FR2948666A1 - METHOD OF DIAGNOSING CANCER AND DETERMINING SEVERITY OF CANCER IN AN INDIVIDUAL - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une méthode in vitro de diagnostic d'un cancer et/ou de détermination de la sévérité d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité du cancer de l'individu.The present invention relates to an in vitro method for diagnosing cancer and / or determining the severity of a cancer in an individual, comprising the following steps: - measuring the concentration of endothelial protein C receptor (EPCR) in a biological sample of the individual; - compare the measured concentration with one or more threshold values; - determine, from the comparison made in the previous step, whether the individual suffers from cancer and / or the severity of the cancer of the individual.
Description
Méthode de diagnostic d'un cancer et de détermination de la sévérité d'un cancer chez un individu Domaine de l'invention La présente invention concerne des méthodes et des outils utiles pour diagnostiquer un cancer et pour déterminer sa sévérité chez un individu. FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to methods and tools useful for diagnosing cancer and determining its severity in an individual.
Arrière-plan technique Dans la lutte contre le cancer, le diagnostic précoce des cancers est un enjeu de taille dans la mesure où l'on estime en général que les chances de guérison d'un cancer sont d'autant plus importantes que celui-ci est pris en charge précocement. Ceci a conduit à la mise en place de programmes de dépistage systématique, comme pour le cancer du sein par exemple. Toutefois, la mise en oeuvre de tels programmes se heurte souvent à la difficulté technique ou au coût élevé du test de diagnostic à réaliser en routine. Dans ce cadre, il est particulièrement intéressant de disposer de marqueurs sérologiques des cancers. Ainsi, il est possible de citer le diagnostic du cancer de la prostate à l'aide de la PSA (Prostate Specific Antigen), dont la concentration sanguine augmente avec la taille de la prostate et est donc indicatrice d'un possible cancer de la prostate (voir par exemple Shariat et al. (2008) Gan. J. Urol. 15:4363-74). Toutefois, de tels marqueurs sont rares à l'heure actuelle et de nombreux cancers ne peuvent bénéficier de ce type d'approche. Le récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) est un régulateur de la coagulation sanguine dont la caractérisation et le clonage du gène sont notamment décrits dans les brevets US 5,695,993 et 5,852,171. EPCR est essentiellement exprimé par dans la membrane des cellules endothéliales à la surface des gros vaisseaux sanguins. Il se lie à la protéine C, ce qui favorise le passage de celle-ci à une forme anti-coagulante active. Ce récepteur peut également exister sous une forme soluble (sEPCR), décrite dans les brevets US 5,804,392 et 6,037,450, à laquelle il manque la partie transmembranaire et la queue cytoplasmique par rapport à la forme membranaire d'EPCR. Cette forme soluble conserve la propriété de se lier à la protéine C, notamment sous sa forme activée, ce qui l'empêche de jouer son rôle anti-coagulant. Il a été montré que la concentration sanguine de sEPCR est indicatrice du niveau d'activité de la thrombine (WO 02/066981) et que lorsque la concentration sanguine de sEPCR est élevée chez un individu, celui-ci présente un risque de thrombose veineuse accru. A ce titre, certains individus porteurs d'un haplotype particulier du gène EPCR, nommé haplotype A3, défini par les quatre nucléotides spécifiques 1651G, 3610T, 4216A et 6936G, présentent une concentration plus élevée que la normale en sEPCR. En particuliers, la présence du G en position 6936 du gène d'EPCR conduit à une substitution de la Sérine en position 219 par une Glycine, ce qui se traduit par un clivage accru de la forme membranaire d'EPCR. Les individus porteurs de l'haplotype A3 sont surreprésentés chez les patients thrombotiques. sEPCR a donc été suggéré comme un marqueur potentiel du risque thrombotique (Saposnik et al. (2004) Blood 103:1311-1318). Il a toutefois été également rapporté une absence d'association forte entre une concentration élevée en sEPCR et un risque accru de thrombose veineuse profonde et qu'une concentration faible en sEPCR semblait réduire le risque de thrombose veineuse profonde (Uitte de Willige et al. (2004) Thromb. Haemost. 2004 2:1305- 1310). Par ailleurs, une autre forme soluble d'EPCR (parfois nommée tEPCR) issue d'un épissage alternatif de l'ARNm d'EPCR qui modifie la partie C-terminale de sEPCR a également été mise en évidence récemment (Saposnik et al. (2008) Blood 111:3442-3451). Elle pourrait également avoir une implication, mais de manière moindre que sEPCR, dans l'augmentation du risque thrombotique. BACKGROUND In the fight against cancer, the early diagnosis of cancer is a major challenge insofar as it is generally considered that the chances of a cancer being cured are all the greater as this one is taken care of early. This has led to the introduction of systematic screening programs, such as for breast cancer for example. However, the implementation of such programs often comes up against the technical difficulty or the high cost of the diagnostic test to be performed routinely. In this context, it is particularly interesting to have serological markers of cancers. Thus, it is possible to mention the diagnosis of prostate cancer using PSA (Prostate Specific Antigen), whose blood concentration increases with the size of the prostate and is therefore indicative of a possible prostate cancer (see, for example, Shariat et al., (2008) Gan J. Urol 15: 4363-74). However, such markers are rare at present and many cancers can not benefit from this type of approach. The endothelial protein C receptor (EPCR) is a regulator of blood coagulation, the characterization and cloning of the gene of which are described in US Pat. Nos. 5,695,993 and 5,852,171. EPCR is essentially expressed by in the membrane of endothelial cells on the surface of large blood vessels. It binds to protein C, which promotes the passage of this protein to an active anticoagulant form. This receptor may also exist in a soluble form (sEPCR), described in US Pat. Nos. 5,804,392 and 6,037,450, which lacks the transmembrane portion and the cytoplasmic tail with respect to the membrane form of EPCR. This soluble form retains the property of binding to protein C, especially in its activated form, which prevents it from playing its anticoagulant role. It has been shown that the blood concentration of sEPCR is indicative of the level of thrombin activity (WO 02/066981) and that when the blood concentration of sEPCR is high in an individual, there is a risk of increased venous thrombosis. . As such, some individuals carrying a particular haplotype of the EPCR gene, named haplotype A3, defined by the four specific nucleotides 1651G, 3610T, 4216A and 6936G, have a higher concentration than normal in sEPCR. In particular, the presence of G at position 6936 of the EPCR gene leads to a substitution of Serine at position 219 by a glycine, which results in an increased cleavage of the membrane form of EPCR. Individuals carrying the A3 haplotype are overrepresented in thrombotic patients. sEPCR has therefore been suggested as a potential marker for thrombotic risk (Saposnik et al (2004) Blood 103: 1311-1318). However, it has also been reported that there is no strong association between a high concentration of sEPCR and an increased risk of deep vein thrombosis and that a low concentration of sEPCR appears to reduce the risk of deep vein thrombosis (Uitte de Willige et al. 2004) Thromb Haemost, 2004 2: 1305-1310). Moreover, another soluble form of EPCR (sometimes called tEPCR) resulting from an alternative splicing of EPCR mRNA that modifies the C-terminal part of sEPCR has also been recently demonstrated (Saposnik et al. 2008) Blood 111: 3442-3451). It could also have an implication, but to a lesser extent than sEPCR, in the increase of the thrombotic risk.
