FR2962906A1 - UTILISATION DES INHIBITEURS DE L'HYPUSINYLATION DE eIF5A POUR TRAITER LES PATHOLOGIES ISCHEMIQUES ET HYPOXIQUES - Google Patents

Abstract

Les présents Inventeurs ont découvert une nouvelle classe d'agents thérapeutiques cyto-protecteurs permettant aux cellules de mammifères de survivre plus longtemps dans des conditions hypoxiques, et de prévenir les troublés liés à la privation d'oxygène dans un modèle d'insuffisance rénale due à une lésion ischémique chez le rat. La présente invention vise donc une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou traiter les pathologies résultant de conditions hypoxiques et/ou de lésions ischémiques chez un mammifère, ladite composition comprenant en tant qu'agent cyto-protecteur un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIF5A, comme par exemple le N1-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7).

Description

La présente invention vise à améliorer les traitements existants pour soulager des patients ayant subi des lésions ischémiques et/ou des conditions d'hypoxie, en prévenant in vivo l'apparition des troubles résultant de la privation de l'apport d'oxygène.

L'hypoxie consiste en une oxygénation insuffisante des tissus. Elle peut survenir de plusieurs manières : d'une part lorsque l'on monte en altitude (hypoxie naturelle), d'autre part à cause d'une lésion ischémique (hypoxie pathologique). L'hypoxie d'altitude (due au milieu naturel ambiant) est dite hypobare. C'est la diminution de pression de l'air atmosphérique (moins de 760mmHg) qui conduit à la diminution de la pression partielle de chacun des gaz qui le composent, dont le dioxygène. Une ischémie est la diminution de l'apport sanguin artériel à un organe. Cette diminution entraîne une diminution de l'oxygénation des tissus et l'accumulation des produits du métabolisme anaérobique. Ces perturbations peuvent conduire à l'arrêt de la fonction tissulaire. L'ischémie peut avoir diverses causes : - présence d'un caillot sanguin obstruant une artère (thrombose), - formation d'une plaque d'athérome, - hémorragie ou hypo perfusion empêchant certains tissus d'être correctement alimentés, - compression d'une artère par un objet extérieur (écrasement d'un membre, garrot) ou par un phénomène interne (hématome, tumeur, ou épanchement d'un liquide). L'ischémie peut être réversible et n'entraîner qu'une gêne limitée. Elle peut être irréversible et peut conduire à l'infarctus de l'organe, c'est-à-dire à la mort d'une partie ou de la totalité de celui-ci. Les deux cas les plus critiques sont évidemment les ischémies touchant le cerveau ou le muscle cardiaque.

L'ischémie aiguë d'un membre, consécutive à l'oblitération brutale de l'axe artériel de ce dernier, est une urgence vasculaire à pronostic vital engagé (mortalité d'environ 20 %). Elle survient le plus souvent après une thrombose ou une embolie. Il en résulte une souffrance tissulaire due à la privation d'oxygène.

