FR2967163A1 - IN VITRO OR EX VIVO METHOD FOR SURVIVAL MAINTENANCE AND GENERATION OR RECONSTRUCTION OF AN EPIDERM - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet sur un procédé in vitro ou ex vivo pour la maintenance en survie et, le cas échéant, la génération ou reconstruction d'un épiderme. Sous un autre aspect, la présente invention comprend le modèle d'épiderme ainsi obtenu et sur son utilisation dans un kit ou dans procédé pour le criblage ou la sélection de composés cosmétiques ou pharmaceutiques.The present invention relates to an in vitro or ex vivo method for survival maintenance and, where appropriate, the generation or reconstruction of an epidermis. In another aspect, the present invention includes the epidermal model thus obtained and its use in a kit or method for screening or selecting cosmetic or pharmaceutical compounds.
Description
L'épiderme est un épithélium pavimenteux pluristratifié et squameux. Il forme une barrière qui résiste aux ravages de la dessiccation, ainsi qu'aux agressions mécaniques, chimiques et microbiennes. Le type cellulaire principal constituant l'épiderme est le kératinocyte. Ce tissu comprend également d'autres populations cellulaires telles que les mélanocytes, les cellules de Langerhans, et les cellules de Merkel. L'épiderme est conventionnellement sous divisé en quatre strates distinctes comprenant des couches internes vers les couches les plus superficielles : la couche basale (une couche), la couche épineuse (4-15 couches), la couche granuleuse (1-3 couches) et la couche cornée (5-10 couches). L'épiderme repose sur le derme grâce une membrane basale constituée entre autres de molécules de collagène. Le derme contient des réseaux vasculaires et nerveux très denses ainsi que les annexes épidermiques, structures kératinisées prolongeant l'épiderme et incluant les follicules pileux, les glandes sébacées, et les glandes sudoripares. The epidermis is a squamous and squamous squamous epithelium. It forms a barrier that resists the ravages of desiccation, as well as mechanical, chemical and microbial attacks. The main cell type constituting the epidermis is the keratinocyte. This tissue also includes other cell populations such as melanocytes, Langerhans cells, and Merkel cells. The epidermis is conventionally subdivided into four distinct layers comprising inner layers towards the most superficial layers: the basal layer (one layer), the spinous layer (4-15 layers), the granular layer (1-3 layers) and the stratum corneum (5-10 layers). The epidermis rests on the dermis thanks to a basement membrane composed among others of collagen molecules. The dermis contains very dense vascular and nervous networks as well as epidermal appendages, keratinized structures extending the epidermis and including hair follicles, sebaceous glands, and sweat glands.
Les techniques qui permettent d'obtenir des épidermes reconstruits in vitro sont dérivées de l'ingénierie cellulaire. Les découvertes réalisées par Rheinwald et Green (Rheinwald, J. G. et al., "Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizing colonies from single cells", Cell, 6 (1975), 331-344; Green, H. et al., "Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5665-5668) ont été le départ de l'établissement de protocoles de cultures de kératinocytes humains, et de leurs utilisations en médecine (grand brûlés) ainsi qu'en recherche dermatologique (modèles in vitro). De nombreux protocoles permettant le développement d'épidermes/peaux reconstruits on été établis. On peut citer par exemple ceux qui sont décrits dans les brevets ou dans les demandes de brevets EP 285471, EP 285474, EP 418035, WOA-90 02796, WO-A-9116010, EP 197090, EP 20753, FR 2665175, FR 2689904. De manière très générale, les modèles de peau ou d'épidermes reconstruits décrits dans ces documents sont constitués de kératinocytes humains déposés sur un support, souvent un équivalent de derme, et cultivés dans des conditions telles qu'ils entrent dans un programme de différenciation aboutissant à la formation d'un équivalent d'épiderme. Les modèles d'épidermes ou de peau reconstruits sont fréquemment utilisés pour des investigations en dermatologie dans le cadre des tests de substances, comme pour les candidats médicaments ou les actifs cosmétiques en développement. Les effets pharmacologiques de ces molécules, notamment leur potentiel corrosif ou l'irritant, sont également analysés grâce à ces systèmes. Les épidermes reconstruits sont aussi utiles pour répondre à des questions de type moléculaires, immunologiques ou encore histologiques. Ceci comprend les études de pénétration et d'absorption. En comparaison avec les études précliniques utilisant des animaux et les études cliniques chez l'Homme, les épidermes/peaux reconstruits permettent d'obtenir des résultats plus rapidement et de façon plus reproductible. Techniques for obtaining reconstructed epidermis in vitro are derived from cellular engineering. The findings by Rheinwald and Green (Rheinwald, JG et al., "Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizing colonies from single cells", Cell, 6 (1975), 331-344, Green, H. et al., "Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting", Proc Nat Sci Sci USA 76 (1979), 5665-5668) were the starting point for the establishment of human keratinocytes, and their uses in medicine (burns) and in dermatological research (in vitro models). Many protocols allowing the development of reconstructed epidermis / skin have been established. Examples which may be mentioned are those described in the patents or in the patent applications EP 285471, EP 285474, EP 418035, WO-90 02796, WO-A-9116010, EP 197090, EP 20753, FR 2665175 and FR 2689904. In a very general manner, the reconstructed skin or epidermis models described in these documents consist of human keratinocytes deposited on a support, often a dermis equivalent, and cultured under conditions such that they enter into a differentiation program resulting in to the formation of an epidermis equivalent. Reconstructed epidermal or skin models are frequently used for dermatology investigations in substance testing, as for drug candidates or developing cosmetic actives. The pharmacological effects of these molecules, in particular their corrosive potential or the irritant, are also analyzed thanks to these systems. The reconstructed epidermis are also useful for answering molecular, immunological or even histological questions. This includes penetration and absorption studies. In comparison with preclinical studies using animals and clinical studies in humans, reconstructed epidermis / skins allow results to be obtained more quickly and in a more reproducible way.
