FR2978162A1

FR2978162A1 - Studying the effect of a biocide on a strain of fungus, comprises performing cultures of the strain of fungus determined on a culture medium, and performing photograph of area of same surface of the cultures at the end of culture period

Info

Publication number: FR2978162A1
Application number: FR1156539A
Authority: FR
Inventors: Sebastien Vacher; Claude Brunet
Original assignee: CONIDIA SARL
Current assignee: CONIDIA SARL
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2013-01-25
Anticipated expiration: 2031-07-19
Also published as: FR2978162B1

Abstract

The process comprises performing a first culture of a strain of fungus determined on a culture medium for a specified period (T), simultaneously performing a second culture of same strain of fungus on the same culture medium, during the same period, in the presence of determined quantity of a biocide, performing the photograph of an area of the same surface of the first and second cultures at the end of the culture period, calculating total combined surface area of spores and the total accumulated length of germinated mycelium spores from photograph. The process comprises performing a first culture of a strain of fungus determined on a culture medium for a specified period (T), simultaneously performing a second culture of same strain of fungus on the same culture medium, during the same period, in the presence of determined quantity of a biocide, performing the photograph of an area of the same surface of the first and second cultures at the end of the culture period, calculating total combined surface area of spores and the total accumulated length of germinated mycelium spores from photograph through analysis and computerized calculation units, assimilating the total spores at a single spore forming a disc of virtual radius (r) that calculates from the total combined surface area of spores, calculating a ratio (R) between the total length of mycelium and virtual radius for photography representative of an elongation rate for the first and second cultures, calculating the elongation percentage of the second culture with respect to the first culture from the ratio (R) obtained from each culture, and discriminating the spores and mycelium from the culture medium by calorimetric analysis of each pixel in the photographs according to a red-green blue (RGB) calorimetric system and assigning fixed scalar value to each pixel such that the scalar value is provided by a triple of RGB value in the calorimetric system. The photograph step is performed for 4-48 hours. The photographs have a resolution of 72 pixels by an image width unit, and are performed under light microscopy at a magnification of 500%. The first and second cultures are performed using a calibrated solution of spores from the strain of fungus. The concentration of the calibrated solution is selected so as to obtain 20-50 spores by photograph, and is 2.10 5>spores by ml spread evenly over identical Petri dishes. The elongation percentage is compared with a determined threshold value for the biocide considered with the reference strains of the same species, which allow to classify the strain studied as mold-resistant or non-resistant to the considered biocide.

Description

La présente invention concerne le domaine de l'étude des moisissures et de leurs propriétés de développement dans des milieux divers. L'invention concerne plus particulièrement un procédé de quantification de la germination de spores de moisissures permettant d'étudier l'effet d'une ou plusieurs substances biocides sur lesdites moisissures, voire de caractériser la résistance de souches de moisissures à une ou plusieurs substances biocides, et notamment de fongicides qui agissent sur la germination des spores et sur l'élongation du tube germinatif. Le procédé de l'invention est destiné à s'appliquer dans tous les domaines industriels pour lesquels l'utilisation ou la lutte contre les moisissures sont cruciaux et notamment la biotechnologie, l'agro-alimentaire, l'hygiène alimentaire, ou encore les milieux médicaux, hôpitaux en particulier. Les moisissures sont des champignons microscopiques qui se développent grâce à un appareil végétatif propre dans tout milieu ambiant relativement saturé en eau (hygrométrie de l'ordre de 70% au minimum), les substances nutritives (essentiellement carbone et azote) et les éléments minéraux (Potassium, Phosphore, Magnésium...) nécessaires à la synthèse de leur propre matière et à une température ambiante relativement élevée de l'ordre de 20°C à 25°C en moyenne. The present invention relates to the field of the study of molds and their properties of development in various environments. The invention more particularly relates to a method for quantifying the germination of mold spores making it possible to study the effect of one or more biocidal substances on said molds, or even to characterize the resistance of mold strains to one or more biocidal substances. , and in particular fungicides which act on the germination of the spores and on the elongation of the germ tube. The process of the invention is intended to be applied in all industrial fields for which the use or the fight against molds are crucial and in particular biotechnology, the food industry, food hygiene, or the media medical, hospitals in particular. Molds are microscopic fungi that develop through a clean vegetative system in any environment relatively saturated with water (hygrometry of the order of 70% minimum), nutrients (mainly carbon and nitrogen) and mineral elements ( Potassium, Phosphorus, Magnesium ...) necessary for the synthesis of their own material and at a relatively high ambient temperature of the order of 20 ° C to 25 ° C on average.

Les moisissures se développent généralement sur des matières diverses, essentiellement d'origines organiques telles qu'aliments, bois ou papier. Elles peuvent également dans certains cas se comporter et se développer de façon parasite sur des organismes vivants animaux ou végétaux dont les défenses immunitaires sont affaiblies. Molds generally develop on a variety of materials, mainly of organic origin such as food, wood or paper. They may also in some cases behave and parasitically develop on living organisms, animals or plants whose immune defenses are weakened.

