflammatoire in vitro consiste à mettre les cellules de la lignée cellulaire permettant de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée, en présence d'une préparation de polymères de glucose susceptibles de contenir des contaminants pro-inflammatoires et à mesurer l'activité du récepteur ou du signal du gène rapporteur qui lui est associé. La détection de cette activité ou de ce signal indique que la préparation contient des contaminants susceptibles d'activer un ou des récepteurs de l'immunité innée et de déclencher une réaction inflammatoire. According to a second embodiment, the cell line used to perform the in vitro inflammation test, is a line for detecting the activity of one or more receptors of innate immunity. In particular, this cell line can be obtained by stable transfection with one or more vectors encoding one or more innate immunity receptors. The activity of a receptor for innate immunity can be detected, for example, by using a reporter gene that is directly dependent on the signaling pathway associated with said receptor. Preferably, this reporter gene codes for a stained or fluorescent protein or for a protein whose activity can be measured with or without a substrate. In particular, the reporter gene codes for alkaline phosphatase. Preferably, the cell line makes it possible to detect the activity of one or more TLR or NOD receptors, such as the TLR2, 3, 4, 5, 7, 8 or 9 or NOD2 receptor. Preferably, the cell line makes it possible to detect the activity of one or more receptors chosen from TLR2, TLR4 and NOD2. The cell lines used can be, for example, HEK-BIue ™ lines (sold by the company InvivoGen), modified by stable transfection with vectors encoding innate immunity receptors. These cells can also be co-transfected with a reporter gene producing, for example, a secreted form of alkaline phosphatase (SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase), the synthesis of which is directly dependent on the signaling pathway. associated with the receptor (s) expressed in the same cell line. The cell lines may, for example, be selected from the group consisting of the HEK-BIueTM hTLR2 line (a line which specifically responds to TLR2 agonists), the HEK-BIueTM hNOD2 line (a line that effectively responds to CDM and related molecules) and the Raw-BIueTM line (mouse macrophage line transfected to express an alkaline phosphatase). These lines are detailed further in this description. The use of such lines thus makes it possible to replace the cytokine assays by an enzymatic test (phosphatase activity), and to target certain families of molecules of bacterial origin as a function of the receptor (s) expressed by the line. In addition, these lines make it possible to detect contaminants at very low thresholds, in particular for the agonists of TLR2 (PGN, LTA, LM, etc.) and NOD2 (MDP and related molecules). According to this second embodiment, the in vitro inflammatory response test consists in putting the cells of the cell line making it possible to detect the activity of one or more innate immunity receptors, in the presence of a polymer preparation. glucose may contain pro-inflammatory contaminants and to measure the activity of the receptor or signal reporter gene associated with it. Detection of this activity or signal indicates that the preparation contains contaminants that may activate innate immunity receptor (s) and trigger an inflammatory response.

Dans un mode de réalisation préféré, la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de glucose de 5 à 50 mg/mL, de préférence entre 5 et 10, 20, 30 ou 40 mg/mL. Dans un mode de réalisation particulier, la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de glucose d'environ 5 mg/mL. In a preferred embodiment, the tested glucose polymer preparation has a glucose polymer concentration of 5 to 50 mg / mL, preferably between 5 and 10, 20, 30 or 40 mg / mL. In a particular embodiment, the tested glucose polymer preparation has a glucose polymer concentration of about 5 mg / mL.

Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape consistant à identifier le(s) contaminant(s) susceptible(s) de déclencher une réaction inflammatoire. Pour cela, une lignée cellulaire permettant de détecter l'activité d'un récepteur ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée telle que décrite ci-dessus, est mise en présence de la préparation de polymères de glucose à tester. L'activité du récepteur ou le signal du gène rapporteur associé à ce récepteur est mesuré. La détection de cette activité ou de ce signal indique la présence dans la préparation d'un contaminant qui est un agoniste du récepteur. The method according to the invention may further comprise a step of identifying the contaminant (s) likely to trigger an inflammatory reaction. For this, a cell line for detecting the activity of a receptor or several innate immunity receptors as described above is brought into contact with the glucose polymer preparation to be tested. The receptor activity or the reporter gene signal associated with this receptor is measured. Detection of this activity or signal indicates the presence in the preparation of a contaminant which is a receptor agonist.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend les étapes consistant à (a) réaliser au moins un test de réponse inflammatoire in vitro consistant à mettre les cellules d'une lignée cellulaire, de préférence des macrophages, en présence d'une préparation de polymères de glucose susceptibles de contenir des contaminants pro- inflammatoires et à mesurer la production de cytokines de la phase aigue de l'inflammation, notamment TNF-a, IL-1(3, IL-8 et/ou des chimiokines telles que CCLS/RANTES, la production de ces cytokines indiquant que la préparation contient des contaminants susceptibles de déclencher une réaction inflammatoire, et (b) dans le cas où la préparation contient de contaminants, mettre en présence une lignée cellulaire permettant de détecter l'activité d'un récepteur ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée telle que décrite ci-dessus, avec la préparation et détecter l'activité du récepteur ou le signal du gène rapporteur associé à ce récepteur, la détection de cette activité ou de ce signal indiquant la présence dans la préparation d'un contaminant qui est un agoniste du récepteur. According to a preferred embodiment, the method according to the invention comprises the steps of (a) carrying out at least one in vitro inflammatory response test of putting the cells of a cell line, preferably macrophages, in the presence of a preparation of glucose polymers which may contain pro-inflammatory contaminants and measure the production of cytokines in the acute phase of inflammation, including TNF-α, IL-1 (3, IL-8 and / or chemokines such as CCLS / RANTES, the production of these cytokines indicating that the preparation contains contaminants likely to trigger an inflammatory reaction, and (b) in the case where the preparation contains contaminants, bringing into the presence of a cell line for detecting the activity of a receptor or more innate immunity receptors as described above, with the preparation and detecting the activity of the receptor or the signal of the reporter associated with this receptor, the detection of this activity or signal indicating the presence in the preparation of a contaminant which is a receptor agonist.

Ce procédé permet donc non seulement détecter la présence de contaminants pro-inflammatoires dans une préparation de polymères de glucose, mais également d'obtenir des informations sur la nature de ces contaminants. II est notamment possible de définir si ces contaminants sont des agonistes de récepteurs TLR ou NOD tels que TLR2, TLR4 ou NOD2. Selon un mode de réalisation préféré, plusieurs lignées peuvent être utilisées pour apporter des informations complémentaires à celles obtenues, par exemple, avec les tests de réponses cytokiniques dans les cellules THP-1 différenciées : - lignée HEK-BIueTM hTLR2 : cette lignée répond spécifiquement aux agonistes du TLR2. Elle permet notamment le dosage des PGN. This method thus makes it possible not only to detect the presence of pro-inflammatory contaminants in a glucose polymer preparation, but also to obtain information on the nature of these contaminants. It is in particular possible to define whether these contaminants are TLR or NOD receptor agonists such as TLR2, TLR4 or NOD2. According to a preferred embodiment, several lines can be used to provide information complementary to that obtained, for example, with cytokine response tests in differentiated THP-1 cells: - line HEK-BIueTM hTLR2: this line specifically responds to TLR2 agonists. It allows in particular the dosage of PGN.

