FR2970262A1 - Methode de criblage de composes antituberculeux, souche de mycobacterium tuberculosis attenuee et vaccin antituberculeux - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à une méthode de criblage de composés inhibant ou ralentissant la croissance de bactéries du genre Mycobacterium, et plus particulièrement à une méthode de criblage de composés présentant une activité antituberculeuse. La présente invention concerne également une bactérie du genre Mycobacterium atténuée, notamment une souche de Mycobacterium tuberculosis atténuée, ainsi qu'une composition vaccinale comprenant cette souche.

Description

METHODE DE CRIBLAGE DE COMPOSES ANTITUBERCULEUX, SOUCHE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ATTENUEE ET VACCIN ANTITUBERCULEUX

La présente invention est relative à une méthode de criblage de composés inhibant ou ralentissant la croissance de bactéries du genre Mycobacterium, et plus particulièrement à une méthode de criblage de composés présentant une activité antituberculeuse. La présente invention concerne également une bactérie du genre Mycobacterium atténuée, notamment une souche de Mycobacterium tuberculosis atténuée, ainsi qu'une composition vaccinale comprenant cette bactérie.

Les mycobactéries sont des bacilles aérobies, longs et fins, immobiles, non capsulés et non sporulants. Ces mycobactéries sont dites « acido-alcoolo-résistantes » dans la mesure où leur paroi riche en acides mycoliques retient les colorants même en présence d'acide et d'alcool. Cette particularité permet de les identifier lors d'examen microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen.

Le genre Mycobacterium regroupe de nombreuses espèces bactériennes, dont seules quelques espèces sont des pathogènes stricts pour l'homme. Il s'agit notamment de Mycobacterium tuberculosis (agent de la tuberculose), Mycobacterium africanum (mycobactérie humaine isolée en Afrique tropicale, très proche de Mycobacterium tuberculosis et responsable de tuberculose), Mycobacterium leprae (agent de la lèpre) et Mycobacterium ulcerans (espèce provoquant des ulcères, notamment l'ulcère de Buruli). Certaines mycobactéries animales peuvent occasionnellement provoquer des maladies chez un hôte humain : il s'agit notamment de Mycobacterium bovis qui provoque parfois la tuberculose chez l'homme. Les autres espèces de Mycobacterium sont généralement saprophytes ou commensales, bien qu'elles puissent provoquer des infections opportunistes, notamment chez des personnes immunodéprimées. Parmi ces autres espèces ont citera notamment : Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium parascrofulaceum, Mycobacterium kansasii et Mycobacterium smegmatis. Les infections à mycobactéries les plus courantes chez l'homme sont la tuberculose et la lèpre. Les estimations de TOMS font état d'environ 14 millions de tuberculeux dans le monde en 2009 (prévalence). Les zones les plus touchées par la maladie sont l'Afrique intertropicale, l'Inde, la Chine, l'Asie du sud-est, l'Amérique centrale, l'Amérique du sud, bien que quelques foyers existent encore en Europe. D'autre part, la tuberculose reste un problème majeur de santé publique puisque l'on estime qu'aujourd'hui environ un tiers de la population mondiale est potentiellement porteur de Mycobacterium tuberculosis, et ce malgré l'existence depuis 1919 du vaccin BCG (souche de Mycobacterium bovis vivante atténuée ayant perdu sa virulence par repiquages successifs) et les nombreuses campagnes mondiales de vaccination. De plus, la tuberculose est encore responsable de plus d'un million de décès chaque année dans le monde (1,7 million en 2009 en incluant les cas de coinfection avec le VIH ; 1,3 million en 2009 en excluant les cas de coinfection avec le VIH). En effet le vaccin BCG ne permet pas d'empêcher totalement la transmission de la maladie et d'enrayer l'épidémie mondiale dans la mesure où son efficacité est estimée entre 75 et 850/0 pour les formes graves du nourrisson et du jeune enfant, notamment la méningite et la tuberculose disséminée, et entre 50 et 75 °/O pour la tuberculose de l'adulte. La maladie peut être traitée par antibiothérapie. Cependant, les traitements actuels sont longs (plus de 6 mois) et ont conduit à l'apparition de souches résistantes à un ou plusieurs antibiotiques de première ou de seconde intention. Ainsi, l'efficacité partielle du vaccin BCG, associée à l'émergence de souches de Mycobacterium tuberculosis résistantes aux antibiotiques habituellement utilisés en clinique, expliquent la résurgence de cette maladie. La lèpre est aujourd'hui traitée à l'aide d'une combinaison d'au moins trois antibiotiques afin d'éviter la survenue de résistances aux traitements observées dans le cas de monothérapie. La durée du traitement antibiotique est longue, généralement comprise entre 6 et 24 mois. En outre, aucun traitement prophylactique de type vaccin n'existe à ce jour. Dans ce contexte, afin d'offrir des traitements alternatifs ou complémentaires à ceux existants actuellement, l'identification de nouveaux composés efficaces pour traiter des infections mycobactériennes, en particulier la tuberculose et la lèpre, et plus spécifiquement les formes de ces maladies associées à des souches résistantes aux antibiotiques actuellement disponibles, est essentielle. Le développement de souches de Mycobacterium tuberculosis ou de Mycobacterium bovis atténuées utilisables comme souches vaccinales conférant une meilleure protection que le vaccin BCG est un enjeu majeur dans la lutte contre la tuberculose.

Dans le but d'identifier de nouveaux facteurs de virulence susceptibles de représenter de nouvelles cibles thérapeutiques, des équipes se sont intéressées aux interactions hôte/mycobactérie à l'origine de la survie et de la croissance des mycobactéries intracellulaires. En effet, certaines mycobactéries, en particulier Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae, sont capables d'infecter des macrophages et des cellules dendritiques, entre autres, et de se multiplier au sein de ces cellules. Dans le cas de Mycobacterium tuberculosis, les bacilles tuberculeux sont présents tant à l'intérieur qu'à l'extérieur des macrophages et des cellules dendritiques lors de l'infection. En revanche, Mycobacterium leprae est une bactérie intracellulaire stricte, ce qui explique sans doute que la culture de cette bactérie s'est révélée impossible jusqu'à aujourd'hui sur milieux inertes. Pour survivre et proliférer dans les macrophages et cellules dendritiques, ces mycobactéries intracellulaires ont développé des mécanismes de contournement afin de ne pas être dégradées par ces cellules qui participent à l'immunité innée en tant que défense non-spécifique. Ainsi, une fois phagocytées par les macrophages, ces deux mycobactéries empêchent la fusion du phagosome avec le lysosome, se protégeant ainsi de l'action bactéricide du contenu lysosomial. Les mécanismes responsables de la résistance à la dégradation des mycobactéries intracellulaires et de leur croissance ont fait l'objet de plusieurs études. Une étude a précédemment été menée par l'équipe des inventeurs dans le but d'analyser conjointement le profil de transcription de Mycobacterium tuberculosis lors de l'infection d'un macrophage ou d'une cellule dendritique, et celui des macrophages ou des cellules dendritiques infectées (Tailleux et al., PLoS One, 1, e1403, 2008). Cette étude a montré que lorsque la mycobactérie infecte une cellule dendritique, 1764 gènes mycobactériens sont régulés différemment par rapport à une croissance extracellulaire. De même, 1306 gènes mycobactériens sont régulés différemment lorsque la bactérie infecte un macrophage par rapport à une croissance extracellulaire. Ainsi, plus d'un millier de gènes semblent impliqués dans l'adaptation de Mycobacterium tuberculosis à l'environnement intracellulaire. En outre, cette étude a montré que 153 et 191 gènes étaient surexprimés par Mycobacterium tuberculosis lors de l'infection des macrophages et des cellules dendritiques, respectivement. Récemment, il a été montré que dans le cas de Mycobacterium tuberculosis, le produit du gène ctpV dénommé CtpV (pour « cation-transporting P-type ATPase V »), précédemment décrit comme un transporteur de cations putatif de la famille des ATPase de type P, est une pompe d'efflux capable d'exporter le cuivre de l'intérieur vers l'extérieur de la mycobactérie. Il a également été montré que CtpV joue un rôle essentiel lors de l'infection par Mycobacterium tuberculosis puisque la capacité de multiplication intracellulaire est diminuée lorsque CtpV n'est plus exprimée, réduisant d'autant la virulence de la souche. Ces résultats viennent conforter l'importance des mécanismes d'homéostasie du cuivre dans la virulence bactérienne et la résistance à l'infection, ce qui avait déjà été observé pour d'autres bactéries, notamment Escherichia coli (White et al., J. Biol. Chem., 284(49) : 33949-33956, 2009) et Pseudomonas aeruginosa (Schwan et al., Int. J. Med. Microbiol., 295 :237-242, 2005). Chez Mycobacterium tuberculosis, quatorze gènes (dont ctpV) codant potentiellement pour des pompes d'efflux ont été mis en évidence : il s'agit des gènes ctpA-J, ctpV et kdpA-C qui coderaient respectivement pour des polypeptides CtpA à CtpJ, CtpV et KdpA à KdpC. Cependant, à l'exception du produit du gène ctpV, la fonction et le rôle lors de l'infection des polypeptides codés par les treize autres gènes restent inconnus. Lors de la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques chez les mycobactéries, en particulier chez Mycobacterium tuberculosis, les inventeurs ont identifié un nouveau facteur de virulence : le produit du gène ctpC. Cette protéine membranaire s'est révélée avoir une fonction de pompe d'efflux pour le zinc. Les inventeurs ont notamment montré que ce transporteur permet à la mycobactérie de résister à un mécanisme de défense antimicrobien de l'hôte, inconnu jusqu'ici, faisant intervenir une intoxication intracellulaire par le zinc via l'accumulation de ce métal dans les phagosomes. Ils ont également montré que la pompe CtpC joue un rôle essentiel dans la croissance des Mycobacterium tuberculosis intracellulaires. Ils ont en outre montré qu'une pompe d'efflux CtpC fonctionnelle, c'est-à-dire capable de transporter le zinc de l'intérieur vers l'extérieur de la bactérie, était requise pour que Mycobacterium tuberculosis puisse se multiplier dans le milieu intracellulaire des macrophages et des cellules dendritiques. En outre, les inventeurs ont analysé le transcriptome de la réponse au zinc de Mycobacterium tuberculosis. Ils ont constaté que conjointement à une forte induction du gène ctpC (et du gène Rv3269 codant pour sa protéine chaperon putative), le gène ctpG, ainsi que le gène Rv1993c codant pour la protéine chaperon putative de la protéine CtpG, étaient également fortement activés. Ces résultats suggèrent que le polypeptide CtpG produit du gène ctpG serait également une pompe d'efflux spécifique du zinc, et qu'elle serait impliquée dans la capacité de Mycobacterium tuberculosis à se multiplier dans le milieu intracellulaire des macrophages et des cellules dendritiques. CtpG serait donc également un facteur de virulence et représenterait alors une autre cible thérapeutique chez Mycobacterium tuberculosis. Les inventeurs ont par ailleurs constaté la présence d'une ATPase de type P putative homologue à la pompe d'efflux CtpC de Mycobacterium tuberculosis chez certaines espèces de mycobactéries pathogènes ou opportunistes chez l'homme, notamment chez Mycobacterium ulcerans (91% d'identité avec CtpC de M. tuberculosis), Mycobacterium marinum (91 °/O d'identité avec CtpC de M. tuberculosis), Mycobacterium kansasii (92% d'identité avec CtpC de M. tuberculosis), Mycobacterium avium (900/0 d'identité avec CtpC de M. tuberculosis), Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis (890/0 d'identité avec CtpC de M. tuberculosis), Mycobacterium parascrofulaceum (880/0 d'identité avec CtpC de M. tuberculosis), Mycobacterium leprae (850/0 d'identité avec CtpC de M. tuberculosis), Mycobacterium smegmatis (770/0 d'identité avec CtpC de M. tuberculosis), Mycobacterium bovis (1000/0 d'identité avec CtpC de M. tuberculosis) (cf. Figure 1 présentant un alignement de séquences de CtpC putatives de différentes espèces de mycobactéries et le Tableau ci-dessous). En ce qui concerne CtpG, une ATPase de type P putative homologue à la pompe d'efflux CtpG de Mycobacterium tuberculosis est présente chez certaines bactérie du genre Mycobacterium, notamment chez Mycobacterium bovis (1000/0 d'identité avec CtpG de M. tuberculosis) et Mycobacterium marinum (800/0 d'identité avec CtpG de M. tuberculosis).