Description de l'invention La présente invention découle, notamment, de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que la concentration plasmatique de la forme soluble du récepteur endothélial de la protéine C (sEPCR), ou du d-dimère, était significativement plus élevée que la normale chez les individus atteints d'un cancer de l'ovaire, du sein ou d'une leucémie, et que cette concentration était corrélée à la masse tumorale, c'est-à-dire à la sévérité du cancer, et à la présence de thromboses. Ainsi, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, de diagnostic d'un cancer et/ou de détermination de la sévérité d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité du cancer de l'individu. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode de l'invention, on détermine que l'individu n'est pas porteur de l'haplotype A3 du gène EPCR ou qu'il n'est pas atteint d'une vasculite. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode telle que définie ci-dessus comprend les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - mesurer la concentration d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation, tel que les D-dimères ou la fibrine soluble, dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer les concentrations mesurées avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité d'un cancer de l'individu. Par ailleurs, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, de diagnostic d'un cancer et/ou de détermination de la sévérité d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration en D-dimères dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité du cancer de l'individu. La présente invention concerne également l'utilisation d'EPCR tel que défini ci-dessus, et éventuellement d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation tel que défini ci-dessus, comme marqueur pour le diagnostic in vitro d'un cancer et/ou pour la détermination in vitro de la sévérité d'un cancer chez un individu. La présente invention concerne également un kit de diagnostic in vitro d'un cancer, de détermination in vitro de la présence de métastases d'un cancer, ou de détermination du risque de thrombose chez un individu atteint d'un cancer, comprenant : - au moins un moyen de mesure de la concentration d'EPCR tel que défini ci-dessus dans un échantillon biologique, et - au moins un moyen de mesure de la concentration d'un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation tel que défini ci-dessus, dans un échantillon biologique. Ainsi, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, de détermination du risque thrombotique chez un individu atteint d'un cancer, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu présente un risque de thrombose. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode telle que définie ci-dessus de détermination du risque thrombotique comprend les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - mesurer la concentration d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation, tel que les D-dimères ou la fibrine soluble, dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer les concentrations mesurées avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu présente un risque de thrombose. Par ailleurs, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, de détermination du risque thrombotique chez un individu atteint d'un cancer, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration en D-dimères dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité du cancer de l'individu. La présente invention concerne également l'utilisation d'EPCR tel que défini ci-dessus, et éventuellement d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation tel que défini ci-dessus, comme marqueur de risque thrombotique chez un individu atteint d'un cancer. Description of the Invention The present invention results, in particular, from the unexpected finding, by the inventors, that the plasma concentration of the soluble endothelial receptor form of protein C (sEPCR), or d-dimer, was significantly higher than normal in individuals with ovarian cancer, breast cancer or leukemia, and this concentration correlated with the tumor mass, ie the severity of the cancer, and the presence of thromboses. Thus, the present invention relates to a method, especially in vitro, for diagnosing a cancer and / or determining the severity of a cancer in an individual, comprising the following steps: measuring the concentration of the endothelial receptor of the protein C (EPCR) in a biological sample of the individual; - compare the measured concentration with one or more threshold values; - determine, from the comparison made in the previous step, whether the individual suffers from cancer and / or the severity of the cancer of the individual. In a particular embodiment of the method of the invention, it is determined that the individual does not carry the A3 haplotype of the EPCR gene or that he does not have vasculitis. In another particular embodiment of the invention, the method as defined above comprises the following steps: measuring the concentration of the endothelial protein C receptor (EPCR) in a biological sample of the individual; measuring the concentration of at least one additional fibrinolysis or coagulation marker, such as D-dimer or soluble fibrin, in a biological sample of the individual; - compare the measured concentrations with one or more threshold values; determine, from the comparison made in the previous step, whether the individual suffers from a cancer and / or the severity of a cancer of the individual. Furthermore, the present invention relates to a method, especially in vitro, for diagnosing cancer and / or determining the severity of a cancer in an individual, comprising the following steps: measuring the concentration of D-dimer in a biological sample of the individual; - compare the measured concentration with one or more threshold values; - determine, from the comparison made in the previous step, whether the individual suffers from cancer and / or the severity of the cancer of the individual. The present invention also relates to the use of EPCR as defined above, and optionally at least one additional fibrinolysis or coagulation marker as defined above, as a marker for the in vitro diagnosis of cancer. and / or for in vitro determination of the severity of a cancer in an individual. The present invention also relates to an in vitro diagnostic kit for cancer, in vitro determination of the presence of cancer metastases, or determination of the risk of thrombosis in an individual suffering from cancer, comprising: less a means for measuring the concentration of EPCR as defined above in a biological sample, and - at least one means for measuring the concentration of an additional fibrinolysis or coagulation marker as defined above, in a biological sample. Thus, the present invention relates to a method, especially in vitro, for determining the thrombotic risk in an individual suffering from a cancer, comprising the following steps: measuring the concentration of the endothelial protein C receptor (EPCR) in a biological sample of the individual; - compare the measured concentration with one or more threshold values; - determine, from the comparison made in the previous step, whether the individual presents a risk of thrombosis. In another particular embodiment of the invention, the method as defined above for determining the thrombotic risk comprises the following steps: measuring the concentration of the endothelial protein C receptor (EPCR) in a biological sample of the individual; measuring the concentration of at least one additional fibrinolysis or coagulation marker, such as D-dimer or soluble fibrin, in a biological sample of the individual; - compare the measured concentrations with one or more threshold values; - determine, from the comparison made in the previous step, whether the individual presents a risk of thrombosis. Furthermore, the present invention relates to a method, especially in vitro, for determining the thrombotic risk in an individual suffering from a cancer, comprising the following steps: measuring the concentration of D-dimer in a biological sample of the individual; - compare the measured concentration with one or more threshold values; - determine, from the comparison made in the previous step, whether the individual suffers from cancer and / or the severity of the cancer of the individual. The present invention also relates to the use of EPCR as defined above, and optionally at least one additional fibrinolysis or coagulation marker as defined above, as a thrombotic risk marker in an individual suffering from cancer.
