FR2946662A1 - Procede d'evaluation in vitro de l'activite d'un agent cosmetique ou dermatologique. - Google Patents
Procede d'evaluation in vitro de l'activite d'un agent cosmetique ou dermatologique. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne des procédés d'évaluation de l'activité de produits, en particulier cosmétiques ou dermatologiques sur la peau, par la mise en oeuvre de modèles d'équivalent de peau in vitro préparés à partir de populations de cellules souches kératinocytaires calibrées, déplétées ou au contraire enrichies en ces cellules.
Description
La présente invention concerne des procédés d'évaluation de l'activité de produits, en particulier cosmétiques ou dermatologiques sur la peau, par la mise en oeuvre de modèles d'équivalent de peau in vitro préparés à partir de populations de cellules souches kératinocytaires calibrées, déplétées ou au contraire enrichies en ces cellules.
Les équivalents de peau employés pour l'évaluation des actifs, des médicaments, des produits chimiques, etc. sont préparés avec la population totale de kératinocytes isolée à partir des épidermes humains (e.g. sans sélection d'une quelconque sous-population). Le pourcentage et la capacité régénérative des cellules souches et des cellules progénitrices dans cette population varient selon le donneur, le site anatomique du tissu, l'exposition du tissu à des facteurs de stress, etc. De ce fait, les populations kératinocytaires dérivées des donneurs différents peuvent avoir des potentiels régénératifs in vitro très différents. De même, la sensibilité de ces populations ainsi que le type de réponse qu'elles peuvent avoir suite à un traitement ou agression in vitro varient d'un donneur à un autre. Cette variabilité peut poser un problème pour l'évaluation des molécules au niveau industriel, qui nécessite des modèles les plus sensibles et reproductibles possible pour détecter soit des effets bénéfiques soit des effets néfastes avec un certain niveau de certitude.
La peau est un tissu qui s'auto renouvèle en continu durant toute la vie de l'individu. Ce renouvellement est maintenu par des populations distinctes qui résident dans l'épiderme. Le renouvellement à court terme, toutes les trois à quatre semaines, est assuré par une sous-population majoritaire de la couche basale appelée kératinocytes progéniteurs. Ces cellules possèdent un potentiel de prolifération variable mais limité qu'elles perdent progressivement en s'engageant vers la différenciation. En revanche, le renouvellement à long terme est assuré par les kératinocytes souches. Le compartiment "souche" épidermique est constitué de cellules rares caractérisées par le fait que, bien que demeurant majoritairement dans un état de quiescence, ces cellules possèdent un potentiel d'expansion à long terme très important. Les cellules souches sont également caractérisées par leur capacité d'autorenouvellement. En comparaison avec les kératinocytes progéniteurs ou les kératinocytes souches, les cellules des couches suprabasales de l'épiderme sont de cellules plus matures dont le potentiel de prolifération est très limité ou nul et qui se différencient en migrant vers la couche cornée.
Les cellules souches kératinocytaires sont à distinguer des cellules souches embryonnaires totipotentes; les kératinocytes appelés "souches" n'ont pas la capacité de régénérer tout type cellulaire, leur plasticité est limitée à la génération de cellules de la peau. Par "population de cellules souches kératinocytaires" on désigne une population de kératinocytes d'origine non embryonnaire, plutôt quiescente, possédant une capacité d'auto-renouvellement et un potentiel d'expansion à long terme élevé, et capable de reconstruire un épiderme. Les cellules souches kératinocytaires peuvent, lors de leur division, donner naissance soit à d'autres cellules souches kératinocytaires, soit à des cellules progénitrices, aussi appelées "transient amplifying cells". Les cellules progénitrices - issues de la division des cellules souches- sont des cellules prolifératives ayant une capacité de renouvellement inférieure à celle des cellules souches; ces cellules vont ensuite migrer de la couche basale et subir les processus de différenciation conduisant aux différentes couches de la peau.
Les cellules clonogéniques représentent un ensemble de cellules à fort potentiel prolifératif constitué des cellules souches et des cellules progénitrices.
Les kératinocytes qui composent l'épiderme peuvent être donc schématiquement classés dans 3 compartiments selon leur stade d'évolution : les cellules souches, les cellules progénitrices et les cellules différenciées. Cependant, il n'existe pas de frontières nettement définies entre ces compartiments, chacun d'eux étant en réalité constitué d'un continuum de cellules au degré de maturation variable, et donc hétérogène. De plus, il est difficile de distinguer les cellules souches épidermiques des cellules progénitrices.
Plusieurs méthodes existent à ce jour pour sélectionner des populations kératinocytaires humaines enrichies en cellules clonogéniques, en particulier en cellules souches, à partir des prélèvements cutanés. Ces méthodes comprennent une sélection basée sur : 1) l'adhésion rapide et forte de ces cellules à un composant de la matrice extracellulaire, et notamment un composant comme le collagène reconnu par la famille des intégrines impliquées dans l'adhésion des kératinocytes (Jones PH et Watt FM. Cell, 1993, 73 :713-724 ; Jones PH et al. Cell, 1995, 80 :83-93 ; Kim DS et al.. Cell. Mol. Life Sci., 2004 61 :2774-2781) 2) l'adhésion rapide et forte de ces cellules à un composant de la matrice extracellulaire en combinaison avec la faible expression d'un ou des récepteurs pour des facteurs mitogéniques (ex. le récepteur pour l'EGF) (Fortunel N. et al. J. Cell Science, 2003, 116 :4043-4052) 3) une forte expression d'intégrine alpha 6 et une faible expression du récepteur CD71 (Li A. et al. PNAS, 1998, 95 :3902-3907 ; Kaur P & Li A. JID, 2000. 114 :413-420) 4) la forte expression d'intégrine beta 1 seule ou en combinaison avec la protéine MCSP (Legg J. et al. Development, 2003, 130 : 6049-6063) 5) une faible expression du desmoglein 3, un composant de desmosomes (Wan H et al. Stem Cells, 2007, 25 :1286-1297) 6) un critère phénotypique caractéristique de ces cellules souches: leur capacité à exclure ou excréter une molécule potentiellement toxique telle que le colorant Hoechst (Larderet G. et al. Stem Cells, 2006, 24 :965-974). Cette méthode peut être employé seule ou en combinaison avec d'autres critères tel que la sélection de cellules de petite taille (Dunwald et al. Exp Dermatol., 2001,10 :45-54).
