FR2957156A1

FR2957156A1 - Focusing device for obtaining isotropic light spot in fields of biology and nanotechnology, has reflecting device located at midway between focal points for forming isotropic light spot by reflecting light spot on another light spot

Info

Publication number: FR2957156A1
Application number: FR1051581A
Authority: FR
Inventors: Anne Sentenac; Emeric Mudry; Moal Eric Le; Patrick Ferrand
Original assignee: Universite Paul Cezanne Aix Marseille III
Current assignee: Aix Marseille Universite
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2011-09-09

Abstract

The device (1) has a light source (4) for generating incident beam propagating along an optical axis (3), and an incident beam forming device (6) i.e. phase shift mask, arranged between the light source and a convergent lens (5) i.e. immersion lens. The incident beam forming device modifies the incident beam to define a focal point (7) and another focal point, where the focal points are different from each other. A reflecting device (11) e.g. deformable mirror, is located at a midway between focal points to form an isotropic light spot (2) by reflecting a light spot on another light spot.

Description

Dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope L'invention concerne de façon générale le domaine de l'optique. L'invention concerne plus particulièrement un dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope comprenant au moins, alignés le long d'un axe optique : û une source de lumière pour générer un faisceau incident se propageant selon l'axe optique, et û un objectif convergent. Un dispositif de ce type est par exemple décrit dans le document EP 0 491 289 qui décrit plus spécifiquement un microscope. Dans le domaine de la microscopie optique, la faible résolution axiale, c'est-à-dire la faible résolution selon l'axe optique ou selon z, des microscopes est un problème qui se retrouve dans la plupart des microscopes commercialisés. Par exemple, pour les meilleurs objectifs, la résolution axiale n'est que de l'ordre du micron, quand la résolution transverse est de l'ordre de 300 nanomètres. La raison principale de cette anisotropie provient du fait que l'on éclaire et que l'on observe l'échantillon à travers un objectif placé d'un seul côté de l'échantillon. En règle générale, les utilisateurs s'accommodent de cette anisotropie. Cependant, certains microscopes « avancés » ont été commercialisés pour remédier à cette difficulté. Ils reposent sur des inventions relativement récentes. The invention relates generally to the field of optics. The invention relates more particularly to a focusing device making it possible to obtain an isotropic luminous task comprising at least, aligned along an optical axis: a light source for generating an incident beam propagating along the optical axis, and a convergent goal. A device of this type is for example described in EP 0 491 289 which more specifically describes a microscope. In the field of optical microscopy, the low axial resolution, that is to say the low resolution along the optical axis or according to z, microscopes is a problem that is found in most microscopes marketed. For example, for the best objectives, the axial resolution is only of the order of one micron, when the transverse resolution is of the order of 300 nanometers. The main reason for this anisotropy is that the sample is illuminated and observed through an objective placed on one side of the sample. In general, users are comfortable with this anisotropy. However, some "advanced" microscopes have been commercialized to remedy this difficulty. They are based on relatively recent inventions.

Il existe des masques de phase propres à modifier le faisceau incident avant son passage par un objectif de manière à réduire l'étalement selon z de la tâche lumineuse obtenu par focalisation. Cependant, cette technique ne permet que des améliorations marginales, c'est-à-dire une réduction de 20 à 30% de l'étalement selon z. There are phase masks adapted to modify the incident beam before it passes through an objective so as to reduce the z-spreading of the light task obtained by focusing. However, this technique allows only marginal improvements, that is, a 20 to 30% reduction in z-spreading.

Parmi les microscopes « avancés » propres à améliorer la résolution axiale de la tâche lumineuse, le document WO 0007056 enseigne un « thêta » microscope propre à obtenir une résolution quasi-isotrope de la tâche lumineuse. Utilisé dans le domaine de la microscopie en fluorescence, son principe consiste à éclairer l'objet selon un axe et à détecter la fluorescence selon un axe orthogonal au premier. La fonction d'appareil résultante étant le produit des fonctions d'illumination et de détection, elle est à peu près isotrope. Ce microscope nécessite deux objectifs (pour l'illumination et la collection) dont l'encombrement impose à chacun une faible ouverture numérique. Cela limite l'intérêt de cette approche en termes de résolution. Une autre version du thêta microscope à un seul objectif existe. Il nécessite d'introduire un porte échantillon relativement complexe, fait d'un miroir horizontal et de prismes métallisés. Dans les deux cas, le réglage du thêta microscope est difficile car il faut faire coïncider les volumes de détection et d'illumination, ces derniers étant obtenus par des chemins optiques différents. Egalement parmi les microscopes « avancés » propres à améliorer la résolution axiale de la tâche lumineuse, le document EP 0 491 289 ou le document WO2005/033768 enseigne un « 4pi » microscope qui utilise deux objectifs se faisant face, pour obtenir une tâche lumineuse isotrope. La tâche lumineuse est plus particulièrement obtenue en faisant interférer les deux champs focalisés obtenus en éclairant les deux objectifs de manière cohérente. Dans le domaine de la microscopie en fluorescence, la détection de fluorescence est obtenue de manière similaire en faisant interférer la lumière collectée par les deux objectifs. De par sa conception, le 4pi microscope est très difficile à régler et très coûteux. Sa mise en oeuvre est très délicate. Elle nécessite un montage assez différent des microscopes à balayage standard (deux objectifs et un système interférométrique de détection). Ensuite, le document WO 9418594 enseigne un « Standing-Wave (SW) » microscope propre à améliorer la résolution axiale du microscope. L'échantillon est placé à proximité d'un miroir mobile. Le miroir est éclairé par une onde plane se propageant selon l'axe optique (ou selon z), qui, en se réfléchissant, crée un système d'onde stationnaire. La fluorescence est collectée par un objectif de microscope conventionnel ou par deux objectifs (technique I5M). En translatant le système d'onde stationnaire, on peut obtenir une image 3D de l'échantillon. Cette technique, beaucoup plus simple à mettre en oeuvre que le 4pi microscope a une résolution transverse et axiale bien moins bonne que ce dernier. Le document WO2008/144434 enseigne une approche qui consiste à éclairer l'échantillon par une grille de lumière dans le plan (x0y) (et non selon z comme dans le Standing Wave microscope). A partir de trois images correspondant à trois positions de la grille, on peut, à l'aide d'un traitement numérique, éliminer en partie la fluorescence ne provenant pas du plan focal et ainsi améliorer la résolution selon l'axe optique de l'image. Cette technique dite « large champ » n'est pas compatible avec une imagerie point par point. Among the "advanced" microscopes capable of improving the axial resolution of the light spot, WO 0007056 teaches a "theta" microscope capable of obtaining a quasi-isotropic resolution of the light spot. Used in the field of fluorescence microscopy, its principle is to illuminate the object along an axis and to detect fluorescence along an axis orthogonal to the first. Since the resulting device function is the product of the illumination and detection functions, it is almost isotropic. This microscope requires two objectives (for illumination and collection) whose size imposes on each a low numerical aperture. This limits the interest of this approach in terms of resolution. Another version of the theta single-lens microscope exists. It requires introducing a relatively complex sample holder, made of a horizontal mirror and metallized prisms. In both cases, the setting of the theta microscope is difficult because it is necessary to coincide the detection and illumination volumes, the latter being obtained by different optical paths. Also among the "advanced" microscopes capable of improving the axial resolution of the light task, the document EP 0 491 289 or the document WO2005 / 033768 teaches a "4pi" microscope which uses two objectives facing one another, to obtain an isotropic light task. . The luminous task is more particularly obtained by interfering the two focused fields obtained by illuminating the two objectives in a coherent manner. In the field of fluorescence microscopy, the fluorescence detection is similarly obtained by interfering the light collected by the two lenses. By design, the microscope is very difficult to adjust and very expensive. Its implementation is very delicate. It requires a rather different mounting of standard scanning microscopes (two objectives and an interferometric detection system). Next, WO 9418594 teaches a "Standing-Wave (SW)" microscope to improve the axial resolution of the microscope. The sample is placed near a moving mirror. The mirror is illuminated by a plane wave propagating along the optical axis (or z), which, reflecting, creates a stationary wave system. Fluorescence is collected by a conventional microscope objective or by two objectives (I5M technique). By translating the standing wave system, a 3D image of the sample can be obtained. This technique, much simpler to implement than the 4pi microscope has a transverse and axial resolution much worse than the latter. WO2008 / 144434 teaches an approach which consists in illuminating the sample by a light grid in the (x0y) plane (and not in z as in the Standing Wave microscope). From three images corresponding to three positions of the grid, it is possible, using a digital processing, to partially eliminate the fluorescence not coming from the focal plane and thus to improve the resolution along the optical axis of the picture. This so-called "wide field" technique is not compatible with point-by-point imaging.