Par ailleurs, les inventeurs ont également identifié de nouveaux peptides dérivés d'EPCR utiles pour produire de nouveaux anticorps anti-EPCR permettant notamment de détecter les formes membranaires et solubles d'EPCR. Ainsi, la présente invention concerne également un peptide comprenant ou constitué d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO : 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO : 4), et TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5) et un anticorps anti-EPCR spécifiquement dirigé contre un peptide constitué d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO : 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO : 4), et TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5). En outre, les inventeurs ont pu montrer que l'anticorps spécifiquement dirigé contre le peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5) présentait des propriétés d'inhibition de l'invasion d'une matrice extracellulaire artificielle par des cellules tumorales. En conséquence, la présente invention concerne également un ligand spécifique du peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), en particulier l'anticorps spécifiquement dirigé contre le peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), ou un fragment de celui-ci, pour son utilisation à titre de médicament, notamment pour le traitement des cancers. En d'autres termes, l'invention concerne également une méthode pour le traitement du cancer chez un individu qui consiste à administrer à l'individu une quantité thérapeutiquement efficace d'un ligand spécifique du peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5), en particulier de l'anticorps spécifiquement dirigé contre le peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), ou d'un fragment de celui-ci. La présente invention concerne également le peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) pour son utilisation à titre de médicament, notamment pour le traitement, en particulier par vaccination, des cancers. En d'autres termes, l'invention concerne également une méthode pour le traitement du cancer chez individu qui consiste à administrer à l'individu une quantité thérapeutiquement efficace du peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), ou d'un fragment de celui-ci. In addition, the inventors have also identified novel EPCR-derived peptides useful for producing new anti-EPCR antibodies that make it possible in particular to detect the membrane and soluble forms of EPCR. Thus, the present invention also relates to a peptide comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO: 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO: 4), and TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) and an anti-EPCR antibody specifically directed against a peptide consisting of a sequence selected from the group consisting of GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO: 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO: 4), and TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5). In addition, the inventors have been able to show that the antibody specifically directed against the sequence peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) exhibited properties of inhibition of the invasion of an artificial extracellular matrix by tumor cells. Accordingly, the present invention also relates to a specific ligand of the sequence peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5), in particular the antibody specifically directed against the sequence peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5), or a fragment thereof. for its use as a medicine, especially for the treatment of cancers. In other words, the invention also relates to a method for treating cancer in an individual which comprises administering to the individual a therapeutically effective amount of a ligand specific for the sequence peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) , in particular the antibody specifically directed against the sequence peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5), or a fragment thereof. The present invention also relates to the sequence peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) for its use as a medicament, in particular for the treatment, in particular by vaccination, of cancers. In other words, the invention also relates to a method for the treatment of cancer in an individual which comprises administering to the individual a therapeutically effective amount of the sequence peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5), or a fragment of it.
Les inventeurs ont également isolé de nouvelles séquences nucléotidiques codant pour EPCR dans des cellules tumorales. Ainsi, la présente invention concerne également les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO : 6, 7, 8. The inventors have also isolated novel nucleotide sequences encoding EPCR in tumor cells. Thus, the present invention also relates to the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 6, 7, 8.
Comme on l'entend ici, l'expression sévérité d'un cancer se rapporte préférentiellement à la masse tumorale totale dudit cancer. Cette masse tumorale totale comprend notamment, dans le cas de tumeurs solides, la ou les tumeur(s) principale(s) ainsi que les éventuelles métastases, et dans le cas des tumeurs non-solides, l'ensemble des cellules cancéreuses ou tumorales. As used herein, the term cancer severity refers preferentially to the total tumor mass of said cancer. This total tumor mass includes, in the case of solid tumors, the main tumor (s) and any metastases, and in the case of non-solid tumors, all cancer cells or tumors.
Les cancers selon l'invention, qu'il s'agisse des cancers pour lesquels on souhaite établir un diagnostic ou en déterminer la sévérité, ou des cancers caractérisant un individu atteint d'un cancer tel que défini ci-dessus, peuvent désigner tout type de néoplasme, on préfère toutefois, qu'il s'agisse d'un adénocarcinome, d'une hémopathie maligne, d'un sarcome ou d'un cancer carcinoïde. Par ailleurs, on préfère tout particulièrement que le cancer soit sélectionné dans le groupe constitué d'une leucémie, d'un cancer du sein, d'un cancer de l'ovaire, d'un cancer du poumon, d'un cancer de la prostate, d'un cancer de la thyroïde, d'un cancer du pancréas, d'un cancer du rein, d'un cancer du foie, et d'un cancer de l'oesophage. The cancers according to the invention, whether they are cancers for which it is desired to establish a diagnosis or to determine the severity thereof, or cancers characterizing an individual suffering from a cancer as defined above, may designate any type of cancer. However, it is preferred that the neoplasm be an adenocarcinoma, a hematological malignancy, a sarcoma or a carcinoid cancer. Furthermore, it is particularly preferred that the cancer be selected from the group consisting of leukemia, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, cancer of the lungs, prostate cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, liver cancer, and cancer of the esophagus.
Comme on l'entend ici, les expressions risque de thrombose et risque thrombotique sont synonymes et désignent notamment un risque accru de présenter une thrombose par rapport à un individu présentant un cancer de même type mais ayant une concentration d'EPCR en deçà de la ou des valeurs seuils. En particulier, la méthode de détermination du risque de thrombose telle que définie ci- dessus est une méthode de détermination du risque de survenue du syndrome de Trousseau chez un individu atteint d'un cancer. Le syndrome de Trousseau est bien connu de l'homme du métier et est en général associé à une thrombose veineuse et/ou à une hypercoagulation chez les patients atteints d'un cancer, notamment d'un adénocarcinome des poumons ou du pancréas. As used herein, the terms risk of thrombosis and thrombotic risk are synonymous and include an increased risk of thrombosis compared to an individual with a cancer of the same type but having a concentration of EPCR below the threshold values. In particular, the method for determining the risk of thrombosis as defined above is a method for determining the risk of occurrence of Trousseau syndrome in an individual suffering from cancer. Trousseau's syndrome is well known to those skilled in the art and is generally associated with venous thrombosis and / or hypercoagulation in patients with cancer, especially an adenocarcinoma of the lungs or pancreas.
Le récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) ainsi que la façon de mesurer sa concentration, ou de le doser, sont bien connus de l'homme du métier. De préférence, on mesure la concentration d'une forme soluble d'EPCR (sEPCR). Les formes soluble d'EPCR sont bien connues de l'homme du métier et sont préférentiellement celles obtenues par clivage de la forme membranaire de sEPCR. The endothelial protein C receptor (EPCR) as well as how to measure its concentration, or to dose it, are well known to those skilled in the art. Preferably, the concentration of a soluble form of EPCR (sEPCR) is measured. Soluble forms of EPCR are well known to those skilled in the art and are preferably those obtained by cleavage of the membrane form of sEPCR.
