FR2945820A1 - GENE PANEL FOR THE PROGNOSIS OF PROSTATE CANCER - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une plaque microfluidique permettant le diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate, ainsi qu'une méthode de diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate basée sur l'utilisation d'une telle plaque. Plus particulièrement, la plaque microfluidique selon l'invention permet d'analyser le niveau d'expression des gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 par RT-qPCR.The present invention relates to a microfluidic plate for the diagnosis and / or prognosis of prostate cancer, as well as a method of diagnosis and / or prognosis of prostate cancer based on the use of such a plaque. More particularly, the microfluidic plate according to the invention makes it possible to analyze the level of expression of the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes. by RT-qPCR.
Description
PANEL DE GENES POUR LE PRONOSTIC DU CANCER DE LA PROSTATE GENE PANEL FOR THE PROGNOSIS OF PROSTATE CANCER
La présente invention concerne une plaque microfluidique permettant le diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate, ainsi qu'une méthode de diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate basée sur l'utilisation d'une telle plaque. Plus particulièrement, la plaque microfluidique selon l'invention permet d'analyser le niveau d'expression des gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 par RT-qPCR. The present invention relates to a microfluidic plate for the diagnosis and / or prognosis of prostate cancer, as well as a method of diagnosis and / or prognosis of prostate cancer based on the use of such a plaque. More particularly, the microfluidic plate according to the invention makes it possible to analyze the level of expression of the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes. by RT-qPCR.
Le cancer de la prostate est le plus fréquent des cancers de l'homme de plus de 50 ans, et représente la deuxième cause de décès par cancer chez l'homme dans le monde développé. Prostate cancer is the most common cancer in men over 50, and is the second leading cause of cancer death in men in the developed world.
La méthode de diagnostic du cancer de la prostate la plus utilisée actuellement est le dosage du PSA ( prostate specific antigen ) sanguin. Cependant, le taux de PSA, dans le sang peut s'élever au cours de pathologies de la prostate autres que les cancers (infections ou inflammations prostatiques, traumatismes de la prostate, hyperplasie bénigne de la prostate, etc.). De plus, le PSA n'étant pas un marqueur spécifique des adénocarcinomes prostatiques, il a une faible valeur prédictive dans le diagnostic précoce des cancers de la prostate. Par conséquent, il existe un besoin en méthodes pour diagnostiquer et/ou établir un pronostic du cancer de la prostate. Plus particulièrement, il serait souhaitable de disposer d'une technique permettant d'établir rapidement un diagnostic fiable, tout en évaluant l'agressivité du cancer de la prostate. The most widely used method of diagnosing prostate cancer today is the determination of PSA (prostate specific antigen) in the blood. However, the level of PSA in the blood can rise during prostate diseases other than cancers (prostatic infections or inflammations, prostate trauma, benign prostatic hyperplasia, etc.). In addition, since PSA is not a specific marker for prostate adenocarcinoma, it has a low predictive value in the early diagnosis of prostate cancer. Therefore, there is a need for methods to diagnose and / or establish a prognosis for prostate cancer. In particular, it would be desirable to have a technique to quickly establish a reliable diagnosis, while assessing the aggressiveness of prostate cancer.
DESCRIPTION DE L'INVENTION Une plaque microfluidique TaqMan à basse densité comportant des amorces permettant de déterminer l'expression des gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGFI, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 a été construite. Les inventeurs ont trouvé que cette plaque microfluidique permettait un pronostic fiable, reproductible et simple de l'agressivité d'un cancer de la prostate. 1. Plaques microfluidiques selon l'invention Un premier aspect de l'invention concerne une plaque microfluidique caractérisée en ce qu'elle contient des moyens pour détecter le niveau d'expression, dans un échantillon biologique, d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Par BRCA1 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée Breast cancer type 1 susceptibility protein en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque de séquences du National Center for Biotechnology Information (dénommé ci après banque NCBI) est : NM 007294 (PRI 26-APR-2009). Par BRCA2 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée Breast cancer type 2 susceptibility protein en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM 000059.3 (PRI 26-APR-2009). Par AR , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée androgen receptor en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001011645.1 (PRI 26-APR-2009). Par IGF1 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée insulin-like growth factor 1 en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001111283.1 (PRI 26-APR-2009). DESCRIPTION OF THE INVENTION A low density TaqMan microfluidic plate comprising primers making it possible to determine the expression of the BRCA1, BRCA2, AR, IGFI, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3 and GSTP1 genes. and RASSF1 was built. The inventors have found that this microfluidic plate allows a reliable, reproducible and simple prognosis of the aggressiveness of a prostate cancer. 1. Microfluidic Plates According to the Invention A first aspect of the invention relates to a microfluidic plate characterized in that it contains means for detecting the level of expression, in a biological sample, of at least eleven, twelve, thirteen , fourteen or fifteen genes selected from the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes. By BRCA1 is meant here the gene encoding the protein called Breast cancer type 1 susceptibility protein in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the sequence library of the National Center for Biotechnology Information (hereinafter referred to as the NCBI database) is: NM 007294 (PRI 26-APR-2009). By BRCA2 is meant here the gene encoding the protein called Breast cancer type 2 susceptibility protein in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM 000059.3 (PRI 26-APR-2009). By AR is meant here the gene encoding the so-called androgen receptor protein in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_001011645.1 (PRI 26-APR-2009). By IGF1 is meant here the gene encoding the protein called insulin-like growth factor 1 in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_001111283.1 (PRI 26-APR-2009).
Par EPHB2 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée EPH receptor B2 en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_017449.3 (PRI 10-APR-2009). Par AMACR , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée alpha-methylacyl-CoA racemase en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence clans la banque NCBI est : NM_203382.1 (PRI 22-FEB-2009). By EPHB2 is meant here the gene encoding the protein called EPH receptor B2 in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_017449.3 (PRI 10-APR-2009). By AMACR is meant here the gene encoding the protein called alpha-methylacyl-CoA racemase in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_203382.1 (PRI 22-FEB-2009).