Elle ne peut donc pas être utilisée pour des applications nécessitant d'éclairer l'échantillon avec un tout petit volume de lumière (pour de la spectroscopie de corrélation de fluorescence par exemple). Récemment, il a été proposé, par le document WO2008/0515, de combiner le SW microscope et l'éclairement structuré. L'échantillon est placé à proximité d'un élément diffractant (réseau métallisé). Cet élément peut être déplacé par rapport à l'échantillon dans les trois dimensions. Cet élément diffractant crée un système d'onde stationnaire complexe dans les trois dimensions de l'espace. On enregistre plusieurs images en translatant cette grille et on reconstruit la carte de fluorescence de l'échantillon grâce à des algorithmes de reconstruction. Ce microscope est un microscope large-champ et n'est pas compatible avec une imagerie point à point. Plus particulièrement, son éclairement consiste en une fonction périodique dans les trois dimensions de l'espace, mais ne consiste pas en une tâche lumineuse isotrope. It can not therefore be used for applications requiring the illumination of the sample with a very small volume of light (for fluorescence correlation spectroscopy for example). Recently, it has been proposed by WO2008 / 0515 to combine the SW microscope with structured illumination. The sample is placed near a diffracting element (metallized network). This element can be moved relative to the sample in all three dimensions. This diffracting element creates a complex stationary wave system in the three dimensions of space. Several images are recorded by translating this grid and the fluorescence map of the sample is reconstructed using reconstruction algorithms. This microscope is a wide-field microscope and is not compatible with point-to-point imaging. More particularly, its illumination consists of a periodic function in the three dimensions of space, but does not consist in an isotropic luminous task.

Par ailleurs, il existe des lentilles structurées (cf. le document US005760871) propres à mettre en forme un faisceau incident ou front d'onde incident avant son passage par un objectif de manière à obtenir, conjointement avec l'objectif, deux foyers. Les applications de ce type de lentilles sont plutôt d'ordre ophtalmologique. In addition, there are structured lenses (see US005760871) adapted to shape an incident beam or incident wavefront before passing through a lens so as to obtain, together with the objective, two foci. The applications of this type of lens are rather ophthalmological.

Dans ce contexte, la présente invention propose une solution applicative permettant de pallier un ou plusieurs des inconvénients précédemment évoqués. In this context, the present invention provides an application solution for overcoming one or more of the aforementioned disadvantages.

A cette fin, le dispositif de l'invention, par ailleurs conforme à la définition générique qu'en donne le préambule ci-dessus, est essentiellement caractérisé en ce qu'il comprend : û un dispositif de mise en forme du faisceau incident, agencé entre la source de lumière et l'objectif et conçu pour modifier le faisceau incident de façon à définir, conjointement avec l'objectif, un premier point focal et au moins un second point focal distincts entre eux et en lesquels la lumière incidente forme respectivement une première tâche lumineuse et au moins une seconde tâche lumineuse, lesdites tâches lumineuses étant cohérentes entre elles et ayant sensiblement la même distribution de champ électrique, et û un dispositif de réflexion situé entre le premier point focal et ledit au moins un second point focal, le dispositif de réflexion étant propre à former ladite tâche lumineuse isotrope par réflexion de ladite au moins une seconde tâche lumineuse sur la première tâche lumineuse. Le dispositif selon l'invention forme donc la tâche lumineuse isotrope, par interférences entre ladite au moins une seconde tâche lumineuse et la première tâche lumineuse. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'objectif est propre à atteindre un angle d'éclairement par rapport à l'axe optique supérieur à 60°. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'objectif est un objectif à immersion. Le dispositif selon l'invention permet ainsi avantageusement d'atteindre une ouverture numérique de l'objectif supérieure à 1. Dans un mode de réalisation de l'invention, le dispositif de mise en forme du faisceau incident est un masque à décalage de phase. Le masque à décalage de phase module en phase le faisceau incident. Il est passif et bon marché. To this end, the device of the invention, moreover in accordance with the generic definition given in the preamble above, is essentially characterized in that it comprises: an incident beam shaping device, arranged between the light source and the objective and adapted to modify the incident beam so as to define, together with the lens, a first focal point and at least a second focal point which are distinct from each other and in which the incident light respectively forms a first light spot and at least one second light spot, said light spots being coherent with each other and having substantially the same electric field distribution, and a reflection device located between the first focal point and said at least one second focal point, the reflection device being adapted to form said isotropic light task by reflection of said at least one second light task on the first light task. The device according to the invention thus forms the isotropic light spot, by interference between said at least one second light task and the first light task. In a preferred embodiment of the invention, the objective is to achieve an illumination angle with respect to the optical axis greater than 60 °. In a preferred embodiment of the invention, the objective is an immersion objective. The device according to the invention thus advantageously makes it possible to achieve a numerical aperture of the objective greater than 1. In one embodiment of the invention, the device for shaping the incident beam is a phase shift mask. The phase shift mask phase-modulates the incident beam. It is passive and cheap.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif de mise en forme du faisceau incident est un modulateur spatial de lumière ou un miroir déformable propre à modifier l'intensité, la phase et/ou la polarisation du faisceau incident. In a preferred embodiment of the invention, the device for shaping the incident beam is a spatial light modulator or a deformable mirror capable of modifying the intensity, the phase and / or the polarization of the incident beam.