Les mécanismes moléculaires responsables des dommages tissulaires sont bien connus. Ils comprennent en particulier : -une acidose cellulaire et les conséquences de la régulation du pH intracellulaire sur l'homéostasie du sodium et du calcium intracellulaire. - des perturbations métaboliques, dont la diminution des réserves d'ATP et 10 l'activation de l'AMP kinase - la production de radicaux libres - l'apoptose selon la sévérité de l'attaque ischémique De nombreux développements pharmaceutiques et études cliniques ont eu pour objet la prévention des lésions ischémiques en elles-mêmes (prévention des infarctus du 15 myocarde et/ou des accidents vasculaires cérébraux), et la prise en charge par les services d'urgence des patients souffrant de ces pathologies a été nettement améliorée ces dernières années. Cependant, les affections pathologiques résultant de ces lésions, ainsi que les troubles liés au vieillissement (insuffisances cardiaques et rénales, microangiopathies cérébrales) ont peu été étudiés à ce jour, et l'industrie 20 pharmaceutique a besoin de nouvelles cibles moléculaires validées dans ce domaine. De telles cibles pourraient avantageusement augmenter la tolérance hypoxique des cellules, leur permettant de survivre plus longtemps dans des conditions hypoxiques, et ce afin de retarder les effets délétères de la privation d'oxygène dans les tissus ischémiés. Une cible moléculaire connue pour augmenter la tolérance hypoxique des 25 cellules est la protéine induite par l'hypoxie HIF (Hypoxia Inducible Factor) et les enzymes associées HIF-prolyl hydroxylases. Des inhibiteurs de ces enzymes induisent un état de tolérance hypoxique in vivo et in vitro. L'utilisation de ces inhibiteurs chez l'homme est cependant exclue car ces molécules favorisent également le développement tumoral et la dissémination des métastases (Semenza GL et al, Science 2007). Dans ce contexte, les présents Inventeurs ont découvert une nouvelle classe d'agents thérapeutiques cyto-protecteurs permettant aux cellules de mammifères de survivre plus longtemps dans des conditions hypoxiques, et de prévenir les troublés liés à la privation d'oxygène dans un modèle d'insuffisance rénale due à une lésion ischémique chez le rat. Ces nouveaux agents permettent de limiter les conséquences de l'hypoxie cellulaire, et de diminuer les troubles liés à la privation d'oxygène in vivo chez les mammifères. Ces troubles résultent le plus souvent de lésions ischémiques ou de conditions d'hypoxie. En particulier, les agents identifiés dans la présente invention permettent de diminuer les symptômes d'une insuffisance rénale provoquée par une ischémie rénale de 40 minutes. RESUME DE L'INVENTION La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les pathologies résultant de conditions hypoxiques et/ou de lésions ischémiques chez un mammifère, ladite composition comprenant en tant qu'agent cyto-protecteur un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA. Selon un aspect plus spécifique de l'invention, lesdites pathologies sont choisies parmi : l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique, l'insuffisance cardiaque due à un infarctus, les séquelles neurologiques dues à un accident vasculaire cérébral, les microangiopathies périphériques et centrales, ou les dérèglements d'un organe tel que le foie, l'intestin, le coeur, le poumon ou le rein suite à sa transplantation. Les inventeurs ont montré en particulier que la composition pharmaceutique de l'invention peut être utilisée pour augmenter la tolérance hypoxique des cellules de mammifère soumises à une lésion ischémique ou à des conditions hypoxiques. De préférence, ledit agent inhibiteur de l'hypusinylation selon l'invention inhibe la synthèse de l'hypusine. En particulier, ledit agent inhibiteur de l'hypusinylation inhibe la désoxyhypusine synthase (DHS) ou la désoxyhypusine hydroxylase (DHH).