Par ESR1 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée estrogen receptor 1 en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001122742.1 (PRI 26-APR-2009). Par ESR2 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée estrogen receptor 2 en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001040275.1 (PRI 26-APR-2009). Par BCL2 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée Bcl2 ou oncogene B-cell leukemia 2 en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_000633.2 (PRI 26- APR-2009). Par RNASEL , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée 2',5'-oligoisoadenylate synthetase-dependent ribonuclease L en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM 021133.2 (PRI 29-MAR-2009). By ESR1 is meant here the gene encoding the protein called estrogen receptor 1 in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_001122742.1 (PRI 26-APR-2009). By ESR2 is meant here the gene encoding the protein called estrogen receptor 2 in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_001040275.1 (PRI 26-APR-2009). By BCL2 is meant here the gene encoding the protein called Bcl2 or oncogene B-cell leukemia 2 in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_000633.2 (PRI 26-APR-2009). By RNASEL is meant here the gene encoding the protein called 2 ', 5'-oligoisoadenylate synthetase-dependent ribonuclease L in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM 021133.2 (PRI 29-MAR-2009).
Par MUC1 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée cell surface associated Mucin 1 en anglais. Ce gène est également connu sous le nom hCG1996357. Par IL18 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée interleukin 18 en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001562.2 (PRI 26-APR-2009). Par COL4A3 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée alpha 3 type IV collagen en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_031362.2 (PRI 14-MAR-2009). Par GSTP1 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée glutathione S-transferase pi en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_000852.2 (PRI 13-JUL-2008). Par RASSF1 , on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée Ras association (RaIGDS/AF-6) domain family member 1 en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM 170713.2 (PRI 26-APR-2009). Les moyens pour détecter le niveau d'expression de ces gènes permettent de détecter le transcrit présenté dans les références dans la banque NCBI mentionnés ci-dessus, et/ou des variants d'épissage de tels transcrits, et/ou les protéines codées par ces transcrits. La référence de ces gènes dans différentes bases de données est présentée dans le tableau 1 ci-dessous. By MUC1 is meant here the gene encoding the protein called cell surface associated Mucin 1 in English. This gene is also known as hCG1996357. By IL18, is meant here the gene encoding the protein called interleukin 18 in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_001562.2 (PRI 26-APR-2009). By COL4A3 is meant here the gene encoding the protein called alpha 3 type IV collagen in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_031362.2 (PRI 14-MAR-2009). By GSTP1 is meant here the gene encoding the protein called glutathione S-transferase pi in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_000852.2 (PRI 13-JUL-2008). By RASSF1 is meant here the gene encoding the protein called Ras association (RaIGDS / AF-6) domain family member 1 in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM 170713.2 (PRI 26-APR-2009). The means for detecting the level of expression of these genes makes it possible to detect the transcript presented in the references in the NCBI library mentioned above, and / or splice variants of such transcripts, and / or the proteins encoded by these transcribed. The reference of these genes in different databases is presented in Table 1 below.
Tableau 1 Gène Référence Applied Biosystems Référence NCBI Locus BRCA1 Hs00173233_ml NM 007294.2 hCG16943 BRCA2 Hs00609060_m1 NM 000059.3 hCG33126 AR Hs00907244_m1 NM 001011645.1 hCG15093 IGF1 Hs01547656m1 NM 001111283.1 hCG21873 EPHB2 Hs01031827_ml I NM 017449.3 hCG1812037 AMACR Hs02786742s1 NM 203382.1 hCG37068 ESR1 Hs01046817_ml NM 001122742.1 hCG1811630 ESR2 Hs00230957 ml NM 001040275.1 hCG21449 Hsuu1u;3~bu mi RNASEL Hs00221692__ml NM 021133.2 hCG24392 MUC1 Hs00410317 ml hCG1996357 IL18 Hs01038788_m1 NM 001562.2 hCG39294 COL4A3 Hs01022527_ml NM 031362.2 hCG2013333 GSTP1 Hs00943351_gl NM 000852.2 hCG21055 RASSF1 Hs00200394 ml NM 170713.2 hCG17462 Dans un mode de réalisation préféré, la plaque microfluidique selon l'invention contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des onze gènes suivants : AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Table 1 Gene Reference Applied Biosystems Reference NCBI Locus BRCA1 Hs00173233_ml NM 007294.2 hCG16943 BRCA2 Hs00609060_m1 NM 000059.3 hCG33126 AR Hs00907244_m1 NM 001011645.1 hCG15093 IGF1 Hs01547656m1 NM 001111283.1 hCG21873 EphB2 Hs01031827_ml I NM 017449.3 hCG1812037 AMACR Hs02786742s1 NM 203382.1 hCG37068 ESR1 Hs01046817_ml NM 001122742.1 hCG1811630 ESR2 Hs00230957 ml NM 001040275.1 hCG21449 Hsuu1u; 3 ~ bu mi RNASEL Hs00221692__ml NM 021133.2 hCG24392 MUC1 Hs00410317 ml hCG1996357 IL18 Hs01038788_m1 NM 001562.2 hCG39294 COL4A3 Hs01022527_ml NM 031362.2 hCG2013333 GSTP1 Hs00943351_gl NM 000852.2 hCG21055 RASSF1 Hs00200394 ml NM 170713.2 hCG17462 in a preferred embodiment, the microfluidic plate according to the The invention provides means for detecting the level of expression of the following eleven genes: AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la plaque microfluidique selon l'invention contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des quinze gènes suivants : BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. In a particularly preferred embodiment, the microfluidic plate according to the invention contains means for detecting the level of expression of the fifteen following genes: BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1.
