FR2967691A1

FR2967691A1 - Procede d'identification d'un champignon, notamment d'un champignon filamenteux, et utilisations

Info

Publication number: FR2967691A1
Application number: FR1059688A
Authority: FR
Inventors: Stephane Ranque; Renaud Piarroux; Carole Cassagne
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2012-05-25
Also published as: WO2012069768A1

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé in vitro d'identification d'un champignon, obtenu par culture à partir d'un échantillon biologique ou environnemental, caractérisé en ce qu'il comprend la construction d'une banque de spectres de masse de champignons filamenteux, ladite banque étant issue de l'analyse spectrométrique d'au moins une soixantaine de souches de champignons, et ladite banque comprenant au moins deux spectres de référence par souche, chacun desdits spectres de référence étant issu de l'analyse d'un réplicat de culture de chacune desdites souches. La présente invention se rapporte également à un procédé d'extraction d'un champignon filamenteux au moyen d'acide formique adapté notamment à la mise en œuvre du procédé d'identification, ainsi qu'à un procédé in vitro d'identification d'un champignon comprenant la mise au point d'un score d'identification à l'espèce ou au genre.

Description

PROCEDE D'IDENTIFICATION D'UN CHAMPIGNON, NOTAMMENT D'UN CHAMPIGNON FILAMENTEUX, ET UTILISATIONS

Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé in vitro d'identification d'un champignon, obtenu par culture à partir d'un échantillon biologique ou environnemental, comprenant éventuellement la mise au point d'un score d'identification à l'espèce ou au genre, ainsi qu'à un procédé d'extraction d'un champignon adapté notamment à la mise en oeuvre du procédé d'identification. La présente invention trouve donc des applications notamment dans le domaine médical ou de prévention des maladies liées aux champignons, notamment dans le cadre d'un procédé de routine d'identification de champignons.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentée après les exemples.

Etat de la technique Les maladies infectieuses sont responsables de plus d'un quart des décès annuels mondiaux (260/0), et restent un problème de santé public majeur à l'échelle du globe (Nakajima H: Le rapport sur la santé dans le monde. OMS 1996, [1]). Ces trente dernières années ont été le théâtre de l'émergence ou de la ré-émergence d'une multitude de nouveaux agents pathogènes parfois à l'origine de dramatiques pandémies mondiales: VIH, virus de la Dengue, virus West-Nile, choiera, bactéries multi-résistantes, paludisme et pathogènes fongiques (Morens DM et al.: Emerging infections: a perpetual challenge. Lancet Infect Dis 2008, [2] ; Alexander BD: Diagnosis of fungal infection: new technologies for the mycology Iaboratory. Transpl Infect Dis 2002, [3] ; Morens DM et al.: The challenge of emerging and re-emerging infectious diseases. Nature 2004, [4]).

Ce phénomène a été particulièrement spectaculaire pour les pathogènes fongiques (Erjavec Z et al.: Trends in invasive fungal infections, with emphasis on invasive aspergillosis. Clin Microbiol Infect 2009, [5] ; Cuenca-Estrella M et al.: Update on the epidemiology and diagnosis of invasive fungal infection. Int J Antimicrob Agents 2008, [6] ; Malani AN et al.: Changing epidemiology of rare mould infections: implications for therapy. Drugs 2007, [7]). Longtemps considérés comme des contaminants de culture, leur potentiel pathogénique n'a été reconnu que dans les années 1980 (Ajello L: Hyalohyphomycosis and 1 o phaeohyphomycosis: two global disease entities of public health importance. Eur J Epidemiol 1986, [8]). Les champignons filamenteux sont désormais unanimement reconnus comme impliqués dans les infections superficielles de l'immunocompétent et surtout responsables de mycoses invasives sévères de l'immunodéprimé ([8]). Favorisées par 15 l'augmentation des populations à risque et les procédures invasives ainsi que par la généralisation des traitements anti-infectieux prophylactiques, les infections invasives sont en augmentation ([7]). Elles inquiètent par leur sévérité affichant des taux de mortalité de 79 à 100 % pour les zygomycetes, supérieurs à 650/0 pour Scedosporium spp., 720/0 pour les 20 aspergilloses invasives ([7] ; [8] ; Pagano L et al.: Fungal infections in recipients of hematopoietic stem cell transplants: results of the seifem b-2004 study--sorveglianza epidemiologica infezioni fungine nelle emopatie maligne. Clin Infect Dis 2007, [9]). Bien que moins souvent impliqués dans les septicémies de l'immunodéprimé que les bactéries, elles sont 25 pourtant à l'origine d'un plus grand nombre de décès (Snydman DR: Infection in solid organ transplantation. Transpl Infect Dis 1999, [10]). Dans une série américaine de 69 greffés pulmonaires , les champignons étaient responsables de seulement 20 % des épisodes infectieux (contre 59 % pour les bactéries) mais de 72 % des décès d'origine infectieuses 30 (Arthurs SK et al.: The impact of invasive fungal diseases on survival after lung transplantation. Clin Transplant 2009, [11]). Le spectre des espèces de moisissures isolé s'est également élargi passant d'une trentaine dans les années 1950 à plus de 400 de nos jours (Maschmeyer G: The changing epidemiology of invasive fungal infections: new threats. Int J Antimicrob Agents 2006, [12] ; Chabasse B: Emergence of new fungal pathogens : general review. Revue Francophone des Laboratoire 2009, [13]). Si Aspergillus fumigatus reste la moisissure la plus rencontrée en pathologie humaine, l'implication d'autres espèces de moisissures est de plus en plus rapportées : A. niger, A. ustus, Scedosporium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Scopulariopsis spp., Paecylomyces spp., 1 o Trichoderma spp. chez les hyalohyphomycetes, Curvularia spp., Alternaria spp., Exophiala spp. chez les phaeohyphomycetes et les zygomycetes Rhizopus spp et mucor spp ([6] ; [7] ; [13]). Face à l'émergence d'agents pathogènes de plus en plus divers, la détection et l'identification rapide de ces agents devient un enjeu crucial en 15 biologie médicale. Pourtant, les moyens diagnostiques disponibles actuellement ne répondent qu'imparfaitement à ces besoins. En effet, la microbiologie n'a pas encore pleinement profité de l'explosion technologique de ces cinquante dernières années (Van Eldere J: Models for change in clinical microbiology. Clin Microbiol Infect 2000, [14] ; 20 Rottman M et al.: Clinical microbiology in the year 2025 : serologic and host-oriented diagnosis. J Clin Microbiol 2003 [15]). Le développement depuis les années 1960 de méthodes d'identification biochimiques, sérologiques ou de systèmes automatisés de détection optique de croissance des bactéries et des levures (Vitek, Biomérieux) ont certes 25 amélioré la fiabilité et la rapidité d'exécution des analyses, mais de nombreux travaux, basés sur la biologie moléculaire, ont montré que l'utilisation de ces méthodes biochimiques étaient sources d'erreurs fréquentes ([14] ; [15] ; Raoult D et al.: What does the future hold for clinical microbiology?. Nat Rev Microbiol 2004 [16]). Ces améliorations ne 3o concernent d'ailleurs pas tous les micro-organismes, comme les virus ou les moisissures d'intérêt médical. La biologie moléculaire a grandement contribué à l'amélioration du diagnostic des maladies infectieuses (Yang S et al.: Pcr-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care settings. Lancet Infect Dis 2004, [17]). L'amplification des acides nucléiques réalisée directement sur les prélèvements cliniques a conduit à la découverte de nombreux agents pathogènes de culture fastidieuse ou impossible comme de nombreux virus ou comme la bactérie T. whipplei ([4] ; [17] ; Fenollar F et al.: Molecular genetic methods for the diagnosis of fastidious microorganisms. APMIS 2004, [18]). Elle a grandement facilité le diagnostic virologique et i o réduit le temps nécessaire à la détection des germes à croissance lente comme les mycobactéries (Jungkind D: Tech.sight. molecular testing for infectious disease. Science 2001, [19]). L'amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) suivi d'un séquençage est également l'outil le plus fiable d'identification des micro-organismes à l'heure actuelle. Les 15 techniques de biologie moléculaire se heurtent toutefois à plusieurs difficultés. L'obtention d'ADN, si simple à partir de la plupart des colonies bactériennes, est bien plus difficile à partir d'autres types de matériel biologique comme certains prélèvements cliniques (selles ou biopsies) ou les cultures de moisissures dont les parois sont très résistantes ([17] ; [18] 20 ; [19] ; Tang CM et al.: The detection of aspergillus spp. by the polymerase chain reaction and its evaluation in bronchoalveolar lavage fluid. Am Rev Respir Dis 1993, [20]). Ces prélèvements tout comme certaines cultures de moisissures contiennent des inhibiteurs empêchant l'amplification par PCR ([20]). Si un seul gène permet en général 25 l'obtention d'une identification au genre, le séquençage de plusieurs gènes reste requis pour une précision à l'espèce ou à la sous-espèce (Balajee SA et al.: Sequence-based identification of aspergillus, fusarium, and mucorales species in the clinical mycology laboratory: where are we and where should we go from here?. J Clin Microbiol 2009, [21] ; Taylor JW et 30 al.: Fungal multilocus sequence typing - it's not just for bacteria. Curr Opin Microbiol 2003, [22]). Cette précision est pourtant nécessaire en raison des différences de pathogénicité entre deux micro-organismes, même phylogénétiquement proches ([21]). C'est ainsi le cas des différents sérotypes d'E. coli (Balter M: Molecular methods fire up the hunt for emerging pathogens. Science 1998, [23]). De plus, l'absence de protocole standardisé remet en cause la fiabilité de certaines séquences déposées dans les banques de données, celles de moisissures notamment ([5]). Enfin, si la détection d'un agent pathogène ciblé par PCR en temps réel est effectuée en 2 à 3 heures, l'identification par amplification et séquençage requière plusieurs jours en pratique de routine (Borman AM et al.: Molecular identification of pathogenic fungi. J Antimicrob Chemother 2008, [24]). Bien que la détection de gènes de résistance soit possible pour certains micro-organismes comme les Staphylococcus aureus, le diagnostic moléculaire ne dispense généralement pas de la mise en culture des prélèvements nécessaire à l'obtention d'un antibiogramme ou d'un antifongigramme ([16] ; Peterson LR et al.,: Multicenter evaluation of the lightcycler(r) mrsa advanced test as a rapid method for detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) in nasal surveillance swabs. J Clin Microbiol 2010, [25]). En définitive, bien que les techniques de biologie moléculaire soient désormais en développement depuis une vingtaine d'années, elles restent encore expérimentales, réservées à des laboratoires spécialisés et n'ont pas eu l'impact espéré sur le diagnostic de routine de microbiologie ([3] ; [14]). A titre d'exemple, seuls 17 % des laboratoires américains seraient en mesure d'effectuer des analyses de biologie moléculaire (Balajee SA et al.: Dna and the classical way: identification of medically important molds in the 21st century. Med Mycol 2007, [26]). Finalement, le diagnostic microbiologique repose, encore aujourd'hui et dans la majorité des laboratoires, sur les techniques d'identification conventionnelles fastidieuses et imprécises ([19] ; Isenberg HD: Clinical microbiology: past, present, and future. J Clin Microbiol 2003, [27]). En particulier, l'identification phénotypique des moisissures est l'un des diagnostics microbiologiques les plus longs et délicats. Les caractères morphologiques macro et microscopiques sont largement influencés par les conditions de culture. Parfois l'isolat ne produit pas d'organes de fructification interdisant toute identification (Hsiao CR et al.: Identification of medically important molds by an oligonucleotide array. J Clin Microbiol 2005, [28]). De plus, les champignons filamenteux peuvent croître tantôt sous leur forme anamorphe, tantôt téléomorphe. Enfin, certaines espèces sont morphologiquement indiscernables. L'identification phénotypique est donc subjective, hautement dépendante des compétences du biologiste et parfois à l'origine d'erreurs ([4] ; Santos C et al.: Filamentous fungal characterizations by matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry. JAppl Microbiol 2009, [291) . Récemment la spectrométrie de masse (SM) a émergé comme un nouvel outil d'identification des bactéries et levures sans préparation, en quelques minutes seulement, avec une fiabilité supérieure à celles des méthodes conventionnelles (Marvin LF et al.: Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clin Chim Acta 2003, [30] ; Lay JOJ: Maldi-tof mass spectrometry of bacteria. Mass Spectrom Rev 2001, [31] ; Fenselau C et al.: Characterization of intact microorganisms by maldi mass spectrometry. Mass Spectrom Rev 2001, [32] ; Seng P et al.: Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis 2009 [33] ; van Veen SQ et al.: High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J Clin Microbiol 2010, [34]). En bactériologie, sa simplicité, sa rapidité et sa fiabilité séduisent un nombre grandissant de laboratoire médicaux qui acquièrent cette nouvelle technologie et ce, malgré l'investissement initial élevé nécessaire à l'achat du matériel de spectrométrie ([34] ; Mellmann A et al.: High interlaboratory reproducibility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based species identification of nonfermenting bacteria. J Clin Microbiol 2009, [35] ; Eigner U et al. Performance of a matrix-assisted laser desorption ionization-timeof-flight mass spectrometry system for the identification of bacterial isolates in the clinical routine laboratory. Clin Lab 2009, [36] ; Dupont C et al.: Identification of clinical coagulase-negative staphylococci, isolated in microbiology laboratories, by matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry and two automated systems. Clin Microbiol Infect 2009, [37] ; Bizzini A et al.: Performance of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for the identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol 2010, [38]). Certains auteurs considèrent maintenant que la SM pourrait remplacer voire faire disparaître le microscope des laboratoires pour l'identification des bactéries obtenues après cultures de prélèvements de patients ([33] ; Schubert S: Novel Maldi-Tof Ms Based Differentiation Of Bacteria From Clinical Samples: Alternative To Biochemical Test Systems ?. ESCMID 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Barcelona, Spain 2008, [39]). Les progrès réalisés ces dix dernières années ont parfaitement adapté la MALDI TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation, time-of-flight mass spectrometry) à l'identification de colonies bactériennes et de levures. L'analyse consiste à déposer directement une colonie bactérienne ou de levures sur une cible en acier puis à la recouvrir d'une goutte de matrice. Les spectres sont ensuite acquis par le spectromètre. Enfin, la comparaison des spectres avec la banque de spectres de référence donne l'identification ([30]). Des stations complètes d'identification par spectrométrie de masse sont commercialisées clé en main depuis quelques années. Ces stations incluent non seulement l'appareillage mais aussi les logiciels d'exploitation des spectres contenant la banque de référence et les algorithmes d'identification. Les résultats des analyses peuvent même être directement transmis au système informatique du laboratoire (Sauer S, Kliem M: Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol 2010, [401) Cette technique présente toutefois encore quelques limitations. Elle est hautement dépendante du protocole utilisé (Valentine N et al.: Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol 2005, [411). Toute modification du protocole entraîne une variabilité des spectres qui ne sont alors plus reconnus par la banque de référence. i o L'analyse directe des prélèvements cliniques sans mise en culture préalable reste à ce jour impossible tout comme l'analyse simultanée de plusieurs agents pathogènes. De plus, cette « révolution » ne sera complète que lorsque la technique aura été adaptée à l'identification de tous les micro-organismes 15 d'intérêt médical susceptibles d'être obtenus par culture. Le principal obstacle restant pour en faire un outil d'identification global, porte sur l'identification des moisissures, dernier grand bastion des microscopistes. En effet, malgré la publication récente de travaux portant sur l'utilisation de la SM dans l'identification de moisissures appartenant à certains genres 20 bien définis ([29]), personne n'a jusqu'ici proposé un protocole de SM applicable à l'identification de l'ensemble des moisissures susceptible d'être isolées sur des prélèvements pathologiques. En effet, le prélèvement d'une colonie et son dépôt sur une cible de SM, si simple et rapide pour les bactéries ou les levures, s'avère 25 inapplicable pour les moisissures et les dermatophytes en raison de leur nature filamenteuse. D'autre part, leur grande variabilité phénotypique, qui gène déjà l'identification morphologique, rend difficile l'obtention de spectres reproductibles. A l'opposé d'une colonie bactérienne où toutes les cellules sont identiques, la colonie fongique se compose de mycelium à 30 différents stades de développement. Au centre de la colonie, se situe un mycelium vieillissant/sénescent produisant des organes de fructifications, des métabolites secondaires et des pigments tandis qu'en périphérie croit un mycelium jeune dont les cellules sont peu différenciées ([29]). Maier al ont démontré que les spectres issus de matériel fongique prélevé dans différentes zones d'une même colonie sont différents et ne se reconnaissent pas entre eux (Maier T et al.: Improved method for fungal identification using maldi-tof mass spectrometry. Symposium Bruker, Paris 2009, [421). De plus, les empreintes spectrales varient également en fonction des conditions de culture, de récolte, d'extraction protéique, de la nature de la matrice et de la qualité du spectromètre utilisé (Valentine NB 1 o et al.: Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2002, [43] ; Hettick JM et al.: Discrimination of aspergillus isolates at the species and strain Ievel by matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry fingerprinting. Anal Biochem 2008, [44] ; 15 Hettick JM et al.: Discrimination of penicillium isolates by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting. Rapid Commun Mass Spectrom 2008, [45] ; Li TY et al.: Characterization of aspergillus spores by matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2000, [461). 20 Welham et al obtinrent des spectres interprétables de Penicillium sp., de Scytalidium sp. et de Trychophyton (Welham KJ et al.: Characterization of fungal spores by laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2000, [471). Puis Li et al. ([46]), analysant des spectres de spores d'Aspergilli du 25 complexe flavus, ont réussi à identifier des biomarqueurs d'aflatoxigénicité. Valentine et al. ont developpé une méthode originale de dépôt par ruban adhésif d'hyphes et de spores de 4 espèces de moisissures ([43]). Les études plus récentes ont réussi à développer des protocoles reproductibles permettant l'identification d'espèces de champignons 30 filamenteux. Toutefois chacune de ses études ne s'est intéressée qu'à un seul genre de moisissures: Hettick et al aux Aspergillus ([45]), Chen et al. aux Penicillium (Chen H et al.: Characterization of intact penicillium spores by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2005, [481), Ehrard et al. aux Trichophyton (Erhard M et al.: Identification of dermatophyte species causing onychomycosis and tinea pedis by maldi-tof mass spectrometry. Exp Dermatol 2008, [491), Marinach et al aux Fusarium (Marinach-Patrice C et al.: Use of mass spectrometry to identify clinical fusarium isolates. Clin Microbiol Infect 2009, [501), Tao et al aux Verticillium (Tao J et al.: Detection of pathogenic verticillium spp. using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2009, [511), De Respinis et al aux Trichoderma (De Respinis S et al.: Maldi-tof ms of trichoderma: a model system for the identification of microfungi. Mycological Progress 2009, [521). Ainsi, les conditions de culture, les méthodes d'extraction, les matrices et les instruments utilisés étaient extrêmement différents entre ces études rendant leur comparaison difficile. Ainsi, Wehlam ([47]), Li ([46]) et Chen ([48]) n'ont travaillé que sur des conidies de moisissures, De Respinis ([52]), uniquement sur les hyphes tandis que Valentine ([43]), Hettick ([45]), Ehrard ([49]), Marinach ([50]) et Tao ([51]) ont acquis des spectres à partir d'un mélange de spores et d'hyphes. Alors que Li ([46]), Valentine ([43]), Chen ([48]), De Respinis ([52]) ont directement mélangé le matériel fongique avec la matrice, les autres études ont utilisé une extraction chimique précédé d'une sonication pour Tao et al. ([51]) ou d'une lyse mécanique pour Hettick et al. ([45]). Différentes matrices ont été utilisées : l'acide dihydroxybenzoique (DHB), l'acide sinapinique, ferrulique ou l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA). Les spectromètres de masse étaient également tous différents. Enfin si la comparaison des spectres a été réalisée de façon visuelle dans les études antérieures à 2008, Erhard ([49]), Marinach ([50]), Tao ([51]) et De Respinis ([52]) ont utilisé des logiciels développant des algorithmes complexes d'identification tels que MaldiBioTyper® ou SARAMIS®. Ces 2967691 Il protocoles, efficaces pour le genre de moisissures pour lesquels ils ont été mis au point, ne sont malheureusement pas applicables à l'ensemble des espèces de moisissures.