Les moisissures connaissent un développement en deux phases sensiblement simultanées. Dans une première phase végétative, les moisissures se nourrissent du milieu ambiant sur lequel elles se trouvent pour croître sous forme de filaments, appelés hyphes, et qui forment un réseau, souvent d'apparence duveteux lorsqu'observé à l'oeil nu, et appelé mycélium. Dans une seconde phase reproductive, les moisissures développent à l'extrémité des filaments de mycélium des spores qui permettent un essaimage et une dispersion de la moisissure sur de nouveaux supports. Les spores se forment à partir des hyphes du mycélium selon des processus très variés propres aux différentes souches de moisissures et, en pratique, l'identification des différentes moisissures s'effectue traditionnellement par l'étude de leurs spores, leur mode de formation et groupement sur le mycélium. L'identification des moisissures et de moyens de lutte contre leur développement constitue un challenge permanent dans les différentes industries précitées car leur développement, du fait de leur toxicité et/ou de la dégradation des matières sur lesquelles elles prospèrent, peut s'avérer gravement dangereux pour la santé humaine et animale. Il est donc essentiel de pouvoir rapidement déterminer si une souche de moisissure quelconque présente dans un milieu donné est sensible ou résistante à une substance biocide connue, afin de pouvoir limiter son développement par le choix d'une substance biocide adaptée puis d'empêcher si possible tout nouveau développement. Malheureusement, les fongicides connus présentent une efficacité sélective et il est donc très important avant d'utiliser l'un d'entre eux de déterminer en fonction de la moisissure présente quel fongicide peut être efficace. A ce jour, on connaît plusieurs techniques pour appréhender les phénomènes de résistance des moisissures vis-à-vis des fongicides. Toutes ces techniques reposent sur une mise en culture préalable de la moisissure étudiée afin de faciliter l'observation et l'expérimentation de différents fongicides le cas échéant. Une première technique consiste à observer visuellement sous microscope la germination et l'élongation des filaments mycéliens. Pour obtenir des résultats quantitatifs, il est nécessaire de faire des mesures manuelles directement avec le microscope. Cette technique est donc longue pour obtenir un nombre de données chiffrées représentatives et utilisables et totalement dépendante des compétences des techniciens réalisant l'observation. Une seconde technique consiste à mesurer la densité optique (DO) d'une 30 culture des spores dans un milieu liquide en présence ou non de fongicide. Après un temps d'incubation défini, une mesure de DO est réalisée et comparée avec une solution témoin. Cependant la culture en milieu liquide qui n'est pas représentative des conditions de culture des moisissures en général. De plus, le temps pour obtenir une croissance significative et quantifiable par DO peut être relativement long là encore. Une dernière technique consiste à réaliser un antifongigramme. Cette technique réalisée sur milieu solide permet de valider l'efficacité d'antifongiques par visualisation macroscopique de croissance. En pratique, on dépose sur un milieu de culture ensemencé de la souche de moisissure étudiée des gouttes de différents fongicides puis on laisse la moisissure se développer pendant un temps donné. On mesure ensuite sur le milieu de croissance le diamètre des zones d'inhibition de croissance produites par les différents fongicides pour mesurer leur efficacité. Cette technique éprouvée nécessite cependant un temps d'incubation suffisant pour que la croissance soit visible macroscopiquement ce qui est malheureusement parfois incompatible avec des besoins de traitement en urgence de certaines moisissures, comme notamment dans le milieu hospitalier. Les calculs des pourcentages de germination des spores et de la vitesse d'élongation sont chez les moisissures des étapes clé pour une étude de l'efficacité de fongicides. Ils se fondent sur la capacité des spores (ou conidies) à germer normalement (conidies résistantes) ou non (conidies sensibles) en présence des fongicides. Il faut donc estimer la fréquence des individus résistants aux différents fongicides dans une suspension de conidies issues de la moisissure testée (ex : la pourriture grise causée par Botrytis cinerea, l'aspergillose pulmonaire causée par Aspergillus fumigatus). Pour cette raison, la première technique évoquée précédemment est la plus complète et la plus utile, bien qu'également la plus délicate et longue. Les calculs de pourcentage de germination sont basés sur le dénombrement manuel ou automatique du nombre des spores germées et non germées dans une photo, ainsi que sur des mesures d'élongation mycélienne. Ce travail se fait en moyenne sur une vingtaine de photos par produit testé, chaque photo contenant entre 10 et 50 spores. Ce travail est donc lent, fatiguant et coûteux lorsqu'il est réalisé manuellement. Lorsque les calculs sont automatiques, une spore est considérée germée si et seulement si la longueur de son tube germinatif est supérieure à son diamètre. Molds develop in two phases that are essentially simultaneous. In a first vegetative phase, molds feed on the environment on which they are found to grow in the form of filaments, called hyphae, which form a network, often of fluffy appearance when observed with the naked eye, and called mycelium. In a second reproductive phase, molds develop at the end of the mycelium filaments spores that allow swarming and dispersion of the mold on new supports. Spores form from hyphae of the mycelium according to very varied processes specific to the different strains of mold and, in practice, the identification of various molds is traditionally carried out by the study of their spores, their mode of formation and grouping. on the mycelium. The identification of molds and means to fight against their development is a permanent challenge in the various industries mentioned above because their development, because of their toxicity and / or degradation of the materials on which they thrive, can be seriously dangerous. for human and animal health. It is therefore essential to be able to quickly determine whether any mold strain present in a given medium is sensitive or resistant to a known biocidal substance, in order to be able to limit its development by choosing a suitable biocidal substance and then to prevent, if possible all new development. Unfortunately, the known fungicides have selective efficacy and it is therefore very important before using one of them to determine, depending on the mold present, which fungicide can be effective. To date, several techniques are known to apprehend the mold resistance phenomena vis-à-vis fungicides. All these techniques are based on a prior cultivation of the mold studied to facilitate the observation and experimentation of different fungicides where appropriate. A first technique consists in observing visually under a microscope the germination and the elongation of the mycelial filaments. To obtain quantitative results, it is necessary to make manual measurements directly with the microscope. This technique is therefore long to obtain a number of representative and usable numerical data and totally dependent on the skills of the technicians performing the observation. A second technique is to measure the optical density (OD) of a spore culture in a liquid medium with or without a fungicide. After a defined incubation time, an OD measurement is performed and compared with a control solution. However, culture in a liquid medium that is not representative of mold growing conditions in general. In addition, the time to achieve significant and quantifiable growth by OD can be relatively long again. A last technique is to perform antifungal flow. This technique carried out on a solid medium makes it possible to validate the efficacy of antifungals by macroscopic visualization of growth. In practice, drops of different fungicides are deposited on a culture medium inoculated with the mold strain studied and then the mold is allowed to develop for a given time. The diameter of the growth inhibition zones produced by the different fungicides is then measured on the growth medium to measure their effectiveness. This proven technique, however, requires sufficient incubation time for growth to be visible macroscopically which is unfortunately sometimes incompatible with emergency treatment needs of certain molds, such as in the hospital environment. Calculations of spore germination percentages and elongation rate are key milestones for fungicide efficacy studies. They are based on the ability of spores (or conidia) to germinate normally (conidia resistant) or not (sensitive conidia) in the presence of fungicides. It is therefore necessary to estimate the frequency of individuals resistant to the different fungicides in a suspension of conidia from the mold tested (eg gray mold caused by Botrytis cinerea, Aspergillosis caused by Aspergillus fumigatus). For this reason, the first technique mentioned above is the most complete and the most useful, although it is also the most delicate and long. Percent germination calculations are based on manual or automatic counting of the number of germinated and ungerminated spores in a photo, as well as measurements of mycelial elongation. This work is done on average about twenty photos per product tested, each photo containing between 10 and 50 spores. This work is slow, tiring and expensive when done manually. When the calculations are automatic, a spore is considered sprouted if and only if the length of its germ tube is greater than its diameter.

Cette condition est prévue pour éliminer les spores dites « fausses germées » qui développent un petit tube germinatif en se servant de leurs propres réserves et non de celles procurées dans le milieu de culture de la moisissure. Ces spores « fausses germées » peuvent perturber la fiabilité des calculs automatiques qui compte ces spores comme spores germés. This condition is intended to eliminate spores called "false sprouts" which develop a small germ tube using their own reserves and not those provided in the mold growing medium. These "false germinated" spores can disrupt the reliability of automatic calculations that count these spores as germinated spores.

D'autre part, la croissance des hyphes du mycélium se fait par nature de façon non directionnelle, avec des croisements multiples des tubes germinatifs entre eux, ce qui rend les mesures manuelles comme automatiques très difficiles. Par ailleurs, cette croissance non directionnelle du mycélium au cours du temps masque la présence des spores et empêche leur comptage. On the other hand, growth of mycelium hyphae is by nature non-directional, with multiple crosses of the germ tubes between them, making manual measurements as automatic very difficult. Moreover, this non-directional growth of the mycelium over time masks the presence of spores and prevents their counting.

