FR2971850A1 - Tests cellulaires multistress et methode non invasive d'evaluation du stress au niveau de la peau - Google Patents

Abstract

Méthode d'analyse de la résistance à un multistress d'au moins une cellule animale ou végétale, caractérisée par le fait que : (a) l'on soumet ladite cellule ou ledit échantillon, simultanément ou séquentiellement, à un ensemble d'effecteurs anti-stress ou stressants (b) puis on mesure la croissance et/ou la viabilité cellulaire et/ou le stress oxydatif pour mesurer l'indice de résistance des cellules auxdits effecteurs défini comme l'effet desdits effecteurs sur la croissance et/ou leur mort desdites cellules et/ou le stress oxydatif (ou) et (c) l'on compare ces résultats avec une mesure identique de la croissance ou de la viabilité cellulaire du même type de cellule dudit patient qui n'a pas été soumis auxdits effecteurs.

Description

TESTS CELLULAIRES MULTISTRESS ET METHODE NON INVASIVE D'EVALUATION DU STRESS AU NIVEAU DE LA PEAU

La méthode décrite porte sur un test d'évaluation de résistance au stress. Ces tests sont effectués sur des cellules ou des tissus. Ils peuvent être appliqués chez l'homme les animaux et les végétaux comme diagnostic de l'état de protection anti stress. Ces tests peuvent servir d'une part de diagnostic pour différentes pathologies liées au stress et à d'autre part à mesurer la protection conférée par des produits ou traitements. Cette méthode permet d'évaluer l'impact au niveau de différents tissus de facteurs stressants ou destressants appliqués à l'organisme entier comme par exemple la pollution, l'infection, le tabagisme, l'exposition à des rayonnements, le stress psychologique l'application sur la peau ou l'ingestion de différentes substances.

Tout être vivant a besoin pour vivre/survivre de pouvoir résister ou être insensible à diverses agressions. La capacité à résister ou à se développer mieux que les autres dans des conditions d'agression confère un avantage sélectif et peut être considéré comme un marqueur prédictif d'une meilleure productivité et/ou santé.

Les méthodes d'évaluation de résistance au stress actuellement développées ne mesurent qu'un seul stress appliqué. Ces méthodes, comme cela est démontré ci-dessous donnent des résultats différents de ceux obtenus dans un contexte de stress multiple utilisé dans notre méthode. Les résultats obtenus avec les autres méthodes sont plus éloignées des conditions dans l'organisme. Ainsi l'utilisation d'une molécule antioxydante avec des doses ayant un effet important mesuré par ces méthodes peut avoir un effet bien moindre ou négligeable lorsqu'il est mesuré par notre méthode qui est beaucoup plus proche de la réalité physiologique. Ceci peut expliquer les résultats décevants d'essais cliniques sur les effets de molécules antioxydantes basés en fait sur des résultats erronés des tests d'évaluation d'effet-dose des produits.

En effet, les cellules, suite à un stress vont déclencher tout un système de défense qui va leur permettre de mieux résister à un renouvellement de ce stress. Cela peut expliquer le fait que l'impact sur des cellules d'un stress suite à un autre stress ou au même stress est différent. Sachant que les cellules dans les conditions naturelles sont généralement soumises a des stress répétés ou a plusieurs stress, notre méthode donne des mesures correspondant à ces conditions contrairement aux autres méthodes. Donc, les mesures de capacité de défense des cellules et l'impact de différents produits sur celle-ci obtenues par notre méthode seront différentes des autres méthodes et sont plus proches de la réalité physiologique.

Cette méthode permet d'évaluer chez un individu, un animal ou un végétal, à partir d'une ou plusieurs de ses cellules ou de ses liquides physiologiques placés en présence de cellules, l'efficacité in vitro de molécules ou autres effecteurs agissants sur la résistance au stress. Cette méthode permet l'évaluation in vitro des effecteurs antistress ou stressants sur les cellules d'un individu soit après la prise de ces effecteurs par l'individu soit en ajoutant directement ces effecteurs sur les cellules.