Tableau 1 : Identité de séquences entre des CtpC putatives exprimées par différentes espèces de mycobactéries SegA Nom longueur SegB Nom longueur $ d'identité 1 M tuberculosis NP 217787 718 2 M bovis NP 856943 718 100.0 1 M tuberculosis NP 217787 718 3 M marinum YP 001849584 732 91.0 1 M tuberculosis NP 217787 718 4 M kansasii ZP 04751156 706 92.0 1 M tuberculosis NP 217787 718 5 M ulcerans YP 906418 732 91.0 1 M tuberculosis NP 217787 718 6 M avium YP 883376 712 90.0 1 M_ tuberculosis _NP_217787 718 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 89.0 1 M_ tuberculosis _NP_217787 718 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 88.0 1 M_ tuberculosis _NP_217787 718 9 M_leprae_YP_002503209 725 85.0 1 M_ tuberculosis _NP_217787 718 10 M_smegmatis_YP_890280 712 77.0 2 M bovis NP 856943 718 3 M marinum YP 001849584 732 91.0 2 M bovis NP 856943 718 4 M kansasii ZP 04751156 706 92.0 2 M bovis NP 856943 718 5 M ulcerans YP 906418 732 91.0 2 M bovis NP 856943 718 6 M avium YP 883376 712 90.0 2 M_bovis _NP_856943 718 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 89.0 2 M_bovis _NP_856943 718 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 88.0 2 M_bovis _NP_856943 718 9 M_leprae_YP_002503209 725 85.0 2 M_bovis _NP_856943 718 10 M_smegmatis_YP_890280 712 77.0 3 M marinum YP 001849584 732 4 M kansasii ZP 04751156 706 94.0 3 M marinum YP 001849584 732 5 M ulcerans YP 906418 732 99.0 3 M marinum YP 00184 - 34 732 6 M avium YP 883376 712 90.0 3 M_marinum _YP_00184`34 732 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 88.0 3 M_marinum _YP_00184 - 34 732 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 89.0 3 M_marinum _YP_00184 - 34 732 9 M_leprae_YP_002503209 725 85.0 3 M_marinum _YP_001849584 732 10 M_smegmatis_YP_890280 712 77.0 4 M kansasii ZP 04751156 706 5 M ulcerans YP 906418 732 93.0 4 M kansasii ZP 04751156 706 6 M avium YP 883376 712 90.0 4 M_kansasii _ZP_04751156 706 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 90.0 4 M_kansasii _ZP_04751156 706 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 92.0 4 M_kansasii _ZP_04751156 706 9 M_leprae_YP_002503209 725 86.0 4 M_kansasii _ZP_04751156 706 10 M_smegmatis_YP_890280 712 77.0 M ulcerans YP 906418 732 6 M avium YP 883376 712 89.0 5 M_ ulcerans _YP_906418 732 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 88.0 5 M_ ulcerans _YP_906418 732 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 89.0 5 M_ ulcerans _YP_906418 732 9 M_leprae_YP_002503209 725 85.0 5 M_ ulcerans _YP_906418 732 10 M_smegmatis_YP_890280 712 76.0 6 M_avium _YP_883376 712 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 99.0 6 M_avium _YP_883376 712 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 90.0 6 M_avium _YP_883376 712 9 M_leprae_YP_002503209 725 85.0 6 M_avium _YP_883376 712 10 M_smegmatis_YP_890280 712 77.0 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 89.0 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 9 M_leprae_YP_002503209 725 83.0 7 M_avium _paratub_NP_962318 726 10 M_smegmatis_YP_890280 712 77.0 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 9 M_leprae_YP_002503209 725 83.0 8 M_ parascrofulaceum_ZP_06850603 723 10 M_smegmatis_YP_890280 712 77.0 9 M_leprae_YP_002503209 725 10 M_smegmatis_YP_890280 712 75.0 Les inventeurs ont donc identifié la pompe d'efflux CtpC comme nouvelle cible thérapeutique particulièrement intéressante pour la recherche de nouveaux antibiotiques utiles pour le traitement d'infections causées par une bactérie du genre Mycobacterium, en particulier une mycobactérie de l'espèce Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium parascrofulaceum, Mycobacterium kansasii et Mycobacterium smegmatis. La pompe d'efflux CtpC sera de préférence codée par un gène d'une de ces espèces. De même, la pompe d'efflux CtpG représente une nouvelle cible thérapeutique pour la recherche de nouveaux antibiotiques utiles pour le traitement d'infections causées par les bactéries du genre Mycobacterium qui possède un gène ctpG fonctionnel, en particulier Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis et Mycobacterium marinum. La pompe d'efflux CtpG sera de préférence codée par un gène d'une de ces espèces.

On entend ici par « pompe d'efflux CtpC » ou « CtpC » (« Cation-transporting P-type ATPase C»), les deux termes étant utilisés indifféremment dans le texte de la demande, une protéine de la paroi bactérienne d'une mycobactérie présentant la fonction d'exporter un cation métallique, moyennant l'hydrolyse d'une molécule d'ATP, qui est codée par le génome d'une bactérie du genre Mycobacterium, et dont la séquence est une isoforme naturelle et ou une séquence homologue de SEQ ID NO : 1 (numéro d'accession NCBI NP_217787.1), cette séquence représentant la pompe d'efflux CtpC de Mycobacterium tuberculosis. La pompe d'efflux CtpC présente de préférence au moins 75%, de préférence encore au moins 850/0, plus préférentiellement au moins 900/0, 920/0, 950/0, 980/0, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. On entend par « pompe d'efflux CtpG » ou « CtpG » (« Cation-transporting P-type ATPase G»), une protéine de la paroi bactérienne d'une mycobactérie présentant la fonction d'exporter un cation métallique, moyennant l'hydrolyse d'une molécule d'ATP, qui est codée par le génome d'une bactérie du genre Mycobacterium, et dont la séquence est une isoforme naturelle et ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 2 (numéro d'accession NCBI NP_216508.1) qui représente la pompe d'efflux CtpG de Mycobacterium tuberculosis. La pompe d'efflux CtpG présente de préférence au moins 750/0, de préférence encore au moins 800/0, plus préférentiellement au moins 850/0, 900/0, 920/0, 950/0, 980/0, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2.

Le cation métallique exporté par les pompes d'efflux CtpC et CtpG est en général l'ion zinc Zn2+. Il est à noter que ces pompes d'efflux peuvent être spécifiques d'au moins deux cations métallique, par exemple Zn2+ et Fe2+.

Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont déterminés sur la base d'un alignement global des séquences à comparer, c'est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité, en utilisant l'algorithme de NEEDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970). Cette comparaison de séquences peut être effectuée par exemple à l'aide du logiciel needle en utilisant le paramètre "Gap open" égal à 10.0, le paramètre "Gap Extend" égal à 0.5, et une matrice « Blosum 62 ». Le logiciel needle est par exemple disponible sur le site internet ebi.ac.uk world wide, sous la dénomination « Align ».

METHODE IN VITRO DE CRIBLAGE Les inventeurs ont développé une méthode permettant d'identifier des composés inhibant la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG susceptibles d'être utilisés pour traiter les infections dont l'agent causal est une bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG.

L'invention a donc comme objet une méthode in vitro de criblage de composés candidats susceptibles d'être utilisés pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection par une bactérie du genre Mycobacterium, comprenant les étapes suivantes : - fournir un composé candidat ; et - déterminer si le composé candidat inhibe la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium ; dans laquelle ledit composé candidat qui inhibe la pompe d'efflux CtpC et/ou CtpG est identifié comme composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une maladie causée par ladite bactérie du gene Mycobacterium. Le pourcentage d'identité entre les séquences homologues de CtpC chez les différentes espèces du genre Mycobacterium étant élevée, les pompes CtpC des mycobactéries sont structurallement proches. Par conséquent, un composé inhibant la pompe d'efflux CtpC identifié comme composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une maladie causée par une bactérie du gene Mycobacterium présentera en général une action croisée sur d'autres bactéries appartenant à d'autres espèces du gene Mycobacterium. Ainsi, un composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une maladie causée par la bactérie du gene Mycobacterium utilisée dans la méthode ci-dessus peut généralement être utilisé pour le traitement d'une bactérie du genre Mycobacterium différente de celle utilisée dans la méthode. De même, un composé candidat inhibant la pompe d'efflux CtpG susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une maladie causée par la bactérie du gene Mycobacterium utilisée dans la méthode ci-dessus peut généralement être utilisé pour le traitement d'une bactérie du genre Mycobacterium différente de celle utilisée dans la méthode.

Le « composé candidat » peut être tout type de composé. Il peut s'agir notamment de molécules synthétisées chimiquement (de préférence de petites molécules chimiques) ou de molécules naturelles (par exemple, extraites de plantes ou de microorganismes), d'anticorps anti-CtpC ou anti-CtpG, d'oligonucléotides antisens ciblant le gène ctpC ou le gène ctpG, de ribozymes dirigés contre I'ARNm de ctpC ou de ctpG, et d'aptamères.

Lorsqu'il s'agit de molécules synthétisées chimiquement, en particulier les petites molécules chimiques, celles-ci pourront avoir été présélectionnées suite à un criblage in silico (ou criblage dit « virtuel »), c'est-à-dire que la structure tridimensionnelle de la pompe CtpC, ou celle de la pompe CtpG, aura été modélisée par ordinateur, en particulier la structure du site actif et la poche où est localisée le cation métallique, et que les molécules auront été conçues et tester virtuellement par ordinateur de sorte qu'elles soient susceptibles d'interférer avec le mécanisme d'export du cation métallique (par exemple afin de bloquer le site actif, le canal d'export ou la poche). On entend par l'expression « inhiber la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG » la capacité d'un composé à empêcher I'export par la pompe d'efflux CtpC et/ou par la pompe d'efflux CtpG d'un cation métallique, en particulier Zn2+, de l'intérieur de la mycobactérie vers l'extérieur. La (ou les) pompe(s) d'efflux utilisée(s) dans la méthode in vitro de criblage sera(seront) de préférence choisie(s) en fonction de la mycobactérie qui cause la maladie que l'on souhaite traiter.

Ainsi, lorsque l'on souhaite identifier des composés pour le traitement préventif et/ou curatif de la tuberculose : -la pompe d'efflux CtpC sera de préférence celle d'une souche de Mycobacterium tuberculosis ou de Mycobacterium bovis, plus préférentiellement la pompe d'efflux CtpC présentera 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ; - la pompe d'efflux CtpG sera de préférence celle d'une souche de Mycobacterium tuberculosis ou de Mycobacterium bovis, plus préférentiellement la pompe d'efflux CtpG présentera 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2. 1) Méthode in vitro de criblage mettant en ouvre un protéoliposome Dans un premier mode de réalisation de la méthode in vitro de criblage selon l'invention, la capacité d'un composé candidat à inhiber la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG peut être déterminée en utilisant un modèle de membrane biologique artificielle, à savoir un protéoliposome (c'est-à-dire un liposome comprenant la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG), et en mesurant le transport du cation métallique pour lequel la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG est (sont) spécifique(s), ceci en présence et en absence d'au moins un composé candidat à tester. Ainsi, dans une méthode in vitro de criblage selon l'invention, l'on détermine si le composé candidat inhibe la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG de ladite bactérie du genre Mycobacterium en mesurant le transport par la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG comprise(s) dans la bicouche lipidique d'un protéoliposome d'un cation métallique habituellement transporté par la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG présente(s) dans la membrane de ladite bactérie du genre Mycobacterium, d'une part en présence du composé candidat, et d'autre part en absence du composé candidat. Lorsque le transport en présence du composé candidat est inférieur à celui mesuré en absence du composé candidat, ledit composé candidat inhibe la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG, et est donc identifié comme composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une maladie causée par une mycobactérie.

Selon l'orientation dans le protéoliposome de la ou des pompe(s) d'efflux dont l'inhibition est évaluée, le transport sera mesuré de l'extérieur vers l'intérieur du protéoliposome (cas d'une orientation de la ou des pompe(s) d'efflux au sein de la bicouche lipidique du protéoliposome inverse par rapport à l'orientation de la ou des pompe(s) d'efflux dans la membrane de la mycobactérie) ou de l'intérieur vers l'extérieur du protéoliposome (cas d'une orientation de la ou des pompe(s) d'efflux au sein du protéoliposome identique à celle de la ou des pompe(s) d'efflux dans la paroi de la mycobactérie).

Dans le cas d'une orientation au sein de la bicouche lipidique du protéoliposome inverse de la ou des pompe(s) d'efflux dont l'inhibition est évaluée par rapport à l'orientation de la ou des pompe(s) d'efflux dans la membrane de la mycobactérie (importation du cation métallique dans le protéoliposome), un composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une maladie causée par une mycobactérie sera identifié lorsque la quantité de cations métalliques présents à l'intérieur des protéoliposomes mis en présence du ou des composés candidats à tester est inférieure à celle mesurée à l'intérieur des protéoliposomes n'ayant pas été mis en présence du composé candidat.