Le modulateur spatial de lumière présente l'avantage d'être actif. Il se présente sous la forme d'une matrice par exemple de cristaux liquides ou de micro-miroirs dont l'orientation est commandée par un champ électrique. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif de mise en forme du faisceau incident est un dispositif comprenant au moins deux lentilles et un séparateur de faisceau. Le positionnement relatif des lentilles permet alors de fixer simplement la position des points focaux. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif de réflexion est un miroir plan. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif de réflexion est un miroir déformable ou déformé par rapport à un miroir plan. L'utilisation d'un miroir déformable permet de corriger les aberrations optiques du dispositif de mise en forme du faisceau incident et de l'objectif du microscope. S'il est connu lesdites aberrations, et par conséquent les corrections à y apporter, l'utilisation d'un miroir déformé par rapport à un miroir plan est non seulement envisageable, mais également préférable pour des raisons de coût, ledit miroir déformé étant propre à corriger les aberrations optiques du dispositif de mise en forme du faisceau incident et de l'objectif du microscope et étant passif donc moins cher que le miroir déformable. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif de réflexion est un miroir concave ou à multiples facettes. Dans le cas où une pluralité de secondes tâches lumineuses sont définies par le dispositif de mise en forme conjointement avec l'objectif, le miroir concave ou à multiples facettes est avantageusement agencé entre le premier point focal et les seconds points focaux, pour réfléchir chacune desdites secondes tâches lumineuses sur la première tâche lumineuse. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope comprend un système de balayage opto-mécanique. Le dispositif selon l'invention est ainsi avantageusement agencé pour balayer un échantillon. The spatial light modulator has the advantage of being active. It is in the form of a matrix for example of liquid crystals or micro-mirrors whose orientation is controlled by an electric field. In another embodiment of the invention, the device for shaping the incident beam is a device comprising at least two lenses and a beam splitter. The relative positioning of the lenses then makes it possible to simply fix the position of the focal points. In a preferred embodiment of the invention, the reflection device is a plane mirror. In another embodiment of the invention, the reflection device is a deformable or deformed mirror with respect to a plane mirror. The use of a deformable mirror makes it possible to correct the optical aberrations of the device for shaping the incident beam and the objective of the microscope. If said aberrations are known, and consequently the corrections to be made thereto, the use of a mirror that is deformed with respect to a plane mirror is not only conceivable, but also preferable for reasons of cost, said deformed mirror being clean. to correct the optical aberrations of the device for shaping the incident beam and the objective of the microscope and being passive therefore less expensive than the deformable mirror. In another embodiment of the invention, the reflection device is a concave or multifaceted mirror. In the case where a plurality of second light tasks are defined by the shaping device together with the objective, the concave or multifaceted mirror is advantageously arranged between the first focal point and the second focal points, to reflect each of said second light tasks on the first light task. In a preferred embodiment of the invention, the focusing device for obtaining an isotropic light spot comprises an opto-mechanical scanning system. The device according to the invention is thus advantageously arranged to scan a sample.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le système de balayage opto-mécanique comprend au moins une platine motorisée de translation dans les trois directions de l'espace. La platine motorisée de translation est par exemple agencée pour supporter l'échantillon et le dispositif selon l'invention est ainsi avantageusement agencé pour balayer l'échantillon dans sa largeur, sa longueur et son épaisseur. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le système de balayage comprend au moins une platine motorisée de rotation. In one embodiment of the invention, the opto-mechanical scanning system comprises at least one motorized translation stage in the three directions of space. The motorized translation stage is for example arranged to support the sample and the device according to the invention is thus advantageously arranged to scan the sample in its width, length and thickness. In another embodiment of the invention, the scanning system comprises at least one motorized turntable.

La platine motorisée de rotation est par exemple agencée pour supporter un miroir déviant la source de lumière cohérente et le dispositif selon l'invention est ainsi avantageusement agencé pour faire varier l'angle d'incidence du faisceau incident, et ainsi balayer l'échantillon dans un plan transverse à l'axe optique. The motorized turntable is for example arranged to support a mirror deviating the coherent light source and the device according to the invention is thus advantageously arranged to vary the angle of incidence of the incident beam, and thus to scan the sample in a plane transverse to the optical axis.

Selon une particularité, le dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope est tel qu'il comprend en outre : û un séparateur de faisceau agencé entre la source de lumière et le dispositif de mise en forme du faisceau incident, et û un détecteur de lumière agencé pour capter un faisceau collecté 20 se propageant dans le sens opposé au sens de propagation du faisceau incident, ledit dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope constituant ainsi un microscope confocal. Ainsi, l'homme de métier comprend que le dispositif selon l'invention 25 est tout à fait exploitable dans un microscope confocal à balayage ou à champ large. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le détecteur de lumière est un détecteur ponctuel ou un détecteur matriciel. Le dispositif selon l'invention permet ainsi de créer des images 30 bidimensionnelles ou stéréoscopiques de l'échantillon observé. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif comprend en outre des moyens de traitement du faisceau collecté, ces moyens de traitement étant placés en amont du détecteur de lumière. According to a particularity, the focusing device making it possible to obtain an isotropic luminous task is such that it further comprises: a beam separator arranged between the light source and the device for shaping the incident beam, and light detector arranged to capture a collected beam 20 propagating in the opposite direction to the direction of propagation of the incident beam, said focusing device for obtaining an isotropic light spot thus constituting a confocal microscope. Thus, those skilled in the art understand that the device according to the invention is fully usable in a confocal scanning or wide-field microscope. In a preferred embodiment of the invention, the light detector is a point detector or a matrix detector. The device according to the invention thus makes it possible to create two-dimensional or stereoscopic images of the sample observed. In a preferred embodiment of the invention, the device further comprises means for processing the collected beam, these processing means being placed upstream of the light detector.