Enfin, dans certains cas de mesures automatiques, notamment lors de la croissance sur certains fongicides, il est possible qu'apparaissent des artefacts qui peuvent être considérés comme des spores par un logiciel comptant uniquement le nombre de spores. Ceci a pour conséquence de faire augmenter artificiellement le nombre de spores et donc de biaiser les rapports calculés par exemple pour déterminer une longueur moyenne de mycélium par spore. Vu les inconvénients des techniques actuelles, la présente invention a pour but de fournir une nouvelle méthode d'évaluation de l'effet d'un biocide sur une souche de moisissures donnée, qui facilite les calculs des pourcentages de germination et de vitesses d'élongation des tubes germinatifs de conidies et utilise des paramètres fiables et stables au cours du temps pour réaliser le test de germination. L'invention atteint ce but grâce à un procédé d'étude de l'effet d'au moins un biocide sur une souche de moisissure, dans lequel : - on réalise une première culture d'une souche de moisissure déterminée sur 30 au moins un milieu de culture pendant une durée déterminée T, - on réalise simultanément une seconde culture de la même souche de moisissure sur un même milieu de culture pendant une même durée T, en présence d'une quantité déterminée d'au moins un biocide et caractérisé en ce que - on réalise à l'échéance de la durée de culture T au moins une photographie d'une zone de même surface des première et seconde cultures, et - on calcule à partir de chaque photographie par l'intermédiaire de moyens d'analyse et de calcul informatisés la surface cumulée totale de spores et la longueur cumulée totale de mycélium de spores germées, et - on assimile la totalité des spores à une spore unique formant un disque de rayon virtuel r que l'on calcule à partir de la surface totale cumulée de spores calculée à l'étape précédente, et - on calcule un rapport R entre la longueur totale de mycélium et le rayon virtuel r pour chaque photographie, - on calcule le pourcentage d'élongation des tubes germinatifs de la seconde culture par rapport à la première culture à partir des rapports R obtenus pour chaque culture. Le procédé proposé par la présente invention fait abstraction du comptage du nombre des spores germées ou non et fait intervenir le rapport entre deux variables : la surface cumulée des spores dont on déduit un rayon r virtuel correspondant au rayon d'une spore circulaire unique représentant une surface égale à la surface cumulée des spores et la longueur totale du mycélium produit par les spores sur une photo. La première culture de la souche de moisissure à étudier effectuée en l'absence de biocide joue le rôle de témoin et constitue une base de référence. Le procédé est de plus mis en oeuvre de façon automatique sans équipement particulier par la mise en oeuvre d'un simple logiciel d'analyse d'images permettant d'identifier de façon distincte les spores et les mycélium. Finally, in some cases of automatic measurements, especially when growing on certain fungicides, it is possible that artefacts appear which can be considered as spores by a software only counting the number of spores. This has the effect of artificially increasing the number of spores and thus skew the calculated ratios for example to determine an average length of mycelium per spore. In view of the drawbacks of current techniques, the present invention aims to provide a new method for evaluating the effect of a biocide on a given strain of mold, which facilitates the calculation of the percentages of germination and elongation rates. germ tubes of conidia and uses reliable and stable parameters over time to perform the germination test. The invention achieves this goal by means of a method of studying the effect of at least one biocide on a mold strain, in which: - a first culture of a mold strain determined on at least one culture medium for a determined period T, - a second culture of the same mold strain is carried out simultaneously on the same culture medium for the same duration T, in the presence of a determined quantity of at least one biocide and characterized in that what is achieved at the expiration of the culture time T at least one photograph of an area of the same area of the first and second cultures, and - is calculated from each photograph through analysis means and computational calculation the total accumulated surface of spores and the total accumulated length of mycelium spores germinated, and - we assimilate all of the spores to a single spore forming a disc of virtual radius r that is calculated at from the cumulative total spore area calculated in the previous step, and - a ratio R between the total length of mycelium and the virtual radius r for each photograph is calculated, - the percentage of elongation of the germ tubes of the second culture compared to the first culture from R ratios obtained for each culture. The method proposed by the present invention disregards the counting of the number of spores germinated or not and involves the ratio between two variables: the cumulative surface of the spores which is deduced a virtual radius r corresponding to the radius of a single circular spore representing a area equal to the cumulative surface of the spores and the total length of the mycelium produced by the spores in a photo. The first culture of the mold strain to be studied carried out in the absence of biocide acts as a control and constitutes a reference base. The method is moreover implemented automatically without special equipment by the implementation of a simple image analysis software to identify separately the spores and mycelium.

Le calcul du pourcentage d'élongation se fait de plus, de préférence, sur une pluralité de photos par culture pour une étude statistique permettant un gain de temps et de fiabilité des résultats. The calculation of the percentage of elongation is preferably done on a plurality of photos by culture for a statistical study allowing a saving of time and reliability of the results.

Le procédé de l'invention est de plus applicable de façon avantageuse à The method of the invention is moreover advantageously applicable to

toutes les moisissures qui ont des spores de formes rondes, ovales, ellipsoïdes ou sphériques. A titre d'exemple, on peut citer les moisissures espèces Aspergillus, Pen/a/Hum, Botrytis, Cercospora, Fusarium, Sphaerotheca, Ustilago dont Botrytis cinerea, Aspergillus sp., Pen/ci/Hum sp., C/adosporium (micro-conidies), Paeci/omyces, Scopu/anOpsis, Trichoderma... Le procédé selon l'invention permet all molds that have spores of round, oval, ellipsoid or spherical shapes. By way of example, mention may be made of the molds Aspergillus, Pen / a / Hum, Botrytis, Cercospora, Fusarium, Sphaerotheca, Ustilago including Botrytis cinerea, Aspergillus sp., Pen / ci / Hum sp., C / adosporium (micro -conidies), Paeci / omyces, Scopu / anOpsis, Trichoderma ... The method according to the invention allows

également d'étudier tout type de biocides tels que notamment les fongicides. A titre d'exemple, on peut citer les biocides appartenant à la famille des imidazoles, des carboxamides comme le boscalid, des anilopyrimidines comme le pyriméthanil, des strobilurines, la famoxadone, les fongicides du domaine médical, le Bénomyl, le Tiophante-méthyl, le métalaxyl ... also to study any type of biocides such as fungicides. By way of example, mention may be made of biocides belonging to the family of imidazoles, carboxamides such as boscalid, anilopyrimidines such as pyrimethanil, strobilurins, famoxadone, medical fungicides, benomyl and tiophante-methyl, the metalaxyl ...

Selon une autre caractéristique du procédé de l'invention, on discrimine les spores et les mycéliums du milieu de culture dans la photographie par analyse colorimétrique de chaque pixel des photographies suivant un système colorimétrique RVB et attribution pour chaque pixel d'une valeur scalaire fixe, cette valeur scalaire étant donnée par un triplé de valeurs dans le système According to another characteristic of the process of the invention, the spores and mycelia of the culture medium are discriminated in the photograph by colorimetric analysis of each pixel of the photographs according to an RGB colorimetric system and allocation for each pixel of a fixed scalar value, this scalar value being given by a triplet of values in the system

colorimétrique RVB utilisé. RGB colorimetric used.

Dans un mode préféré de réalisation, on prend un nombre entier n de photographies de la première culture et un même nombre n de photographies de la seconde culture et on calcule pour chaque photographie le rapport R, noté Ri. On calcule ensuite pour chaque série de n photographies de chaque culture un In a preferred embodiment, an integer number n of photographs of the first culture and the same number n of photographs of the second culture are taken and the ratio R, denoted Ri, is calculated for each photograph. Then, for each series of n photographs of each culture,

rapport R' moyen tel que : E1.1 Ri R' _ n Le rapport entre les deux rapports R' de la 2eme culture avec biocide et R' de la iere culture sans biocide donne le pourcentage d'élongation d'une souche donnée en présence d'un biocide donné. R 'average ratio such as: E1.1 Ri R' _ n The ratio between the two ratios R 'of the second crop with biocide and R' of the culture without biocide gives the percentage of elongation of a given strain in presence of a given biocide.

