FR2945866A1 - Nouveau procede de detection de composes cibles. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection d'un composé cible d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) disposer d'une solution contenant des nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, qui possède au moins une fonction ou site de reconnaissance lui permettant de réagir ou interagir avec le composé cible d'intérêt, b) mettre en contact la solution contenant des nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, avec l'échantillon d'intérêt, c) récupérer les nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, susceptible d'avoir réagi avec le composé cible, redisperser les nanoparticules récupérées dans une solution de référence, d) disposer la solution obtenue à l'étape c) en un point d'un canal et mesurer le temps que met la solution pour atteindre, par remplissage capillaire, un autre point donné du canal, e) comparer le temps mesuré avec un temps de référence, pour conclure à la présence ou à l'absence du composé cible.

Description

La présente invention concerne une nouvelle méthode de détection de composés cibles, pouvant être utilisée dans différents domaines, par exemple dans le domaine diagnostic, agroalimentaire, environnemental, industriel. Dans ces différents secteurs, il est très souvent recherché des méthodes permettant de détecter la présence d'un composé cible, dans un échantillon. Dans le cas où le composé cible correspond à un ligand biologique, sa reconnaissance est, par exemple, réalisée grâce à une réaction antigène-anticorps (immunodétection) ou grâce à une réaction d'hybridation avec l'oligonucléotide complémentaire. Afin de quantifier cette reconnaissance, les techniques actuelles ont, le plus souvent, recours à un marquage par une sonde fluorescente, soit des brins d'ADN contenus dans l'échantillon (puces à ADN), soit de l'anticorps complémentaire de l'antigène contenu dans l'échantillon (tests ELISA, tests western blot). La détection par fluorescence permet d'atteindre de basses limites de détection, mais elle nécessite des réactifs marqués chers et présente certains artéfacts, en particulier le photoblanchiement des sondes fluorescentes. D'autres tests par immunoagglutination sur latex ont également été développés, mais le temps de réponse est relativement long. Un des objectifs de l'invention est de proposer une nouvelle méthode permettant la détection, voire même de quantification si besoin, d'un composé cible d'intérêt, par exemple d'un ligand biologique, dans des échantillons notamment biologiques, agroalimentaires ou environnementaux. Le procédé selon l'invention se doit d'être rapide, fiable, facile à mettre en oeuvre et avantageux économiquement.

Dans ce contexte, la présente invention concerne un procédé de détection d'un composé cible d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes a) disposer d'une solution contenant des nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, qui possède au moins une fonction ou site 30 de reconnaissance lui permettant de réagir ou interagir avec le composé cible d'intérêt, b) mettre en contact la solution contenant des nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, avec l'échantillon d'intérêt, c) récupérer les nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, susceptible d'avoir réagi avec le composé cible, et redisperser les nanoparticules récupérées dans une solution de référence, d) disposer la solution obtenue à l'étape c) en un point d'un canal et mesurer le temps que met la solution pour atteindre, par remplissage capillaire, un autre point donné du canal, e) comparer le temps mesuré avec un temps de référence, pour conclure à la présence ou à l'absence du composé cible. La détection des composés cibles en solution se fait en utilisant les interactions existant entre la surface interne du canal et le liquide contenant une suspension de particules fonctionnalisées avec un composé, nommé sonde, susceptible de réagir ou de se lier avec le composé cible d'intérêt. La présence d'une réaction sonde-cible modifie la surface des particules et donc son interaction avec la surface interne du canal et, par voie de conséquence, la vitesse de remplissage, par capillarité, du canal. Le procédé selon l'invention utilise donc la microfluidique, qui peut se définir comme l'étude et l'exploitation des écoulements de fluides dans des canaux dont les dimensions sont généralement de l'ordre de quelques dizaines de microns au maximum, dans le sens de la profondeur le plus souvent. La réaction cible/sonde entraine une variation de la tension superficielle du liquide en fonction de sa composition, ce qui modifie la vitesse de remplissage, par capillarité, du microcanal. Dans le cadre de l'invention, la mesure du temps de remplissage joue le rôle de capteur de la cible d'intérêt. La comparaison de la vitesse obtenue avec un temps de référence permet de conclure si la cible est présente ou pas. Le temps de référence correspond au temps de remplissage d'un canal identique, obtenu sur un parcours identique, avec une solution de nanoparticules identiques porteuses d'au moins un composé sonde dans la solution de référence. En l'absence de variation, on peut conclure en l'absence du composé cible. Une variation significative, qui dépend de la méthode de mesure (de quelques dixièmes de seconde à quelques minutes), permet de conclure en la présence du composé cible. Le procédé de détection selon l'invention présente de nombreux avantages : une très grande simplicité de mise en oeuvre, un très bas coût, des volumes très faibles (de l'ordre de quelques microlitres) et une rapidité de mise en oeuvre, contrairement notamment aux tests d'immunoagglutination et surtout la possibilité de pouvoir effectuer la mesure sur site (zones difficiles d'accès, pays pauvres, etc...). De plus, par rapport aux méthodes mettant en oeuvre une puce ADN ou un test ELISA ou encore un test Western Blot, le procédé selon l'invention ne nécessite pas de marquage avec une sonde fluorescente, comme c'est le cas pour les puces à ADN avec les brins d'ADN contenus dans l'échantillon ou pour les tests ELISA ou Western Blot avec l'anticorps complémentaire de l'antigène contenu dans l'échantillon.