Afin d'obtenir un épiderme comportant plusieurs types cellulaires, des mélanocytes ou des cellules immunitaires peuvent être ajoutées aux cultures de kératinocytes (Celine AUXENFANS et al., « Evolution of three dimensional skin equivalent models reconstructed in vitro by tissue engineering », Eur J Dermatol 2009; 19 (2): 107-13). Cependant, les technologies utilisées ne permettent pas encore une production d'épidermes contenant à la fois des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Langerhans et des cellules de Merkel. Enfin, de nombreux verrous technologiques persistent pour reconstruire in vitro des annexes épidermiques comme des follicules pileux, des glandes sébacées et des glandes sudoripares. En conclusion, les technologies de reconstruction disponibles jusqu'alors sont encore très limitantes pour permettre la production d'un épiderme contenant l'ensemble des annexes et types cellulaires qui le caractérise. Ainsi, depuis de nombreuses années, la mise au point de nouveau procédés visant à obtenir des modèles de peau reconstruite est recherchée. De tels modèles auraient comme avantages de pouvoir permettre la réalisation d'études nécessaires à une meilleure compréhension du rôle de la peau, notamment de son épiderme tant dans le domaine mécanique que dans le domaine physiologique. De tels modèles peuvent également être utilisés pour la prédiction par des tests in vitro ou ex vivo, de l'activité de principe actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques ou encore des effets secondaires de composé topiques. Ceci est justement l'objet de la présente invention. De façon surprenante, la demanderesse a mis en évidence que la mise en oeuvre du procédé de l'invention tel que décrit ci-après, notamment comprenant le dépôt de fragment de peau dans une première étape sur une phase liquide, puis, dans une seconde étape, sur une phase liquide dont on peut induire la solidification, permettait d'obtenir la maintenance en survie et, le cas échéant la reconstruction d'un épiderme artificiel pouvant conduire à un épiderme complet utilisable comme modèle in vitro ou ex vivo. La présente invention a donc pour objet un procédé in vitro ou ex vivo pour la maintenance en survie et, le cas échéant, la génération ou reconstruction de la peau, de préférence d'un épiderme. L'invention comprend en particulier un procédé permettant de faire 15 survivre ex vivo un explant entier d'épiderme avec ces annexes. De préférence, ledit fragment de peau est un fragment de peau de mammifère, de préférence humaine. La présente invention se rapporte également à une peau, notamment un épiderme pouvant comprendre ses annexes et son utilisation comme modèle pour 20 évaluer in vitro l'effet de produits cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique à administration topique. Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé ex vivo ou in vitro de conservation ou de maintenance en survie d'un épiderme à partir d'un fragment de peau comprenant de l'épiderme et du derme, ce 25 fragment ayant été préalablement prélevé chez un mammifère, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) la préparation d'une matrice liquide dans un container, ladite matrice comprenant une solution enzymatique apte à dégrader les protéines de la membrane basale séparant l'épiderme du derme, le niveau de la matrice dans le container étant de 30 préférence supérieur à l'épaisseur du fragment prélevé ; b) le dépôt dudit fragment sur ladite matrice de façon à ce que l'épiderme contenu dans ledit fragment reste émergé et le derme sous-jacent dudit fragment soit immergé dans ladite matrice ; c) l'incubation dudit fragment ainsi disposé dans la matrice pendant une période suffisante pour aboutir au détachement du derme de l'épiderme, ce détachement étant induit par les enzymes contenus dans la matrice, le derme ainsi détaché plongeant progressivement dans le fond du container ; d) le cas échéant, l'élimination du derme ainsi détaché ; e) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice liquide, de préférence nutritive, apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation de la température ou d'un composé ou composition spécifique ; f) la solidification de la matrice augmentation de la température de ladite matrice et/ou par l'ajout dudit composé ou composition spécifique. Ce procédé se révèle avantageux par le fait qu'il permet d'obtenir un 15 modèle de peau comprenant un épiderme qui peut être maintenu en survie de manière prolongée sans dégradation notable. L'invention comprend par exemple un procédé permettant de faire survivre ex vivo un explant entier d'épiderme avec ces annexes. Un tel procédé comprendra en particulier : (i) la disposition d'une biopsie de peau cylindrique dans 20 une solution enzymatique de façon à ce que la ligne de flottaison sépare l'épiderme émergé du derme immergé ; (ii) la dégradation enzymatique de la membrane basale laissant l'épiderme flotter à la surface tandis que le derme se détache et plonge progressivement dans le fond ; (iii) le remplacement de la solution enzymatique par une matrice liquide (solution dérivée de plasma sanguin, solution de fibrinogène ou 25 de collagène) dont la solidification est induite par ajout de thrombine ou à la chaleur. (iiii) Après solidification, l'ensemble est maintenue en culture et peut être utilisé à des fins de modèle, en particulier pour des analyses toxicologiques (tels que des tests de corrosion, d'irritation) ou à des fins de recherche. Selon un mode de réalisation préféré, ledit procédé comprend : 30 i) le prélèvement de l'épiderme reposant sur la matrice contenant la solution enzymatique et son dépôt sur ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contenue