La demande WO 03/038073 décrit un procédé d'enrichissement d'une culture en cellules souches kératinocytaires à partir d'une population de kératinocytes, sans toutefois proposer d'applications spécifiques de ces cultures. WO2005/071063 enseigne l'isolement de cellules dérivées de précurseur de cellules souches à partir de follicule pileux ou de papille dermique, et leur utilisation pour induire la repousse des cheveux chez l'homme. US2006/0057126 concerne aussi des méthodes d'isolement et de culture de cellules souches du bulbe pour les réimplanter en vue de favoriser la repousse de cheveux. US2006/0105454 décrit l'isolement de cellules de la peau et leur culture dans des conditions spécifiques, en vue de permettre des greffes de peau notamment dans le cas de brûlure ou de blessures sur des zones étendues de peau. US5340744 porte sur l'identification de cellules souches dans une zone spécifique du follicule pileux, le bulge, et étudie leur activité pour déterminer le potentiel de croissance du cheveu chez l'homme.
Cependant, à la connaissance des demandeurs, il n'a jamais été proposé de mettre en oeuvre des populations enrichies ou au contraire déplétées en cellules clonogéniques de la peau, en particulier en cellules souches notamment en cellules souches kératinocytaires, dans un procédé d'évaluation d'actifs in vitro, ni pour la reconstruction d'un équivalent d'épiderme pluristratifié en vue de l'évaluation d'actifs.
De manière inattendue, les inventeurs ont maintenant mis en évidence que des équivalents de peau (ou "peaux reconstruites") générés à partir de populations enrichies ou déplétées en cellules clonogéniques, en particulier en cellules souches épidermiques sont à la fois plus sensibles aux effets des actifs et présentent une reproductibilité supérieure à ce qui est observé avec des modèles fabriqués à partir de populations kératinocytaires non sélectionnées (des populations de kératinocytes "totaux").
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé d'évaluation in vitro de l'activité d'un agent sur le renouvellement de l'épiderme, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de préparation d'un équivalent d'épiderme en présence dudit agent à évaluer, et en ce que ledit équivalent d'épiderme est préparé à partir d'une population de kératinocytes dans laquelle le pourcentage de cellules clonogéniques dans population de kératinocytes totaux est modifié d'au moins 10%, et notamment d'au moins 20%, par rapport au pourcentage de cellules clonogéniques d'une population de kératinocytes standard. Le procédé comprend en outre au moins une étape de comparaison des caractéristiques de l'épiderme obtenu avec celles d'un épiderme témoin.
Par "cellules clonogéniques" on désigne dans le présent texte, une population de kératinocytes possédant un potentiel d'expansion à long terme élevé et capable de reconstruire un épiderme, constitué des cellules souches kératinocytaires et des cellules progénitrices kératinocytaires.
Par population standard, on entend au sens de la présente demande la composition physiologique des kératinocytes souches et non-souches présents dans une peau humaine adulte normale et dans des cultures de kératinocytes in vitro qui n'ont jamais subi un processus de sélection. Le pourcentage de cellules souches et cellules progénitrices dans une population standard varie de 1% à 15%, et est notamment d'environ 10 %, mesuré en réalisant un test de clonogénicité (test CFE pour colony forming effiiciency ) décrit par Barrandon et Green (PNAS, 1985, 82 :5390-5394) permettant la quantification des cellules clonogéniques. Brièvement, après séparation des kératinocytes de la peau, on ensemence une population calibrée en monocouche sur un milieu nutritif solide contenant des fibroblastes. Après culture pendant un temps permettant la multiplication, on évalue la quantité et qualité de colonies formées, et on la compare au nombre de cellules initialement ensemencées. Chaque colonie correspond à la présence initiale d'une cellule clonogénique, soit cellule souche soit cellule progénitrice.
Toutefois au sens de la présente invention, on considérera généralement qu'une population est enrichie en cellules clonogéniques, et plus spécifiquement enrichie en cellules souches kératinocytaires, si le pourcentage de cellules clonogéniques dans la population kératinocytaire totale, évalué par le test de clonogénicité, est supérieur à 10%, et notamment d'environ 11 % à 50%. Inversement, on considérera généralement qu'une population est déplétée en cellules clonogéniques, et plus spécifiquement déplétée en cellules souches kératinocytaires, si le pourcentage de cellules clonogéniques) dans la population kératinocytaire totale, évalué par le test de clonogénicité, est inférieur ou égal à 7%, notamment d'environ 6,5% à 0,1%, voire inférieur.
Le nombre de cellules souches présente dans une population standard de kératinocytes peut être également estimé en analysant par cytométrie en flux le pourcentage de cellules caractérisées par une forte expression d'intégrine alpha 6 et une faible expression du récepteur CD71 (Li A. et al. PNAS, 1998, 95 :3902-3907 ; Kaur P & Li A. JID, 2000. 114 :413-420), les cellules présentant ces caractéristiques correspondent aux cellules souches. En employant cette technique, le pourcentage de cellules souches issues de la couche basale varie de 1% à 10%, notamment d'environ 6 %.
Au sens de la présente invention, on considérera également qu'une population est enrichie en cellules souches kératinocytaires, si le pourcentage de cellules intégrine alpha6 fort/CD71 faible dans la population kératinocytaire totale, évalué par cytométrie en flux, est supérieur à 10%, en particulier supérieur ou égal à 1% et notamment d'environ 15% à 95%, en particulier supérieur ou égal à 30%.
Inversement, on considérera généralement qu'une population est déplétée en cellules souches kératinocytaires, si le pourcentage de (cellules intégrine alpha6 fort/CD71 faible) dans la population kératinocytaire totale, évalué par cytométrie en flux, est inférieur ou égal à 5%, notamment d'environ 5% à 0,1%, voire inférieur, en particulier inférieur ou égal à 4,5%.
Par "agent", on entend tout produit, ingrédient ou molécule simple ou complexe, d'origine naturelle ou de synthèse sous une forme plus ou moins purifiée, mais aussi une formulation comprenant un ou plusieurs de ces ingrédients et un support et des adjuvants adaptés à l'application visée. Il s'agit en particulier d'actif cosmétiques ou dermatologiques.35 Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, le pourcentage de cellules clonogéniques dans la population de kératinocytes utilisée pour préparer l'équivalent d'épiderme est supérieur d'au moins 10% au pourcentage d'une population de kératinocytes standard, mesurée en réalisant un test de clonogénicité.
Le pourcentage de cellules clonogéniques dans la population kératinocytaire totale pourra ainsi varier de plus de 10% et jusqu'à 95% de cellules clonogéniques dans la population de kératinocytes utilisée pour la préparation de l'équivalent d'épiderme. De bons résultats sont notamment obtenus avec des pourcentages variant de 11 % à environ 50%, par exemple de 11 % à 30%.
Selon une variante du procédé d'évaluation selon l'invention, le pourcentage de cellules souches dans la population de kératinocytes utilisée pour préparer l'équivalent d'épiderme est supérieur à 10% mesuré en réalisant des analyses des cellules intégrine alpha6 fort/CD71 faible en cytométrie en flux.