En préalable à une description plus détaillée de l'invention, les définitions de certains termes utilisés dans la présente demande de brevet sont données ci-après. Par "composé cible d'intérêt", on entend tout type de composé, molécule ou entité, naturelle ou synthétique, dont il peut être intéressant de détecter la présence. Il peut, par exemple, s'agir de ligands biologiques. La détection de tels ligands biologiques, peut être de manière connue, utile notamment dans les domaines du biomédical (diagnostic, suivi thérapeutique, dialyse rénale,...), de l'agroalimentaire, de l'environnement (analyse de l'eau potable, suivi de ressources en eau,...). Il peut également s'agir de polluants ou d'additifs susceptibles d'être présents dans des hydrocarbures utilisables, en tant que carburants. Par "ligand biologique", on entend les composés naturels et les composés présentant un intérêt biologique. A titre d'exemples de ligands biologiques, on peut, notamment citer les polynucléotides, les polypeptides, les protéines, notamment les anticorps et les antigènes, les sucres, les vitamines, les hormones, la biotine, la streptavidine. Les ADN, ARN, récepteurs membranaires, acides aminés, urée, glucose, sont quelques exemples plus précis. Le terme "polynucléotide" signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée telle que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique, au niveau du squelette. A titre d'exemple de polynucléotide, on peut citer les oligonucléotides, les acides nucléiques naturels ou encore obtenus par une technique d'amplification enzymatique, les ADN, ARN ribosomiques, ARN messagers, ARN de transfert. Par "polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Les acides aminés en question peuvent être des acides aminés naturels soit primaires codant pour les protéines, soit non codant pour les protéines, ou encore des acides aminés naturels modifiés tels que des acides aminés, dont certaines des fonctions chimiques sont protégées, ou des acides aminés modifiés par action enzymatique.

Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines, les enzymes, les récepteurs, les complexes enzyme/substrat, les glycoprotéines, les anticorps, les antigènes. Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Par " nanoparticule", on entend une particule de taille nanométrique Ces nanoparticules peuvent être de n'importe quelle forme. De préférence, les nanoparticules utilisées présentent une plus grande dimension comprise dans la gamme allant de 1 à 1000 nm, de préférence de 100 à 300 nm, dimension mesurée par microscopie à force atomique ou par microscopie électronique à transmission ou à balayage. Les particules de forme sphérique sont, néanmoins, préférées. Les nanoparticules sont porteuses d'au moins un, de préférence de 1 à 1000000 et préférentiellement de 10000 à 1000000, composés sondes qui possèdent au moins une fonction ou site de reconnaissance leur permettant de réagir ou interagir avec le composé cible d'intérêt. Quelques exemples de couples composés cibles/composés sondes sont donnés ci-après : antigène/anticorps, anticorps/antigène, ADN simple brin/ADN simple brin complémentaire, biotine/streptavidine, recepteur/ligand,... Par "surface hydrophobe", on entend, par exemple, une surface dont l'angle de contact avec l'eau est typiquement supérieur ou égal à 90° (angle droit). Ces angles de contact sont, par exemple, déterminés en déposant, à l'aide d'une microseringue, une goutte d'eau sur la surface plane en question, puis l'angle de contact est mesuré à partir des dimensions de la goutte, selon une méthode bien connue de l'homme de l'art. (W.Gutowski, Fundamentals of Adhesion, L.H. Lee Ed., Plenum Press, New York, 1991). De même, par "surface hydrophile", on entend, par exemple, une surface dont l'angle de contact avec l'eau est typiquement inférieur à 90° (angle droit). Les échantillons susceptibles d'être utilisés dans le cadre de l'invention peuvent être liquides ou solides. Dans le cas d'échantillons solides, une mise en forme pourra être nécessaire, par broyat par exemple. Il peut s'agir d'échantillons biologiques (tissus, sang , urine, salive, lymphe, etc...), alimentaires, de tout type de prélèvements dans le sol, l'eau, d'échantillons issus de carburants. Le procédé selon l'invention prévoit de mettre, préalablement en présence, l'échantillon à étudier susceptible de contenir le composé cible d'intérêt avec une solution contenant des nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, qui possède au moins une fonction ou site de reconnaissance lui permettant de réagir ou interagir avec le composé cible d'intérêt. La nature de la solution contenant les nanoparticules doit permettre l'interaction entre la sonde et la cible. La mise en contact ou la mise en présence, par exemple par mélange, de la solution contenant les nanoparticules et de l'échantillon, est réalisée dans des conditions permettant aux composés cibles et aux composés sondes de réagir, par liaison covalente, ou de se lier par d'autres types de liaison forte, par exemple du type ionique, polaire, Van der Waals, hydrogène. Notamment, dans le cas de couple ADN sonde/ADN cible ou antigène/anticorps, les conditions d'incubation classiques pourront être utilisées. Ensuite, une solution de référence contenant les nanoparticules, susceptibles d'être porteuses de la molécule cible d'intérêt après interaction avec l'échantillon, est déposée dans un canal dans lequel cette solution va se propager spontanément, et le temps de remplissage du canal, ou plus précisément entre deux point du canal, nommé point de départ à point d'arrivée, est mesuré. La solution est déposée, par exemple, à l'entrée du canal, et la solution va alors se propager dans ce dernier. Le volume de solution, qui peut représenter, notamment de 0,1 à 1000 pl, est par exemple déposé avec une micropipette.