Description de la méthode : La ou les cellules sont soumises à un ensemble de stress puis traitées pour évaluer l'effet de ces stress sur leur 20 métabolisme, leur croissance et/ou leur mort. Les stress de nature physique, chimique, mécanique ou biologique pourront être appliqués ensemble ou séquentiellement. La croissance et/ou la viabilité cellulaire pourra être 25 mesurée de diverses façons : Soit directement par des méthodes de mesures spectroscopiques de réfraction, diffraction, absorption, les différences observées pouvant être dues à des changements de morphologie, de taille ou au relargage de 30 molécules dans le milieu. Soit par la quantification de différents marqueurs de la viabilité, de la croissance et de la mort cellulaire. Ces marqueurs pouvant être une activité enzymatique comme dans le cas des tests MTT, une expression et/ou quantification 35 d'une ou plusieurs protéines spécifiques d'un état de la cellule comme la p53. L'expression de ces protéines marqueurs peut être quantifiée au niveau des gènes (ADN) ou de leur (ARN) par diverses techniques comme la PCR ou le gène array, les protéines produites pouvant être mesurées 40 par des techniques biochimiques, biophysiques, immunologiques ou protéomiques. Ces marqueurs pouvant aussi être la régulation de ROS quantifiable par diverses activités enzymatiques ou via des sondes, un exemple étant les sondes DHR 123 qui, modifiées par les ROS vont acquérir 45 la capacité de fluorescer. Cette méthode de mesure va donner un indice de résistance des cellules par rapport à un ensemble de stress. Les stress à appliquer seront établis plus précisément pour obtenir un meilleur écart entre tissus pathologiques et 50 tissus sain pour que les mesures obtenues lors de leur application sur un tissu de patient aient une valeur diagnostic par rapport à des pathologies et puissent être prédictifs d'une évolution. Ces tests seront alors utilisés pour rechercher des agents interférents avec ses pathologies (vérification de l'effet de produits ou plantes déjà connues et découverte de nouvelles drogues, ou de nouvelles habitudes de vie). Ces stress seront aussi établis pour caractériser une résistance corrélée avec certains habitudes ou certains états comme le tabagisme, le sport et la vieillesse. Dans ce cas, ces tests diagnostics seront aussi utilisés pour rechercher des agents capables de modifier in vitro la résistance des cellules dans ces mêmes conditions de stress et d'évaluer l'effet de diverses substances , habitudes ou comportements alimentaires sur la résistance des cellules.

Application au niveau de la peau par une nouvelle méthode utilisant un support adhésif.

L'invention a trait à l'utilisation de spectroscopie à partir d'un prélèvement cutané non invasif pour évaluer l'état de stress oxydant de la peau. Ceci permet de mesurer l'impact au niveau de la peau sur le stress oxydatif de l'exposition des personnes à différents stress comme la pollution ou l'irradiation. Cette invention permet d'évaluer l'efficacité de traitements sur le stress oxydant notamment mesurer l'effet de produits cosmétiques antioxydants. Cette invention concerne aussi l'aide au diagnostic, au pronostic au suivi -thérapeutique des patients atteins de maladies liées au stress oxydant. L'invention concerne plus particulièrement une méthode d'analyse d'un échantillon des couches supérieures de l'épiderme.