Son utilisation permet donc de connaître la part de ces contaminants dans le déclenchement des réponses inflammatoires. En outre, le traitement des solutions par le lysozyme et/ou la (3-glucanase permet d'éliminer le PGN et/ou les (3-glucanes, et de connaître ainsi l'importance des autres agonistes du TLR2 susceptibles d'être présents dans les lots contaminés (glycolipides et lipopeptides). - lignée HEK-BIueTM hNOD2 : cette lignée répond efficacement au MDP et molécules apparentées (EC50 MDP = 35 ± 5 ng/mL), alors que des taux compris entre 1 et 10 µg/mL sont nécessaires dans les modèles utilisant des lignées monocytaires et des PBMC. L'utilisation de cette lignée permet donc de les détecter à des concentrations faibles. Cette analyse est d'autant plus intéressante que la présence de PGN suppose que ses produits de dégradation soient aussi présents, et qu'ils puissent agir de façon synergique avec les agonistes des TLRs. - lignée HEK-BIueTM NuII2: il s'agit d'une lignée contrôle, dont l'utilisation est nécessaire pour vérifier que les solutions de polymères de glucose n'induisent pas la production de l'enzyme par un mécanisme intrinsèque. - lignée Raw-BIueTM : il s'agit d'une lignée de macrophages de souris transfectée par la SEAP. L'avantage de cette lignée est qu'elle exprime de façon naturelle la quasi-totalité des récepteurs de l'immunité innée. Elle sert de témoin positif dans les tests, puisqu'elle est censée répondre à tout type de contaminants microbiens. L'invention a également pour objet les moyens d'identification des contaminants pro-inflammatoires. Les dosages des LPS et PGN réalisés par tout moyen connu de l'homme du métier, et les tests de "réponses inflammatoires" tels que décrits ci-dessus, par exemple en utilisant les cellules HEK-BIueTM, permettent d'identifier la nature des principaux contaminants (LPS, PGN, (3-glucanes, MDP et molécules apparentées) et d'estimer leur part dans l'induction de la réponse inflammatoire. Its use therefore makes it possible to know the part of these contaminants in triggering inflammatory responses. In addition, the treatment of the solutions with lysozyme and / or β-glucanase makes it possible to eliminate PGN and / or β-glucans, and thus to know the importance of the other TLR2 agonists likely to be present. in contaminated batches (glycolipids and lipopeptides) - HEK-BIueTM hNOD2 line: this line responds effectively to MDP and related molecules (EC50 MDP = 35 ± 5 ng / mL), whereas levels between 1 and 10 μg / mL are necessary in models using monocytic lines and PBMCs, the use of this line makes it possible to detect them at low concentrations.This analysis is all the more interesting because the presence of PGN assumes that its degradation products are also present, and that they can act synergistically with TLR agonists - HEK-BIueTM NuII2 line: this is a control line, the use of which is necessary to verify that glucose polymer solutions 'undue It is not the production of the enzyme by an intrinsic mechanism. Raw-BIueTM line: This is a mouse macrophage line transfected by SEAP. The advantage of this line is that it expresses in a natural way almost all the innate immunity receptors. It serves as a positive control in the tests, since it is supposed to respond to any type of microbial contaminants. The invention also relates to the means for identifying pro-inflammatory contaminants. Assays of LPS and PGN carried out by any means known to those skilled in the art, and tests of "inflammatory responses" as described above, for example using HEK-BIueTM cells, make it possible to identify the nature of the main contaminants (LPS, PGN, (3-glucans, MDP and related molecules) and estimate their share in the induction of inflammatory response.

Les autres contaminants susceptibles d'être présents dans les lots à tester sont essentiellement des glycolipides et lipopeptides agonistes de TLR2 ou des peptides microbiens. - pour les glycolipides et lipopeptides, une procédure de fractionnement basé sur leur caractère amphiphile est réalisée pour les récupérer et les concentrer. Un traitement par un mélange chloroforme/méthanol permet d'extraire ces molécules des solutions de polymères de glucose et de les concentrer après évaporation du chloroforme. Une fois les molécules récupérées, elles sont reprises dans un volume minimum de DMSO (ou tout autre solvant non toxique pour les cellules) puis analysées dans les tests de réponses inflammatoires décrites précédemment. Ainsi, l'utilisation d'une lignée cellulaire permettant de détecter l'activité d'un récepteur tel que TLR2, par exemple la lignée HEK-BIueTM hTLR2, permet de confirmer ou non la présence de traces d'agonistes de TLR2 autres que le PGN dans les lots à analyser. The other contaminants likely to be present in the test batches are essentially glycolipids and lipopeptides TLR2 agonists or microbial peptides. for glycolipids and lipopeptides, a fractionation procedure based on their amphiphilic nature is carried out to recover and concentrate them. Treatment with a chloroform / methanol mixture makes it possible to extract these molecules from glucose polymer solutions and to concentrate them after evaporation of the chloroform. Once the molecules have been recovered, they are taken up in a minimum volume of DMSO (or any other non-toxic solvent for the cells) and then analyzed in the inflammatory response tests described previously. Thus, the use of a cell line making it possible to detect the activity of a receptor such as TLR2, for example the HEK-BIueTM hTLR2 line, makes it possible to confirm or not the presence of traces of TLR2 agonists other than the PGN in the lots to be analyzed.

Les composés peuvent également être testés dans un modèle utilisant des cellules exprimant tous les types de récepteurs telles que les cellules Raw-BIueTM, mais dans ce cas, les solutions de polymères de glucose sont au préalable traitées sur Detoxi-gel, de façon à éliminer les traces de LPS. En fonction des quantités récupérées, une analyse plus fine des contaminants est réalisée. Dans ce cas, le traitement avec le mélange chloroforme/méthanol permet d'extraire les produits qui sont ensuite fractionnées sur résine C18 et/ou de colonne de charbon. Les composés sont alors élués par un gradient eau/acétonitrile. En fonction de la pureté des fractions et de la quantité de matériel, une analyse plus poussée permet de déterminer la nature biochimique de ces composés, voire leur structure. - pour les peptides microbiens, une étape d'ultra-filtration sur filtre 5 kDa permet de les extraire des solutions de polymères de glucose. Si nécessaire, un passage sur colonne de charbon permet de débarrasser le filtrat des composés plus hydrophobes de taille < 5 kDa. The compounds can also be tested in a model using cells expressing all types of receptors such as Raw-BIueTM cells, but in this case, the glucose polymer solutions are previously treated on Detoxi-gel, so as to eliminate traces of LPS. Depending on the quantities recovered, a finer analysis of the contaminants is carried out. In this case, treatment with the chloroform / methanol mixture makes it possible to extract the products which are then fractionated on C18 resin and / or carbon column. The compounds are then eluted with a water / acetonitrile gradient. Depending on the purity of the fractions and the amount of material, further analysis can determine the biochemical nature of these compounds, or even their structure. for the microbial peptides, an ultrafiltration step on a 5 kDa filter makes it possible to extract them from glucose polymer solutions. If necessary, a passage on a carbon column makes it possible to rid the filtrate of more hydrophobic compounds of size <5 kDa.

Les solutions sont ensuite concentrées puis testées pour leurs propriétés biologiques. Ces peptides étant chimio-attractants pour les leucocytes, leur présence peut être détectée dans un test de migration cellulaire in vitro disponible au Laboratoire. II se peut que les polymères de glucose soient contaminés par d'autres molécules connues pour déclencher des réponses inflammatoires, telles que la flagelline, une protéine agoniste de TLR5, et les dérivés d'acides nucléiques et molécules apparentées, agonistes des TLR3, 7, 8 et 9 (les trois premiers sont impliqués dans les réactions à des composés d'origine virale, alors que le TLR9 est activé par des ADN d'origine bactérienne). En ce cas, les lignées cellulaires permettant de détecter l'activité de ces différents TLRs, notamment des lignées HEK-BIueTM, sont disponibles et peuvent être utilisées pour analyser l'impact de ces molécules dans les réponses inflammatoires. De plus, la présence de composés oligonucléotidiques peut être confirmée ou non par des analyses biochimiques. Le procédé de l'invention permet la détection des contaminants de polymères de glucose destinés à la dialyse péritonéale, contaminants susceptibles d'agir en synergie les uns avec les autres pour déclencher une réaction inflammatoire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un test de réponse inflammatoire in vitro à l'aide de lignées cellulaires modifiées. La présente invention fournit également une méthode de quantification des peptidoglycanes dans un échantillon, en particulier de polymères de glucose destinés à la dialyse péritonéale, comprenant l'incubation de l'échantillon avec une lignée cellulaire permettant de détecter l'activité du récepteur TLR2 et la mesure de l'activation de la voie de signalisation associée à TLR2, permettant ainsi de déterminer la quantité de peptidoglycanes contenue dans l'échantillon. Notamment, cette lignée est une lignée modifiée par transfection (de préférence transfection stable) avec un vecteur codant pour le récepteur TLR2. De préférence, cette lignée n'exprime pas d'autres récepteurs de l'immunité innée. En outre, cette lignée peut contenir un gène rapporteur qui est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au récepteur TLR2. De manière préférée, ce gène rapporteur code pour une protéine colorée ou fluorescente ou pour une protéine dont l'activité peut être mesurée avec ou sans substrat. De manière particulière, le gène rapporteur code pour une phosphatase alcaline. Ces cellules peuvent par exemple être co-transfectées avec un gène rapporteur produisant, par exemple, une forme sécrétée de la phosphatase alcaline (acronyme anglo-saxon SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase), dont la synthèse est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au récepteur TLR2. Cette lignée peut par exemple être la lignée HEKBIueTM hTLR2. The solutions are then concentrated and tested for their biological properties. Since these peptides are chemo-attracting to leukocytes, their presence can be detected in an in vitro cell migration assay available in the laboratory. Glucose polymers may be contaminated by other known molecules to trigger inflammatory responses, such as flagellin, a TLR5 agonist protein, and nucleic acid derivatives and related molecules, TLR3 agonists, 7, 8 and 9 (the first three are involved in reactions to compounds of viral origin, whereas TLR9 is activated by DNAs of bacterial origin). In this case, cell lines for detecting the activity of these different TLRs, including HEK-BIueTM lines, are available and can be used to analyze the impact of these molecules in inflammatory responses. In addition, the presence of oligonucleotide compounds can be confirmed or not by biochemical analyzes. The method of the invention enables the detection of glucose polymer contaminants intended for peritoneal dialysis, which contaminants may act in synergy with one another to trigger an inflammatory reaction, characterized in that it comprises at least one test inflammatory response in vitro using modified cell lines. The present invention also provides a method for quantifying peptidoglycans in a sample, particularly glucose polymers for peritoneal dialysis, including incubating the sample with a cell line for detecting TLR2 receptor activity and measuring the activation of the signaling pathway associated with TLR2, thus making it possible to determine the amount of peptidoglycans contained in the sample. In particular, this line is a line modified by transfection (preferably stable transfection) with a vector encoding the TLR2 receptor. Preferably, this line does not express other receptors of innate immunity. In addition, this line may contain a reporter gene which is directly dependent on the signaling pathway associated with the TLR2 receptor. Preferably, this reporter gene codes for a stained or fluorescent protein or for a protein whose activity can be measured with or without a substrate. In particular, the reporter gene codes for alkaline phosphatase. These cells may, for example, be co-transfected with a reporter gene producing, for example, a secreted form of alkaline phosphatase (SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase), the synthesis of which is directly dependent on the control pathway. signaling associated with the receiver TLR2. This line may for example be the HEKBIueTM line hTLR2.