La présence de la cible d'intérêt, qui a réagi avec la sonde présente en surface des nanoparticules, influe sur l'état de surface des nanoparticules, et donc sur la vitesse de remplissage du canal dans laquelle est réalisée la mesure. Le temps de remplissage obtenu est comparé à un temps de référence, ce qui permet de déterminer qualitativement et/ou quantitativement, l'absence ou la présence de la cible, et éventuellement sa concentration dans l'échantillon étudié. Le temps de référence correspond au temps de remplissage d'un canal identique, obtenu sur un parcours identique, avec une solution de nanoparticules identiques porteuses d'au moins un composé sonde dans la solution de référence. La concentration des nanoparticules et la solution dans laquelle elles se trouvent doivent être la même pour la mesure de référence et pour celle concernant le composé d'intérêt, pour que le seul paramètre susceptible de modifier le temps de remplissage soit l'interaction du composé sonde avec le composé cible éventuellement présent. Aussi, une fois que la solution a été mise en contact, pendant un temps suffisant, par exemple entre une minute et deux heures, avec l'échantillon à étudier, les nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, susceptible d'avoir réagi avec le composé cible, sont récupérées et redispersées dans une solution de référence. Cette récupération peut se faire par filtration ou par toute autre technique adaptée. L'étape de récupération doit offrir la possibilité d'extraire de manière simple et fiable l'ensemble des nanoparticules de la solution de mise en contact. Aussi, tout type de nanoparticules, susceptibles d'être collectées de manière simple et fiable à partir d'une dispersion, convient. Néanmoins, des nanoparticules magnétiques préalablement fonctionnalisées avec un composé sonde spécifique permettant d'interagir directement avec la cible susceptible d'être présente dans l'échantillon, seront de préférence utilisées. De telles particules magnétiques sont, par exemple, constituées d'un coeur en ferrite recouvert d'un polymère. Il est également possible d'utiliser des particules avec un coeur en nickel ou en tout autre matériau susceptible d'interagir avec un champ magnétique, par exemple un aimant. On pourra, par exemple, se référer à Colloidal Nanoparticles In Biotechnology , Abdelhamid Elaissari, 2008, John Wiley & Sons, INC, pour plus de détails. Leur caractère magnétique permet une séparation aisée du milieu réactionnel, séparation qui peut être réalisée à l'aide d'un aimant. D'une manière générale, on pourra utiliser des nanoparticules à base de tout type de matériau magnétique ou sensible à toute autre interaction. Le dit matériau sera soit lui-même fonctionnalisable avec le composé sonde, soit recouvert d'un enrobage fonctionnalisable. De façon avantageuse, un lavage des nanoparticules obtenues après réaction avec l'échantillon d'intérêt est réalisé, pour éviter des interactions non spécifiques et éliminer les molécules ou espèces cibles n'ayant pas réagi, ainsi que toute autre molécule ou espèce présente dans l'échantillon pouvant modifier la tension interfaciale de la solution. Les nanoparticules séparées et lavées sont remises dans une solution de référence, et la mesure du temps de remplissage est alors réalisée. La solution de référence est notamment une solution aqueuse dans le cas où les composés cibles sont hydrophiles et, est, par exemple de l'eau pure. Dans le cas où les composés cibles sont hydrophobes, la solution de référence pourra être un solvant organique tel que l'acétonitrile, l'éthanol, le méthanol, ou tout autre solvant typiquement utilisé en chimie organique. La mesure du temps de référence peut être réalisée en amont et être enregistrée pour servir de référence pour plusieurs mesures. Il est également possible et préféré de réaliser la mesure de référence, de manière rapprochée dans le temps avec la mesure concernant l'échantillon d'intérêt et/ou de réaliser une mesure de référence pour chaque nouvelle mesure sur un échantillon d'intérêt. Le même canal ou deux canaux différents, mais en tout point identique, pourront être utilisés pour les deux mesures. Il existe une relation linéaire entre le temps de remplissage du canal et la concentration en molécule cible d'intérêt, de sorte qu'une étape de calcul à partir du temps mesuré permet de déterminer la concentration du composé cible d'intérêt dans l'échantillon et le procédé selon l'invention peut inclure une telle étape de calcul. Le canal dans lequel la solution est disposée peut être réalisé sur tout type de format de support, notamment sous les formats classiques connus dans le domaine des puces microfluidiques, cartouches d'analyse qui peuvent se présenter sous diverses formes, par exemple carrée, rectangulaire ou circulaire. Ces puces microfluidiques sont constituées d'un support et éventuellement d'un couvercle, le support étant muni d'un seul ou d'une pluralité de canaux. Le couvercle sera alors, par exemple, troué au niveau de l'entrée du canal dans lequel la solution doit être déposée. Dans le cas où plusieurs canaux sont présents, ces derniers seront de préférence identiques, de manière à mener, en parallèle, les mesures concernant les échantillons à analyser et l'échantillon de référence la ou les canaux peuvent être également rectiligne(s) ou présenter des zones courbes ou encore de ralentissement correspondant à un élargissement du canal. Un point de détection (par exemple un marquage optique ou des électrodes) sera, avantageusement, présent au niveau des points correspondants au début et à la fin du processus de remplissage capillaire. Les supports dans lesquels les canaux sont réalisés dans le cadre de l'invention pourront être ceux classiquement utilisés dans le domaine des puces microfluidiques, des cartouches d'analyse et des biopuces. Les canaux sont, avantageusement, de taille micrométrique sur l'une au moins de leurs dimensions et, de préférence présentent une profondeur ou une largeur inférieure à 100 dam. Plus précisément, la profondeur des canaux sera comprise entre 0,lpm et 500pm, leur largeur sera comprise entre lpm et 10cm et leur longueur sera comprise entre 100pm et 1m. Les canaux pourront être réalisés par usinage, par gravure, par pressage à chaud, par moulage, par microablation, par injection, ou par lithographie ou par toutes techniques appropriées, par exemple utilisées dans le domaine des semi-conducteurs, du verre, et des matériaux polymères. A titre d'exemple de matériau pouvant être utilisé dans le cadre de l'invention, on peut citer le PDMS (polydiméthylsiloxane), le verre, le quartz, le silicium, les polystyrènes, les matériaux plastiques du type polycarbonate ou oléfine (Cyclo-Oléfine-Copolymère). Ces matériaux pourront être modifiés chimiquement ou physiquement, par exemple, sous l'action d'un greffage ou d'un traitement plasma, pour modifier les caractéristiques de surface du matériau et obtenir une surface, par exemple, hydrophile. Afin que les solutions disposées dans les canaux circulent spontanément dans ces derniers, depuis un premier point de référence, jusqu'à atteindre le point donné, choisi comme fin du temps de remplissage, il faut qu'il existe des interactions privilégiées entre la surface interne du canal et la solution déposée. La surface du canal doit être de nature à faciliter la propagation par capillarité de la solution. Le composé d'intérêt peut être de nature hydrophile (par exemple, dans le cas d'un ligand biologique précédemment décrit) ou hydrophobe (par exemple, dans le cas des polluants ou additifs des hydrocarbures susceptibles d'être utilisés en tant que carburants ou des polluants ou additifs des huiles comestibles).