Les méthodes à ce jour utilisant un adhésif appliqué sur la peau permettent d'identifier la présence ou l'absence de certains marqueurs reliés à des pathologies. Ces méthodes procèdent de trois étapes : l'application et le retrait de l'adhésif, le traitement des adhésifs afin de récupérer les molécules à étudier puis un traitement complexe et délicat des échantillons. L'étape de traitement de l'adhésif nécessite des actions drastiques à l'aide de moyens physicochimiques comme un premier traitement chimique et/ou enzymatique et biophysique (ultrasons). L'étape de récupération et d'analyse des échantillons est encore plus longue, délicate et coûteuse. En effet, elle nécessite soit dans le cas de matériel génomique d'une étape de purification puis une étape complexe d'amplification puis d'analyse(RT-PCR) soit dans le cas de matériel protéique ou 50 autres molécules d'une à plusieurs étapes de purification (gel filtration, électrophorèses) puis une étape complexe de mesure et analyse (RMN, Spectrométrie de masse). Enfin on peut remarquer que les méthodes d'analyse de protéines vont nécessiter une quantité importante de matériel au départ pour réaliser avec succès les étapes de purifications. Ceci implique dans le protocole l'utilisation de plusieurs prélèvements par adhésifs et/ou plusieurs adhésifs pour une seule mesure. Ainsi ces méthodes sont longues coûteuses en outre, elles vont nécessiter la mesure et l'analyse de marqueurs en parallèle avec la molécule étudiée. On peut remarquer de plus que le fait de procéder à plusieurs étapes différentes augmente le risque de perte différentielle de matériel d'intérêt et d'avoir des erreurs donc rend la méthode délicate à mettre en couvre. La présente invention se propose de résoudre ces inconvénients de l'état de la technique en présentant une nouvelle méthode fiable, rapide et non-invasive de mesure du stress oxydant in vivo caractérisée en ce que a) On prélève un échantillon cutané contenant du matériel biologique, par application sur la peau dudit patient d'une couche d'adhésif, puis par retrait dudit adhésif. b) On place l'adhésif dans une solution contenant le réactif diffusible, on incube puis on mesure la quantité de réactif modifié dans cette solution.

Selon la méthode de l'invention , au moins un échantillon de peau, en particulier la couche supérieure de l'épiderme (le stratum cornéum)est prélevé sur un patient. En fonction du but de l'étude ce prélèvement sera sur une zone protégée (pour tests de pathologie) ou sur une zone exposée (tests 30 de protection antioxydante). Le prélèvement est effectué par l'application et le retrait d'un adhésif. Cet adhésif peut être avantageusement constitué d'une bande de plastique souple de préférence pliable de manière à pouvoir s'adapter au mieux aux 35 contours et à l'élasticité de la partie du corps sur laquelle il est appliqué ce qui favorise l'obtention d'un échantillon de peau , et plus particulièrement de stratum cornéum aussi complet que possible . Un tel support peut être constitué par exemple d'un film plastique. Par exemple 40 cet adhésif peut être des pastilles de type D-squamesT`" , SebutapeT`", BlenddermT`" ScotchTapeT`" CornéofixT`" ou bien des hydrogels comme ceux du type HypanT`" ou tout autres types de matériaux ayant des propriétés adhésives comme les colles, le gommes et les résines. 45 Les exemples 6 à 8 montrent une partie des usages possibles de l'invention comme l' évaluation de l' effet d' un produit protecteur de stress formulé de différentes façons et la mesure de l'état de stress de la peau suite à l'application d'un stress externe.

Description détaillée de tests : Exemples portant 1) sur les deux types de cellules retrouvées dans l'organisme : des cellules humaines se multipliant séparément en suspension (lymphocytes), ou se multipliant sur des supports et en contact (cellules épithéliales) 2) sur un ensemble de cellules différentes entrant dans la composition d'un tissu (sang total = hématies + lymphocytes, monocytes etc...) 3) Sur les cellules de la peau 4) Sur les cellules de la peau avec effet de stress environnemental sur l'organisme EXEMPLE 1 : Test pour l'évaluation de l'effet d'ajout de vitamines sur la résistance des lymphocytes humains.

Des lymphocytes humains sont rincés avec du tampon classique au phosphate (PBS) puis sont resuspendus à une concentration de 5 105 oeil / ml dans du milieu RPMI contenant ou non (témoin cellules sans vitamines) différentes vitamines (Vit E et Vit C) à des concentrations finales de 10 pM et de l'arsenic à une concentration finale de 50pM (stressl). On applique alors un choc thermique à 56°C 5 minutes (stress2) et on incube ensuite à 37°C pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite traitées au MTT et l'absorption (DO à 450 nm moins DO 595nm) des surnageants de cultures est mesurée dans un spectrophotomètre.