Par ailleurs, on préfère que l'EPCR mesuré selon l'invention ne comprennent pas SEQ ID NO: 2. Ainsi, à titre d'exemple, un sEPCR dont on mesure préférentiellement la concentration selon l'invention est représenté par SEQ ID NO : 1. Les méthodes de dosage ou de détermination de la concentration d'EPCR, notamment de sEPCR, dans un échantillon biologique font notamment appel à un dosage de type ELISA, tel que celui-décrit par Esmon et al. (1999) Haematologica 84:363-368 ou Stearns-Kurosawa et al. (2002) Blood 99:526-530 .ou au kit ELISA sEPCR Asserachrom (Diagnostica Stago, Asnières, France). De préférence, dans la méthode selon l'invention, on détermine si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité d'un cancer de l'individu, lorsque la concentration mesurée d'EPCR tel que défini ci-dessus est supérieure à une ou plusieurs valeurs seuils. La ou les valeurs seuils telles que définies ci-dessus peuvent être aisément déterminées par l'homme du métier et peuvent notamment correspondre à la valeur normale d'EPCR dans une population d'individus sains. Lorsqu'on veut déterminer la sévérité d'un cancer, la ou les valeurs seuils peuvent être la concentration moyenne d'EPCR tel que défini ci-dessus chez des individus présentant un cancer à un stade déterminé ou en deçà d'un stade déterminé. Par ailleurs, lorsqu'on souhaite déterminer le risque thrombotique la ou les valeurs seuils peuvent être la concentration moyenne d'EPCR tel que défini ci-dessus chez des individus présentant un cancer du même type. En particulier, la ou les valeurs seuils peuvent être d'au moins 65 ng/ml, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 400 ng/mL, ou 500 ng/mL. A ce titre, déterminer que l'individu n'est pas porteur de l'haplotype A3 du gène EPCR permet notamment de s'assurer que la concentration mesurée pour sEPCR n'est pas d'origine génétique. Cette détermination peut être aisément effectuée par l'homme du métier par les techniques de biologie moléculaire classique. Il peut notamment procéder comme cela est décrit dans Saposnik et al. (2004) Blood 103:1311-1318. Par ailleurs, il peut également être utile de déterminer que l'individu n'est pas atteint d'une vasculite, dans la mesure où cette maladie peut avoir pour conséquence une augmentation de la concentration de sEPCR. L'homme du métier sait comment diagnostiquer une vasculite. Comme on l'entend ici, un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation se réfère à tout composé mesurable dans un échantillon biologique ayant un rôle direct ou indirect dans la formation ou la destruction du caillot sanguin. Ainsi, lorsqu'un marqueur additionnel est utilisé dans la méthode selon l'invention celui-ci est de préférence sélectionné dans le groupe constitué des D-dimères et de la fibrine soluble. De manière particulièrement préférée, le marqueur additionnel est constitué des D-dimères. Les D-dimères ainsi que la façon de mesurer leur concentration, ou de les doser, sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans Mirshahi et al. (1986) Thromb. Res. 44:715-728. De préférence, on choisit une méthode de dosage impliquant l'action de l'activateur tissulaire du plasminogène (t- PA) dans des conditions telles que seule la fibrine (et non le fibrinogène) soit dégradée. La fibrine soluble, ainsi que la façon de mesurer sa concentration, ou de la doser, sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans la demande US 2003/175,839. Furthermore, it is preferred that the EPCR measured according to the invention do not comprise SEQ ID NO: 2. Thus, by way of example, a sEPCR, the concentration of which is preferably measured according to the invention, is represented by SEQ ID NO: 1. The methods for assaying or determining the concentration of EPCR, in particular sEPCR, in a biological sample make use in particular of an ELISA type assay, such as that described by Esmon et al. (1999) Haematologica 84: 363-368 or Stearns-Kurosawa et al. (2002) Blood 99: 526-530. Or the Asserachrom EPIC kit ELISA (Diagnostica Stago, Asnieres, France). Preferably, in the method according to the invention, it is determined whether the individual suffers from a cancer and / or the severity of a cancer of the individual, when the measured concentration of EPCR as defined above is greater than one or more threshold values. The threshold value (s) as defined above can be easily determined by those skilled in the art and can in particular correspond to the normal value of EPCR in a population of healthy individuals. When it is desired to determine the severity of a cancer, the threshold value (s) may be the average EPCR concentration as defined above in individuals having cancer at a given stage or below a certain stage. In addition, when it is desired to determine the thrombotic risk, the threshold value (s) may be the average EPCR concentration as defined above in individuals presenting a cancer of the same type. In particular, the threshold value (s) may be at least 65 ng / ml, 100 ng / ml, 200 ng / ml, 300 ng / ml, 400 ng / ml, or 500 ng / ml. In this respect, determining that the individual does not carry the A3 haplotype of the EPCR gene makes it possible in particular to ensure that the concentration measured for sEPCR is not of genetic origin. This determination can be easily performed by those skilled in the art by conventional molecular biology techniques. It can in particular proceed as described in Saposnik et al. (2004) Blood 103: 1311-1318. On the other hand, it may also be useful to determine that the individual does not have vasculitis, as this disease may result in an increase in the concentration of sEPCR. The skilled person knows how to diagnose vasculitis. As used herein, an additional marker of fibrinolysis or coagulation refers to any measurable compound in a biological sample having a direct or indirect role in the formation or destruction of the blood clot. Thus, when an additional marker is used in the method according to the invention it is preferably selected from the group consisting of D-dimers and soluble fibrin. In a particularly preferred manner, the additional marker consists of D-dimers. D-dimers and the manner of measuring their concentration, or of assaying them, are well known to those skilled in the art and are described in particular in Mirshahi et al. (1986) Thromb. Res. 44: 715-728. Preferably, an assay method involving the action of tissue plasminogen activator (t-PA) is chosen under conditions such that only fibrin (and not fibrinogen) is degraded. Soluble fibrin, as well as the manner of measuring its concentration, or of assaying it, are well known to those skilled in the art and are described in particular in application US 2003 / 175,839.