5 Il existe donc un réel besoin de procédés palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant d'identifier un champignon filamenteux, notamment standardisé et utilisable en protocole de routine.

10 Description de l'invention L'invention permet précisément de pallier les inconvénients de l'art antérieur et de répondre à ces besoins. Bien que l'application de la technique de spectroscopie de masse, et notamment celle de MALDI TOF, à l'identification des champignons, 15 notamment des champignons filamenteux, se heurte à de nombreuses difficultés, la Demanderesse a réussi à mettre au point, grâce à ses recherches ardues, un procédé d'identification d'un champignon, notamment d'un champignon filamenteux. Le procédé permet avantageusement l'identification, en routine, des 2 0 champignons, notamment des champignons filamenteux, par SM. Avantageusement, le procédé de l'invention ne nécessite pas une connaissance préalable du genre ou de l'espèce du champignon. Avantageusement, le procédé de l'invention permet d'identifier famille, le genre, l'espèce, ou la sous-espèce du champignon filamenteux. 25 Avantageusement, le procédé de l'invention garantit une reproductibilité intra-espèce ainsi qu'une variation inter-espèce des signatures spectrales mises en oeuvre par le procédé. Avantageusement, le procédé de l'invention est une technique simple et reproductible d'obtention de spectres. 30 Avantageusement, le procédé de l'invention est une technique simple et reproductible de construction d'une banque valide de références.