De façon préférée selon l'invention, on réalise les photographies après une durée T de 4 à 48h en fonction du biocide testé et de la souche de moisissure cultivée. La croissance est, de préférence, réalisée avec un contrôle du temps d'incubation pour éviter une croissance trop importante et donc une impossibilité de mesurer les longueurs de mycélium. Pendant le début de la phase de croissance exponentielle, moins de chevauchements au niveau des mycéliums sont visibles et les spores peuvent bien être distinguées. Selon un mode de réalisation de l'invention, les première et seconde cultures sont réalisées à partir d'une solution calibrée de spores de la souche de moisissure considérée. De manière avantageuse, la concentration de la solution calibrée est choisie de manière à obtenir de 20 à 50 spores par photographie. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la concentration de la solution calibrée est de 2.105 spores par ml étalées de façon homogène sur des boîtes de pétri identiques. Il est ainsi possible d'obtenir des photographies exploitables de manière optimisée, avec un nombre de spores par photographies ni trop faible, ni trop important. De façon préférée selon l'invention, les photographies présentent une résolution d'au moins 72, de préférence 96, pixels par pouce de largeur d'image (PPP)- De façon préférée encore, les photographies sont réalisées sous microscopie optique avec un grossissement d'au moins 500%. Le procédé de l'invention permet notamment de façon automatique rapide et reproductible de : - Etudier la résistance aux biocides, et notamment fongicides et la détermination de leur seuil d'efficacité (calcul de la dose d'efficacité à 50%, DE50). - Remplacer les antifongigrammes dans le domaine médical pour gagner du temps dans la prédiction du traitement chez les patients. Le procédé selon l'invention peut également permettre de déterminer si une souche de moisissures étudiée est résistante ou non à un biocide. Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte une étape de comparaison du pourcentage de d'élongation des tubes germinatifs obtenu (pour la souche étudiée avec un biocide donné) avec une valeur seuil déterminée pour le biocide considéré avec des souches de référence de la même espèce que la souche de moisissures étudiée, permettant de classer la souche de moisissure étudiée en tant que résistante ou non résistante au biocide considéré. De manière préférée, les souches de référence comprennent au moins 3 souches de références connues pour être résistantes au biocide considéré et au moins une souche de référence connue pour être sensible au biocide considéré. Par exemple dans le cas de Botrytis cinerea, en tant que souches de référence résistantes aux molécules de la famille des Anilino-pyrimidines, on pourra utiliser 3 à 4 souches du phénotype AniR connues pour être résistante et une souche sauvage sensible à ces biocides et en tant que souches de référence résistantes au carboxamide, 3 à 4 souches du phénotype H connues pour être résistante et une souche sauvage sensible à ce biocide. In a preferred manner according to the invention, the photographs are carried out after a duration T of 4 to 48 hours depending on the biocide tested and the strain of mold grown. The growth is preferably carried out with a control of the incubation time to avoid excessive growth and therefore an impossibility of measuring the lengths of mycelium. During the beginning of the exponential growth phase, fewer overlaps in the mycelia are visible and the spores can be distinguished. According to one embodiment of the invention, the first and second cultures are made from a calibrated solution of spores of the mold strain considered. Advantageously, the concentration of the calibrated solution is chosen so as to obtain 20 to 50 spores per photograph. According to a preferred embodiment of the invention, the concentration of the calibrated solution is 2.105 spores per ml spread homogeneously on identical petri dishes. It is thus possible to obtain exploitable photographs in an optimized manner, with a number of spores per photograph neither too weak nor too important. In a preferred manner according to the invention, the photographs have a resolution of at least 72, preferably 96, pixels per inch of image width (PPP). Still more preferably, the photographs are carried out under optical microscopy with a magnification. at least 500%. The method of the invention allows in particular automatically fast and reproducible way: - Study the resistance to biocides, including fungicides and the determination of their efficiency threshold (calculation of the 50% efficiency dose, ED50). - Replace antifongigrams in the medical field to save time in predicting treatment in patients. The method according to the invention can also make it possible to determine whether a mold strain studied is resistant or not to a biocide. In this case, the method according to the invention comprises a step of comparing the percentage of elongation of the germ tubes obtained (for the strain studied with a given biocide) with a threshold value determined for the biocide considered with reference strains of the same species as the mold strain studied, allowing to classify the mold strain studied as resistant or non-resistant to the biocide considered. Preferably, the reference strains comprise at least 3 reference strains known to be resistant to the biocide in question and at least one reference strain known to be sensitive to the biocide in question. For example, in the case of Botrytis cinerea, as reference strains resistant to molecules of the family Anilino-pyrimidines, it will be possible to use 3 to 4 strains of the AniR phenotype known to be resistant and a wild strain sensitive to these biocides and as long as reference strains resistant to carboxamide, 3 to 4 strains of phenotype H known to be resistant and a wild strain sensitive to this biocide.

Dans ce mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, la concentration en biocide utilisée dans la deuxième culture pourra être ajustée en fonction des souches de référence. La concentration optimale en biocide à utiliser pourra être connue d'après la littérature ou déterminée en faisant des gammes étalon. La concentration choisie correspondra à une concentration, où il existe une différence marquée entre les souches de référence résistante et la(es) souche(s) de référence sensible(s). Par ailleurs, la détermination de la valeur seuil pourra être déterminée au moment de l'étude en appliquant le procédé selon l'invention aux souches de référence ou aura pu être déterminée au préalable et stockée, par exemple dans une base de données. Par exemple, la valeur seuil pourra correspondre à la valeur R minimale obtenue pour les souches de référence résistantes, à la concentration sélectionnée, par rapport à laquelle la valeur R pour la souche sensible de référence est bien inférieure. Sera alors considérée comme résistante, toute souche étudiée présentant une valeur R supérieure ou égale. Les autres seront considérées comme sensibles. In this embodiment of the process according to the invention, the concentration of biocide used in the second culture can be adjusted according to the reference strains. The optimum concentration of biocide to be used may be known from the literature or determined by making standard ranges. The chosen concentration will correspond to a concentration, where there is a marked difference between the resistant reference strains and the sensitive reference strain (s). Moreover, the determination of the threshold value may be determined at the time of the study by applying the method according to the invention to the reference strains or may have been previously determined and stored, for example in a database. For example, the threshold value may correspond to the minimum value R obtained for the resistant reference strains, at the selected concentration, relative to which the value R for the sensitive reference strain is much lower. Will then be considered resistant, any strain studied having a R value greater than or equal to. The others will be considered sensitive.

Le procédé selon l'invention pourra également être utilisé pour classer différentes souches à étudier, dont la nature n'est pas connue. Dans ce cas, ces différentes souches pourront être étudiées simultanément et en parallèle, en réalisant des gammes de concentration en un biocide considéré et en calculant pour chaque concentration les rapports R. La comparaison des différents rapports R obtenus permet de classer relativement les souches étudiées, sur une échelle de sensibilité/résistance au biocide considéré. D'autres caractéristiques du procédé de la présente invention ressortiront à la lecture de la description détaillée d'un mode de réalisation particulier de ce 10 procédé et en référence aux figures annexées parmi lesquelles : - Les figures 1A à ID représentent des photographies d'un développement d'une même souche de moisissure de type Botrytis cinerea en présence respectivement de quatre fongicides différents pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention ; 15 - la figure 2 représente une copie d'écran du traitement d'une photographie de moisissure par un logiciel de traitement d'image informatique mettant en oeuvre de façon automatique le procédé de l'invention ; - la figure 3 représente est une copie d'écran analogue à celle de la figure 2 montrant le traitement d'une photographie de moisissure fortement développée ; 20 - la figure 4 représente un histogramme représentant les résultats de mesure obtenus par la mise en oeuvre du procédé de l'invention pour déterminer la résistance à quatre fongicides de différentes souches de moisissures de type Botrytis cinerea. La présente invention propose un nouveau procédé d'étude de l'effet d'au 25 moins un biocide sur une souche de moisissure dont une des applications est la caractérisation de la résistance d'une moisissure à une ou plusieurs substances biocides. Ce procédé défini comme nouveau paramètre de détermination de la résistance d'une souche de moisissure à une substance biocide déterminée le 30 rapport R entre la longueur totale cumulée L de mycélium des spores d'une culture et le rayon virtuel r d'une spore virtuelle unique circulaire d'une surface égale à la surface totale cumulée de toutes les spores germées d'une culture donnée. En d'autres termes, pour calculer le rapport R, on calcule dans un premier temps la surface totale cumulée S des spores germées pour une culture de moisissure considérée, surface cumulée S que l'on assimile à une spore unique de surface égale. A partir de cette surface, on calcule ensuite le rayon virtuel r de la spore unique virtuelle de surface égale à la surface cumulée S préalablement calculée. Il suffit ensuite de rapporter ce rayon r virtuel à la longueur totale de mycélium L calculée ou inversement. The method according to the invention may also be used to classify different strains to be studied, the nature of which is not known. In this case, these different strains can be studied simultaneously and in parallel, realizing ranges of concentration of a considered biocide and calculating for each concentration the R ratios. The comparison of the different R ratios obtained makes it possible to classify the studied strains relatively, on a scale of sensitivity / biocide resistance considered. Other features of the method of the present invention will become apparent on reading the detailed description of a particular embodiment of this method and with reference to the appended figures among which: FIGS. 1A to ID represent photographs of a development of the same strain of Botrytis cinerea mold in the presence respectively of four different fungicides for carrying out the process of the invention; FIG. 2 represents a screen shot of the processing of a mold photograph by computer image processing software automatically implementing the method of the invention; FIG. 3 represents a screen copy similar to that of FIG. 2 showing the treatment of a highly developed mold photograph; FIG. 4 represents a histogram representing the measurement results obtained by carrying out the method of the invention for determining the resistance to four fungicides of different Botrytis cinerea mold strains. The present invention provides a novel method of studying the effect of at least one biocide on a mold strain, one of whose applications is the characterization of the resistance of a mold to one or more biocidal substances. This process defined as a new parameter for determining the resistance of a mold strain to a biocidal substance determined the ratio R between the accumulated total length L of mycelium spores of a culture and the virtual radius r of a virtual spore unique circular with an area equal to the cumulative total area of all germinated spores of a given culture. In other words, in order to calculate the ratio R, the cumulative total surface area S of the germinated spores for a given mold culture, cumulated area S, which is assimilated to a single spore of equal area, is first calculated. From this surface, the virtual radius r of the single virtual spore of area equal to the cumulative surface area S calculated beforehand is then calculated. It is then sufficient to relate this virtual radius r to the total length of calculated mycelium L or vice versa.

