FR2952648A1 - In vitro poration of cells contained in substrate comprises contacting substrate with nanotubes and macromolecules of medicament including nucleic acids in cells and applying electromagnetic field - Google Patents
In vitro poration of cells contained in substrate comprises contacting substrate with nanotubes and macromolecules of medicament including nucleic acids in cells and applying electromagnetic field Download PDFInfo
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Abstract
Description
Procédé de poration de cellules comprises dans un substrat comportant l'utilisation de nanotubes comme récepteur hyperfréquences L'invention se situe dans le domaine des technologies nanométriques et hyperfréquence appliquées à la biologie et à la médecine et notamment à la diffusion de médicaments au travers de membranes cellulaires. Il est rappelé de manière générale que l'administration de ~o médicaments peut être effectuée par différentes méthodes. On distingue l'administration systémique (par voie générale) et l'application topique (locale). Les formes d'administration systémiques agissent sur tout l'organisme, les formes d'application topiques seulement à l'endroit où le médicament est appliqué, notamment sur la peau. 15 Les formes d'administration systémiques : les médicaments peuvent être absorbés par la bouche. Au niveau du tractus gastro-intestinal, les substances actives pénètrent dans le sang, qui les transporte vers l'organe où elles doivent agir. Dans le cas de l'administration rectale, les substances actives diffusées par les suppositoires sont absorbées par la muqueuse du 20 rectum. Il existe aussi une administration parentérale, c'est-à-dire par une voie autre que l'appareil digestif. Il s'agit habituellement d'une injection. On peut injecter une substance par voie intraveineuse (dans les veines), intramusculaire (dans le muscle) ou sous-cutanée (sous la peau). Lorsqu'une 25 solution est administrée par voie intraveineuse pendant un temps prolongé, on parle de perfusion. Les formes galéniques, telles que les aérosols, les vapeurs ou les gaz, sont employées en inhalation. Le système transdermique est une sorte de timbre - ou «patch» - contenant une certaine quantité de substance active qui diffuse dans l'organisme de façon continue. 30 Les formes d'administration topiques : dans le cas d'une application cutanée, le médicament - une pommade, par exemple - est appliqué sur la peau. Actuellement, les procédés physiques de transfert de gènes (et/ou de médicaments) permettent la pénétration directe, dans les cellules, de 35 molécules non perméables, tant petites que grandes, qui autrement ne peuvent diffuser à travers la membrane plasmatique ou être activement transportées à travers la membrane plasmatique. Il existe de nombreux procédés de transfert de gènes ou de médicaments in vivo, par exemple la biolistique, l'injection-jet, l'injection hydrodynamique, les ultrasons, le champ magnétique et l'électroperméabilisation (Villemejane, J. et Mir, L. Physical methods of nucleic acid transfer: general concept and applications, British Journal of Pharmacology 157, 207-219, 2009). L'électroperméabilisation (ou électroporation) est une technique utilisée pour introduire des macromolécules (transfection cellulaire), notamment de l'ADN, de l'ARN, des gènes et des protéines, et des médicaments en général, dans des cellules (Neumann, E. et al.,.Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes, Bioelectrochem. Bioenerg. 48, 3û16, 1999) par application de champs électriques, généralement pulsés, ayant une intensité et une durée suffisantes pour induire une augmentation temporaire de la perméabilité de la membrane cellulaire. Les potentiels transmembranaires élevés induits de cette manière provoquent la formation de très petits pores (de 20-120 nm de diamètre). Les macromolécules introduites à travers la membrane cellulaire passent à travers les pores, par électrophorèse dans le cas des molécules chargées (Neumann, E. et al., Calcium-mediated DNA adsorption to yeast cells and kinetics of cet/ transformation by electroporation, Biophys. J. 71, 868û877,1996), et par diffusion passive dans le cas des molécules neutres (Neumann, E. et al. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells, Biophys. J. 74, 98û108, 1998). Actuellement, pour une électroporation in vivo, le champ électrique pulsé est transmis par des électrodes-aiguilles implantées dans le tissu à traiter, ou par des électrodes plates appliquées en contact superficiel avec le tissu. Des électrodes et des réseaux d'électrodes, pour libérer des impulsions électriques dans le but de parvenir à des effets thérapeutiques, sont décrits par exemple dans la demande de brevet WO 98/47 562. Alors que le procédé basé sur l'utilisation d'électrodes-aiguilles est invasif, celui qui basé sur l'utilisation d'électrodes plates ne l'est pas, et est donc en principe préférable. Cependant, il est limité uniquement à une application en surface sur de petites zones. Ceci est corrélé avec les données scientifiques disponibles concernant l'intensité des champs électriques et la durée nécessaires pour une électroporation efficace des cellules, comme décrit dans "Guidelines for the limitation of the exposure to electric and magnetic fields that vary in time and to electromagnetic fields (up to 300 GHz)" de la Commission Internationale sur la Radioprotection non ionisante (ICNIRP). Ainsi, si les valeurs seuils recommandées par ces instructions sont observées, la profondeur de traitement (c'est-à-dire la distance entre les électrodes-plates, ou à partir de l'électrode-plate) n'est que de quelques millimètres, ce qui signifie que le procédé n'est efficace in vivo 1 o que dans les zones proches de la surface corporelle (par exemple l'épiderme et le derme). D'autres procédés d'électroporation sont bien établis, qui font usage de "médiateurs", y compris et en particulier les nanotubes de carbone (NTC). Les nanotubes de carbone sont des structures tubulaires très minces 15 formées par un ou plusieurs feuillets de graphite enroulés sur eux-mêmes. Les nanotubes de carbone, produits par une décharge d'arc entre deux électrodes de graphite, ont été découverts et décrits pour la première fois par Sumio lijima ("Helical Microtubules of Graphitic Carbon", Nature, Vol. 354, Nov. 7, 1991, pages 56 58). En général, les nanotubes de carbone sont 20 classés en deux catégories : les nanotubes monofeuillets, ou SWNT, composés d'une structure tubulaire formée d'un feuillet de graphite enroulé sur lui-même et fermé aux deux extrémités par deux calottes hémisphériques, et qui se distinguent des nanotubes multifeuillets ou MWNT, qui peuvent être considérés comme formés de plusieurs nanotubes SWNT 25 concentriques. L'utilisation des NTC en tant que médiateurs d'électroporation a déjà été proposée pour réduire les tensions exigées pour une électroporation irréversible, dans le but de développer un microlaboratoire (lab-on-a-chip) portatif à faible consommation