Préférentiellement, la plaque microfluidique selon l'invention contient en outre des moyens pour détecter le niveau d'expression d'un gène de calibration. Par gène de calibration , on entend un gène qui est ni surexprimé, ni sous exprimé, dans un cancer de la prostate. Des gènes de calibration couramment utilisés par l'homme du métier incluent, par exemple, le gène codant pour l'ARN ribosomique 18s (référence dans la banque NCBI: X03205.1, PRI 16-DEC-1994), actine (référence dans la banque NCBI: NM_001101, PRI 03-AUG-2008) et la glyceraldehyde-3-phosphate déhydrogénase (référence dans la banque NCBI: NM 002046, PRI 22-MAR-2009). Un mode de réalisation particulièrement préféré porte sur une plaque microfluidique qui contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des gènes consistant en BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1, RASSF1 et un gène de calibration (par exemple l'ARNr 18s). Des moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont bien connus de l'homme de l'art. L'expression d'un gène peut soit être détectée au niveau de la protéine codée par le gène, soit au niveau des ARN transcrits à partir du gène. Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes incluent donc, par exemple, des anticorps et des oligonucléotides tels que des sondes et/ou des amorces. Dans le cadre de la présente invention, les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont préférentiellement des oligonucléotides pour amplification en chaîne par polymérisation (ACP ou PCR), et plus particulièrement des oligonucléotides pour amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR). Une telle amplification par RT-gPCR peut être réalisée par plusieurs techniques différentes, incluant la technique SYBR Green et les techniques utilisant des sondes fluorescentes (techniques dites TaqMan , FRET , Beacon , etc.). Dans le cas d'une détection basée sur l'utilisation de sondes fluorescentes, chacun des puits de la plaque microfluidique selon l'invention contient une amorce sens, une amorce antisens, et une sonde fluorescente ( sonde TaqMan , sonde FRET , sonde Beacon , etc.). Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont préférentiellement des oligonucléotides pour la réalisation d'une RT-gPCR par la technique Taqman. Dans ce cas, chacun des puits de la plaque microfluidique selon l'invention contient une amorce sens, une amorce antisens, et une sonde fluorescente dite sonde Taqman . Les oligonucléotides appropriés peuvent aisément être choisis et construits par l'homme du métier en fonction de la technique choisie pour réaliser la RT-gPCR. Alternativement, des oligonucléotides appropriés et/ou des plaques microfluidiques contenant des oligonucléotides appropriés peuvent être commandés auprès de fournisseurs tels que Applied Biosystem (Carlsbad, Californie, USA). Par plaque microfluidique , on entend ici toute plaque convenant à être utilisée dans une plateforme à haut débit pour réaliser des réactions chimiques et/ou biologiques telles que des RT-qPCR. Ladite plaque microfluidique est préférentiellement une carte TagMan à basse densité ( TLDA ). Une telle plaque contient 384 puits. La carte TDLA commercialisée par Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA) sous la référence n° 4346798 convient tout particulièrement à la présente invention puisque cette plaque permet l'analyse de l'expression de 15 gènes ainsi que celle d'un gène de calibration, et ce pour huit échantillons analysés en parallèle. Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes peuvent par exemple être positionnés comme montré sur la Figure 1. 2. Méthodes de pronostic et/ou diagnostic selon l'invention Un autre aspect de l'invention porte sur l'utilisation d'une plaque microfluidique selon l'invention pour le pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate. Par pronostic , on entend l'évaluation de l'agressivité du cancer et/ou de la durée de survie du patient. Par diagnostic , on entend la détermination qu'un individu souffre d'un cancer. L'invention porte également sur l'utilisation de moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes tels que définis dans le paragraphe ci-dessus pour le pronostic et/ou diagnostic in vitro du cancer de la prostate. Preferably, the microfluidic plate according to the invention also contains means for detecting the level of expression of a calibration gene. By calibration gene is meant a gene that is neither overexpressed nor under expressed in prostate cancer. Calibration genes commonly used by those skilled in the art include, for example, the gene coding for 18s ribosomal RNA (reference in the NCBI library: X03205.1, PRI 16-DEC-1994), actin (reference in NCBI bank: NM_001101, PRI 03-AUG-2008) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (reference in NCBI bank: NM 002046, PRI 22-MAR-2009). A particularly preferred embodiment relates to a microfluidic plate which contains means for detecting the level of expression of the genes consisting of BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1, RASSF1 and a calibration gene (e.g. 18s rRNA). Means for detecting the level of gene expression are well known to those skilled in the art. The expression of a gene can either be detected at the level of the protein encoded by the gene, or at the level of the RNAs transcribed from the gene. Means for detecting the level of gene expression therefore include, for example, antibodies and oligonucleotides such as probes and / or primers. In the context of the present invention, the means for detecting the level of gene expression are preferably oligonucleotides for polymerase chain amplification (PCR or PCR), and more particularly oligonucleotides for chain amplification by quantitative polymerization in real time. (RT-qPCR). Such amplification by RT-gPCR can be carried out by several different techniques, including the SYBR Green technique and the techniques using fluorescent probes (techniques called TaqMan, FRET, Beacon, etc.). In the case of detection based on the use of fluorescent probes, each of the wells of the microfluidic plate according to the invention contains a sense primer, an antisense primer, and a fluorescent probe (TaqMan probe, FRET probe, Beacon probe, etc.). The means for detecting the level of gene expression are preferably oligonucleotides for performing a RT-gPCR by the Taqman technique. In this case, each well of the microfluidic plate according to the invention contains a sense primer, an antisense primer, and a fluorescent probe called Taqman probe. Suitable oligonucleotides can readily be selected and constructed by those skilled in the art depending on the technique chosen to perform RT-gPCR. Alternatively, suitable oligonucleotides and / or microfluidic plates containing appropriate oligonucleotides can be ordered from suppliers such as Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA). By microfluidic plate is meant any plate suitable for use in a high-throughput platform to perform chemical and / or biological reactions such as RT-qPCR. Said microfluidic plate is preferably a low density TagMan card (TLDA). Such a plate contains 384 wells. The TDLA card marketed by Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA) under the reference No. 4346798 is particularly suitable for the present invention since this plate makes it possible to analyze the expression of genes as well as that of a calibration gene. , for eight samples analyzed in parallel. The means for detecting the level of gene expression can for example be positioned as shown in FIG. 1. 2. Methods of Prognosis and / or Diagnosis According to the Invention Another aspect of the invention relates to the use of a microfluidic plate according to the invention for the prognosis and / or diagnosis of prostate cancer. Prognosis is the evaluation of the aggressiveness of the cancer and / or the survival time of the patient. Diagnosis refers to the determination that an individual has cancer. The invention also relates to the use of means for detecting the level of expression of genes as defined in the above paragraph for the prognosis and / or in vitro diagnosis of prostate cancer.