Un montage interférométrique peut ainsi être placé, avant la détection, pour compenser le retard de phase d'une partie de la lumière émise par l'échantillon, ce retard étant induit par la réflexion sur le dispositif de réflexion. An interferometric assembly can thus be placed, before the detection, to compensate for the phase delay of a portion of the light emitted by the sample, this delay being induced by the reflection on the reflection device.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront clairement de la description qui en est faite ci-après, à titre indicatif et nullement limitatif, en référence aux dessins annexés, dans lesquels : û la figure 1 représente un schéma de principe d'un microscope confocal selon l'art antérieur, û la figure 2 représente une première partie du dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope selon l'invention, û la figure 3 représente le dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope selon l'invention, et û la figure 4 illustre un microscope confocal intégrant le dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope selon l'invention. Comme illustré sur la figure 3, le dispositif de focalisation 1 permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope 2 comprend au moins, alignés le long d'un axe optique 3 : û une source de lumière 4 pour générer un faisceau incident se propageant selon l'axe optique, et û un objectif 5 convergent. Dans l'acceptation la plus large du dispositif selon l'invention, la source de lumière 4 peut être incohérente. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la source de lumière 4 est cohérente. A titre d'exemple, il comprend un laser, plus particulièrement un laser émettant un rayonnement d'une longueur d'onde égale à 630 nanomètres environ. Il est à noter que la source de lumière 4 cohérente n'est pas limitée à cette préférence et toute autre source de lumière cohérente est envisageable, telle que par exemple une lampe à sodium ou un maser. Il est également à noter que l'étalement transverse de chaque tâche lumineuse 9 ou 10 est proportionnel à la longueur d'onde du rayonnement incident. L'objectif doit permettre d'atteindre des angles d'éclairement par rapport à l'axe optique supérieurs à 60°. En effet, une telle ouverture angulaire ou numérique permet de focaliser des tâches lumineuses dont l'étalement axial, quoique bien supérieur à l'étalement transverse, est suffisamment petit pour obtenir après interférence axiale sur le miroir une tâche lumineuse isotrope. Une ouverture angulaire inférieure fait apparaître plusieurs lobes secondaires autour de la tâche lumineuse isotrope qui ne sont pas souhaitables, hormis dans certaines applications spécifiques. Dans un mode réalisation préféré de l'invention, l'objectif 5 est un objectif à immersion. L'utilisation d'un objectif à immersion permet d'éliminer la lame d'air entre l'objectif et un échantillon à éclairer, en la remplaçant par un liquide (par exemple des huiles de synthèse dont l'indice est proche de celui du verre). Dans ce cas, le dispositif selon l'invention permet avantageusement d'atteindre une ouverture numérique supérieure à 1. Dans le mode réalisation préféré de l'invention, le dispositif est tel qu'il comprend en outre : û un dispositif de mise en forme 6 du faisceau incident, agencé entre la source de lumière cohérente et l'objectif et conçu pour modifier le faisceau incident de façon à définir, conjointement avec l'objectif, deux points focaux 7 et 8 distincts, et û un dispositif de réflexion 11 situé à mi-distance entre les deux points focaux. Other features and advantages of the invention will emerge clearly from the description which is given hereinafter, by way of indication and in no way limiting, with reference to the appended drawings, in which: FIG. 1 represents a schematic diagram of a confocal microscope according to the prior art, FIG. 2 represents a first part of the focusing device making it possible to obtain an isotropic light task according to the invention, FIG. 3 represents the focusing device making it possible to obtain a luminous task isotropic according to the invention, and - 4 shows a confocal microscope incorporating the focusing device for obtaining an isotropic light task according to the invention. As illustrated in FIG. 3, the focusing device 1 making it possible to obtain an isotropic light spot 2 comprises, at least, aligned along an optical axis 3: a light source 4 for generating an incident beam propagating according to FIG. optical axis, and a convergent objective 5. In the broadest acceptance of the device according to the invention, the light source 4 may be incoherent. In a preferred embodiment of the invention, the light source 4 is coherent. By way of example, it comprises a laser, more particularly a laser emitting radiation with a wavelength equal to about 630 nanometers. It should be noted that the coherent light source 4 is not limited to this preference and any other coherent light source is possible, such as for example a sodium lamp or a maser. It should also be noted that the transverse spreading of each light spot 9 or 10 is proportional to the wavelength of the incident radiation. The objective must make it possible to reach illumination angles with respect to the optical axis greater than 60 °. In fact, such an angular or numerical aperture makes it possible to focus light spots, the axial spread of which, although much greater than the transverse spread, is small enough to obtain, after axial interference on the mirror, an isotropic light spot. A lower angular aperture causes several secondary lobes to appear around the isotropic light spot that are undesirable, except in some specific applications. In a preferred embodiment of the invention, the objective 5 is an immersion objective. The use of an immersion objective makes it possible to eliminate the air gap between the objective and a sample to be illuminated, by replacing it with a liquid (for example synthesis oils whose index is close to that of the glass). In this case, the device according to the invention advantageously makes it possible to reach a numerical aperture greater than 1. In the preferred embodiment of the invention, the device is such that it further comprises: a shaping device 6 of the incident beam, arranged between the coherent light source and the objective and designed to modify the incident beam so as to define, in conjunction with the objective, two focal points 7 and 8 distinct, and a reflection device 11 located midway between the two focal points.