Pour déterminer la quantité de peptidoglycanes contenue dans l'échantillon sur la base de la mesure de l'activation de la voie de signalisation associée à TLR2, une courbe doses-réponses a été préalablement ou simultanément établit avec une gamme étalons comprenant des concentrations croissantes de peptidoglycanes. Préalablement au dosage, l'échantillon à doser peut facultativement avoir été partiellement épuré afin d'éliminer par exemple d'éventuels contaminants gênants. Des glycopeptides et lipopeptides peuvent être éliminés de l'échantillon par extraction chloroformique. Après centrifugation, le dosage sera réalisé sur la phase aqueuse, normalement débarrassée des contaminants à caractère lipophile. Un fractionnement sur micro-concentrateur sur filtre de seuils 30 ou 50 kDa peut être réalisé, le dosage étant ensuite réalisé sur le rétentat. Un traitement préalable à la (3-glucanase peut permettre d'affiner le dosage en éliminant les molécules apparentées. Ce même procédé peut être également mis en oeuvre pour la détection des contaminants de polymères de glucose destinés à la nutrition entérale et parentérale, voire même à la nutrition des nouveaux nés. To determine the amount of peptidoglycans contained in the sample based on the measurement of TLR2-associated signaling pathway activation, a dose-response curve was previously or simultaneously established with a standard range comprising increasing concentrations of peptidoglycan. Prior to the assay, the sample to be assayed may optionally have been partially purified in order, for example, to eliminate any troublesome contaminants. Glycopeptides and lipopeptides can be removed from the sample by chloroform extraction. After centrifugation, the assay will be performed on the aqueous phase, normally free of lipophilic contaminants. A micro-concentrator fractionation on a 30 or 50 kDa threshold filter can be carried out, the assay then being carried out on the retentate. Pre-treatment with β-glucanase can be used to refine the assay by eliminating related molecules.The same process can also be used for the detection of glucose polymer contaminants for enteral and parenteral nutrition, or even to the nutrition of newborns.

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels se veulent illustratifs et non limitatifs. The invention will be better understood with the aid of the examples which follow, which are intended to be illustrative and not limiting.

Brève Description des Figures Figure 1: Production de RANTES en réponse au PGN et au LPS dans des cellules THP-1 sensibilisées. La courbe « Différence » a été obtenue en retranchant la réponse intrinsèque de l'agent de sensibilisation. Figure 2 : Production de TNF-a en réponse au PGN et au LPS dans des cellules THP-1 sensibilisées. La courbe « Différence » a été obtenue en retranchant la réponse intrinsèque de l'agent de sensibilisation. Figure 3 : Effet de l'adition de MDP (10 µg/mL) dans les solutions de polymères (50 mg/mL). Figure 4 : Réponses induites par une solution de PGN avec ou sans filtration (0,22 µm). Figure 5 : Effet de l'addition de MDP dans les solutions de polymères non filtrées (50 mg/mL). Figure 6 : Effet de la concentration en polymère sur la réponse RANTES induite par le PGN. Figure 7 : Mesure de l'activité de la SEAP produites par les cellules HEK-Blue en réponse au PGN. Brief Description of the Figures Figure 1: Production of RANTES in response to PGN and LPS in sensitized THP-1 cells. The "Difference" curve was obtained by subtracting the intrinsic response of the sensitizer. Figure 2: TNF-α production in response to PGN and LPS in sensitized THP-1 cells. The "Difference" curve was obtained by subtracting the intrinsic response of the sensitizer. Figure 3: Effect of the addition of MDP (10 μg / mL) in the polymer solutions (50 mg / mL). Figure 4: Responses induced by a solution of PGN with or without filtration (0.22 microns). Figure 5: Effect of adding MDP in unfiltered polymer solutions (50 mg / mL). Figure 6: Effect of polymer concentration on PGN-induced RANTES response. Figure 7: Measurement of SEAP activity produced by HEK-Blue cells in response to PGN.

Figure 8 : Production de SEAP par les cellules HEK-TLR2 en réponse aux polymères de glucose. Figure 9 : Effet de la filtration sur la réponse des cellules HEK-TLR2 au PGN. Figure 10 : Production de SEAP par les cellules HEK-TLR2 en réponse aux polymères de glucose non filtrés. Les valeurs de PGN indiquées ont été calculées à partir de la courbe présentée en Figure 7. Figure 8: SEAP production by HEK-TLR2 cells in response to glucose polymers. Figure 9: Effect of filtration on the response of HEK-TLR2 cells to PGN. Figure 10: SEAP production by HEK-TLR2 cells in response to unfiltered glucose polymers. The indicated PGN values were calculated from the curve presented in Figure 7.