d'énergie (Yantzi J. D. et al., Carbon 30 Nanotube Enhanced Pulsed Electric Field Electroporation for Biomedical Applications, Proceedings of the IEEE International Conference on Mechatronics & Automation Niagara Falls, Canada, 2005), ou de provoquer la perméabilisation réversible de cellules bactériennes par exposition à des micro-ondes des cellules mises en contact avec les NTC (Rojas-Chapana 35 J.A. et al., Enhanced Introduction of Gold Nanoparticles into Vital Acidothiobacillus ferrooxidans by Carbon Nanotube-based Microwave Electroporation, Nano Letters, vol. 4, no. 5, pages 985-988, 2004), ou pour une électroporation réversible par exploitation des propriétés diélectriques des NTC (PCT/IB 2007/05 47 54, 22 novembre 2007). Process for poration of cells comprised in a substrate comprising the use of nanotubes as a microwave receiver The invention lies in the field of nanoscale and microwave technologies applied to biology and medicine, and in particular to the diffusion of drugs through membranes. cell. It is recalled in general that the administration of ~ o drugs can be performed by different methods. Systemic (systemic) administration and topical (local) application are distinguished. Systemic forms of administration act on the whole organism, topical forms of application only where the drug is applied, especially on the skin. Systemic Forms of Administration: Drugs can be absorbed through the mouth. At the level of the gastrointestinal tract, the active substances enter the blood, which transports them to the organ where they must act. In the case of rectal administration, the active substances diffused by the suppositories are absorbed by the mucous membrane of the rectum. There is also parenteral administration, that is to say by a route other than the digestive tract. It is usually an injection. A substance can be injected intravenously (into the veins), intramuscularly (into the muscle) or subcutaneously (under the skin). When a solution is administered intravenously for a prolonged period, it is referred to as an infusion. Galenic forms, such as aerosols, vapors or gases, are used by inhalation. The transdermal system is a kind of patch - or "patch" - containing a certain amount of active substance that diffuses into the body continuously. Topical administration forms: In the case of a cutaneous application, the drug - an ointment, for example - is applied to the skin. Currently, physical methods of gene transfer (and / or drugs) allow the direct entry into cells of 35 non-permeable molecules, both large and small, that otherwise can not diffuse across the plasma membrane or be actively transported. through the plasma membrane. There are many methods of gene transfer or in vivo drugs, for example biolistics, jet injection, hydrodynamic injection, ultrasound, magnetic field and electropermeabilization (Villemejane, J. and Mir, L British Journal of Pharmacology 157, 207-219, 2009). Electropermeabilization (or electroporation) is a technique used to introduce macromolecules (cell transfection), including DNA, RNA, genes and proteins, and drugs in general, into cells (Neumann, E et al., Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes, Bioelectrochem Bioenerg., 48, 3016, 1999) by application of electric fields, generally pulsed, having an intensity and duration sufficient to induce a temporary increase in the permeability of the cell membrane. The high transmembrane potentials induced in this way cause the formation of very small pores (20-120 nm in diameter). Macromolecules introduced through the cell membrane pass through the pores by electrophoresis in the case of charged molecules (Neumann, E. et al., Calcium-mediated DNA adsorption to yeast cells and kinetics of this / transformation by electroporation, Biophys. J. 71, 868, 877, 1996), and by passive diffusion in the case of neutral molecules (Neumann, E. et al Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells, Biophys J. 74, 98108, 1998). Currently, for in vivo electroporation, the pulsed electric field is transmitted by needle electrodes implanted in the tissue to be treated, or by flat electrodes applied in surface contact with the tissue. Electrodes and electrode arrays, for releasing electrical pulses for the purpose of achieving therapeutic effects, are described for example in patent application WO 98/47 562. While the method based on the use of Needle electrodes are invasive, the one based on the use of flat electrodes is not, and so is in principle preferable. However, it is limited only to surface application on small areas. This is correlated with available scientific data regarding the intensity of electric fields and the time required for efficient electroporation of cells, as described in "Guidelines for the limitation of electromagnetic fields and electromagnetic fields". (up to 300 GHz) "of the International Commission on Non-ionizing Radiation Protection (ICNIRP). Thus, if the threshold values recommended by these instructions are observed, the processing depth (that is to say the distance between the flat electrodes, or from the flat electrode) is only a few millimeters which means that the method is effective in vivo only in areas close to the body surface (for example the epidermis and the dermis). Other electroporation methods are well established, which make use of "mediators", including and in particular carbon nanotubes (CNTs). Carbon nanotubes are very thin tubular structures formed by one or more layers of graphite wound on themselves. The carbon nanotubes produced by an arc discharge between two graphite electrodes have been discovered and described for the first time by Sumio lijima ("Helical Microtubules of Graphitic Carbon", Nature, Vol 354, Nov. 7, 1991). , pages 56-58). In general, carbon nanotubes are classified into two categories: single-walled nanotubes, or SWNTs, composed of a tubular structure formed of a sheet of graphite wound on itself and closed at both ends by two hemispherical caps, and which differ from the multi-wall or MWNT nanotubes, which can be considered as consisting of several concentric SWNT nanotubes. The use of NTCs as electroporation mediators has already been proposed to reduce the voltage requirements for irreversible electroporation, with the aim of developing a low-power portable lab-on-a-chip ( Yantzi JD et al., Carbon Nanotube Enhanced Pulsed Electric Field Electroporation for Biomedical Applications, Proceedings of the IEEE International Conference on Mechatronics & Automation Niagara Falls, Canada, 2005), or to cause reversible permeabilization of bacterial cells by exposure to microparticles. Cells Contacted with NTCs (Rojas-Chapana, JA et al., Enhanced Introduction of Gold Nanoparticles into Vital Acidothiobacillus ferrooxidans by Carbon Nanotube-based Microwave Electroporation, Nano Letters, 4, 5, 985 -988, 2004), or for reversible electroporation by exploiting the dielectric properties of CNTs (PCT / IB 2007/05 47 54, November 22, 2004). 2007).