A l'inverse, dans le cas d'une orientation de la ou des pompe(s) d'efflux au sein du protéoliposome identique à celle de la ou des pompe(s) d'efflux dans la paroi de la mycobactérie (donc exportant à l'extérieur du protéoliposome le cation métallique), un composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une maladie causée par une mycobactérie sera identifié lorsque la quantité de cations métalliques présents à l'extérieur des protéoliposomes mis en présence du ou des composés candidats à tester est inférieure à celle mesurée à l'extérieur des protéoliposomes n'ayant pas été mis en présence du composé candidat. On entend par « liposome » une vésicule artificielle mimant les membranes biologiques, cette vésicule étant formée par des bicouches lipidiques concentriques, emprisonnant entre elles des compartiments aqueux. Une grande variété de lipides amphiphiles, dont les plus couramment utilisés sont les phospholipides d'origine naturelle ou synthétique, peuvent être utilisés pour produire des liposomes. On citera par exemple la phosphatidylcholine, notamment issue de jaune d'ceuf. Les méthodes pour produire des liposomes et des protéoliposomes sont bien connues de l'homme du métier (pour revue, voir les articles de Reza Mozafari, Cellular & Molecular Biology Letters, 10 : 711-719, 2005 ; et l'article de revue de Banerjee et Datta, Mol. Cell Biochem., 50(1) : 3-15, 1983, qui décrit des méthodes couramment utilisé pour produire des protéoliposomes comprenant par exemple des protéines de transport). La formation d'un protéoliposome fait intervenir l'addition de la protéine d'intérêt, ici la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG, au cours de la formation des liposomes. Un exemple de méthode permettant d'incorporer une pompe d'efflux appartenant à la famille des ATPase de type P dans un liposome est décrit dans Fessel et al. (Archives of Biochemistry and Biophysics, 458 : 229-235, 2007). La pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG utilisée(s) lors de la production du protéoliposome sera (seront) préférentiellement sous forme purifiée(s) ou partiellement purifiée(s). Elle(s) pourra (pourront) être produite(s) par les techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al. (MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001), par exemple par clonage de I'ADNc codant la pompe d'efflux CtpC et/ou de I'ADNc codant la pompe d'efflux CtpG dans un vecteur d'expression, puis expression par une bactérie transformée par le plasmide, notamment E. coli, ou bien transcription puis traduction in vitro de CtpC et/ou CtpG. Afin de pouvoir mesurer le transport du zinc, le zinc doit être sous une forme aisément quantifiable. Ainsi, un isotope du zinc, de préférence choisi parmi 65Zn et "Zn, pourra être utilisé, et la quantification du zinc effectuée par comptage de la radioactivité.

On pourra également mesurer directement le zinc (ou tout autre métal) dans le protéoliposome par ICP-MS (inductively coupled plasma-mass spectrometry) ou torche à plasma avec détection par spéctrométrie de masse (pour revue voir l'article « Elemental speciation studies--new directions for trace metal analysis », Caruso JA, Montes-Bayon M., Ecotoxicol. Environ. Saf.; 56(1):148-63, 2003). La quantification du zinc pourra encore être effectuée en mesurant la fluorescence en utilisant des fluorophores appropriés (par exemple Fluozin-3, Invitrogen8).

Dans le cadre d'une méthode de criblage mettant en ceuvre des protéoliposomes comprenant une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG, avantageusement les protéoliposomes comprendront également la protéine chaperon spécifique de la, ou des deux, pompe(s) d'efflux. On entend par « protéine chaperon spécifique de la pompe d'efflux », la protéine qui in vivo assure une maturation et/ou un repliement tridimensionnel adéquat de la pompe d'efflux.

De préférence, la pompe d'efflux et la protéine chaperon sont issues de la même espèce de mycobactérie.

Par exemple : - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium tuberculosis ou de Mycobacterium bovis, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO : 3 (numéro d'accession NCBI NP_217786.1) ; - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium ulcerans, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO : 4 (numéro d'accession NCBI YP_906417.1) ; - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium leprae, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO: 5 (numéro d'accession NCBI NP_301579.1) ; - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium marinum, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO : 6 (numéro d'accession NCBI YP_001849585.1) ; - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium avium, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO: 7 (numéro d'accession NCBI YP_883375.1) ; - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium parascrofulaceum, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO : 8 (numéro d'accession ZP_06850604.1) ; - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium kansasii, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO: 9 (numéro d'accession NCBI ZP_04751157.1) ; - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium avium paratuberculosis, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO : 10 (numéro d'accession NCBI NP_962317.1) ; - dans le cas de la pompe d'efflux CtpC d'une souche de Mycobacterium smegmatis, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO: 11 (numéro d'accession NCBI YP_890281.1) - dans le cas de la pompe d'efflux CtpG d'une souche de Mycobacterium tuberculosis ou de Mycobacterium bovis, la protéine chaperon présente la séquence SEQ ID NO : 12 (numéro d'accession NCBI NP_216509.1). 2) Méthode in vitro de criblage par détermination de la croissance bactérienne dans un milieu de culture additionné de zinc Dans un second mode de réalisation de la méthode in vitro de criblage selon l'invention, la capacité d'un composé candidat à inhiber la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium peut être évaluée en déterminant la croissance d'une bactérie recombinante modifiée génétiquement pour exprimer une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium cultivée dans un milieu de culture additionné de zinc.

Ainsi, la présente invention a pour objet une méthode in vitro de criblage comprenant les étapes suivantes : i) cultiver, en présence de zinc et d'au moins un composé candidat à tester, une bactérie recombinante modifiée génétiquement pour exprimer une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium ; ii) mesurer la croissance de ladite bactérie recombinante ; iii) sélectionner en tant que composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection par une bactérie du genre Mycobacterium dont la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG est (sont) testée(s) le composé candidat en présence duquel la croissance de la bactérie recombinante est inférieure à celle obtenue dans le cas où la même bactérie recombinante est cultivée dans les mêmes conditions que dans l'étape i) mais en l'absence du ou des composés candidats à tester.

La bactérie recombinante utilisée pour mettre en ceuvre ce mode de réalisation est une bactérie i) qui a été modifiée génétiquement pour exprimer une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium, et ii) qui n'exprimait pas une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium avant d'être modifiée. Avantageusement, la bactérie recombinante aura également été modifiée génétiquement pour exprimer la protéine chaperon de la ou des pompe(s) d'efflux dont l'inhibition est évaluée.

Les méthodes de génie génétique permettant de générer une bactérie recombinante exprimant une protéine hétérologue sont bien connues de l'homme du métier et sont par exemple décrites par SAMBROOK et al. (MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001).

Ladite bactérie recombinante sera de préférence choisie dans le groupe constitué par : Escherichia coli, des bactéries du genre Corynebacterium (plus proches des mycobactéries que E. colt). Plus préférentiellement, la bactérie sera Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

On entend également par « une bactérie qui n'exprimait pas une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium avant d'être modifiée» toute bactérie du genre Mycobacterium qui peut être cultivée en milieu de culture inerte, et dont la séquence du gène codant CtpC et/ou dont la séquence du gène codant CtpG est (sont) inactivée(s) (souche mutante simple Knock-out ctpC-KO et ctpG- KO, ou souche double Knock-out ctpC-KO/ctpG-KO) ou n'est (ne sont) pas présente(s) naturellement. Dans ce cas, la bactérie du genre Mycobacterium sera de préférence choisie parmi : Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium parascrofulaceum, Mycobacterium kansasii et Mycobacterium smegmatis. Le milieu de culture pour mettre en ceuvre la méthode sera choisi en fonction de l'espèce à laquelle appartient la bactérie recombinante. Les milieux de culture utilisables en fonction de l'espèce bactérienne sont bien connus de l'homme du métier (cf. notamment Koneman's color atlas and textbook of diagnostic microbiology, Lippincott Williams & Wilkins; Sixth edition (November 10, 2005)). Notamment, si la bactérie recombinante est une souche d'Escherichia ce, le milieu de culture sera de préférence du milieu LB (pour « Lysogeny broth »), ou du milieu minimal M9 (Koneman's color atlas and textbook of diagnostic microbiology, Lippincott Williams & Wilkins; Sixth edition (November 10, 2005)). Si la bactérie recombinante est une mycobactérie, le milieu de culture sera notamment choisi parmi le milieu 7H9 ou le milieu minimal Sauton (Koneman's color atlas and textbook of diagnostic microbiology, Lippincott Williams & Wilkins; Sixth edition (November 10, 2005)). Le zinc utilisé dans l'étape i) est présent à une concentration suffisante pour inhiber la croissance de la bactérie qui n'exprime pas ladite pompe d'efflux CtpC et/ou ladite pompe d'efflux CtpG dont est issue la bactérie recombinante. De préférence la concentration de zinc dans le milieu de culture est d'au moins 0,1 mM, de préférence encore la concentration est comprise entre 0,1 et 2 mM, plus préférentiellement entre 0,25 et 1 mM, et avantageusement entre 0,5 et 1 mM.

Lorsque le composé candidat testé présente un effet inhibiteur sur la croissance de la bactérie recombinante cultivée en présence de zinc, il sera avantageux de s'assurer que l'effet inhibiteur observé est bien dû à un effet spécifique sur la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG qui a (ont) été testée(s). Pour ce faire, dans les mêmes conditions que l'étape i) mais sans addition de zinc dans le milieu, la croissance de la bactérie sauvage dont est issue la bactérie recombinante (c'est-à-dire la bactérie n'exprimant pas ladite pompe d'efflux CtpC) sera mesurée. On conclura que le composé candidat agit au niveau de ladite pompe d'efflux CtpC et/ou de ladite pompe d'efflux CtpG lorsque dans ces conditions de culture le composé candidat : i) n'a pas d'effet sur la croissance de la bactérie sauvage , ou ii) si le composé a un effet inhibiteur sur la croissance de la bactérie sauvage, mais que cet effet inhibiteur est inférieur à celui observé dans le cas de la souche recombinante exprimant une pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG cultivée dans les conditions de l'étape i).

3) Méthode in vitro de criblage par détermination de la croissance bactérienne dans les macrophages et/ou les cellules dendritiques infectés Dans un troisième mode de réalisation de la méthode in vitro de criblage selon l'invention, la capacité d'un composé candidat à inhiber la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG pourra être évaluée en déterminant la croissance intracellulaire d'une bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG dans les macrophages et/ou les cellules dendritiques mises en contact avec ce composé candidat. Un objet de l'invention concerne donc une méthode in vitro de criblage qui comprend les étapes suivantes : i) mettre en contact le ou les composés candidats avec des macrophages et/ou des cellules dendritiques infectés par une bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage, puis cultiver en présence du ou desdits composés candidats à tester lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés ; ii) mesurer la croissance intracellulaire dans lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés de la bactérie du genre Mycobacterium ; iii) sélectionner en tant que composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection par ladite bactérie du genre Mycobacterium le composé candidat en présence duquel la croissance intracellulaire dans lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés de la bactérie du genre Mycobacterium est inférieure à celle obtenue dans le cas de macrophages et/ou cellules dendritiques infectés par la même bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage et mise en culture dans les mêmes conditions que dans l'étape i) mais en l'absence du ou des composés candidats à tester.

Ce mode de mise en ceuvre de la méthode in vitro de criblage permet d'identifier les composés capables d'inhiber la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG lorsque la bactérie du genre Mycobacterium est intracellulaire. Cependant, ce mode de mise en ceuvre ne permet pas d'évaluer le potentiel inhibiteur des composés qui n'ont pas la capacité de traverser la membrane plasmique des macrophages et/ou des cellules dendritiques.

Par conséquent, dans un autre mode de mise en ceuvre, la bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage est mise en contact avec le composé candidat avant l'infection des macrophages. Ce mode de mise en ceuvre permet de tester tous les types de composés candidats, que ceux-ci aient ou non la capacité de passer la membrane plasmique des macrophages et/ou des cellules dendritiques. Dans ce mode de mise en ceuvre, la méthode in vitro de criblage selon l'invention comprend alors les étapes suivantes : i) infecter in vitro des macrophages et/ou des cellules dendritiques par une bactérie du genre Mycobacterium qui exprime une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage qui a préalablement été mise en contact avec le ou les composés candidats à tester, puis cultiver lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés ; ii) mesurer la croissance intracellulaire dans lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés de la bactérie du genre Mycobacterium ; iii) sélectionner en tant que composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection causée par une bactérie du genre Mycobacterium le composé candidat pour lequel la croissance intracellulaire dans lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés de la bactérie du genre Mycobacterium est inférieure à celle obtenue dans le cas de macrophages et/ou cellules dendritiques infectés par la même bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage, n'ayant pas été préalablement mise en contact avec le ou les composés candidats à tester, et mise en culture dans les mêmes conditions que dans l'étape i).