Les mesures sont alors comparées de la façon suivante : Action de Vit C = (valeur DO des cellules sans vitamines - valeur de DO des cellules avec vit C) / valeur des cellules sans vitamine. Ces rapports donnent un indice de multiplication/viabilité cellulaire entre les culture non traitées et traitées qui sera positif si le traitement augmente la multiplication cellulaire et négatif à l'inverse. Pour chaque vitamines et l'ensemble des deux vitamines, les valeurs sont présentées dans la figure 1 où l'on peut observer que dans nos conditions de stress un apport supplémentaire de vitamine E ne va pas protéger les cellules (indice inférieur à 0)contrairement à un apport de vitamine C indice supérieur à 0)50 EXEMPLE 2 Test pour l'évaluation de l'effet d'ajout de vitamines sur la résistance des cellules épithélialles humaines.

10 Test pour des cellules épithéliales humaines HeLa Des cellules épithéliales humaines sont cultivées dans des plaques de cultures 24 puits en présence de milieu de culture classique (DMEM) et de 10% de sérum de veau foetal à 37°C et 5% CO2. A 80% de confluence on rince les cellules, 15 on ajoute ou non (témoin cellules sans vitamines) différentes vitamines (Vit E, Vit C ou Vit E + Vit C) à des concentrations finales de 10 uM et de l'arsenic à une concentration finale de 50pM (stressl). On applique alors un choc thermique à 56°C 5 minutes (stress2) et on incube 20 ensuite à 37°C pendant lheure. Les cellules sont ensuite traitées au MTT et l'absorption (DO à 450 nm moins DO 595nm) des surnageants de cultures est mesurée dans un spectrophotomètre. Les mesures sont alors comparées de la façon suivante : 25 Action de Vit C = (valeur DO des cellules sans vitamines - valeur de DO des cellules avec vit C) / valeur des cellules sans vitamine Pour chaque vitamines et l'ensemble des deux vitamines, les valeurs sont présentées dans la Figure 2 où l'on peut 30 observer que dans nos conditions de stress un apport supplémentaire de vitamine E ne va pas protéger les cellules contrairement à un apport de vitamine C et que l'effet de la vitamine E sera contre balancé positivement par un apport de même quantité de vitamine C. 35

EXEMPLE 3 Test pour l'évaluation de l'effet d'ajout de vitamines sur la résistance des cellules du sang total de cheval. 40

Des globules rouges de cheval sont répartis dans des plaques de culture de 96 puits en présence de concentrations variables de vitamine C et d'arsenic à une 45 concentration finale de 50pM (stressl). On applique alors un choc thermique à 56°C 5 minutes (stress2) et on incube ensuite à 37°C pendant 1 heure. Les valeurs d'absorptions sont comparées entre les témoins non traités et les puits traités. Les valeurs sont reportées dans la figure 3 où 65 l'on observe une protection conférée par la vitamine C de façon dose-dépendante. EXEMPLE 4 Test pour l'évaluation de l'effet de multiples stress sur la résistance des lymphocytes humains en culture.

10 Des lymphocytes humains cellules Jurkat sont resuspendus à une concentration de 5 105 oeil / ml dans du milieu RPMI. Les cellules sont soumises de façon successive à différents stress de différentes intensités et de différentes natures. Les résultats sont comparés à ceux obtenus suite à 15 l'application d'un seul stress. Les stress utilisés sont l'ajout de différentes concentrations d'éthanol et d'eau oxygénée. La mesure de l'effet de ces stress est obtenue par la mesure de la production de radicaux libres grâce à une sonde, la DHR123 20 qui va être modifiée par les radicaux libres en rhodamine 123 capable, contrairement à la DHR123 de fluorescer. Ainsi, la fluorescence est proportionnelle à la quantité de radicaux libres générés et l'on notera cette mesure QS pour Quantité de Stress 25 Après traitement et incubation les milieux respectifs sont transférés dans une plaque 96 puits a raison de 200 pl par puits et placés dans un fluorimètre. La fluorescence est alors mesurée en utilisant les longueurs d'ondes d'émission 30 et réception respectives de 485 nm et 535 nm.