Afin de pouvoir déterminer ce rapport R, la souche de moisissure à étudier est mise en culture sur un milieu de culture, avec ou sans biocide. Le milieu de culture est adapté au biocide testé et est identique dans les deux cas (avec ou sans biocide). Il peut s'agir, par exemple, d'un milieu gélosé supplémenté avec des sels ou différents additifs tels que des tensio-actifs. Dans ce cas le biocide pourra être ajouté avant ou après le placement des moisissures sur le milieu de culture. Il existe également des milieux commerciaux disponibles avec ou sans fongicides. Pour la mise en culture, il est possible d'utiliser une culture jeune de la moisissure à tester. Il est également possible de travailler directement à partir d'échantillons sans phase de pré-culture si les échantillons sont propres et si la concentration de spores est suffisante. C'est par exemple, le cas des prélèvements de populations de Botrytis sur baies. Dans tous les cas, une solution de spores, par exemple dans de l'eau stérile, avec éventuellement des additifs tels que des sels, des tensio-actifs, de la Tryptone, est répartie de manière homogène sur le milieu de culture, par exemple par pulvérisation. In order to be able to determine this ratio R, the mold strain to be studied is cultured on a culture medium, with or without biocide. The culture medium is adapted to the tested biocide and is identical in both cases (with or without biocide). It may be, for example, an agar medium supplemented with salts or various additives such as surfactants. In this case the biocide may be added before or after the placement of the molds on the culture medium. There are also commercial environments available with or without fungicides. For cultivation, it is possible to use a young culture of mold to test. It is also possible to work directly from samples without pre-culture phase if the samples are clean and the concentration of spores is sufficient. This is, for example, the case of collecting populations of Botrytis on berries. In all cases, a solution of spores, for example in sterile water, with possibly additives such as salts, surfactants, Tryptone, is distributed homogeneously on the culture medium, for example by spraying.

La culture est réalisée dans des conditions de culture (temps et température notamment selon l'espèce de moisissure étudiée) qui seront adaptés par l'homme du métier. Le calcul s'effectue à partir d'au moins une photographie d'au moins une première culture et d'au moins une seconde culture d'une souche de moisissure déterminée sur au moins un milieu de culture pendant une durée déterminée T, la seconde culture ayant reçu une quantité déterminée d'au moins un biocide alors que la première culture constitue un témoin de référence. Ces cultures sont réalisées de façon avantageuse de telle sorte que l'on obtienne en moyenne lors du passage de la boîte de pétri sous microscope pour l'analyse de 10 à 50 spores de moisissure (germées et non germées) par photographie. Ces photographies sont prises après une durée de 4h à 48h d'incubation selon le biocide testé et l'espèce de moisissures étudiée en conditions contrôlées d'obscurité et de température entre 17 et 45°C (selon le couple fongicide/moisissure étudié). Pour chaque échantillon testé (ainsi que pour chaque souche de moisissure référence) correspond une boite témoin dont le milieu n'est pas amendé en fongicide. Le temps d'incubation est un facteur déterminant qui est lié à la vitesse de croissance du témoin (boite sans fongicide). Il faut donc connaître précisément le temps d'incubation pour chaque espèce pour avoir des photos exploitables. The culture is carried out under culture conditions (time and temperature, in particular according to the species of mold studied) which will be adapted by those skilled in the art. The calculation is made from at least one photograph of at least one first culture and at least one second culture of a mold strain determined on at least one culture medium for a determined duration T, the second culture having received a determined quantity of at least one biocide while the first culture constitutes a reference control. These cultures are advantageously carried out so that on average the passage of the petri dish under a microscope for the analysis of 10 to 50 spores of mold (germinated and ungerminated) is obtained by photography. These photographs are taken after a duration of 4h to 48h of incubation according to the tested biocide and the species of mold studied under controlled conditions of darkness and temperature between 17 and 45 ° C (depending on the couple fungicide / mold studied). For each sample tested (as well as for each strain of mold reference) corresponds a control box whose medium is not amended in fungicide. The incubation time is a determining factor that is related to the growth rate of the control (box without fungicide). It is therefore necessary to know precisely the incubation time for each species to have exploitable photos.

Conformément à l'invention, le calcul du rapport R est représentatif du taux d'élongation des tubes germinatifs des spores, pour la première et la seconde culture réalisées, ce taux d'élongation étant lui-même représentatif du taux de germination des spores. Ce rapport R permet ensuite de calculer le pourcentage d'élongation de la seconde culture par rapport à la première culture et ainsi de qualifier l'efficacité du biocide mis en oeuvre sur cette souche de moisissure Le calcul du rapport R rend également possible pour chaque culture d'une souche de moisissure de caractériser sa résistance pour un biocide considéré par comparaison du pourcentage d'élongation calculée à une valeur seuil déterminée pour le biocide considéré. In accordance with the invention, the calculation of the ratio R is representative of the elongation rate of the germ tubes of the spores, for the first and second cultures produced, this elongation rate being itself representative of the spore germination rate. This ratio R then makes it possible to calculate the percentage of elongation of the second culture with respect to the first culture and thus to qualify the effectiveness of the biocide used on this mold strain. The calculation of the ratio R also makes it possible for each culture. of a mold strain to characterize its resistance for a biocide considered by comparing the percentage of elongation calculated at a threshold value determined for the biocide considered.