On entend par « pompe d'efflux CtpC (ou CtpG) sauvaqe » toute pompe CtpC (ou CtpG) codée par un gène ctpC (ou un gène ctpG) présent dans le génome d'une bactérie du genre Mycobacterium qui circule dans la nature et qui n'a pas été modifiée par génie génétique au niveau de ce gène.

Ce troisième mode de réalisation peut être utilisé en première intention, en particulier lorsque les inhibiteurs ont été conçus afin de cibler spécifiquement la séquence codant CtpC ou la séquence codant CtpG (oligonucléotides antisens ciblant le gène ctpC ou le gène ctpG, ribozymes dirigés contre l'ARNm de CtpC ou de CtpC), la pompe d'efflux CtpC ou CtpG (anticorps anti-CtpC ou anti-CtpG, aptamères, et molécules synthétisées chimiquement présélectionnées suite à un criblage in silico).

Cependant, il sera avantageux de confirmer que les composés candidats inhibant la croissance intracellulaire d'une bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG agissent bien au niveau de la pompe d'efflux testée.

Cela pourra notamment être réalisé en testant les composés candidats inhibant la croissance intracellulaire d'une bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG à l'aide du premier et/ou du second mode de réalisation de la méthode in vitro de criblage décrits ci-dessus.

Ce troisième mode de réalisation de la méthode in vitro de criblage selon l'invention est particulièrement bien adapté pour identifier des composés utilisables pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection causée par toute mycobactérie intracellulaires exprimant une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG. Les infections sont de préférences celles causées par Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, Mycobacterium paratuberculosis De préférence, la bactérie du genre Mycobacterium utilisée pour mettre en ceuvre la méthode est choisie en fonction de la maladie pour laquelle on souhaite identifier un médicament. Ainsi, ce troisième mode de réalisation de la méthode selon l'invention permet notamment d'identifier des composés pour le traitement de la tuberculose. Dans ce cas, la bactérie du genre Mycobacterium utilisée pour mettre en ceuvre la méthode est de préférence une souche de Mycobacterium tuberculosis ou une souche de Mycobacterium bovis, les pompes CtpC et CtpG de cette mycobactérie étant identiques ou présentant le plus d'homologie avec celles de Mycobacterium tuberculosis. Plus préférentiellement, la bactérie du genre Mycobacterium utilisée pour identifier des composés antituberculeux sera une souche de Mycobacterium tuberculosis. A ce jour Mycobacterium leprae ne peut pas être cultivée in vitro. Ainsi, afin d'identifier des composés pour le traitement de la lèpre, un mode de réalisation préféré consistera à utiliser une bactérie du genre Mycobacterium capable d'être cultivée et à la modifier génétiquement dans le but de générer une bactérie recombinante exprimant la pompe CtpC de Mycobacterium leprae, par exemple celle de la souche Mycobacterium leprae Br4923 correspondant à SEQ ID NO: 13 (numéro d'accession NCBI YP_002503209.1), et n'exprimant plus sa propre pompe CtpC. Une telle souche recombinante pourra avoir été générée par la méthode de l'échange allélique décrite par Pelicic et al. (Proc Natl Acad Sci U S A., 94(20):10955-60,1997). Brièvement, cette méthode consiste à introduire dans une bactérie du genre Mycobacterium dite « réceptrice » un plasmide, parfois linéarisé, comprenant au moins un marqueur de sélection (gène codant pour une protéine conférant la résistance à un antibiotique par exemple) et la séquence du gène ctp C codant pour la pompe d'efflux CtpC de Mycobacterium leprae bordée par la séquence en amont et la séquence en aval du gène ctpC de la souche réceptrice. Après recombinaison homologue au niveau des séquences en amont et en aval du gène ctpC de la souche réceptrice, les souches de mycobactéries recombinantes codent pour la pompe d'efflux de Mycobacterium leprae.

La souche du genre Mycobacterium dite réceptrice peut être toute bactérie du genre Mycobacterium capable d'infecter un macrophage et/ou une cellule dendritique. Il s'agira de préférence d'une souche de Mycobacterium tuberculosis ou d'une souche de Mycobacterium bovis La méthode de l'échange allélique pourra également être utilisée pour cribler des composés efficaces pour inhiber la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG provenant de toute autre bactérie du genre Mycobacterium, et notamment pour toutes les souches qui s'avèrent difficiles ou impossibles à cultiver.

TRAITEMENT D'UNE MALADIE CAUSEE PAR UNE BACTERIE DU GENRE MYCOBACTERIUM Les inventeurs ont montré que la pompe d'efflux CtpC d'une mycobactérie est impliquée dans la virulence lors d'une infection par une bactérie du genre Mycobacterium, en particulier Mycobacterium tuberculosis. Par conséquent, tout composé capable d'inhiber la pompe d'efflux CtpC est utile pour traiter et/ou prévenir une infection causée par une bactérie du genre Mycobacterium. Ainsi, un objet de la présente invention est relatif à une méthode pour traiter ou prévenir une infection causée par une bactérie du genre Mycobacterium comprenant une étape d'administration à une personne en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un inhibiteur de la pompe d'efflux CtpC et/ou d'un inhibiteur de la pompe d'efflux CtpG. L'invention concerne également un inhibiteur de la pompe d'efflux CtpC ou un inhibiteur de la pompe d'efflux CtpG pour son utilisation comme médicament dans le traitement ou la prévention d'une infection causée par une bactérie du genre Mycobacterium.

L'invention concerne encore un inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpC d'une bactérie du genre Mycobacterium et un inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium en tant que préparation combinée pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement et/ou la prévention d'une infection par une bactérie du genre Mycobacterium.

Chez une personne infectée par une mycobactérie, on entend par « quantité thérapeutiquement efficace » une quantité d'inhibiteur suffisante pour empêcher la maladie d'évoluer vers une aggravation, voire suffisante pour faire régresser la maladie. Chez une personne non infectée, la « quantité thérapeutiquement efficace » est la quantité suffisante pour protéger une personne qui serait mise en contact avec une mycobactérie et éviter la survenue de la maladie causée par cette mycobactérie. La quantité exacte d'inhibiteur à administrer varie selon l'âge et le poids du patient à traiter, le type de maladie, le stade de la maladie, l'état du patient, le mode d'administration, la fréquence d'administration ainsi que les autres ingrédients présents dans la composition qui comprend l'inhibiteur.

Les inhibiteurs de la pompe d'efflux CtpC selon l'invention sont capables d'inhiber la pompe d'efflux CtpC d'une bactérie du genre Mycobacterium, en particulier une pompe d'efflux CtpC codé par le génome d'une bactérie du genre Mycobacterium qui présente au moins 75%, de préférence au moins 85°/O, plus préférentiellement au moins 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO :1.

L'infection est de préférence causée par au moins une bactérie choisie parmi Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, Mycobacterium paratuberculosis et Mycobacterium smegmatis. Plus préférentiellement, la maladie est causée par Mycobacterium tuberculosis.

Les inhibiteurs de la pompe d'efflux CtpG selon l'invention sont capables d'inhiber la pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium, en particulier une pompe d'efflux CtpG codé par le génome d'une bactérie du genre Mycobacterium qui présente au moins 75°/O, de préférence au moins 80°/O, plus préférentiellement au moins 85°/O, 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO :2.

L'infection est de préférence causée par au moins une bactérie choisie parmi Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis et Mycobacterium marinum. Plus préférentiellement, l'infection est causée par Mycobacterium tuberculosis.

On entend par « inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpC d'une bactérie du qenre Mycobacterium » et « inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du qenre Mycobacterium » tout composé capable soit de bloquer ou réduire l'activité de la pompe d'efflux considérée (c'est-à-dire le transport d'un ion métallique de l'intérieur de la mycobactérie vers l'extérieur), soit d'empêcher l'expression de cette pompe d'efflux. Les inhibiteurs selon l'invention sont capables d'inhiber ou de réduire l'activité de la pompe d'efflux considérée d'au moins 10%, préférentiellement de 30%, plus préférentiellement d'au moins 50%, et avantageusement d'au moins 70%, 750/0, 80%, 850/0, 90%, 950/0, ou 100%. L'inhibiteur est de préférence une petite molécule chimique, un anticorps anti-CtpC, un anticorps anti-CtpG (de préférence un anticorps humanisé), ou un dérivé d'anticorps anti-CtpC ou anti-CtpG, un oligonucléotide antisens ciblant le gène ctpC ou le gène ctpG, un ribozyme dirigé contre l'ARNm de CtpC ou de CtpG, ou un aptamère. L'inhibiteur peut avoir été identifié par une méthode de criblage selon la présente invention.

Le terme «petite molécule» fait référence à une molécule de moins de 1000 daltons, notamment un composé organique ou inorganique. La conception de structure chimique assistée par ordinateur et le criblage in silico sont utiles dans la conception de telles molécules. On entend ici par : « anticorps anti-CtpC » et « anticorps anti-CtpG », une molécule d'immunoglobuline dirigée respectivement contre la pompe d'efflux CtpC ou la pompe d'efflux CtpG, de préférence la partie extra-cellulaire de la pompe, et qui bloque l'activité de la pompe d'efflux considérée. Le terme « anticorps humanisé » se réfère à un anticorps produit chez un animal non humain, de préférence la souris, ayant conservé sa spécificité de liaison à la pompe d'efflux considérée, mais dans lequel, afin de réduire son immunogénicité chez l'homme, le plus de séquences non humaines possible ont été remplacées par les séquences humaines correspondantes. En ce qui concerne les domaines variables, les séquences remplacées sont en général les régions FR (framework), c'est-à-dire les séquences situées entre les boucles hypervariables CDRs. Diverses méthodes pour obtenir des anticorps humanisés sont bien connues en elles-mêmes (pour revue cf. par exemple ALMAGRO & FRANSSON, Frontiers in Bioscience, 13, 1619-1633, 2008). On rappellera que les CDRs (« complementarity determining regions ») d'un anticorps sont les portions des domaines variables qui sont impliquées dans la reconnaissance spécifique de l'antigène. Chaque chaîne lourde et légère d'un anticorps possède trois CDRs, dénommées VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 dans le cas de la chaine lourde, et VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3 dans le cas de la chaîne légère.

Des dérivés d'anticorps anti-CtpC ou anti-CtpG selon l'invention peuvent être en particulier : - tout fragment d'un anticorps anti-CtpC ou anti-CtpG comprenant au moins les CDR3, et de préférence comprenant en outre les CDR2 et/ou les CDR1 des chaînes lourde et légère dudit anticorps ; - toute protéine recombinante comprenant un fragment d'anticorps anti-CtpC ou un fragment d'anticorps anti-CtpG tel que défini ci-dessus. Des fragments d'anticorps anti-CtpC ou anti-CtpG utilisables conformément à l'invention sont notamment des fragments Fv, dsFv, Fab, Fab'2 ou scFv. Les fragments Fv sont constitués des domaines variables des chaînes lourde et légère VH et VL d'un anticorps, associés l'un à l'autre par des interactions hydrophobes. Le fragment dsFv est constitué d'un dimère VH VL relié par un pont disulfure. Les fragments scFv sont constitués des portions variables des chaînes lourdes et légères d'un anticorps, reliées entre elles par l'intermédiaire d'un lieur flexible (CLACKSON et al., Nature, 352: 624-628, 1991), formant ainsi une protéine simple-chaîne. Les fragments Fab résultent de l'action de la papaïne sur une molécule d'immunoglobuline, et contiennent chacun une chaîne légère et la première moitié d'une chaîne lourde reliées entre elles par un pont disulfure. Le fragment F(ab')2 peut être obtenu par traitement d'un anticorps par la pepsine : ce fragment comprend deux fragments Fab et une partie de la région charnière. Les fragments Fab' peuvent être obtenus à partir des fragments F(ab')2 par coupure du pont disulfure dans la région charnière. Ces fragments se liant à l'antigène peuvent également être combinés afin d'obtenir des dérivés plurivalents, tels que les « diabodies » ou « triabodies », résultant de l'association de 2 ou 3 de ces fragments se liant à l'antigène.