Comme illustré sur la figure 2, le dispositif de mise en forme 6 du faisceau incident est propre à modifier la lumière incidente. La lumière incidente n'est plus un faisceau homogène, mais un faisceau mis en forme pour former des première et seconde tâches lumineuses 9 et 10 sur les premier et second points focaux 7 et 8 respectivement. Le dispositif de mise en forme est plus particulièrement agencé de façon à ce que les première et seconde tâches lumineuses 9 et 10 soient cohérentes entre elles et aient sensiblement la même distribution de champ électrique. Cette dernière caractéristique signifie que les première et seconde tâches lumineuses 9 et 10 ont sensiblement la même intensité, la même polarisation et le même étalement spatial. Ainsi, et comme illustré sur la figure 3, le dispositif de réflexion est propre à former ladite tâche lumineuse isotrope 2 par réflexion par le dispositif de réflexion 11 de la seconde tâche lumineuse sur la première tâche lumineuse. La seconde tâche lumineuse 10 et la première tâche lumineuse 9 ainsi superposés interfèrent entre eux au moins axialement pour former la tâche lumineuse isotrope 2. Ladite tâche lumineuse isotrope est ainsi parfaitement localisée. Il est à noter que, y compris dans le cas où le faisceau incident est émis par une source de lumière incohérente, le dispositif de mise en forme est propre à définir, conjointement avec l'objectif, des tâches lumineuses cohérentes entre elles et sensiblement de même distribution de champ électrique. Des dispositifs de mise en forme 6 de différents types peuvent être envisagés tels que : û un masque à décalage de phase ou PSM (Phase Shift Mask selon la terminologie anglaise), ou û un modulateur spatial de lumière ou SLM (Spatial Light Modulator selon la terminologie anglaise), ou û un miroir déformable, ou encore - un dispositif comprenant au moins deux lentilles et un séparateur de faisceau. Le masque à décalage de phase est un masque comportant des zones qui sont différentes par leur indice de réfraction ou par leur épaisseur et qui sont réparties de manière symétrique sous forme de bandes superposées ou concentriques ou sous forme matricielle. Il module en phase le faisceau incident. Le masque de phase est passif et bon marché. Les lentilles bifocales sont un exemple spécifique de masque à décalage de phase particulièrement bien adaptées à la présente invention. As illustrated in FIG. 2, the shaping device 6 of the incident beam is able to modify the incident light. The incident light is no longer a homogeneous beam, but a beam shaped to form first and second light spots 9 and 10 on the first and second focal points 7 and 8, respectively. The shaping device is more particularly arranged so that the first and second light spots 9 and 10 are coherent with each other and have substantially the same electric field distribution. This last characteristic means that the first and second light spots 9 and 10 have substantially the same intensity, the same polarization and the same spatial spread. Thus, and as illustrated in FIG. 3, the reflection device is able to form said isotropic light spot 2 by reflection by the reflection device 11 of the second light spot on the first light spot. The second light spot 10 and the first superimposed light spot 9 interfere with each other at least axially to form the isotropic light spot 2. Said isotropic light spot is thus perfectly localized. It should be noted that, even in the case where the incident beam is emitted by an incoherent light source, the shaping device is able to define, in conjunction with the objective, light tasks that are coherent with one another and substantially same electric field distribution. Shaping devices 6 of different types may be envisaged, such as: a phase shift mask (PSM), or a spatial light modulator (SLM) (Spatial Light Modulator according to the English terminology), or a deformable mirror, or a device comprising at least two lenses and a beam splitter. The phase shift mask is a mask having areas which are different in refractive index or thickness and which are symmetrically distributed in the form of superimposed or concentric bands or in matrix form. It modulates the incident beam in phase. The phase mask is passive and cheap. Bifocal lenses are a specific example of a phase shift mask particularly well suited to the present invention.

Le modulateur spatial de lumière ou le miroir déformable est propre à modifier l'intensité, la phase et/ou la polarisation du faisceau incident. Il présente l'avantage d'être actif. En effet, il se présente généralement sous la forme d'une matrice par exemple de cristaux liquides ou de micro-miroirs dont l'orientation est commandée par un champ électrique. Il permet de moduler la position de la tâche lumineuse isotrope le long de l'axe optique, en faisant varier la position relative des première et seconde tâches lumineuses 9 et 10 le long de ce même axe. Il permet également de corriger les aberrations optiques éventuelles par la mise en oeuvre d'un algorithme d'optimisation duquel dépend le champ électrique commandant le modulateur spatial de lumière ou le miroir déformable. Le modulateur spatial de lumière ou le miroir déformable est cependant onéreux par rapport à un masque à décalage de phase. The spatial light modulator or the deformable mirror is able to modify the intensity, the phase and / or the polarization of the incident beam. It has the advantage of being active. Indeed, it is generally in the form of a matrix for example of liquid crystals or micro-mirrors whose orientation is controlled by an electric field. It makes it possible to modulate the position of the isotropic light spot along the optical axis, by varying the relative position of the first and second light spots 9 and 10 along this same axis. It also makes it possible to correct the possible optical aberrations by implementing an optimization algorithm on which depends the electric field controlling the spatial light modulator or the deformable mirror. The spatial light modulator or the deformable mirror is however expensive compared to a phase shift mask.

Le dispositif comprenant au moins deux lentilles et un séparateur de faisceau (non représenté) présente l'avantage que le positionnement relatif des lentilles permet de fixer la position des points focaux. Ainsi, un simple déplacement le long de l'axe optique de l'une ou l'autre ou les deux lentilles dudit dispositif permet de déplacer les points focaux, et par conséquent la tâche lumineuse isotrope, le long de l'axe optique. Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif de réflexion 11 est un miroir plan. Il est à noter que le faisceau réfléchi dépend des propriétés de réflexion du dispositif de réflexion. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif de réflexion 11 est un miroir déformable ou un miroir déformé par rapport au miroir plan. L'utilisation d'un miroir déformable permet de corriger les aberrations du dispositif de mise en forme du faisceau incident et de l'objectif du microscope. The device comprising at least two lenses and a beam splitter (not shown) has the advantage that the relative positioning of the lenses makes it possible to fix the position of the focal points. Thus, a simple displacement along the optical axis of one or the other or both lenses of said device makes it possible to move the focal points, and consequently the isotropic light spot, along the optical axis. In the preferred embodiment of the invention, the reflection device 11 is a plane mirror. It should be noted that the reflected beam depends on the reflection properties of the reflection device. In another embodiment of the invention, the reflection device 11 is a deformable mirror or a mirror that is deformed with respect to the plane mirror. The use of a deformable mirror makes it possible to correct the aberrations of the device for shaping the incident beam and the objective of the microscope.