Encore plus particulièrement, ledit agent inhibiteur de l'hypusinylation est choisi parmi les dérivés du 1,7-diaminoheptane (DAH) tels que le Nl-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7), le 1,3 diazacyclohexane et le 1,3 diazacyclo-l-hexene, le (R,S)-2-(difluorométhyl)ornithine (DFMO), la Crans-4-methylcyclohexylamine, la N-(3- aminopropyl)cyclohexylamine, et est de préférence le Nl-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7). De façon encore plus préférée, ladite invention a pour objet une composition pharmaceutique qui peut être utilisée pour prévenir et/ou traiter l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique, ladite composition comprenant, en tant qu'agent cyto- protecteur, un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, de préférence le Nl-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7). LEGENDES DES FIGURES La figure 1 décrit le modèle d'ischémie rénale par arrêt momentané du flot artériel utilisé dans les exemples. L'artère rénale gauche d'un rat anesthésié est maintenu 15 ligaturée pendant au moins 40 minutes avant d'être relâchée. La figure 2 représente le dosage du marqueur NGAL dans les urines totales avant et 24 heures après la ligature de 40 minutes de l'artère rénale gauche, chez des rats contrôles (barres blanches) ou traités par du GC7 (3 mg/kg intra péritonéal, pendant 4 jours, barres grises). Les moyennes sont représentées (± sem) et le nombre d'animaux utilisés 20 est indiqué (entre parenthèses). ** = P< 0.01 avec le test « t » de Student. La figure 3 représente le NGAL plasmatique dosé 24 heures après la ligature de 40 minutes de l'artère rénale gauche chez des rats contrôles (barre blanche) ou traités par du GC7 (3 mg/kg infra péritonéal, pendant 4 jours avant la ligaturation, barre grise). Les moyennes sont représentées (± sem) et le nombre d'animaux utilisés est indiqué 25 (entre parenthèse). * = P< 0.05 avec le test « t » de Student. La figure 4 représente le dosage du glucose dans le sang et les urines avant et 24 heures après la ligature de 40 minutes de l'artère rénale gauche, chez des rats contrôles (barres blanches) ou traités par du GC7 (3 mg/kg infra péritonéal, pendant 4 jours, barres grises). Les moyennes sont représentées (± sem) et le nombre d'animaux utilisés est indiqué. * = P< 0.05 avec le test « t » de Student. La figure 5 est un graphique représentant le sodium et les phosphates urinaires dosés 24 heures après la ligature de 40 minutes de l'artère rénale gauche chez des rats contrôles (barre blanche) ou traités par du GC7 (3 mg/kg intra péritonéal, pendant 4 jours avant la ligaturation, barre grise). Les moyennes sont représentées (± sem) et le nombre d'animaux utilisés est indiqué (entre parenthèses). * = P< 0.05 avec le test « t » de Student. La figure 6 décrit la quantité d'eIFSA hypusinylé reconnue par l'anticorps spécifique de l'hypusinylation d'eIFSA, avant et après traitement par le GC7 (mesure des niveaux du signal sur des westerns blots, unités arbitraires). Les moyennes et déviations standart moyennes, provenant de 4 animaux dans chaque catégorie, sont indiquées (p< 0.01, test « t » de Student). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les agents thérapeutiques identifiés par les Inventeurs sont des molécules connues pour inhiber une modification post-traductionnelle appelée l'hypusinylation. En particulier, ces molécules d'intérêt inhibent l'hypusinylation du facteur d'initiation de la traduction eIF5A (SEQ ID NOs : 1, 3 et 4, isoformes Al chez l'homme, la souris et le rat, respectivement ; SEQ ID NOs : 5, 6 et 7, isoformes A2 chez l'homme, la souris et le rat ; SEQ ID NO : 2, isoforme B chez l'homme). L'hypusinylation est une modification post-traductionnelle qui résulte de l'addition d'un résidu 4 aminobutyl (provenant de la spermidine) sur un résidu Lys. La protéine eIF5A est la seule protéine connue à ce jour pour être hypusinylée (Park M.H. et al, J. Biochem. 2006). Cette protéine est un facteur d'initiation de la traduction eucaryote dont la structure est très conservée entre la levure et l'homme. La formation d'hypusine est généralement connue pour rendre la protéine eIF5A fonctionnelle, et contribue à la prolifération cellulaire, de sorte qu'elle est associée à différentes formes de cancers. L'inhibition de l'hypusinylation d'eIFSA est donc connue pour ses propriétés antiapoptotiques et cytostatiques, favorisant un état quiescent des cellules en bloquant les cellules en phase Gl/S (Balabanov S et al, Blood 2007 ; Jasiulionis M.G. et al, Cet/ Biochem. Funct. 2007). Plusieurs isoformes de eIF5A ont été découvertes : parmi elles, eIF5A1 (SEQ ID NO 1 à 4 chez l'homme, la souris et le rat) serait exprimée spécifiquement en réponse à l'induction d'une apoptose, induite par un inhibiteur du protéasome, le MG132, une autre (appelée eIF5A2, SEQ ID NO 5 à 7 pour l'homme, la souris et le rat) serait vraisemblablement impliquée dans la traduction et la prolifération cellulaire (Park M.H. et al, Amino Acids 2010). La protéine eIF5A1 est présentée comme une protéine spécifique de l'apoptose, ayant des propriétés pro-apoptotiques que l'on peut utiliser pour induire l'apoptose cellulaire, notamment celle des cellules tumorales (voir EP1959010 par exemple). La forme non-hypusinylée d'eIFSAl est active dans l'apoptose. L'inhibition de l'hypusinylation d'eIFSAl est donc généralement associée à un effet pro-apoptotique (Sun Z, J. Cell Physiol 2010).