La solution de référence peut être une solution aqueuse, ou hydrophobe. II est possible d'utiliser une solution de référence hydrophile, avec des composés cibles hydrophiles ou hydrophobes. De même, il est possible d'utiliser une solution de référence hydrophobe, avec des composés cibles hydrophiles ou hydrophobes. L'important est que la solution contenant les nanoparticules porteuses du composé sonde, tout comme la solution susceptible de contenir les nanoparticules porteuses du composé sonde lié au composé sonde, pénètre spontanément dans les microcanaux, certes avec des vitesses de remplissage différentes. Aussi, lorsque la solution de référence est hydrophile, le ou les matériaux constitutifs de la partie du support délimitant le canal sont choisis de manière à ce que la surface du canal en contact avec la solution soit, au moins sur une majeure partie, hydrophile. Par majeure partie, on entend au moins 50% de la surface interne du canal sur laquelle circule la solution déposée. La surface du canal en contact avec la solution aqueuse est, au moins sur une majeure partie, en un matériau choisi parmi le PDMS traité pour présenter une surface hydrophile, le verre, etc... Les polymères sélectionnés peuvent être fonctionnalisés, si besoin, de manière à être hydrophiles. Le fond du support sur lequel est aménagé le canal doit être de nature hydrophile, tout comme le couvercle, mais les parois elles peuvent être hydrophobes, comme c'est le cas notamment du support utilisé aux exemples 2 et 3 ci-après. L'important est que la surface du canal soit, en quelque sorte, globalement hydrophile, de manière à avoir des interactions hydrophiles avec la solution déposée et permettre le remplissage spontané du canal.

Par contre, lorsque la solution de référence est une solution hydrophobe, notamment huileuse, le ou les matériaux constitutifs de la partie du support délimitant le canal sont choisis de manière à ce que la surface du canal en contact avec la solution est, au moins sur une majeure partie, hydrophobe. Dans ce cas, la surface du canal en contact avec la solution est, au moins sur une majeure partie, en un matériau choisi parmi les polymères et par exemple, le PDMS, ou encore en silicium ou en verre fonctionnalisé pour être hydrophobe (par exemple avec des silanes fluorés).

Les polymères sélectionnés peuvent être fonctionnalisés, si besoin, de manière à être hydrophobes. La mesure du temps de remplissage du canal peut être réalisée de façon extrêmement simple à l'oeil, par exemple avec un chronomètre. Bien entendu, pour une mise en oeuvre plus performante et fiable, il pourra être fait appel à un dispositif automatique, notamment de mesure d'avancée, mettant en oeuvre, par exemple, une caméra et un logiciel approprié. Il est également possible d'utiliser une détection électrique, ou encore une mesure optiques simple, du type absorbance ou fluorescence, notamment.