Selon une forme de mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention, le calcul du rapport R se fait sur un nombre n de photographies prises au microscope, avec un grossissement de 500% (x5). On obtient ainsi pour une culture considérée, et par photographie, un rapport R individuel noté par exemple Ri... pour chaque photographie considérée. On moyenne ensuite ces rapports R pour obtenir un rapport R' moyen et déterminer le pourcentage d'élongation de la culture amendée de fongicide par rapport à une culture témoin. Le rapport moyen R' peut ainsi être défini tel que : R'_r_ Ri n En pratique, on considère en général six boites de pétri, trois contenant chacune une reproduction d'une première culture de moisissure sans biocide et trois contenant chacune une seconde culture de la même moisissure, mais avec une dose connue de biocide. On prend ensuite un nombre n de photographies, en général de 6 à 8 photographies, de chaque boîte de pétri pour chacune des cultures et on calcule tout d'abord pour chaque photographie le rapport Ri correspondant à la croissance de la moisissure observée sur cette photographie puis le rapport R' moyen correspondant à la somme de tous les rapports R individuels calculés pour chaque photographie de chaque culture (pour les trois boîtes de pétri) divisé par le nombre n total de photographies. Le procédé de l'invention est de façon préférée mis en oeuvre par un logiciel informatique de traitement d'images qui analyse des photographies numériques d'une zone de même surface des cultures de moisissure réalisées et qui calcule par une analyse colorimétrique numérique des photographies la surface totale de spores germées et non germées) et la longueur totale de mycélium dans la surface photographiée. Pour réaliser cette analyse, le logiciel assimile avantageusement les spores de moisissures à des sphères (ou des disques) et calcule la surface de chaque spore puis la surface totale des spores dans chaque photo. Le logiciel assimile ensuite cette surface totale cumulée S à celle d'une spore unique en forme de disque de rayon r, en pm, rayon r qui est alors calculé à partir de la surface totale cumulée S. Le logiciel mesure également la longueur de chaque ramification de mycélium et donne la longueur totale L du mycélium en pm présent par photo. L'analyse numérique des photographies de cultures repose sur une analyse colorimétrique codée sur 24 bits de chaque pixel des photographies, dont la résolution et le format sont reconnues par le logiciel, dans un modèle colorimétrique RVB (Rouge-Vert-Bleu), bien connu de l'homme de l'art dans le domaine de l'imagerie numérique. Le modèle RVB repose sur trois couleurs primaires (rouge, vert et bleu) qui par leurs mélanges vont restituer toutes les autres, le blanc étant donné par l'addition des trois couleurs primaires. Ainsi, lors de l'analyse des photographies, chaque pixel se voit attribuer une valeur scalaire calculée en fonction du mélange des couleurs rouge, vert et bleu. La couleur des spores est différente de celle du mycélium qui elle-même est différente de celle du milieu de culture. Ces différences se traduisent par des valeurs scalaires différentes de pixels selon que ces pixels correspondent à une zone d'image reproduisant une spore, un mycélium ou le milieu de culture. Lorsque tous les pixels d'une photographie ont été analysés, le logiciel compare chaque pixel avec ceux qui l'entourent. Les pixels qui ont la même valeur scalaire et sont situés côte à côte (connexes) dans l'image photographique représentent ainsi un même « objet » dans l'image, c'est-à-dire une spore, le mycélium ou le milieu de culture. Il est ainsi très facile ensuite de calculer la surface. Ces surfaces sont additionnées pour donner une valeur unique S pour chaque image. En considérant la surface totale S comme celle d'une spore unique, il est possible de calculer le rayon r virtuel de cette spore unique virtuelle. Pour calculer la longueur de mycélium, le logiciel procède à une addition de l'ensemble de pixels qui ont la même valeur dans une seule direction ou dimension. Une fois ces calculs réalisés, spores et mycélium sont colorisés par une couleur propre unique pour les faire ressortir sur l'image traitée qui s'affiche sur le moniteur d'un opérateur réalisant l'analyse comme représenté sur les figures 1 et 2. Cette coloration permet à l'opérateur d'effectuer une vérification manuelle du comptage réalisé par le logiciel de façon automatisée. According to a preferred embodiment of the method of the invention, the calculation of the ratio R is done on a number n of photographs taken under a microscope, with a magnification of 500% (x5). For a given crop, and by photograph, an individual R ratio, for example, Ri, is obtained for each photograph considered. These R ratios are then averaged to obtain a mean R 'ratio and to determine the percentage of elongation of the modified fungicide culture relative to a control culture. The average ratio R 'can thus be defined such that: R'_r_ Ri n In practice, six petri dishes are generally considered, three containing each a reproduction of a first mold culture without biocide and three each containing a second culture. of the same mold, but with a known dose of biocide. We then take a number n of photographs, generally 6 to 8 photographs, of each petri dish for each of the cultures and we first calculate for each photograph the ratio Ri corresponding to the growth of the mold observed in this photograph. then the average ratio R 'corresponding to the sum of all the individual R ratios calculated for each photograph of each culture (for the three petri dishes) divided by the total number n of photographs. The method of the invention is preferably implemented by an image processing computer software which analyzes digital photographs of an area of the same surface of the mold cultures produced and which calculates by digital colorimetric analysis of the photographs the total area of germinated and ungerminated spores) and the total length of mycelium in the photographed surface. To perform this analysis, the software advantageously assimilates mold spores to spheres (or disks) and calculates the surface of each spore and the total surface of the spores in each photo. The software then assimilates this cumulative total area S to that of a single disk-shaped spore of radius r, in pm, radius r, which is then calculated from the cumulative total area S. The software also measures the length of each mycelium branching and gives the total length L of the mycelium in pm present by photo. The digital analysis of crop photographs is based on a 24-bit color coded analysis of each pixel of the photographs, whose resolution and format are recognized by the software, in a well-known RGB (Red-Green-Blue) colorimetric model. of those skilled in the art in the field of digital imaging. The RGB model is based on three primary colors (red, green and blue) which by their mixtures will restore all the others, the white being given by the addition of the three primary colors. Thus, during the analysis of the photographs, each pixel is given a scalar value calculated according to the mixture of the colors red, green and blue. The color of the spores is different from that of the mycelium, which itself is different from that of the culture medium. These differences result in different scalar values of pixels depending on whether these pixels correspond to an image zone reproducing a spore, a mycelium or the culture medium. When all the pixels in a photograph have been analyzed, the software compares each pixel with those around it. Pixels that have the same scalar value and are located side by side (related) in the photographic image thus represent the same "object" in the image, that is, a spore, mycelium or culture. It is very easy then to calculate the surface. These surfaces are added to give a unique value S for each image. Considering the total area S as that of a single spore, it is possible to calculate the virtual radius r of this single virtual spore. To calculate the length of mycelium, the software proceeds to add the set of pixels that have the same value in a single direction or dimension. Once these calculations are made, spores and mycelium are colored by a unique clean color to make them stand out on the treated image which is displayed on the monitor of an operator carrying out the analysis as represented in FIGS. 1 and 2. staining allows the operator to perform a manual counting check performed by the software in an automated way.

La qualité des photographies réalisées pour chaque analyse d'une souche donnée de moisissure est un facteur primordial et décisif à la bonne mise en oeuvre du procédé de l'invention sous la forme d'un logiciel informatique. En effet, tous les calculs de surface cumulée de spores, de rayon des spores, de longueur de mycélium et du rapport R qui en découle selon l'invention sont basés sur l'analyse numérique des photographies de cultures. Ces calculs dépendent donc directement de la qualité des photos fournies. Aussi ces photographies doivent être prises à temps, avec une bonne mise au point du microscope et un appareil photo de bonne qualité qui doit être bien réglé par l'opérateur. Toutefois ces conditions expérimentales de mise au point sont tout à fait triviales pour les opérateurs. The quality of the photographs made for each analysis of a given strain of mold is a primary and decisive factor for the proper implementation of the method of the invention in the form of computer software. Indeed, all cumulative spore surface area, spore radius, mycelium length calculations and the resulting R ratio according to the invention are based on the digital analysis of crop photographs. These calculations therefore depend directly on the quality of the photos provided. Also these photographs must be taken in time, with a good focus of the microscope and a good quality camera which must be well adjusted by the operator. However these experimental conditions of development are quite trivial for the operators.