Le pourcentage de cellules souches (intégrine alpha6 fort/CD71 faible) pourra ainsi varier de plus de 10% et jusqu'à 95% de cellules souches dans la population de kératinocytes utilisé pour la préparation de l'équivalent d'épiderme. De bons résultats sont notamment obtenus avec des pourcentages variant de 30% à environ 50%.
Un tel modèle, enrichi en cellules clonogéniques et notamment en cellules souches, sera particulièrement avantageux pour évaluer des agents à activité anti-proliférative, ou inhibant l'homéostasie cutané (i.e. inhibant l'équilibre prolifération / différenciation conduisant vers une stratification physiologique de l'épiderme) ou protecteurs du compartiment cellules souches et/ou cellules clonogéniques de la peau.
Selon un autre mode de réalisation du procédé d'évaluation selon l'invention, le pourcentage de cellules clonogéniques dans la population de kératinocytes totale utilisée pour préparer l'équivalent d'épiderme est inférieur d'au moins 10% au pourcentage d'une population de kératinocytes standard, mesuré en réalisant un test de clonogénicité. En particulier, le pourcentage de cellules clonogéniques dans la population de kératinocytes totale sera inférieure à 7%.
Le pourcentage de cellules clonogéniques pourra ainsi varier de plus de 0.1% et jusqu'à 6.5% de cellules dans la population de kératinocytes utilisé pour la préparation de l'équivalent d'épiderme.
Selon une variante du procédé d'évaluation selon l'invention, le pourcentage de cellules souches dans la population de kératinocytes utilisée pour préparer l'équivalent d'épiderme est inférieur à 5% mesuré en réalisant des analyses des cellules (intégrine alpha6 fort/CD71 faible) en cytométrie en flux.
Le pourcentage de cellules souches (cellules intégrine alpha6 fort/CD71 faible) pourra ainsi varier de plus de 0.1% et jusqu'à 5% de cellules souches dans la population de kératinocytes utilisé pour la préparation de l'équivalent d'épiderme. De bons résultats sont notamment obtenus avec des ratio à environ 4%.
Les modèles ainsi obtenus, déplétés en cellules clonogéniques et notamment en cellules souches, seront très utiles pour évaluer des actifs ou molécules ayant une activité pro-régénérative, et notamment des agents anti-âge.
L'invention a ainsi objet un procédé d'évaluation d'un actif pro-régénérant, en particulier d'un agent luttant contre les signes cutanés du vieillissement, dans lequel (a) on ensemence une population de kératinocytes sur un équivalent de derme dans un milieu de culture, la population de kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux inférieur à 7%, (b) on met en contact l'agent à évaluer avec les kératinocytes ou le milieu de culture, (c) on laisse l'équivalent d'épiderme se différencier, (d) on compare l'équivalent d'épiderme à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais sans l'actif à évaluer. On considère que l'agent a une activité pro-régénerante et /ou est efficace contre les signes cutanés du vieillissement, si les caractéristiques de prolifération et/ou de régénération de l'équivalent d'épiderme sont augmentées par rapport à celles de l'équivalent d'épiderme témoin
L'invention a également pour objet un procédé permettant d'obtenir des modèles de peau reconstruite générés à partir de quantités calibrées de cellules souches et cellules progénitrices kératinocytaires et présentant une sensibilité et une reproductibilité supérieure à celles observées en employant des modèles classiques.
Les kératinocytes utilisés selon l'invention peuvent provenir de toutes origines, mais sont préférentiellement des kératinocytes d'origine humaine. Ils peuvent être préparés selon n'importe quelle méthode connue de l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple la culture à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique ou la culture de kératinocytes issus de la gaine de follicules pileux normaux ou pathologiques. Ils sont obtenus à partir de peau ou de follicules adulte, d'enfant ou néo-nataux, en particulier à partir de peau ou de follicules adultes.
Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique, selon la méthode décrite dans Régnier et collaborateurs (Frontiers of Matrix Biology, 1981, 9 : 4-35).
La sélection ou déplétion des cellules souches/progénitrices épidermiques peut être réalisée par des méthodes connues de l'homme du métier, basée par exemple sur des caractéristiques choisies parmi : 1) une petite taille 2) l'adhésion rapide et forte de ces cellules à un composant de la matrice extracellulaire, et notamment un composant comme le collagène reconnu par la famille des intégrines impliquées dans l'adhésion des kératinocytes 3) la faible expression d'un ou des récepteurs pour des facteurs mitogéniques (ex. le récepteur pour l'EGF) 4) la forte expression des intégrines alpha6 ou betal ou bien de la protéine MCSP (melanoma chondroitin sulphate proteoglycan) 5) la faible expression du desmoglein 3 ou bien du récepteur CD71 6), la capacité à exclure ou excréter une molécule potentiellement toxique (ex. un xénobiotique) ou un colorant tel que le colorant Hoechst.
L'épiderme ou peau reconstruite utile pour la mise en oeuvre de l'invention comprend de préférence des kératinocytes à au moins deux stades de différenciation, en particulier il comprend un équivalent de stratum corneum.
Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'équivalent d'épiderme est avantageusement préparé par ensemencement, dans un milieu de culture, d'un équivalent de derme par une population de kératinocytes dont le ratio est modifié comme indiqué dans ce qui précède, et ledit agent à évaluer est mis en contact des kératinocytes et/ou du milieu de culture pendant la phase de prolifération et/ou la phase différenciation de l'épiderme Selon l'une des variantes de l'invention, l'agent à évaluer est mis en contact avec le milieu de culture et/ou la population de kératinocytes à teneur modifiée en cellules clonogéniques et notamment en cellules souches au moment de l'ensemencement par ladite population de kératinocytes.
Selon une autre variante, l'agent à évaluer peut être mis en contact avec l'équivalent d'épiderme et/ou le milieu de culture à partir de la phase de différenciation, notamment à un temps compris entre 2 jours et 21 jours après l'ensemencement de l'équivalent de derme par la population de kératinocytes et la mise à l'interface air-liquide de l'épiderme reconstruit, notamment entre 3 et 21 jours.
Le milieu nutritif utilisé peut être tout milieu nutritif connu pour sa capacité à permettre la prolifération et la différenciation des kératinocytes. On peut citer à titre d'exemple le milieu Dulbecco modifié Eagle, ou un milieu défini à teneur en calcium variable, tel le milieu décrit par Boyce S.T. et Ham R.G., (J. Tissue Cuit. Meth., 1985, 9 : 83-93). Il est possible d'utiliser un mélange de plusieurs milieux nutritifs comme par exemple le mélange milieu Dulbecco modifié Eagle/milieu HAM F12 ou milieu de Rheinwald et Green, (CelI, 1975, 6 : 331-334).