II convient aussi de mentionner les brevets décrivant un dispositif qui exploite la propriété des SWCNT à dégager de la chaleur dans un champ radio fréquence (RF) dans le but de produire une ablation thermique de cellules malignes (brevets US n° US 2006/01 90 063 Al, US 2005/02 51 12 33 Al, et US 2005/02 51 234 Al et demande internationale WO 2007/02 76 14). Dans ce contexte, la présente invention propose un nouveau procédé de perméabilisation cellulaire, qui se fonde sur l'application d'un champ électromagnétique au voisinage de nano-antennes constituées par des nanotubes, et ce afin de réaliser une électroporation d'une membrane cellulaire. Cette action a pour but de permettre notamment l'introduction dans l'organisme de nanotubes enrobés d'une substance contenant un ou plusieurs type de macro-molécules, il peut s'agir par exemple d'agent thérapeutique, puis d'activer ces nanotubes à l'aide d'un champ électromagnétique localisé permettant la pénétration dans la cellule puis la libération desdits agents afin de générer un traitement localisé. Ainsi ce type de procédé ouvre des possibilités en terme de lutte contre des maladies telles que le cancer en limitant le traitement à la zone contaminée. It is also worth mentioning the patents describing a device that exploits the property of SWCNTs to release heat in a radio frequency (RF) field for the purpose of producing thermal ablation of malignant cells (US Patent No. US 2006/01 90 063 Al, US 2005/02 51 12 33 A1, and US 2005/02 51 234 A1 and international application WO 2007/02 76 14). In this context, the present invention proposes a new cell permeabilization method, which is based on the application of an electromagnetic field in the vicinity of nano-antennas constituted by nanotubes, in order to perform electroporation of a cell membrane. . This action is intended to allow in particular the introduction into the body of nanotubes coated with a substance containing one or more types of macromolecules, it may be for example therapeutic agent, then to activate these nanotubes using a localized electromagnetic field allowing penetration into the cell and the release of said agents to generate a localized treatment. Thus this type of process opens up possibilities in terms of the fight against diseases such as cancer by limiting the treatment to the contaminated zone.
Ce procédé permet notamment de transférer un gène et/ou un médicament à l'intérieur du cytoplasme des cellules cibles. Le procédé s'applique à des applications tant in vitro qu'in vivo et permet une poration réversible des cellules sans dégradation des cellules impliquées par le traitement. This method makes it possible in particular to transfer a gene and / or a drug into the cytoplasm of the target cells. The method is applicable to both in vitro and in vivo applications and allows reversible poration of cells without degradation of the cells involved in the treatment.
Plus précisément la présente invention a pour objet un procédé de poration de cellules contenues dans un substrat, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence du substrat, avec des nanotubes assurant une fonction de récepteur hyperfréquences et avec des macro-molécules pouvant être de type médicament y compris les acides nucléiques et transférables dans des cellules; l'application d'un champ électromagnétique permettant de générer une excitation électromagnétique absorbée par lesdits nanotubes générant la poration desdites cellules par circulation d'électrons au sein desdits nanotubes. Selon une variante de l'invention, le champ électromagnétique émet dans la bande de fréquence des Gigahertz. Selon une variante de l'invention, le champ électromagnétique est ~o appliqué en continu. Selon une variante de l'invention, le champ électromagnétique est appliqué de manière pulsée. Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont utilisés en solution à une concentration comprise entre environ 0,5 tag/ml et 500 pg/mI. 15 Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont mis en contact direct avec le substrat par mélange direct. Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont mis en contact avec le substrat par administration systémique. Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont mis en 20 contact avec le substrat par injection parenthéale pouvant être par intraveineuse. Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont enrobés par un liant contenant des macro-molécules transférables dans des cellules. Selon une variante de l'invention, le procédé comprend une 25 opération de fonctionnalisation des nanotubes avec un agent tensio-actif. More specifically, the subject of the present invention is a process for poration of cells contained in a substrate, characterized in that it comprises: the placing in the presence of the substrate, with nanotubes providing a microwave receiver function and with macromolecules may be of the drug type including nucleic acids and transferable into cells; the application of an electromagnetic field for generating an electromagnetic excitation absorbed by said nanotubes generating the poration of said cells by circulating electrons within said nanotubes. According to a variant of the invention, the electromagnetic field emits in the Gigahertz frequency band. According to one variant of the invention, the electromagnetic field is applied continuously. According to a variant of the invention, the electromagnetic field is applied in a pulsed manner. According to one variant of the invention, the nanotubes are used in solution at a concentration of between approximately 0.5 and 500 μg / ml. According to a variant of the invention, the nanotubes are brought into direct contact with the substrate by direct mixing. According to one variant of the invention, the nanotubes are brought into contact with the substrate by systemic administration. According to one variant of the invention, the nanotubes are brought into contact with the substrate by parenteral injection, which can be intravenous. According to one variant of the invention, the nanotubes are coated with a binder containing transferable macromolecules in cells. According to a variant of the invention, the process comprises an operation of functionalization of the nanotubes with a surfactant.