Le choix de la résolution des photographies, c'est-à-dire de la densité de pixels par unité de surface des images, est libre et reste à la discrétion de l'opérateur mais revêt bien entendu une grande importance pour la qualité de traitement des photographies. De façon préférée dans le cadre du procédé de l'invention on choisira une résolution d'au minimum 72 pixels par pouce (ppp) et de préférence de 96 ppp. Il est bien entendu possible d'augmenter cette résolution pour affiner la qualité des photographies sans que cela ne perturbe l'analyse. La variation de la résolution a pour conséquence de modifier le nombre de photos à réaliser pour traiter un nombre constant de spores (de 20 à 50 par photos). Comme la résolution, la taille de l'image (Hauteur et Largeur) n'influence pas le traitement par le logiciel. Il est préférable de laisser ces deux paramètres par défaut en fonction de l'appareil photo pour un gain du temps. Afin de permettre le calcul de la surface totale S des spores et le rayon r virtuel correspondant ainsi que la longueur L du mycélium en pm alors que l'analyse des photographies se fait pixel par pixel, le logiciel de traitement mettant en oeuvre le procédé de l'invention effectue automatiquement la conversion en pm à partir des valeurs de résolution des photographies et de l'objectif et du grossissement du microscope. Ces paramètres doivent être enregistrés dans le logiciel avant le traitement des photographies pour le calcul du rapport R. Le calcul du rapport R, ainsi que du rapport moyens R' éventuel, est automatique une fois les images traitées. On portera cependant de préférence une attention toute particulière aux valeurs de rapport moyens R' qui permettent d'estomper les effets éventuels d'artefact dans l'analyse individuelle de chacune des photos réalisées. En effet, en fonction de la résistance ou la sensibilité de la souche traitée au biocide utilisé, les spores germent à des vitesses variables et par conséquent la taille du mycélium diffère. Pour le même temps d'incubation, le mycélium du témoin (boite sans biocide) chevauche et masque la présence des spores. Le logiciel parfois considère les zones d'intersection de plusieurs mycéliums comme des surfaces et ainsi il les compte comme des spores. Ce problème constitue un artefact pour le logiciel ce qui rend le nombre des spores calculé pas toujours exploitable. Cet artefact rend aussi le calcul à l'oeil nu parfois difficile (confusion entre la spore et les mycéliums). La taille et la forme de ses zones sont similaires de celle de spores donc donne une valeur de surface proche de celles de spores. La multiplication des photographies sur trois champs distincts pour chaque culture de moisissure étudiée et chaque culture témoin permet de lisser et pondérer ce risque d'artefact par le calcul de valeurs moyennes R'. Un exemple d'application particulier du procédé de l'invention va maintenant être décrit pour une souche déterminée de moisissure qu'est Botrytis cinerea. Botrytis cinerea (forme imparfaite du télémorphe Botryotinia fucke/fana) est l'agent responsable de la pourriture grise sur plus de 200 plantes-hôtes. Qualifié de polyphage, Botrytis cinerea est en fait un complexe d'espèces dans lequel des populations distinctes pourraient être adaptées à différents hôtes. Il s'agit d'un des principaux champignons pathogène de la vigne conduisant à des importantes pertes pour l'agriculture au niveau de la France et de l'Europe. Les spores ou les conidies de Botrytis cinerea sont sub-ovales et sont un bon exemple de la mise en oeuvre pratique du procédé de l'invention. Les souches à tester sont mises en culture sur un milieu MEAc qui contient 20g de malt, 1g de peptone, 20g de glucose et 0,5 g de chloramphénicol, pendant une durée de 7 jours (préculture). Le milieu de culture pour les tests avec fongicide est préparé comme suit : Extrait de levure (20,0 f 0,1) g Bactopeptone (20,0 t 0,1) g Acétate de sodium (2,0 t 0,1) g Agar (12,5 f 0,1) g Eau distillée QSP (1,00 t 0,01) L Agiter à l'aide d'un barreau aimanté puis autoclaver (30 t 1) min à (110 ±1) °C Après autoclavage, laisser le milieu refroidir jusqu'à environ 50°C au bain marie puis ajouter stérilement le biocide - Milieu coulé en boite 55 : (4 t 0,1) ml par boite La suspension de spores à 2.105 UFC/ml est étalée de façon homogène sur les boites d'essais et témoin, cette suspension est obtenue à partir de la préculture. Les spores sont suspendues dans un diluant (Tryptone ig/I, NaCI 0,5 g/I, Tween 80 iml/I et Eau 1 litre)). La pulvérisation des spores est réalisée sous un poste de sécurité microbiologique (PSM). Les milieux sont autoclavés à 110°C pendant 30 min puis placés dans un bain marie à 50°C pour les amener à cette température avant d'ajouter le biocide correspondant. Les biocides présentés dans le Tableau 1 ci-dessous sont ajoutés. Tableau 1 Biocides Abréviations Concentration à tester Préparation de solution mère Pyriméthanil Pyr 1 mg/I 504 pl dans 100 ml d'eau. 37,4 On ajoute 250 pl de cette solution à % v/v de MA 500 ml de milieu de culture Tebuconazole Teb 0,7 mg/I 193 mg dans 100 ml d'eau. 25,9% m/m de On ajoute 700 pL de cette solution à MA 500 ml de milieu de culture Fluodioxonil Flu 0,125 mg/I 30 mg dans 100 ml d'eau. 50% m/m de MA On ajoute 416 pl de cette solution à 500 ml de milieu de culture Boscalid Bos 3 mg/I 200 mg dans 100 ml d'eau. 50% m/m de MA On ajoute 1,5 ml de cette solution à 500 ml de milieu de culture Avec MA = matière active Au bout de 24 h d'incubation, on réalise au moins trois photographies numériques, de préférence 6 photographies au moins sous microscope, grossissement x5, des cultures réalisées pour le biocide Boscalid (Bos). On enregistre alors les fichiers correspondant sur un support physique quelconque tel que disque dur ou disque optique. The choice of the resolution of the photographs, that is to say the density of pixels per unit area of the images, is free and remains at the discretion of the operator but is of course of great importance for the quality of treatment photos. Preferably, in the context of the method of the invention, a resolution of at least 72 pixels per inch (dpi) and preferably 96 dpi will be chosen. It is of course possible to increase this resolution to refine the quality of the photographs without disturbing the analysis. The variation of the resolution has the effect of modifying the number of photos to be made to treat a constant number of spores (from 20 to 50 per photo). Like the resolution, the size of the image (Height and Width) does not influence the processing by the software. It is best to leave these two default settings for the camera to save time. In order to allow the calculation of the total area S of the spores and the corresponding virtual radius r as well as the length L of the mycelium in μm while the analysis of the photographs is done pixel by pixel, the processing software implementing the method of the invention automatically converts to pm from the resolution values of the photographs and the objective and magnification of the microscope. These parameters must be recorded in the software before the processing of the photographs for the calculation of the ratio R. The calculation of the ratio R, as well as the average ratio R ', is automatic once the images have been processed. However, particular attention will be paid to the average ratio values R ', which makes it possible to reduce the possible artifact effects in the individual analysis of each of the photos taken. In fact, depending on the resistance or sensitivity of the strain treated with the biocide used, the spores germinate at variable speeds and consequently the size of the mycelium differs. For the same incubation time, the mycelium of the control (box without biocide) overlaps and masks the presence of spores. The software sometimes considers the intersecting areas of several mycelia as surfaces and so counts them as spores. This problem is an artifact for the software which makes the calculated spore count not always exploitable. This artifact also makes the calculation with the naked eye sometimes difficult (confusion between the spore and the mycelia). The size and shape of its areas are similar to that of spores so gives a surface value close to that of spores. The multiplication of photographs on three distinct fields for each mold culture studied and each control culture makes it possible to smooth and weight this risk of artefact by calculating average values R '. An example of a particular application of the process of the invention will now be described for a specific strain of mold Botrytis cinerea. Botrytis cinerea (imperfect form of the telemorph Botryotinia fucke / fana) is the causal agent of gray rot on more than 200 host plants. Described as polyphagous, Botrytis cinerea is actually a complex of species in which distinct populations could be adapted to different hosts. It is one of the main pathogenic fungi in the vineyard, leading to significant losses for agriculture in France and Europe. The spores or conidia of Botrytis cinerea are sub-oval and are a good example of the practical implementation of the method of the invention. The strains to be tested are cultured on MEAC medium which contains 20 g of malt, 1 g of peptone, 20 g of glucose and 0.5 g of chloramphenicol for a period of 7 days (preculture). The culture medium for the fungicide tests is prepared as follows: Yeast extract (20.0 f 0.1) Bactopeptone (20.0 t 0.1) Sodium acetate (2.0 t 0.1) g Agar (12.5 f 0.1) g Distilled water QSP (1.00 t 0.01) L Shake with a magnetized bar and autoclave (30 t 1) min at (110 ± 1) ° C After autoclaving, allow the medium to cool to about 50 ° C in a water bath and then sterilely add the biocide - Poured medium 55: (4 t 0.1) ml per box The spore suspension at 2.105 CFU / ml is spread homogeneously on the test and control boxes, this suspension is obtained from the preculture. The spores are suspended in a diluent (Tryptone ig / I, NaCl 0.5 g / l, Tween 80 iml / I and water 1 liter)). Spore spraying is carried out under a microbiological safety station (PSM). The media are autoclaved at 110 ° C for 30 min and then placed in a water bath at 50 ° C to bring them to this temperature before adding the corresponding biocide. The biocides shown in Table 1 below are added. Table 1 Biocides Abbreviations Test concentration Preparation of Pyrimethanil Pyr mother solution 1 mg / l 504 μl in 100 ml of water. 37.4 250 μl of this solution at% v / v of MA are added 500 ml of Tebuconazole Teb 0.7 mg / I 193 mg culture medium in 100 ml of water. 25.9% w / w of 700 μL of this solution are added to MA 500 ml of Fluodioxonil Flu 0.125 mg / l 30 mg culture medium in 100 ml of water. 50% w / w AM 416 μl of this solution is added to 500 ml of Boscalid Bos 3 mg / I 200 mg culture medium in 100 ml of water. 50% w / w AM 1.5 ml of this solution is added to 500 ml of culture medium With MA = active material After 24 hours of incubation, at least three digital photographs, preferably 6 less under microscope, x5 magnification, cultures made for the Boscalid biocide (Bos). The corresponding files are then recorded on any physical medium such as hard disk or optical disk.