Là encore, la ou les valeurs seuils pour le marqueur additionnel et pour les D-dimères, peuvent être aisément déterminées par l'homme du métier, notamment comme cela a été indiqué ci-dessus pour EPCR. A titre d'exemple, la ou les valeurs seuils pour les D-dimères peuvent notamment être d'au moins 500 ng/mL ou 1000 ng/ml et la ou les valeurs seuils pour la fibrine soluble peuvent être d'au moins 300 ng/mL. Selon un mode de réalisation préférentiel de la méthode de l'invention, la concentration d'EPCR et la concentration du marqueur additionnel sont mesurées dans le même échantillon biologique. Par ailleurs, l'échantillon biologique tel que défini ci-dessus est de préférence sélectionné dans le groupe constitué d'un échantillon de sang, notamment de sang total, d'un échantillon de plasma, d'un échantillon de sérum, et d'un échantillon d'épanchement d'organe. Comme on l'entend ici, lorsque les peptides selon l'invention comprennent une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO: 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO: 4), et TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), on comprendra que ces peptides sont tels qu'ils ne reconstituent pas une portion de la séquence d'EPCR englobant ces séquences. Comme on l'entend ici un ligand spécifique d'un peptide peut être de toute nature dans la mesure où il ne se lie essentiellement pas avec un peptide qui ne comprend pas ou qui n'est pas constitué dudit peptide cible. De préférence, le ligand est un anticorps, un fragment d'anticorps, un aptamère, ou un peptide obtenu par phage display . Par ailleurs, un anticorps est spécifique d'un peptide cible s'il ne se lie essentiellement pas avec un peptide qui ne comprend pas ou qui n'est pas constitué dudit peptide cible. Cela signifie également que l'épitope reconnu par l'anticorps est compris dans le peptide cible. En outre, il sera clair pour l'homme du métier que les fragments d'anticorps selon l'invention, sont tels qu'ils conservent la propriété de se lier spécifiquement au même peptide que l'anticorps dont ils dérivent, c'est-à-dire qu'ils comprennent la partie de liaison à l'antigène. De tels fragments sont notamment des fragments Fab, F(ab')2, et scFv Comme on l'entend ici, un anticorps , peut appartenir à n'importe quelle espèce, et est notamment un anticorps humain, de souris, de rat, de chèvre ou de Camelidae. L'anticorps peut également être un anticorps chimérique, c'est-à-dire un anticorps constitué de parties provenant de différentes espèces. Les anticorps chimériques préférés sont dits humanisés, dans lesquels les parties constantes (notamment CH et CL) sont d'origine humaine et les parties variables (VH et VL) ou les CDR des parties variables sont d'une autre espèce, la souris par exemple. L'anticorps peut être produit par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par immunisation d'un animal ou par de méthodes recombinantes ou chimiques. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal, notamment un anticorps polyclonal monospécifique, ou un anticorps monoclonal. Les "aptamères" sont bien connus de l'homme du métier. Ils peuvent être de nature nucléotidique comme décrit notamment par Ellington et al. (1990) Nature 346:818-22 et Bock et al. (1992) Nature 355:564-6, ou de nature peptidique, comme décrits, notamment, par Hoppe-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78:426-30. La méthode dite du "phage display" est une méthode de sélection de ligands polypeptidiques exprimés sur la capside d'un bactériophage et codés par une séquence nucléotidique insérée dans le gène codant la capside. Cette méthode est bien connue de l'homme du métier et est notamment décrite par Scott & Smith (1990) Science 249:386-390, et Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597. De préférence, le polypeptide obtenu par phage display est un polypeptide du type scFv (pour single-chain variable fragment ), comme cela est notamment décrit par Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. Here again, the threshold value (s) for the additional marker and for the D-dimers can be easily determined by those skilled in the art, especially as indicated above for EPCR. By way of example, the threshold value (s) for the D-dimers may especially be at least 500 ng / ml or 1000 ng / ml and the threshold value (s) for the soluble fibrin may be at least 300 ng / mL. According to a preferred embodiment of the method of the invention, the concentration of EPCR and the concentration of the additional marker are measured in the same biological sample. Furthermore, the biological sample as defined above is preferably selected from the group consisting of a blood sample, in particular whole blood, a plasma sample, a serum sample, and an organ effusion sample. As used herein, when the peptides according to the invention comprise a sequence selected from the group consisting of GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO: 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO: 4), and TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) it will be understood that these peptides are such that they do not reconstitute a portion of the EPCR sequence encompassing these sequences. As used herein a peptide-specific ligand can be of any kind insofar as it does not essentially bind with a peptide that does not comprise or is not constituted by said target peptide. Preferably, the ligand is an antibody, an antibody fragment, an aptamer, or a peptide obtained by phage display. On the other hand, an antibody is specific for a target peptide if it does not substantially bind to a peptide that does not or does not comprise said target peptide. It also means that the epitope recognized by the antibody is included in the target peptide. In addition, it will be clear to those skilled in the art that the antibody fragments according to the invention are such that they retain the property of binding specifically to the same peptide as the antibody from which they derive, that is, that is, they include the antigen binding part. Such fragments are in particular Fab, F (ab ') 2 and scFv fragments. As used herein, an antibody may belong to any species, and is especially a human, mouse or rat antibody. Goat or Camelidae. The antibody may also be a chimeric antibody, i.e. an antibody consisting of parts from different species. The preferred chimeric antibodies are called humanized, in which the constant parts (in particular CH and CL) are of human origin and the variable parts (VH and VL) or the CDRs of the variable parts are of another species, the mouse for example . The antibody can be produced by any method known to those skilled in the art, for example by immunization of an animal or by recombinant or chemical methods. The antibody may be a polyclonal antibody, especially a monospecific polyclonal antibody, or a monoclonal antibody. "Aptamers" are well known to those skilled in the art. They can be of nucleotide nature as described in particular by Ellington et al. (1990) Nature 346: 818-22 and Bock et al. (1992) Nature 355: 564-6, or of peptide nature, as described, in particular, by Hoppe-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78: 426-30. The so-called "phage display" method is a method of selecting polypeptide ligands expressed on the capsid of a bacteriophage and encoded by a nucleotide sequence inserted in the gene encoding the capsid. This method is well known to those skilled in the art and is described in particular by Scott & Smith (1990) Science 249: 386-390, and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597. Preferably, the polypeptide obtained by phage display is a polypeptide of the scFv (for single-chain variable fragment) type, as described in particular by Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455.
De préférence, dans le kit de diagnostic tel que défini ci-dessus, le moyen de mesure de la concentration d'EPCR est un ligand tel que défini ci-dessus. De même, dans la méthode selon l'invention, la concentration d'EPCR tel que défini ci-dessus dans un échantillon biologique de l'individu est mesurée à l'aide d'un ligand tel que défini ci-dessus. L'invention sera davantage explicitée à l'aide des figures et des exemples qui suivent. Preferably, in the diagnostic kit as defined above, the means for measuring the concentration of EPCR is a ligand as defined above. Similarly, in the method according to the invention, the concentration of EPCR as defined above in a biological sample of the individual is measured using a ligand as defined above. The invention will be further explained with the aid of the figures and examples which follow.
Description des figures Description of figures
Figure 1 : distribution de la concentration de sEPCR (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints d'adénocarcinomes mammaires non-métastasiques. La valeur plasmatique normale estimée à 100 ng/mL est représentée par un trait horizontal. Figure 1: Distribution of sEPCR concentration (y-axis, in ng / mL) in plasma samples from patients with non-metastatic breast adenocarcinoma. The normal plasma value estimated at 100 ng / mL is represented by a horizontal line.