Exemple 1 : Préparation des polymères de glucose destinés à la dialyse péritonéale La matière première pour l'obtention des polymères de glucose selon l'invention est produite à partir d'amidon de maïs waxy de la manière suivante : - nettoyage du maïs de manière à garder exclusivement les grains de maïs entier, - trempe du maïs ainsi nettoyé en présence d'acide lactique de manière à assouplir les grains, - broyage humide, puis séparation des différents constituants, i.e. germe, enveloppe cellulosique, protéines et amidon, - nettoyage de l'amidon à contre courant avec de l'eau sanitisée de manière à purifier l'amidon aussi bien physico-chimiquement que bactériologiquement, - centrifugation et séchage de l'amidon, - mise en suspension de l'amidon dans une eau sanitisée à une matière sèche finale de 40 % et à une Température de 45°C à 50°C, - acidification de la suspension d'amidon par addition d'HCI à un pH < 2, et accroissement de la température jusqu'à 115 à 120°C pendant 6 à 8 minutes, - floculation des protéines et des matières grasses à ce pH, - neutralisation de la suspension à pH 5, - filtration de la suspension sur terre de diatomées (de manière à retenir les protéines, les matières grasses et la cellulose résiduelles), - déminéralisation sur résine cationique forte et résine anionique faible, - traitement au charbon actif à une Tp de 70-80°C et à un pH de 4 à 4,5; ce qui élimine les impuretés colorées et réduit le niveau d'impuretés microbiologiques. Le charbon actif poudre étant ajouté à une concentration comprise entre 0,2 et 0,5% sur sec est retenu sur un filtre céramique de 10 µm chargé auparavant avec un agent filtrant, - concentration par passage sur évaporateur à film tombant, - atomisation de la solution concentrée dans un atomiseur de type MSD commercialisée par la société NIRO. Cet hydrolysat d'amidon est conforme à la monographie de la pharmacopée européenne (réf Maltodextrines : 1542). o pH : 4,0 - 7,0 pour une solution à solution 10 %, o I. d. : conforme, o Perte à la dessiccation : 6 % max o DE:<20 o Cendres sulfuriques : 0,5 % max o S02 : 20 ppm max o Métaux lourds : < 10 ppm o E. coli : absent / g o Salmonelles : absent / 10 g o Germes viables totaux : 100 CFU/g max (EP 1000 CFU/g) o Moisissures : 100 CFU/g max En complément, sont analysés les lots produits sur les valeurs de : - contamination en levures + moisissures : 150 CFU/10 g max, soit 15 / g max - germes aérobies : 500 CFU/10 g max, soit 50/g max - endotoxines (test LAL gel clot en point final) : 20 EU/g max - peptidoglycanes : 2700 ng/g max Les conditions d'obtention des polymères de glucose conformes à l'invention à partir de l'hydrolysat d'amidon ainsi obtenu sont les suivantes : 1) Préparation de l'eau / Qualité de l'eau - purification de l'eau par filtration sur 3 µm ; traitement sur charbon actif, déminéralisation sur résines échangeuses de cations et d'anions, et filtration à nouveau (UA), - deux réservoirs utilisés : o 10 m3 pour la dissolution de l'hydrolysat d'amidon, les étapes de rinçage et nettoyage de l'atomiseur, o 60 m3 pour le procédé principal (nettoyage des réservoirs, ses suspensions de charbon actif et de la chromatographie 3) Chromatographie - solubilisation de l'hydrolysat d'amidon avec de l'eau purifiée de manière à obtenir une MS de 35 - 45 % à une température comprise entre 60 - 85°C, - filtration stérilisante de l'hydrolysat d'amidon par passage sur 0,45 µm puis 0,22 µm, réalisée à un P < 3 bars, - séparation chromatographique par exclusion stérique (SEC) réalisée à l'aide d'un système continu composé de 6 séries de double plateaux de 1 m3 de résine chacun. La résine mise en oeuvre est une PCR145K commercialisée par la société Purolite. Example 1 Preparation of glucose polymers for peritoneal dialysis The raw material for obtaining the glucose polymers according to the invention is produced from waxy corn starch in the following manner: keep the whole maize kernels exclusively, - soaking of the maize thus cleaned in the presence of lactic acid so as to soften the grains, - wet grinding, then separation of the different constituents, ie germ, cellulosic envelope, protein and starch, - cleaning of counter-current starch with sanitized water so as to purify the starch both physico-chemically and bacteriologically, centrifugation and drying of the starch, suspension of the starch in a sanitized water at a rate of final dry matter of 40% and at a temperature of 45 ° C to 50 ° C, - acidification of the starch suspension by addition of HCl at a pH <2, and increase of the temperature up to 115 to 120 ° C for 6 to 8 minutes, - flocculation of proteins and fats at this pH, - neutralization of the suspension at pH 5, - filtration of the suspension on diatomaceous earth (so as to retain the protein, fat and residual cellulose), - demineralization on strong cationic resin and weak anionic resin, - activated carbon treatment at a Tp of 70-80 ° C and a pH of 4 to 4.5; which eliminates colored impurities and reduces the level of microbiological impurities. The active charcoal powder being added at a concentration between 0.2 and 0.5% on a dry basis is retained on a 10 μm ceramic filter previously loaded with a filtering agent, - concentration by passing on a falling film evaporator, - atomization of the concentrated solution in an MSD type atomizer marketed by the company NIRO. This starch hydrolyzate is in accordance with the monograph of the European Pharmacopoeia (ref. Maltodextrins: 1542). o pH: 4.0 - 7.0 for a 10% solution solution, o I. d. : compliant, o Loss on drying: 6% max o DE: <20 o Sulfuric ash: 0.5% max o S02: 20 ppm max o Heavy metals: <10 ppm o E. coli: absent / go Salmonella: absent / 10 go Total viable germs: 100 CFU / g max (EP 1000 CFU / g) o Mold: 100 CFU / g max In addition, the batches produced are analyzed on the following values: - yeast + mold contamination: 150 CFU / 10 g max, ie 15 / g max - aerobic germs: 500 CFU / 10 g max, ie 50 / g max - endotoxins (final gel LAL gel test): 20 EU / g max - peptidoglycans: 2700 ng / g max The conditions for obtaining the glucose polymers according to the invention from the starch hydrolyzate thus obtained are as follows: 1) Preparation of the water / Quality of the water - purification of the water by filtration on 3 μm; activated carbon treatment, demineralization on cation and anion exchange resins, and re-filtration (UA), - two tanks used: o 10 m3 for the dissolution of the starch hydrolyzate, the rinsing and cleaning steps the atomizer, o 60 m3 for the main process (tank cleaning, its suspensions of activated charcoal and chromatography 3) chromatography - solubilization of the starch hydrolyzate with purified water to obtain an MS of 35 - 45% at a temperature between 60 - 85 ° C, - sterilizing filtration of the starch hydrolyzate by passage over 0.45 μm then 0.22 μm, carried out at a P <3 bar, - chromatographic separation by steric exclusion (SEC) carried out using a continuous system consisting of 6 series of double trays of 1 m3 of resin each. The resin used is a PCR145K sold by the company Purolite.

La solution qui traverse cette résine présente une température comprise entre 75 et 85°C à 35-45 % de MS. La durée de chaque séquence définit le procédé. Dans le cas présent, la durée de chaque séquence est de 15 minutes. The solution that passes through this resin has a temperature between 75 and 85 ° C to 35-45% of MS. The duration of each sequence defines the process. In this case, the duration of each sequence is 15 minutes.

Le contrôle est effectué par une analyse de distribution du poids moléculaire et l'analyse du rendement de chromatographie, de la manière suivante : (Quantité de matière sèche de la fraction voulue)/ (Quantité de matière sèche de l'alimentation) Les poids moléculaires les plus faibles interagissent avec la résine et les haut poids moléculaires sont élués à l'eau purifiée. La concentration est effectuée par évaporation en film tombant à une MS de 35 - 45 %. On réalise un traitement thermique à une température de 120°C pendant 2 minutes, On ajoute le charbon actif entre 0,5 et 1,5 % de la masse totale de l'hydrolysat d'amidon à 75°C avec des résines cationiques (1 à 3 I) pour contrôler le pH (4 - 4,5) et anioniques (5 à 10 I) pour contrôler le pH (5,5 - 6), On filtre sur filtres à manches en polypropylène avec P < 5 bars, en 5 à 6 heures par lot. On effectue une seconde et une troisième filtration sur 1,5 et 0,45 µm, puis sur 0,22 et 0,1 µm, et une ultrafiltration sur membrane d'un seuil de coupure de l'ordre de 40.000 Da Pour l'atomisation : alimentation à 500 kgs /h avec une solution à 40% de MS et à 250°C dans un atomiseur de type MSD commercialisé par la société Niro. Le produit atomisé présente à sa sortie une humidité inférieure à 6 %. On refroidit le produit alors en lit d'air fluidisé comprenant 3 zones de refroidissement alimentée par de l'air à 40, 30 et 20°C. Le produit obtenu est ensuite tamiser sur 800µm afin de retirer les agrégats. De l'ordre de 500 kgs de produit fini sont obtenus à partir de 800 kgs de maltodextrines départ, soit un rendement de l'ordre de 60%. La détermination de la contamination éventuelle du circuit est réalisée par l'analyse de la teneur en peptidoglycanes et endotoxines sur le produit fini. Pour exemple, les teneurs habituellement observées et mesurées sur les lots du produit fini (exprimés par g de polymère de glucose) sont pour les critères spécifiés ci-dessus les suivants : - Levures et moisissures : 0 / g - Germes aérobies : 0/g - Endotoxines (test LAL gel clot en point final) : à 0,3 EU/g. - Peptidoglycanes : < 3 ng/g B. acidocaldarius : 1/g Exemple 2: Utilisation des lignées cellulaires "sensibilisées" THP-1 humaines promonocytaires Matériels & Méthodes Les cellules THP-1 (88081201, ECACC) sont cultivées en routine au Laboratoire. The control is carried out by a molecular weight distribution analysis and the analysis of the chromatographic yield, in the following way: (Quantity of dry matter of the desired fraction) / (Quantity of dry matter of the feed) Molecular weights the weaker ones interact with the resin and the high molecular weights are eluted with purified water. The concentration is carried out by film evaporation falling to an MS of 35 - 45%. A heat treatment is carried out at a temperature of 120 ° C. for 2 minutes. The activated carbon is added between 0.5 and 1.5% of the total mass of the starch hydrolyzate at 75 ° C. with cationic resins ( 1 to 3 I) to control the pH (4 - 4.5) and anionic (5 to 10 I) to control the pH (5.5 - 6), is filtered on polypropylene bag filters with P <5 bar, in 5 to 6 hours per batch. A second and a third filtration are carried out on 1.5 and 0.45 microns, then on 0.22 and 0.1 microns, and a ultrafiltration on membrane of a threshold of cutoff of the order of 40.000 Da For the atomization: feed at 500 kgs / h with a 40% DM solution and at 250 ° C in an MSD type atomizer marketed by Niro. The atomized product has a moisture content of less than 6% at its outlet. The product is then cooled in a fluidized air bed comprising 3 cooling zones supplied with air at 40, 30 and 20 ° C. The product obtained is then sieved over 800 μm in order to remove the aggregates. On the order of 500 kgs of finished product are obtained from 800 kgs of maltodextrines starting, a yield of about 60%. The determination of the possible contamination of the circuit is carried out by analyzing the content of peptidoglycans and endotoxins on the finished product. For example, the levels usually observed and measured on the batches of the finished product (expressed per g of glucose polymer) are for the criteria specified above: - Yeasts and molds: 0 / g - Aerobic germs: 0 / g - Endotoxin (final gel LAL gel test): at 0.3 EU / g. Peptides: <3 ng / g B. acidocaldarius: 1 / g EXAMPLE 2 Use of Promonocyte Human THP-1 "Sensitized" Cell Lines Materials & Methods The THP-1 cells (88081201, ECACC) are routinely cultured in the laboratory.