De plus, s'il est connu lesdites aberrations optiques, et par conséquent les corrections à y apporter, l'utilisation d'un miroir déformé par rapport à un miroir plan est non seulement envisageable, mais également préférable pour des raisons de coût, ledit miroir déformé étant propre à corriger les aberrations optiques du dispositif de mise en forme du faisceau incident et de l'objectif du microscope et étant passif donc moins cher que le miroir déformable. Dans un autre mode réalisation de l'invention (non représenté), le dispositif de mise en forme 6 du faisceau incident est conçu pour modifier le faisceau incident de façon à définir, conjointement avec l'objectif, un premier point focal et une pluralité de seconds points focaux, les premier et seconds points focaux étant distincts entre eux, et le dispositif de réflexion 11 est situé entre le premier point focal et lesdits seconds points focaux. Les seconds points focaux sont répartis dans le demi-espace défini an aval du plan transverse à l'axe optique au niveau du premier point focal. En chaque second point focal, la lumière incidente forme une seconde tâche lumineuse. Les première et secondes tâches lumineuses ainsi formées sont cohérentes entre elles et ont sensiblement la même distribution de champ électrique. In addition, if said optical aberrations are known, and consequently the corrections to be made thereto, the use of a mirror that is deformed with respect to a plane mirror is not only conceivable, but also preferable for reasons of cost, said distorted mirror being adapted to correct the optical aberrations of the device for shaping the incident beam and the objective of the microscope and being passive therefore less expensive than the deformable mirror. In another embodiment of the invention (not shown), the incident beam shaping device 6 is designed to modify the incident beam so as to define, in conjunction with the objective, a first focal point and a plurality of second focal points, the first and second focal points being distinct from each other, and the reflection device 11 is located between the first focal point and said second focal points. The second focal points are distributed in the half-space defined downstream of the plane transverse to the optical axis at the first focal point. In each second focal point, the incident light forms a second light spot. The first and second light spots thus formed are coherent with each other and have substantially the same electric field distribution.

Dans ce mode de réalisation, le dispositif de réflexion est un miroir concave ou à multiples facettes avantageusement agencé pour que chaque seconde tâche lumineuse soit réfléchie par le dispositif de réflexion sur le premier point lumineux. Plus particulièrement, en se limitant, à titre d'exemple illustratif, au cas comprenant un miroir multi-facettes, chaque facette du miroir est située à mi-distance entre le premier point focal et un second point focal parmi la pluralité de seconds points focaux, de sorte que chaque seconde tâche lumineuse soit réfléchie sur la première tâche lumineuse par la facette qui lui correspond. Le dispositif selon l'invention forme donc la tâche lumineuse isotrope, par interférences axiales et transverses entre ladite pluralité de secondes tâches lumineuses et la première tâche lumineuse. Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif est tel qu'il comprend un système de balayage opto-mécanique. Le dispositif selon l'invention est ainsi avantageusement agencé pour balayer un échantillon. In this embodiment, the reflection device is a concave or multifaceted mirror advantageously arranged so that each second light task is reflected by the reflection device on the first light point. More particularly, by limiting, as an illustrative example, to the case comprising a multi-faceted mirror, each facet of the mirror is located midway between the first focal point and a second focal point among the plurality of second focal points. , so that each second light task is reflected on the first light task by the corresponding facet. The device according to the invention thus forms the isotropic light spot, by axial and transverse interferences between said plurality of second light tasks and the first light task. In the preferred embodiment of the invention, the device is such that it comprises an opto-mechanical scanning system. The device according to the invention is thus advantageously arranged to scan a sample.

Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, le système de balayage opto-mécanique comprend au moins une platine motorisée de translation dans les trois directions de l'espace et/ou au moins une platine motorisée de rotation. Dans les cas de figure où l'échantillon bouge et la tâche lumineuse isotrope reste fixe dans l'espace, un masque à décalage de phase ou un dispositif comprenant au moins deux lentilles et un séparateur de faisceau suffit pour la mise en forme du faisceau incident. Autrement dit, il n'est pas nécessaire d'utiliser des dispositifs de mise en forme du faisceau incident plus onéreux tels qu'un modulateur spatial de lumière ou un miroir déformable. La platine motorisée de translation est par exemple agencée pour supporter l'échantillon de sorte que le dispositif selon l'invention est avantageusement agencé pour balayer l'échantillon dans sa largeur, sa longueur et son épaisseur. Dans le cas où les deux points focaux 7 et 8 sont séparés d'une distance inférieure à 50 micromètres, il est avantageux de déposer l'échantillon sur le miroir. Dans cet exemple, la platine motorisée de translation est agencée pour supporter le miroir sur lequel est collé l'échantillon à éclairer. Son déplacement permet de balayer l'échantillon dans sa largeur et sa longueur. Le balayage selon la profondeur nécessite un dispositif de mise en forme du faisceau incident actif (miroir déformable, SLM ou un système formé de deux lentilles et un séparateur de faisceau). Dans un autre exemple, une première platine est agencée pour supporter l'objectif et une seconde platine est agencée pour supporter le dispositif de réflexion, ce dernier pouvant être un miroir plan ou un miroir déformable ou déformé par rapport à un miroir plan. Les mouvements de translation des deux platines sont limités à une translation le long de l'axe optique et sont synchronisés. Le dispositif selon l'invention est ainsi avantageusement agencé pour déplacer le point focal le long de l'axe optique, et ainsi balayer l'échantillon dans son épaisseur. L'échantillon peut en outre être monté sur une autre platine motorisée de translation permettant toute translation de l'échantillon dans le plan transverse à l'axe optique au niveau du premier point focal, autrement dit dans le plan transverse. Dans ce dernier cas, un miroir plan est préféré. La platine motorisée de rotation est par exemple agencée pour supporter un miroir plan (non représenté) propre à dévier la source de lumière cohérente. Le dispositif selon l'invention est ainsi avantageusement agencé pour faire varier l'angle d'incidence du faisceau incident, et ainsi balayer l'échantillon dans le plan transverse. Il est alors souhaitable d'utiliser pour la mise en forme du faisceau incident un modulateur spatial de lumière ou un miroir déformable de façon à pouvoir balayer l'échantillon également dans son épaisseur. In the preferred embodiment of the invention, the opto-mechanical scanning system comprises at least one motorized translation stage in the three directions of the space and / or at least one motorized turntable. In the cases where the sample moves and the isotropic light spot remains fixed in space, a phase shift mask or a device comprising at least two lenses and a beam splitter is sufficient for shaping the incident beam. . In other words, it is not necessary to use more expensive incident beam shaping devices such as a spatial light modulator or a deformable mirror. The motorized translation stage is for example arranged to support the sample so that the device according to the invention is advantageously arranged to scan the sample in its width, length and thickness. In the case where the two focal points 7 and 8 are separated by a distance of less than 50 microns, it is advantageous to deposit the sample on the mirror. In this example, the motorized translation stage is arranged to support the mirror on which is glued the sample to be illuminated. Its displacement makes it possible to sweep the sample in its width and its length. Depth scanning requires a device for shaping the active incident beam (deformable mirror, SLM or a system consisting of two lenses and a beam splitter). In another example, a first plate is arranged to support the objective and a second plate is arranged to support the reflection device, the latter may be a plane mirror or a deformable mirror or deformed relative to a plane mirror. The translation movements of the two plates are limited to a translation along the optical axis and are synchronized. The device according to the invention is thus advantageously arranged to move the focal point along the optical axis, and thus scan the sample in its thickness. The sample may also be mounted on another motorized translation stage allowing any translation of the sample in the plane transverse to the optical axis at the first focal point, in other words in the transverse plane. In the latter case, a plane mirror is preferred. The motorized turntable is for example arranged to support a plane mirror (not shown) adapted to deflect the coherent light source. The device according to the invention is thus advantageously arranged to vary the angle of incidence of the incident beam, and thus to scan the sample in the transverse plane. It is then desirable to use for the shaping of the incident beam a spatial light modulator or a deformable mirror so as to be able to scan the sample also in its thickness.