L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre donnée à titre non limitatif et grâce aux figures annexées parmi lesquelles : la figure 1 illustre les structures de nanotubes ; les figures 2a et 2b illustrent la structure de NTC fonctionnalisés utilisés dans l'invention et leur comportement en tant que nano-antennes; les figures 3a et 3b illustrent I"efficacité du transfert de gènes dans des cellules bactériennes exposées à un champ 30 35 électromagnétique pour différentes puissances et différentes augmentations de température du substrat (durée d'exposition 30 secondes), b) efficacité du transfert de gènes dans des cellules bactériennes exposées à un CEM à une puissance de 5 W (durées d'exposition 30 secondes et 5 secondes); les figures 4a à 4c illustrent l'augmentation de température linéaire (R2 = 0,9992) en fonction de la puissance (a) qui est due à l'échauffement de l'eau (b) et est indépendante de la concentration des nano-antennes (c). The invention will be better understood and other advantages will become apparent on reading the following description, which is given in a nonlimiting manner and by virtue of the appended figures in which: FIG. 1 illustrates the structures of nanotubes; Figures 2a and 2b illustrate the functionalized NTC structure used in the invention and their behavior as nano-antennas; FIGS. 3a and 3b illustrate the efficiency of gene transfer into bacterial cells exposed to an electromagnetic field for different powers and different substrate temperature increases (exposure time 30 seconds), b) gene transfer efficiency in bacterial cells exposed to 5W EMC (exposure times 30 seconds and 5 seconds), Figures 4a to 4c illustrate linear temperature increase (R2 = 0.9992) as a function of power (a) which is due to the heating of the water (b) and is independent of the concentration of the nano-antennas (c).
De manière générale, les définitions ci-après sont utilisées dans la description qui suit : Un substrat : tout matériau contenant des cellules vivantes, en particulier une partie d'un être vivant (végétal, humain ou animal), ou un substrat séparé de l'être vivant et contenu dans un récipient (par exemple une culture de cellules animales, végétales ou fongiques). Un champ électromagnétique EM champ physique produit par des objets électriquement chargés. Il est caractérisé par son amplitude, sa 20 fréquence (Hz) et sa puissance (W). Un médicament : toute molécule devant être transférée dans des cellules, y compris les acides nucléiques. In general, the following definitions are used in the following description: A substrate: any material containing living cells, in particular a part of a living being (plant, human or animal), or a substrate separated from the be alive and contained in a container (for example a culture of animal, plant or fungal cells). An electromagnetic field EM physical field produced by electrically charged objects. It is characterized by its amplitude, frequency (Hz) and power (W). A drug: any molecule to be transferred into cells, including nucleic acids.
Le fonctionnement hyperfréquence sur lequel se base la présente 25 invention est décrit ci-après : Premier principe utilisé : l'antenne filaire Le principe d'une antenne filaire consiste à faire résonner une onde électromagnetique dans un conducteur métallique linéaire soumis à un champ EM à une fréquence donnée. De même que pour les principes de 30 résonance acoustique, la résonance d'une onde EM est soumise aux dimensions de l'élément métallique servant de support à l'onde EM. La longueur d'onde associée doit être de dimension adaptée à la longueur de l'élément métallique. La conséquence directe est que si l'on place une barre métallique de longueur égale à ou T,/2 (À. la longueur d'onde définie par  f , c la vitesse de propagation de l'onde et f la fréquence de cette onde) alors on obtient une résonance EM dans le conducteur métallique. La conséquence de cette résonance dans le conducteur métallique linéaire est l'apparition d'un courant alternatif dans ce conducteur. Cette énergie est en partie dissipée par effet Joule (en fonction de la résistivité du conducteur) et en partie ré-émise dans le milieu. The microwave operation on which the present invention is based is described below: First principle used: the wired antenna The principle of a wired antenna consists of resonating an electromagnetic wave in a linear metallic conductor subjected to an EM field. a given frequency. As with the principles of acoustic resonance, the resonance of an EM wave is subject to the dimensions of the metallic element supporting the EM wave. The associated wavelength must be of dimension adapted to the length of the metallic element. The direct consequence is that if one places a metal bar of length equal to or T, / 2 (at the wavelength defined by f f, c the speed of propagation of the wave and f the frequency of this wave. wave) then an EM resonance is obtained in the metallic conductor. The consequence of this resonance in the linear metallic conductor is the appearance of an alternating current in this conductor. This energy is partially dissipated by the Joule effect (depending on the resistivity of the conductor) and partially re-emitted into the medium.
Second principe utilisé : les Nanotubes de Carbone (NTC) ~o Les CNT sont des éléments de taille nanométrique (typiquement leur diamètre, la longueur d'un NTC pouvant atteindre quelque centimètres.) constitués d'atome de carbone. Ces derniers sont organisés comme une feuille de graphène (a) enroulé sur elle même afin de former un tube mono-couche (b) (SWNT) mais 15 peut aussi se retrouver en éléments concentrique (c) (MWNT) comme illustré en figure 1. Les propriétés électromagnétiques de ces NTC sont très différentes de celles d'un fil métallique de taille macroscopique. Du fait de leur structure, la vitesse de propagation d'une onde est beaucoup plus faible (de l'ordre de 20 1/50 à 1/1 oo) mais leur résistance beaucoup importante. Tout cela est principalement dû à leur taille d'échelle atomique. Ils restent malgré tout bien plus intéressants que des nanofils de métal dont la conductivité à ces dimensions peut être considérée comme quasi nulle. Suivant les principes d'électroporation exposés plus haut, un des 25 buts de la présente invention est de permettre l'introduction des NTC sélectivement dans une zone de l'organisme sur laquelle on souhaite travailler puis d'exposer cette zone à des micro-ondes afin de générer l'électroporation des membranes cellulaire dans cette zone. Selon une variante de l'invention, les NTC peuvent avantageusement 3o être des intermédiaires enrobés d'une substance servant à fixer les molécules que l'on souhaite faire passer dans les cellules. Les figures 2a et 2b illustrent à cet effet, des nanotubes fonctionnalisés et se comportant comme des nano-antennes. Les NTC sont ainsi utilisés comme nano-antennes réceptrices qui sous l'influence d'un champ EM vont à la fois créer l'électroporation nécessaire pour permettre le passage de macro-molécule à travers la membrane cellulaire et la libération de cesdites macro-molécules de la couche qui enrobe les NTC pour les besoins du transport de ces macro-molécules. Second principle used: Carbon Nanotubes (CNTs) ~ o CNTs are elements of nanometric size (typically their diameter, the length of a CNT up to a few centimeters.) Consisting of a carbon atom. The latter are organized as a graphene sheet (a) wound on itself to form a single-layer tube (b) (SWNT) but can also be found in concentric elements (c) (MWNT) as illustrated in FIG. The electromagnetic properties of these CNTs are very different from those of a macroscopically sized wire. Due to their structure, the speed of propagation of a wave is much lower (of the order of 1/50 to 1/1 oo) but their resistance is very important. All this is mainly due to their atomic scale size. They are still much more interesting than metal nanowires whose conductivity to these dimensions can be considered almost zero. According to the principles of electroporation explained above, one of the aims of the present invention is to allow the introduction of CNTs selectively in an area of the organism on which it is desired to work and then to expose this zone to microwaves. to generate electroporation of cell membranes in this area. According to one variant of the invention, the CNTs may advantageously be intermediates coated with a substance for fixing the molecules that it is desired to pass through the cells. Figures 2a and 2b illustrate for this purpose nanotubes functionalized and behaving as nano-antennas. CNTs are thus used as receiving nano-antennas which under the influence of an EM field will both create the electroporation necessary to allow the passage of macro-molecules through the cell membrane and the release of said macromolecules of the layer that coats the CNTs for the purpose of transporting these macromolecules.