Par ailleurs, à l'inverse, il est généralement admis que c'est la forme hypusinylée des isoformes d'eIFSA qui est impliquée dans la prolifération cellulaire. Dans ce cas, l'inhibition de l'hypusinylation bloque le cycle cellulaire et induit l'apoptose dans de nombreuses cellules tumorales (d'où son utilisation comme agent cytostatique) (Taylor CA, Exp Cet/ Res 2007 ; Li AL, J. Biol. Chem. 2004).

Si eIF5A a été initialement décrite comme étant un facteur d'initiation de la traduction, son inactivation n'est pas réellement associée à une diminution de la synthèse protéique, et un rôle plus complexe de transport nucléocytoplasmique des ARN messagers a également été suggéré (Park et al, Amino Acids, 2010). Deux enzymes, la désoxyhypusine synthase DHS (EC n° 2.5.1.46 ; SEQ ID NO : 8 à 10 pour l'homme (isoformes A, B, et C), SEQ ID NO : 11 chez la souris, et SEQ ID NO : 12 chez le rat) et la désoxyhypusine hydroxylase DHH (EC N° 1.14.99.29 ; SEQ ID NO : 13 pour l'homme, SEQ ID NO : 14 chez la souris, et SEQ ID NO : 15 chez le rat) sont nécessaires à l'hypusinylation d'eIFSA. D'autres enzymes y contribuent par ailleurs : ce sont les enzymes responsables de la synthèse des polyamines, dont en particulier la spermidine, qui est transformée en hypusine par la DHS et la DHH. Ces enzymes sont : l'ornithine décarboxylase (ODC), la Spermine synthase, la Spermidine synthase, la spermidine/spermine acétyltransferase (SSAT) et la polyamine oxydase, et la S-adénosyl-L-méthionine décarboxylase.

Des inhibiteurs de l'hypusinylation d'eIFSA ont été identifiés. Les plus connus sont le DFMO (R,S)-2-(difluorométhyl)ornithine) ou a-difluorométhylornithine (CAS 70052-12-9), un inhibiteur spécifique de l'ornithine décarboxylase et le GC7 (Nl-guanyl-1,7 diaminoheptane), un inhibiteur de la désoxyhypusine synthase DHS (CAS 150333-69-0). Ces inhibiteurs sont utilisés comme de puissants agents cytostatiques, et ont été proposés pour inhiber les pathologies cancéreuses ainsi que d'autres indications infectieuses (VIH, malaria, leishmaniose) (Jasiulionis M.G. et al, Cet/ Biochem. Funct. 2007, Kersher B et al, Amino Acids 2010). Certaines études suggèrent un effet proapoptotique propre du GC7 et d'autres inhibiteurs de DHS (cf. EP1959010, Sun Z, J. Cet/ Physiol 2010).