La plaque microfluidique selon l'invention est particulièrement utile pour évaluer si un cancer de la prostate est agressif ou non. Les cancers agressifs, pour lesquels la durée de survie est faible, sont définis comme des cancers dont le score de Gleason est supérieur ou égal à 7. Alternativement, l'agressivité du cancer peut être définie par son grade, lequel indique le degré de dédifférenciation des cellules cancéreuses, ou par la classification TNM, laquelle indique l'extension anatomique d'un cancer. La présente invention permet de déterminer l'agressivité des cancers de la prostate de manière simple et rapide grâce à une approche transcriptomique. The microfluidic plate according to the invention is particularly useful for evaluating whether a prostate cancer is aggressive or not. Aggressive cancers, for which the survival time is low, are defined as cancers whose Gleason score is greater than or equal to 7. Alternatively, the aggressiveness of the cancer can be defined by its grade, which indicates the degree of dedifferentiation cancer cells, or by the TNM classification, which indicates the anatomical extension of a cancer. The present invention makes it possible to determine the aggressiveness of prostate cancers in a simple and rapid manner using a transcriptomic approach.
Le cancer de la prostate peut par exemple être un adénocarcinome prostatique, un sarcome prostatique, un carcinome squameux prostatique, un carcinome ductal de la prostate ou une néoplasie intra-épithéliale de prostate. Le cancer de la prostate est préférentiellement un adénocarcinome prostatique, lequel est le cancer de la prostate le plus courant. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant les étapes suivantes : (a) mettre une plaque microfluidique selon l'invention en contact avec : (i) au moins un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate ; et (ii) au moins un échantillon de référence ; (b) réaliser une amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR). For example, prostate cancer may be prostatic adenocarcinoma, prostatic sarcoma, prostatic squamous cell carcinoma, ductal carcinoma of the prostate, or intraepithelial prostatic neoplasia. Prostate cancer is preferentially a prostatic adenocarcinoma, which is the most common prostate cancer. More particularly, the invention relates to an in vitro method for prognosis and / or diagnosis of prostate cancer comprising the following steps: (a) placing a microfluidic plate according to the invention in contact with: (i) at least one biological sample a patient suffering from, or likely to suffer from, prostate cancer; and (ii) at least one reference sample; (b) perform real time quantitative polymerization chain amplification (RT-qPCR).
Dans cette méthode, le niveau d'expression d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est analysé. De préférence, ces gènes incluent les onze gènes suivants : AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Dans un mode de réalisation préféré, le niveau d'expression des quinze gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est analysé. L'échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate correspond ou contient des cellules prostatiques. In this method, the expression level of at least eleven, twelve, thirteen, fourteen or fifteen genes selected from the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18 genes. , COL4A3, GSTP1 and RASSF1 is analyzed. Preferably, these genes include the following eleven genes: AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1. In a preferred embodiment, the level of expression of the fifteen BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes is analyzed. The biological sample of a patient suffering from, or likely to suffer from, prostate cancer corresponds to or contains prostate cells.
Celles-ci peuvent être prélevées lors d'une biopsie ou être obtenues à partir d'un fluide biologique (par exemple du sang) ayant subi un traitement visant à l'enrichir en cellules prostatiques. Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique correspond à une préparation d'ARNc préparé à partir des cellules prostatiques. These can be taken during a biopsy or obtained from a biological fluid (eg blood) that has been treated to enrich it with prostate cells. In a preferred embodiment, the biological sample corresponds to a cRNA preparation prepared from prostate cells.
L'échantillon de référence est un contrôle négatif indicatif du niveau d'expression de ces gènes chez un individu sain. Il peut par exemple correspondre à un pool d'ARN de prostates saines, tel que celui commercialisé par Ozyme (Saint-Quentin-en-Yvelines, France) sous la référence n° 636550. The reference sample is a negative control indicative of the level of expression of these genes in a healthy individual. It may, for example, correspond to a pool of healthy prostatic RNA, such as that marketed by Ozyme (Saint-Quentin-en-Yvelines, France) under the reference No. 636550.
Cette méthode est préférentiellement mise en oeuvre en utilisant une plateforme de haut débit, telle que celle représentée sur la Figure 2. This method is preferably implemented using a broadband platform, such as that shown in FIG. 2.
Cette méthode peut en outre comporter une étape (c) qui consiste à déterminer si, chez le patient, les gènes dont le niveau d'expression est détecté grâce à la plaque microfluidique selon l'invention sont surexprimés ou sous exprimés par rapport à l'échantillon de référence. Cette méthode peut également comporter les étapes de : This method may further comprise a step (c) which consists in determining whether, in the patient, the genes whose level of expression is detected by means of the microfluidic plate according to the invention are overexpressed or under expressed with respect to the reference sample. This method can also include the steps of:
(d) pour chacun des gènes, attribuer un score de 1 si : (d) for each gene, assign a score of 1 if:
(i) chez le patient, les gènes BRCA1, BRCA2, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSFI sont surexprimés par rapport à l'échantillon de référence ; et (i) in the patient, the BRCA1, BRCA2, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSFI genes are overexpressed with respect to the reference sample; and
(ii) chez le patient, le gène AR est sous exprimé par rapport à l'échantillon de référence ; (e) faire la somme des scores obtenus pour chacun des gènes afin d'obtenir un score global. (ii) in the patient, the AR gene is under expressed relative to the reference sample; (e) sum the scores obtained for each of the genes in order to obtain an overall score.