Avantageusement, le procédé de l'invention est une technique simple et reproductible de définition d'un seuil opérationnel de décision. Le procédé de l'invention est un procédé in vitro d'identification d'un champignon, notamment un champignon filamenteux, obtenu par culture à partir d'un échantillon biologique ou environnemental, caractérisée en ce qu'elle comprend la construction d'une banque de spectres de masse de champignons, notamment de champignons filamenteux, ladite banque de référence étant issue de l'analyse spectrométrique d'au moins une soixantaine de souches de champignons, notamment de champignons i o filamenteux, et ladite banque de référence comprenant au moins deux spectres de référence par souche, chacun desdits spectres de référence étant issu de l'analyse d'un réplicat de culture de chacune desdites souches. On entend par « identification », au sens de la présente invention, la 15 détermination des caractères reproductibles entre individus appartenant à un même groupe, mais variables entre individus de groupes différents, afin de pouvoir inclure un individu dans un groupe si ses caractères correspondent à ceux du groupe. Le groupe peut être par exemple la famille, le genre, l'espèce, la sous-espèce. Eventuellement, l'identification 20 peut comprendre la comparaison des caractères observés chez un individu avec les caractères de référence définissant les groupes. Eventuellement, l'identification peut comprendre la décision d'un seuil de ressemblance de ces caractères pour inclure un individu dans un groupe. On entend par « champignon », au sens de la présente invention, 25 tout champignon macromycète ou micromycète. Dans le cas où il s'agit d'un macromycète, il peut s'agir de tout ou partie du macromycète. Avantageusement, l'identification du macromycète permet un diagnostic d'une intoxication, par exemple alimentaire, due à ce macromycète. Le macromycète peut appartenir aux genres : Agaricus, Agrocybe, Aleuria, 30 Amanita, Auricularia, Balsamia, Boletus, Bovista, Calocybe, Cantharellus, Choiromyces, Chroogomphus, Clavariadelphus, Clavulina, Clitocybe, Clitopilus, Collybia, Coprinus, Cortinarius, Craterellus, Cuphophyllus, Dendropolyporus, Disciotis, Entoloma, Fistulina, Flammulina, Gomphidius, Gomphus, Grifola, Gyroporus, Hebeloma, Hydnum, Hygrophorus, Kuehneromyces, Laccaria, Lactarius, Laetiporus, Langermannia, Leccinum, Lentinellus, Lentinula, Lentinus, Lepista, L espia ultinia, Leucocortinarius, Leucopaxillus, Lycoperdon, Lyophyllum, Macrolepiota, Marasmius, Meripilus, Mitrophora, Morchella, Otidea, Phaeolepiota, Pholiota, Pleurotus, Pseudohydnum, Ramaria, Rozites, Russula, Scutiger, Sparassis, Strobilurus, Stropharia, Suillus, Terfezia, Tremiscus, Tricholoma, Tuber, Verpa, Volvariella, Xerocomus, Chlorophyllum , Conocybe, Copelandia' Cystolepiota, Galerina, Hygrocybe, Hypholoma, Inocybe, Lepiota, Lepista, Leucoagaricus, Leucocoprinus, Mycena, Omphalotus, Panaeolus, Paxillus, Ph aeonematoloma, Pholiotina, Psilocybe, Ramicola, Sarcosphaera, Scleroderma, Scutiger, Ustilago, Claviceps, Cudonia, Gyromitra, Maublancomyces, cette liste n'étant pas limitative. Dans le cas où il s'agit d'un champignon micromycète, il peut s'agir par exemple d'un champignon filamenteux. Le champignon à identifier est par définition de famille, de genre, d'espèce ou de sous- espèce inconnue avant la mise en oeuvre du procédé d'identification de l'invention. On entend par « champignon filamenteux », au sens de la présente invention, tout champignon formé de filaments. Il peut s'agir d'un champignon formé uniquement de filaments ou de filaments produisant des organes de reproduction, par exemple des spores. Le champignon filamenteux peut être un dermatophyte ou une moisissure. Dans le cas d'un dermatophyte, il peut s'agir de tout dermatophyte connu de l'homme du métier, appartenant notamment au genre Trichophyton, Microsporum ou Epidermophyton. Dans le cas d'une moisissure, il peut s'agir de toute moisissure connue de l'homme du métier dont les principaux genres sont les suivants : Absidia, Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Beauveria, Bipolaris, Chrysosporium, Cladosporium, Curvularia, Cylindroncarpon, Exophiala, Fusarium, Mucor, Onychocola, Paecilomyces, Penicillium, Phialophora, Rhizomucor, Rhizopus, Scedosporium, Scopulariopsis, Scytalidium, Trichoderma et Ulocladium. Il peut s'agir par exemple d'un champignon filamenteux choisi parmi Absidia corymbifera, Acremonium strictum, Acrophialophora fusispora, Alternaria alternats, Alternaria tenulsima, Aspergillus candidus, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus hollandicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus restrictus, Aspergillus sydowi, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans, Beauveria bassiana, Botrytis cinerea, Chaetomium globosum, Chrysonilia sp., Cladosporium carionii, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium herbarum, Cladosporium sphaerospermum, Curvularia sp., Emericiella nidulans, Eurotium chevalieri, Exophiala dermatitidis, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Geomyces pannorum, Humicola sp., Irpex lacteus, Mucor circinelloides, Neosartorya pseudofisheri, Paecilomyces variotii, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium brevicompactum, Penicillium chrysogenum, Penicillium corylophylus, Penicillium purpurogenum, Penicillium roqueforti, Penicillium spirulosum, Phaecoccomyces exophialae, Phialophora parasitica, Rhizomucor pusillus , Rhizopus oryzae, Rhizopus oryzae, Rhyzomucor pusillus, Scedosporium apiospermum, Scedosporium inflatum, Scedosporium prolificans, Schizophyllum commune, Scopulariopsis brevicaulis, Trichoderma viride, Trichophyton interdigitale, Trichotecium roseum et Ulocladium sp. Le prélèvement de culture de champignon filamenteux analysé peut être un hyphe, une spore (sexuée ou asexuée), ou un de leurs mélanges. On entend par « culture », au sens de la présente invention, désigne toute méthode adaptée à la croissance et/ou à la réplication du champignon filamenteux. La culture peut être réalisée sur tout milieu adapté, en fonction du champignon filamenteux, et connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un milieu de Sabouraud, d'une gélose au malt ou extrait de malt, d'un milieu PDA (Potato Dextrose Agar) ou encore d'un milieu de Czapek, contenant éventuellement des antibactériens et/ou de la cycloheximide. Le milieu peut être de préférence un milieu solide ou un milieu liquide. La culture peut être déposée sur la cible soumise à la spectrométrie de masse. On entend par « échantillon biologique », au sens de la présente invention, tout prélèvement d'un organisme humain ou animal, réalisé i o antérieurement à la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Il peut s'agir d'un échantillon cellulaire ou tissulaire. L'échantillon peut provenir de tout organe ou de tout fluide biologique. L'organe peut être par exemple le poumon, le foie, le cerveau, les sinus, le muscle, l'os, la cornée, les phanères, cette liste n'étant pas limitative. Le fluide biologique peut être 15 par exemple le sang, la lymphe, l'urine, les liquides de lavage broncho- alvéolaire, les expectorations, les pus, cette liste n'étant pas limitative. On entend par « échantillon environnemental », au sens de la présente invention, tout prélèvement réalisé dans un milieu naturel, c'est-à-dire non fabriqué par l'être humain, ou artificiel, c'est-à-dire fabriqué par 20 l'être humain ou lié à l'activité humaine ou animale. Il peut s'agir d'un milieu minéral, végétal, gazeux ou liquide. Le prélèvement est réalisé antérieurement à la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Dans le cas d'un milieu naturel, il peut s'agir par exemple de d'arbres, de mousses, d'air, d'eau potable, d'eau non potable, de matériaux de construction, cette 25 liste n'étant pas limitative. Dans le cas d'un milieu artificiel, il peut s'agir par exemple de matière à base de plastique, de polymères, de verre, de papier, de poussière, de prélèvement lié à l'agriculture, à I'agroalimentaire, à l'environnement hospitalier, d'un isolat clinique, cette liste n'étant pas limitative. 30 On entend par « spectres de masse », au sens de la présente invention, la représentation de la répartition des rapports de masse sur charge (m/z) des ions gazeux générés par l'ionisation/désorption/vaporisation des molécules de l'échantillon à analyser après introduction dans le spectromètre de masse. Cette représentation peut être de préférence graphique, représentant en abscisse les m/z des différentes entités ioniques détectées et en ordonnée, leur intensité relative. Le pic de masse moléculaire le plus élevé, ou pic « parent », correspond généralement à l'ion produit à partir de la molécule introduite dans l'appareil. Les ions secondaires détectés sont issus de l'ion parent par perte successive de groupements moléculaires (Guilhaus M: Principles and instrumentation in time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 1995, [56]). Les différences de masse moléculaire entre les différents ions détectés sur le spectre renseignent sur la composition et la structure de la molecule originelle (Han X et al. : Mass spectrometry for proteomics. Curr Opin Chem Biol 2008, [57]). Les spectres de masse peuvent être obtenus par toute méthode connue de l'homme du métier. L'échantillon être introduit directement dans le spectromètre de masse, sous forme gazeuse, liquide ou solide, par exemple par canne d'introduction directe ou dépôt sur plaque MALDI, ou encore par l'association à une méthode séparative, comme par exemple la chromatographie en phase liquide, la chromatographie en phase gazeuse ou la électrophorèse capillaire. La source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et peuvent être utilisés, comme par exemple l'ionisation électronique (El), l'ionisation chimique (Cl) et la désorption-ionisation chimique (DCI), le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou ions (SIMS, LSIMS), le couplage plasma inductif (ICP), l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI), l'électronébulisation ou 3o électrospray (ESI), la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI), activée par une surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS), ou l'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART). L'analyseur, qui sépare les ions en fonction de leur rapport masse/charge (m/z), peut être le quadripôle ou quadrupôle (Q), le piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FTICR) et I'Orbitrap. Ces analyseurs peuvent être couplés entre eux pour réaliser des expériences de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Le détecteur permettant la détection du signal ionique puis sa transformation en signal électrique, peut être une plaque photographique, un cylindre de Faraday, un multiplicateur d'électrons, une galette de micro-canaux, ou un multiplicateur de photons. De préférence, les spectres de masse sont obtenus par MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation - time-of-flight mass spectrometry). Dans ce cas, l'échantillon à analyser peut être co-cristallisé avec une matrice organique, comme par exemple l'acide sinnapinique, l'acide 2,5-dihydroxybenzoique (DHB) ou l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA), ou leurs dérivés, avant l'analyse. On entend par « banque », au sens de la présente invention, tout groupe constitué plusieurs spectres de masse. La banque peut être issue de l'analyse spectrométrique d'au moins une dizaine, ou d'au moins une vingtaine, ou d'au moins une cinquantaine, ou d'au moins une soixantaine, ou d'au moins une centaine, ou d'au moins 200, ou d'au moins 300, ou d'au moins 400, ou d'au moins 500, ou d'au moins 1000 ou de plusieurs milliers de souches de champignons. Avantageusement, plus le nombre de souches analysé est élevé, plus le pourcentage d'identification erroné est faible. La banque peut être constituée de souches de champignons appartenant à une ou plusieurs familles de champignons, et/ou à un ou plusieurs genres de champignons, et/ou à une ou plusieurs espèces de champignons, et/ou à une ou de plusieurs sous-espèces de champignons. 3o On entend par « souche », au sens de la présente invention, tout champignon constitué par une succession de cultures dérivées d'une culture pure, généralement une colonie parfaitement isolée. Par exemple, les souches utilisées pour la construction de la banque de spectres de masse peut comprendre au moins une souche appartenant aux espèces choisies parmi : Absidia corymbifera, Alternaria sp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans, Cladosporium sp., Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Mucor circinelloides, Neosartorya pseudofisheri, Paecilomyces variotii, Penicillium chrysogenum, Penicillium purpurogenum, Penicillium roqueforti, Penicillium sp., Rhizopus oryzae, Rhizomucor pusillus, Scedosporium apiospermum, Scedosporium prolificans, Schizophyllum commune, Scopulariopsis brevicaulis, Trichoderma sp., Trichophyton sp., Microsporum sp., Epidermophyton sp.. Plus particulièrement, les souches utilisées pour la construction de la banque de spectres de masse peut comprendre au moins deux, ou au moins trois, ou au moins quatre, ou au moins cinq, ou au moins six, ou au moins sept, ou au moins huit, ou au moins dix, ou au moins quinze, ou au moins vingt souches appartenant à ces espèces. Plus particulièrement, les souches utilisées pour la construction de la banque de spectres de masse peuvent comprendre au moins une souche appartenant à chacune de ces espèces. Plus particulièrement, les souches utilisées pour la construction de la banque de spectres de masse peut comprendre au moins une souche appartenant à chacune des espèces suivantes :Absidia corymbifera, Acremonium strictum, Acrophialophora fusispora, Alternaria alternats, Alternaria tenulsima, Aspergillus candidus, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus hollandicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus restrictus, Aspergillus sydowi, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, 3 o Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans, Beauveria bassiana, Botrytis cinerea, Chaetomium globosum, Chrysonilia sp., Cladosporium carionii, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium herbarum, Cladosporium sphaerospermum, Curvularia sp., Emericiella nidulans, Eurotium chevalieri, Exophiala dermatitidis, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Geomyces pannorum, Humicola sp., Irpex lacteus, Mucor circinelloides, Neosartorya pseudofisheri, Paecilomyces variotii, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium brevicompactum, Penicillium chrysogenum, Penicillium corylophylus, Penicillium purpurogenum, Penicillium roqueforti, Penicillium spirulosum, Phaecoccomyces exophialae, Phialophora parasitica, Rhizomucor pusillus , Rhizopus oryzae, Rhizopus oryzae, Rhizomucor pusillus, Scedosporium apiospermum, Scedosporium prolificans, Schizophyllum commune, Scopulariopsis brevicaulis, Trichoderma viride, Trichophyton interdigitale, Trichotecium roseum, Ulocladium sp.. Dans le cas d'un procédé d'identification d'un macromycète, les souches utilisées pour la construction de la banque de spectres de masse peut comprendre au moins une souche appartenant aux espèces choisies parmi celles mentionnées ci-avant. On entend par « spectres de référence », au sens de la présente invention, le spectre de masse pour une souche de champignon.

Avantageusement, la présence d'au moins deux spectres de référence par souche permet de prendre en compte la variabilité entre différents spectres de masse réalisés pour une même souche de champignon. Eventuellement, les spectres bruts atypiques peuvent être éliminés. Le spectre de référence peut être une synthèse des spectres obtenus à partir d'une culture. Avantageusement, à chaque culture peut correspondre un spectre de référence. Le nombre de spectres de référence peut être d'au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, voire au moins 10. Avantageusement, plus le nombre de spectres de référence est élevé, plus la variabilité potentielle entre les résultats obtenus sur des réplicats de 3o culture est prise en compte. Les spectres de référence sont créés en utilisant le logiciel MALDIBioTyper®.

On entend par « réplicat de culture », au sens de la présente invention, toute culture issue de repiquages différents d'une souche de champignon. En d'autres termes, il peut s'agir de tout produit prélevé d'une sous-culture d'une souche de champignon. Les conditions de culture, de croissance et de réplication de la culture sont donc les mêmes. Chaque réplicat peut contenir des champignons ayant globalement les mêmes caractéristiques phénotypiques que les champignons de la culture dont le réplicat est issu, mais avec des caractéristiques différentes, possiblement liées au polymorphisme des champignons, notamment i o filamenteux, qui ne se développent pas de façon parfaitement identique sur plusieurs repiquages effectués pourtant dans les mêmes conditions expérimentales. Ces variations subtiles, affectant peu le phénotype macro et microscopique, peuvent cependant modifier le profil d'expression protéique et in fine le spectre de masse. Avantageusement, accroître le 15 nombre de spectres de référence issus de repiquages différents augmente la probabilité que le spectre d'un échantillon à identifier se rapproche de l'un ou l'autre des spectres de référence de cette souche. Le procédé de l'invention peut comprendre en outre une étape d'extraction protéique à partir de la culture du champignon filamenteux, 20 notamment sur un support solide. L'étape d'extraction peut donc être réalisée après l'étape de culture. L'étape d'extraction peut être réalisée au moyen d'acide formique (ci-après désigné « FA »), éventuellement accompagné d'un chauffage ou d'une lyse thermique (ci-après désigné « C.FA ») ou d'un broyage avec un instrument du type FastPrepO (ci- 25 après désigné « FP.FA »), voire les deux (ci-après désigné « C.FP.FA »), ou encore d'acide trifluoroacétique. De préférence, l'étape d'extraction est réalisée au moyen d'acide formique. Avantageusement, cette étape permet l'obtention d'un produit d'extraction comprenant tout ou partie des protéines du champignon, notamment les protéines ribosomales. Ce 30 produit d'extraction peut être soumis à l'analyse par spectrométrie de masse.