Ainsi, l'hypusinylation d'eIFSA est considérée comme une cible potentielle dans le traitement de cancers et d'autres maladies infectieuses (VIH, malaria, leishmaniose). Cependant, le lien entre cette hypusinylation et la tolérance hypoxique n'a jamais été identifié chez un mammifère. Des études récentes sur les mécanismes impliqués dans les mécanismes de tolérance à l'hypoxie ont été réalisées sur des mouches de l'espèce Drosophila (Vigne P, et al, Mech Ageing Dev 2007 et Vigne P. et al, BMC Physiology 2008). Ces études démontrent que le sucrose augmente la survie des Drosophiles placées en conditions d'hypoxie chronique (5% d'02). A l'inverse, les acides aminés naturels (notamment L-proline, L-arginine, L-glutamine, et L-asparagine), les acides aminés du cycle de l'urée (L-citrulline, L-ornithine) et les polyamines (putrescine, spermine, et spermidine) réduisent la survie des mouches hypoxiées et nourries par une solution de sucrose. Les acides aminés du régime alimentaire sont bénéfiques dans des conditions normales d'oxygénation (21% d'02). Vigne et al. a démontré en 2008 que l'inhibiteur spécifique de l'hypusinylation d'eIFSA, GC7, est capable de diminuer l'effet toxique des acides aminés et des polyamines cités ci-dessus. Les expériences de En l'absence d'acides aminés, le traitement des mouches avec du GC7 diminue leur longévité dans des conditions d'hypoxie, suggérant que le GC7 a un effet délétère sur les cellules hypoxiées. En d'autres termes, selon cette étude, en l'absence d'acides aminés ou de polyamines, le traitement au GC7 induit une diminution de la tolérance hypoxique chez la Drosophile. Dans des conditions hypoxiques et en présence d'acides aminés, le GC7 augmente la tolérance hypoxique des drosophiles. Dans un premier aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les pathologies résultant de conditions hypoxiques et/ou de lésions ischémiques chez un mammifère, ladite composition comprenant, en tant qu'agent cyto-protecteur, un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA. En d'autres termes, la présente invention vise l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent cyto-protecteur, un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou traiter les pathologies résultant de conditions hypoxiques et/ou de lésions ischémiques chez le mammifère. Plus précisément, la présente invention vise un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les pathologies résultant de conditions hypoxiques et/ou de lésions ischémiques chez un mammifère, ou encore l'utilisation d'un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou traiter les pathologies résultant de conditions hypoxiques et/ou de lésions ischémiques chez un mammifère. Enfin, la présente invention vise aussi une méthode de prévention et/ou de traitement de pathologies résultant de conditions hypoxiques et/ou de lésions ischémiques chez un individu qui en souffre, comprenant l'étape d'administrer une composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent cyto-protecteur, un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.

Dans le cadre de la présente invention, les conditions «hypoxiques » résultent soit d'une lésion ischémique (hypoxie pathologique), soit lorsque l'on monte en altitude (hypoxie naturelle). De préférence, la composition pharmaceutique est utilisée pour prévenir l'apparition de troubles liés à l'occurrence d'une lésion ischémique. Dans le cadre de la présente invention, lesdites pathologies sont de préférence choisies parmi : l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique, l'insuffisance cardiaque due à un infarctus, les séquelles neurologiques dues à un accident vasculaire cérébral, les microangiopathies périphériques et centrales, ou les dérèglements d'un organe tel que le foie, l'intestin, le coeur, le poumon ou le rein suite à sa transplantation. En effet, lors de la transplantation d'organes comme le foie, les intestins, le coeur ou les poumons, ces organes sont transportés parfois sur une certaine distance et pendant un temps plus ou moins long. Classiquement, les greffons sont conservés 4°C dans des solutions appropriées à chaque organe.