Dans la méthode ci-dessus, le score global est calculé avec un score binaire de 0 ou de 1 pour chacun des gènes. Cependant, le poids des scores attribués peut être modifié en pondérant les scores afin de d'accorder plus d'importance à certains des gènes. Par ailleurs, il est envisageable n'attribuer un score de 1 que si la différence de niveau d'expression entre l'échantillon du patient et l'échantillon de référence est statistiquement significative. In the above method, the overall score is calculated with a binary score of 0 or 1 for each of the genes. However, the weight of the assigned scores can be modified by weighting the scores to give more importance to some of the genes. Moreover, it is possible to attribute a score of 1 only if the difference in level of expression between the patient sample and the reference sample is statistically significant.
Lorsque la méthode est mise en oeuvre avec quinze gènes et que les scores attribués aux gènes sont binaires (0 ou 1), le score global va de 0 à 15. When the method is implemented with fifteen genes and the scores attributed to the genes are binary (0 or 1), the overall score ranges from 0 to 15.
Afin de pouvoir le comparer au score de Gleason (allant de 0 à 10), il peut être recalculé sur une échelle de 0 à 10. De ce fait, la méthode selon l'invention peut en outre comporter une étape (f) de calcul d'un score global pondéré (i.e. un score sur une échelle de 0 à 10). Ce score global pondéré peut par exemple être obtenu en utilisant la formule suivante : (score global -Xmin) X XmaxG-XminG) (Xmax-Xmin) où Xmin indique le score global minimun, Xmax indique le score global maximum, XmaxG indique le score de Gleason maximum (en l'occurrence 10) et XminG indique le score de Gleason mnimum (en l'occurrence 0).Par exemple, pour un score global de 9 obtenu lorsque la méthode est mise en oeuvre avec quinze gènes et que les scores attribués aux gènes sont binaires (0 ou 1), le score global pondéré sera de 6 : (9-0) x(10-0)=6. (15-0) Le score global et le score global pondéré indiquent si le patient souffre d'un cancer de la prostate, et/ou le degré d'agressivité du cancer de la prostate. Si ces scores sont élevés, le cancer est agressif. A l'inverse, s'ils sont faibles le cancer est peu agressif. Ainsi, un score global pondéré supérieur ou égal à 2 indique que ledit patient souffre probablement d'un cancer de la prostate. Un score global pondéré supérieur ou égal à 7 indique que le patient souffre probablement d'un cancer de la prostate agressif. Plus généralement, l'invention concerne toute méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant l'étape (a) de déterminer le niveau d'expression, dans un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate, d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. De préférence, ces gènes incluent les onze gènes suivants : AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le niveau d'expression de l'ensemble des quinze gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est déterminé. Cette méthode peut en outre comprendre une étape (b) de comparer le niveau d'expression de chacun de ces gènes avec le niveau d'expression déterminé dans un échantillon de référence. Le niveau d'expression des gènes est de préférence déterminé par quantification des ARNm transcrits à partir de ces gènes, par exemple par RT-qPCR ou par hybridation à des sondes nucléiques. Alternativement, le niveau d'expression est déterminé par quantification de la protéine traduite à partir du gène grâce à des anticorps. In order to be able to compare it to the Gleason score (ranging from 0 to 10), it can be recalculated on a scale of 0 to 10. As a result, the method according to the invention may further comprise a calculation step (f). a weighted overall score (ie a score on a scale from 0 to 10). This weighted overall score can for example be obtained by using the following formula: (Xminax-XminG Xminax-Xmin) (Xmax-Xmin) where Xmin indicates the minimum overall score, Xmax indicates the maximum overall score, XmaxG indicates the score maximum Gleason (in this case 10) and XminG indicates the Gleason mnimum score (in this case 0). For example, for an overall score of 9 obtained when the method is implemented with fifteen genes and the scores assigned to the genes are binary (0 or 1), the overall weighted score will be 6: (9-0) x (10-0) = 6. (15-0) The overall score and weighted overall score indicate whether the patient has prostate cancer, and / or the degree of aggressiveness of prostate cancer. If these scores are high, the cancer is aggressive. Conversely, if they are weak, the cancer is not very aggressive. Thus, a weighted overall score greater than or equal to 2 indicates that said patient is probably suffering from prostate cancer. A weighted overall score greater than or equal to 7 indicates that the patient is probably suffering from aggressive prostate cancer. More generally, the invention relates to any in vitro method for prognosis and / or diagnosis of prostate cancer comprising the step of (a) determining the level of expression in a biological sample of a patient suffering from, or susceptible to at least eleven, twelve, thirteen, fourteen or fifteen genes selected from the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL and MUC1 genes, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1. Preferably, these genes include the following eleven genes: AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1. In a particularly preferred embodiment, the expression level of all fifteen BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes is determined. This method may further comprise a step (b) of comparing the level of expression of each of these genes with the level of expression determined in a reference sample. The level of expression of the genes is preferably determined by quantitation of the mRNAs transcribed from these genes, for example by RT-qPCR or by hybridization with nucleic probes. Alternatively, the level of expression is determined by quantifying the protein translated from the gene with antibodies.