Pour les expériences d'activation pro-inflammatoire, les cellules sont différenciées pendant 3 jours en présence de phorbol ester (PMA). En particulier, les cellules sont mises en culture dans 200 µl de milieu complet (0,75 106 cellules/mL) en présence de 20 nM de PMA pendant 72 h. Des échantillons de polymères de glucose sont préparés selon l'exemple 1. For pro-inflammatory activation experiments, the cells are differentiated for 3 days in the presence of phorbol ester (PMA). In particular, the cells are cultured in 200 μl of complete medium (0.75 × 10 6 cells / ml) in the presence of 20 nM of PMA for 72 h. Glucose polymer samples are prepared according to Example 1.

Tableau 1 : Echantillon de polymères de glucose. 1 10- 1 10- 1 10- MM MM MP MP MC 10- LY LY 01 02 03 10-04 10-05 10-06 10-07 08 10-09 10-10 LPS < 0,3 < 1,2 9,6 < 0,3 38,4 9.6 < 0,15 < 0,15 (EU/g) 0,3 0,3 PGN < 20 755 27 < 20 2755 < 20 4613 16288 < 20 208 (ng/g) La solution de dilution des standards est 1-10-01 avec < 0,3 EU/g de LPS (LAL), < 20 ng/g de PGN (Wako) et utilisée à la concentration de 5 mg/mL finale. Les mesures sont ensuite effectuées sur une première série d'échantillons 15 correspond à différents lots sélectionnés sur la base des taux de contamination par le PGN, le LPS et les [3-glucanes. Une deuxième série provient de prélèvements effectués aux différentes étapes du même procédé de fabrication d'un lot de polymères de glucose. Les kits ELISA de dosage de TNF-OE, de CCL5/RANTES et de l'IL-8 sont achetés par le 20 Laboratoire chez AbCys, les agonistes standards (PGN, LTA, LM, PAM3(cys), FSL-1, LPS, f-MLP et MDP) chez InvivoGen. Le test de mesure de l'activité SEAP est distribué par InvivoGen. Les cellules THP-1 différenciées (0,75.106 cellules/mL) sont mises en culture dans 200 µl de milieu complet, puis incubées en présence des différents échantillons à tester. 25 Chaque analyse est réalisée en triplicate. Les surnageants cellulaires sont collectés afin de doser les cytokines sécrétées après 8 h de stimulation pour le TNP-Cc, et 20 h pour le RANTES. Les dosages ELISA sont réalisés selon les indications données par le fabricant. Table 1: Sample of glucose polymers. 1 10- 1 10- 1 10- MM MM MP MP MC 10- LY LY 01 02 03 10-04 10-05 10-06 10-07 08 10-09 10-10 LPS <0.3 <1.2 9 , 6 <0.3 38.4 9.6 <0.15 <0.15 (EU / g) 0.3 0.3 PGN <20 755 27 <20 2755 <20 4613 16288 <20 208 (ng / g) Standard dilution solution is 1-10-01 with <0.3 EU / g LPS (LAL), <20 ng / g PGN (Wako) and used at the final concentration of 5 mg / mL. The measurements are then carried out on a first series of samples corresponding to different batches selected on the basis of the levels of contamination by PGN, LPS and [3-glucans. A second series comes from samples taken at the different stages of the same process of manufacturing a batch of glucose polymers. ELISA kits for TNF-OE, CCL5 / RANTES and IL-8 assay are purchased by the AbCys Laboratories, standard agonists (PGN, LTA, LM, PAM3 (cys), FSL-1, LPS , f-MLP and MDP) at InvivoGen. The measurement of the SEAP activity is distributed by InvivoGen. The differentiated THP-1 cells (0.75 × 10 6 cells / ml) are cultured in 200 μl of complete medium and then incubated in the presence of the different samples to be tested. Each analysis is performed in triplicate. The cell supernatants are collected in order to assay the secreted cytokines after 8 h stimulation for TNP-Cc, and 20 h for RANTES. The ELISA assays are performed according to the indications given by the manufacturer.

Résultats Les premiers essais ont consisté à analyser les réponses des cellules THP-1 "sensibilisées" en réponse à des doses croissantes de PGN et de LPS. Le MDP a été testé aux doses de 1, 10 et 100 pg/mL. La dose minimale n'induit pas d'effet synergique. Par contre, les doses de 10 et 100 pg/mL ont une activité synergique similaire sur la production des cytokines en réponse aux PGN et LPS. Pour la suite de l'étude, la dose de 10 pg/mL de MDP a été retenue. L'effet synergique du LPS a été analysé en ajoutant une dose sub-optimale (25 pg/mL) à des doses croissantes de PGN. L'effet synergique entre les deux agonistes est bien observé. La réponse a été quantifiée en mesurant la production de RANTES (Figure 1) et de TNF-a (Figure 2). Dans tous les cas, la synergie est nettement visible pour le dosage de RANTES, avec une sensibilité élevée. Ce dosage sera donc privilégié et conservé pour la suite des expérimentations. Results The first tests consisted of analyzing the responses of the "sensitized" THP-1 cells in response to increasing doses of PGN and LPS. MDP was tested at doses of 1, 10 and 100 μg / mL. The minimum dose does not induce a synergistic effect. In contrast, doses of 10 and 100 μg / mL have similar synergistic activity on cytokine production in response to PGN and LPS. For the rest of the study, the dose of 10 μg / mL of CDM was selected. The synergistic effect of LPS was analyzed by adding a suboptimal dose (25 μg / mL) to increasing doses of PGN. The synergistic effect between the two agonists is well observed. The response was quantified by measuring the production of RANTES (Figure 1) and TNF-a (Figure 2). In all cases, the synergy is clearly visible for the determination of RANTES, with a high sensitivity. This dosage will be preferred and kept for the rest of the experiments.

Ces premiers résultats montrent que la sensibilisation des cellules THP-1 avec le MDP, avec dosage en retour de RANTES, est particulièrement efficace pour détecter de faibles taux de PGN et de LPS. En théorie, ces seuils de détection devraient permettre de détecter les contaminants présents dans les produits Roquette (Tableau 2). These first results show that the sensitization of THP-1 cells with MDP, with RANTES back assay, is particularly effective in detecting low levels of PGN and LPS. In theory, these detection thresholds should make it possible to detect the contaminants present in Roquette products (Table 2).

