TITRE Epreuve de compatibilité sanguine chez l'animal par une technique Immunochromatographique NOMS DES INVENTEURS 1) Docteur Dominique RIGAL 4, chemin de Chantemerle 69370 Saint Didier au Mont D'Or 2) Madame Alice RIGAL 9 rue de la Monnaie 69002 LYON 3) Monsieur Gabriel RIGAL 9 rue de la Monnaie 69002 LYON 2937143 II DESCRIPTION Indication du domaine technique La présente invention a pour objet un procédé capable de réaliser une épreuve de compatibilité sanguine chez les animaux avant la réalisation d'une transfusion. 5 La transfusion animale est maintenant devenue une technologie courante dans de nombreuses espèces animales comme le chat, le chien, le cheval, le furet Cependant pour assurer une parfaite sécurité dans ce domaine, il convient de réaliser les groupages sanguins du donneur et du receveur dans les systèmes de groupes sanguins les plus immunogènes comme par exemple le système DEA1.1 (Dog Erytrocyte Antigen) chez le chien, le système AB chez le chat, les systèmes 10 Aa et Ca chez le cheval de façon à éviter les situations d'allo-immunisation et des réactions transfusionnelles immédiates ou retardées pouvant être délétères chez le receveur. Toutefois le respect des compatibilités sanguines ne protége pas nécessairement le receveur d'un d'accident transfusionnelle par incompatibilité sanguine dans les systèmes de groupes qui n'ont pas été déterminés au préalable. 15 Indication de l'Etat de l'art Cependant, le seul moyen d'assurer une transfusion très fiable consiste à réaliser un test de compatibilité (encore appelé Cross match) entre les globules rouges du donneur et le plasma ou le sérum du receveur. Ce test est encore appelé test de compatibilité majeur. Le test de compatibilité mineur consiste à mettre en présence le plasma du donneur avec les globules rouges du receveur. Il existe plusieurs méthodes pour réaliser les tests de compatibilité. La méthode historique est encore appelé le test de Coombs indirect en tube ou sur plaque. Dans cette méthode les globules rouges du donneur sont lavés 3 à 4 fois en solution saline puis mis en contact avec le plasma ou le sérum du receveur pendant 15 à 35 min à 35° puis de nouveau lavés 3 à 4 fois en solution saline, ensuite on ajoute une anti-globuline spécifique de l'espèce et les tubes sont centrifugés et lus après agitation douce. Cette méthode est longue (1 à 2 heures) et fastidieuse. Elle nécessite la production d'un anti-globuline d'espèce d'une grande qualité. Elle demande à être réalisé par un laboratoire spécialisé. Une seconde technique consiste à utiliser la méthode de gel filtration. Dans cette méthode une anti- globuline spécifique d'espèce est dispersée dans un gel de Sephadex déposé dans des micro- colonnes de chromatographie. Les globules rouges du donneur et le plasma ou sérum du receveur sont mélangés au sommet de la colonne. Le mélange est laissé 15 à 30 min à 37° puis les colonnes sont centrifugées durant 10 minutes. La présence d'anticorps dans le plasma du donneur va provoquer une agglutination des globules rouges qui restent bloqués au sommet de la colonne. En revanche, en l'absence d'anticorps, les globules rouges vont passer entre les billes de Sephadex et se retrouver en bas de la colonne. Cette technique nécessite un équipement spécifique et ne peut être 2937143 III réalisé que dans un laboratoire spécialisé. Par ailleurs, elle va prendre entre 30 et 45 minutes. Cette technique nécessite la production d'un anti-globuline d'espèce d'une grande qualité. TITLE Test of blood compatibility in animals by an Immunochromatographic technique NAMES OF INVENTORS 1) Dr. Dominique RIGAL 4, chemin de Chantemerle 69370 Saint Didier at Mont D'Or 2) Mrs. Alice RIGAL 9 rue de la Monnaie 69002 LYON 3) Mr. Gabriel The present invention relates to a method capable of performing a blood compatibility test in animals before carrying out a transfusion. 5 Animal transfusion has now become a common technology in many animal species such as the cat, dog, horse, ferret. However, to ensure complete safety in this area, donor and recipient blood the most immunogenic blood group systems, for example the DEA1.1 system (Dog Erytrocyte Antigen) in dogs, the AB system in cats, the Aa and Ca systems in the horse so as to avoid the situations of allo -immunization and immediate or delayed transfusion reactions that may be deleterious in the recipient. However, the respect of the blood compatibilities does not necessarily protect the recipient of a transfusion accident by blood incompatibility in the group systems that have not been previously determined. Indication of the state of the art However, the only way to ensure a very reliable transfusion is to perform a compatibility test (also called cross match) between the red blood cells of the donor and the plasma or serum of the recipient. This test is still called a major compatibility test. The minor compatibility test consists in placing the donor's plasma in the presence of the red blood cells of the recipient. There are several methods for performing compatibility tests. The historical method is still called the indirect tube or plate Coombs test. In this method, the red blood cells of the donor are washed 3 to 4 times in saline solution and then put in contact with the plasma or the serum of the recipient for 15 to 35 min at 35 ° and then washed again 3 to 4 times in saline solution, then an anti-globulin specific for the species is added and the tubes are centrifuged and read after gentle stirring. This method is long (1 to 2 hours) and tedious. It requires the production of an anti-globulin species of high quality. It requires to be carried out by a specialized laboratory. A second technique is to use the gel filtration method. In this method a species-specific anti-globulin is dispersed in a Sephadex gel deposited in micro-chromatography columns. The red blood cells of the donor and the plasma or serum of the recipient are mixed at the top of the column. The mixture is left for 30 minutes at 37 ° and the columns are then centrifuged for 10 minutes. The presence of antibodies in the donor's plasma will cause agglutination of the red blood cells that remain blocked at the top of the column. On the other hand, in the absence of antibodies, the red blood cells will pass between the Sephadex beads and be at the bottom of the column. This technique requires specific equipment and can only be performed in a specialized laboratory. By the way, it will take between 30 and 45 minutes. This technique requires the production of an anti-globulin species of high quality.