dans un second container; ou ii) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice liquide dans le container initial. Selon un mode de réalisation également préféré, ledit procédé comprend à l'étape e): i) le prélèvement de l'épiderme reposant sur la matrice contenant la solution enzymatique et son dépôt sur ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contenue dans un second container; et, en ce que ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient en outre des cellules autres que des cellules de l'épiderme, de préférence choisies dans le groupe de cellules constitué par les fibroblastes, des cellules endothéliales, des cellules nerveuses, des cellules constituant le derme et des cellules immunitaires. ii) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice liquide dans le container initial, ladite matrice liquide de remplacement étant une matrice liquide apte à pouvoir se solidifier, et, le cas échéant contenant en outre des cellules autres que des cellules de l'épiderme. A l'étape e), i) le fragment obtenu est ensuite placé sur une matrice liquide apte à pouvoir se solidifier ladite matrice liquide pouvant apporter tous les ingrédients nutritifs ou de cultures, ainsi que toutes les cellules nécessaires à la préparation d'un équivalent de peau complet reproduisant les caractéristiques d'une peau in vivo. A l'étape e), ii) la matrice liquide de remplacement apte à pouvoir se solidifier est de préférence une matrice liquide pouvant apporter tous les ingrédients nutritifs ou de culture de l'épiderme ou de peau, ainsi que toutes les cellules nécessaires à la préparation d'un équivalent de peau complet reproduisant les caractéristiques d'une peau in vivo. De préférence, il est souhaitable que ladite matrice liquide ne recouvre pas la face supérieure de l'épiderme avant que cette matrice ne soit solidifiée. Sous un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé ex vivo ou in vitro de régénération ou reconstruction d'un épiderme à partir d'un fragment de peau, ledit procédé comprend les étapes suivantes : A) la conservation ou maintenance en survie d'un épiderme à partir d'un fragment de peau préalablement prélevé par un procédé selon la présente invention; et B) la culture de l'épiderme ainsi obtenue à l'étape A) dans des conditions de cultures adéquates, de préférence, ledit épiderme étant au contact de l'air. Plus spécifiquement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit fragment préalablement prélevé est un explant entier d'épiderme avec ces annexes comprenant notamment les follicules pileux, les glandes sébacées et sudoripares. Selon un mode de réalisation également préféré, ledit fragment préalablement prélevé est un fragment de forme cylindrique, de préférence dont la taille est comprise entre 1 à 10 mm de diamètre, de préférence encore de 1 à 8 mm et de 0,5 à 8 mm d'épaisseur, de préférence de 1 à 5 mm. Selon un mode de réalisation également préféré, la solution enzymatique apte à dégrader les protéines de la membrane basale séparant l'épiderme du derme et contenue dans la ladite matrice à l'étape a) est une solution contenant une protéase, de préférence de la dispase ou de la thermolysine. In order to obtain an epidermis comprising several cell types, melanocytes or immune cells can be added to the keratinocyte cultures (Celine AUXENFANS et al., "Evolution of three dimensional skin equivalents models reconstructed in vitro by tissue engineering", Eur J Dermatol 2009; 19 (2): 107-13). However, the technologies used do not yet allow the production of epidermis containing both keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells and Merkel cells. Finally, many technological barriers persist to reconstruct in vitro epidermal appendages such as hair follicles, sebaceous glands and sweat glands. In conclusion, the reconstruction technologies available until now are still very limiting to allow the production of an epidermis containing all the annexes and cell types that characterizes it. Thus, for many years, the development of new methods for obtaining models of reconstructed skin is sought. Such models would have the advantages of being able to allow the realization of studies necessary for a better understanding of the role of the skin, in particular of its epidermis both in the mechanical field and in the physiological field. Such models can also be used for the prediction by in vitro or ex vivo tests, of the activity of cosmetic and / or pharmaceutical active ingredients or else of the topical compound side effects. This is precisely the object of the present invention. Surprisingly, the applicant has demonstrated that the implementation of the method of the invention as described below, in particular comprising the deposition of skin fragment in a first step on a liquid phase, then, in a second stage, on a liquid phase which can induce solidification, allowed to obtain the maintenance in survival and, if necessary the reconstruction of an artificial epidermis that can lead to a complete epidermis used as model in vitro or ex vivo. The subject of the present invention is therefore an in vitro or ex vivo method for survival maintenance and, where appropriate, the generation or reconstruction of the skin, preferably of an epidermis. The invention particularly includes a method for ex vivo surviving an entire epidermis explant with these appendices. Preferably, said skin fragment is a fragment of mammalian skin, preferably human skin. The present invention also relates to a skin, in particular an epidermis which may comprise its appendices and its use as a model for evaluating in vitro the effect of topical cosmetic, pharmaceutical or dermatological