Au bout de 48H, on fait de même pour les autres biocides: Pyriméthanil (Pyr), Tebuconazole (Teb), Fluodioxonil (Flu) et Tolnaftate (Toi). On enregistre également ces fichiers. After 48 hours, the same is done for the other biocides: Pyrimethanil (Pyr), Tebuconazole (Teb), Fluodioxonil (Flu) and Tolnaftate (Toi). These files are also saved.

Les photographies obtenues sont analogues aux figures 1A à ID. Comme il ressort de ces figures, on peut constater une croissance différente des spores de moisissures sur chaque photographie, caractéristique d'une résistance différente de Botrytis cinerea aux différents fongicides testés. The photographs obtained are similar to FIGS. 1A to ID. As can be seen from these figures, there is a different growth of mold spores in each photograph, characteristic of a different resistance of Botrytis cinerea to the different fungicides tested.

Les photos préalablement enregistrées sont ensuite chargées dans le logiciel informatique de traitement mettant en oeuvre le procédé de l'invention. On renseigne ensuite dans le logiciel, l'objectif et le grossissement du microscope utilisés pour la prise d'images. Une fois ces paramètres enregistrés on lance le traitement d'image pour le calcul de la surface S et la longueur L. Un fichier texte est généré et affiche les résultats sous forme de la surface S et de la longueur L pour chaque photo. Le calcul de R pour chacune des photos prises pour chaque culture se fait avec toute application informatique de calcul (tableur par exemple), puis le calcul du rapport R' moyen obtenus à partir des photos prises pour chacune des cultures est calculé. Le pourcentage par rapport à la culture témoin sans biocide est alors calculé à partir de ces données. Les résultats sont affichés sous forme d'un histogramme tel que représenté à la figure 4. L'interprétation des résultats se fait directement par une simple lecture de l'histogramme pour identifier les souches sauvages et les souches résistantes aux différents biocides en tenant compte des seuils prédéfinis en avance. Des souches référencées en tant que résistantes aux fongicides étudiés ont été utilisées comme référence dans des laboratoires spécialisés. Une base de données des rapports R obtenus conformément au procédé de l'invention a été ensuite créée pour sélectionner le seuil en pourcentage d'élongation dans chaque cas. Chaque biocide a un seuil en pourcentage de taux d'élongation des tubes germinatifs à partir duquel la souche est déclarée résistante Pour Bos, seuil = 50%, Pour Pyr, seuil = 85% Pour Teb, seuil = 70% Pour Flu, seuil = 60% Dans l'exemple représenté sur la figure 4, les souches 607 et 621 sont résistantes au Pyriméthanil, la souche T263 est résistante au Fludioxonil et au Tebuconazole. Les souches 607 et 621 sont résistantes au Pyriméthanil, la souche T263 est résistante au Fludioxonil, les souches 614 et 626 sont résistantes au Tebuconazole et les souches 619 et 626 sont résistantes au Boscalid. Les souches 604, 605, 606, 608, 613, 617, 618, 622, 623, 624, 625 et 628 sont sensibles aux 4 biocides, c'est-à-dire sont limitées dans leur croissance en présence de ces biocides. Le procédé de l'invention permet donc la qualification rapide et automatique de la résistance d'une souche de moisissure à un ou plusieurs biocides sans requérir d'expérimentation complexe ni une durée excessive d'analyse additionnelle à la culture des souches de moisissures. The previously recorded photos are then loaded into the computer processing software implementing the method of the invention. We then inform in the software, the objective and the magnification of the microscope used for taking pictures. Once these parameters have been saved, the image processing is started for the calculation of the surface S and the length L. A text file is generated and displays the results in the form of the surface S and the length L for each photo. The calculation of R for each of the photos taken for each crop is done with any calculation computer application (spreadsheet for example), then the calculation of the average ratio R 'obtained from the photos taken for each crop is calculated. The percentage relative to the control culture without biocide is then calculated from these data. The results are displayed in the form of a histogram as shown in Figure 4. The interpretation of the results is done directly by a simple reading of the histogram to identify wild strains and strains resistant to different biocides taking into account the results. predefined thresholds in advance. Strains referenced as resistant to the fungicides studied have been used as reference in specialized laboratories. A database of the ratios R obtained according to the method of the invention was then created to select the percentage threshold of elongation in each case. Each biocide has a threshold in percentage of elongation rate of the germ tubes from which the strain is declared resistant For Bos, threshold = 50%, For Pyr, threshold = 85% For Teb, threshold = 70% For Flu, threshold = 60% In the example shown in FIG. 4, strains 607 and 621 are resistant to pyrimethanil, strain T263 is resistant to Fludioxonil and Tebuconazole. Strains 607 and 621 are resistant to pyrimethanil, strain T263 is resistant to Fludioxonil, strains 614 and 626 are resistant to Tebuconazole and strains 619 and 626 are resistant to Boscalid. The strains 604, 605, 606, 608, 613, 617, 618, 622, 623, 624, 625 and 628 are sensitive to the biocides, i.e. are limited in their growth in the presence of these biocides. The method of the invention therefore allows rapid and automatic qualification of the resistance of a mold strain to one or more biocides without requiring complex experimentation or excessive duration of additional analysis to the culture of mold strains.

Claims

CLAIMS1 - Method for studying the effect of at least one biocide on a mold strain, in which: - a first culture of a determined mold strain is carried out on at least one culture medium for a determined period of time T a second culture of the same mold strain is simultaneously carried out on the same culture medium for the same duration T, in the presence of a determined quantity of at least one biocide and characterized in that: expiry of the culture time T at least one photograph of an area of the same area of the first and second cultures, and - calculating from each photograph by computerized analysis and calculation means the cumulative area total spore count and total cumulative length of germinated spore mycelium, and - all spores are assimilated to a single spore forming a virtual radius disk r that is calculated from the total area e cumulative amount of spores calculated in the previous step, and - a ratio R is calculated between the total length of mycelium and the virtual radius r for each photograph, representative of the elongation rate for the first and second cultures produced, - calculates the percentage of elongation of the second culture with respect to the first culture from the ratios R obtained for each culture.

2 - Process according to claim 1, characterized in that the spores and mycelia of the culture medium are discriminated in the photograph, by colorimetric analysis of each pixel of the photographs according to an RGB colorimetric system and allocation for each pixel of a fixed scalar value, this scalar value being given by a triplet of RGB values in the RGB colorimetric system used. 19

3 - Method according to one of claims 1 to 2, characterized in that we take an integer n of photographs of the first culture and the same whole number of photographs of the second culture and for each photograph is calculated the R ratio, noted Ri, before calculating, for each series of n photographs of each culture, a ratio R 'means such that: R' = ~ n xt n

4 - Process according to one of claims 1 to 3, characterized in that the photographs are carried out after a period T between 4 and 48h depending on the biocide tested and the strain of mold grown.

5 - Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the photographs have a resolution of at least 72 pixels per unit of image width (dpi).

6 - Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the photographs are performed under optical microscopy with a magnification of at least 500%. 20

7 - Process according to one of claims 1 to 6, characterized in that the first and second cultures are made from a calibrated solution of spores of the mold strain considered.

8 - Process according to claim 7, characterized in that the concentration of the calibrated solution is chosen so as to obtain from 20 to 50 spores per photograph.

9 - Process according to claim 7 or 8, characterized in that the concentration of the calibrated solution is 2.105 spores per ml spread homogeneously on identical petri dishes. 30

10 - Method according to one of the preceding claims, characterized in that the percentage of elongation obtained is compared with a threshold value determined for the biocide considered with reference strains of the same species, which allows to classify the strain of mold tested as resistant or non-resistant to the biocide considered.

11 - Process according to claim 10 characterized in that the reference strains comprise at least 3 reference strains known to be resistant to the biocide in question and at least one reference strain known to be sensitive to the biocide considered.