Figure 2 : distribution de la concentration de sEPCR (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints d'adénocarcinomes mammaires métastasiques. La valeur plasmatique normale estimée à 100 ng/mL est représentée par un trait horizontal. Figure 2: Distribution of sEPCR concentration (y-axis, in ng / mL) in plasma samples from patients with metastatic breast adenocarcinoma. The normal plasma value estimated at 100 ng / mL is represented by a horizontal line.
Figure 3 : Distribution des concentrations plasmatiques de sEPCR (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints de différentes hémopathies malignes (leucémie aiguë lymphoïde (LAL), leucémie aiguë myéloïde (LAM), leucémie lymphoïde chronique (LLC), leucémie myéloïde chronique (LMC), lymphome et myélome multiple (MM), éventuellement en rémission (rem)). La valeur plasmatique normale estimée à 100 ng/mL est représentée par un trait horizontal. Figure 3: Distribution of plasma concentrations of sEPCR (y axis, in ng / mL) in plasma samples from patients with different hematological malignancies (acute lymphoid leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia ( LLC), chronic myeloid leukemia (CML), lymphoma and multiple myeloma (MM), possibly in remission (rem)). The normal plasma value estimated at 100 ng / mL is represented by a horizontal line.
Figure 4 : Distribution des concentrations plasmatiques de D-dimères (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints de différentes hémopathies malignes (leucémie aiguë lymphoïde (LAL), leucémie aiguë myéloïde (LAM), leucémie lymphoïde chronique (LLC), leucémie myéloïde chronique (LMC), lymphome et myélome multiple (MM), éventuellement en rémission (rem)). La valeur plasmatique normale estimée à 500 ng/mL est représentée par un trait horizontal. Figure 4: Distribution of plasma D-dimer concentrations (y-axis, in ng / mL) in plasma samples from patients with various hematological malignancies (acute lymphoid leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), lymphoid leukemia chronic (CLL), chronic myeloid leukemia (CML), lymphoma and multiple myeloma (MM), possibly in remission (rem)). The normal plasma value estimated at 500 ng / mL is represented by a horizontal line.
Figure 5 : Distribution des concentrations plasmatiques de sEPCR (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints d'hémopathies malignes (losanges) et dans des échantillons de plasma de patients atteints d'hémopathies malignes et de thrombose (croix). Les traits horizontaux marquent la moyenne. 11 Exemples Figure 5: Distribution of plasma concentrations of sEPCR (y axis, in ng / mL) in plasma samples from patients with hematological malignancies (diamonds) and in plasma samples from patients with hematological malignancies and thrombosis (cross). The horizontal lines mark the average. 11 Examples
Exemple 1 Dosage de sEPCR dans des plasmas de patients atteints de néoplasies malignes 5 Un protocole d'observation préliminaire a été effectué sur des patients atteints de néoplasies malignes. Plusieurs facteurs hémostatiques ont été dosés dans le plasma de ces patients et les résultats ont été analysés suivant leur pathologie et comparés à des volontaires sains. 10 Le dosage a été réalisé avec le kit ASSERACHROM sEPCR (Dagnostica Stago, Asnière, France) en suivant le protocole du fournisseur. Cette étude a permis de montrer que quelle que soit l'atteinte néoplasique, la concentration plasmatique de sEPCR est augmentée chez 57% des patients (n=64). De plus, principalement pour les cancers du sein, la quantité d'EPCR soluble semble 15 augmenter avec la sévérité de la maladie ; les concentrations plasmatiques de sEPCR des patients atteints de métastases étant plus conséquentes que celles de patients non métastasés (Ficiures 1 et 2). Par ailleurs, 2 autres marqueurs de thrombose liés à la production de fibrine (fibrine soluble) et à la fibrinolyse secondaire à la formation de fibrine (D-dimères) ont 20 été dosés en parallèle. On observe que les valeurs de D-dimères sont très souvent augmentées chez les patients cancéreux car ils sont souvent le reflet de la dégradation péri-tumorale de la fibrine, tandis que les concentrations élevées plasmatiques de fibrine soluble sont le témoin d'une thrombose chez ces malades.. Example 1 Assay of sEPCR in Plasmas of Patients with Malignant Neoplasias A preliminary observation protocol was performed on patients with malignant neoplasia. Several haemostatic factors were measured in the plasma of these patients and the results were analyzed according to their pathology and compared to healthy volunteers. The assay was performed with the ASSERACHROM sEPCR kit (Dagnostica Stago, Asniere, France) following the supplier's protocol. This study showed that regardless of the neoplastic lesion, the plasma concentration of sEPCR is increased in 57% of patients (n = 64). In addition, primarily for breast cancers, the amount of soluble EPCR appears to increase with the severity of the disease; Plasma concentrations of sEPCR in patients with metastases were greater than those in nonmetastatic patients (Ficiures 1 and 2). In addition, 2 other thrombosis markers related to the production of fibrin (soluble fibrin) and to fibrinolysis secondary to the formation of fibrin (D-dimer) were assayed in parallel. It is observed that the D-dimer values are very often increased in cancer patients because they often reflect peri-tumoral degradation of fibrin, whereas the high plasma concentrations of soluble fibrin are the witness of a thrombosis in these patients ..
25 Exemple 2 Dosage de sEPCR dans des plasmas de patients atteints d'hémopathies malignes Example 2 Assay of sEPCR in plasma of patients with haematological malignancies
Les plasmas de 167 patients de l'Hôtel Dieu (Paris, France) atteints ou en rémission (rem) de leucémie aigue lymphoïde (LAL), de leucémie aigue myéloïde 30 (LAM), de leucémie lymphoïde chronique (LLC), de leucémie myéloïde chronique (LMC), de lymphome et de myélome multiple (MM) ont été collectés et les valeur de D-dimères et de sEPCR ont été évaluées par dosage ELISA. Le dosage de sEPCR a été réalisé comme indiqué dans l'Exemple 1, le dosage des D-dimères a été réalisé en utilisant le système semi-automatique 12 StaliaD-Di (Diagnostica Stago, Asnieres, France), conformément aux recommandations du fournisseur. Plasmas of 167 patients at Hôtel Dieu (Paris, France) with or in remission (rem) of Acute Lymphocytic Leukemia (ALL), Acute Myeloid Leukemia (AML), Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL), Myeloid Leukemia chronic (CML), lymphoma and multiple myeloma (MM) were collected and the values of D-dimer and sEPCR were evaluated by ELISA assay. The sEPCR assay was carried out as indicated in Example 1, the D-dimer assay was performed using the semi-automatic 12 StaliaD-Di system (Diagnostica Stago, Asnieres, France), in accordance with the supplier's recommendations.