La durée d'ischémie froide (DIF) des organes prélevés est le délai pendant lequel le greffon est réfrigéré. Il a été montré que le risque d'échec de la greffe augmente avec l'augmentation de la DIF. La lésion ischémique ne doit généralement pas dépasser quelques heures, sous peine de séquelles irréversibles.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique de l'invention peut être utilisée pour augmenter la tolérance hypoxique des cellules de mammifère soumises à une lésion ischémique ou à des conditions hypoxiques. Notamment, en ce qui concerne le don d'organe, la composition pharmaceutique de l'invention permet d'augmenter le temps limite d'attente de l'organe avant sa réoxygénation dans les tissus de l'individu transplanté(le DIF), avant que des séquelles n' apparaissent. De préférence, dans le cadre de la présente invention, ledit agent inhibiteur de l'hypusinylation inhibe la synthèse de l'hypusine.

L'hypusine (N£-(4-amino-2-hydroxybutyl)lysine) est un acide aminé unique qui n'intervient que pour la modification d'eIFSA, que ce soit chez les mammifères ou chez la Drosophile. Il est formé en deux temps. D'abord, l'enzyme DHS transfère le groupe 4-aminobutyl de la spermidine sur le groupe c du résidu lysine de la protéine eIF5A inactive. Puis DHH effectue l'hydroxylation de la protéine eIF5A-désoxyhypusine en eIF5A-hypusine qui est la forme active d'eIFSA (Park MH et al, Amino Acids 2010). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'agent inhibiteur de l'hypusinylation inhibe la désoxyhypusine synthase (DHS) ou la désoxyhypusine hydroxylase (DHH). Dans le cadre de la présente invention, cet agent inhibiteur de l'hypusinylation est choisi parmi les dérivés du 1,7-diaminoheptane (DAH ; CAS 646-19-5) tels que le Nl-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7) (CAS 150333-69-0 ), le 1,3 diazacyclohexane (CAS 505-21-5) et le 1,3 diazacyclo-l-hexene (CAS 25377-66-6), le (R,S)-2- (difluorométhyl)ornithine (DFMO ; CAS 70052-12-9), la trans-4- methylcyclohexylamine (CAS 2523-55-9), la N-(3-aminopropyl)cyclohexylamine (CAS 3312-60-5), et est de préférence le Nl-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7). Enfin, les présents Inventeurs ont démontré que le GC7 permettait de protéger un mammifère des conséquences néfastes d'une insuffisance rénale causée par une lésion ischémique (voir exemples). Dans un deuxième aspect la présente invention concerne donc une composition pharmaceutique pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique, ladite composition comprenant, en tant qu'agent cytoprotecteur, un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, de préférence le Nl-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7). En d'autres termes, la présente invention vise l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent cyto-protecteur, un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou traiter l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique chez le mammifère. De préférence, la composition pharmaceutique est utilisée pour prévenir l'apparition de troubles liés à l'insuffisance rénale.

Plus précisément, la présente invention vise un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique chez un mammifère, ou encore l'utilisation d'un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou traiter l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique chez un mammifère. De préférence, ledit agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA est le Nl-Guanyl- 1 ,7- diamino heptane (GC7). La présente invention vise enfin une méthode de prévention et/ou de traitement de l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique chez un individu qui en souffre, comprenant l'étape d'administrer une composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent cyto-protecteur, un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIFSA, et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. EXEMPLES Les Inventeurs ont évalué si et dans quelle mesure la désoxyhypusine synthase (DHS) pouvait être utilisée comme cible pharmacologique potentielle dans les indications d'hypoxie/ischémie chez une espèce mammifère, par exemple le rat. Pour ce faire, un modèle d'ischémie rénale par arrêt momentané du flot artériel (Wenzel et al., 1992, Basile et al., 2005) a été mis en place (figure 1). L'ischémie a été réalisée chirurgicalement par ligature de l'artère rénale chez des rats femelles adultes anesthésiés à l'isoflurane. Après 40 minutes d'ischémie, le flux sanguin a été restauré. L'atteinte rénale a été évaluée par la mesure d'un marqueur de la soufrance rénale (NGAL, Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin, par test ELISA) dans l'urine des rats. La fonction rénale a été évaluée par la méthode des clairances : des échantillons de plasma et d'urine ont été collectés et analysés pour déterminer l'excrétion fractionnelle de glucose, de sodium et de phosphate. Synthèse du GC 7 Le GC7 (Nl-guanyl-1,7 diaminoheptane), un inhibiteur de la désoxyhypusine synthase DHS, a été synthétisé selon la méthode décrite par Jalusionis et al. Cet/ Biochem Funct (2007). La structure du produit et sa pureté ont été évaluées par des méthodes d'analyse connues de l'homme du métier (RMN, spectrométrie de masse).