Suivant des principes démontrés par expériences, les NTC agissent comme récepteurs hyperfréquence ayant une longueur appropriée à la longueur d'onde utilisée pour les exciter (ou bien les harmoniques). Ils réceptionnent ainsi l'énergie de cette onde hyperfréquence qui génère dans chacun d'eux une circulation d'électrons. Les nanotubes présentant un facteur d'absorption relativement élevé en dessous de 100 GHz, la très grande partie de cette énergie reçue est ainsi dissipée en générant l'électroporation d'une part et en chaleur d'autre part, libérant la couche d'enrobage et les macro-molécules qu'elle contient. Selon l'invention, la fonction des médiateurs de poration cellulaire, remplie par la NTC, est réalisée par exploitation de leurs propriétés d'antenne. Cela se produit quand les NTC sont placés près des cellules-cibles. Par exposition du substrat au champ électromagnétique, les nanotubes induisent le phénomène de perméabilisation de la membrane cellulaire, en permettant l'administration intracellulaire de molécules thérapeutiques. Dans la production à grande échelle de NTC, le produit natif (tel que préparé) existe sous forme d'agglomérats ayant une taille allant jusqu'à cent micromètres. Ces NTC vierges sont entièrement hydrophobes et ne peuvent donc être utilisés à des fins biologiques. According to principles demonstrated by experiments, CNTs act as microwave receivers having a length appropriate to the wavelength used to excite them (or the harmonics). They thus receive the energy of this microwave wave which generates in each of them a circulation of electrons. Since nanotubes have a relatively high absorption factor below 100 GHz, most of this received energy is dissipated by generating electroporation on the one hand and heat on the other hand, releasing the coating layer. and the macro-molecules it contains. According to the invention, the function of the cellular pore mediators, filled by the CNT, is achieved by exploiting their antenna properties. This happens when the CNTs are placed near the target cells. By exposing the substrate to the electromagnetic field, the nanotubes induce the phenomenon of permeabilization of the cell membrane, allowing the intracellular administration of therapeutic molecules. In large scale production of CNTs, the native product (as prepared) exists as agglomerates up to a hundred microns in size. These virgin NTCs are entirely hydrophobic and can not be used for biological purposes.
Pour toute application biomédicale, il est donc essentiel que les NTC soient traités, de façon à leur permettre de subir une dispersion dans l'eau. La solution/dispersion de NTC utilisée dans le procédé décrit par la présente invention est réalisée par des modes opératoires bien établis dans le domaine, par exemple ceux qui sont décrits dans T. Saito et al., Chemical treatment and modification of multi-walled carbon nanotubes, Physica B 323:280-283, 2002. Le but du traitement est de produire une solution cytocompatible de nanotubes revêtus/enveloppés de polymères, de tensioactifs, etc. Le mécanisme d'enveloppement peut être ionique, non ionique, 35 covalent, etc. Ces nanotubes fonctionnalisés (NTC-f) sont utilisés à des concentrations variant de 0,1 à 500 pg/mI. Les concentrations préférées sont comprises dans la plage de 1 à 10 pg/ml. For any biomedical application, it is therefore essential that the CNTs are treated, so that they can be dispersed in water. The solution / dispersion of CNTs used in the process described by the present invention is carried out by procedures well established in the art, for example those described in T. Saito et al., Chemical treatment and modification of multi-walled carbon. nanotubes, Physica B 323: 280-283, 2002. The purpose of the treatment is to produce a cytocompatible solution of nanotubes coated / wrapped in polymers, surfactants, etc. The wrapping mechanism can be ionic, nonionic, covalent, etc. These functionalized nanotubes (CNT-f) are used at concentrations ranging from 0.1 to 500 μg / ml. Preferred concentrations are in the range of 1 to 10 μg / ml.
Exemple de réalisation de fonctionnalisation de nanotubes Selon un exemple de l'invention, les nanotubes de carbone de type MWNT pour « multi-wall nanotube » sont fabriqués de manière connue selon un procédé classique de croissance par dépôt chimique en phase vapeur encore couramment dénommé « CCVD » pour « catalytic chemical vapor deposition » ou « CVD » pour « chemical vapor deposition » en utilisant des sources d'hydrocarbones déposées sur un substrat d'oxyde de type AI2O3 imprégné de catalyseur métallique à base de fer comme décrit dans l'article de Kouravelou KB, Sotirchos SV, Verykios XE. Catalytic effects of production of carbon nanotubes in a thermogravimetric CVD reactor. Surf Coat Technol 2007;201:9226û31. Exemplary embodiment of functionalization of nanotubes According to one example of the invention, MWNT type carbon nanotubes for "multi-wall nanotube" are manufactured in a known manner according to a conventional method of growth by chemical vapor deposition still commonly referred to as " CCVD "for" catalytic chemical vapor deposition "or" CVD "for" chemical vapor deposition "using hydrocarbon sources deposited on a type Al 2 O 3 oxide substrate impregnated with iron-based metal catalyst as described in the article from Kuravelou KB, Sotirchos SV, Verykios XE. Catalytic effects of carbon nanotube production in a thermogravimetric CVD reactor. Surf Coat Technol 2007; 201: 9226.