La description qui précède met en évidence que le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre sur un système léger, transportable qui nécessite de faibles volumes d'échantillon, telles que des plaques porteuses de canaux de taille micrométrique. De plus, sa mise en oeuvre est rapide et ne nécessite pas de marquage préalable de l'échantillon à étudier. De plus, le procédé selon l'invention peut être conduit à température ambiante. Les nanoparticules fonctionnalisées porteuses de la molécule ou espèce sonde, susceptibles d'interagir avec la molécule ou l'espèce sonde sont stables et pourront être conservées pendant une durée prolongée. De plus, le procédé selon l'invention offre de nombreuses applications, notamment, applications dans l'analyse biomédicale, l'analyse vétérinaire, le contrôle de microorganismes pathogènes dans l'agroalimentaire et dans l'environnement. Les exemples, en référence aux Figures annexées, ci-après permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif.

La Figure 1 représente schématiquement, la géométrie des canaux présents sur le support utilisés à l'exemple 1. Les Figures 2, 3, 4, 5 et 6 présentent différentes mesures de temps de remplissage.

Exemple 1 Détection de biotine Les trois liquides (solution 1, solution 2 et solution 3) suivants : •De l'eau (solution 1) •De l'eau avec des particules magnétiques modifiées en surface par la streptavidine diluées dans l'eau 20 fois d'une solution initiale à 5mg/ml (solution 2). Ces nanoparticules sont commercialisées par la société ADEMTECH SA ( BioAdemBeads Streptavidin ) •De l'eau avec la même concentration de nanoparticules magnétiques mais qui ont préalablement interagi avec une solution de biotine à 2,66 10-3 M. (solution 3) ont été injectés au niveau de l'entrée E, (symbolisée par les ronds blancs) dans les trois canaux micro-usinés, présentant une zone de ralentissement R (symbolisée par les ronds noirs), tels que représentés schématiquement sur la Figure 1 dans une puce en PDMS ( Sylgard 184 ) rendue hydrophile par un traitement plasma 02. Les dimensions des canaux sont les suivantes : 35pm de profondeur, 300 Lam de largeur, 22,15 cm entre les deux repères d'avancée D et F, permettant respectivement d'indiquer le début et la fin de la mesure du temps de remplissage. Un volume total de 2325 nl de chaque solution a été introduit dans un des trois canaux. Les temps de remplissage suivants ont été obtenus : Temps de remplissage canal 1 (solution 1) : 231,32s 0,81s Temps de remplissage canal 2 (solution 2) : 270,0s 8,3s Temps de remplissage canal 3 (solution 3, concentration initiale en biotine : 3,25x10-4M) : 300,5s Temps de remplissage canal 3' (solution 3', concentration initiale en biotine : 1,32x10-3M) : 312,7s Ces résultats confirment bien que toute modification au niveau de la surface des nanoparticules magnétiques entraîne une modification de la vitesse d'écoulement dans des microcanaux en PDMS, dans le cas de l'interaction biologique avidine-biotine.

Exemple 2 a) Description de la fabrication de la puce. De la résine bleue photosensible (Etertec IiQ-6100, Chimie Tech Service - CTS) est utilisée pour la fabrication des puces. La résine bleue est laminée sur une lame de verre et irradiée pendant 4s en présence d'un masque de photolithographie correspondant à la forme des canaux désirés. Après révélation, des canaux creusés à l'intérieur de la résine sont obtenus (300pm de large, 35pm de profondeur et 4cm de longueur). Après révélation, la lame de verre porteuse des canaux en résine bleue est irradiée de nouveau pendant 2,5 s. Une lamelle de verre est, ensuite, utilisée pour couvrir la lame recouverte avec la résine bleue et ainsi fermer les canaux. La lamelle de verre est ouverte au niveau de l'entrée du canal. L'ensemble est collé efficacement sous presse chauffante à 90°C, sous une pression de 15 bars pendant 2 min. Le temps d'insolation et les paramètres de collage ont été optimisés.