La pureté obtenue est supérieure à 99%. Le GC7 est soluble dans l'eau. Une solution 3 mg/ml a été préparée dans une solution saline physiologique. Production d'anticorps anti hypusine La L-hypusine a été synthétisée selon la technique décrite par Bergeron et al. (J Med Chem 1998) et incorporée dans le peptide : Cys-Thr-Gly-Hpu-His-Gly (Hpu = hypusine). Un anticorps polyclonal a été produit chez le lapin après couplage du peptide à l'ovalbumine. Il reconnaît dans des expériences de Western blot, une seule protéine au poids moléculaire attendu (17 kDa). Le sérum pré-immun est inactif. La dilution utilisée et 1/1000. NGAL : un marqueur de l'atteinte rénale Le NGAL (Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin) est considéré comme un marqueur fiable d'un état d'hypoxie tissulaire au niveau rénal (Mishra et al., 2003, 2004, Haase et al., 2009). Les taux urinaires de NGAL sont déterminés par un test ELISA commercial (Bioporto) et rapportés aux concentrations urinaires de créatinine. Les rats ont été répartis en deux groupes, l'un traité au GC7 (3 mg/kg infra 20 péritonéal), l'autre avec le véhicule contrôle (même quantité de solution saline) pendant 4 jours avant que soit réalisée la lésion ischémique. Pour réaliser la lésion ischémique, les rats ont été anesthésiés avec de l'isoflurane, et l'artère rénale gauche a été ligaturée. Après 40 minutes d'ischémie, le flux sanguin est restauré. Les urines et un échantillon sanguin sont récoltés au temps 25 zero (avant l'ischémie) et après 24 heures de récupération. a) dosage du NGAL urinaire Le marqueur NGAL a été dosé dans les urines totales avant et 24 heures après la ligature de 40 minutes de l'artère rénale gauche. Les résultats sont présentés sur la figure 2. Ces résultats démontrent que l'ischémie induit une production urinaire de NGAL chez les animaux contrôles (confirmant l'existence d'un état ischémique), et que cette production est inhibée par le GC7, indiquant un effet protecteur du GC7. La figure 2 montre également que l'administration de GC7 ne modifie pas l'excrétion 5 urinaire de NGAL au temps 0 avant l'ischémie. b) dosage du NGAL plasmatique Le NGAL plasmatique a été dosé 24 heures après une ligature de 40 minutes de l'artère rénale gauche chez des rats contrôles ou traités par du GC7. Les résultats sont présentés sur la figure 3. Ces résultats démontrent que l'augmentation de NGAL 10 plasmatique est plus réduite chez les animaux traités au GC7, ce qui indique un effet protecteur. c) Fonction rénale La fonction rénale a été évaluée par une mesure de l'excrétion fractionnelle de glucose. Tous les rats ont été soumis à une ischémie de 40 minutes de l'artère rénale gauche 15 puis reperfusés. Après 24 heures de récupération les expériences de clearance ont été réalisées sur des rats anesthésiés au pentobarbital. Le glucose sanguin et urinaire a été dosé par une technique spectrométrique (Randox, Kit Glue HK). La figure 4 montre une altération de la réabsorption de glucose par les reins ischémiés. Le GC7 corrige en grande partie ce défaut. 20 Le sodium plasmatique (Na) et urinaire a été mesuré par spectrométrie de flamme. Le Phosphate plasmatique et urinaire a été dosé par chromatographie ionique (Dionex IonPac AS11). La figure 5 montre une altération de la réabsorption de sodium et de phosphates par les reins ischémiés. Ici encore les animaux traités par le GC7 sont protégés des conséquences cellulaires néfastes induites par l'ischémie. 25 d) Hypusinylation de eIF5A GC7 est un inhibiteur réputé spécifique de la desoxyhypusine synthase, l'enzyme qui permet l'hypusinylation (et la fonctionalisation de eIF5A). Il était important de vérifier que le traitement des rats par le GC7 réduisait effectivement l'hypusinylation de eIF5A. L'hypusinylation de eIF5A a été analysée par des expériences de « Western blot » en utilisant deux anticorps primaires : 1) un anticorps commercial (AbCam, Ref : ab32443). Cet anticorps reconnaît toutes les formes (hypusinylées ou non de eIF5A) 2) un anticorps polyclonal dirigé contre les formes hypusinylées de eIF5A a été produit chez le lapin à partir d'un peptide synthétique (Cys-Thr-Gly-Hpu-His-Gly) qui reproduit la séquence de eIF5A autour du site d'hypusinylation. Les reins d'animaux contrôle ou traités au GC7 (3 mg/kg intra péritonéal pendant 4 jours) ont été homogénéisés dans un tampon de solubilisation (10 mM Phosphate, 3% SDS, 3% glycerol). Les expressions des formes totale et hypusynilée de eIF5A sont analysées par Western blot. Après numérisation, le rapport des deux signaux est calculé. La Figure 6 montre que, comme attendu, l'administration de GC7 diminue de manière significative l'hypusinylation de eIF5A au niveau rénal. Conclusion Les résultats présentés ci-dessus indiquent que le GC7 inhibe bien l'hypusinylation d'eIFSA au niveau rénal. Par ailleurs, les présents Inventeurs ont pu montrer que le GC7 protège l'atteinte rénale induite par une ischémie/reperfusion. Le GC7 protège donc en grande partie les animaux contre les conséquences rénales d'une ischémie.