Des protéines recombinantes comprenant un fragment d'anticorps anti-CtpC ou un fragment d'anticorps anti-CtpG peuvent être notamment : - des protéines associant au moins un fragment d'anticorps anti-CtpC, ou au moins un fragment d'anticorps anti-CtpG, avec au moins un fragment d'un autre anticorps; on citera à titre d'exemples, des immunoglobulines bi-spécifiques, des conjugués d'un fragment Fv ou Fab d'un anticorps anti-CtpC, ou d'un d'un fragment Fv ou Fab anticorps anti-CtpG, avec un fragment Fv ou Fab d'un anticorps de spécificité différente, des « diabodies bi-spécifiques » résultant de l'association d'un fragment scFv d'un anticorps anti-CtpC, ou d'un fragment scFv d'un anticorps anti-CtpG, avec un fragment Fv ou Fab d'un anticorps de spécificité différente ; - des protéines associant au moins un fragment d'anticorps anti-CtpC, ou au moins un fragment d'anticorps anti-CtpG, avec une molécule permettant de prolonger sa demi- vie plasmatique lors de son administration in vivo, notamment avec un polypeptide hydrosoluble de masse moléculaire suffisante pour que la masse moléculaire du polypeptide de fusion ainsi obtenu soit supérieure au seuil de filtration rénale. Des anticorps chimériques ou recombinants, des fragments scFv et leurs dérivés, etc. peuvent être obtenus par les techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al. (MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001). Les «Aptamères» sont une classe de molécule qui représente une alternative aux anticorps en terme de reconnaissance moléculaire. Les aptamères sont des séquences oligonucléotidiques ou oligopeptidiques qui possèdent la capacité de reconnaître pratiquement toutes les catégories de molécules cible avec une haute affinité et une forte spécificité. Ces ligands peuvent être isolés d'une banque de séquences aléatoires par mise en ceuvre de la méthode « SELEX » (pour « Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment »), comme décrit dans Tuerk C. et L. Gold (Science, 1990, 249 (4968) : 505-10). La banque de séquence aléatoire peut être obtenue par synthèse chimique combinatoire de l'ADN. Dans cette bibliothèque, chaque membre est un oligomère linéaire, éventuellement modifié chimiquement, d'une séquence unique. Les modifications possibles, les utilisations et les avantages de cette classe de molécules ont été exposés par Jayasena SD, Clin. Chem., 1999, 45 (9) :1628-50. Les aptamères peptidiques sont des peptides conformationnels, en général d'une vingtaine de résidus, sélectionnés à partir de bibliothèques combinatoires par le système du double hybride (Colas et al., Nature, 1996, 380 : 548-50 ; Hoppe-Seyler et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2001, 78(2) : 105-11)).

Le terme «ribozyme» désigne une molécule d'ARN possédant une activité enzymatique qui est capable de cliver d'autres molécules d'ARN distinctes, le clivage étant spécifique d'une séquence ribonucléotidique cible donnée. Dans le cas présent, la séquence ribonucléotidique cible est comprise dans la séquence de I'ARNm issu de la transcription du gène ctpC ou du gène ctpG.

L'inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpC et/ou CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium selon l'invention peut être utilisé dans une composition pharmaceutique. La composition pharmaceutique peut contenir tout excipient couramment utilisé pour la préparation des médicaments. Lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie parentérale, un excipient pharmaceutiquement acceptable adéquat est, par exemple, l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol ou une combinaison de ceux- ci. Pour une administration par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous la forme de comprimés, de gélules, de dragées, de pilules, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granulés, d'émulsions, de capsules, de microsphères ou nanosphères ou vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Les excipients acceptables pour ce mode d'administration sont par exemple des excipients tels que l'amidon, les sucres, le mannitol, le lactose, les agents liants tels que le carboxycellulose, le carboxyméthylcellulose et autres dérivés cellulosiques, les alginates, la gélatine la polyvinylpyrrolidone, les agents humidifiants tels que la glycérine.

BACTERIES DU GENRE MYCOBACTERIUM ATTENUEES Les inventeurs ont constaté qu'une bactérie du genre Mycobacterium, en particulier Mycobacterium tuberculosis, qui n'exprime pas la pompe d'efflux CtpC est une souche atténuée dans la mesure où elle est particulièrement sensible au zinc et est incapable de croitre normalement à l'intérieur des macrophages et des cellules dendritiques infectés. Un autre objet de la présente invention concerne donc une bactérie recombinante du genre Mycobacterium, caractérisée en ce que au moins la séquence du gène ctpC codant pour une pompe d'efflux CtpC, de préférence codant pour une pompe d'efflux CtpC présentant au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO :1, comprend au moins une mutation, ladite au moins une mutation conduisant soit au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpC, par exemple suite à l'inactivation ou la délétion de toute ou partie de la séquence du gène ctpC, soit à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpC non-fonctionnelle, c'est-à-dire incapable d'exporter un cation métallique, de préférence le zinc, de l'intérieur vers l'extérieur de la mycobactérie. La bactérie du genre Mycobacterium peut être choisie dans le groupe constituée par les espèces Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, Mycobacterium parascrofulaceum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium paratuberculosis et Mycobacterium smegmatis.

Dans un mode de réalisation préféré, la bactérie du genre Mycobacterium est choisie dans le groupe constituée par : - Mycobacterium tuberculosis dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 (numéro d'accession NCBI NP_217787.1) ; - Mycobacterium ulcerans dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 14 (numéro d'accession NCBI YP_906418.1) ; - Mycobacterium leprae dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 13 (numéro d'accession NCBI YP_002503209.1) ; Mycobacterium bovis dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 15 (numéro d'accession NCBI NP_856943.1) ; Mycobacterium marinum dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 16 (numéro d'accession NCBI YP_001849584.1) ; Mycobacterium avium dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 17 (numéro d'accession NCBI YP_883376.1) ; Mycobacterium parascrofulaceum dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 (numéro d'accession NCBI ZP_06850603.1) ; Mycobacterium kansasii dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 19 (numéro d'accession NCBI ZP_04751156.1) ; Mycobacterium avium paratuberculosis dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 (numéro d'accession NCBI NP_962318.1) ; et Mycobacterium smegmatis dont le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 21 (numéro d'accession NCBI YP_890280.1).

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la bactérie recombinante du genre Mycobacterium est Mycobacterium tuberculosis et le gène ctpC code pour une pompe d'efflux CtpC possédant par ordre de préférence 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

L'analyse du transcriptome de la réponse au zinc de Mycobacterium tuberculosis réalisée par les inventeurs suggère que le gène ctpG serait également une pompe d'efflux spécifique du zinc, et qu'elle pourrait être impliquée dans la virulence de Mycobacterium tuberculosis, et plus généralement des bactéries du genre Mycobacterium qui exprime cette pompe. Un autre objet de la présente invention concerne ainsi une bactérie recombinante du genre Mycobacterium, caractérisée en ce que au moins la séquence du gène ctpG codant pour une pompe d'efflux CtpG, de préférence codant pour une pompe d'efflux CtpG présentant au moins 75%, de préférence au moins 80°/O, d'identité avec la séquence SEQ ID NO :2, comprend au moins une mutation, ladite au moins une mutation conduisant soit au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpG, par exemple suite à l'inactivation ou la délétion de toute ou partie de la séquence du gène ctpG, soit à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpG non-fonctionnelle, c'est-à-dire incapable d'exporter un cation métallique, de préférence le zinc, de l'intérieur vers l'extérieur de la mycobactérie. Ladite bactérie du genre Mycobacterium dont au moins la séquence du gène ctpG codant pour une pompe d'efflux CtpG comprend au moins une mutation sera de préférence choisie dans le groupe constituée par Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum.

Avantageusement, afin d'obtenir une bactérie selon l'invention davantage atténuée, au moins un autre gène codant une ATPase de type P transporteuse de cation (« cation-transporting P-type ATPase ») comprend au moins une mutation (notamment une délétion), ladite mutation conduit soit au défaut d'expression dudit gène, soit à la synthèse d'un polypeptide non-fonctionnel. Des modes de réalisation avantageux sont présentés ci-après : - Mycobacterium tuberculosis Dans le cas d'une bactérie de l'espèce Mycobacterium tuberculosis recombinante davantage atténuée selon l'invention, le ou les autre(s) gène(s) codant une ATPase de type P transporteuse de cation qui porte au moins une mutation est (sont) choisi(s) parmi les gènes codant : - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpA de séquence SEQ ID NO : 22 (numéro d'accession NCBI NP_214606.1) ; - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpB de séquence SEQ ID NO : 23 (numéro d'accession NCBI NP_214617.1) ; - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpD de séquence SEQ ID NO : 24 (numéro d'accession NCBI YP_001282784.1) ; - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpE de séquence SEQ ID NO : 25 (numéro d'accession NCBI NP_215423.1) ; - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpF de séquence SEQ ID NO : 26 (numéro d'accession NCBI NP_216513.1) ; - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpG de séquence SEQ ID NO : 2 (numéro d'accession NCBI NP_216508.1) ; - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpH de séquence SEQ ID NO : 27 (numéro d'accession NCBI YP_001281713.1) ; - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec Ctpl de séquence SEQ ID NO : 28 (numéro d'accession NCBI NP_214621.1) ; - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpJ de séquence SEQ ID NO : 29 (numéro d'accession NCBI NP_218260.1) ; et - un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpV de séquence SEQ ID NO : 30 (numéro d'accession NCBI NP_215484.1).

Dans un mode de réalisation préférentiel, la bactérie recombinante de l'espèce Mycobacterium tuberculosis davantage atténuée selon l'invention présente, en plus de la ou des mutations dans le gène ctpC conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpC ou à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpC non-fonctionnelle, au moins une mutation dans au moins un des gènes choisis parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpF de séquence SEQ ID NO : 26, un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpG de séquence SEQ ID NO : 2 et un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpV de séquence SEQ ID NO : 30. De préférence, au moins deux des gènes choisi parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpF de séquence SEQ ID NO : 26, un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpG de séquence SEQ ID NO : 2 et un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpV de séquence SEQ ID NO : 30 portent au moins une mutation, ladite au moins une mutation conduit soit au défaut d'expression dudit au moins un gène, soit à la synthèse d'un polypeptide non-fonctionnel. Plus préférentiellement, une bactérie de l'espèce Mycobacterium tuberculosis recombinante davantage atténuée selon l'invention présente, en plus de la ou des mutations dans le gène ctpC conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpC ou à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpC non-fonctionnelle, au moins une mutation dans les gènes codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpF de séquence SEQ ID NO : 26, un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpG de séquence SEQ ID NO : 2 et un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpV de séquence SEQ ID NO : 30, lesdites au moins une mutation conduisent soit au défaut de synthèse de ces gènes, soit à la synthèse de polypeptides non-fonctionnels.

Avantageusement, une bactérie de l'espèce Mycobacterium tuberculosis recombinante davantage atténuée selon l'invention présente, en plus de la ou des mutations dans le gène ctpC conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpC ou à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpC non-fonctionnelle, au moins une mutation dans le gène codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpG de séquence SEQ ID NO : 2, ladite mutation dudit gène conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpG ou à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpG non-fonctionnelle.

-Mycobacterium bovis Dans le cas d'une bactérie de l'espèce Mycobacterium bovis recombinante davantage atténuée selon l'invention, le ou les autre(s) gène(s) codant une ATPase de type P transporteuse de cation qui porte au moins une mutation est (sont) choisi(s) parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec : - CtpA correspondant au numéro d'accession NCBI NP_853763.1 ; - CtpB correspondant au numéro d'accession NCBI NP_853774.1 ; - CtpD correspondant au numéro d'accession NCBI NP_855156.1 ; - CtpE correspondant au numéro d'accession NCBI NP_854589.1 ; - CtpF correspondant au numéro d'accession NCBI NP_855670.1 ; - CtpG de séquence SEQ ID NO : 31, correspondant au numéro d'accession NCBI N P_855665.1; - CtpH correspondant au numéro d'accession NCBI NP_854096.1 ; - Ctpl correspondant au numéro d'accession NCBI NP_853778.1 ; - CtpJ correspondant au numéro d'accession NCBI NP_857406.1 ; ou - CtpV correspondant au numéro d'accession NCBI NP_854651.1.

Dans un mode de réalisation, la bactérie de l'espèce Mycobacterium bovis recombinante davantage atténuée présente au moins une mutation dans au moins un, de préférence au moins deux, et avantageusement les trois, gènes choisis parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpF correspondant au numéro d'accession NCBI NP_855670.1, un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpG correspondant au numéro d'accession NCBI NP_855665.1, et un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpV correspondant au numéro d'accession NCBI N P_854651.1.