Généralement pour la préparation de l'équivalent d'épiderme, les kératinocytes sont d'abord étalés sur un support et maintenus immergés dans un milieu nutritif pendant un temps d'incubation de plusieurs jours. Au bout de ce temps d'incubation, la culture est portée à l'interface air/liquide, et l'incubation se poursuit ensuite jusqu'à obtention d'un épiderme présentant les couches cellulaires classiques à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Ainsi, l'incubation se poursuit pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours.
Le support utilisé selon l'invention peut être l'un quelconque de ceux décrits dans l'art antérieur. A titre d'exemple, on peut citer comme support les lattices mixtes collagène/fibroblastes, le derme préalablement désépidermisé, les membranes artificielles comme par exemple les filtres de marque Millipores, les substituts sous-cutanés à base de collagène, le plastique ou tout autre support compatible avec la viabilité cellulaire.
Préférentiellement, le support est constitué par un substitut sous-cutané à base de collagène et comprenant des fibroblastes vivants. L'équivalent de peau de l'invention peut comprendre tout autre type cellulaire qui pourrait y être incorporé. A titre d'exemple on peut citer des précurseurs de cellules de Langerhans induits ou non et des mélanocytes.
Quelque soit le support choisi, le protocole pour sa mise en oeuvre utilisé selon l'invention peut-être l'un quelconque des protocoles décrits dans l'art antérieur. On peut citer par exemple les modèles décrits dans les demandes de brevets EP-A-285471, EP-A-285474, EP-A-789074, EP-A-502172, EP-A-418035, WO-A-9116010, EP-A-197090, EP-A-20753, FR-A-2665175, FR-A-2689904. De manière très générale, les modèles de peau reconstruite décrits dans ces documents comprennent des kératinocytes humains associés ou non à d'autres cellules de la peau comme les mélanocytes et/ou les cellules de Langerhans, déposés sur un support, souvent un équivalent de derme, et cultivés dans des conditions telles qu'ils entrent dans un programme de différenciation aboutissant à la formation d'un équivalent d'épiderme.
En particulier, l'équivalent de derme pour la mise en oeuvre de l'invention pourra être choisi parmi les dermes désépidermisés et les lattices de collagène et de fibroblastes.
Selon l'un des modes de mise en oeuvre du procédé on compare l'équivalent d'épiderme obtenu en présence de l'agent à évaluer à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais en l'absence d'agent à évaluer. Cette comparaison pourra porter sur des caractéristiques qualitatives et/ou quantitatives des épidermes, notamment par la mesure du taux de cellules souches et cellules progénitrices après sélection de cette population et analyse par un test de clonogénicité ou plus spécifiquement par évaluation du taux de cellules souches par l'analyse des marqueurs membranaire en cytométrie en flux. La comparaison pourra porter également sur des aspects histologiques (épaisseur de l'épiderme, qualité de la couche basale, morphologie des cellules, niveau de stratification/différenciation, etc.) obtenus avec ceux d'un épiderme ou d'une peau reconstruite non traité. Des analyses immunohistochimiques (suivi des marqueurs de prolifération ou de différenciation) ou biochimiques (analyses des extraits cellulaires ou des protéines secrétées dans le milieu de culture) pourront également être réalisées afin d'étudier l'impact de l'agent appliqué. Le nombre de cellules prolifératives peut être également quantifié en dénombrant les cellules qui incorporent un marqueur comme le BrdU (ou 5-bromo-2-deoxyuridine) qui mis dans la culture et incorporé dans l'ADN de cellules en division.
En particulier, on compare dans les équivalents d'épiderme obtenus en présence ou non de l'agent à évaluer, au moins un paramètre choisi parmi le nombre de cellules prolifératives, l'épaisseur ou le nombre de couches vivantes du compartiment épidermique ou l'expression de marqueurs moléculaires de la couche basale (ki67, l'intégrine alpha 6 ou beta 1, le MCSP, etc.) ou des couches suprabasales (marqueurs de différentiation par exemple).
L'invention a encore pour objet un équivalent de peau in vitro susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre de populations kératinocytaires dont le pourcentage de cellules souches et/ou cellules progénitrices est modifié par rapport au pourcentage d'une population standard, en présence d'agent comme indiqué précédemment, cet équivalent de peau comprenant au moins un équivalent d'épiderme dont le pourcentage en cellules clonogéniques est modifiée d'au moins 10% par rapport à un équivalent de peau standard, et au moins un agent cosmétique ou dermatologique.
L'invention a également pour objet un équivalent de peau in vitro susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre de populations kératinocytaires dont le pourcentage est modifié par rapport au pourcentage standard, en présence d'agent comme indiqué précédemment, cet équivalent de peau comprenant au moins un équivalent d'épiderme dont le pourcentage en cellules clonogéniques est supérieur à 10% ou inferieur à 7% et au moins un agent cosmétique ou dermatologique.
L'invention se rapporte également l'utilisation de tels équivalents de peau pour déterminer le potentiel régénératif d'un agent cosmétique ou dermatologique.
Un autre aspect de la présente invention est un procédé de criblage d'actifs cosmétiques 25 ou dermatologiques caractérisé en ce que (a) on ensemence une population de kératinocytes sur un équivalent de derme dans un milieu de culture, la population de kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux inférieur d'au moins 10% au pourcentage d'une population standard de kératinocytes, 30 (b) on met en contact au moins un actif cosmétique ou dermatologique avec les kératinocytes ou le milieu de culture, (c) on laisse l'équivalent d'épiderme se différencier, (d) on compare l'équivalent d'épiderme à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais sans l'actif à évaluer (e) on sélectionne les actifs pour lequel les caractéristiques de prolifération et/ou de régénération de l'équivalent d'épiderme sont augmentées par rapport à celles de l'équivalent d'épiderme témoin. Par "régénération", on entend la capacité à régénérer des couches vivantes et stratifiées caractéristiques du compartiment épidermique, évaluée notamment par la qualité de la couche basale (densité de cellules, orientation vis-à-vis la membrane basale), le nombre (ou l'épaisseur) des couches de l'équivalent d'épiderme et l'organisation de ces couches.
Selon l'un des modes de réalisation du procédé de criblage, à l'étape b), le ou les actifs à évaluer sont mis en contact avec les kératinocytes ou le milieu de culture immédiatement après ensemencement des kératinocytes. Selon un autre mode de réalisation du procédé de criblage, à l'étape b), le ou les actifs à évaluer sont mis en contact avec les kératinocytes ou le milieu de culture après culture des kératinocytes dans des conditions permettant la différenciation des cellules à au moins 2 stades différents (i.e. après avoir mise les échantillons à l'interface air-liquide).