On effectue l'enrobage des nanotubes de carbone de la façon suivante dans un second temps, en réalisant une fonctionnalisation des nanotubes avec un agent tensio-actif de type Pluronic F127 correspondant à un copolymère bloc de polyoxyethyleneûpolyoxypropylene block commercialisé par la société Sigma, St. Louis, MO. The coating of the carbon nanotubes is carried out in the following manner in a second step, by performing a functionalization of the nanotubes with a Pluronic F127 surfactant corresponding to a polyoxyethylene / polyoxypropylene block block copolymer marketed by the company Sigma, St. Louis, MO
Plus précisément, les nanotubes sont dispersés dans une solution de tensio-actif soluble dans l'eau, de poids moléculaire égal à 12 600. Typiquement 5 mg de nanotubes sont mélangés avec 10 ml de solution comportant du Plutonic F127, dans une solution tamponnée de phosphate. Le mélange est disposé sur une plaque chauffée à 70°C sous une agitation magnétique durant 4 heures, puis passé aux ultrasons avec un appareil à ultrasons de type Branson 2510 (commercialisé par la société Brasonoc, CT, USA) à 20 W pendant 12 heures. Le mélange est finalement centrifugé. Les nanotubes ainsi traités conservent leurs propriétés électroniques initiales comme décrit dans l'article de Zhang J, Zou H, Qing Q, Yang Y, Li Q, Liu Z, et al. Effect of chemical oxidation on the structure of single-walled carbon nanotubes. J Phys Chem B 2003;107:3712. II est à noter que le Pluronic en faible concentration comme dans le présent cas, ne présente pas de problème particulier de toxicité comme décrit dans l'article de Monteiro-Riviere NA, Inman AO, Wang YY, Nemanich RJ. Surfactant effects on carbon nanotube interactions with human keratinocytes. Nanomed: Nanotechnol Biol Med 2005;1:293-9. Les nanotubes MWNT ainsi obtenus sont traités avec de l'acide nitrique pour obtenir des nanotubes de type COOH-MWNT. More specifically, the nanotubes are dispersed in a solution of water-soluble surfactant, with a molecular weight of 12,600. Typically 5 mg of nanotubes are mixed with 10 ml of solution comprising Plutonic F127, in a buffered solution of phosphate. The mixture is placed on a hot plate heated at 70 ° C. for 4 hours and then sonicated with a Branson 2510 ultrasonic apparatus (sold by Brasonoc, CT, USA) at 20 W for 12 hours. . The mixture is finally centrifuged. The nanotubes thus treated retain their initial electronic properties as described in the article by Zhang J, Zou H, Qing Q, Yang Y, Li Q, Liu Z, et al. Effect of chemical oxidation on the structure of single-walled carbon nanotubes. J Phys Chem B 2003; 107: 3712. It should be noted that Pluronic in low concentration, as in the present case, does not present any particular problem of toxicity as described in the article by Monteiro-Riviere NA, Inman AO, Wang YY and Nemanich RJ. Surfactant effects on carbon nanotube interactions with human keratinocytes. Nanomed: Nanotechnol Biol Med 2005; 1: 293-9. The MWNT nanotubes thus obtained are treated with nitric acid to obtain nanotubes of the COOH-MWNT type.
Les nanotubes sont passés aux ultrasons pendant 10 minutes dans de l'acide HNO3 à raison de 65 %. La solution est agitée à 220°C pendant 20 minutes, refroidie à température, filtrée puis finalement séchée à température ambiante durant quelques heures. 100 pg de COOH-MWNT sont dispersés dans 20m1 d'un mélange anhydride de dimethylformamide (DMFA) / anhydride de dichlorométhane (DCM) dans le ratio 1 : 2 et refroidi. A cette solution, 2ml d'hydroxybenzotriazole (HOBt) dans le DMFA (125 pg/ml, 37 eqv) sont ajoutés et le mélange est agité 10 minutes. 1ml of 1-Ethyl-3-(3-d imethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDAC) dans du DMFA (100 pg/l ml, 10egv) sont ajoutés lentement pour réagir puis être agités durant 30 minutes à une température de 0°C, puis durant 3heures à température ambiante. Ainsi des nanotubes actifs sont obtenus par filtration à travers une 20 membrane de Nylon 66 (avec des pores de 0.45pm de diamètre). La solution recueillie est lavée dans 200m1 de DCM anhydride et remise en excès dans du EDAC et du HOBt. Les nanotubes sont alors dispersés dans 10 ml de DCM anhydride et ajoutés doucement à une solution de PEI (MW = 25000gmol"1, 1.0g) dans 25 40m1 de DCM anhydre à une température de 0°C. La réaction est obtenue sous agitation durant 30 minutes à 0°C puis, une nuit à température ambiante. Les nanotubes résultants sont filtrés à travers une membrane de Nylon 66 puis lavée dans 30 ml de DCM anhydride, 50 ml d'éthanol, 100 ml 30 d'eau et 20 ml de EtOH. Après séchage sous vide, on obtient 88,5 mg de nanotubes fonctionnalisés. La solution de NTC préalablement obtenue, peut être mise en contact avec les cellules et le substrat, de différentes manières en fonction 35 de l'administration, par exemple par simple mélange, administration systémique ou injection intraveineuse, intramusculaire ou directe dans les tissus lésés. The nanotubes are sonicated for 10 minutes in 65% HNO3 acid. The solution is stirred at 220 ° C for 20 minutes, cooled to temperature, filtered and finally dried at room temperature for a few hours. 100 μg of COOH-MWNT are dispersed in 20 ml of a mixture of dimethylformamide anhydride (DMFA) / dichloromethane anhydride (DCM) in the ratio 1: 2 and cooled. To this solution, 2 ml of hydroxybenzotriazole (HOBt) in DMFA (125 μg / ml, 37 eqv) is added and the mixture is stirred for 10 minutes. 1 ml of 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDAC) in DMFA (100 μg / l ml, 10 μg) are added slowly to react and then stirred for 30 minutes at a temperature of 0 ° C. then for 3 hours at room temperature. Thus, active nanotubes are obtained by filtration through a nylon 66 membrane (with pores 0.45 μm in diameter). The collected solution is washed in 200 ml of anhydrous DCM and redissolved in EDAC and HOBt. The nanotubes are then dispersed in 10 ml of anhydrous DCM and added slowly to a solution of PEI (MW = 25,000 gmol -1, 1.0 g) in 40 ml of anhydrous DCM at a temperature of 0 ° C. The reaction is obtained with stirring during 30 minutes at 0 ° C. and then overnight at room temperature The resulting nanotubes are filtered through a nylon 66 membrane and then washed in 30 ml of anhydrous DCM, 50 ml of ethanol, 100 ml of water and 20 ml. After drying under vacuum, 88.5 mg of functionalized nanotubes are obtained.The previously obtained CNT solution can be contacted with the cells and the substrate in various ways depending on the administration, for example by simple mixing, systemic administration or intravenous, intramuscular or direct injection into the injured tissues.