Avantageusement, une bactérie de l'espèce Mycobacterium bovis recombinante davantage atténuée selon l'invention présente, en plus de la ou des mutations dans le gène ctpC conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpC ou à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpC non-fonctionnelle, au moins une mutation dans le gène codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpG de séquence SEQ ID NO : 31, ladite mutation dudit gène conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpG ou à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpG non-fonctionnelle.

-Mycobacterium ulcerans Dans le cas d'une bactérie de l'espèce Mycobacterium ulcerans recombinante davantage atténuée selon l'invention, le ou les autre(s) gène(s) codant une ATPase de type P transporteuse de cation qui porte au moins une mutation est (sont) choisi(s) parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec : - CtpA correspondant au numéro d'accession NCBI YP_908222.1 ; - CtpB correspondant au numéro d'accession NCBI YP_908217.1 ; - CtpD correspondant au numéro d'accession NCBI YP_905470.1 ; - CtpE correspondant au numéro d'accession NCBI YP_904449.1 ; - CtpF correspondant au numéro d'accession NCBI YP_904755.1 ; - Ctpl correspondant au numéro d'accession NCBI YP_908203.1 ; ou - CtpV correspondant au numéro d'accession NCBI YP_904606.1.

Dans un mode de réalisation, la bactérie de l'espèce Mycobacterium ulcerans recombinante davantage atténuée présente au moins une mutation dans un gène codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpV correspondant au numéro d'accession NCBI YP_904606.1.

-Mycobacterium marinum Dans le cas d'une bactérie de l'espèce Mycobacterium marinum recombinante davantage atténuée selon l'invention, le ou les autre(s) gène(s) codant une ATPase de type P transporteuse de cation qui porte au moins une mutation est (sont) choisi(s) parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90%, 920/0, 950/0, 980/0, 990/0 ou 100% d'identité avec : - CtpA correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001848587.1 ; - CtpB correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001848592.1 ; - CtpD correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001850579.1 ; - CtpE correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001852880.1 ; - CtpF correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001849173.1 ; - CtpG de séquence SEQ ID NO : 32, correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001850444.1 ; - CtpH correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001849055.1 ; - Ctpl correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001848619.1 ; - ZntA correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001849744.1 ;ou - CtpV correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001853135.1 Dans un mode de réalisation, la bactérie de l'espèce Mycobacterium marinum recombinante davantage atténuée selon l'invention présente au moins une mutation dans au moins un, de préférence au moins deux, et avantageusement les trois, gènes choisis parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90%, 920/0, 950/0, 980/0, 990/0 ou 100% d'identité avec CtpF correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001849173.1, un polypeptide possédant 90%, 920/0, 950/0, 980/0, 990/0 ou 100% d'identité avec CtpG correspondant au numéro d'accession NCBI YP_001850444.1, et un polypeptide possédant 90%, 920/0, 950/0, 980/0, 990/0 ou 100% d'identité avec CtpV correspondant au numéro d'accession NCBI YP 001849744.1. Avantageusement, une bactérie de l'espèce Mycobacterium marinum recombinante davantage atténuée selon l'invention présente, en plus de la ou des mutations dans le gène ctpC conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpC ou à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpC non-fonctionnelle, au moins une mutation dans le gène codant un polypeptide possédant 90%, 920/0, 950/0, 980/0, 990/0 ou 100% d'identité avec CtpG de séquence SEQ ID NO : 32, ladite mutation dudit gène conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpG ou à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpG non-fonctionnelle.

- Mycobacterium leprae Dans le cas d'une bactériede l'espèce Mycobacterium leprae recombinante davantage atténuée selon l'invention, le ou les autre(s) gène(s) codant une ATPase de type P transporteuse de cation qui porte au moins une mutation est (sont) choisi(s) parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec : - CtpA correspondant au numéro d'accession NCBI NP_302338.1 ; - CtpB correspondant au numéro d'accession NCBI NP_302350.1; ou - Ctpl correspondant au numéro d'accession NCBI NP_302704.1.

- Mycobacterium kansasii Dans le cas d'une bactérie de l'espèce Mycobacterium kansasii recombinante davantage atténuée selon l'invention, le ou les autre(s) gène(s) codant une ATPase de type P transporteuse de cation qui porte au moins une mutation est (sont) choisi(s) parmi les gènes codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec : - CtpB correspondant au numéro d'accession NCBI ZP_04746732.1 ; - CtpD correspondant au numéro d'accession NCBI ZP_04750871.1 ; - CtpE correspondant au numéro d'accession NCBI ZP_04750852.1 ; - CtpF correspondant au numéro d'accession NCBI ZP_04749912.1 ; - CtpH correspondant au numéro d'accession NCBI ZP_04747559.1 ; ou - Ctpl correspondant au numéro d'accession NCBI ZP_04746738.1. Dans un mode de réalisation préféré, la bactérie de l'espèce Mycobacterium kansasii recombinante davantage atténuée présente au moins une mutation dans un gène codant un polypeptide possédant 90°/O, 92°/O, 95°/O, 98°/O, 990/0 ou 1000/0 d'identité avec CtpF correspondant au numéro d'accession NCBI ZP_04749912.1.

Les bactéries du genre Mycobacterium recombinantes selon l'invention pourront également être davantage atténuées par les méthodes bien connues de l'homme du métier (notamment atténuation génétique par délétion de gènes de virulence bien connus...).

VACCIN ET COMPOSITION IMMUNOGENE COMPRENANT DES BACTERIES DU GENRE MYCOBACTERIUM SELON L'INVENTION La présente invention a également pour objet i) une composition vaccinale et ii) une composition immunogène, ces compositions comprenant une bactérie recombinante du genre Mycobacterium selon l'invention telle que décrite ci-dessus et un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Un autre objet de la présente invention est relatif à une méthode pour induire une réponse immune contre une bactérie du genre Mycobacterium comprenant une étape d'administration à une personne en ayant besoin d'une composition immunogène selon l'invention comprenant une bactérie isolée recombinante de Mycobacterium selon l'invention. L'invention concerne également une bactérie recombinante du genre Mycobacterium selon l'invention pour son utilisation pour induire une réponse immune vis-à-vis d'une bactérie du genre Mycobacterium appartenant à la même espèce que la bactérie recombinante du genre Mycobacterium selon l'invention.

Un objet de la présente invention est en outre relatif à une méthode de vaccination pour prévenir (vaccination préventive) ou guérir (vaccination curative) une maladie causée par une bactérie du genre Mycobacterium comprenant une étape d'administration à une personne en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition vaccinale selon l'invention comprenant une bactérie recombinante du genre Mycobacterium selon l'invention, cette bactérie étant de préférence de la même espèce que la bactérie contre laquelle on souhaite protégée un sujet. L'invention concerne également une bactérie recombinante du genre Mycobacterium selon l'invention pour son utilisation comme vaccin dans le traitement ou la prévention d'une maladie causée par une bactérie du genre Mycobacterium, cette bactérie étant de préférence de la même espèce que la bactérie contre laquelle on souhaite protégée un sujet. Un vaccin selon l'invention comprend une quantité thérapeutiquement efficace d'une bactérie isolée recombinante de Mycobacterium selon l'invention. Dans le cas du présent vaccin, on entend par « quantité thérapeutiquement efficace » une quantité de mycobactéries suffisante pour susciter chez la personne vaccinée une résistance immunitaire acquise et spécifique contre une bactérie sauvage appartenant à la même espèce que celle utilisée dans le vaccin, ou pour conférer une protection croisée contre une bactérie sauvage d'une autre espèce de mycobactérie que celle présente dans le vaccin (par exemple une réaction croisée entre Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium bovis). La quantité administrée pour être efficace est fonction du sujet à traiter, notamment de l'âge, de la capacité du système immunitaire du sujet à installer une réponse immunitaire, du poids du sujet, du type de maladie, du stade de la maladie dans le cas d'une vaccination curative, de l'état du patient, du mode d'administration, de la fréquence d'administration (une seule injection, une ou plusieurs injection de rappel) ainsi que des autres ingrédients présents dans le vaccin, notamment des adjuvants. Typiquement, le vaccin selon l'invention contient 105 à 106 U.F.0 (unité formant colonie) d'une bactérie recombinante de Mycobacterium selon l'invention.

On entend ici par bactérie sauvage toute souche qui circule dans la nature et qui n'a pas subi de modification par génie génétique. Dans un mode de réalisation, le vaccin contient au moins une bactérie recombinante du genre Mycobacterium selon l'invention choisie dans le groupe constitué des expèces : Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, Mycobacterium parascrofulaceum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium paratuberculosis et Mycobacterium smegmatis. Dans un mode de réalisation préféré, le vaccin et la composition immunogène 10 contiennent une souche de Mycobacterium tuberculosis selon l'invention. Dans un autre mode de réalisation préféré, le vaccin et la composition immunogène contiennent une souche de Mycobacterium bovis selon l'invention. Les procédés de préparation de vaccins ou de compositions immunogènes comprenant une bactérie isolée recombinante atténuée sont bien connus de l'homme du 15 métier. Le vaccin et la composition immunogène peuvent être sous toute forme pouvant être administrée. Typiquement, les vaccins et les compositions immunogènes selon l'invention sont préparés sous des formes injectables (soit sous forme de solution liquide, soit sous forme de suspension), des formes solides convenables pour être mises en suspension ou 20 en solution dans un liquide avant l'injection. Des excipients pharmaceutiquement acceptables, c'est-à-dire n'ayant pas d'effet physiologiques néfastes pour le sujet, et compatibles avec la survie des mycobactéries présentent dans le vaccin, peuvent être utilisés. Parmi ces excipients on citera l'eau, une solution saline (eau physiologique), le glycérol. 25 Le vaccin la composition immunogène peuvent également contenir des quantité mineures de substances auxiliaires, telles que des agents tamponnant le pH, ou des adjuvants qui ont pour fonction d'améliorer l'efficacité du vaccin en stimulant, activant, prolongeant, renforçant, potentialisant et/ou modulant la réponse immunitaire dirigée contre la mycobactérie présente dans le vaccin. Les adjuvants utilisés en médecine 30 humaine, notamment ceux couramment utilisés dans le cas d'un vaccin vivant atténué, sont bien connu de l'homme du métier. On citera notamment l'hydroxyde ou le phosphate d'aluminium, le squalène, le tocophérol, l'hydroxyapathite, les adjuvants complets et incomplets de Freund, le bromure de diméthyldioctadécylammonium (DDA), les lymphokines (notamment l'IFN gamma, l'IL-2 et l'IL-12), la paroi issue de M. bovis souche 35 BCG.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de génération d'une souche de Mycobacterium tuberculosis ctp C-KO et de caractérisation de cette souche, notamment quant à sa capacité de croissance dans des macrophages.

Description des Figures : Figure 1 : Cette figure représente un alignement de séquence entre souches de différentes espèces du genre Mycobacterium.

Figure 2 : Cette figure est un histogramme montrant l'induction de l'expression de chacun des dix gènes ctp A à ctpJ en présence de 500 pM de ZnSO4. Figure 3 : Cette figure est un histogramme montrant l'induction de l'expression du gène ctp C en présence respectivement de ZnSO4 (500µM), CuSO4 (500µM), CdSO4 (200nM), CoSO4 (500µM) et NiSO4 (200µM).

Figure 4 : Cette figure est un histogramme montrant la croissance de M. tuberculosis sauvages cultivées dans un milieu contenant différentes concentrations 0, 0,25 ou 1 mM de ZnSO4 en fonction du temps. Figure 5 : Cette figure est un histogramme montrant la croissance de M. tuberculosis ctp C-KO (mutant inactivé au niveau du gène ctp C) cultivées dans un milieu contenant différentes concentrations 0, 0,25 ou 1 mM de ZnSO4 en fonction du temps. Figure 6: Cette figure montre deux photographies de microscopie électronique de macrophages infectées par M. tuberculosis sauvage (panneau A) ou par M. tuberculosis ctp C-KO (panneau B). Les grains noirs représentent 1 zinc. Figure 7 : Cette figure est un histogramme montrant la croissance intracellulaire de M. tuberculosis sauvage et de M. tuberculosis ctp C-KO en fonction du temps. Figure 8 : Cette figure est un histogramme montrant l'induction de l'expression de gènes lors d'une intoxication au Zinc (culture en présence de 500µM de ZnSO4 pendant 4h).

EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES - Culture des mycobactéries : Les mycobactéries (M. tuberculosis (M.tb), souche GC1237, et M. bovis BCG) sont cultivées en milieu liquide à 37°C dans du milieu Middlebrook 7H9 broth (Difco) supplémenté avec 10% d'ADC (50/0 d'albumine de sérum bovin, 20/0 de dextrose, et 0.0030/0 de catalase; Difco) et 0,050/0 de tween-80 (Sigma-Aldrich) ou dans du milieu Sauton (0,5g de KH2PO4, 0,5g de MgSO4, 1,8g d'acide citrique, 0,05g de citrate d'ammonium ferrique, 4g d'asparagine, 60m1 de Glycérol, dans 940 ml d'H2O) supplémenté de 0,050/0 tween 80. En milieu solide, elles sont cultivées sur milieu Middlebrook 7H11 broth (Difco) supplémenté avec 10% d'OADC (0.050/0 d'acide oléique, ADC; Difco). Lors de la sélection des intégrants, 2% de sucrose sont ajoutés au milieu 7H11. La kanamycine est ajoutée à une concentration finale de 50µg/m1.

- Construction du mutant ctpC-KO dans M.tb : L'inactivation du gène ctpC (Rv3270) chez M.tb a été obtenue en introduisant une cassette de résistance à la kanamycine dans la région codante du gène. La région couvrant 1000 pb en amont et en aval du gène ctpC a été amplifiée par PCR à partir d'ADN génomique de M.tb GC1237 en utilisant les primers ctpCKOFd (GTTTAAACTCGTTGGTGCAGGTGGCCAATC ; SEQ ID NO : 33) et ctpCKORv (GTTTAAACTCGGATCCGTCGCGTTGAC ; SEQ ID NO : 34). La cassette de résistance à la kanamycine, amplifiée à partir du plasmide pACYC177(Chang et al, J. Bacteriol., 134(3):1141-56, 1978) à l'aide des primers KanaFd (TCTCTGATGTTACATTGCACAAG ; SEQ ID NO : 35) et KanaRv (GATCACGCATCTTCCCGACAACG ; SEQ ID NO : 36), a été introduite au milieu de la région codante du gène. Le fragment complet a ensuite été cloné dans le plasmide pPR23. Ce plasmide a été électroporé dans M.tb GC1237. Les transformants sont sélectionnés sur milieu solide 7H11-OADC- kanamycine à 32°C pendant 4 semaines, puis amplifiés dans du milieu 7H9-ADC-Tween80-kanamycine. Les intégrants ont été sélectionnés sur milieu solide 7H11-OADC- kanamycine 2% sucrose à 39°C, puis amplifiés à 37°c dans du milieu 7H9-ADC-Tween80-kanamycine.

Tests de croissance de M. tb et M. bovis BCG en présence de zinc : 5 ml de milieu Sauton-Tween-80 sont inoculés avec 251.1I d'une culture en milieu de phase exponentielle. Le suivi de la croissance s'effectue par mesure de la turbidité de la culture (MacFarland).

Analyse transcriptionnelle de l'expression des gènes ctp chez M.tb et M. bovis BCG Les ARN totaux de 10 ml de culture en phase exponentielle de M.tb ou M.bovis BCG exposée au métal (ZnSO4 500µM, CuSO4 500µM, CdSO4 200nM, CoSO4 500µM, NiSO4 200µM) pendant 4h à 37°c ont été extraits avec le RNeasy mini kit (QIAGEN) et l'ADN génomique résiduel digéré par la RNase-free DNase 1 (Ambion). La qualité des ARN extraits a été vérifiée avec un appareil Nanodrop. Les ARN sont rétro-transcrits en ADNc à l'aide du kit SuperScript First Strand Synthesis System (Invitrogen). L'analyse transcriptionnelle a été faite par PCR quantitative avec le Power SYBR-Green mastermix (Applied biosystems) et l'appareil de détection ABI Prism 7300 (Applied biosystems) utilisant le gène SigA comme référence.

Les amorces utilisées sont :

- pour ctpA : A-Fd : 5'-CACCGTCAAACTCAACATGG-3' (SEQ ID NO : 37) et A-Rv : 5'-CAAGCTGTTTGAGACCACGA-3' (SEQ ID NO : 38);

- pour ctpB : B-Fd : 5'-TGTGACCGTCTTCGTTCTTG-3' (SEQ ID NO 39) et B-Rv : 5'-15 CTCGCCGGTATCACTAGCTC-3' (SEQ ID NO : 40);

- pour ctpC : C-Fd : 5'-TCACCATTTTCACCGGGTAT-3' (SEQ ID NO 41) et C-Rv : 5'-GATGTTGAGCAACCACAGGA-3' (SEQ ID NO : 42); - pour ctpD : D-Fd : 5'-CCGAGCAGAAGGTTGAAGTC-3' (SEQ ID NO : 43) et D-Rv : 5'-AGTTCGTCCCGTATGGTCAC-3' (SEQ ID NO : 44);

25 - pour ctpE : E-Fd : 5'-CCGTGAAACGCTGGATTATT-3' (SEQ ID NO : 45) et E-Rv : 5'-ACGGCCAAAACTGGTGTAAG-3' (SEQ ID NO : 46);

- pour ctpF : 30 F-Fd : 5'-CCGAACTCGGTGAGATTCAT-3' (SEQ ID NO : 47) et F-Rv : 5'-GATGGCGATGGTCAGAAACT-3' (SEQ ID NO : 48);

- pour ctpG : G-Fd : 5'-AGTTCACCGAGGTCATCGTC (SEQ ID NO : 49) et G-Rv : 5'-35 AGTCCGATCAGGTGTCTTGG-3' (SEQ ID NO : 50); 20 - pour ctpH : H-Fd : 5'-GGTGCTCACCGGAAACTCTA-3' (SEQ ID NO : 51) et H-Rv : 5'-ACTTCGATGTACCTCGGCTG-3' (SEQ ID NO : 52); - pour ctpl : I-Fd : 5'-CTGTCCTACGAACCGGTGAT-3' (SEQ ID NO 53) et I-Rv : 5'-AGTAGCGCGTCGATATTGCT-3' (SEQ ID NO : 54);

- pour ctpJ : J-Fd : 5'-GATGACCTGACCACCATTCC-3' (SEQ ID NO : 55) et J-Rv : 5'-CATTGAGTCCGACGATGATG-3' (SEQ ID NO : 56);

- pour ctpV : V-Fd : 5'-GCAGGACAAGGTAGCTGAGG-3' (SEQ ID NO : 57) et V-Rv : 5'-15 GACATTAGCGTGATGTCGGA-3' (SEQ ID NO : 58).

- pour SigA : SigA-Fd: 5'-CTCGACGGCTGAACCAGACCT-3' (SEQ ID NO: 59) et SigA-Rv: 5'-AGGTCTTCGTGGTCTTCGTC-3'(SEQ ID NO : 60) 20 Infection de macrophages humains : Les macrophages humains ont été isolés à partir de sang de patients atteints d'hémochromatose. 30 ml de sang dilué dans du PBS sont déposés sur 15ml de ficoll et centrifugés pendant 40 minutes à 1600rpm. Les cellules mononucléaires ainsi isolées 25 sont prélevées et lavées 2 fois dans du milieu RPMI 1640. Les cellules sont ensuite déposées dans une plaque 24 puits à une densité de 2 millions de cellules par puits dans du RPMI 1640. Le lendemain, les cellules non adhérentes sont éliminées par aspiration/refoulement du milieu. Le milieu est enlevé et remplacé par du milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de sérum humain et 20ng/ml de MCSF humain. 30 Après 7 jours de différenciation, les macrophages ont été infectés à une multiplicité d'infection (MOI) de 1 ou 0.1. Après 4 heures d'incubation à 37°C, les cellules ont été lavées une fois au PBS puis cultivées dans du RPMI 100/0 sérum humain. Aux temps indiqués, les cellules ont été lavées une fois au PBS puis Iysées dans de l'eau Triton 0.010/0 pendant 5 minutes. Des dilutions du Iysat ont été effectuées et étalées sur milieu 35 7H 11-OADC.

Microscopie confocale : Pour l'observation des macrophages humains infectés par M.tb, les cellules sont cultivées et infectées (MOI 1) en plaque 24 puits sur des lamelles de verre de 12 mm de diamètre.

Après fixation dans de la paraformaldéhyde 4%, les macrophages sont lavés 3 fois dans du PBS. Pour la visualisation du Zinc, un marquage à la Fluozin3 (Molecular probes) est réalisé (dilution 1/200 dans su PBS, incubation l h à température ambiante). Les images de microscopie confocale ont été enregistrées sur un microscope confocal Zeiss LSM710 avec un objectif 40X ON1.3 immersion à huile, acquises avec le logiciel Zen.

Microscopie électronique : Préparation des échantillons pour l'observation conventionnelle en microscopie électronique (utilisation de la méthode décrite dans De Chastellier et al., Eur J Cell Biol. ; 68(2):167-82, 1995): Les cellules sont d'abord fixées par le glutaraldéhyde 2,50/0 en tampon cacodylate 0,1 M pH 7,2 contenant du sucrose 0,1 M, du CaCl2 5mM et du MgCl2 5mM pendant 1 heure à température ambiante. Après deux lavages de 15 minutes avec le même tampon les cellules sont fixées par le tétroxyde d'osmium 10/0 en tampon cacodylate 0,1 M pH 7,2 contenant du CaCl2 5mM et du MgCl2 5mM pendant 1 heure à température ambiante. Après trois lavages rapides avec du tampon cacodylate, les cellules sont recouvertes de l ml de tampon et récupérées par grattage avec un grattoir en caoutchouc.

Apres centrifugation des cellules, le surnageant est éliminé et le culot est concentré dans un petit volume d'agar 20/0 préparé en tampon cacodylate. L'échantillon de cellules est ensuite incubé pendant 1 heure à température ambiante dans de l'acétate d'uranyle 10/0 préparé en tampon véronal. Les échantillons sont ensuite déshydratés dans des bains successifs et de concentration croissante d'éthanol (25, 50, 75, 900/0 pendant 15 min chacun suivis de 3 bains d'éthanol 1000/0 sec de 30 min chacun) et finalement enrobés dans une résine, le Spurr, par incubation dans des concentrations croissantes de Spurr (25, 50, 750/0 pour 1h, suivi de Spurr pur pendant 3h à température ambiante et 3h à 37°C). Les échantillons sont transférés dans des moules contenant de la résine pure et mis à polymériser à 60°C pendant 48h. Des coupes fines de 70nm d'épaisseur sont préparées avec un ultramicrotome, colorées par de l'acétate d'uranyle à 20/0 dans l'eau et du citrate de plomb et observées au microscope électronique (Zeiss EM912). Quantifications : Au moins 100 phagosomes différents par échantillon sont observés en prenant soin d'éviter les coupes en série des mêmes cellules et/ou phagosomes.

Préparation des échantillons pour l'observation du zinc en microscopie électronique : Les cellules sont fixées dans du tampon cacodylate S+ (0,1M de cacodylate, 0,1M de sucrose, pH 7,2) contenant 2,5% de glutaraldéhyde (Sigma) et 0,10/0 de sulfure de sodium, une nuit à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées 4 fois avec du tampon cacodylate S+, puis incubées 1 heure à température ambiante à l'obscurité sous agitation douce dans la solution d'autométallographie (15ml de gomme arabique, 2,5 ml de tampon citrate de sodium (50mM d'acide citrique, 50mM de sodium citrate tribasique dissous dans de l'eau distillée), 3,75ml de réducteur (2mM d'hydroquinone dans de l'eau distillée dissous à 40°C) et 3,75ml de solution d'ions d'argent (40mM dans de l'eau distillée dissous à 40°C». Pour stopper la réaction, la solution d'autométallographie est remplacée par du thiosulfate de sodium 50/0 pendant 10min à température ambiante. Les cellules sont ensuite lavées abondamment avec de l'eau distillée, puis fixées par du tetroxyde d'osmium 10/0 en tampon cacodylate S- (0,1M de cacodylate, pH 7,2) pendant 1h à température ambiante. Les cellules sont ensuite traitées de la même manière que pour l'observation conventionnelle en microscopie électronique (ci-dessus).

EXEMPLE 2 : INDUCTION DE L'EXPRESSION DE CtpC PAR LE ZINC Les bactéries M. tuberculosis ont été incubées dans du milieu Middlebrook 7H9 broth (DifcoTM) supplémenté avec 100/0 d'ADC ou dans du milieu Sauton contenant 500 µM de ZnSO4. Après 4h de culture à 37°c, les ARN totaux ont été extraits puis l'expression des gènes ctp A-J a été quantifiée par RT-PCR quantitative (méthode SybrGreen).

Les résultats de cette expérience sont présentés à la Figure 2. Ils montrent que le zinc libre n'induit l'expression que du gène ctp C. Afin de savoir si ce gène peut également être induit pas d'autres cations métalliques, M. tuberculosis ont été cultivées comme décrit ci-dessus en présence respectivement de ZnSO4 (500µM), CuSO4 (500µM), CdSO4 (200nM), CoSO4 (500µM) et NiSO4 (200µM).