products. Thus, in a first aspect, the present invention relates to an ex vivo or in vitro method of preservation or maintenance in survival of an epidermis from a skin fragment comprising the epidermis and the dermis. fragment previously taken from a mammal, characterized in that said method comprises the following steps: a) the preparation of a liquid matrix in a container, said matrix comprising an enzymatic solution capable of degrading the proteins of the basement membrane separating the epidermis of the dermis, the level of the matrix in the container preferably being greater than the thickness of the sampled fragment; b) depositing said fragment on said matrix so that the epidermis contained in said fragment remains emerged and the underlying dermis of said fragment is immersed in said matrix; c) incubating said fragment thus disposed in the matrix for a period sufficient to result in the detachment of the dermis of the epidermis, this detachment being induced by the enzymes contained in the matrix, the dermis thus detached progressively plunging into the bottom of the container ; (d) where appropriate, the removal of the detached dermis; e) replacing the matrix containing the enzymatic solution with a liquid matrix, preferably nutritive, able to be solidified under the action of an increase in temperature or a specific compound or composition; f) solidifying the matrix, increasing the temperature of said matrix and / or adding said specific compound or composition. This method is advantageous in that it provides a skin model comprising an epidermis that can be maintained in prolonged survival without significant degradation. The invention comprises, for example, a method for ex vivo survival of an entire epidermis explant with these appendices. Such a method will include in particular: (i) arranging a cylindrical skin biopsy in an enzyme solution so that the waterline separates the emerged epidermis from the submerged dermis; (ii) enzymatic degradation of the basement membrane allowing the epidermis to float on the surface while the dermis detaches and progressively dips into the bottom; (iii) replacing the enzymatic solution with a liquid matrix (solution derived from blood plasma, fibrinogen or collagen solution) whose solidification is induced by addition of thrombin or heat. (iiii) After solidification, the assembly is maintained in culture and can be used for model purposes, in particular for toxicological analyzes (such as corrosion and irritation tests) or for research purposes. According to a preferred embodiment, said method comprises: i) removing the epidermis resting on the matrix containing the enzymatic solution and depositing it on said liquid matrix capable of being solidified contained in a second container; or ii) replacing the matrix containing the enzymatic solution with a liquid matrix in the initial container. According to a also preferred embodiment, said method comprises in step e): i) the removal of the epidermis resting on the matrix containing the enzymatic solution and its deposition on said liquid matrix capable of being able to solidify contained in a second container; and in that said self-solidifying liquid matrix further contains cells other than epidermal cells, preferably selected from the group of cells consisting of fibroblasts, endothelial cells, nerve cells, cells constituting the dermis and immune cells. ii) replacing the matrix containing the enzymatic solution with a liquid matrix in the initial container, said replacement liquid matrix being a liquid matrix capable of being able to solidify, and, where appropriate, further containing cells other than the epidermis. In step e), i) the fragment obtained is then placed on a liquid matrix capable of being able to solidify said liquid matrix that can supply all the nutritive or culturing ingredients, as well as all the cells necessary for the preparation of an equivalent of complete skin reproducing the characteristics of a skin in vivo. In step e), ii) the liquid matrix of substitution capable of being able to solidify is preferably a liquid matrix that can supply all the nutritive or cultured ingredients of the epidermis or skin, as well as all the cells necessary for the preparation of a complete skin equivalent reproducing the characteristics of a skin in vivo. Preferably, it is desirable that said liquid matrix does not cover the upper face of the epidermis before this matrix is solidified. In a second aspect, the present invention relates to an ex vivo or in vitro method of regeneration or reconstruction of an epidermis from a skin fragment, said method comprises the following steps: A) conservation or maintenance in survival an epidermis from a fragment of skin previously removed by a method according to the present invention; and B) culturing the epidermis thus obtained in step A) under suitable culture conditions, preferably said epidermis being in contact with the air. More specifically, the method according to the invention is characterized in that said fragment previously removed is an integer epidermis explant with these appendices including hair follicles, sebaceous glands and sweat glands. According to a also preferred embodiment, said fragment previously removed is a fragment of cylindrical shape, preferably whose size is between 1 to 10 mm in diameter, more preferably from 1 to 8 mm and from 0.5 to 8 mm thickness, preferably 1 to 5 mm. According to a also preferred embodiment, the enzymatic solution able to degrade the proteins of the basement membrane separating the epidermis from the dermis and contained in the said matrix in step a) is a solution containing a protease, preferably dispase. or thermolysin.
Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation de la température ou d'un composé ou composition spécifique est choisie parmi toute solution liquide, de préférence nutritive, capable de se solidifier ou de se gélifier dans des conditions particulières compatibles avec la survie et la culture de cellules d'épiderme, de préférence choisie parmi : - du plasma sanguin ou une solution dérivée de plasma sanguin, une solution de fibrinogène, une solution de collagène, de la gélatine, gel polymériques synthétiques, naturels tels que les gels d'agarose, d'amidon, de polysaccharides. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e) : - ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles, de préférence par du citrate de sodium ; et - la solidification de ladite matrice est obtenue en présence d'ions calcium, de 30 préférence également en présence de thrombine. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape c), ledit fragment ainsi disposé dans la matrice est incubé pendant une période d'au moins 10 heures, de préférence à 4°C, de préférence encore une nuit à 4 °C. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e), ladite matrice liquide est solidifiée après au maximum de 8 heures, de préférence moins de 2 heures ou moins d'une heure, une durée de moins de 30 min, de préférence de moins de 10 min étant la durée la plus préférée pour engager la phase de solidification de la matrice liquide. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de plasma sanguin contenant de 25 % à 60 %, de préférence entre 35 % et 45 % (v/v) de plasma sanguin, de 70 % à 35 % d'une solution physiologique, telle qu'une solution de NaCl à 0,9 %, de 5 % à 12 %, de préférence 8 %, d'une solution saline de CaClz à 1 % et d'un agent antifibrinolytique en concentration suffisante pour obtenir l'activité anti-fribrinolytique recherchée, de préférence entre 5 % et 2 %, de préférence l'agent anti-fibrinolytique étant choisi parmi l'acide tranaxémique ou de l'aprotinine. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide de fibrinogène et de thrombine, ou de collagène et pour laquelle l'incubation à 37 °C permet sa solidification. Sous un troisième aspect, la présente invention a pour objet un modèle d'épiderme susceptible d'être obtenu par le procédé selon la présente invention. Selon cet aspect de l'invention, a également pour objet un kit comprenant un tel modèle d'épiderme reposant notamment sur une matrice solide et, le cas échéant, nutritive, cette matrice solide étant adaptée par sa composition à la maintenance en survie dudit épiderme, le cas échéant à multiplication et à la différenciation des cellules pouvant être incluses dans cette matrice solide. Ainsi, selon cet aspect, l'invention a pour objet également un kit d'évaluation de composés cosmétique, dermatologique ou thérapeutique pour la peau comprenant un modèle de peau ou d'épiderme obtenu selon le procédé de l'invention. According to a also preferred embodiment of the process according to the invention, in stage e), said liquid matrix capable of being able to solidify under the action of an increase in temperature or of a specific compound or composition is chosen among any liquid solution, preferably nutritive, capable of solidifying or gelling under particular conditions compatible with survival and culture of epidermal cells, preferably selected from: - blood plasma or solution derived from blood plasma , a solution of fibrinogen, a solution of collagen, gelatin, natural synthetic polymeric gels such as agarose, starch, polysaccharide gels. According to a also preferred embodiment of the method according to the invention, in step e): said solidifying liquid matrix is a liquid solution derived from blood plasma treated with an anticoagulant agent with reversible properties, preferably by sodium citrate; and the solidification of said matrix is obtained in the presence of calcium ions, preferably also in the presence of thrombin. According to a also preferred embodiment of the process according to the invention, in step c), said fragment thus disposed in the matrix is incubated for a period of at least 10 hours, preferably at 4 ° C., more preferably overnight at 4 ° C. According to a also preferred embodiment of the method according to the invention, in step e), said liquid matrix is solidified after a maximum of 8 hours, preferably less than 2 hours or less than one hour, a duration of less than 30 min, preferably less than 10 min being the most preferred time to initiate the solidification phase of the liquid matrix. According to a also preferred embodiment of the process according to the invention, in step e), said liquid matrix capable of being able to solidify is a liquid solution derived from blood plasma containing from 25% to 60%, preferably between 35% and 45% (v / v) of blood plasma, 70% to 35% of a physiological solution, such as 0.9% NaCl solution, 5% to 12%, preferably 8%, d a 1% CaCl 2 saline solution and an antifibrinolytic agent in sufficient concentration to obtain the desired anti-fibrinolytic activity, preferably between 