L'étape d'extraction peut être constituée par l'étape d'extraction à l'acide formique, notamment sans étape de chauffage, de lyse thermique ou de broyage. L'étape d'extraction protéique peut être suivie d'au moins deux dépôts du produit d'extraction sur la cible soumise à la spectrométrie de masse. Il peut s'agir d'au moins 3 dépôts, ou d'au moins 4 dépôts, ou d'au moins 5 dépôts. Avantageusement, plus le nombre de dépôt n'est élevé, et mieux la variabilité des spectres de masse est prise en compte. Le procédé de l'invention peut comprendre en outre, notamment i o après l'étape de construction de la banque, la mise au point d'un score d'identification à l'espèce ou au genre ou à la sous-espèce basé sur la quantification de la ressemblance du spectre de l'échantillon à identifier vis-à-vis : 1) du spectre de référence (A) le plus ressemblant, et : 2) du spectre de référence (B) le plus ressemblant après le spectre (A) et 15 n'appartenant pas à la même espèce, à la même sous-espèce ou au même genre respectivement que celle ou celui du spectre de référence (A). On entend par « score », au sens de la présente invention, toute valeur numérique reflétant la quantification de la ressemblance du spectre 20 de l'échantillon à identifier vis-à-vis : 1) du spectre de référence (A) le plus ressemblant, et : 2) du spectre de référence (B) le plus ressemblant après le spectre (A) et n'appartenant pas à la même espèce, sous espèce ou au même genre respectivement que celle ou celui du spectre de référence (A). La quantification de la ressemblance entre les spectres peut 25 s'effectuer par toute méthode connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une comparaison visuelle, ou d'un calcul par ordinateur, par exemple au moyen d'un logiciel connu de l'homme du métier, comme SARAMIS® (BioMérieux, France), BRUCKER® ou ANDROMAS® (Ferroni et al, Journal of Clinical Microbiology 2010 ; 48 ; 1542-48). 30 Le spectre de référence (A) le plus ressemblant peut être choisi parmi tous les spectres de référence contenus dans la banque. Le spectre de référence (B) peut être choisi parmi tous les spectres de référence contenus dans la banque, hormis le spectre (A). Les critères de choix du spectre (A) sont invariables, et basés sur la ressemblance avec le spectre de l'échantillon à analyser. En revanche, les critères de choix du spectre (B) sont basés à la fois sur la ressemblance avec le spectre de l'échantillon à analyser et la résolution de l'identification souhaitée (au genre, à l'espèce , ou à la sous-espèce), qui peut être aisément déterminée par l'homme du métier. Pour une identification au genre, le spectre de référence (B) peut i o être choisi parmi tous les spectres de référence contenus dans la banque, hormis les spectres référence de même genre que le spectre (A). Pour une identification à l'espèce, le spectre de référence (B) peut être choisi parmi tous les spectres de référence contenus dans la banque, hormis les spectres référence de même espèce que le spectre (A). 15 Pour une identification à la sous-espèce, le spectre de référence (B) peut être choisi parmi tous les spectres de référence contenus dans la banque, hormis les spectres référence de même sous-espèce que le spectre (A). Avantageusement, le procédé de l'invention permet la bonne 20 identification d'un spectre d'un champignon à identifier car il implique en partie la mise au point d'un score reposant d'une part sur la similarité du spectre du champignon à identifier avec les spectres appartenant au même genre, espèce ou sous espèce, et d'autre part sur sa dissemblance avec ceux des autres genres, espèces ou sous-espèces suivant que 25 l'identification est réalisée respectivement au genre, à l'espèce ou à la sous espèce. Le procédé de l'invention peut donc comprendre les étapes suivantes : a. extraction protéique à partir de la culture dudit champignon au 3o moyen d'acide formique, permettant l'obtention d'un produit d'extraction, b. construction d'une banque de spectres de masse de champignons filamenteux, ladite banque étant issue de l'analyse spectrométrique d'au moins une soixantaine de souches de champignons, et ladite banque comprenant au moins deux spectres de référence par souche, chacun desdits spectres de référence étant issu de l'analyse d'un réplicat de culture de chacune desdites souches, c. mise au point d'un score d'identification dudit champignon à l'espèce ou au genre basé sur la quantification de la 1 o ressemblance du spectre de l'échantillon à identifier vis-à-vis : 1) du spectre de référence (A) le plus ressemblant, et : 2) du spectre de référence (B) le plus ressemblant après le spectre (A) et n'appartenant pas à la même espèce, sous-espèce ou au même genre respectivement que celle ou celui du spectre de 15 référence (A). Le procédé de l'invention peut comprendre en outre une étape de détermination d'un seuil associé à une spécificité d'identification désirée, suivie d'une étape d'identification de l'échantillon comme appartenant à la sous-espèce, l'espèce ou au genre du spectre (A) si le score dudit 20 échantillon dépasse ledit seuil. On entend par « seuil associé à une spécificité d'identification désirée », au sens de la présente invention, toute valeur numérique choisie en fonction de la spécificité d'identification désirée. On entend par «spécificité d'identification » le pourcentage d'identification du champignon 25 filamenteux sans erreur. Plus la spécificité désirée est élevée, plus le seuil d'identification choisi est élevé. A contrario, plus la spécificité désirée est faible, plus le seuil d'identification choisi est bas. Le score est une fonction de LS1 et LS2, et peut être calculé selon la formule suivante : 3o Score = aLS1 + (LS1-LS2) dans laquelle : LS1 représente la quantification de la ressemblance du spectre de référence (A) LS2 représente la quantification de la ressemblance du spectre de référence (B) a représente un coefficient non nul. Avantageusement, la fonction choisie est celle permettant d'expliquer le mieux les données observées pour un échantillon donné. Ce choix est basé sur une sélection pas à pas de différents modèles de régression logistique permettant d'obtenir la meilleure spécificité en fonction d'une combinaisons des variables LS1 et LS2, et peut être réalisé par l'homme du métier sans difficulté à la lumière de ces connaissances générales de l'état de la technique. Avantageusement, le modèle retenu est le plus parcimonieux ayant la plus faible valeur du critère d'information d'Aka'ike (AIC). La finalité est d'obtenir à la fois un score le plus élevé possible pour une identification sans erreur ou juste et le plus faible possible pour une identification erronée. On entend par « valeur seuil du score », la valeur du score au delà duquel l'identification est considérée comme juste. Cette valeur est déterminée par une analyse des courbes ROC (receiver operating characteristic) (Fawcett, T. (2006). An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters, 27, 861-874, [58]) réalisées par le logiciel R [Sing T., et al. ([55]). Un autre objet de l'invention se rapporte à un procédé d'extraction, sur support solide, d'un champignon filamenteux au moyen d'acide formique, caractérisé en ce que ledit champignon filamenteux est choisi parmi les genres et espèces suivantes : Aspergillus, notamment Aspergillus candidus, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus hollandicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus restrictus, Aspergillus sydowi, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Aspergillus versicolor, Penicillium, notamment Penicillium aurantiogriseum, Penicillium brevicompactum, Penicillium chrysogenum, Penicillium corylophylus, Penicillium purpurogenum, Penicillium roqueforti, Penicillium spirulosum, Absidia corymbifera, Acremonium strictum, Acrophialophora fusispora, Alternaria alternats, Alternaria tenulsima, , Aureobasidium pullulans, Beauveria bassiana, Botrytis cinerea, Chaetomium globosum, Chrysonilia sp., Cladosporium carionii, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium herbarum, Cladosporium sphaerospermum, Curvularia sp., Emericiella nidulans, Eurotium chevalieri, Exophiala dermatitidis, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Geomyces pannorum, Humicola sp., Irpex lacteus, Mucor circinelloides, Neosartorya pseudofisheri, Paecilomyces variotii, Phaecoccomyces exophialae, Phialophora parasitica, Rhizomucor pusillus, Rhizopus oryzae, Rhizopus oryzae, Rhyzomucor pusillus, Scedosporium apiospermum, Scedosporium inflatum, Scedosporium prolificans, Schizophyllum commune, Scopulariopsis brevicaulis, Trichoderma viride, Trichophyton interdigitale, Trichotecium roseum, Ulocladium sp, et les dermatophytes. Pour cet objet de l'invention, toutes les définitions, modes de réalisation et combinaisons décrits ci-dessus s'appliquent. Un autre objet de l'invention se rapporte à un procédé in vitro d'identification d'un champignon, obtenu par culture sur milieu spécifique à partir d'un échantillon biologique ou environnemental, caractérisé en ce qu'il comprend : a. la construction d'une banque de spectres de masse de champignons, ladite banque étant issue de l'analyse spectrométrique de souches de champignons, b. la mise au point d'un score d'identification dudit champignon à l'espèce ou au genre basé sur la quantification de la ressemblance du spectre dudit échantillon vis-à-vis 1) d'un spectre (A) d'une souche de champignon de la banque le plus ressemblant et 2) d'un spectre (B) d'une souche de champignon de la banque le plus ressemblant après le spectre (A) et n'appartenant pas à la même espèce ou au même genre respectivement que celle ou celui du spectre (A). Pour cet autre objet de l'invention, toutes les définitions, modes de réalisation et combinaisons décrits ci-dessus s'appliquent.

Un autre objet de l'invention se rapporte à un kit d'identification, pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, comprenant (merci de compléter/modifier le cas échéant) : a. les moyens nécessaires à l'extraction protéique d'un champignon filamenteux, ces moyens comprenant de l'acide formique, b. les moyens nécessaires à la construction d'une banque de spectres de masse de champignons filamenteux telle que définie ci-dessus, c. les moyens nécessaires à la mise au point d'un score d'identification dudit champignon à l'espèce ou au genre. Le kit de l'invention comprend tous les moyens connus de l'homme du métier pour la réalisation de l'extraction, de la construction d'une banque de spectres de masse et de mise au point d'un score 20 d'identification, comme des milieux de culture, des plaques ou des boites de culture, des spectromètres de masse, des logiciels d'analyse des spectres de masse, des logiciels de calcul du score, des ordinateurs, cette liste n'étant pas limitative. 25 D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 15 30 Brève description des figures - La figure 1 montre la visualisation « Stack View » des spectres de 8 souches de champignons filamenteux obtenus par les protocoles suivants : FA (A) et C.FA(B) (figure 1A), FP.FA (C) et C.FP.FA (D) (figure 1B) et LIQ (E) (figure 1C). Les figures 1A, 1B et 1C représentent plus particulièrement le rapport masse/charge (m/z) en fonction de l'intensité (u.a). - La figure 2 montre la schématisation de la méthodologie utilisée lors de l'optimisation de la banque de MSPs. - La figure 3 montre une représentation en boite à moustache du i o nombre de pics par spectre (A), des CCI-v (B) et des LS-v (C) des protocoles C.FA, C.FP.FA, FA, FP.FA et LIQ. Les bords de la boite représentent les premier et troisième quartiles. Le sommet et le bas des pointillés symbolisent 1,5 fois l'écart interquartile respectivement ajoutés au premier quartile et retranché au troisième quartile. Les cercles montrent 15 les valeurs extrêmes. - La figure 4 montre une comparaison des valeurs de CCI-v, dCCI, LS-v et dLS de reproductibilité technique entre les protocoles FA, FP.FA et LIQ représentées sous la forme de boites à moustache. Les bords de la boite représentent les premier et troisième quartiles. Le sommet et le bas 20 des pointillés symbolisent 1,5 fois l'écart interquartile respectivement ajoutés au lier quartile et retranché au troisième quartile. - La figure 5 montre une comparaison des valeurs de CCI-v, dCCI, LS-v et dLS de reproductibilité biologique entre les protocoles FA, FP.FA et LIQ représentées sous la forme de boites à moustache. Les bords de la 25 boite représentent les premier et troisième quartiles. Le sommet et le bas des pointillés symbolisent 1,5 fois l'écart interquartile respectivement ajoutés au premier quartile et retranché au troisième quartile. - La figure 6 montre une représentation en boite à moustache des dLS et LS-v du protocole FA détaillés par souche fongique. Les dLS sont 30 représentés en gris et les LS-v en noir. Les flèches signalent les 6 souches dont la médiane des dLS était la plus faible après extraction par le protocole FA. Les bords de la boite représentent les premier et troisième quartiles. Le sommet et le bas des pointillés symbolisent 1,5 fois l'écart interquartile respectivement ajoutés au premier quartile et retranché au troisième quartile. - La figure 7 montre la représentation en boite à moustaches des dLS de chacune de 6 souches en fonction des protocoles FA, FP.FA et LIQ. Les bords de la boite représentent les premier et troisième quartiles. Le sommet et le bas des pointillés symbolisent 1,5 fois l'écart interquartile respectivement ajoutés au premier quartile et retranché au troisième i o quartile. Les astérisques pouvant figurer au-dessus des boites à moustache indiquent la significativité de leur différence avec le protocole FA. - La figure 8 montre une représentation en boite à moustache des valeurs de CCI-v, dCCI, LS-v et dLS obtenues pour le protocole FA.CG 15 comparé à ceux du protocole FA lors du test de reproductibilité technique. Les bords de la boite représentent les premier et troisième quartiles. Le sommet et le bas des pointillés symbolisent 1,5 fois l'écart interquartile respectivement ajoutés au premier quartile et retranché au troisième quartile. Les astérisques pouvant figurer au-dessus des boites à 20 moustache notent la significativité de leur différence avec le protocole FA. - La figure 9 montre la représentation en boite à moustache des valeurs de CCI-v, dCCI, LS-v et dLS obtenues pour le protocole FA.CG comparé à ceux du protocole FA lors du test de reproductibilité biologique. Les bords de la boite représentent les premier et troisième quartiles. Le 25 sommet et le bas des pointillés symbolisent 1,5 fois l'écart interquartile respectivement ajoutés au premier quartile et retranché au troisième quartile. Les astérisques pouvant figurer au-dessus des boites à moustache notent la significativité de leur différence avec le protocole FA. - La figure 10 est une représentation en boite à moustache des 3o valeurs de LS-v et dLS obtenues lors de l'identification des spectres avec chacune des banques B1 à B5. En abscisse, figurent les 5 banques utilisées : B1 à B5. Les bords de la boite représentent les premier et troisième quartiles. Le sommet et le bas des pointillés symbolisent 1,5 fois l'écart interquartile respectivement ajoutés au lier quartile et retranché au troisième quartile. - La figure 11 représente l'histogramme du nombre de réponses correctes et fausses pour chacune des banques. Les nombres figurant au centre des bâtons indiquent le nombre d'identifications correctes, les pourcentages figurant au sommet des bâtons indiquent la proportion d'identifications correctes. - La figure 12 représente les courbes ROC du test d'identification par le MoldScore (A) et le score RP (B). Ces graphes représentent la sensibilité en fonction de 1-spécificité. Les nombres figurant le long de la courbe indiquent la valeur du MoldScore ou du score RP correspondante. Sous la courbe figure la performance globale du test évaluée sur la valeur de l'aire sous la courbe (AUC).

EXEMPLES EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DE CHAMPIGNONS FILAMENTEUX Matériel et méthode

Souches Les 19 souches utilisées pour la mise au point du protocole optimisé de spectrométrie de masse sont décrites dans le tableau I. Tableau 1 : Liste et origine des souches utilisées dans cette étude.