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Claims (7)

1. REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique pour son utilisation pour REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les pathologies résultant de conditions hypoxiques et/ou de lésions ischémiques chez un mammifère, ladite composition comprenant en tant qu'agent cyto-protecteur un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIF5A choisi parmi les dérivés du 1,7-diaminoheptane (DAH) tels que le N1-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7), le 1,3 diazacyclohexane et le 1,3 diazacyclo-1-hexene, le (R,S)-2-(difluorométhyl)ornithine (DFMO), la trans-4-methylcyclohexylamine, et la N-(3-aminopropyl)cyclohexylamine.
2. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites pathologies sont choisies parmi : l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique, l'insuffisance cardiaque due à un infarctus, les séquelles neurologiques dues à un accident vasculaire cérébral, les microangiopathies périphériques et centrales, ou les dérèglements d'un organe tel que le foie, l'intestin, le coeur, le poumon ou le rein suite à sa transplantation.
3. 3. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, pour son utilisation pour augmenter la tolérance hypoxique des cellules de mammifère soumises à une lésion ischémique ou à des conditions hypoxiques.
4. 4. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit agent inhibiteur de l'hypusinylation inhibe la synthèse de l'hypusine.
5. 5. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent inhibiteur de l'hypusinylation inhibe la désoxyhypusine synthase (DHS) ou la désoxyhypusine hydroxylase (DHH).
6. 6. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit agent inhibiteur de l'hypusinylation est le Ni-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7).
7. 7. Composition pharmaceutique pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter l'insuffisance rénale due à une lésion ischémique, ladite composition comprenant, entant qu'agent cyto-protecteur, un agent inhibiteur de l'hypusinylation d'eIF5A, de préférence le Nl-Guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7).