Tableau 2 : Seuils de détection et EC50 pour le PGN et le LPS. PGN PGN + MDP PGN + LPS LPS LPS + MDP (10 pg/mL) (25 pg/mL) (10 µg/m L) Sensibilité 0,02 0,002 pg/mL 0,01 pg/mL 0,005 ng/mL 0,002 ng/mL pg/mL EC50 2 pg/mL 1 pg/mL 1 pg/mL 1 ng/mL 0,4 ng/mL Seuil de détection 400 40 ng/g 200 ng/g 0,1 ng/g 0,04 ng/g (soit (50 mg/mL) ng/g (soit 1 EU/g) 0,4 EU/g) Les essais avec les cellules THP-1 sensibilisées par le MDP ont donc été réalisés ensuite avec les dix échantillons Roquette (Figure 3). Une réponse inflammatoire (production de RANTES et de TNF-a) n'est observée que 25 dans l'échantillon 10-07, qui est le seul fortement chargé en LPS. Les PGN ne sont pas détectés, alors qu'ils sont normalement présents en quantités dosables. Une différence majeure entre les solutions préparées avec les standards de PGN et les échantillons de polymères de glucose du Tableau 1 est la présence d'une étape de filtration. 19 En effet, les standards sont préparés stérilement puis dilués dans une solution préparée avec le polymère 10-01, qui a été filtrée au préalable. En revanche, les autres polymères ont été filtrés sur filtre 0,22 µm avant d'être ajoutés hétérogènes et ils peuvent atteindre des tailles imposantes (> 106 Da). Ces derniers sont peu solubles, ce qui affecte leur pouvoir pro-inflammatoire mais favorise leur élimination par filtration. Par contre, les PGN solubles, et par conséquent actifs, ont une masse moyenne de 120 kDa. La comparaison des réponses induites par une même solution de PGN montre que la filtration réduit de plus de 50 % la réponse attendue (Figure 4). II est donc envisageable que le test Wako permette de doser tous les PGN, alors que les tests cellulaires présentent l'avantage de ne détecter que le PGN actifs. Pour vérifier cette hypothèse, des essais ont été réalisés avec des solutions de polymères préparées de façon aseptique mais sans étape de filtration (Figure 5). Dans ce cas, le polymère 10-07 donne encore une réponse très positive (LPS), alors que les autres échantillons sont peu ou non réactifs. On observe quand même une réponse supérieure au bruit de fond pour le 10-05 et les deux composés LY (10-09 et 10-10). Aucune relation n'a été observée entre ces faibles réponses et les taux de PGN dosés par le test Wako (voir tableau 1). Un autre paramètre susceptible d'optimiser le dosage est la concentration du polymère lorsqu'il est ajouté aux cellules. Table 2: Detection thresholds and EC50 for PGN and LPS. PGN PGN + MDP PGN + LPS LPS LPS + MDP (10 μg / mL) (25 μg / mL) (10 μg / mL) Sensitivity 0.02 0.002 μg / mL 0.01 μg / mL 0.005 ng / mL 0.002 ng / mL pg / mL EC50 2 μg / mL 1 μg / mL 1 μg / mL 1 μg / mL 0.4 ng / mL Threshold of detection 400 40 ng / g 200 ng / g 0.1 ng / g 0.04 ng / g (ie (50 mg / ml) ng / g (ie 1 EU / g) 0.4 EU / g) The tests with the THP-1 cells sensitized with the MDP were then carried out with the ten Roquette samples ( Figure 3). An inflammatory response (production of RANTES and TNF-α) is observed only in sample 10-07, which is the only one heavily loaded with LPS. PGNs are not detected, whereas they are normally present in measurable quantities. A major difference between the solutions prepared with the PGN standards and the glucose polymer samples of Table 1 is the presence of a filtration step. Indeed, the standards are prepared sterilely and then diluted in a solution prepared with the polymer 10-01, which has been filtered beforehand. On the other hand, the other polymers have been filtered on a 0.22 μm filter before being added heterogeneous and they can reach imposing sizes (> 106 Da). These are poorly soluble, which affects their pro-inflammatory power but promotes their elimination by filtration. On the other hand, soluble, and therefore active, PGNs have an average mass of 120 kDa. Comparison of the responses induced by the same PGN solution shows that the filtration reduces by more than 50% the expected response (Figure 4). It is therefore conceivable that the Wako test makes it possible to assay all the PGNs, whereas the cellular tests have the advantage of only detecting the active PGNs. To test this hypothesis, tests were carried out with solutions of polymers prepared aseptically but without filtration step (Figure 5). In this case, the polymer 10-07 still gives a very positive response (LPS), while the other samples are little or not reactive. There is still a higher response to the background for 10-05 and the two compounds LY (10-09 and 10-10). No relationship was observed between these low responses and the Wako-tested PGN levels (see Table 1). Another parameter that can optimize the assay is the concentration of the polymer when it is added to the cells.

Pour tester ce paramètre, les inventeurs ont analysé la réponse RANTES induite par du PGN standard dilué dans du milieu de culture seul (contrôle) ou additionné du polymère 10-01 à 5 mg/mL (valeur utilisée dans les tests doses-réponses des figures 1 et 2) et 50 mg/mL (valeur utilisée pour les tests avec les polymères). Alors que la concentration 5 mg/mL ne modifie pas de façon significative la réponse RANTES par rapport au contrôle, la présence du polymère à 50 mg/mL réduit au moins de moitié la réactivité des cellules, ce qui est surtout visible pour les faibles taux de PGN (Figure 6). II est donc préférable d'optimiser la concentration en polymère à utiliser, de façon à définir des conditions permettant de réduire au maximum cette atténuation tout en apportant suffisamment de produits pour avoir une réponse cellulaire détectable. To test this parameter, the inventors analyzed the RANTES response induced by standard PGN diluted in culture medium alone (control) or supplemented with 10-01 polymer at 5 mg / mL (value used in the dose-response tests of the figures 1 and 2) and 50 mg / mL (value used for testing with polymers). While the 5 mg / mL concentration does not significantly modify the RANTES response to the control, the presence of the 50 mg / mL polymer reduces the reactivity of the cells by at least half, which is especially visible at low levels. PGN (Figure 6). It is therefore preferable to optimize the polymer concentration to be used, so as to define conditions to minimize this attenuation while providing enough products to have a detectable cellular response.

Exemple 2 : Utilisation des lignées cellulaires HEK-BIueTM (hTLR2, hNOD2, Null2) et Raw-BIueTM (InvivoGen) Les cellules HEK-BIueTM et Raw-BIueTM sont cultivées au Laboratoire selon les conditions décrites par le fournisseur. EXAMPLE 2 Use of the HEK-BIueTM Cell Lines (hTLR2, hNOD2, Null2) and Raw-BIueTM (InvivoGen) The HEK-BIueTM and Raw-BIueTM cells are cultured in the laboratory according to the conditions described by the supplier.

Pour les cellules HEK-BIueTM et Raw-BIueTM, l'activité enzymatique libérée par activation des récepteurs de l'immunité innée est mesurée par un test colorimétrique selon les recommandations du fournisseur. Les mesures sont ensuite effectuées sur une première série d'échantillons correspondant à différents lots sélectionnés sur la base des taux de contamination par le PGN, le LPS et les [3-glucanes. Une deuxième série provient de prélèvements effectués aux différentes étapes du même procédé de fabrication d'un lot de polymères de glucose. For HEK-BIueTM and Raw-BIueTM cells, enzymatic activity released by activation of innate immunity receptors is measured by colorimetric assay according to the supplier's recommendations. The measurements are then carried out on a first series of samples corresponding to different batches selected on the basis of the levels of contamination by PGN, LPS and [3-glucans. A second series comes from samples taken at the different stages of the same process of manufacturing a batch of glucose polymers.

Exemple 3 : Méthode de dosage des peptidoglycanes Le dosage est basé sur la reconnaissance spécifique des PGN par une lignée exprimant le récepteur TLR2 et sur la production d'une activité enzymatique mesurable via l'activation de la voie de signalisation associée à TLR2. Procédures expérimentales Les lignées cellulaires HEK-BIueTM (InvivoGen) sont des lignées modifiées par transfection stable avec des vecteurs codant pour des récepteurs de l'immunité innée. Ces cellules sont également co-transfectées avec un gène rapporteur produisant une forme sécrétée de la phosphatase alcaline (SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase), dont la synthèse est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au(x) récepteur(s) exprimé(s) dans la même lignée cellulaire. Pour les expériences relatives à ce dosage, deux lignées sont utilisées : - lignée HEK-BIueTM hTLR2 : cette lignée répond spécifiquement aux agonistes du TLR2. Son utilisation permettra donc de connaître le taux de ces contaminants peptidoglycanes. - lignée HEK-BIueTM NuII2: il s'agit d'une lignée contrôle, dont l'utilisation permet de vérifier que les solutions de polymères de glucose n'induisent pas la production de l'enzyme par un mécanisme intrinsèque. Ce sont des lignées contrôles. Etablissement de la courbe doses-réponses La courbe doses-réponses est réalisée avec un peptidoglycane standard (Figure 7). Example 3 Peptidoglycan Assay Method The assay is based on the specific recognition of PGNs by a line expressing the TLR2 receptor and on the production of measurable enzymatic activity via activation of the TLR2-associated signaling pathway. Experimental Procedures HEK-BIueTM cell lines (InvivoGen) are lines modified by stable transfection with vectors encoding innate immunity receptors. These cells are also co-transfected with a reporter gene producing secreted alkaline phosphatase (SEAP), whose synthesis is directly dependent on the signaling pathway associated with the receptor (s). expressed in the same cell line. For the experiments relating to this assay, two lines are used: - HEK-BIueTM line hTLR2: this line responds specifically to TLR2 agonists. Its use will therefore make it possible to know the level of these peptidoglycan contaminants. - HEK-BIueTM NuII2 line: this is a control line whose use makes it possible to verify that the glucose polymer solutions do not induce the production of the enzyme by an intrinsic mechanism. These are control lines. Establishment of the dose-response curve The dose-response curve is performed with a standard peptidoglycan (Figure 7).