Les méthodes selon l'invention peuvent être utilisées non seulement pour déterminer si un individu souffre d'un cancer de la prostate et/ou pour estimer l'agressivité du cancer de la prostate, mais aussi pour établir le schéma de traitement ( treatment regimen ) d'un patient, pour ajuster le schéma de traitement d'un patient, pour suivre la progression d'un cancer de la prostate, et/ou pour suivre la réponse d'un patient à un traitement donné ( drug monitoring ). Les méthodes selon l'invention peuvent donc comporter une étape supplémentaire d'établir et/ou ajuster le schéma de traitement d'un patient. En effet, si le cancer est agressif, le médecin va opter pour un traitement agressif, par exemple une chimiothérapie associant plusieurs principes médicamenteux. En revanche, si le cancer n'est pas agressif, il pourra opter pour un traitement moins lourd produisant moins d'effets secondaires chez le patient. Le schéma de traitement d'un patient peut donc être établi et/ou ajusté en fonction du score global obtenu à l'étape (e). The methods of the invention can be used not only to determine whether an individual is suffering from prostate cancer and / or to estimate the aggressiveness of prostate cancer, but also to establish the treatment regimen (treatment regimen) a patient, to adjust the treatment regimen of a patient, to monitor the progression of prostate cancer, and / or to track a patient's response to a given treatment (drug monitoring). The methods according to the invention may therefore comprise an additional step of establishing and / or adjusting the treatment scheme of a patient. Indeed, if the cancer is aggressive, the doctor will opt for an aggressive treatment, for example a chemotherapy combining several medicinal principles. On the other hand, if the cancer is not aggressive, it will be able to opt for a less heavy treatment producing less side effects in the patient. The treatment scheme of a patient can therefore be established and / or adjusted according to the overall score obtained in step (e).
Lors de l'ajustement d'un schéma de traitement, du suivi de la progression d'un cancer et/ou du suivi de la réponse d'un patient, la méthode selon l'invention est répétée à au moins deux reprises sur des échantillons prélevés d'un même patient à différents moments. Des échantillons peuvent par exemple être prélevés et analysés tous les mois, ou tous les six mois environ. Lors du suivi de la réponse d'un patient, un échantillon est d'abord prélevé avant le début du traitement, et un ou plusieurs échantillons sont prélevés après le début de traitement. When adjusting a treatment regimen, monitoring the progression of a cancer and / or monitoring the response of a patient, the method according to the invention is repeated at least twice on samples. taken from the same patient at different times. For example, samples can be taken and analyzed every month or every six months or so. When monitoring a patient's response, a sample is first taken before the start of treatment, and one or more samples are taken after the start of treatment.
Tous les articles, revues, demandes de brevet, brevets et manuels mentionnés ici sont incorporées par référence au texte de la présente demande. All articles, reviews, patent applications, patents and manuals mentioned herein are incorporated by reference into the text of this application.
Bien qu'ayant des significations distinctes, les termes comprenant , contenant , comportant et consistant en ont été utilisés de manière interchangeable dans la description de l'invention, et peuvent être remplacés l'un par l'autre. Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Although having distinct meanings, the terms including, containing, comprising and consisting of have been used interchangeably in the description of the invention, and may be replaced by each other. The following examples and figures illustrate the invention without limiting its scope.
LEGENDES DES FIGURES La Figure 1 représente une plaque microfluidique selon l'invention, en l'occurrence une carte TaqMan à basse densité ( TLDA ), laquelle comporte 384 puits. Chaque numéro désigne un gène dont l'expression est détectée grâce aux oligonucléotides présents dans le puits. 1 : BRCA1; 2 : BRCA2; 3 : AR; ctl : gène de calibration (ARNr 18s); 4 : IGFI ; 5 : EPHB2; 6 : ESR1; 7 : ESR2; 8 : AMACR; 9: BCL2; 10: RNASEL; 11 : MUC1; 12: IL18; 13: COL4A3; 14: GSTP1; 15: RASSF1. Les emplacements destinés au chargement des échantillons sont représentés par des accolades. LEGENDS OF THE FIGURES FIG. 1 represents a microfluidic plate according to the invention, in this case a low density TaqMan map (TLDA), which comprises 384 wells. Each number designates a gene whose expression is detected by virtue of the oligonucleotides present in the well. 1: BRCA1; 2: BRCA2; 3: AR; ctl: calibration gene (18s rRNA); 4: IGFI; 5: EPHB2; 6: ESR1; 7: ESR2; 8: AMACR; 9: BCL2; 10: RNASEL; 11: MUC1; 12: IL18; 13: COL4A3; 14: GSTP1; 15: RASSF1. Slots for loading samples are represented by braces.
La Figure 2 représente une plateforme à haut débit convenant à la méthode de diagnostic et/ou pronostic selon l'invention. 1 : Ordinateur avec logiciels d'acquisition et d'analyse. 2 : Douchette à code barres pour identification des plaques. 3: Appareil d'analyse par RT-qPCR. 4: Bras de chargement des plaques. 5. Lecteur de code barres. 6: Robot pour plateforme à haut débit. Figure 2 shows a high-throughput platform suitable for the diagnostic method and / or prognosis according to the invention. 1: Computer with acquisition and analysis software. 2: Barcode shower for plate identification. 3: Analysis apparatus by RT-qPCR. 4: Plate loading arms. 5. Barcode reader. 6: High speed platform robot.