Selon une particularité, le dispositif de focalisation permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope selon l'invention comprend en outre un séparateur de faisceau 12 et un détecteur de lumière 13. Selon un premier exemple représenté sur la figure 1, le séparateur de faisceau 12 est agencé selon un angle de 45° par rapport à l'axe optique et est conçu pour ne pas dévier le faisceau incident et pour dévier, d'un angle de 90° par rapport à l'axe optique, un faisceau réfléchi se propageant dans le sens opposé au sens de propagation du faisceau incident. Selon cet exemple, le détecteur de lumière 13 est agencé selon un angle de 90° par rapport à l'axe optique à la perpendiculaire du séparateur de faisceau pour capter un faisceau collecté. Dans un deuxième exemple représenté sur la figure 4, la source de lumière cohérente est agencée selon un angle de 90° par rapport à l'axe optique à la perpendiculaire du séparateur de faisceau. Le séparateur de faisceau 12 est alors agencé selon un angle de 45° par rapport à l'axe optique et est conçu pour dévier le faisceau incident d'un angle de 90° de façon à ce que celui-ci se propage le long de l'axe optique. Le séparateur de faisceau 12 est agencé en outre pour ne pas dévier le faisceau réfléchi et le détecteur de lumière 13 est agencé le long de l'axe optique pour capter le faisceau collecté. En outre et comme illustré sur la figure 4, il est à noter que, dans ces exemples, le séparateur de faisceau est agencé entre la source de lumière cohérente et le dispositif de mise en forme du faisceau incident. Selon l'invention, le faisceau réfléchi repasse par l'objectif pour traverser à nouveau le dispositif de mise en forme. Le faisceau ainsi collecté rencontre le séparateur de faisceau, pour être dirigé vers et capté par le détecteur de lumière. Le dispositif de mise en forme est ainsi apte à mettre en forme le faisceau réfléchi, et ce d'une manière inversée ou non par rapport à la mise en forme du faisceau incident. A titre d'exemple non limitatif, le modulateur spatial de lumière ou le miroir déformable permet ainsi de corriger les aberrations optiques liées aux éventuelles imperfections du dispositif de réflexion. According to one feature, the focusing device making it possible to obtain an isotropic luminous spot according to the invention further comprises a beam splitter 12 and a light detector 13. According to a first example shown in FIG. 1, the beam splitter 12 is arranged at an angle of 45 ° to the optical axis and is designed not to deflect the incident beam and to deflect, at an angle of 90 ° to the optical axis, a reflected beam propagating through the opposite direction to the direction of propagation of the incident beam. According to this example, the light detector 13 is arranged at an angle of 90 ° to the optical axis perpendicular to the beam splitter to capture a collected beam. In a second example shown in FIG. 4, the coherent light source is arranged at an angle of 90 ° with respect to the optical axis perpendicular to the beam splitter. The beam splitter 12 is then arranged at an angle of 45 ° to the optical axis and is designed to deflect the incident beam by an angle of 90 ° so that it propagates along the beam. optical axis. The beam splitter 12 is further arranged not to deflect the reflected beam and the light detector 13 is arranged along the optical axis to capture the collected beam. Furthermore and as illustrated in FIG. 4, it should be noted that, in these examples, the beam splitter is arranged between the coherent light source and the incident beam shaping device. According to the invention, the reflected beam passes through the lens to cross again the shaping device. The beam thus collected meets the beam splitter, to be directed to and picked up by the light detector. The shaping device is thus able to shape the reflected beam, and this in a manner inverted or not with respect to the shaping of the incident beam. By way of nonlimiting example, the spatial light modulator or the deformable mirror thus makes it possible to correct the optical aberrations related to possible imperfections of the reflection device.