L'invention a donc notamment pour objet un procédé de criblage d'actifs cosmétiques ou dermatologiques caractérisé en ce que (a) on ensemence une population de kératinocytes sur un équivalent de derme dans un milieu de culture, la population de kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux inférieur d'au moins 10% au pourcentage d'une population standard de kératinocytes, (b) après culture dans des conditions permettant la différenciation des cellules à au moins 2 stades différents on met en contact au moins un actif cosmétique ou dermatologique avec les kératinocytes ou le milieu de culture, (c) on laisse l'équivalent d'épiderme se différencier, (d) on compare l'équivalent d'épiderme à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais sans l'actif à évaluer (e) on sélectionne les actifs pour lequel les caractéristiques de prolifération et/ou de régénération (capacité à régénérer des couches stratifiées caractéristiques du compartiment épidermique) de l'équivalent d'épiderme sont augmentées par rapport à celles de l'équivalent d'épiderme témoin.
L'invention a également pour objet un procédé de criblage d'actifs cosmétiques ou dermatologiques caractérisé en ce que (a) on ensemence une population de kératinocytes sur un équivalent de derme dans un milieu de culture, la population de kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux inférieur d'au moins 10% au pourcentage d'une population standard de kératinocytes, (b) on met en contact au moins un actif cosmétique ou dermatologique avec les kératinocytes ou le milieu de culture immédiatement après ensemencement des kératinocytes, (c) on laisse l'équivalent d'épiderme se différencier, (d) on compare l'équivalent d'épiderme à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais sans l'actif à évaluer (e) on sélectionne les actifs pour lequel les caractéristiques de prolifération et/ou de régénération de l'équivalent d'épiderme sont augmentées par rapport à celles de l'équivalent d'épiderme témoin.
Ce procédé de criblage pourra être mis en oeuvre avec les populations de kératinocytes déplétées en cellules souches et/ou cellules progénitrices définies dans ce qui précède, et notamment avec des populations dans lesquelles le pourcentage de cellules clonogéniques est inférieur à 7%, mesuré par le test de clonogénicité.
Selon encore un autre aspect, l'invention se rapporte à un procédé de criblage d'actifs cosmétiques ou dermatologiques caractérisé en ce que (a) on ensemence une population de kératinocytes sur un équivalent de derme dans un milieu de culture, la population de kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux supérieur d'au moins 10% au pourcentage d'une population de kératinocytes standard, (b) on met en contact au moins un actif cosmétique ou dermatologique avec les kératinocytes ou le milieu de culture, (c) on laisse l'équivalent d'épiderme se différencier, (d) on compare l'équivalent d'épiderme à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais sans l'actif à évaluer (e) on sélectionne les actifs pour lequel les caractéristiques de prolifération et/ou de régénération et/ou d'homéostasie épidermique de l'équivalent d'épiderme sont diminuées par rapport à celles de l'équivalent d'épiderme témoin.
La même approche pourra être employée afin d'identifier des actifs qui pourrait avoir des effets néfastes sur la régénération cutanée et/ou l'homéostasie épidermique (équilibre physiologique entre la prolifération et la différentiation).
De façon analogue au procédé mettant en oeuvre des populations de kératinocytes déplétées, selon l'un des modes de réalisation du procédé de criblage utilisant des populations des kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux supérieur d'au moins 10% au pourcentage standard, à l'étape b), le ou les actifs à évaluer sont mis en contact avec les kératinocytes ou le milieu de culture immédiatement après ensemencement des kératinocytes. Selon un autre mode de réalisation du procédé de criblage, à l'étape b), le ou les actifs à évaluer sont mis en contact avec les kératinocytes ou le milieu de culture après culture des kératinocytes dans des conditions permettant la différenciation des cellules à au moins 2 stades différents (i.e. après avoir mise les échantillons à l'interface air-liquide).
Le temps de contact à l'étape c dans les différentes variantes des procédés de criblage sera adapté par l'homme du métier mais variera généralement de 1 à 50 jours, notamment de 6 à 25 jours.
Avantageusement, les procédés selon la présente invention comprennent une première étape au cours de laquelle on modifie le pourcentage de cellules clonogéniques et en particulier de cellules souches dans la population de kératinocytes totale, pour obtenir une population de kératinocytes dans laquelle le pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux est modifié d'au moins 10% par rapport au pourcentage d'une population standard. Cet enrichissement ou cette déplétion en cellules clonogéniques et notamment en cellules souches kératinocytaires, sera réalisée par des méthodes connues de l'homme du métier, et notamment décrites précédemment dans la présente demande.
L'invention sera illustrée plus en détail dans les exemples qui suivent.
Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes: Figure 1: Comparaison du potentiel clonogénique de kératinocytes Totaux (témoin), Adh+++ (fraction enrichie), et Adh-/+ (fraction déplétée).
Figure 2: Analyse des aspects qualitatifs (diamètre de clones, degré d'immaturité) de clones issus des populations kératinocytaires Adh+++ totaux, ou Adh"/+.
Figure 3: Reconstructions épidermiques sur derme mort dé-épidermisé (DED) ou derme vivant comprenant des fibroblastes cultivés au sein d'une lattice de collagène (lattice) Figure 4: Detection de cellules proliferatives (ki67+) dans les modèles de peau reconstruite réalisés à partir des populations kératinocytaires Adh+++ totaux, ou Adh-/+ (modèle DED). Figure 5: Analyse de l'impact d'un actif pro-régénérant sur le modèle de peau reconstruite déplétée en cellules clonogéniques. Figure 6: Analyse de l'impact d'un actif qui perturbe la régénération ainsi que l'homéostasie épidermique et plus précisément la différentiation sur le modèle de peau reconstruite enrichi en cellules clonogéniques.
Exemple 1 Isolement des kératinocytes à partir d'un prélèvement cutané Après élimination du tissu sous-cutané à l'aide d'un scalpel, le prélèvement cutané est découpé en fragments d'environ 5mm x 5mm, puis décontaminé par un traitement antibiotique-antimycotique (GIBCO Cat N° 15240-062)/Gentamycine (BIOCHROM AG Cat N°A2712), dans du milieu de culture DMEM (Life Technologies Ltd, Scotland). Pour permettre la séparation du derme de l'épiderme, le prélèvement est ensuite soumis à un traitement protéolytique (Dispase Il (Roche Cat N°10295825001)/Trypsine 0.25% (1 :250) (GIBCO Cat N°25050-14) 1 nuit à 4°C.. Les fragments d'épiderme séparés du tissu dermique sont placés dans une solution de trypsine Trypsine-EDTA lx (GIBCO Cat N°25300-054) 20 minutes à 37°C. L'effet de la trypsine est ensuite neutralisé par l'ajout d'un milieu de culture contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF) (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) (DMEM+10%SVF). La suspension cellulaire est homogénéisée, puis lavée dans du milieu de culture pour kératinocytes (Keratinocyte growth medium, KGM) (KGM Bullet Kit, BioWhittaker, Clonetics Corp., San Diego, CA, USA). Les cellules en suspension sont comptées au microscope à l'aide d'une cellule de Malassez. La viabilité des échantillons est estimée par la méthode d'exclusion au bleu Trypan (Life Technology, Cergy Pontoise Cedex, France).