C'est pourquoi, nous avons mis au point une nouvelle technologie qui va permettre de réaliser en 5 moins de 10 minutes un test de comptabilité tout en s'affranchissant d'une Anti-globuline spécifique de l'espèce et de matériel de centrifugation. Ce test ultra rapide permet de résoudre en particulier l'épreuve de compatibilité en situation d'urgence ou au cabinet d'un vétérinaire non spécialisé. That is why we have developed a new technology that will allow to achieve in less than 10 minutes an accounting test while avoiding a specific anti-globulin species and centrifugation equipment. This ultra-fast test makes it possible to solve, in particular, the compatibility test in an emergency situation or in the office of a non-specialized veterinarian.
10 Exposé de l'invention Cette invention comporte 2 parties : Fixation des anticorps anti globules rouges sur les GR du donneur avec un facilitateur de l'agglutination Lecture de la réaction par une technique Immunochromatographique 15 Première partie : Fixation des anticorps anti globules rouges sur les globules rouges du donneur Une suspension de GR du donneur de 1 à 20% dans un tampon A de type PBS (phosphate buffer solution ph 7.2) de base force ionique est déposé dans une cupule à fond arrondis ou plat d'un volume de 5(411 à l000 1. A cette suspension de globule rouge d'un volume de 5 l à 10011l et 20 préférentiellement 25 l, on ajoute 5 i à l00 1 de sérum ou de plasma du donneur et préférentiellement 25111. Apres une période d'incubation d'1 minute à 3 minutes et préférentiellement 1,30 min, on ajoute dans la cupule 241 d'un tampon B contenant des macro molécules polycationiques (polyvinyle pyrolidone, methylcelullose, polylysine, héparine, bromure d'hexadimethrine...) à des concentrations de 0,0001% à 1% et préférentiellement à 0,02%. 25 Apres 3 minutes et préférentiellement 1,30 min, on ajoute un volume de 5 l à 100 l et préférentiellement 2511l de tampon C (tampon salin avec un pH acide). Au terme de 15 à 75 sec, une agglutination des globules rouges est évaluée en effectuant la 2eme partie de l'invention. DESCRIPTION OF THE INVENTION This invention is in two parts: Attachment of anti-red blood cell antibodies to GR of the donor with an agglutination facilitator Reaction of the reaction by Immunochromatographic technique Part 1: Attachment of anti-red blood cell antibodies to red blood cells of the donor A GR donor suspension of 1 to 20% in PBS (phosphate buffer solution ph 7.2) buffer A of ionic strength base is deposited in a round-bottomed or flat-bottomed cup with a volume of 5 ( 411 to 1000 1. To this suspension of red blood cell with a volume of 5 liters to 100 liters and preferably 25 liters, 5 μl to 100 μl of serum or plasma of the donor and preferably 25 μl are added. After an incubation period from 1 minute to 3 minutes and preferably 1.30 min, is added in the cup 241 a buffer B containing polycationic macromolecules (polyvinyl pyrrolidone, methylcellulose, polylysine, heparin, hexadime bromide) thrine ...) at concentrations of 0.0001% to 1% and preferably to 0.02%. After 3 minutes and preferably 1.30 min, a volume of 5 l to 100 l and preferably 2511 l of buffer C (salt buffer with acidic pH) are added. After 15 to 75 sec, agglutination of red blood cells is evaluated by performing the second part of the invention.