5% and 2%, preferably the anti-fibrinolytic agent being selected from tranaxemic acid or aprotinin. According to a also preferred embodiment of the process according to the invention, in step e), said solidifying liquid matrix is a liquid solution of fibrinogen and thrombin, or collagen and for which the incubation at 37 ° C allows its solidification. In a third aspect, the present invention relates to an epidermis model obtainable by the method according to the present invention. According to this aspect of the invention, also relates to a kit comprising such an epidermis model resting in particular on a solid and, where appropriate, nutritive matrix, this solid matrix being adapted by its composition to the survival maintenance of said epidermis , where appropriate to the multiplication and differentiation of the cells that can be included in this solid matrix. Thus, according to this aspect, the subject of the invention is also a cosmetic, dermatological or therapeutic skin evaluation kit comprising a skin or epidermis model obtained according to the method of the invention.
Un autre objet de la présente invention se rapporte à une méthode de screening in vitro de composés candidats pour le traitement cosmétique ou thérapeutique de la peau, de préférence de l'épiderme, de préférence de l'épiderme associée au derme comprenant les étapes suivantes: a) l'obtention d'un modèle d'épiderme selon la présente invention; b) la mise en contact dudit modèle avec le composé candidat ; et c) la mise en évidence d'une modification physiologique, en particulier la perméabilité, ou morphogénique des cellules de l'épiderme dudit modèle; et d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement. Ainsi le modèle de peau et/ou d'épiderme selon l'invention peut aussi être utilisé dans tout procédé, notamment automatisé, pour le criblage ou l'identification de nouveaux composés cosmétiques, dermatologiques ou pharmaceutiques. Les procédés de criblage en vue d'identifier de nouveaux composés efficace comprennent en général une de mise en contact dudit composé à tester avec un modèle de peau et/ou d'épiderme obtenu selon l'invention puis une étape de lecture de l'effet du composé sur ledit modèle, notamment en comparant cet effet avec un modèle contrôle ou témoin selon l'invention n'ayant pas été mis en contact avec le composé à tester. Cette dernière étape de lecture pourra également être réalisée par la détermination ou l'analyse de marqueurs épidermiques et/ou de cellules associées et incluses dans la matrice solidifiée, tels que des protéines associées à ces structures. Par exemple si ces cellules associées sont des cellules du système immunitaire, ledit procédé de criblage sera par exemple destiné à identifier ou sélectionner des composés tests susceptibles d'induire des effets secondaires non recherchés tels que des réactions allergiques. Les produits testés pourront également être des vecteurs d'expression de gènes, ou encore des acides nucléiques, tels que des acides nucléiques antisens, microRNA, siRNA aptes à modifier l'expression d'un gène constitutif de cellules présentes dans ledit modèle de l'invention. Another subject of the present invention relates to a method for in vitro screening of candidate compounds for the cosmetic or therapeutic treatment of the skin, preferably of the epidermis, preferably of the epidermis associated with the dermis, comprising the following steps: a) obtaining an epidermis model according to the present invention; b) contacting said model with the candidate compound; and c) the demonstration of a physiological modification, in particular the permeability, or morphogenicity of the epidermal cells of said model; and d) selecting said compound if the modifications obtained are those desired for the treatment. Thus the model of skin and / or epidermis according to the invention can also be used in any method, especially automated, for screening or identification of new cosmetic, dermatological or pharmaceutical compounds. Screening methods for identifying new effective compounds generally comprise contacting said test compound with a model of skin and / or epidermis obtained according to the invention and then a step of reading the effect. of the compound on said model, in particular by comparing this effect with a control or control model according to the invention which has not been put in contact with the test compound. This last reading step may also be performed by determining or analyzing epidermal markers and / or associated cells and included in the solidified matrix, such as proteins associated with these structures. For example, if these associated cells are cells of the immune system, said screening method will for example be intended to identify or select test compounds capable of inducing undesired side effects such as allergic reactions. The products tested may also be gene expression vectors, or nucleic acids, such as antisense nucleic acids, microRNAs, siRNAs capable of modifying the expression of a gene constituting cells present in said model of the invention.