Exemple 2: Enrichissement d'une préparation de kératinocytes en cellules souches et cellules proqénitrices de la couche basale de l'épiderme. La couche basale de l'épiderme contient les kératinocytes les plus immatures caractérisés par un fort potentiel régénératif. Cette population comprend les cellules souches et les cellules progénitrices. Ces cellules peuvent être séparées des kératinocytes plus matures sur la base de leur propriété d'adhésion rapide.
La suspension cellulaire est placée dans des flacons de culture préalablement recouverts avec du collagène de type I (solution de collagène de type I - Sigma Chemical Co Ltd, Irvine, UK- diluée d'un facteur 2 dans du PBS), à une densité de 200 000 cellules/cm2. Après 15 minutes, les kératinocytes n'ayant pas adhéré sont récupérées par lavage en tampon PBS. Les cellules adhérentes ainsi sélectionnées sont détachées du support par une trypsination (trypsine 0,05%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 3 à 5 minutes à 37°C). Après neutralisation de la trypsine (DMEM+10%SVF), les cellules sont récupérées, lavées, puis remises en suspension dans du milieu Green 7F. La fraction des cellules adhérentes sélectionnée par cette méthode représente environ 10% des kératinocytes totaux de l'épiderme.
Exemple 3: Tests clonoqéniques (test Colony Forminq Efficiency) Le test clonogénique est réalisé selon une méthode dérivée de celle décrite par Barrandon et Green (PNAS, 1985, 82: 5390-5394.)
Les boites de Pétri sont couverte par une couche de collagène de type I et incubée pendant 1 heure à 37°C. Le surplus de collagène est ensuite enlevé et la boité est rincé 2 fois avec du PBS (contenant du Mg2+ et du Cal+). Une couche nourricière de fibroblastes murines irradiés dans du milieu Green 7F est ensemencée dans chaque boite (26000 ce cellules 3T3i / cm2). Les boites sont cultivées à 37°C pendant 2h. Les kératinocytes sont ensuite ensemencés à faible densité (0,058 cellules / cm2 : 1000 cellules / boite de pétri de 58 cm2) afin d'obtenir des clones bien individualisés et aisément observables au microscope. Le milieu de culture est renouvelé à J4 et à J8 jusqu'à l'arrêt des expériences (6 à 12 jours). En fin de culture, les boites sont rincées au PBS et fixées à l'éthanol 70 % pendant 10min. Les boites sont ensuite colorées à l'éosine (Réactifs RAL Réf. 361640-1000) pendant 3-5min, puis rincées à l'eau, puis colorées au bleuRAL 555 (Réactifs RAL Réf. 361650-1000) pendant 3-5min, et rincées et laissées sécher. Les clones sont ensuite comptés et classés suivant leur diamètre.
La figure 1 montre la comparaison du potentiel clonogénique de kératinocytes totaux ("standard") avec une fraction enrichie (Adh+++) et un fraction déplétée (Adh-l+).
La population Adh+++ comprend plus de cellules clonogéniques et elle est donc considérée comme étant enrichie en cellules souches et cellules progénitrices.
L'analyse des aspects qualitatifs est représentée sur la figure 2.
La population Adh+++ comprend plus de cellules clonogéniques ayant un diamètre plus grand que 7 mm que la population standard (Totaux) confirmant l'enrichissement en cellules souches et cellules progénitrices. La population Adh-'+ comprend moins de cellules clonogéniques ayant un diamètre plus grand que 7 mm que la population standard (Totaux) confirmant la diminution en cellules souches et cellules progénitrices.
Exemple 4. Analyse de la pourcentage de cellules intégrine alpha 6f°rr/CD71faib'e par cytométrie en flux.
Les cellules sont en suspension monocellulaire dans du PBS/SAB 0.2% et sont conservées à 4°C pendant toute la durée de l'expérience, à l'abri de la lumière directe. Un Contrôle Isotypique (CIT) est réalisé pour chaque anticorps utilisé. Les sites non spécifiques sont saturés avec des Gamma Globulines de la même espèce que l'anticorps. La saturation se fait avec 3pL de gamma globuline (Code 015-000-002, Lot82104, Jackson ImmunoResearch) pour 100 000 cellules pendant 10min à 4°C.
Les immunomarquages sont réalises en utilisant les anticorps ci-dessous pendant 30 à 45mn sous agitation à 4°C avec 2pL de chaque anticorps ou de CIT pour 100 000 cellules de chaque population cellulaire à analyser. Marqueur Anticorps Référence Intégrine alpha 6 Rat Anti human cat555735 CD49f 1ot17123 BD Biosciences CIT Intégrine Rat IgG2a K Cat555843 alpha 6 Lot99177 BD Biosciences CD71 Mouse Anti human cat551374 CD71 1ot22544 BD Biosciences CIT CD71 Mouse IgG2a K Cat555576 Loti 4792 BD Biosciences Les cellules sont rincées à l'aide de PBS-SAB-0,2% puis centrifuger à 1200 tours/mn 10 mn 4°C. Un deuxième rinçage est réalisée au PBS-SAB-0,2% et les cellules sont à25 nouveau centrifuger. Ensuite les culots cellulaires sont resuspendues dans 400pL de PBS-SAB 0,2% et analysés au cytomètre en flux BD FACS Aria.
Les résultats de l'analyse par cytométrie en flux du pourcentage de cellules exprimant 5 l'intégrine alpha6f°r`/CD71faibie dans les populations Totaux (témoin), Adh+++ (fraction enrichie), et Adh"/+ (fraction déplétée) sont présentés sur le tableau suivant: Population kératinocytaire % de cellules intégrine analysée alpha6 fort/CD7lfaib~e Adh+++ 41,3 Totaux 6 ,4 Adh-'+ 4, 3 On constate une augmentation par un facteur de 6.5 du nombre de cellules intégrine 10 alpha 6f°r`/CD71fa'b'e dans la population Adh+++ par rapport à la population de kératinocytes totaux. Ce résultat confirme l'enrichissement en cellules souches dans la population Adh+++. En revanche, la population Adh-'+ présente 33% moins de cellules souches (cellules intégrine alpha 6f°rr/CD71faib'e) que dans la population de kératinocytes totaux..