Nom Origine expectoration d'un patient expectoration d'un patient expectoration d'un patient expectoration d'un patient prélèvement d'air environnemental biopsie cutanée prélèvement de cornée expectoration d'un patient contaminant de culture expectoration d'un patient expectoration d'un patient prélèvement d'air environnemental expectoration d'un patient expectoration d'un patient contrôle de qualité expectoration d'un patient IHEM14263 RHIZ002 cutané superficiel M00O002 LBA d'un patient (LBA: liquide de lavage broncho-alvéolaire) Elles sont issues de prélèvements cliniques ou environnementaux 3o reçus au laboratoire de Parasitologie du CHU de la Timone (Marseille, France) pour identification ou de la collection de l'Institut d'Hygiène et d'Epidémiologie (IHEM) de Bruxelles (Belgique). Ces souches ont été identifiées à la fois de façon conventionnelle (macroscopie et microscopie) et par biologie moléculaire (séquençage de la région ITS - Internai 35 Transcribed Region) avant d'être caractérisées par spectrométrie de masse. Les isolats fongiques utilisés dans la seconde partie sont issus de prélèvements cliniques reçus au laboratoire de Parasitologie du CHU de la Timone (Marseille, France), et ont été prélevés dans des expectorations, 4o des fosses nasales, des sinus, des prélèvements cutanés, le LBA, l'oreille droite, l'aspiration bronchique, le mouchage, un abcès cérébral, ou une lentille droite. Leurs principales caractéristiques sont résumées dans le tableau V. Tableau V : 20 10 AFLA002 AFUM001 AFUM002 ANIG001 ATER002 ATER003 ATER004 PEN1006 PEN1007 ALTE004 ALTE006 TRI0001 EXOP001 F U SA003 ABS1001 BEA0001 SCED14263 souche Identifiant Prélèvement d'origine 873055 expectoration 883420 expectoration 918192 expectoration 1000403 fosse nasale 1000521 expectoration 1000525 sinus 1000527 sinus 1000694 cutané 1003358 LBA 1005555 expectoration 1005595 expectoration 1005660 expectoration 1005766 expectoration 1005979 expectoration 1006130 oreille droite 1006351 expectoration 1007277 expectoration 1007329 expectoration 1007409 expectoration 1007844 aspiration bronchique 1007900 sinus 1008115 mouchage 1008277 aspiration bronchique 1008343 expectoration 1008358 expectoration 1008439 expectoration 1008440 expectoration 1008441 expectoration 1008548 oreille droite 1008580 abcès cérébral 1008668 expectoration 1008717 lentille droite 1008846 expectoration 1009096 expectoration 1009264 expectoration 1009394 expectoration Ces isolats ont été identifiés par les techniques d'identification conventionnelles sauf les espèces de Scedosporium et de Fusarium également identifiés par biologie moléculaire selon les pratiques du laboratoire (cf. infra). Les souches pour lesquelles l'identification phénotypique s'avérait impossible (hyphomycetes) ont également été identifiées par biologie moléculaire. Culture Les souches ont été cultivées sur milieu gélosé Sabouraudchloramphénicol-gentamicine (AES, France) ainsi que dans un tube stérile contenant 2 mL de milieu liquide Sabouraud-chloramphenicol (Biomérieux, 1 o France). Les géloses et les milieux liquides ont tous été incubés à 27°C pendant 3 jours et 24h respectivement. Les isolats cliniques ont été cultivés à partir des échantillons cliniques sur une gélose Sabouraud-chloramphenicol-gentamicine et conservées à 27°C pendant 28 jours au maximum. Les géloses étaient 15 examinées tous les deux jours. La détection d'une colonie fongique entraînait leur identification extemporanée par les méthodes phénotypiques et par SM. Identification conventionnelle L'identification conventionnelle a été réalisée par des mycologues 20 expérimentés du Laboratoire de Parasitologie de la Timone sur l'observation des caractéristiques macroscopique et microscopique des colonies après coloration avec du bleu de méthyle (mycetblue, SRB, Paris, France). Identification par biologie moléculaire 25 L'ADN des souches a été extrait à partir de matériel fongique à l'aide du kit QIAmp DNA kits (QIAGEN, France). L'identification par biologie moléculaire reposait sur l'amplification et le séquençage de la région ITS du gène de TARN ribosomal. Le mix de la PCR d'amplification d'un volume final de 32 pL se composait de 5pL de désoxynucléotide triphosphate à 30 0.2 mM, 0.2 pM de chaque amorce, soit V9D et LS266 dont les séquences sont respectivement 5'-TTA AGT CCC TGC CCT TTG TA-3' (SEQ ID NO : 1) et 5'-GTA TTC CCA AAC AAC TCG ACT C-3' (SEQ ID NO : 2), de Hoog GS et al.: Molecular analysis and pathogenicity of the cladophialophora carrionii complex, with the description of a novel species. Stud Mycol 2007, [531), de 5 pL de Tampon 10 X, de 2 U de Taq polymérase (AmpliTaq DNA polymerase, Applyed Biosystem, Inc., Courtaboeuf, France) et de 2 pL d'ADN. Le programme de PCR consistait en une phase initiale de dénaturation de 120 s à 94°C suivi de 35 cycles comportant une dénaturation à 94°C pendant 20 s, une hybridation à 60°C pendant 30 s et une élongation à 72 °C pendant 60 s puis une élongation finale de 420 s à 72°C. Les deux brins, « forward » et « reverse », ont été sequencés, en utilisant le protocol Big Dye Terminator (Appled Biosystem, Inc., Courtaboeuf, France) avec les amorces ITS1 5'-TCG GTA GGT GAA CCT GCG G-3' (SEQ ID NO : 3), ITS4 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3' (SEQ ID NO : 5) et ITS5 5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G- 3' (SEQ ID NO: 4). Le programme d'amplification effectué sur un thermocycleur T_gradient Thermoblock (Biometra) était le suivant : 2 min à 96°C puis 25 cycles de 10 s à 96°C, 5 s à 50°C, 240 s à 60°C. Les séquences obtenues ont ensuite été comparées aux séquences de la banque GenBank en utilisant le logiciel BLAST (http://ncbi.nlm.qov/BLAST/).

Spectrométrie de masse 1. Récolte des colonies à partir des différents milieux de culture La récolte a été effectuée de la même façon qu'il s'agisse d'une souche destinée à intégrer la banque ou d'un isolat clinique. Les champignons filamenteux cultivés sur une gélose sabouraud chloramphenicol-gentamicine ont été récoltés par grattage de la surface des colonies avec une pince à suture stérile (sterile suture forceps, Euroband). Du matériel fongique (hyphes et spores) de la taille d'une lentille a été déposée dans un ou plusieurs tubes Eppendorf stériles contenant 300 pL d'eau HPLC (Water HPLC, Prolabo BDH, Fontenay- sous-Bois, France) et 900 pL d'éthanol absolu (ethyl alcohol anhydrous, Carlo Erba SDS, Val de Reuil, France) en vue de l'extraction protéique. Les champignons filamenteux cultivés en milieu sabouraud liquide ont été centrifugés à 13 000g pendant 10 min puis le culot a été lavé 3 fois avec 1 mL d'eau HPLC. Le culot a ensuite été remis en suspension dans une solution hydro-alcoolique (300pL d'eau HPLC et 900 pL d'éthanol absolu). 2. Extraction protéique Les protéines du matériel fongique en suspension hydro-alcoolique ont été extraites selon cinq protocoles différents appelés FA, C.FA, FP.FA, C.FP.FA et LIQ (culture en milieu liquide) suivant qu'il comportait une étape de congélation, de lyse thermique et/ou de lyse mécanique. Les échantillons destinés au protocole FA ont été prélevés en double dont une moitié à été congelée tandis que l'autre a été traitée extemporanément. 2.1 Protocole FA et FA.CG Le matériel fongique en suspension hydro-alcoolique était soit congelé à -80°C pendant 7 jours (FA.CG) soit immédiatement extrait (FA). L'extraction commençait ensuite par une centrifugation de 10 min à 13000 g. Le culot séché était ensuite re-suspendu dans 10 pL d'acide formique (Sigma-Aldrich, Lyon, France) à 700/0. Après 5 min d'incubation à température ambiante, 10 pL d'acétonitrile 1000/0 (Prolabo BDH, Fontenay-sous-Bois, France) était ajouté et incubé pendant 10 min. L'échantillon était centrifugé à 13 000 g pendant 2 min juste avant d'être déposé sur une cible (cf. infra). 2.2. Protocole C.FA Dans ce protocole, le matériel fongique était soumis à une étape de lyse thermique supplémentaire par rapport au protocole FA. La lyse thermique a été effectuée par chauffage du matériel fongique en suspension hydro-alcoolique à 95°C pendant une heure dans un bain-sec. 3o Puis l'extraction suivait les étapes décrites dans le protocole FA. 2.3. Protocole FP.FA Ce protocole comportait une étape de lyse mécanique supplémentaire par rapport au protocole FA. La lyse mécanique consistait à soumettre le matériel fongique en suspension hydro-alcoolique à 3 cycles de broyage (30 s à la puissance 6.5) en présence de 200 pL de bille de verre de 0.1 mm de diamètre sous l'effet des mouvements horizontaux et verticaux d'un FastPrep 24 (MP Biomedicals, LLC). Puis l'extraction suivait les étapes décrites dans le protocole FA. 2.4. Protocole C.FP.FA Ce protocole se déroulait suivant les étapes du protocole FP.FA i o précédée d'une étape de lyse thermique (cf supra). 2.5. Protocole LIQ L'extraction comportait les mêmes étapes que celles décrites dans le protocole FA appliquée aux suspensions hydro-alcooliques de champignons filamenteux cultivés en milieu liquide. 15 3. Dépôts sur la cible MALDI-TOF Une goutte de 1 pL de surnageant était ensuite déposé sur une cible en acier poli (MTP 384 target plate polished steel, Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany) et laissée sécher à l'air. Chaque dépôt était ensuite recouvert d'1 pL de solution de matrice. La matrice se composait d'une 2o solution aqueuse d'acétonitrile (500/0) et d'acide trifluoroacetique (TFA) (2,50/0) saturée en acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (Sigma-Aldrich, Lyon, France). Les échantillons étaient déposés soit en quadruplicat soit en décaplicat (cf infra). 4. Acquisition des spectres 25 Les spectres ont été réalisés sur un Autoflex 1 en mode linéaire d'ion positif avec un laser à nitrogène émettant à 337 nm avec les réglages suivants : délai : 170 ns, source ionique 1 : voltage 20 kV, source ionique 2 : voltage 20 kV, rang de masse analysé : 2-20 kDa, temps d'acquisition : 30 à 60 seconde par tir laser). Les données ont été automatiquement 3o acquises par 1'AutoXecute du logiciel Flexcontrol v2.4 (Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany) puis importées et analysées grâce au logiciel BioTyper v2.1 (Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany). Seuls les pics dont le rapport signal sur bruit était supérieur à 10 et ayant un m/z compris entre 3 et 20 kDa ont été considérés dans cette étude. 5. Création des spectres de référence (MSP) Chaque spectre de référence a été créé à partir de 4, 10, 20 ou 40 spectres d'un même isolat en utilisant la fonction « MSP creation » du logiciel MaldiBioTyper® avec les paramètres standards (erreur de masse maximale de chaque spectre brut, 2000 Da ; erreur de masse désirée pour le MSP, 200 Da ; fréquence minimale désirée pour un pic, 25 %; nombre maximal de pics pour la création d'un MSP, 70). 6. Création des matrices de corrélation Chaque matrice de corrélation a été créée à partir des informations spectrales de 4 ou 10 spectres par souche via la fonction « Create Composite Correlation Index Matrice» du logiciel MaldiBioTyper® avec les paramètres standards (Limite inférieure de l'intervalle de masse analysé, 3000 Da; limite supérieure de l'intervalle de masse analysé, 12000 Da; résolution de l'intervalle de masse analysé, 4; nombre de masse des intervalles, 8). 7. Obtention des LogScores (LS) et des coefficients de corrélation (COI) Le LogScore est le score caractérisant la fiabilité de l'identification obtenue lors de la procédure d'identification d'un spectre inconnu avec une banque de MSPs. Chaque MSP possède un score maximal consistant en l'addition du nombre de pic pondéré par leur fréquence (Score Max).

L'identification commence par l'alignement des pics les plus intenses du spectre inconnu avec ceux des MSPs. Chaque pic du spectre inconnu est ensuite comparé avec ceux des MSP et leur score réel calculé (Score Réel). Sont ensuite répertoriés le nombre de pics du spectre inconnu se situant dans la fenêtre de tolérance de m/z (Nbr.Pint.) et ceux se situant à l'extérieur de cette fenêtre (Nbr. Pext.). Le LS est ensuite calculé comme suit : LS = log score Réel x Nbr.Pint+ 0.5Nbr.Pext x corrl x 1000 score Max Nbr. total de pic du spectre inconnu avec corrl représentant la valeur de corrélation des intensités des pics. La corrélation composite est une méthode d'analyse statistique des

10 relations entre les spectres (Arnold RJ, Reilly JP: Fingerprint matching of e. Coli strains with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of whole cells using a modified correlation approach. Rapid Commun Mass Spectrom 1998, [54]). Après découpage du spectre en intervalles, une valeur normalisée de corrélation sur l'intervalle est 15 calculée entre les spectres comparés. Le CCI consiste en la moyenne géométrique des valeurs normalisées de corrélation obtenues sur chaque intervalle ([54]). Les coefficients de corrélation (CCI) ont été obtenus par l'inclusion d'un spectre dans une matrice grâce à la fonction «Match Composite Correlation Index » du logiciel MaldiBiotyper. Les 20 LogScores (LS) ont été obtenus par la comparaison d'un spectre avec une banque de MSPs grâce aux fonctions « Start Identification » du logiciel MaldiBiotyper. Le LS-v et le CCI-v ont respectivement été définis comme étant le score de LS et de CCI le plus élevé pour une souche de même espèce 25 que celle de l'échantillon testé (réponse juste). A contrario, le LS-f et le CCI-f ont été respectivement définies comme le score le plus élevé de LS et de CCI pour une espèce différente de celle de l'échantillon testé (mauvaise réponse ayant le meilleur score) (cf. Figure 1). Les dLS et le dCCI ont été définis respectivement comme la différence entre le LS-v et 30 le LS-f et le CCI-v et le CCI-f. Le LS1 a été défini comme le LS de score le plus élevé et le LS2 comme le second score le plus élevé pour une espèce de champignon différente de LS1. Il en résulte que LS-v est égal à LS1 et LS-f à LS2 pour une souche correctement identifiée. A contrario, LS-f est égal à LS1 pour une souche mal identifiée.

Evaluation de différents protocoles pour l'obtention de spectres 1. Evaluation des protocoles FA, FP.FA, C.FA, C.FP.FA et LIQ Comme aucun protocole validé n'existe pour l'identification des champignons filamenteux par SM, le premier objectif de ce travail a été de comparer cinq protocoles différents : FA, C.FA, FP.FA, C.FP.FA et LIQ testés en parallèle sur 8 souches de champignons filamenteux (ANIG001, AFUM001, AFLA002, ATER002, ALTE004, TRI0001, FUSA001 et EXOP001) (cf. Tableau 1). Les spectres de chaque souche cultivées sur i o Sabouraud, issus des cultures solide (gélose, GO) et liquide (LO) ont servis à réaliser cinq matrices (une par protocole) ainsi que cinq banques de MSP. Chaque spectre a été inclus dans la matrice de corrélation et comparé à la banque de MSPs issues du même protocole afin d'obtenir respectivement le CCI-v et le LS-v. L'effet des différents protocoles 15 d'extraction sur la qualité des spectres a été évalué dans un premier temps de manière qualitative et visuelle sur l'allure générale des spectres observés via la fonction « gel view » et « stack view » du logiciel MaldiBioTyper®. La qualité des spectres a également été évaluée par la comparaison du nombre médian de pics composant les MSP, de la 20 médiane des CCI-v, des LS-v. Ces variables quantitatives ont été comparées entre les cinq protocoles par un test de somme des rangs de Kruskall-Wallis. Lorsque le test de Kruskall-Wallis montrait une différence significative (p-value < 0,05), i1 était complété d'une analyse post-hoc par une comparaison deux à deux des protocoles par le test de Wilcoxon 25 apparié avec ajustement de Ho1ms. Dans une seconde étape, la reproductibilité technique et la reproductibilité biologique des protocoles FA, FP.FA et LIQ ont été comparés sur un panel de 19 souches de moisissures (cf. Tableau 1). Les protocoles C.FA et C.FP.FA n'ont pas été retenus pour cette deuxième 30 étape car ils avaient généré des spectres de qualité médiocre lors de la première étape.