D'autres effets tels que l'expression de certains médiateurs ou la cytotoxicité intrinsèque des composés tests vis à vis de certaines cellules pourront être également recherchés comme effet secondaire selon les cellules associées également présentes dans la matrice solidifiée. Ces modèles témoins seront bien entendus mis en oeuvre dans les mêmes conditions que le modèle de l'invention ayant reçu le produit à tester. Other effects such as the expression of certain mediators or the intrinsic cytotoxicity of the test compounds with respect to certain cells may also be sought as a side effect according to the associated cells also present in the solidified matrix. These control models will of course be used under the same conditions as the model of the invention which has received the product to be tested.
Sous un cinquième aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu souffrant d'un désordre de la peau, notamment de l'épiderme, ce procédé comprenant les étapes suivantes : a) à partir d'un fragment de peau prélevé chez ledit patient, l'obtention d'un modèle 10 selon la présente invention; b) la mise en contact dudit modèle avec un composé candidat pour ledit traitement ; c) la mise en évidence de modification physiologique ou morphogénique associée à l'efficacité du traitement des cellules de l'épiderme pour ledit désordre de l'épiderme; et 15 d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement. Sous un sixième aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu souffrant d'un désordre de la peau, notamment de l'épiderme, selon la présente invention, 20 caractérisé en ce qu'à l'étape a), le fragment de peau utilisé est un fragment issu d'une collection ou de culture de peau. Sous un septième aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un modèle selon la présente invention, pour déterminer pour un produit les effets secondaires sur l'épiderme, tels que par exemple ; 25 - sa toxicité ; - son adsorption ou absorption; - sa distribution, son métabolisme, son excrétion ; - l'irritation ou encore la corrosion. Un tel modèle pourra être en effet selon la présente invention être utilisé 30 ou mis en oeuvre dans tout procédé ou test in vitro ou ex vivo nécessitant des expérimentations animales ou humaines, comme par exemple l'étude de libération ou de pénétration de principes actifs, et/ou de leur biodisponibilité cutanée, l'étude de leur efficacité, ou encore de leur tolérance, de leur compatibilité, ces principes actifs étant à visée cosmétiques, dermatologiques et/pharmaceutiques. Selon un mode de réalisation préféré, ledit produit est un produit cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique. In a fifth aspect, the present invention relates to a method for determining the therapeutic treatment adapted for an individual suffering from a disorder of the skin, in particular of the epidermis, this process comprising the following steps: a) starting from a skin fragment taken from said patient, obtaining a model 10 according to the present invention; b) bringing said model into contact with a candidate compound for said treatment; c) the demonstration of physiological or morphogenic modification associated with the effectiveness of the treatment of the cells of the epidermis for said epidermal disorder; and d) selecting said compound if the modifications obtained are those desired for the treatment. In a sixth aspect, the present invention relates to a method for determining the therapeutic treatment suitable for an individual suffering from a disorder of the skin, especially the epidermis, according to the present invention, characterized in that step a), the skin fragment used is a fragment from a collection or skin culture. In a seventh aspect, the present invention relates to the use of a model according to the present invention, for determining for a product the side effects on the epidermis, such as for example; 25 - its toxicity; - its adsorption or absorption; - its distribution, its metabolism, its excretion; - irritation or corrosion. Such a model may indeed be used according to the present invention to be used or implemented in any in vitro or ex vivo process or test requiring animal or human experiments, such as, for example, the release or penetration study of active principles, and / or their cutaneous bioavailability, the study of their effectiveness, or even of their tolerance, of their compatibility, these active ingredients being for cosmetic, dermatological and / pharmaceutical purposes. According to a preferred embodiment, said product is a cosmetic, dermatological or pharmaceutical product.
L'utilisation comme modèle concernera également sa mis en oeuvre pour l'étude de toute pathologie se traduisant par des anomalies de la peau, notamment de l'épiderme mais également pour toutes les cellules situées sous l'épiderme pour lesquelles l'épiderme constitue une barrière naturelle et pour lesquelles une thérapie par voie topique est envisageable. The use as a model will also concern its implementation for the study of any pathology resulting in abnormalities of the skin, in particular of the epidermis, but also for all the cells located under the epidermis for which the epidermis constitutes a natural barrier and for which topical therapy is feasible.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec l'exemple et la figure. La figure dont les légendes sont ci-après, ainsi que l'exemple qui suit sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant en limiter la portée. Other features and advantages of the invention appear in the following description with the example and the figure. The figure whose captions are below, as well as the following example are intended to illustrate the invention without limiting its scope.