Les résultats montrent que si l'on utilise l'éthanol (noté OH ou OH pour une concentration double de ;420H) (expérience 35 1 Figure 4) ou l'eau oxygénée (noté noté H2o2 ou H2O2 pour une concentration double de H2O2)(expérience 2 Figure 4), la succession de deux stress d'intensité i à des temps to et tl ne génère pas la même production de radicaux libres que l'application d'un stress égal à la somme de ces 40 stress (2i) à to ou à tl. De plus on vérifie que l'application d'un stress d'intensité i à un temps donné est différent de l'application d'un seul stress d'intensité 2i à ce même temps qu'il soit au début to ou après une heure tl. 45 De plus on obtient une différence de génération de radicaux libres si le même stress (qu'il soit H2O2 ou Ethanol) est appliqué à la suite d'un stress différent (H2O2 versus Ethanol) (Expériences 3 et 4 Figure 4). 50 EXEMPLE 5 Test pour l'évaluation de l'effet de multiples stress sur des cellules de la peau humaine.

Des cornéofix sont appliqués sur la peau puis immergés dans 2 ml de RPMI contenant 5 pM de DHR123. Au temps 0 sont ajoutés 250 pl d'éthanol 96% (OH) ou 250pl d'eau. Au temps tl= 30 minutes sont ajoutés (H2O2)ou non (-) 50 pl d'H2O2 pour obtenir une concentration finale de 2mM H2O2. Les milieux respectifs sont ensuite transférés dans une plaque 96 puits a raison de 200 pl par puits et placés dans un fluorimètre. La fluorescence est alors mesurée en utilisant les longueurs d'ondes d'émission et réception respectives de 485 nm et 535 nm.La fluorescence est proportionnelle à la quantité de radicaux libres générés et l'on notera cette mesure QS pour Quantité de Stress

Les résultats sont présentés dans la figure 5 où l'on remarque qu'à l'instar des résultats obtenus avec les lymphocytes en culture, l'application d'un stress préalable (OH) au stress H2O2 va entraîner une réaction protectrice des cellules de la peau et diminuer le nombre de radicaux libres libérés donc la quantité de stress.

EXEMPLE 6 Test pour l'évaluation de l'effet de multiples stress sur des cellules de la peau humaine en présence de produit protecteur de stress.

Trois crèmes a formulation pharmaceutique industrielle sont confectionnées contenant 0 0,5 % et 2 % de vitamine C Cutina CBS-V : 2.10% Huile de vaseline : 28.50% Méthyl paraben sodé : 0.18% Propyl paraben sodé : 0.02% 45 Les crèmes sont étalées sur la peau de cinq volontaires à raison de 2mg/cm2. Après 30 minutes d'absorption des cornéofix sont appliqués sur les différentes zones traitées ou non et sont mis en présence de 2 ml de milieu RPMI contenant 5 pM. Au temps 0 sont ajoutés 250 pl d'éthanol 50 96% (OH) ou 250pl d'eau. Au temps tl= 30 minutes sont Composition des crèmes : 35 Alcool cétylique : 3.80% Eumulgin (alcool cétostéarylique) : 2.00% 40 Triéthanolamine : 0.01% Actif : ascorbate de sodium (0 0,5 % ou 2 %) Eau : QSP 100.00% ajoutés (H2O2)ou non (-) 50 pl d'H2O2 pour obtenir une concentration finale de 2mM H2O2. Au temps t3 les milieux respectifs sont transférés dans une plaque 96 puits a raison de 200pl par puits et placés dans un fluorimètre. La fluorescence est alors mesurée en utilisant les longueurs d'ondes d'émission et réception respectives de 485 nm et 535 nm. Les résultats sont présentés dans la figure 6 ou l'on observe cchez trois sujets une diminution des ROS produites de façon dose- dépendante en fonction de la quantité de vitamine c appliquée.

La différence des quantités de radicaux libres produites en absence et présence d'éthanol dans les conditions contrôle {crème 0% vitc) donne une quantité produite par l'induction du stress. Quand on compare cette valeur de base aux valeurs obtenues en présence de vit C on obtient des pourcentages d'inhibition de l'induction de ROS présentés dans le tableau ci dessous.

Concentration PA en % 0 0,5 2 Sujet 1 0 - 63 Sujet 2 0 42 64 Sujet 3 0 ' 100 >100 Données comparées au contrôle 0% de PA (Vit C) qui n'est 25 pas inhibé : % age d'inhibition = 0

EXEMPLE 7 Effet de l'addition de stress sur les propriétés 30 protectrices d'un produit sur la peau.