Exemple de réalisation du procédé de l'invention : Les résultats d'essais expérimentaux effectués sur des cellules bactériennes de E.coli sont décrits ci-dessous et illustrés sur les figures 3a-3b et 4a-4c. Dans le protocole orthodoxe existant de transfection bactérienne, les cellules bactériennes viables sont placées sur de la glace avec de l'ADN, ~o puis soumises brièvement à un choc thermique (par exemple 42°C pendant 30 secondes), ce qui amène l'ADN à pénétrer dans la cellule. Dans les expériences décrites, des cellules bactériennes sont incubées sur de la glace pendant 30 minutes avec une solution préparée par mélange de 2 pg d'ADN plasmidique à 0,25 pg de nanotubes fonctionnalosés NTC-f (complexe NTC- 15 f:ADNp). Cette solution est ensuite exposée à une énergie électromagnétique (longueur d'onde environ 3 cm, gamme de puissances 0,1-5 Watt, fréquence 10 GHz et durée d'exposition 5-60 secondes à la température ambiante). Dans ces expériences, le squelette plasmidique contient un 20 promoteur bactérien exprimant la résistance à la kanamycine dans E. coll. Ainsi, les plasmides utilisés dans ces expériences de transfection contiennent un gène conférant une résistance à l'antibiotique kanamycine. Après la transfection effectuée par cette nouvelle technique, on identifie les cellules bactériennes qui ont acquis l'ADNp, en plaquant une boîte de Petri 25 pré-traitée avec 30 pg/ml de kanamycine, car seules les bactéries transfectées avec le gène de la résistance à la kanamycine sont à même de croître en présence de cet antibiotique, alors que les cellules bactériennes non transfectées ne subissent aucune croissance. Tous les essais sont effectués dans un tube Eppendorf avec un 30 volume d'échantillon de 50 pl. La température pendant l'exposition au rayonnement de champ électromagnétique est suivie à l'aide d'un thermocouple type k (sensibilité 0,1°C). En l'absence d'application du champ électromagnétique, le nombre de colonies croissant dans les boîtes de Petri est d'environ 50 (essai témoin). 35 On applique ainsi différentes puissances pendant 30 secondes, tout en surveillant l'augmentation correspondante de température et le nombre de colonies ayant subi une croissance. Comme on le voit sur la figure 3a, l'efficacité optimale de transfection de cellules bactériennes de E. Coli est réalisée avec 1 W. L'augmentation de la transfection des bactéries est, en présence de la nano-antenne (NTC-f:ADN) beaucoup plus grande qu'en présence de l'ADN seul (ou du f:ADNp, données non représentées). L'efficacité observée de la transsection diminue avec une augmentation ou une diminution de la puissance au-delà ou en dessous de 1,0 W. A 0,1 W (augmentation de température : 2,5°C), le nombre de colonies est de 50 (analogue au témoin) et de 100, pour des cellules respectivement en contact avec l'ADN et le NTC-f:ADN. A 0,5 W (augmentation de température : 4,5°C), le nombre de colonies est de 100 et de 400, pour les cellules respectivement en contact avec l'ADN et le NTC- f:ADN. A 1 W (augmentation de température : 7°C), le nombre de colonies est de 350 et de 800 pour les cellules respectivement en contact avec l'ADN et le NTC-f:ADN. A 5 W (augmentation de température: 35°C), toutes les cellules sont tuées à cause de l'effet d'échauffement. Les données expérimentales montrent que les résultats réalisés à 1 W pendant 30 secondes sont très analogues à ceux obtenus à 5 W pendant 5 secondes (figure 3b), ce qui révèle que l'efficacité de la transfection dépend de l'énergie libérée, plutôt que de la puissance appliquée. On observe aussi que l'augmentation de la température est linéaire (R2 = 0,9992) en fonction de la puissance. Cette augmentation résulte de l'échauffement de l'eau et est indépendante de la concentration des nanotubes comme illustré en figures 4a-4c. Toutes les données expérimentales sont en accord avec la théorie selon laquelle les nanotubes fonctionnent comme une antenne réceptrice, capable d'induire une augmentation locale de la perméabilisation de la membrane cellulaire. La poration cellulaire de la présente invention convient aux applications tant in vitro qu'in vivo, et les moyens permettant de transposer le procédé dans la pratique vont varier en fonction de l'objectif prévu pour la poration cellulaire. Exemplary embodiment of the method of the invention: The results of experimental tests carried out on E. coli bacterial cells are described below and illustrated in FIGS. 3a-3b and 4a-4c. In the existing orthodox bacterial transfection protocol, viable bacterial cells are placed on ice with DNA, then briefly heat-shocked (eg 42 ° C for 30 seconds), resulting in DNA to enter the cell. In the described experiments, bacterial cells are incubated on ice for 30 minutes with a solution prepared by mixing 2 μg of plasmid DNA with 0.25 μg of NTC-f functionalised nanotubes (NTC-f: pDNA complex). . This solution is then exposed to electromagnetic energy (wavelength about 3 cm, power range 0.1-5 Watt, frequency 10 GHz and exposure time 5-60 seconds at room temperature). In these experiments, the plasmid backbone contains a bacterial promoter expressing kanamycin resistance in E. coli. Thus, the plasmids used in these transfection experiments contain a gene conferring resistance to the antibiotic kanamycin. After the transfection performed by this new technique, the bacterial cells that acquired the pDNA were identified by plating a pretreated Petri dish with 30 μg / ml kanamycin because only the bacteria transfected with the resistance gene kanamycin are able to grow in the presence of this antibiotic, while untransfected bacterial cells do not grow. All tests are carried out in an Eppendorf tube with a sample volume of 50 μl. The temperature during exposure to electromagnetic field radiation is monitored using a thermocouple type k (sensitivity 0.1 ° C). In the absence of