15 Exemple 5: Préparation des modèles de peau reconstruite comprenant des quantités calibrés des cellules souches et des cellules proqénitrices Les sous populations des kératinocytes sont ensemencées à raison de 150 000 à 450 20 000 cellules dans du milieu type Green G7F sur la partie supérieure du support dermique préalablement placé dans un insert. Le substrat de culture utilisé est un derme humain dévitalisé et exempt d'épiderme ou un derme vivant comprenant des fibroblastes au sein d'une lattice de collagène (modèle tendu, production EPISKIN ).
25 Les sous-populations étudiées comprennent la population enrichie en cellules souches et cellules progénitrices (la population désignée Adh+++) et la population déplétée de ces mêmes cellules (la population désignée Adh-'+). Une population de kératinocytes totaux (i.e. des cellules qui n'ont pas subies une étape de sélection) sert comme un contrôle expérimental. Du milieu est ajouté en dessous et au dessus de chaque insert et 30 ce milieu est renouvelé tous les deux jours. Après 6-7 jours à 37°C dans une étuve à 5% CO2, le milieu sur la partie supérieure de l'échantillon est aspiré complètement et le milieu en dessous de l'insert est remplacé par un milieu moins riche en facteurs de croissance, type Green G3F. Ceci débute la phase d'émersion nécessaire pour l'induction de la stratification et la différenciation du compartiment épidermique. Les échantillons sont cultivés pendant 1-3 semaines à 37°C et 5% CO2; le milieu est renouvelé tous les deux jours.
Les peaux reconstruites obtenues à partir de différentes populations enrichies ou au contraire appauvries en cellules souches sont en figure 3. La population de kératinocytes Adh+++ enrichie en cellules souches et cellules progénitrices, a un potentiel régénératif plus important que la population standard (sans sélection d'une population quelconque, la population Totaux ). La population de kératinocytes Adh-'+, déplétée en cellules souches et cellules progénitrices, a un potentiel régénératif réduit en comparaison avec la population standard (sans sélection d'une population quelconque, la population Totaux ).
Exemple 6: Immunomarquaqe du ki67, marqueur de cellules prolifératives Les échantillons de peau reconstruites congelés dans un milieu d'enrobage (Tissue- Tek Sakura, n° 4583) et conservés à -80°C sont coupés au cryostat. Les coupes sont fixées dans l'acétone préablement refroidie à -20°C pendant 3 min puis séchées à l'air. Les sites non spécifiques sont saturés par incubation dans un tampon PBS sans Ca/Mg (ICN Biomedicals) additionné de 1% de BSA (Albumine Bovine fraction V, MP Biomedicals) et de 10% sérum de chèvre pendant 30 min à température ambiante. Les coupes sont ensuite incubées en présence de l'anticorps primaire spécifique (Ac antiki67, souris, Novocastra NCL-Ki67-MM1, 1/100) dilué dans du PBS/BSA 1% pendant 1h à température ambiante. Après lavages dans le PBS, les coupes sont incubées en présence de l'anticorps secondaire anti-souris-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1/800, PBS/1% BSA) pendant 1h. Les noyaux sont marqués par une incubation de 15 min avec l'iodure de propidium à 50 pg/mL. Les coupes sont à nouveau lavées dans le PBS, montées et observées au microscope à fluorescence. La figure 4 montre les résultats de marquage moléculaire obtenus dans des modèles de peau reconstruites obtenus à partir des différentes populations kératinocytaires.
Le modèle reconstruit avec la population enrichie en cellules souches et cellules progénitrices (Adh+++) comprend plus de cellules prolifératives (cellules positives pour le ki67) que le modèle reconstruit avec une population standard (totaux). Le modèle reconstruit avec la population déplétée en cellules souches et cellules progénitrices (Adh-/+) présente, tant à lui, moins de cellules prolifératives (ki67+) en comparaison avec le modèle reconstruit avec une population standard (totaux). Exemple 7: Application des aqents impactants le potentiel réqénératif et/ou l'homéostasie épidermique des échantillons de peaux reconstruites
Les agents à tester sont appliqués soit en topique (2mg/cm2) à partir du 3ième jour 10 d'émersion soit en systémique (dans le milieu de culture) dès l'ensemencement du support dermique avec des kératinocytes. L'application de l'agent est renouveler tous les 48h. Pour certains produits visqueux, un lavage est réalisé entre 4 et 24h après application. Des analyses histologiques (épaisseur de l'épiderme, organisation générale, 15 stratification, qualité de la couche basale etc.) ou immunohistochimiques (suivi des marqueurs de prolifération ou de différenciation) sont réalisées afin d'étudier l'impact de l'agent appliqué. La figure 5 montre l'effet d'un actif pro-régénérant, le C-3-D-xylopyranoside-2-hydroxy-propane, sur des modèles de peau reconstruite 20 préparés à partir soit d'une population présentant un nombre réduit de cellules clonogéniques - cellules souches et de cellules progénitrices (Fraction Adh"/+)- soit d'une population "standard" de kératinocytes (Kératinocytes totaux). Le modèle déplété en cellules souches et cellules progénitrices s'avère beaucoup plus sensible aux effets d'un actif pro-régénérant.
25 La figure 6 montre l'effet d'un actif, le rétinol, qui perturbe la régénération et l'homéostasie épidermique sur des modèles de peau reconstruite préparé à partir soit d'une population présentant une population enrichie de cellules clonogéniques (Fraction Adh+++)- soit d'une population "standard" de kératinocytes (Kératinocytes totaux). Le modèle enrichi en 30 cellules souches et cellules progénitrices s'avère beaucoup plus sensible aux effets de l'actif que le modèle fait avec une population standard de kératinocytes.5
Claims (14)
- Revendications1- Procédé d'évaluation in vitro de l'activité d'un agent sur le renouvellement de l'épiderme, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de préparation d'un équivalent d'épiderme en présence dudit agent à évaluer, et en ce que ledit équivalent d'épiderme est préparé à partir d'une population de kératinocytes dans laquelle le pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux est modifié d'au moins 10% par rapport au pourcentage de cellules clonogéniques d'une population standard.
- 2- Procédé d'évaluation selon la revendication 1 caractérisé en ce que le pourcentage de cellules clonogèniques de la population de kératinocytes utilisée pour préparer l'équivalent d'épiderme est supérieur d'au moins 10% au pourcentage d'une population de kératinocytes standard.
- 3- Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le pourcentage de cellules clonogéniques dans la population de kératinocytes utilisée pour préparer l'équivalent d'épiderme, mesuré par le test de clonogénicité est de 11 % à 50%.
- 4- Procédé d'évaluation selon la revendication 1 caractérisé en ce que le pourcentage de cellules clonogèniques de la population de kératinocytes utilisée pour préparer l'équivalent d'épiderme est inférieur d'au moins 10% au pourcentage d'une population de kératinocytes standard.