Plusieurs barèmes de collage ont été étudiés (temps, température, pression). Les températures testées sont (80, 90 et 100°C), la pression (10, 15 et 20 bars) et le temps (1, 1,5, 2 et 3 min) et les meilleurs paramètres de collage sélectionnés sont : 90°C, 2 min, 15 bars. Des tests de remplissage des canaux avec de l'eau ont montré la bonne entrée du liquide à l'intérieur des canaux et, également, validé la possibilité de réutiliser la puce plusieurs fois, ce qui n'est pas possible avec une puce réalisée en PDMS.

b) Détection de la bactérie E.CoIi La détection de la bactérie E. Coli est basée sur une interaction antigène- anticorps. Le protocole suivant a été utilisé: -préparation d'une solution de nanoparticules à 5mg /ml (dans du tampon PBS) diluée 40 fois dans l'eau. Ces nanoparticules sont commercialisées par la société ADEMTECH SA ( BioAdemBeads Streptavidin ) -addition à la solution de nanoparticules 20 pi d'une solution (solution PBS 0,01M, pH 7,2) d'anticorps polyclonaux biotinylés à 1 mg/ml (Anticorps anti-E.coli biotinylé commercialisé par la société ABCAM (ab20640)) -incubation 1 h à 4°C -récupération des nanoparticules à l'aide d'un aimant -lavage 3 fois à l'eau -suspension des nanoparticules dans des solutions (milieu de culture) de bactéries à 102, 103, 104 et 105 UFC (nommées respectivement bact 1, bact 2, bact 3 et bact 4 sur la Figure 5). (Bactérie E.Coli Collection de l'Institut Pasteur CIP 76.24) - récupération des nanoparticules avec un aimant Les résultats obtenus sont présentés Figures 2, 3, 4 et 5. La Figure 2 montre, différentes mesures, du temps de remplissage d'un même canal microfluidique avec de l'eau ultra-pure (deux mesures : eau 1 et eau 2) et met en évidence la bonne répétabilité du temps de remplissage avec une variation ne dépassant pas les 0,44s avec une moyenne de temps de remplissage de 24,47s et un écart type de 0,31s. La Figure 3 représente les temps de remplissage d'un canal avec la solution de nanoparticules porteuses d'anticorps polyclonaux biotinylés, en l'absence de réaction avec des bactéries cibles (quatre mesures : eau bille 1, eau bille 2, eau bille 3, eau bille 4). La bonne répétabilité est confirmée avec une variation de 0,81 s, une moyenne de 27,38 s et un écart type de 0,36. La Figure 4 compare la moyenne des temps de remplissage obtenus avec de l'eau (moy eau) et la solution aqueuse de nanoparticules (moy billes) et montre une variation significative entre les temps de remplissage obtenus dans chacun des cas, cette variation étant bien supérieure aux variations obtenues (diff billes-eau), dans le cas de plusieurs mesures réalisées avec une solution de nanoparticules (diff billes-billes). La Figure 5 présente les mesures de vitesse obtenues dans le cas de la détection de différentes concentrations d'E.Coli et montre que plus la concentration de bactéries augmente, plus le temps de remplissage est important. Il existe une relation linéaire entre le temps de remplissage et le log de la concentration en bactéries, ce qui permet de quantifier le nombre de bactéries présentes dans l'échantillon.