Les résultats sont présentés à la Figure 3 qui montre clairement que l'expression du gène ctp C est induite significativement uniquement par le zinc libre.

EXEMPLE 3 : ctpC EST NECESSAIRE POUR LA RESISTANCE AU ZINC CHEZ M. TUBERCULOSIS Les bactéries M. tuberculosis sauvages ou la souche de M. tuberculosis mutante ctpC-KO ont été incubées dans des solutions contenant différentes concentrations (0, 0,25 et 1 mM) de ZnSO4 et la croissance bactérienne a été suivie à différents temps par mesure de la turbidité du milieu (unités McF). Les résultats sont présentés aux Figure 4 (M. tuberculosis sauvages : témoin positif) et 5 (M. tuberculosis mutante ctpC -KO).

Ces résultats montrent que la croissance de la souche sauvage est peu affectée par la présence de zinc libre, même à 1 mM, alors que le mutant ctpC-négatif de M. tuberculosis présente une hypersensibilité au zinc, même à une concentration de 0,25 mM.

EXEMPLE 4 : ACCUMULATION DE ZINC DANS M. TUBERCULOSIS ctpC-KO Des macrophages humains ont été infectés 4 heures avec M. tuberculosis sauvage ou le mutant ctpC-KO puis les cellules ont été traitées afin de révéler le zinc (précipitation) et les lames observées au microscope électronique. Les observations au microscope électronique montrent que le zinc (grains noirs) s'accumule dans les phagosomes, et majoritairement dans le cytoplasme du mutant ctpC- KO (Figure 6, panneau droit (B)), alors que peu ou pas de zinc est détecté dans le cytoplasme de la souche sauvage (Figure 6, panneau droit (A)).

Ces résultats montrent que le produit du gène ctpC est une pompe d'efflux qui possède la fonction de transporter le zinc de l'intérieur vers l'extérieur de la bactérie. Ces travaux montrent également pour la première fois que du zinc libre s'accumule dans les phagosomes intracellulaires contenant le pathogène, le zinc passant alors de l'intérieur du phagosome à l'intérieur de la bactérie. Ces résultats ont été confirmés par des études de microscopie confocale (résultats non présentés).

EXEMPLE 5 : LA POMPE CtpC EST NECESSAIRE POUR LA CROISSANCE DE M. TUBERCULOSIS Des macrophages humains dérivés de monocytes circulants ont été infectés avec M. tuberculosis sauvage ou le mutant ctpC-KO pendant 4 heures à une multiplicité d'infection de 1 bactérie/cellule. Les cellules ont ensuite été lavées puis incubées avec du milieu frais. La croissance intracellulaire des bactéries a été mesurée par étalement sur milieu gélosé et comptage des unités formant colonies. Les résultats sont présentés à la Figure 7. Ces résultats montrent que la pompe d'efflux CtpC est requis pour la croissance intracellulaire de M. tuberculosis.35 EXEMPLE 6 : ANALYSE TRANSCRIPTOMIQUE DE LA REPONSE DE M. TUBERCULOSIS AU ZINC A partir de 3 cultures en phase exponentielle de M. tuberculosis dans du milieu Sauton, 20 ml ont été exposés ou non pendant 4h à 500µM de ZnSO4. Les ARN totaux ont été extraits avec le RNeasy mini kit (QIAGEN8) et l'ADN génomique résiduel digéré par la RNase-free DNase I (Ambion8). La qualité des ARN extraits a été vérifiée avec un appareil Nanodrop (mesure du ration 260/280>1.8) et un appareil Agilent 2100 Bioanalyzer (mesure du rapport 28S/18S(>1.7) et mesure du RNA Integrity Number (>9)).

Les ARN ont été marqués au Cy5 avec le kit QuickAmp Labelling® à partir de 500ng d'ARN total, puis 600ng d'ARNc-Cy5 ont été hybridés dans un four à hybridation Agilent pendant 17 heures sur des lames 8x15K M. tuberculosis (Genotypics), qui contiennent 3 sondes pour chaque ORF, à l'aide du Gene Expression Hybridization Kit (Agitent). Les lames ont été ensuite lavées avec les Gene Expression Wash buffer 1 et 2 (Agitent), et scannées sur l'appareil Genepix 4000B (Axon Instruments). Les images ont ensuite été analysées avec le logiciel FeatureExtraction (Agitent). Les résultats de cette analyse sont présentés à la Figure 8. Cette analyse montre une forte induction du gène ctpC et de sa chaperone putative (Rv3269), ainsi que du gène ctpG et de sa chaperone putative (Rv1993c).

Ces résultats suggèrent fortement que le produit du gène CtpG est une seconde pompe d'efflux de zinc chez M. tuberculosis.

EXEMPLE 7 : EVALUATION IN VIVO DE LA VIRULENCE DE LA SOUCHE M. TUBERCULOSIS ctpC-KO : Des souris Balb/C ou C57BL/6 âgées de 6 semaines sont infectées par voie nasale avec 251.1I d'une suspension contenant 1000 CFU de M. tuberculosis GC1237 ou ctpC-KO. Après 1, 7, 21 et 42 jours, les poumons et la rate sont prélevés et broyés à l'aide de l'appareil GentIeMACS dissociator (Milteny). Les broyats sont dilués et étalés sur milieu 7H11. Les CFU sont comptées après 3 semaines d'incubation à 37°C.

Les souris SCID sont infectées par voie intranasale à hauteur de 1000 CFU avec M. tuberculosis GC1237 ou ctpC-KO. Les souris sont surveillées quotidiennement afin de détecter les premiers signes d'apparition de la maladie.

Claims (16)

1. REVENDICATIONS1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats susceptibles d'être utilisés pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection par une bactérie du genre Mycobacterium, comprenant les étapes suivantes : - fournir un composé candidat ; et - déterminer si le composé candidat inhibe la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium ; dans laquelle ledit composé candidat qui inhibe la pompe d'efflux CtpC est identifié comme composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une maladie causée par ladite bactérie du genre Mycobacterium.
2. 2. Méthode in vitro de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on détermine si le composé candidat inhibe la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG de ladite bactérie du genre Mycobacterium en mesurant le transport, par la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG comprise(s) dans la bicouche lipidique d'un protéoliposome, d'un cation métallique habituellement transporté par la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG présente(s) dans la membrane de ladite bactérie du genre Mycobacterium, d'une part en présence du composé candidat, et d'autre part en absence du composé candidat.
3. 3. Méthode in vitro de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : i) cultiver, en présence de zinc et d'au moins un composé candidat à tester, une bactérie recombinante modifiée génétiquement pour exprimer une pompe d'efflux CtpC et/ou une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium ; ii) mesurer la croissance de ladite bactérie recombinante ; iii) sélectionner en tant que composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection par une bactérie du genre Mycobacterium dont la pompe d'efflux CtpC et/ou la pompe d'efflux CtpG est (sont) testée(s) le composé candidat en présence duquel la croissance de la bactérie recombinante est inférieure à celle obtenue dans le cas où la même bactérie recombinante est cultivée dans les mêmes conditions que dans l'étape i) mais en l'absence du ou des composés candidats à tester.
4. 4. Méthode in vitro de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :Copie sans modifications apparentes i) mettre en contact le ou les composés candidats avec des macrophages et/ou des cellules dendritiques infectés par une bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage, puis cultiver en présence du ou desdits composés candidats à tester lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés ; ii) mesurer la croissance intracellulaire dans lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés de la bactérie du genre Mycobacterium ; iii) sélectionner en tant que composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection par ladite bactérie du genre Mycobacterium le composé candidat en présence duquel la croissance intracellulaire dans lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés de la bactérie du genre Mycobacterium est inférieure à celle obtenue dans le cas de macrophages et/ou cellules dendritiques infectés par la bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage et mise en culture dans les mêmes conditions que dans l'étape i) mais en l'absence du ou des composés candidats à tester.
5. 5. Méthode in vitro de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : i) infecter in vitro des macrophages et/ou des cellules dendritiques par une bactérie du genre Mycobacterium qui exprime une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage qui a préalablement été mise en contact avec le ou les composés candidats à tester, puis cultiver lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés ; ii) mesurer la croissance intracellulaire dans lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés de la bactérie du genre Mycobacterium ; iii) sélectionner en tant que composé candidat susceptible d'être utilisé pour le traitement préventif et/ou curatif d'une infection causée par une bactérie du genre Mycobacterium le composé candidat pour lequel la croissance intracellulaire dans lesdits macrophages et/ou cellules dendritiques infectés de la bactérie du genre Mycobacterium est inférieure à celle obtenue dans le cas de macrophages et/ou cellules dendritiques infectés par la même bactérie du genre Mycobacterium exprimant une pompe d'efflux CtpC sauvage et/ou une pompe d'efflux CtpG sauvage, n'ayant pas été préalablement mise en contact avec le ou les composés candidats à tester, et mise en culture dans les mêmes conditions que dans l'étape i).35Copie sans modifications apparentes
6. 6. Méthode in vitro de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la bactérie du genre Mycobacterium est choisie dans le groupe constitué par Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium parascrofulaceum, Mycobacterium kansasii et Mycobacterium smegmatis.
7. 7. Méthode in vitro de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la bactérie du genre Mycobacterium est une souche de 10 Mycobacterium tuberculosis.
8. 8. Inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpC d'une bactérie du genre Mycobacterium ou inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium choisi parmi: 15 - des anticorps anti-CtpC, des oligonucléotides antisens ciblant le gène ctpC, des ribozymes dirigés contre l'ARNm de CtpC et des aptamères ; - des anticorps anti-CtpG, des oligonucléotides antisens ciblant le gène ctpG, des ribozymes dirigés contre l'ARNm de CtpG et des aptamères ; pour son utilisation comme médicament dans le traitement ou la prévention d'une 20 infection par une bactérie du genre Mycobacterium.
9. 9. Inhibiteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que : - l'inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpC d'une bactérie du genre Mycobacterium est un anticorps anti-CtpC, un oligonucléotide antisens ciblant le gène ctpC, ou un ribozyme 25 dirigé contre l'ARNm de CtpC ; - l'inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium est un anticorps anti-CtpG, un oligonucléotide antisens ciblant le gène ctpG, ou un ribozyme dirigé contre l'ARNm de CtpG. 30
10. 10. Inhibiteur selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que l'infection par une bactérie du genre Mycobacterium est une tuberculose dont l'agent causal est une souche de Mycobacterium tuberculosis.
11. 11. Bactérie recombinante du genre Mycobacterium qui contient : 35 - au moins une mutation du gène ctpC, ladite au moins une mutation du gène ctpC étant soit une inactivation ou une délétion de tout ou partie du gène ctpC conduisant auCopie sans modifications apparentes défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpC, soit une mutation qui aboutit à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpC incapable d'exporter le zinc ; et/ou - au moins une mutation du gène ctpG, ladite au moins une mutation du gène ctpG étant soit une inactivation ou une délétion de tout ou partie du gène ctpG conduisant au défaut de synthèse de la pompe d'efflux CtpG, soit une mutation qui aboutit à la synthèse d'une pompe d'efflux CtpG incapable d'exporter le zinc.
12. 12. Bactérie recombinante selon la revendication 11, caractérisée en ce que la bactérie recombinante est une souche de Mycobacterium tuberculosis.
13. 13. Composition immunogène ou vaccinale comprenant une bactérie selon l'une des revendications 11 ou 12 et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
14. 14. Bactérie recombinante du genre Mycobacterium telle que définie dans les 15 revendications 11 ou 12 pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection par une bactérie du genre Mycobacterium.
15. 15. Bactérie recombinante du genre Mycobacterium pour son utilisation selon la revendication 14, dans laquelle ladite bactérie est telle que définie dans la revendication 20 12, et en ce que l'infection est la tuberculose.
16. 16. Inhibiteur d'une pompe d'efflux CtpC d'une bactérie du genre Mycobacterium choisi parmi des anticorps anti-CtpC, des oligonucléotides antisens ciblant le gène ctpC, des ribozymes dirigés contre l'ARNm de CtpC et des aptamères, et inhibiteur d'une 25 pompe d'efflux CtpG d'une bactérie du genre Mycobacterium choisi parmi des anticorps anti-CtpG, des oligonucléotides antisens ciblant le gène ctpG, des ribozymes dirigés contre l'ARNm de CtpG et des aptamères, en tant que préparation combinée pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement et/ou la prévention d'une infection par une bactérie du genre Mycobacterium. 30