- 5- Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 ou 4, caractérisé en ce que le pourcentage de cellules clonogéniques de la population de kératinocytes utilisée pour préparer l'équivalent d'épiderme, mesuré par un test de clonogénicité, est inférieur à 7%.
- 6- Procédé d'évaluation selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'équivalent d'épiderme est préparé par ensemencement, dans un milieu de culture, d'un équivalent de derme par une population de kératinocytes, et en ce que ledit agent à évaluer est mis en contact des kératinocytes et/ou du milieu de culture dès l'ensemencement de kératinocytes.
- 7- Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent à évaluer est mis en contact avec l'équivalent d'épiderme et/ou le milieu de culture à un temps compris entre 2 jours et 21 jours après l'ensemencement de l'équivalent de derme par la population de kératinocytes et la mise de l'épiderme reconstruit à l'interface air-liquide.
- 8- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on compare l'équivalent d'épiderme obtenu en présence de l'agent à évaluer à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais en l'absence d'agent à évaluer.
- 9- Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'on mesure dans les équivalents d'épiderme, au moins un paramètre choisi parmi le nombre de cellules prolifératives, l'épaisseur ou le nombre de couches vivantes du compartiment épidermique, l'expression de marqueurs moléculaires de la couche basale (ex. ki67, l'intégrine alpha 6 ou beta 1, le MCSP), ou l'expression de marqueurs de différentiation des couches suprabasales (ex. transglutaminase, filagrinne).
- 10- Equivalent de peau susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend au moins un équivalent d'épiderme dont le pourcentage en cellules clonogèniques est modifié d'au moins 10% par rapport à un équivalent de peau standard, et au moins un agent cosmétique ou dermatologique.
- 11-Utilisation d'un équivalent de peau selon la revendication précédente pour déterminer le potentiel prolifératif et/ou régénératif d'un agent cosmétique ou dermatologique.
- 12- Procédé de criblage d'actifs cosmétiques ou dermatologiques caractérisé en ce que (a) on ensemence un équivalent de derme par une population de kératinocytes sur un équivalent de derme dans un milieu de culture, la population de kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogèniques inférieur d'au moins 10% au ratio d'une population standard de kératinocytes, (b) on met en contact au moins un actif cosmétique ou dermatologique avec les kératinocytes ou le milieu de culture, (c) on laisse l'équivalent d'épiderme se différencier, (d) on compare l'équivalent d'épiderme à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais sans l'actif à évaluer (e) on sélectionne les actifs pour lequel les caractéristiques de prolifération et/ou régénération de l'équivalent d'épiderme sont augmentées par rapport à celles de l'équivalent d'épiderme témoin.
- 13-Procédé de criblage d'actifs cosmétiques ou dermatologiques selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'à l'étape (a) on ensemence l'équivalent dederme avec une population de kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogèniques inférieur à 7%.
- 14- Procédé de criblage d'actifs cosmétiques ou dermatologiques caractérisé en ce que (a) on ensemence un équivalent de derme par une population de kératinocytes sur un équivalent de derme dans un milieu de culture, la population de kératinocytes présentant un pourcentage de cellules clonogèniques supérieur d'au moins 10% au ratio d'une population standard de kératinocytes, (b) on met en contact au moins un actif cosmétique ou dermatologique avec les kératinocytes ou le milieu de culture (c) on laisse l'équivalent d'épiderme se différencier, (d) on compare l'équivalent d'épiderme à un équivalent d'épiderme témoin obtenu dans les mêmes conditions mais sans l'actif à évaluer (e) on sélectionne les actifs pour lequel les caractéristiques de prolifération et/ou de régénération de l'équivalent d'épiderme sont diminuées par rapport à celles de l'équivalent d'épiderme témoin. 2946662 Procédé d'évaluation in vitro de l'activité d'un agent cosmétique ou dermatologique L'invention a pour objet un procédé d'évaluation in vitro de l'activité d'un agent sur le 5 renouvellement de l'épiderme, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de préparation d'un équivalent d'épiderme en présence dudit agent à évaluer, et en ce que ledit équivalent d'épiderme est préparé à partir d'une population de kératinocytes dans laquelle le pourcentage de cellules clonogéniques par rapport aux kératinocytes totaux est modifié d'au moins 10% par rapport au pourcentage de cellules clonogéniques d'une 10 population standard. L'invention concerne également un procédé de criblage d'actifs cosmétiques ou dermatologiques.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109475666A (zh) * | 2016-07-29 | 2019-03-15 | 欧莱雅 | 具有有区别的、并列的真皮隔室的皮肤等同物 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001072970A2 (fr) * | 2000-03-28 | 2001-10-04 | University Of Iowa Research Foundation | Methodes de preparation et d'utilisation de cellules souches epidermiques |
| WO2006047426A2 (fr) * | 2004-10-22 | 2006-05-04 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions, procedes et systemes de preparation d'une population de cellules enrichie en cellules souches |
-
2009
- 2009-06-16 FR FR0954031A patent/FR2946662B1/fr active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001072970A2 (fr) * | 2000-03-28 | 2001-10-04 | University Of Iowa Research Foundation | Methodes de preparation et d'utilisation de cellules souches epidermiques |
| WO2006047426A2 (fr) * | 2004-10-22 | 2006-05-04 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions, procedes et systemes de preparation d'une population de cellules enrichie en cellules souches |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DUNNWALD M ET AL: "Isolating a pure population of epidermal stem cells for use in tissue engineering", EXPERIMENTAL DERMATOLOGY, BLACKWELL MUNSGAARD, COPENHAGEN; DK, vol. 10, no. 1, 1 February 2001 (2001-02-01), pages 45 - 54, XP002182788, ISSN: 0906-6705 * |
| JANES S M ET AL: "EPIDERMAL STEM CELLS", JOURNAL OF PATHOLOGY, JOHN WILEY & SONS LTD, GB, vol. 197, no. 4, 1 July 2002 (2002-07-01), pages 479 - 491, XP009036659, ISSN: 0022-3417 * |
| STRACHAN LAUREN R ET AL: "Rapid adhesion to collagen isolates murine keratinocytes with limited long-term repopulating ability in vivo despite high clonogenicity in vitro", STEM CELLS, ALPHAMED PRESS, DAYTON, OH, US, vol. 26, no. 1, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 235 - 243, XP009128511, ISSN: 1066-5099, [retrieved on 20071011] * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109475666A (zh) * | 2016-07-29 | 2019-03-15 | 欧莱雅 | 具有有区别的、并列的真皮隔室的皮肤等同物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2946662B1 (fr) | 2013-06-28 |
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