EXEMPLES Exemple 1 : Protocole de diagnostic et de pronostic du cancer de la prostate en utilisant une plaque microfluidique selon l'invention Les plaques microfluidiques TaqMan à basse densité, dénommées TLDA pour TagMan Low Density Array , sont des cartes comportant 384 puits et permettant 384 réactions simultanées de PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR), sans utilisation de robots de remplissage ou de pipettes multicanaux pour les remplir. Une telle plaque permet l'analyse simultanée de huit échantillons. Une plaque microfluidique TDLA selon l'invention a été fabriquée par Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA). La Figure 1 montre un schéma de cette plaque microfluidique, dénommée plaque Oncodiag . Cette plaque comporte des oligonucléotides permettant l'analyse de seize gènes (quinze gènes de diagnostic/pronostic et un gène de calibration) par RT-qPCR. Les quinze gènes de diagnostic/pronostic dont l'expression est détectée par la plaque microfluidique selon l'invention sont connus comme étant des gènes soit surexprimés, soit sous exprimés, dans les cancers. Ainsi, BRCA1, BRCA2, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 sont connus comme étant surexprimés dans les cancers, et le gène AR est connu comme étant sous exprimé dans les cancers. Huit échantillons peuvent être chargés et analysés simultanément grâce à cette plaque. Une fois les échantillons chargés sur la plaque, une RT-qPCR est mise en oeuvre en utilisant une plateforme de haut débit telle que celle représentée sur la Figure 2. La plaque Oncodiag permet ainsi d'estimer la sous expression ou la surexpression des gènes par rapport à un échantillon de référence (en l'occurrence, un pool d'ARN de 32 prostates saines, référence n° 636550, Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France). EXAMPLES Example 1 Prostate Cancer Diagnosis and Prognosis Protocol Using a Microfluidic Plate According to the Invention The low density TaqMan microfluidic plates, called TLDA for TagMan Low Density Array, are 384-well cards and allow 384 reactions. simultaneous quantitative real-time PCR (RT-qPCR), without the use of filling robots or multichannel pipettes to fill them. Such a plate allows the simultaneous analysis of eight samples. A microfluidic TDLA plate according to the invention was manufactured by Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA). Figure 1 shows a diagram of this microfluidic plate, called Oncodiag plate. This plate contains oligonucleotides allowing the analysis of sixteen genes (fifteen diagnostic / prognostic genes and a calibration gene) by RT-qPCR. The fifteen diagnostic / prognostic genes whose expression is detected by the microfluidic plate according to the invention are known to be genes that are either overexpressed or expressed in cancers. Thus, BRCA1, BRCA2, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 are known to be overexpressed in cancers, and the AR gene is known to be under expressed in cancers. Eight samples can be loaded and analyzed simultaneously using this plate. Once the samples are loaded onto the plate, RT-qPCR is carried out using a high-throughput platform such as that shown in FIG. 2. The Oncodiag plate thus makes it possible to estimate the under-expression or over-expression of the genes by compared to a reference sample (in this case, an RNA pool of 32 healthy prostates, reference No. 636550, Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France).
Plus précisément, 100 ng d'ADNc issu d'ARN de prostate, à 2 ng/pL, et 50 pL de Mix TagMan Universel sont chargés dans chaque cupule de la plaque. Un échantillon de référence est étudié en parallèle des échantillons à tester. Un ensemble de cycles de PCR est ensuite lancé afin d'étudier et d'évaluer la sous expression ou surexpression des gènes de diagnostic/pronostic grâce au logiciel d'analyse RQmanager. Les résultats de la RT-qPCR sont obtenus à partir des logiciels de la plateforme de haut débit. Pour chaque échantillon à tester, la sous expression ou la surexpression des gènes de diagnostic/pronostic, par rapport à l'échantillon de référence, est calculée et fournie par le logiciel RQManager. Les données sont exportables sous Excel. Ainsi en passant les données en LOG, la référence étant évaluée à zéro, si la valeur est positive, il y a surexpression du gène et inversement si la valeur est négative, le gène est sous exprimé par rapport à la référence. Pour chacun des gènes, on attribue un score de 1 si la différence d'expression observée pour l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence est celle qui est retrouvée lors de cancers. Par exemple, si IGF1 est surexprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, on attribue une valeur de 1 pour IGF1. Inversement, si IGF1 est sous exprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, on attribue une valeur de 0 pour IGF1. Dans le cas de RA, on attribue un score de 1 si ce gène est sous exprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, et sinon on attribue un score de 1. Specifically, 100 ng cDNA from prostate RNA, at 2 ng / μL, and 50 μL of Universal TagMan Mix are loaded into each well of the plate. A reference sample is studied in parallel with the samples to be tested. A set of PCR cycles is then launched to study and evaluate the under-expression or overexpression of the diagnostic / prognostic genes using the RQmanager analysis software. The results of the RT-qPCR are obtained from the software of the broadband platform. For each sample to be tested, the under-expression or overexpression of the diagnostic / prognostic genes, relative to the reference sample, is calculated and provided by the RQManager software. The data can be exported in Excel. Thus by passing the data in LOG, the reference being evaluated to zero, if the value is positive, there is overexpression of the gene and conversely if the value is negative, the gene is under expressed relative to the reference. For each of the genes, a score of 1 is assigned if the difference in expression observed for the sample to be tested relative to the reference sample is that found during cancers. For example, if IGF1 is overexpressed in the test sample relative to the reference sample, a value of 1 is assigned for IGF1. Conversely, if IGF1 is under expressed in the test sample relative to the reference sample, a value of 0 is assigned for IGF1. In the case of RA, a score of 1 is assigned if this gene is under-expressed in the test sample relative to the reference sample, and otherwise a score of 1 is assigned.
En additionnant les scores obtenus pour chacun des quinze gènes, un score global est obtenu. Ce score est compris entre 0 et 15 et est corrélé avec le degré d'agressivité du cancer de la prostate. By adding the scores obtained for each of the fifteen genes, an overall score is obtained. This score is between 0 and 15 and is correlated with the degree of aggressiveness of prostate cancer.
Exemple 2: Résultats Le protocole ci-dessus a été mis en oeuvre pour des échantillons d'ADNc provenant de vingt-deux patients différents. Afin de valider la méthode selon l'invention, le score Oncodiag a été comparé au score de Gleason. Le score de Gleason, qui est déterminé par anatomo-pathologie, est un score arbitraire établi durant l'examen des tissus sur lames. Il correspond à la somme de l'évaluation du degré de malignité (allant de 0 à 5) sur deux prélèvements. Les résultats obtenus pour le patient 1 sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Les scores Oncodiag et de Gleason déterminés pour chacun des vingt-deux patients sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Example 2: Results The above protocol was carried out for cDNA samples from twenty-two different patients. In order to validate the method according to the invention, the Oncodiag score was compared to the Gleason score. The Gleason score, which is determined by pathology, is an arbitrary score established during examination of slide tissue. It corresponds to the sum of the evaluation of the degree of malignancy (ranging from 0 to 5) on two samples. The results obtained for patient 1 are shown in Table 2 below. The Oncodiag and Gleason scores determined for each of the twenty-two patients are shown in Table 3 below.