Pour tester la reproductibilité technique, les spectres issus des milieux de culture G1 (gélose Sabouraud-gentamicine-chloramphenicol) et L1 (Sabouraud liquide) ont servis à réaliser 5 matrices de corrélation et 5 banques de MSPs. Les spectres ont ensuite été inclus dans la matrice et comparés à la banque de MSPs issus du même protocole. Les CCI-v, les dCCI, les LS-v et les dLS ont été enregistrés. La médiane des CCI-v, des dCCI, des LS-v et des dLS obtenus avec chacun des protocoles ont ensuite été comparés par le test de Kruskall-Wallis puis par le test non-paramétrique apparié de Wilcoxon. Cette expérience avait pour but de i o déterminer la reproductibilité technique des spectres obtenus par chacun des protocoles. Pour tester la reproductibilité biologique, les spectres obtenus à partir des milieux de culture G5 (gélose Sabouraud-gentamicinechloramphenicol) et L2 (Sabouraud liquide) ont été inclus dans la matrice 15 de corrélation et comparés à la banque de MSPs issues du même protocole et construite à l'étape précédente. CCI-v, dCCI, LS-v et dLS ont été de nouveau comparés comme décrit précédemment. Le nombre de réponses justes (LS-v>LS-f) entre les 3 protocoles ont également été comparées deux à deux par un test de Mc Nemar (McNemar, Quinn (June 20 18, 1947). "Note on the sampling error of the difference between correlated proportions or percentages". Psychometrika 12 (2): 153-157, [591) sans correction de continuité. 2. Impact de la congélation Les spectres issus du protocole FA.CG obtenus à partir des 25 échantillons prélevés sur la gélose G1 ont servis à construire une matrice et une banque de spectre de référence pour le protocole FACG. Les CCI-v et dCCI des décaplicats de spectres du protocole FA.CG ont été obtenus par inclusion dans la matrice issue du protocole FA.CG. Les LS-v et les dLS des décaplicats de spectres du protocole FA.CG ont été obtenus par 30 identification de ces spectres par la banque de MSPs issue du protocole FA.CG.

L'effet de la congélation sur la reproductibilité technique des spectres a été évalué en comparant les CCI-v, les dCCi, les LS-v et les dLS du protocole FA.CG à ceux du protocole FA par un test de Mann Whitney. L'effet de la congélation sur la reproductibilité biologique a été évalué en comparant les CCI-v, les dCCI, les LS-v et les dLS obtenus par le protocole FA.CG avec ceux du protocole FA par un test de Mann Whitney. Enfin, les spectres issus de la gélose G5 issus du protocole FA.CG ont été identifiés en utilisant la banque de référence du protocole FA. Les LS-v et dLS ont été comparés à ceux précédemment obtenus lors de l'identification de ces mêmes spectres avec la banque de MSPs issue du protocole FA.CG. Optimisation de la banque de MSP - Cette étape n'a été réalisée que pour une seule méthode de préparation des échantillons, à savoir la méthode FA, qui présentait l'avantage d'être la plus simple à mettre en oeuvre en routine tout en donnant les meilleurs résultats lors des évaluations des deux premières étapes. Lors de cette troisième étape, cinq méthodes de constitution d'une banque ont été comparées (cf. Figure 2). Les spectres obtenus par le protocole FA à partir des géloses G1 à G4 ont servi à créer cinq banques de MSPs (B1 à B5). La banque B1 se composait d'un seul MSP par souche calculé à partir des 10 spectres issus de la gélose G1. La banque B2 se composait de quatre MSPs par souche (soit 76 MSPs en tout) réalisés à partir de 10 spectres issus de chacune des géloses G1 à G4. La banque B3 se composait de deux MSPs par souche (soit 38 MSPs en tout) chacun étant composé des données spectrales issus de deux géloses (20 spectres par MSP). La banque B4 a été constituée en créant un seul MSP par isolat calculé à partir des 40 spectres issus des géloses G1 à G4. Lors d'une dernière étape d'optimisation, une cinquième banque, la banque B5 a été créée. Comme la banque B2, elle comprenait quatre MSPs par 3o souche, soit 76 MSPs différents. Cependant, ces MSPs n'étaient composés que des sept meilleurs spectres obtenus pour chaque gélose (i.e. les 7 spectres dont les LS-v étaient les plus élevés). Les spectres obtenus à partir de la gélose G5 avec le protocole FA ont été utilisés pour comparer les 5 banques. Un premier screening visuel a été mis en place pour identifier d'éventuelles erreurs de manipulation correspondant à la contamination d'un dépôt par un dépôt voisin. Une fois ces erreurs éliminées de l'analyse, les spectres restants ont chacun été identifiés successivement en utilisant les banques B1, B2, B3, B4 et B5. Les LS-v et dLS obtenus avec chaque banque ont été comparés comme décrit précédemment. i o La dernière étape a consisté à tester l'effet d'un changement de spectromètre de masse. Pour ce faire, les 19 souches ont été remises en culture sur une gélose G6 qui a été traitée de façon identique à la gélose G5. L'extraction protéique a été effectuée par le protocole FA. Quatre spectres par souches ont été acquis sur un Autoflex II (Bruker Daltonics 15 GmbH, Bremen, Germany). Les spectres ont été screenés visuellement puis identifiés en utilisant les banques B1 à B5. Les LS-v et les dLS ont été à nouveau comparés (cf. Figure 2). Détermination d'un score d'identification La mise au point du score d'identification a été effectuée sur la base 20 des résultats de l'identification des quadruplicats de spectre des 36 isolats cliniques extraits avec le protocole FA et après identification avec la banque B2. Les erreurs d'identification, dues à une contamination d'un dépôt par un autre, détectables visuellement ont été préalablement supprimées. Une variable catégorielle « identification » à deux classes a 25 été définie. Cette variable prenait la valeur «vrai » lorsque l'identification du spectre donnée par le LS1 correspondait à l'identification phénotypique et/ou moléculaire et la valeur « fausse » dans le cas contraire. La variable « identification » a été supposée pouvoir être prédite par le LS1 et/ou le LS2 et/ou leur différence et/ou leur produit et/ou leur rapport et/ou leur 30 ratio normalisé. Toutes les combinaisons possibles de ces variables explicatives ont été testées en utilisant une démarche pas à pas de régression linéaire logistique dont l'équation était la suivante : « identification » = F ( a + b LS1 + c LS2 + d (LS1-LS2) + eLS1*LS2 + fLS1/LS2 + g(LS1-LS2)/LS2 ) où a, b, c ,d ,e, f ,g sont des constantes. La sélection du modèle de régression prédisant le mieux la variable « identification » s'est basée sur le critère d'information d'Akaike (Akaike, Hirotugu (1974). "A new look at the statistical model identification". IEEE Transactions on Automatic Control 19 (6): 716-723, [60]). La combinaison i o de variables explicatives de plus faible AIC a été retenue comme modèle prédictif. Le score d'identification particulier aux moisissures (MoldsScore) a alors été défini comme le résultat de l'équation de la droite de régression logistique du modèle prédictif retenu. Toujours en utilisant ce modèle, la probabilité que l'identification donnée par le LS1 soit juste a été calculée 15 pour chacun des spectres. Puis une valeur seuil du score a été déterminée sur l'analyse de la courbe ROC (receiver operating characteristic) en utilisant l'extension ROCR du logiciel R (Sing T, Sander O, Beerenwinkel N, Lengauer T: Rocr: visualizing classifier performance in R software. Bioinformatics 2005, [55]). 20 Essai d'identification des isolats cliniques par spectrométrie de masse Les isolats cliniques ont été re-identifiés en utilisant les critères d'interprétation définis lors des étapes précédents. Après un tri des spectres par screening visuel, les spectres ont été identifiés avec la 25 banque de référence B2 afin de calculer leur score RP. Les isolats cliniques dont l'un des spectres avait un score RP > 1,6 ont été considérés comme identifié par la SM et cette identification a été comparée à celle obtenue par les méthodes conventionnelles et par biologie moléculaire. Statistiques 30 Les tests statistiques ont été réalisés en utilisant le logiciel R (http://www.r-project.org/) avec ajout des extensions (« package ») MASS et ROCK. Tous les tests statistiques ont été réalisés de façon bilatérale au risque d'erreur a égal à 50/0.

Résultats Résultats de l'identification phénotypique et moléculaire des souches et des isolats 1. Identification des souches La croissance des 19 souches de moisissures sous leur forme anamorphe avec production de fructification a permis l'identification i o phénotypique au moins jusqu'au genre pour toutes les souches. L'identification à l'espèce a été réalisée uniquement pour les souches du genre Aspergillus. L'identification moléculaire a été obtenue pour 14 souches et a confirmé le résultat de l'identification phénotypique. Elle a également précisé l'identification jusqu'à l'espèce de 10 souches. Le 15 séquençage du gène de l'ITS s'est révélé insuffisamment discriminant pour AFLA002, ANIG001, ALTE004 et ALTE006. Les séquences obtenues présentaient des pourcentage d'homologie identiques avec plusieurs séquences de la banque de référence GenBank de plusieurs moisissures du même genre mais appartenant à des espèces différentes. Aucune 20 identification moléculaire n'a pu être obtenue pour les souches ATER003, PEN1006, PEN1007, RHIZ002 et TRI0001 malgré des tentatives répétées. 2. Identification des isolats cliniques Sur les 36 isolats cliniques, 35 ont pu être identifiés au moins au genre par les méthodes phénotypiques. L'identification phénotypique a été 25 réalisée jusqu'à l'espèce pour les isolats appartenant au genre Aspergillus. L'isolat 1007329 n'ayant pas produit de fructifications lors de sa croissance n'a pu être identifié précisément phénotypiquement. L'observation d'hyphes hyalins septés l'a fait classé dans le groupe des hyalohyphomycetes. 30 L'identification moléculaire n'a été entreprise que pour les 9 isolats appartenant à l'ordre des Mucorales, aux genres Scedosporium et10 Fusarium ou au groupe des hyalohyphomycètes selon les pratiques du laboratoire. Une identification moléculaire a été obtenue pour 8 isolats ; les deux tentatives de séquençage ayant échoué pour l'isolat de Fusarium 1008717. L'identification moléculaire a confirmé et précisé les résultats de l'identification phénotypique des isolats.

Tableau II : Identification phénotypique et moléculaire des souches de cette étude 15 Molecular identification Origine Phenotypic identification results accession number sputum sample A. fia vus A.flavus ou oryzae ou DQ467968/AY373857/DQ0260( parasiticus 1 sputum sample A. fumigatus A. fumigatus AY214448 ? sputum sample A. fumigatus A. fumigatus AY214448 sputum sample A. niger A.niger/ tubigien sis EF661193/EF661191 air sample A. terreus A. terreus AY373871 3 cutaneous biopsy A. terreus NA NA i cornea A. terreus A. terreus AY303607 sputum sample Penicillium sp. NA NA sputum sample Penicillium sp. NA NA sputum sample Alternaria sp. A. tenuissima, alternata, mail GQ995482.1 sputum sample Alternaria sp. A. tenuissima, citri GQ995482.1 / AY154705.1 air sample Trichoderma sp. NA NA 1 sputum sample Exophiala sp. Exophiala sp. AF050267 3 sputum sample Fusarium sp. F. oxysporum AY667487.1 air sample Absidia sp. A. corymbifera DQ11898.1 1 sputum sample Beauveria sp. B. brongniartii AB027381.1 IHEM14263 Scedosporium NR NR 33 strain apiospermum cutaneous biopsy Penicillium sp. NA NA 2 BAL Rhizopus sp. R. oryzae AB 109758.1 Pour les souches dont la séquence ITS s'est révélée insuffisamment discriminante pour donner une identification à l'espèce, toutes les identifications présentant la même homologie sont consignées dans la colonne de l'identification moléculaire ainsi que leur numéro d'accession GenBank correspondant. (n° : numéro; LBA: liquide de lavage broncho-alvéolaire; NO: séquence non obtenue; NR: séquence non réalisée). 1 o Tableau III : Identification phénotypique et moléculaire des isolats cliniques Nom Prélèvement Identification Identification moléculaire d'origine phénotypique n° accession Score espèce GenBank d'identité 1000525 sinus A. flavus NR NR NR 1000527 sinus A. flavus NR NR NR 1006130 oreille droite A. flavus NR NR NR 1000521 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1005555 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1005766 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1005979 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1007409 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1007844 aspiration A. fumigatus NR NR NR bronchique 1008277 aspiration A. fumigatus NR NR NR bronchique 1008358 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1008440 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1008668 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1008846 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1009096 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1009264 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1009394 expectoration A. fumigatus NR NR NR 1008441 expectoration A. niger NR NR NR 1008548 oreille droite A. niger NR NR NR 1008580 abcès cérébral A. terreus NR NR NR 1008115 mouchage Alternaria sp. NR NR NR 1006351 expectoration Beauveria sp. NR NR NR 1000694 cutané Fusarium sp. F.solani AF150465 100 1007277 expectoration Fusarium sp. F. oxysporum AB 237662 99 1008717 lentille droite Fusarium sp. NO NO NO Beauveria 1007329 expectoration hyalohyphomycete brongniartii AB 027381 99 918192 expectoration Penicillium sp. NR NR NR 1003358 LBA Penicillium sp. NR NR NR 1005595 expectoration Penicillium sp. NR NR NR 1008343 expectoration Penicillium sp. NR NR NR 1000403 fosse nasale Rhizopus sp. Rhizopus oryzae DQ119017 100 873055 expectoration Scedosporium sp. S. aurantiacum AJ888441 99,63 Pseudallescheria 883420 expectoration Scedosporium sp. boydii AJ888418 99,62 Pseudallescheria 1005660 expectoration Scedosporium sp. boydii AJ888418 99,62 Pseudallescheria 1008439 expectoration Scedosporium sp. boydii AJ888418 99,62 1007900 sinus Trichoderma sp. NR NR NR (n° : numéro; LBA: liquide de lavage broncho-alvéolaire; NO: séquence non obtenue; NR: séquence non réalisée).