Sur 167 patients dosés, 117 (70%) présentent une concentration d'EPCRs 5 supérieure à la norme plasmatique estimée à 100 ng/mL et 34 (20,4%) ont une concentration d'EPCRs supérieure à 200 ng/mL (Figure 3). Le dosage de d-dimère a été réalisé sur les prélèvements médullaires de 80 patients. 77 (96,3%) patients présentent une concentration de D-dimères supérieure à la norme plasmatique de 500 ng/mL et 47 (58,8%) ont une concentration 10 supérieure à 1000 ng/mL (Figure 4) Par ailleurs, le dosage de sEPCR et des D-dimères dans les plasmas de patients atteints d'hémopathies malignes, confirme que les concentrations de ces marqueurs sont plus élevées que la norme chez ces individus et indique également que les concentrations de ces marqueurs sont encore plus élevées dans une sous- 15 population de ces patients constituée des patients thrombophiles (Figure 5, Tableau 1). sEPCR Patients analysés Patients thrombophiles Total 127 15 [sEPCR] < 100 ng/ml 35 (28%) 4 (27%) [sEPCR] = 100 û 200 ng/ml 68 (53%) 6 (40%) [sEPCR] > 200 ng/ml 24 (19%) 5 (33%) [sEPCR] moyenne 167,9 ng/ml 244,6 ng/ml D-dimères Total 63 6 [D-dimères] < 500 ng/ml 2 (3%) 1 [D-dimères] = 500 û 1000 ng/ml 25 (40%) 1 [D-dimères] > 1000 ng/ml 36 (57%) 4 (67%) [D-dimères] moyenne 1051,7 ng/ml 1004,2 ng/ml Tableau 1 : concentrations plasmatique et médullaire en sEPCR et en D-dimères dans une population d'individus atteints d'hémopathies malignes (population totale et sous-population thrombophile) Il est à noter que la concentration moyenne plasmatique de sEPCR chez des individus sains a été déterminée comme étant inférieure à 65 ng/mI. Par raison de commodité la valeur normale a toutefois été estimée à 100 ng/ml dans le cadre de la présente étude. 20 Exemple 3 Préparation d'anticorps anti-EPCR Production des anticorps spécifiques de ces peptides. Les peptides suivants ont été synthétisés par AGRO-BIO (La Ferté St Aubin, France) : GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO : 3) IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO : 4) TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5) Of 167 patients who were dosed, 117 (70%) had a concentration of EPCRs greater than the estimated plasma norm of 100 ng / mL and 34 (20.4%) had a concentration of EPCRs greater than 200 ng / mL (Figure 3). The d-dimer assay was performed on bone marrow samples from 80 patients. 77 (96.3%) patients have a D-dimer concentration above the plasma norm of 500 ng / mL and 47 (58.8%) have a concentration greater than 1000 ng / mL (Figure 4). the determination of sEPCR and D-dimer in the plasma of patients with hematological malignancies, confirms that the concentrations of these markers are higher than the norm in these individuals and also indicates that the concentrations of these markers are even higher in a subpopulation of these patients constituted thrombophilic patients (Figure 5, Table 1). sEPCR Patients analyzed Thrombophilia patients Total 127 15 [sEPCR] <100 ng / ml 35 (28%) 4 (27%) [sEPCR] = 100 - 200 ng / ml 68 (53%) 6 (40%) [sEPCR]> 200 ng / ml 24 (19%) 5 (33%) [sEPCR] average 167.9 ng / ml 244.6 ng / ml D-dimer Total 63 6 [D-dimer] <500 ng / ml 2 (3% ) 1 [D-dimer] = 500-1000 ng / ml (40%) 1 [D-dimer]> 1000 ng / ml 36 (57%) 4 (67%) [D-dimer] average 1051.7 ng / ml 1004.2 ng / ml Table 1: Plasma and medulla concentrations of sEPCR and D-dimer in a population of individuals with haematological malignancies (total population and thrombophilic subpopulation) It should be noted that the mean concentration Plasma sEPCR in healthy individuals was determined to be less than 65 ng / mI. For convenience, however, the normal value was estimated at 100 ng / ml for this study. Example 3 Preparation of anti-EPCR antibodies Production of antibodies specific for these peptides. The following peptides were synthesized by Agrobio (La Ferte St Aubin, France): ## STR1 ## SEQ ID NO: 4
Ces peptides ont été ensuite couplés à une protéine carrier (KLH) et injectés à 5 reprise, toutes les deux semaines, en présence d'adjuvant de Freund à des lapins blancs de Nouvelle Zélande (150 à 300 pg par injection). La cinquième injection des antigènes a eu lieu le 56ème jour et les sérums de lapins ont été prélevés le 77ème jour, aliquotés puis conservés à -20°C. These peptides were then coupled to a carrier protein (KLH) and injected every two weeks in the presence of Freund's adjuvant to New Zealand white rabbits (150 to 300 μg per injection). The fifth injection of the antigens took place on the 56th day and the rabbit sera were taken on the 77th day, aliquoted and then stored at -20 ° C.
Test des anticorps spécifiques des peptides. Des examens immunocytochimiques visant à détecter la présence d'EPCR sur différente lignées cellulaires ont été réalisés : à cet effet, les cellules étalées sur des lames ont été fixées à l'aide de formol à 4% pendant 5 min puis incubées avec l'anticorps dirigé contre EPCR pendant 1 h. les frottis cellulaires ont ensuite été lavées et la fixation de l'anticorps a été détectée à l'aide d'un anticorps anti-Ig de lapin marqué à la peroxydase. Après lavage du frottis, la révélation est effectuée à l'aide d'une solution de tétra-méthyl-benzidine (TMB) et d'H2O2. Les examens immunocytochimiques ont été réalisés sur plusieurs types cellulaires (cellules endothéliales et épithéliales), notamment sur la lignée d'adénocarcinome mammaire MDA-MB231, et montrent que les anticorps obtenus se fixent sur les cellules exprimant l'EPCR. Des résultats similaires ont pu être été obtenu avec 2 anticorps commerciaux spécifique d'EPCR : AF2245 de R&D system et 552500 de BD pharmingen. Test of antibodies specific for peptides. Immunocytochemical tests to detect the presence of EPCR on different cell lines were performed: for this purpose, the cells plated on slides were fixed with 4% formalin for 5 min and then incubated with the antibody. directed against EPCR for 1 h. The cell smears were then washed and the antibody binding was detected using a peroxidase labeled anti-rabbit Ig antibody. After washing the smear, the revelation is carried out using a solution of tetramethylbenzidine (TMB) and H2O2. The immunocytochemical examinations were performed on several cell types (endothelial and epithelial cells), in particular on the mammary adenocarcinoma line MDA-MB231, and show that the antibodies obtained bind to the cells expressing the EPCR. Similar results could be obtained with 2 EPCR-specific commercial antibodies: AF2245 from R & D system and 552500 from BD pharmingen.