Trois crèmes à formulation pharmaceutiques magistrales sont confectionnées contenant 0 %, 0,5 % et 2 % de vitamine C. Formulation à base d'Excipial Lipolotion, une émulsion E/H 35 (lipides 36%, eau 61%).

Les crèmes sont étalées sur la peau à raison de 2mg/cm2. Après 30 minutes d'absorption des cornéofix sont appliqués 40 sur les différentes zones traitées ou non et sont mis en présence de 2 ml de milieu RPMI contenant 5 pM. Au temps 0 sont ajoutés 250 pl d' éthanol 96% (OH) ou 250pl d'eau. Au temps tl= 30 minutes 4 x 200pl sont prélevés et placés dans une plaque 96 puits. Ensuite sont ajoutés (H2O2)ou non (-) 50 pl d'H2O2 pour obtenir une concentration finale de 2mM H2O2.

Afin de déterminer l'impact éventuel des différentes couches superficielles de la peau, cinq cornéofix ont été déposés et retirés séquentiellement sur la même zone. Les résultats obtenus étaient simmilaires avec un écart de + ou - 3 ° o.

Comme attendu la crème contenant 2% de vitamine c va avoir un effet protecteur. Lorsque l'on applique un stress, on va augmenter la production de ROS. On peut comparer la production de ROS lors de l'application d'un stress. Ce stress va entrainer une augmentation de production de ROS que l'on exprime en pourcentage par rapport au 100 % correspondant à la zone non stressée. Ainsi dans le tableau ci-dessous sont mesurées ces augmentations provoquées par un même stress sur une zone traitée et une zone non traitée.

Dans le tableau on observe que l'application d'un seul stress (OH)(première ligne) va générer plus de ROS (140%)que l'application de deux stress(H2O2)(deuxième ligne) dont un équivalant au stress ligne 1. En fait l'application du premier stress va déclencher un mécanisme de défense au niveau de la peau qui permettra de diminuer l'effet du premier stress. Dans ces deux cas de figure on observe que la protection conférée par la vitamine c 2% n'est plus la même. En effet, les données dans le tableau ci-dessous montrent que l'inhibition produite par la vit C 2% est différente lorsque l'on a 2 stress (57% Stress augmentation des ROS Augmentation des ROS % age d'inhibition appliqué zone témoin non traité Zone traitée avec 2% vitC d'inhibition) au lieu d'un stress (70% d'inhibition) % OH 140% 112 % 70% OH +H2O2 120 % 108 % 57 EXEMPLE 8

L'établissement de tests in vivo tenant compte de stress 45 multiple est tout à fait primordial pour établir la réelle protection conférée par un produit ce qui a été montré dans40 l'exemple 7. Ce dernier exemple atteste que les tests de notre invention de mesure du stress sur la peau représentent sont sensibles à des stress appliqués in vivo au préalable du prélèvement par les cornéofix. Dans cette expérience sur chaque avant bras sont délimitées deux zones où sont appliquées à raison de 2mg/cm2 respectivement une crème 0 % vit c et une crème 2% vit C décrites dans l'exemple 7. Après une heure, un avant-bras (zone témoin)est couvert par des vêtements et l'autre est exposé à une température de 10°C pendant 20 minutes puis placé à 22 °C pendant 10 minutes. Des corneofix sont appliqués et les productions de ROS sont établies par mesure de fluorescence selon la méthode décrite précédemment. Les résultats dans la figure 8 montre que la vit c 2% à conféré une protection et que la quantité de ROS produite par les deux avants bras est différente, le choc thermique appliqué sur l'avant bras a généré un stress quantifiable (et significativement différent du bras témoin) par la méthode de notre invention. De plus on a pu évaluer la protection conférée par la vit c 2% vis-à-vis de ce stress. 30 35 40 45 50