Evaluation des différents protocoles pour l'obtention de spectres 1.Test de répétabilité sur un panel de 8 souches La première étape de ce travail a consisté en la mise au point d'un i o protocole optimisé d'extraction protéique des souches de champignons filamenteux. Le but était d'obtenir des spectres dont le nombre et l'intensité des pics seraient suffisants pour permettre l'identification des moisissures. Les cinq protocoles testés en parallèle sur 8 souches ont tous permis d'obtenir des spectres présentant des pics dont les masses moléculaires 15 s'étendaient de 3 à 15 kDa. La majorité des espèces ioniques détectées se situaient entre 3 et 6 kDa quel que soit le protocole utilisé. Les spectres paraissaient différer en fonction de la souche ainsi que du protocole utilisé tandis que les spectres issus d'une même souche et d'un même protocole étaient beaucoup plus ressemblants (cf. Figure 1). Visuellement, les protocoles C.FA et C.FP.FA ont fourni des spectres comportant des pics en nombre et en intensité plus faible que les trois autres protocoles ne comportant pas d'étape de lyse thermique (cf. Figure 1). A contrario, les spectres issus des protocoles FA, FP.FA comportaient de nombreux pics à la fois plus intenses et plus fins s'étendant sur un plus vaste domaine de i o m/z. Le protocole LIQ a donné des pics de qualité intermédiaire entre les protocoles comportant une lyse thermique et FA et FP.FA. La comparaison statistique du nombre de pics, des CCI-v et des LS-v a confirmé l'appréciation visuelle des spectres. En effet, le nombre de pics ainsi que les valeurs de LS obtenues par les protocoles C.FA et C.FP.FA étaient 15 statistiquement inférieures à celle des protocoles FA, FP.FA et LIQ (p-value < 0,05). Les CCI-v de C.FA et C.FP.FA étaient également statistiquement plus faibles que ceux de FA (p-value < 0,05) sans toutefois différer de ceux de FP.FA et LIQ (p-value > 0,05). La comparaison des variables nombre de pics, LS-v et CCI-v n'a par contre pas montré de 20 différence entre les protocoles FA, FP.FA et LIQ (p-value > 0,05) (cf. Tableau IV et Figure 3. Tableau IV : Données statistiques (1) et la significativité des tests (2) de comparaison des différentes variables : nombre de pic par spectre (A), CCI-v (B), LS-v(C). Nombre de pics par spectre Al FA C.FA FP.FA min. lier médiane 3ième max. quartile quartile 61 70 70 70 70 6 52,75 57 61,75 70 61 68,75 70 70 70 C.FP.FA 40 44 48,5 54,25 59 LIQ 65 68 69 70 70 CCI-v B1 min. lier médiane 3ième max. quartile quartile FA 0,587 0,9113 0,947 0,966 1 C.FA 0,548 0,7215 0,8035 0,9477 1 FP.FA 0,587 0,7808 0,933 0,948 1 C.FP.FA 0,541 0,6995 0,8285 0,8882 0,9 LIQ 0,585 0,7905 0,89 0,9447 1 LS Cl min. lier médiane 3ième max. quartile quartile FA 2,177 2,412 2,58 2,646 2,7 C.FA 1,284 2,083 2,245 2,338 2,8 FP.FA 1,781 2,36 2,518 2,57 2,7 C.FP.FA 0,887 1,558 1,913 2,143 2,4 LIQ 2,124 2,358 2,429 2,56 2,7 A2 Test de Kruskall-Wallis : Test de Wilcoxon apparié, correction de Holms p-value FA FP.FA C.FP.FA / / FA / / FP.FA 0,96 / LIQ 1 1 B2 Test de Kruskall-Wallis : Test de Wilcoxon apparié, correction de Holms FA FP.FA / / / / 0,6256 / 0,1205 0,6402 C2 Test de Kruskall-Wallis : Test de Wilcoxon apparié, correction de Holms FA FP.FA / / / / 0,128 / 0,107 0,421 Les valeurs significatives sont indiquées en gras. (min.: valeur minimale prise par la variable, max.: valeur maximale prise par variable, K : résultat du test de Kruskall-Wallis, df : degré de liberté). 2. Evaluation des protocoles FA, FP.FA et LIQ sur un panel de 19 souches Cette évaluation, menée sur un panel de 19 souches et un nombre augmenté de spectres, a permis de mettre en évidence des différences de reproductibilité entre les protocoles FA, FP.FA et LIQ. Lors du test de reproductibilité technique, les dCCI, les LS-v et dLS différaient significativement entre les 3 protocoles (p-value<0,05). Les médianes de ces variables étaient plus élevées pour le protocole FA que pour FP.FA, elles même plus élevées que celle de LIQ (cf. Tableau V et Figure 4. Les valeurs de dCCI, LS-v et dLS de reproductibilité biologique étaient significativement plus faibles (p- value<0,05) pour le protocole LIQ. Les protocoles FA et FP.FA n'étaient p-value C.FP.FA FA FP.FA LIQ p-value C.FP.FA FA FP.FA LIQ par contre pas différents (cf. Tableau VI et Figure 5). Les CCI-v de reproductibilité technique et biologique se sont par contre toujours avérés statistiquement similaires. Les résultats ci-dessus montrent que le protocole FA était « globalement » le plus reproductible des protocoles pour l'ensemble des souches testées. Cependant ces résultats ne prouvent pas que FA soit le protocole le plus adéquat pour chacune des souches. Les valeurs de dLS obtenues avec FA ont alors été analysées de façon détaillée pour chacune des souches (cf. Figure 6). Les 6 souches de plus faible dLS avec le protocole FA étaient : ALTE004, ALTE006, EXOP001, FUSA003, PEN1007 et RHIZ002. Pour ces 6 souches, les dLS obtenues avec FA ont été comparés aux dLS obtenus avec les protocoles FP.FA et LIQ (cf. Figure 7). Ces deux protocoles ne se sont pas montrés plus performants que FA. Le protocole LIQ a toujours donné des valeurs de dLS statistiquement inférieures à celle de FA pour les 6 souches. Quant aux dLS obtenus avec FP.FA, ils étaient inférieurs à ceux de FA pour ALTE004, FUSA003, PEN1007 et RHIZ002 et n'étaient pas différents de ceux de FA pour ALTE006 et EXOP001. Les protocoles FA, FP.FA et LIQ ont respectivement identifié correctement 63, 60 et 39 spectres. Si la proportion de bonne identification n'étaient pas statistiquement différente entre FA et FP.FA (p-value = 0,0823), elles l'étaient fortement entre le protocole LIQ et les protocoles FA (p-value<10-6) et FP.FA (p-value<10-5).

Tableau VI : Données statistiques (1) et significativité des tests (2) de comparaison de la reproductibilité technique des différentes variables entre FA, FP.FA et LIQ : CCI-v (A), dCCI (B), LS-v (C) et dLS-v (D). Tableau VI : A1: données statistiques des CCI-v CCI- lier 3ième v min. quartile médiane quartile max.

FA 0,28 0,75 0,8 0,94 1 FP.FA 0,27 0,69 0,8 0,93 1 LIQ 0,46 0,71 0,77 0,93 1 B1: données statistiques des dCCI lier 3ième dCCI min. quartile médiane quartile max. FA 0,35 0,22 0,36 0,48 0,8 FP.FA 0,37 0,2 0,34 0,48 0,7 LIQ 0,39 0,16 0,28 0,42 0,7 C1: données statistiques des LS-v lier 3ième LS-v min. quartile médiane quartile max. FA 1,78 2,34 2,51 2,61 2,8 FP.FA 1,56 2,17 2,41 2,33 2,7 LIQ 0,29 2,01 2,22 2,47 2,7 D1: données statistiques des dLS lier 3ième dLS min. quartile médiane quartile max. FA 0,38 1,05 1,34 1,59 2,1 FP.FA 0,71 1,02 1,31 1,52 2 LIQ 0,67 0,88 1,19 1,41 1,8 A2 : résultats des tests de comparaison des CCI-v Test de Kruskall-Wallis : K= ,97 , df = 2, p-value = 0,37 Test de Wilcoxon apparié, correction de Holms p-value FA FP.FA 53 FP.FA 0,87 / LIQ 0,66 0,87 B2 : résultats des tests de comparaison des dCCI Test de Kruskall-Wallis : 18,61 , df = 2, p-value = 9,06e-05 Test de Wilcoxon apparié, correction de Holms p-value FP.FA LIQ C2 : résultats des tests de comparaison des LS-v Test de Kruskall-Wallis : 34,21 , df = 2, p-value = 3,721e-08 Test de Wilcoxon apparié, correction de Holms FA FP.FA 0,13 / 2,40E-06 8,80E-07 D2 : résultats des tests de comparaison des dLS Test de Kruskall-Wallis : 57,17 , df = 2, p-value = 1,724e-12 Test de Wilcoxon apparié, correction de Holms FA FP.FA 0,27 / 7,10E-09 1,20E-09 Les valeurs significatives sont indiquées en gras. (min.: valeur minimale prise par la variable, max.: valeur maximale prise par variable, K : résultat du test de Kruskall-Wallis, df : degré de liberté). (FA : protocole d'extraction chimique à partir de souches fongiques cultivées en milieu solide ; FP.FA : protocole d'extraction mécanique et chimique de souches fongiques cultivées en milieu solide; LIQ : protocole d'extraction chimique de souches fongiques cultivées en milieu liquide).

En conclusion, les résultats des tests de reproductibilité technique et biologique ont mis en évidence que le protocole LIQ donnait des FA FP.FA 0,13 / 7,60E-03 4,80E-04 p-value FP.FA LIQ p-value FP.FA LIQ résultats inférieurs à ceux des autres protocoles. Le protocole FA, de plus hautes médianes de CCI-v et de LS-v de reproductibilité, avait une reproductibilité soit identique soit supérieure au protocole FP.FA. La reproductibilité des 6 souches donnant les plus médiocres valeurs de dLS avec FA n'était pas statistiquement améliorée par les autres protocoles. FA apparaît donc comme le protocole fournissant les spectres les plus reproductibles. Les protocoles FP.FA et LIQ, de surcroît plus complexes et chronophages, ont donc été abandonnés devant ces résultats. 3. Impact de la congélation i o Cette étape avait pour but d'évaluer la possibilité de congeler les échantillons avant leur identification par SM. L'identification des spectres issus du protocole FA.CG de la gélose G5 par la banque de MSP a correctement identifié 53 spectres sur 76. Les spectres après congélation se sont donc révélés statistiquement moins souvent correctement 15 identifiés que les spectres issus du protocole FA sans congélation (p-value = 0,0015). Ces résultats plus médiocres obtenus à partir de prélèvements congelés pouvaient résulter du fait que la banque de référence, avec laquelle ils ont été comparés, avait été construite avec des spectres obtenus sans congélation. Une matrice et une banque de MSPs 20 « FA.CG » ont alors été construites à partir des échantillons prélevés sur la gélose G1 et traités par le protocole FA.CG. Les caractéristiques de reproductibilité de cette banque ont été comparées à celle issue du protocole FA. Aucune différence n'a été notée entre les valeurs de CCI-v et dCCI entre le protocole FA.CG et FA par le test de Mann-Whitney que 25 ce soit lors du test de reproductibilité technique (p-values> 0,05) (cf. Figure 8). Par contre, le LS-v de reproductibilité technique ainsi que le CCI-v, LS-v et le dLS de reproductibilité biologique se sont avérés inférieurs pour le protocole FA.CG que pour FA (p-values<10-6) (cf. Figure 9). Enfin, la ré-identification des spectres de la gélose G5 traités par le protocole FA.CG 3o avec la nouvelle banque de MSPs FA.CG a significativement résulté en un plus grand nombre de mauvaises identifications (33 contre 53) qu'avec la banque de MSPs FA (p-value<10-5). Ainsi, les prélèvements ayant été congelés étaient moins bien identifiés par une banque de spectres « congelés » que par une banque de spectres issus de prélèvements « frais ».

Optimisation de la banque de MSP Le but de cette étape était de déterminer la meilleure stratégie de construction d'une banque de MSPs en comparant les performances de 5 banques différentes. Tout d'abord, le screening visuel des spectres a permis de repérer certains spectres issus de la gélose G5 fortement i o dissemblant des 3 autres spectres de leur quadruplicat : - un des 4 spectres d'ALTE004 identifié comme PEN1006 avec un LS1 de 2,27 ; - un des 4 spectres de PEN1007 identifié comme FUSA003 avec un LS1 de 1,697 ; 15 -un des 4 spectres de TRI0001 identifié comme ATER002 avec une LS1 de 1,407 . La recherche de la position de ces dépôts a montré qu'ils se situaient respectivement en-dessous de PEN1006, FUSA003 et ATER002 suggérant une contamination des dépôts. Ceci avait d'ailleurs été noté par 20 l'opérateur pour ALTE004. Ces spectres ont été éliminés avant la procédure d'identification. Le screening visuel des spectres issus de la gélose G6 n'a détecté aucune erreur. L'identification a donc été réalisée pour 73 des 76 spectres de la gélose G5 et pour les 76 spectres de la gélose G6. 25 Les valeurs de LS-v, de dLS ainsi que le nombre d'identifications correctes obtenus avec la banque B1 composée de spectre issus d'une seule culture étaient significativement inférieures à celles des banques comportant des spectres issus de plusieurs réplicats de culture (B2 à B5) (p-value < 10-3). 3o L'influence de l'architecture de la banque a été mise en évidence par la comparaison des valeurs de LS-v différant significativement entre les banques B2 à B5 pourtant toutes créés à partir du même pool de spectres (p-value < 10-3). L'inclusion de spectres issus de différentes cultures d'une même souche résultait en une diminution des valeurs médianes de LS-v (2,05 pour B2, 1,97 pour B3 et 1,92 pour B4). Une tendance similaire était retrouvée avec les valeurs de dLS et le nombre d'identifications correctes bien qu'elle ne soit cette fois pas significative. Plus le nombre de spectres de références issus de réplicats de cultures d'une même souche augmente, plus le nombre d'identifications correctes augmente. i o L'élimination de 300/0 des spectres les plus divergents au sein de chaque MSP n'a statistiquement modifié ni les valeurs de LS-v et de dLS, ni le nombre d'identification correcte. En effet, la banque B5 de même architecture que B2 mais construite avec un pool « épuré » de spectres était comparables à B2 pour ces variables (p-value < 0,05) (cf. figures 10 15 et 11 et tableaux VII et VIII).