Exemple 3 Détection de l'ADN du virus HIV Le virus du sida est détecté par le biais de son ADN. Pour ce faire, de l'ADN biotinylé est utilisé comme ADN sonde et des brins d'ADN complémentaire comme ADN cible. Les séquences des ADN cibles et sondes sont les suivantes : HIV ADN sonde: GAGACCATCAATGAGGAAGCTG6iotine HIV ADN cible: ATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC La préparation des échantillons est faite comme suit : -préparation d'une solution de nanoparticules magnétiques à 5 mg/ml (dans tampon PBS) diluée 40 fois. Ces nanoparticules sont commercialisées par la société ADEMTECH SA ( BioAdemBeads Streptavidin ) -incubation de cette solution avec 20 pl d'une solution (solution tampon PBS 0,01M, pH 7,2) d'ADN sonde à 70,37 nmole/ml pendant 1 h à 4°C - récupération des nanoparticules et lavage, de manière analogue à l'exemple 2, -incubation des nanoparticules fonctionnalisées avec différentes concentrations d'ADN cible (4,09 nmole/ml, 8,19 nmole/ml et 16,38 nmole/ml nommées respectivement ADN cible 1, ADN cible 2 et ADN cible 3 sur la Figure 6) (solution tampon PBS 0.01M, pH 7.2) Les variations engendrées par la fixation de l'ADN sonde (billes ADN biot sur la Figure 6) et de l'hybridation de l'ADN cible (ADN cible 1, ADN cible 2 et ADN cible 3 sur la Figure 6) ont été observées et les résultats obtenus sont présentés Figure 6. L'analyse des résultats montre que la fixation de l'ADN sur les nanoparticules augmente le temps de remplissage des canaux. Cette variation est d'autant plus importante que la concentration d'ADN cible est importante. La variation est directement proportionnelle à la concentration d'ADN.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1 - Procédé de détection d'un composé cible d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) disposer d'une solution contenant des nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, qui possède au moins une fonction ou site de reconnaissance lui permettant de réagir ou interagir avec le composé cible d'intérêt, b) mettre en contact la solution contenant des nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, avec l'échantillon d'intérêt, c) récupérer les nanoparticules porteuses d'au moins un composé sonde, susceptible d'avoir réagi avec le composé cible, redisperser les nanoparticules récupérées dans une solution de référence, d) disposer la solution obtenue à l'étape c) en un point d'un canal et mesurer le temps que met la solution pour atteindre, par remplissage capillaire, un autre point donné du canal, e) comparer le temps mesuré avec un temps de référence, pour conclure à la présence ou à l'absence du composé cible.
2. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la solution de référence est une solution aqueuse et en ce que la surface du canal en contact avec la solution est, au moins sur une majeure partie, hydrophile.
3. 3 - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que la surface du canal en contact avec la solution est, au moins sur une majeure partie, en un matériau polymère, tel que le PDMS traité pour présenter une surface hydrophile, en verre, ou en un polymère éventuellement fonctionnalisé de manière à être hydrophile_
4. 4 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le composé cible est un ligand biologique.
5. 5 - Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le ligand biologique est choisi parmi les polynucléotides, les polypeptides, les protéines, notamment les anticorps et les antigènes, les sucres, les vitamines, les hormones, la biotine, la streptavidine.
6. 6 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la solution de référence est une solution hydrophobe, notamment huileuse, et en ce que la surface du canal en contact avec la solution est, au moins sur une majeure partie, hydrophobe.
7. 7 - Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que la surface du canal en contact avec la solution est, au moins sur une majeure partie, en un matériau choisi parmi le PDMS, le verre fonctionnalisé de manière à être hydrophobe, ou un polymère éventuellement fonctionnalisé de manière à être hydrophobe.
8. 8 - Procédé selon la revendication 6 ou 7 caractérisé en ce que le composé cible est choisi parmi les polluants ou additifs des hydrocarbures susceptibles d'être utilisés en tant que carburants, ou les polluants ou additifs des huiles comestibles.
9. 9 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le canal est de taille micrométrique sur au moins l'une de ses dimensions.
10. 10 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont magnétiques.
11. 11 - Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que les nanoparticules sont, au moins pour partie, constituées de ferrites ou nickel.
12. 12 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le temps de référence correspond au temps de remplissage d'un canal identique, obtenu sur un parcours identique, avec une solution de nanoparticules identiques porteuses d'au moins un composé sonde dans la solution de référence.
13. 13 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend une étape de calcul à partir du temps mesuré permettant de déterminer la concentration du composé cible d'intérêt dans l'échantillon.
14. 14 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la mesure de la vitesse est effectuée au moyen d'un dispositif automatisé, intégrant une caméra.
15. 15 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que la mesure de la vitesse est effectuée par mesure électrique ou optique.