LEGENDES DE LA FIGURE Figure : Schéma décrivant les différentes étapes du procédé - Etape 1 : Une biopsie cylindrique de peau est réalisée ; - Etape 2 : La biopsie est placée dans un container contenant une solution 20 enzymatique dégradant la membrane basale; - Etape 3 : La biopsie est incubée à 4 °C jusqu'à ce que le derme se détache de l' épiderme; - Etape 4 : L'épiderme est disposé sur une solution de plasma sanguin (liquide); - Etape 5 : La solution de plasma sanguin est solidifiée par coagulation; et 25 - Etape 6 : L'épiderme disposé sur le plasma coagulé est maintenu en culture; LEGENDS OF THE FIGURE Figure: Diagram describing the different steps of the process - Step 1: A cylindrical skin biopsy is performed; Step 2: The biopsy is placed in a container containing an enzymatic solution degrading the basement membrane; - Step 3: The biopsy is incubated at 4 ° C until the dermis detaches from the epidermis; Step 4: The epidermis is placed on a solution of blood plasma (liquid); Step 5: The blood plasma solution is solidified by coagulation; and Step 6: The epidermis disposed on the coagulated plasma is maintained in culture;
EXEMPLE : Différentes étapes du procédé (voir figure) EXAMPLE: Different process steps (see figure)
1. Une biopsie cylindrique est tout d'abord réalisée sur un fragment de peau 30 fraîchement prélevé pour permettre sa survie ex vivo. 2. La biopsie cutanée est délicatement déposée dans une solution enzymatique de dispase ou de thermolysine, qui dégrade spécifiquement les protéines de la membrane basale, de façon à ce que la partie superficielle (l'épiderme) reste émergée alors que le derme sous-jacent est immergé. 3. L'ensemble est laissé à incuber (généralement au moins 10 heures à 4 °C) jusqu'à ce que le derme s'enfonce progressivement dans la solution après s'être détaché de l'épiderme resté , quand à lui, étalé, flottant à la surface de la solution, et toujours associées à ses annexes. La séparation entre l'épiderme et le derme peut être achevée à l'aide de pinces en veillant à préserver l'intégrité des tissus. 4. La solution enzymatique est ensuite remplacée par une solution dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anti-coagulant aux propriétés réversibles en présence d'ions calcium (citrate de sodium). Cette solution contient 42 % de plasma sanguin, 50 % d'une solution de NaCl à 0,9 %, 8 % d'une solution saline de CaC12 à 1% et un agent anti-fibrinolytique (acide tranaxémique ou aprotinine). 5. En coagulant, le plasma fait office de support dermique sur lequel adhère l'expiant d'épiderme. La coagulation consiste essentiellement en la transformation, en présence d'ions calcium et de thrombine, du fibrinogène présent dans le plasma en un échafaudage de molécules de fibrine reliées entre elles par des liaisons covalentes. L'agent anti-fibrinolytique a pour fonction d'inhiber les enzymes suceptibles de dégrader la matrice de plasma sécrétées par l'expiant d'épiderme, et ainsi de maintenir l'intégrité du support dermique. De la même façon la solution de plasma peut être substituée par une solution de fibrinogène ou de collagène. Pour cette dernière, l'incubation à 37 °C seule permet la solidification. 6. L'ensemble constitué par l'expiant d'épiderme est maintenue en culture avec l'épiderme au contact de l'air. 1. A cylindrical biopsy is first performed on a freshly harvested skin fragment to allow ex vivo survival. 2. The cutaneous biopsy is gently deposited in an enzyme solution of dispase or thermolysin, which specifically degrades the basement membrane proteins, so that the superficial part (the epidermis) remains emerging while the underlying dermis is immersed. 3. The whole is allowed to incubate (usually at least 10 hours at 4 ° C) until the dermis gradually sinks into the solution after being detached from the epidermis remained, when to him, spread , floating on the surface of the solution, and always associated with its annexes. The separation between the epidermis and the dermis can be completed using forceps while ensuring the integrity of the tissues. 4. The enzymatic solution is then replaced by a solution derived from blood plasma treated with an anti-coagulant agent with reversible properties in the presence of calcium ions (sodium citrate). This solution contains 42% blood plasma, 50% 0.9% NaCl solution, 8% 1% CaCl 2 saline and an anti-fibrinolytic agent (tranaxemic acid or aprotinin). 5. By coagulating, the plasma acts as a dermal support on which adheres the epidermis explant. Coagulation consists essentially of the transformation, in the presence of calcium ions and thrombin, of the fibrinogen present in the plasma into a scaffold of fibrin molecules linked together by covalent bonds. The function of the anti-fibrinolytic agent is to inhibit the enzymes capable of degrading the plasma matrix secreted by the epidermis explant, and thus to maintain the integrity of the dermal support. In the same way the plasma solution can be substituted by a solution of fibrinogen or collagen. For the latter, incubation at 37 ° C alone allows solidification. 6. The assembly consisting of the explant of epidermis is kept in culture with the epidermis in contact with the air.
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