De même, le rôle du dispositif de réflexion peut être joué par un autre modulateur spatial de lumière, pour simuler un miroir parfait ou pour maîtriser les imperfections de ce miroir simulé. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif comprend en outre un sténopé 16 situé à proximité du détecteur de lumière. Le faisceau collecté capté par le détecteur n'est ainsi pas perturbé par la lumière émise par d'autres sources de lumière. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, le détecteur de lumière est un détecteur ponctuel comprenant par exemple un 10 photomultiplicateur ou une photodiode à avalanche. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le détecteur de lumière est un détecteur matriciel comprenant par exemple un ensemble de photomultiplicateurs ou une caméra à capteurs de transfert de charge. Le dispositif selon l'invention permet ainsi de créer des images 15 bidimensionnelles ou stéréoscopiques de l'échantillon observé. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif comprend en outre des moyens de traitement du faisceau collecté, ces moyens de traitement étant placés en amont du détecteur de lumière. Un montage interférométrique peut ainsi être placé, avant la détection pour 20 compenser le retard de phase d'une partie de la lumière émise par l'échantillon induit par la réflexion sur le miroir, en particulier dans le cas où cette fonction ne serait pas remplie par le dispositif de mise en forme du faisceau incident et réfléchi. Comme illustré sur la figure 4, ledit dispositif de focalisation 25 permettant d'obtenir une tâche lumineuse isotrope constitue ainsi un microscope confocal 14. Ainsi, l'homme de métier comprend que le dispositif selon l'invention est tout à fait exploitable ou intégrable dans un microscope confocal, tel que celui représenté sur la figure 1. De plus, le microscope confocal amélioré du dispositif selon l'invention peut être à balayage ou à 30 champ large et utilisé, comme les microscopes confocaux antérieurs, pour étudier des échantillons fluorescents. On notera que le dispositif selon l'invention permet de collecter aussi bien la lumière émise vers l'objectif que celle émise vers le dispositif de réflexion. Cette propriété est particulièrement intéressante lorsque l'échantillon présente des propriétés d'émission (ou de diffusion) fortement anisotropes. Un autre mode d'utilisation de l'invention (4), qui n'est pas exploitable dans le cas du microscope confocal (1) est l'observation d'échantillons absorbants. Dans ce cas, on collecte la lumière renvoyée par le miroir. Cette dernière peut être fortement atténuée si l'on a focalisé sur une région absorbante. Le dispositif selon l'invention peut s'adapter sur la plupart des microscopes existant avec des modifications mineures et, en particulier, sur tous les microscopes modernes à balayage en régime d'optique linéaire ou non-linéaire. Il suffit de déposer l'échantillon à proximité d'un miroir et de mettre en forme le faisceau incident. La mise en forme peut aussi servir à corriger les aberrations optiques du microscope ou diminuer les lobes secondaires de la fonction d'illumination (avec des filtres adaptés). De manière générale, le dispositif selon l'invention permet d'obtenir exactement la même résolution qu'un microscope « 4Pi » et toutes les améliorations mises en avant avec le 4pi microscope peuvent être obtenues avec le dispositif selon l'invention avec moins de difficultés techniques. En outre, elle requiert un montage et un réglage beaucoup plus simple et nécessite un seul objectif. Le dispositif selon l'invention apporte une réponse nouvelle au problème majeur de la faible résolution selon l'axe optique des microscopes en ne nécessitant que des modifications externes au microscope (support de l'échantillon et source de lumière). Il concerne ainsi tous les domaines où le microscope à balayage est utilisé pour faire des images tridimensionnelles. Similarly, the role of the reflection device can be played by another spatial light modulator, to simulate a perfect mirror or to control the imperfections of this simulated mirror. In a preferred embodiment of the invention, the device further comprises a pinhole 16 located near the light detector. The collected beam picked up by the detector is thus not disturbed by the light emitted by other light sources. In a first embodiment of the invention, the light detector is a point detector comprising for example a photomultiplier or an avalanche photodiode. In another embodiment of the invention, the light detector is a matrix detector comprising for example a set of photomultipliers or a camera with charge transfer sensors. The device according to the invention thus makes it possible to create two-dimensional or stereoscopic images of the sample observed. In another embodiment of the invention, the device further comprises means for processing the collected beam, these processing means being placed upstream of the light detector. An interferometric assembly can thus be placed, before the detection, to compensate for the phase delay of part of the light emitted by the sample induced by the reflection on the mirror, in particular in the case where this function is not fulfilled. by the device for shaping the incident and reflected beam. As illustrated in FIG. 4, said focusing device 25 making it possible to obtain an isotropic luminous spot thus constitutes a confocal microscope 14. Thus, the person skilled in the art understands that the device according to the invention is quite exploitable or integrable into a confocal microscope, such as that shown in FIG. 1. In addition, the improved confocal microscope of the device according to the invention can be scanning or wide-field and used, like prior confocal microscopes, to study fluorescent samples. It will be noted that the device according to the invention makes it possible to collect both the light emitted towards the objective and that emitted towards the reflection device. This property is particularly interesting when the sample has highly anisotropic emission (or diffusion) properties. Another mode of use of the invention (4), which is not exploitable in the case of the confocal microscope (1) is the observation of absorbent samples. In this case, the light reflected by the mirror is collected. The latter can be strongly attenuated if one has focused on an absorbing region. The device according to the invention can be adapted to most existing microscopes with minor modifications and, in particular, to all modern scanning microscopes in linear or nonlinear optical mode. Just drop the sample near a mirror and shape the incident beam. The shaping can also be used to correct the optical aberrations of the microscope or to reduce the secondary lobes of the illumination function (with suitable filters). In general, the device according to the invention makes it possible to obtain exactly the same resolution as a "4Pi" microscope and all the improvements put forward with the microscope can be obtained with the device according to the invention with less difficulty. techniques. In addition, it requires a much simpler mounting and adjustment and requires a single lens. The device according to the invention provides a new answer to the major problem of low resolution along the optical axis of the microscopes by requiring only external modifications to the microscope (sample support and light source). It thus concerns all areas where the scanning microscope is used to make three-dimensional images.

Les applications de cette invention se situent entre autres dans les domaines de la biologie et des nanotechnologies grâce à l'amélioration notable des performances des microscopes optiques. The applications of this invention are among others in the fields of biology and nanotechnology through the significant improvement in the performance of optical microscopes.

Claims

REVENDICATIONS1. Focusing device (1) for obtaining an isotropic light spot (2) comprising, at least, aligned along an optical axis (3): a light source (4) for generating an incident beam propagating according to the optical axis, and a lens (5) converging, the device being characterized in that it further comprises: a device for shaping (6) the incident beam, arranged between the coherent light source and the lens and adapted to modify the incident beam so as to define, together with the lens, a first focal point (7) and at least a second focal point (8) which are distinct from each other and in which the incident light respectively forms a first task a light spot (9) and at least one second light spot (10), said light spots being coherent with each other and having substantially the same electric field distribution, and a reflection device (11) located at a distance between the first piece of light focal point and said at least one second focal point, the reflection device being adapted to form said isotropic light task (2) by reflection of said at least one second light spot on the first light spot.

2. Device according to claim 1, characterized in that the objective (5) is adapted to achieve an illumination angle with respect to the optical axis greater than 60 °.

3. Device according to claim 1 or 2, characterized in that the objective (5) is an immersion objective.

4. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the shaping device (6) of the incident beam is a phase shift mask.

5. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the device for shaping (6) the incident beam is a spatial light modulator or a deformable mirror adapted to change the intensity, phase and / or the polarization of the incident beam.

6. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the device for shaping (6) the incident beam is a device comprising at least two lenses and a beam splitter.

7. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the reflection device (11) is a plane mirror.

8. Device according to one of claims 1 to 6, characterized in that the reflection device (11) is a deformable mirror or deformed relative to a plane mirror.

9. Device according to one of the preceding claims, characterized in that it comprises an opto-mechanical scanning system.

10. Device according to claim 9, characterized in that the opto-mechanical scanning system comprises at least one motorized translational stage in the three directions of space.

11. Device according to claim 9 or claim 10, characterized in that the scanning system comprises at least one motorized turntable.

12. Device according to one of the preceding claims, characterized in that it further comprises: a beam splitter (12) arranged between the coherent light source and the device for shaping the incident beam, and light detector (13) arranged to pick up a collected beam propagating in the direction opposite to the direction of propagation of the incident beam, said focusing device making it possible to obtain an isotropic light spot thus constituting a confocal microscope (14).

13. Device according to claim 12, characterized in that the light detector is a point or matrix detector.

14. Device according to claim 12 or claim 13, characterized in that the device further comprises means for treating the collected beam, these processing means being placed upstream of the light detector.