Les cellules HEK-BIueTM sont incubées avec des concentrations croissantes en standard, et la réponse cellulaire est mesurée par quantification de l'activité enzymatique produite. Le résultat est une courbe classique de réponse cellulaire de type sigmoïde. - La partie (A) correspond aux réponses obtenues avec des concentrations faibles en PGN, en-deçà de celles donnant une activation efficace de TLR2. Cette zone non linéaire correspond donc au seuil limite de détection de la méthode. Facultativement, de façon à inclure la variabilité de la méthode, on estime ce seuil de détection à trois fois la valeur du bruit de fond («réponse» obtenue en absence de stimulus). - La partie (B) est la plus intéressante car on observe une réponse linéaire. Cette zone de réponses efficaces permet de déterminer une relation directe entre la réponse cellulaire et le taux de PGN. II s'agit donc de la zone de dosage. - La partie (C) correspond à une saturation de la réponse cellulaire en présence de concentrations trop fortes en PGN. II y a en fait une saturation des récepteurs TLR2. Dans le cas d'échantillons susceptibles d'être fortement contaminés en PGN, il suffit donc de réaliser plusieurs dilutions en série de façon à toujours se localiser dans la zone de linéarité. A l'inverse, des concentrations faibles en PGN nécessitent une étape de concentration de l'échantillon si l'on veut augmenter la sensibilité du dosage. Préparation des échantillons Les dosages des PGN sont réalisés sur des solutions de polymères de glucose. L'échantillon nécessitant la quantification de PGN est incubé avec des cellules HEK-BIueTM hTLR2, et la réponse cellulaire est mesurée par quantification de l'activité enzymatique produite. En se reportant à la courbe doses-réponses, on détermine la quantité de PGN contenu dans l'échantillon. Matériels & Méthodes Cellules : lignées HEK-BIueTM (hTLR2, NuII2). Les cellules seront cultivées au Laboratoire selon les conditions décrites par le fournisseur. Notamment, elles ont été cultivées en routine dans du milieu DMEM contenant 4,5 g/L glucose, 10% (v/v) SVF décomplémenté, 50 U/mL pénicilline, 50 pg/mL streptomycine, 2 mM glutamine et 100 pg/mL de normocine. La zéocine (100µg/mL) a été utilisée pour assurer une pression de sélection du plasmide codant la SEAP. Pour les cellules HEK-TLR2, une sélection supplémentaire du plasmide codant pour TLR2 a été assurée en ajoutant dans le milieu l'antibiotique HEK-Blue Sélection. Les cellules ont été repiquées 2 fois par semaine. A 75% de confluence, les cellules ont été décrochées et remises en suspension à une densité de 0,28.106 cellules/mL. 180µL de la suspension cellulaire ont été répartis dans les puits de culture (boite de 96 puits), soit 50.000 cellules / puits. HEK-BIueTM cells are incubated with increasing concentrations as standard, and the cellular response is measured by quantification of the enzyme activity produced. The result is a classic sigmoid cell response curve. - Part (A) corresponds to the responses obtained with low concentrations of PGN, below those giving effective activation of TLR2. This non-linear zone therefore corresponds to the limit of detection of the method. Optionally, in order to include the variability of the method, this detection threshold is estimated at three times the value of the background noise ("response" obtained in the absence of stimulus). - Part (B) is the most interesting because we observe a linear response. This zone of effective responses makes it possible to determine a direct relationship between the cellular response and the PGN level. It is therefore the dosing zone. Part (C) corresponds to a saturation of the cellular response in the presence of too high concentrations of PGN. There is in fact a saturation of the TLR2 receptors. In the case of samples likely to be heavily contaminated with PGN, it suffices to carry out several serial dilutions so as to always be located in the linearity zone. In contrast, low PGN concentrations require a sample concentration step in order to increase the sensitivity of the assay. Sample Preparation The PGN assays are performed on glucose polymer solutions. The sample requiring the quantification of PGN is incubated with HEK-BIueTM hTLR2 cells, and the cellular response is measured by quantification of the enzyme activity produced. Referring to the dose-response curve, the amount of PGN contained in the sample is determined. Materials & Methods Cells: HEK-BIue ™ lineages (hTLR2, NuII2). Cells will be grown in the laboratory according to the conditions described by the supplier. Notably, they were routinely cultured in DMEM medium containing 4.5 g / L glucose, 10% (v / v) decomplemented FCS, 50 U / mL penicillin, 50 μg / mL streptomycin, 2 mM glutamine and 100 μg / mL. mL of normocine. Zeocin (100 μg / ml) was used to ensure a selection pressure of the plasmid encoding SEAP. For HEK-TLR2 cells, a further selection of the plasmid encoding TLR2 was ensured by adding in the medium the HEK-Blue Selection antibiotic. The cells were transplanted twice a week. At 75% confluency, the cells were removed and resuspended at a density of 0.28 × 10 6 cells / ml. 180 μL of the cell suspension were distributed in the culture wells (96-well box), ie 50,000 cells / well.

Echantillons : - Une première série d'échantillons correspond à différents lots sélectionnés sur la base des taux de contamination par le PGN, le LPS et les (3-glucanes. Elle permet d'établir une courbe étalon et d'effectuer des contrôles. Une deuxième série provient de prélèvements effectués aux différentes étapes du même Process de fabrication d'un lot de polymères de glucose. Elle correspond aux échantillons à doser. - Les agonistes standards (PGN, LPS et MDP) et le test de mesure de l'activité SEAP sont achetés par le Laboratoire chez InvivoGen. Stimulation des cellules et mesure de la réponse cellulaire : Les cellules sont incubées en présence des différents échantillons à tester. Notamment, 20 µL d'échantillon (PGN, polymères) ont été ajoutés dans chaque puits. La stimulation a duré de 16 à 24 h. Chaque analyse a été réalisée en triplicate. Les surnageants cellulaires sont collectés afin de doser l'activité enzymatique libérée (test colorimétrique) selon les recommandations du fournisseur. Notamment, la mesure de l'activité de la SEAP a été réalisée en mélangeant 180 µL de Quanti- blue (1 sachet pour 100 mL H2O préalablement chauffé à 37°C) et 20 µL de surnageant de culture. Le développement de la coloration (du rose au bleu) s'est fait à 37°C et la lecture a été réalisée à différents intervalles à 620 nm. Résultats Les premiers essais ont consisté à analyser les réponses des cellules HEK-TLR2 et HEK- Null à de doses croissantes de PGN et en présence des deux concentrations en polymère 10-01 utilisées précédemment. La réponse a été quantifiée en mesurant l'activité de la SEAP produite dans les surnageants des deux types cellulaires en réponse au PGN (Figure 7). La réponse des cellules HEK-TLR2 au PGN est plus sensible que celle obtenue en utilisant les cellules THP-1 (d'au moins un log). Ici aussi, une quantité trop élevée en polymères peut gêner la réponse des cellules. Une concentration à 5 mg/mL permet une quantification de PGN avec une linéarité parfaite entre 1 et 100 ng/mL (soit entre 200 et 20 000 ng/g de produits). Pour comparaison, le test Wako est adapté pour des concentrations > 20 ng/g, alors que les tests cellulaires classiques permettent de détecter à partir de 4000 ng/g. Les tests ont été réalisés avec des échantillons contaminés de polymères de glucose filtrés (Figure 8). Bien que le seuil de sensibilité soit en-deçà des taux de PGN contaminants, le dosage ne permet pas de retrouver de réponse au PGN. Ce résultat était toutefois attendu, puisque comme précédemment, la filtration des échantillons sur filtre 0,22 µm réduit la réponse de plus de 50% (Figure 9). Samples: - A first series of samples corresponds to different batches selected on the basis of the contamination rates by PGN, LPS and (3-glucans) It makes it possible to establish a standard curve and to carry out controls. second series is taken from samples taken at the different stages of the same manufacturing process of a batch of glucose polymers and corresponds to the samples to be assayed - standard agonists (PGN, LPS and MDP) and the activity measurement test SEAP are purchased by the Laboratory from InvivoGen Cell Stimulation and Cell Response Measurement: The cells are incubated in the presence of the different test samples, including 20 μL of sample (PGN, polymers) in each well. Stimulation lasted from 16 to 24 hours, each analysis was performed in triplicate and cell supernatants were collected to determine the enzyme activity released (test c). olorimetric) as recommended by the supplier. In particular, the measurement of the activity of the SEAP was carried out by mixing 180 μl of Quantibot (1 sachet per 100 ml H2O preheated to 37 ° C.) and 20 μl of culture supernatant. Color development (from pink to blue) was at 37 ° C and reading was performed at different intervals at 620 nm. Results The first tests consisted of analyzing the responses of HEK-TLR2 and HEK-Null cells at increasing doses of PGN and in the presence of the two polymer concentrations 10-01 used previously. The response was quantified by measuring the activity of SEAP produced in the supernatants of both cell types in response to PGN (Figure 7). The response of HEK-TLR2 cells to PGN is more sensitive than that obtained using THP-1 cells (of at least one log). Here too, too much polymer can interfere with cell response. A concentration of 5 mg / mL allows quantification of PGN with perfect linearity between 1 and 100 ng / mL (ie between 200 and 20 000 ng / g of products). For comparison, the Wako test is suitable for concentrations> 20 ng / g, whereas conventional cell tests can detect from 4000 ng / g. The tests were performed with contaminated samples of filtered glucose polymers (Figure 8). Although the sensitivity threshold is below contaminating PGN levels, the assay does not allow a response to PGN to be found. This result was, however, expected since, as before, the filtration of the samples on a 0.22 μm filter reduces the response by more than 50% (FIG. 9).