Tableau 2 Gène RQ LOG RQ Score BRCA1 1,083 0,035 1 BRCA2 2,432 0,386 1 AR 0,785 -0,105 1 IGF1 1,366 0,135 1 EphB2 1,006 0,003 1 ESR1 2,279 0,358 1 ESR2 1,023 0,01 1 AMACR 8,637 0,936 1 BCL2 0,292 -0,535 0 RNASEL 0,598 -0,223 0 MUC1 0,911 -0,04 0 _ -0,262 0 IL18 0,547 /. F I A A /l A ff /l /7, '.. !l A A r .1 GSTP1 0,4 -0,398 0 RASSF1 0,961 -0,017 0 Score général Score ONCODIAG 6 Score de Gleason 6 Tableau 3 Patient Score Oncodiag Score de Gleason 1 6 6 2 2 6 3 6 6 4 9 9 9 6 6 4 6 7 5 6 8 3 6 9 5 6 6 6 11 5 6 12 1 0 13 1 0 14 9 8 9 9 16 9 0 17 9 0 18 3 0 19 9 7 9 7 21 1 0 22 9 7 Une bonne corrélation entre le score Oncodiag et le score de Gleason est observée. Plus particulièrement, tous les cancers dont le score de Gleason est 5 supérieur ou égal à 7 présentent également un score Oncodiag supérieur ou égal à 7. De ce fait, la plaque microfluidique selon l'invention permet un diagnostic et un pronostic efficace des cancers de la prostate agressifs. Table 2 Gene RQ LOG RQ Score BRCA1 1,083 0.035 1 BRCA2 2,432 0,386 1 AR 0,785 -0,105 1 IGF1 1,366 0,135 1 EphB2 1,006 0.003 1 ESR1 2,279 0.358 1 ESR2 1,023 0.01 1 AMACR 8,637 0,936 1 BCL2 0,292 -0,535 0 RNASEL 0,598 - 0.223 0 MUC1 0.911-0.04 0 -0.262 0 IL18 0.547%. FIAA / l A ff / l / 7, '..! L AA r .1 GSTP1 0,4 -0,398 0 RASSF1 0,961 -0,017 0 General score ONCODIAG score 6 Gleason score 6 Table 3 Patient Score Oncodiag Gleason score 1 6 6 2 2 6 3 6 6 4 9 9 9 6 6 4 6 7 5 6 8 3 6 9 5 6 6 6 11 5 6 12 1 0 13 1 0 14 9 8 9 9 16 9 0 17 9 0 18 3 0 19 9 7 9 7 21 1 0 22 9 7 A good correlation between the Oncodiag score and the Gleason score is observed. More particularly, all the cancers whose Gleason score is greater than or equal to 7 also have an Oncodiag score of greater than or equal to 7. As a result, the microfluidic plate according to the invention makes it possible to effectively diagnose and predict cancer. aggressive prostate.
Exemple 3 : Les avantages des plaques microfluidiques et méthodes 10 selon l'invention L'utilisation de plaque microfluidique en RT-qPCR est une technique récente et novatrice. Les avantages techniques sont nombreux car cette technique est fiable, reproductible, simple d'utilisation et facilement réalisable. Elle est également moins coûteuse que l'utilisation de biopuces. De plus, la possibilité 15 d'utiliser une plateforme haut débit (appareil robotisé) offre la possibilité d'une analyse de routine. La fiabilité est assurée dans la continuité du système d'information grâce à un système de lecteur de code barres. Example 3: Advantages of Microfluidic Plates and Methods According to the Invention The use of microfluidic plate in RT-qPCR is a recent and novel technique. The technical advantages are numerous because this technique is reliable, reproducible, easy to use and easily achievable. It is also less expensive than the use of biochips. In addition, the possibility of using a high-speed platform (robotic device) offers the possibility of a routine analysis. Reliability is ensured in the continuity of the information system thanks to a system of barcode reader.
Les avantages des plaques TLDA sont nombreux. La technologie TDLA est sensible et reproductible pour l'étude de l'expression des gènes. De plus, il a été démontré que cette nouvelle technique permet de produire des résultats comparables à ceux obtenus par la méthode conventionnelle de RT-qPCR. The advantages of TLDA plates are numerous. TDLA technology is sensitive and reproducible for the study of gene expression. In addition, this new technique has been shown to produce results comparable to those obtained by the conventional RT-qPCR method.
L'avantage essentiel de ce type de plaque provient de la possibilité d'étudier simultanément l'expression de plusieurs gènes issus d'un même échantillon, ce qui permet qui plus est de réaliser des économies en termes de coûts et de matériaux. Cette technique constitue une nouvelle approche de la sensibilité et de l'étude des profils transcriptomiques. Ainsi, en moins de trois jours, il est possible d'obtenir un score Oncodiag illustrant le degré d'agressivité du cancer de la prostate du patient après étude transcriptomique du panel de gènes grâce à la plaque Oncodiag. The essential advantage of this type of plate comes from the possibility of simultaneously studying the expression of several genes from the same sample, which moreover makes it possible to achieve savings in terms of costs and materials. This technique is a new approach to the sensitivity and study of transcriptomic profiles. Thus, in less than three days, it is possible to obtain an Oncodiag score illustrating the degree of aggressiveness of the patient's prostate cancer after transcriptomic study of the gene panel using the Oncodiag plate.
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