Tableau VII : Résultats des tests de Kruskall-Wallis et de Wilcoxon lors de la comparaison des banques B1 à B5. LS-V Test de Kruskall- K = 56,4;df = 4; p-value = 1,603e-Wallis 11 Test de Wilcoxon apparié, correction de B1 B2 B3 B4 Holmes B2 < 2e-16 B3 2,5e-14 5,1e-09 B4 7,5e-07 < 2e- 9,9e- 16 10 B5 < 2e-16 0.6 2,1e- 4,3e- 05 16 dLS Test de Kruskall- K = 22.47;df = 4; p-value = Wallis 0.000161 Test de Wilcoxon apparié, de B1 B2 B3 B4 correction Holmes B2 1,1e-11 B3 1,4e-10 1 B4 2,2e-06 0.06 0.073 B5 3,9e-09 1 1 0,411 (K : résultats du test de Kruskall-Wallis, df = degré de liberté ; en gras : les valeurs de p significatives).

Tableau VIII: Résultats des tests de Mc Nemar réalisés lors de la comparaison du nombre d'identifications correctes et fausses entre les 1 o banques B1 à B5. Test de Mc Nemar, sans correction de continuité p-value B2 B3 B4 B5 B1 0,00027 0,0027 0,18 0,0046 B2 0,083 0,0027 0,25 B3 0,014 1 B4 0,083 Les valeurs significatives de p sont en gras.

Essai d'identification des isolats cliniques Les 36 isolats cliniques identifiés par SM dans cette étude appartenaient à 8 genres différents (cf. Tableau III). Sur les 144 spectres obtenus à partir de ces isolats, 5 spectres ont été éliminés lors de l'analyse visuelle des spectres d'identification en raison de leur qualité insuffisante ou d'une dissemblance flagrante avec les autres réplicats (réplicat 4 du 1005766, réplicat 2 du 1007844, réplicat 3 du 1008358, réplicat 4 du 1009096, réplicat 2 du 1007277). L'identification par SM concordait avec l'identification phénotypique et moléculaire pour 101 spectres sur les 139 restants ; ce qui était considéré comme une identification correcte. Sur les 36 isolats, 33, soit 91,660/0, ont été correctement identifiés par au moins l'un des 4 spectres avec un LS1 allant de 0,974 à 2,269 et 21 (58,30/0) l'ont même été sur les 4 spectres : 13 A. fumigatus sur les 14 testés, 1 A. terreus, 1 A. flavus, 2 Beauveria, 1 Alternaria, 1 Penicillium, 1 Scedosporium 1 Trichoderma.

Les 38 mauvaises identifications (LS1> LS-v) concernaient au-moins l'un des spectres de 17 isolats. Seuls 3 isolats n'ont été reconnus sur aucun des spectres du quadruplicat. Ces isolats appartenaient à deux espèces : A. niger (1008580 et 1008441) et Fusarium solani (1000694). Les médianes de LS1 et la différence entre le LS1 et le LS2 des 3 o identifications correctes (respectivement de 1,506 et 0,431) étaient statistiquement différentes de celles des identifications fausses (1,094 et 0,073 respectivement) (p-value < 104). Mise au point d'un score d'identification Le modèle de régression logistique a montré que l'identification pouvait être prédite par la valeur du LS1 et de la différence entre LS1 et LS2. Ces deux variables étaient fortement associées à l'identification dans ce modèle (p-value < 104). Le modèle de plus petit AIC avait pour équation : « Identification » = 0,89LS1 + (LS1-LS2) = 1,89LS1-LS2 i o Cette équation signifie que l'identification d'un spectre est d'autant plus fiable que le score de la première réponse est élevé et que le score de la seconde réponse est faible. Le score spécifique aux moisissures, nommé MoldScore, a donc été défini comme suit: 15 MoldsScore = 0,89LS1 + (LS1-LS2). Comme le LS calculé par le logiciel MaldiBioTyper varie de 0 à 3, il résulte que le MoldScore peut prendre n'importe quelle valeur de l'intervalle [0 ; 5,67]. Ce modèle d'identification avait une performance globale élevée puisque l'aire sous la courbe ROC était de 0,951. 20 Un seuil de « positivité » du MoldScore a été déterminé à l'aide de la courbe ROC (Receiver Operating Character) et fixé à 1,44 (cf. Figure 12A). L'interprétation des résultats du MoldScore avec ce seuil confère au test une valeur prédictive positive (VPP) de 1, une valeur prédictive négative (VPN) de 0,35, une sensibilité de 0,79 et une spécificité de 1 25 selon les résultats observés d'identification des isolats. Comme l'échantillonnage pouvait être favorable, une probabilité d'identification théorique en fonction du score a été calculée à partir du modèle de régression logistique. Ainsi, la probabilité que l'identification soit juste était supérieure à 90 % lorsque le MoldScore est supérieur ou égal 30 au seuil d'identification et dépasse 99 % pour un MoldScore > 1,68. Puis le score RP a été défini comme une version simplifiée du MoldScore selon la formule : score RP = LS1 + (LS1-LS2) en faisant l'approximation que 0,89 est très proche de 1. L'AUC (aire sous la courbe) de la courbe ROC de ce modèle de 0,95 était comparable au modèle du MoldScore (cf. Figure 12B). Le seuil d'identification pour le score RP était de 1,6. Le test utilisant le score RP avait des performances identiques à celles du MoldScore en termes de VPP, de VPN, de sensibilité et de spécificité. Mise au point d'une procédure d'identification des moisissures i o par SM et interprétation des résultats des isolats cliniques Sur la base des résultats obtenus lors des étapes précédentes, une procédure complète d'identification des moisissures a été formalisée. Après mise en culture des prélèvements cliniques sur un milieu Sabouraud-gentamicine-chloramphenicol, les colonies de moisissures sont 15 récoltées puis extraites selon le protocole FA. Les extraits sont alors déposés extemporanément en quadruplicat sur une cible. Après l'acquisition des spectres, le quadruplicat par colonie est visualisé dans son ensemble afin de détecter d'éventuelles erreurs de manipulation ou de contamination de dépôt par un autre. Si au moins 3 spectres du 20 quadruplicat apparaissent visuellement similaires, la procédure est poursuivie. Dans le cas contraire, la procédure est stoppée et le quadruplicat de spectres jugé ininterprétable. Les 3 ou 4 spectres du quadruplicat sont ensuite comparés à une banque de MSPs d'architecture B2. Le MoldScore ou le score RP est 25 calculé. Si le MoldScore ou le score RP d'au moins un spectre du quadruplicat est respectivement supérieur à 1,44 et 1,6, l'identification du LS1 est acceptée comme identification de la colonie fongique inconnue. Toute autre situation est jugée ininterprétable et la procédure doit être recommencée. 30 L'application de cette procédure aux 36 isolats cliniques a rendu une identification pour 27 isolats dont au-moins l'un des réplicats de spectres avait un score RP supérieur au seuil de positivité. L'identification par SM concordait avec l'identification phénotypique et moléculaire des ces 27 isolats. Aucun des réplicats des 8 autres souches n'ayant un score supérieur au seuil de positivité, l'identification par SM a été jugée ininterprétable. Les isolats non identifiés consistaient en deux Fusarium (1008717 et 1000694), deux A. niger (1008548 et 1008441), deux Scedosporium apiospermium (1008439 et 1005660) et deux Penicillium (1008443 et 1003358). L'identification des 17 isolats cliniques a ensuite été réalisée à partir des échantillons congelés (isolat 1000694, 1008846, 1008580, 1008668, 1008440, 1008115, 1007844, 1007409, 1005979, 1006351, 1008358, 1008717, 1008548, 1008439, 1007329, 1007277 et 1008343). Sur les 17 isolats, 10 ont pu être identifiés et 7 ont été jugés ininterprétables. Parmi les résultats ininterprétables, sont retrouvés les mêmes isolats que lors de l'identification sans congélation, soit l'A. niger 1008548, les Fusarium 1008717 et 1000694, le Scedosporium 1008439 et le Penicillium 1008343. A ceux-ci s'ajoutaient l'isolat de Beauveria 1007329 et l'isolat de Fusarium 1007277. Globalement, cette procédure a permis l'identification correcte de 750/0 des isolats cliniques extraits par le protocole FA et 580/0 des isolats extraits par le protocole FA.CG et surtout n'a rendu aucune identification incorrecte.

CONCLUSION Ce travail démontre la faisabilité d'identifier rapidement et facilement les moisissures d'intérêt médical par spectrométrie de masse, notamment MALDI TOF MS. Le processus d'identification développé est bien adapté à l'identification en routine de ces agents pathogènes et pourrait dans un futur proche avantageusement remplacer les techniques conventionnelles. Il constitue une évolution majeure du diagnostic des infections fongiques, encore long et délicat, qui n'a guère changé depuis les débuts de la microbiologie médicale. Ce processus d'identification contribue également à faire de la spectrométrie de masse, notamment MALDI TOF MS, un outil global d'identification des micro-organismes et harmonise ainsi la qualité du diagnostic microbiologique.5 Liste des références

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Claims

REVENDICATIONS1. Procédé in vitro d'identification d'un champignon, obtenu par culture à partir d'un échantillon biologique ou environnemental, caractérisé en ce qu'il comprend la construction d'une banque de spectres de masse de champignons, ladite banque étant issue de l'analyse spectrométrique d'au moins une soixantaine de souches de champignons, et ladite banque comprenant au moins deux spectres de référence par souche, chacun i o desdits spectres de référence étant issu de l'analyse d'un réplicat de culture de chacune desdites souches.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit champignon est un macromycète.
3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit champignon est un champignon filamenteux.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel ledit champignon 2 0 filamenteux est une moisissure ou un dermatophyte.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lesdits spectres de masse sont obtenus par MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation - time-of-flight mass 25 spectrometry).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel lesdites souches utilisées pour la construction de ladite banque de référence de spectres de masse comprend au moins une 3o souche appartenant aux espèces choisies parmi : Absidia corymbifera, Alternaria sp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, 15Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans, Cladosporium sp., Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Mucor circinelloides, Neosartorya pseudofisheri, Paecilomyces variotii, Penicillium chrysogenum, Penicillium purpurogenum, Penicillium roqueforti, Penicillium sp., Rhizopus oryzae, Rhizomucor pusillus, Scedosporium apiospermum, Scedosporium prolificans, Schizophyllum commune, Scopulariopsis brevicaulis, Trichoderma sp., Trichophyton sp., Microsporum sp., Epidermophyton sp.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant en outre une étape d'extraction protéique à partir de la culture dudit champignon au moyen d'acide formique, permettant l'obtention d'un produit d'extraction.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel on effectue, après ladite étape d'extraction, au moins deux dépôts dudit produit d'extraction.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant en outre la mise au point d'un score d'identification dudit champignon à l'espèce ou au genre basé sur la quantification de la ressemblance du spectre de l'échantillon à identifier vis-à-vis : 1) du spectre de référence (A) le plus ressemblant, et : 2) du spectre de référence (B) le plus ressemblant après le spectre (A) et n'appartenant pas à la même espèce, à la même sous-espèce ou au même genre respectivement que celle ou celui du spectre de référence (A).
10. Procédé selon la revendication 9, comprenant en outre la détermination d'un seuil associé à une spécificité d'identification désirée, et l'identification dudit échantillon comme appartenant à l'espèce du spectre (A) si le score dudit échantillon dépasse ledit seuil.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, dans lequel ledit score d'identification est calculé selon la formule suivante : Score = aLS1 + (LS1-LS2) dans laquelle : LS1 représente la quantification de la ressemblance du spectre de référence (A) LS2 représente la quantification de la ressemblance du spectre de référence (B) a représente un coefficient non nul.
12. Procédé d'extraction d'un champignon filamenteux au moyen d'acide formique, caractérisé en ce que ledit champignon filamenteux est choisi parmi Absidia corymbifera, Acremonium strictum, Acrophialophora fusispora, Alternaria alternats, Alternaria tenulsima, Aspergillus candidus, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus hollandicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus restrictus, Aspergillus sydowi, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans, Beauveria bassiana, Botrytis cinerea, Chaetomium globosum, Chrysonilia sp., Cladosporium carionii, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium herbarum, Cladosporium sphaerospermum, Curvularia sp., Emericiella nidulans, Eurotium chevalieri, Exophiala dermatitidis, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Geomyces pannorum, Humicola sp., Irpex lacteus, Mucor circinelloides, Neosartorya pseudofisheri, Paecilomyces variotii, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium brevicompactum, Penicillium chrysogenum, Penicillium corylophylus, Penicillium purpurogenum, Penicillium roqueforti, Penicillium spirulosum, Phaecoccomyces exophialae, Phialophora parasitica, Rhizomucor pusillus , Rhizopus oryzae, Rhizopus oryzae, Rhyzomucor pusillus, Scedosporiumapiospermum, Scedosporium inflatum, Scedosporium prolificans, Schizophyllum commune, Scopulariopsis brevicaulis, Trichoderma viride, Trichophyton interdigitale, Trichotecium roseum et Ulocladium sp..
13. Procédé in vitro d'identification d'un champignon, obtenu par culture sur milieu spécifique à partir d'un échantillon biologique ou environnemental, caractérisé en ce qu'il comprend : a. la construction d'une banque de spectres de masse de i o champignons, ladite banque étant issue de l'analyse spectrométrique de souches de champignons, b. la mise au point d'un score d'identification dudit champignon à l'espèce ou au genre basé sur la quantification de la ressemblance du spectre dudit échantillon vis-à-vis 1) d'un spectre 15 (A) d'une souche de champignon de la banque le plus ressemblant et 2) d'un spectre (B) d'une souche de champignon de la banque le plus ressemblant après le spectre (A) et n'appartenant pas à la même espèce, à la même sous-espèce ou au même genre respectivement que celle ou celui du spectre (A).