Par ailleurs, les cellules MDA-MB231 ont été cultivées sur MatrigelTM (BD Biosciences), une matrice extracellulaire artificielle qui recrée le milieu naturel des 14 cellules, essentiellement comme décrit par Kleinman et al. (1982) Biochemistry 21:6188 On observe que les cellules MDA-MB231 s'organisent naturellement en réseaux pseudo-tubulaires. La densité de ces réseaux (nombre d'interconnection cellulaire) est significativement augmentée par une incubation avec la Protéine C Activée (PCA). Ces effets pro-invasifs induit par la PCA sont abolis par la présence, dans le milieu de culture (sérum dilué au 1/1000), de l'anticorps dirigé contre le peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) qui présente donc une activité neutralisante. Par comparaison, aucune activité neutralisante n'a pu être démontrée pour les anticorps dirigés contre les deux autres peptides (les résultats obtenus sont similaires à ceux observés avec un anticorps neutralisant l'activation de PAR-1). Furthermore, MDA-MB231 cells were grown on MatrigelTM (BD Biosciences), an artificial extracellular matrix that recreates the natural medium of the cells, essentially as described by Kleinman et al. (1982) Biochemistry 21: 6188 It is observed that the MDA-MB231 cells organize themselves naturally in pseudo-tubular networks. The density of these networks (number of cell interconnections) is significantly increased by incubation with Activated Protein C (PCA). These pro-invasive effects induced by the PCA are abolished by the presence, in the culture medium (serum diluted 1/1000), of the antibody directed against the peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) which therefore has an activity neutralizing. By comparison, no neutralizing activity could be demonstrated for the antibodies directed against the other two peptides (the results obtained are similar to those observed with an antibody neutralizing the activation of PAR-1).
Exemple 4 Identification de séquences nucléotidiques codant EPCR spécifiques de cellules cancéreuses Example 4 Identification of nucleotide sequences encoding EPCR specific for cancer cells
Le gène codant EPCR ainsi que ses transcrits provenant de lignées de cellules de cancers du sein, de l'ovaire, du colon, du poumon et de leucémie promyéolicytaire ont été séquencés. Les résultats indiquent que ces séquences sont hautement conservées par rapport aux séquences de référence d'origine endothéliale. En particulier, les polymorphismes d'un nucléotide décrits dans la séquence de référence sont retrouvés dans les cellules néoplasiques, ce qui permet de caractériser l'haplotype EPCR de ces cellules (Tableaux 2 et 3). On observe ainsi que la fréquence de l'haplotype A3, corrélé à une solubilisation accrue du récepteur, est nettement plus élevée que celle observée dans la population générale. De plus, des polymorphismes supplémentaires, non décrits dans la séquence de référence, sont spécifiquement détectés dans les régions non transcrites des gènes provenant des cellules de carcinomes mammaire (MDA-MB231) et ovarien (OVCAR), et de leucémie aiguë promyélocytaire (HL60), ce qui peut permettre d'identifier ces cellules cancéreuses. Les séquences génomiques correspondantes sont respectivement représentées par SEQ ID NO : 6, 7 et 8. Ainsi, une insertion d'un T est retrouvée dans la partie 5' UTR en position 260 pour MDA-MB231, OVCAR et HL60 ; une délétion d'un A est retrouvée dans la partie 5' UTR en position 840 pour MDA-MB231 et HL60 ; une amplification de T dans la région non codante de l'exon IV en position 7650 ; le remplacement de G en position 7965 par C et le remplacement de T en position 8153 par C dans la partie 3' UTR. SNPs 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Locus(pb) 1651 3610 3787 3877 4216 4868 5230 5760 6333 6936 7014 7968 7999 MDA- C C/T C/T A/G x C/T A/G x C/T A/G x A/G A/G M B231 OVCAR C C/T C G x T G T T A/G G A G HL60 C T C/T A/G x C/T A/G C/T C/T A C/G A/G A/G Haplotype Al C T T A C C A C C A C G A A2 C T C G G T G T T A G A G A3 G C C G A T G T T G G A G Tableau 2 : localisation des SNPs dans la séquence génomique du gène EPCR pour les lignées cellulaires indiquées. Les haplotypes Al, A2 et A3 sont indiqués pour référence. X indique un incertitude sur le nucléotide. SNPs 10 11 Haplotype Locus (pb) 738 816 MDA-MB231 A/G X Al /A3 OVCAR A/G G A2/A3 A549 G G A3/A3 HCT-8 A G A2/A2 HT-29 A G A2/A2 H L60 A C/G Al/A2 Al A C A2 A G A3 G G 10 Tableau 3 : localisation des SNPs dans la séquence exonique du gène EPCR pour les lignées cellulaires indiquées. Les haplotypes A1, A2 et A3 sont indiqués pour référence5 The gene encoding EPCR and its transcripts from breast, ovarian, colon, lung and promyelocytic leukemia cell lines have been sequenced. The results indicate that these sequences are highly conserved relative to endothelial reference sequences. In particular, the nucleotide polymorphisms described in the reference sequence are found in neoplastic cells, which makes it possible to characterize the EPCR haplotype of these cells (Tables 2 and 3). It is thus observed that the frequency of the A3 haplotype, correlated with an increased solubilization of the receptor, is significantly higher than that observed in the general population. In addition, additional polymorphisms, not described in the reference sequence, are specifically detected in the non-transcribed regions of the genes from mammary carcinoma (MDA-MB231) and ovarian (OVCAR) cells, and acute promyelocytic leukemia (HL60) cells. , which can identify these cancer cells. The corresponding genomic sequences are respectively represented by SEQ ID NO: 6, 7 and 8. Thus, an insertion of a T is found in the 5 'UTR part at position 260 for MDA-MB231, OVCAR and HL60; a deletion of an A is found in the 5 'UTR at position 840 for MDA-MB231 and HL60; an amplification of T in the non-coding region of exon IV at position 7650; the replacement of G at position 7965 by C and the replacement of T at position 8153 by C in part 3 'UTR. SNPs 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Locus (pb) 1651 3610 3787 3877 4216 4868 5230 5760 6333 6936 7014 7968 7999 MDA-CC / TC / TA / G x C / TA / G x C / TA / G x A / GA / GM B231 OVCAR CC / TCG x TGTTA / GGAG HL60 CTC / TA / G x C / TA / GC / TC / TAC / GA / GA / G Haplotype Al CTTACCACCACGA A2 CTCGGTGTTAGAG A3 GCCGATGTTGGAG Table 2: Location SNPs in the genomic sequence of the EPCR gene for the indicated cell lines. Haplotypes Al, A2 and A3 are for reference. X indicates an uncertainty on the nucleotide. SNPs 10 11 Haplotype Locus (bp) 738 816 MDA-MB231 A / GX Al / A3 OVCAR A / GG A2 / A3 A549 GG A3 / A3 HCT-8 AG A2 / A2 HT-29 AG A2 / A2 H L60 AC / G Table 3: Location of the SNPs in the exon sequence of the EPCR gene for the indicated cell lines. A1, A2 and A3 haplotypes are shown for reference5
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