Les essais ont donc été reproduits avec des échantillons non filtrés (Figure 10). La méthode appliquée à des échantillons non filtrés permettent de faire ressortir quatre produits qui avaient été identifiés comme étant contaminés par du PGN (voir tableau 1). On peut noter que le polymère 10-07 ne répond pas, alors qu'il donnait une réponse très forte avec les cellules THP-1. Ce résultat confirme que la réponse était bien due à la présence d'un taux élevé de LPS. La méthode est donc bien spécifique des ligands TLR2 et permet de détecter des produits contaminés par le PGN. Par contre, il n'y a pas de corrélation entre les taux de PGN mesurés par la méthode Wako et les amplitudes des réponses cellulaires au PGN. Sur la base de ces premiers résultats, il peut être supposé que la méthode basée sur l'utilisation des cellules HEKTLR2 permet de détecter des PGN actifs. The tests were therefore reproduced with unfiltered samples (Figure 10). The method applied to unfiltered samples revealed four products that had been identified as contaminated with PGN (see Table 1). It may be noted that the polymer 10-07 does not respond, whereas it gave a very strong response with the THP-1 cells. This result confirms that the answer was due to the presence of a high level of LPS. The method is therefore very specific for TLR2 ligands and makes it possible to detect products contaminated with PGN. On the other hand, there is no correlation between WAKO-measured PGN levels and the amplitudes of cellular responses to PGN. Based on these early results, it can be assumed that the method based on the use of HEKTLR2 cells can detect active PGNs.

Les deux méthodes décrites dans les exemples 2 et 3 permettent de détecter les contaminants à activité pro-inflammatoire. Cela peut expliquer les différences observées entre les réponses cellulaires et les dosages quantitatifs (LAL et Wako). The two methods described in Examples 2 and 3 make it possible to detect contaminants with pro-inflammatory activity. This may explain the observed differences between cellular responses and quantitative assays (LAL and Wako).

En effet, les PGN sont très hétérogènes en taille. Les formes les plus lourdes (> 106 Da) sont peu solubles et donc peu réactives dans les tests cellulaires. Par contre, elles sont dosées par le test Wako. Les PGN de taille intermédiaire (- 100 kDa) sont très solubles et sont de puissants inducteurs de TLR2. Malgré des taux faibles, ils sont susceptibles de déclencher une forte réponse inflammatoire. Enfin, les formes monomériques sont reconnues par le récepteur NOD2. Comme le MDP, elles sont donc peu pro-inflammatoires mais peuvent agir en synergie avec d'autres contaminants. Cette dispersion de taille et donc d'activité présente un inconvénient majeur pour faire la relation entre le taux de contamination et le risque de développer une réponse inflammatoire lorsque des dosages quantitatifs classiques sont utilisés (LAL et Wako). Indeed, PGN are very heterogeneous in size. The heaviest forms (> 106 Da) are poorly soluble and therefore not very reactive in cell tests. On the other hand, they are dosed by the Wako test. PGNs of intermediate size (- 100 kDa) are very soluble and are powerful inducers of TLR2. Despite low levels, they are likely to trigger a strong inflammatory response. Finally, the monomeric forms are recognized by the NOD2 receptor. Like MDP, they are therefore not very pro-inflammatory but can act synergistically with other contaminants. This size and therefore activity dispersion has a major disadvantage in making the relationship between the contamination rate and the risk of developing an inflammatory response when conventional quantitative assays are used (LAL and Wako).

A titre d'illustration, les échantillons MP10-07 et MC10-08 sont très chargés en PGN (4613 et 16288 ng/mg, respectivement), mais ne donne pas de réponse cellulaire marquée avec les cellules HEK-TLR2. A l'inverse, les échantillons 110-02 et LY10-10 sont peu contaminés (755 et 208 ng/g) mais sont les plus réactifs en réponse cellulaire. Ces deux échantillons sont des produits finaux, qui ont donc subi entre autres des étapes de micro-filtration et de tamisage moléculaire. II est donc envisageable que les PGN présents dans ces deux produits soient solubles et donc très réactifs. A l'inverse, les échantillons MP10-07 et MC10-08 contiennent probablement des PGN de grande taille, qui seront éliminés en cours de production du produit final.35 By way of illustration, samples MP10-07 and MC10-08 are heavily loaded with PGN (4613 and 16288 ng / mg, respectively), but do not give a marked cell response with HEK-TLR2 cells. Conversely, samples 110-02 and LY10-10 are slightly contaminated (755 and 208 ng / g) but are the most reactive in cellular response. These two samples are final products, which have therefore undergone, among other things, micro-filtration and molecular sieving steps. It is therefore conceivable that the PGNs present in these two products are soluble and therefore very reactive. Conversely, samples MP10-07 and MC10-08 probably contain large PGNs, which will be eliminated during production of the final product.

Claims

REVENDICATIONS1. A method for detecting pro-inflammatory contaminants of glucose polymers, said contaminants being capable of triggering, separately or in combination, an inflammatory reaction, characterized in that it comprises at least one in vitro inflammatory response test with the aid of a cell line for detecting at least one factor of the inflammatory response.

2. Method according to claim 1, characterized in that the glucose polymers are chosen from the group of glucose polymers intended for peritoneal dialysis, enteral and parenteral nutrition and feeding of newborns, and more particularly polymers. of glucose for peritoneal dialysis.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell line is a macrophage, preferably a macrophage-differentiated cell line, more preferably the macrophage-differentiated THP-1 line.

4. Method according to claim 3, characterized in that the cell line produces TNF-C (, CCL5 / RANTES and / or CXCL8 / IL-8.

5. Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the inflammatory response test consists of putting the cells of the cell line in the presence of a glucose polymer preparation may contain pro-inflammatory contaminants and measuring the production of cytokines in the acute phase of inflammation, the production of these cytokines indicating that the preparation contains contaminants likely to trigger an inflammatory reaction.

6. Method according to claim 5, characterized in that the cytokines of the acute phase of inflammation are selected from the group consisting of TNF-α, IL-8, IL-1 (3 and chemokines such as CCL5 / RANTES preferably the cytokine is RANTES.

7. Process according to claim 6, characterized in that a molecule chosen from muramyl dipeptide (MDP) and related molecules, microbial peptides of f-MLP type (tripeptide formyl-Met) is added to the preparation of glucose polymers. -Leu-Phe) and lipopolysaccharides (LPS), preferably MDP or LPS.

8. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell line 5 makes it possible to detect the activity of one or more receptors of innate immunity.

9. Method according to claim 8, characterized in that the cell line is obtained by stable transfection with one or more vectors encoding one or more innate immunity receptors.

10. The method of claim 8 or 9, characterized in that the cell line can detect the activity of one or more receivers TLR or NOD.

11. The method of claim 10, characterized in that the cell line 15 can detect the activity of a TLR2 receptor.

12. The method of claim 10, characterized in that the cell line can detect the activity of a NOD2 receptor. 20

13. The method of claim 10, characterized in that the cell line can detect the activity of a TLR4 receptor.

14. Method according to any one of claims 8 to 13, characterized in that in the cell line, a reporter gene is directly dependent on the signaling pathway associated with the immunity receptor (s). innate, preferably a reporter gene encoding a stained or fluorescent protein or a protein whose activity can be measured with or without a substrate, even more preferably for an alkaline phosphatase. 30

15. Method according to any one of claims 8 to 14, characterized in that the inflammatory response test consists in putting the cells of the cell line in the presence of a glucose polymer preparation which may contain pro-inflammatory contaminants. and measuring the activity of the receptor or signal of the reporter gene, the detection of this activity or signal indicating that the preparation contains contaminants capable of activating innate immunity receptor (s) and triggering an inflammatory reaction .

16. Process according to any one of claims 1 to 15, characterized in that the tested glucose polymer preparation has a polymer concentration of 5 to 50 mg / mL.

17. A method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that it further comprises a step of identifying or quantifying the contaminant (s) may (s) trigger an inflammatory reaction.

18. The method of claim 17, characterized in that the contaminant (s) capable (s) to trigger an inflammatory reaction are identified or quantified by putting the preparation of glucose polymers in the presence of cells of a cell line as defined in any one of claims 8 to 15 and measuring the activity of the receptor or signal of the reporter gene, the detection of that activity or signal indicating the presence in the preparation of a contaminant which is a receptor agonist.

19. The method of claim 18, characterized in that the method allows the quantification of peptidoglycans (PGN) in which the cell line used to detect the activity of a TLR2 receptor.

20. The method of claim 19, characterized in that, in the cell line, a reporter gene is directly dependent on the signaling pathway associated with the TLR2 immunity receptor.