application of the electromagnetic field, the number of colonies growing in the Petri dishes is about 50 (control test). Different powers are thus applied for 30 seconds, while monitoring the corresponding increase in temperature and the number of colonies grown. As seen in FIG. 3a, the optimal efficiency of transfection of E. coli bacterial cells is carried out with 1 W. The increase of the transfection of the bacteria is, in the presence of the nano-antenna (NTC-f: DNA) much larger than in the presence of DNA alone (or of f: pDNA, data not shown). The observed efficiency of transsection decreases with increasing or decreasing power above or below 1.0 W. At 0.1 W (temperature increase: 2.5 ° C), the number of colonies is 50 (analogous to the control) and 100, for cells respectively in contact with the DNA and the NTC-f: DNA. At 0.5 W (temperature increase: 4.5 ° C), the number of colonies is 100 and 400, for cells respectively in contact with DNA and NTC-f: DNA. At 1 W (temperature increase: 7 ° C), the number of colonies is 350 and 800 for the cells respectively in contact with the DNA and the NTC-f: DNA. At 5 W (temperature increase: 35 ° C) all cells are killed due to the heating effect. The experimental data show that the results made at 1 W for 30 seconds are very similar to those obtained at 5 W for 5 seconds (Figure 3b), which reveals that the efficiency of the transfection depends on the energy released, rather than the applied power. It is also observed that the increase in temperature is linear (R2 = 0.9992) as a function of the power. This increase results from the heating of the water and is independent of the concentration of the nanotubes as illustrated in FIGS. 4a-4c. All experimental data are in agreement with the theory that nanotubes function as a receiving antenna, capable of inducing a local increase in permeabilization of the cell membrane. The cell poration of the present invention is suitable for both in vitro and in vivo applications, and the means for transposing the method into practice will vary depending on the intended purpose of cell poration.
Par exemple, s'il s'agit d'une culture de cellules fixées dans une boîte de culture de cellules, on peut l'exposer au rayonnement émis par une source appropriée. Dans le cas de petits animaux (par exemple le rat ou la souris), la partie de l'animal (par exemple la tête, un membre, etc.) peut être placée dans le trou foré dans un tube métallique directement raccordé au générateur d'ondes. Si la poration cellulaire doit impliquer des parties plus importantes des animaux, ou une partie du corps humain, une chambre métallique appropriée pourrait être développée. Le procédé de poration cellulaire selon la présente invention peut être utilisé pour (i) la recherche et les investigations et (ii) des applications thérapeutiques cliniques, par exemple l'administration ciblée de médicaments, y compris l'électrochimiothérapie des tumeurs, et la thérapie génique pour toute une gamme de troubles cliniques. Grâce à ce procédé, on peut introduire dans des cellules/des tissus cibles, en utilisant aussi, si nécessaire, une nanoparticule fonctionnalisée par des substances ou des molécules du type décrit ci-dessus, des molécules bioactives en général, des acides nucléiques et un matériel génétique, des protéines, des substances ayant des propriétés pharmacologiques et des agents chimiothérapeutiques, des neurorégénérateurs, etc. For example, if it is a culture of cells fixed in a cell culture dish, it can be exposed to radiation emitted by an appropriate source. In the case of small animals (eg rat or mouse), the part of the animal (eg head, limb, etc.) can be placed in the drilled hole in a metal tube directly connected to the generator. wave. If cell poration is to involve larger parts of animals, or part of the human body, a suitable metal chamber could be developed. The cell poration method of the present invention can be used for (i) research and investigations and (ii) clinical therapeutic applications, for example, targeted drug delivery, including tumor electrochemotherapy, and therapy. gene for a range of clinical disorders. With this method, it is possible to introduce into target cells / tissues, using also, if necessary, a nanoparticle functionalized with substances or molecules of the type described above, bioactive molecules in general, nucleic acids and a genetic material, proteins, substances with pharmacological properties and chemotherapeutic agents, neuroregenerators, etc.
Un avantage important du procédé de poration cellulaire selon la présente invention réside dans le fait que l'utilisation des nanotubes, en tant que traitement localisé, permet une poration ciblée et sélective, seulement des cellules traitées par des NTC, ce qui évite une perméabilisation involontaire ou indésirable des tissus environnants, perméabilisation qui se produit avec les procédés d'électroporation existants. Le procédé décrit par la présente invention peut aussi être appliqué à la mise en oeuvre d'une lyse cellulaire par une poration (ou une ablation) irréversible des cellules, par une augmentation de la puissance appliquée (par exemple pour le traitement du cancer).30 An important advantage of the cellular poration method according to the present invention lies in the fact that the use of nanotubes, as a localized treatment, allows targeted and selective poration, only cells treated with CNTs, which avoids an involuntary permeabilization or unwanted surrounding tissue, permeabilization that occurs with existing electroporation methods. The method described by the present invention can also be applied to the implementation of cell lysis by irreversible poration (or ablation) of the cells, by an increase in the power applied (for example for the treatment of cancer). 30
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