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Méthode d'analyse de la résistance à un multistress d'au moins une cellule animale ou végétale, 5 caractérisée par le fait que : (a) l'on soumet ladite cellule ou ledit échantillon, simultanément ou séquentiellement, à un ensemble d'effecteurs anti-stress ou stressants (b) puis on mesure la croissance et/ou la viabilité 10 cellulaire et/ou le stress oxydatif pour mesurer l'indice de résistance des cellules auxdits effecteurs défini comme l'effet desdits effecteurs sur la croissance et/ou leur mort desdites cellules et/ou le stress oxydatif (ou) et (c)l'on compare ces résultats avec une mesure identique de 15 la croissance ou de la viabilité cellulaire du même type de cellule dudit patient qui n'a pas été soumis auxdits effecteurs.
2. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite cellule est saine ou 20 différente d'une cellule saine, notamment cancéreuse.
3. 3. Méthode se selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que ladite cellule est un lymphocyte, ou une cellule épithéliale, un cornéocyte, ou un hématocyte. 25
4. 4. Méthode se selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que lesdits effecteurs sont des vitamines, de préférence la vitamine E et la vitamine C, de l'arsenic, un choc thermique comprenant l'application d'une température comprise entre 30 4°C et 75 °C ,de l'éthanol , de l'eau oxygénée ou une combinaison de ces effecteurs.
5. 5. Méthode se selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la mesure de l'indice de résistance comprend un traitement MTT et/ou une 16mesure du métabolisme comme par exemple la génération de ROS. Cet indice correspond la mesure de l'état de stress oxydant de ladite au moins une cellule.
6. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que ladite au moins une cellule est issue d'un patient ayant subi au moins un des effecteurs stressants suivants : (1) exposition prolongée au soleil, (2) exposition aux radiations (3) contacts avec des agents cancérigènes, notamment l'amiante, (4) tabagisme (5) prise de médicaments, (6)pilule contraceptive (7) pratique trop intense ou mal gérée d'un sport (8) consommation excessive d'alcool (9) stress intellectuel (10) stress thermique (11) ozonothérapie (12) pollution (13) agents infectieux.
7. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la mesure de la croissance ou de la viabilité cellulaire est effectuée directement par des méthodes de mesures spectroscopiques de réfraction, diffraction, absorption ou par la quantification de différents marqueurs de la viabilité, de la croissance et de la mort cellulaire choisis parmi le groupe comprenant. tests MTT, une expression et/ou quantification d'une ou plusieurs protéines spécifiques d'un état de la cellule comme la p53, l'expression différentielle d'enzymes impliquées dans le métabolisme cellulaire et l'expression d'espèces réactives oxygénées ; l'expression de ces protéines marqueurs peut être quantifiée au niveau des gènes (ADN) ou de leur (ARN) par diverses techniques comme la PCR ou le gène array, les protéines produites pouvant être mesurées par des techniques biochimiques, biophysiques, immunologiques ou protéomiques. Des tests utilisant des sondes par exemplecomme la sonde fluorescente D 8123 mesurant la quantité de ROS produite pourront aussi être utilisés.
8. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que : a)on prélève un échantillon cutané contenant du matériel biologique ayant subi ou non un/des stress. Ce prélèvement est effectué par l'application sur la peau dudit patient d'une couche d'adhesif puis retrait dudit adhésif. b)on incube l'adhésif dans une solution contenant une sonde réactive au stress diffusible dans les milieux et cellules comme par exemple la DHR123. c)on quantifie la sonde ayant réagit dans la solution qui est proportionnelle au stress subi par l'échantillon de peau. Cette mesure est réalisée par différentes méthodes de l'homme de l'art comme par exemple la spectrofluorimétrie. 20
9. 9. Utilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1-5 pour identifier une carence ou les mécanismes de défense naturelle dans ladite au moins une cellule ainsi que les effecteurs non stressants, de préférence choisis parmi les vitamines ou 25 médicaments qui, chez un patient donné, augmenteront la résistance de ses tissus aux effecteurs stressants.
10. 10. kit d'aide à l'évaluation de la résistance globale d'une cellule aux différents stress pouvant affecter ladite cellule, caractérisé en ce qu'il comprend 30 les solutions et consommables nécessaires à la réalisation du test. 10 15