Deuxième partie: Lecture de la réaction par une technique Immunochromatographique 30 Dans la première partie de ce test, il a été réalisé une réaction d'agglutination des globules rouges du receveur, grâce à un polycation facilitateur de l'agglutination. En milieu acide, l'agglutination va disparaître rapidement si le globules rouges n'ont pas été revêtus par des anticorps présents dans le plasma du receveur. En revanche, il n'y aura pas de disparition de l'agglutination en milieu acide si les globules rouges ont été recouverts par des anticorps du plasma 35 du receveur. L'évaluation de l'agglutination est une observation subjective de la part de l'opérateur. C'est pourquoi dans cette invention, nous utilisons des bandelettes de nitrocellulose permettrant la migration des globules rouges libres entre les mailles de la membrane de nitrocellulose. 2937143 IV La lecture de la réaction se réalisera donc en trempant cette bandelette de nitrocellulose dans la cupule réactionnelle avec 2 résultats possibles : Les globules rouges restent sous forme d'agglutinats dans la cupule et de ce fait ne peuvent pas migrer dans les mailles de la membrane nitrocellulose qui restera blanche ou rose pale avec une 5 bande rouge intense à son extrémité inférieure (test positif Fig.1). Si les agglutinats de globules rouges se dissocient en présence du tampon acide, ceci témoigne d'une absence de revêtement des globules rouges par des anticorps présents dans le plasma du receveur. Alors les globules rouges vont migrées le long de la membrane de nitrocellulose et la teinter en rouge sans bande rouge à son extrémité inférieure (test négatif Fig.2). 10 Présentation des figures Les dessins annexés illustrent l'invention : La figure 1 représente la membrane de nitrocellulose avec un résultat positif. Les globules rouges sont retenus à l'extrémité inferieure de la membrane sous forme d'agglutinats laissant une bande 15 rouge intense apparaitre. Le reste de la membrane étant blanche ou rosé. La figure 2 représente la membrane de nitrocellulose avec un résultat négatif. Les globules rouges ont migrés le long de la membrane entrainant une teinte rouge tout au long de la membrane. Part 2: Reading of the reaction by an immunochromatographic technique In the first part of this test, an agglutination reaction of the red blood cells of the recipient was carried out, thanks to a polycation facilitating the agglutination. In acidic medium, agglutination will disappear rapidly if the red blood cells have not been coated with antibodies present in the plasma of the recipient. On the other hand, there will be no disappearance of agglutination in acidic medium if the red blood cells have been covered by antibodies of the plasma of the recipient. The evaluation of agglutination is a subjective observation on the part of the operator. Therefore, in this invention, nitrocellulose strips are used to allow the migration of free red blood cells between the mesh of the nitrocellulose membrane. The reading of the reaction will therefore be carried out by dipping this nitrocellulose strip into the reaction cup with 2 possible results: The red blood cells remain in the form of agglutinates in the cup and therefore can not migrate into the cells of the cell. nitrocellulose membrane which will remain white or pale pink with an intense red band at its lower end (positive test Fig.1). If the agglutinates of red blood cells dissociate in the presence of the acid buffer, this indicates a lack of coating of red blood cells by antibodies present in the plasma of the recipient. Then the red blood cells will migrate along the nitrocellulose membrane and stain red without red band at its lower end (negative test Fig.2). BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The accompanying drawings illustrate the invention: Figure 1 shows the nitrocellulose membrane with a positive result. The red blood cells are retained at the lower end of the membrane as agglutinates leaving an intense red band appear. The rest of the membrane is white or pink. Figure 2 shows the nitrocellulose membrane with a negative result. The red blood cells migrated along the membrane causing a red tint throughout the membrane.
Première exemple : compatibilité entre le sérum d'un chat de groupe B et les globules rouges d'un 20 chat de groupe A. On sait que les chats de groupe B possèdent des anticorps naturels Anti globules rouges de groupe A (Anti-A). Avec cette technologie nous avons évalué le sérum de 10 chats de groupes B contre un panel de globules rouges de groupe A. Dans tous les cas il a été possible de démontrer la présence d'anticorps anti-A avec des titres du 1/8 au 1/256. 25 Inversement, il a été testé des plasmas de chat de groupe A vis a vis de globules rouges B. La présence d'anticorps Anti-B a été retrouvée dans 30% des cas avec des titres allant de 1/2 à 1/64. First example: compatibility between the serum of a group B cat and the red blood cells of a group A cat. Group B cats are known to have naturally occurring antibodies. Anti-A red blood cells (Anti-A) . With this technology we evaluated the serum of 10 cats of group B against a panel of red blood cells of group A. In all cases it was possible to demonstrate the presence of anti-A antibodies with titres of 1/8 to 1/256. Conversely, Group A cat plasmas were tested against B-cell red blood cells. The presence of Anti-B antibodies was found in 30% of cases with titres ranging from 1/2 to 1/64. .
Deuxième exemple : compatibilité entre le sérum de chien de différents groupes des systèmes DEA et des globules rouges cible porteur des antigènes DEA d'intérêts. 30 Nous avons pu évaluer des sérum contenant des anticorps anti DEA1.1, 1.2, DEA-2, DEA-3, DEA-4, DEA-7 obtenu auprès de la Midwest Animal Blood services (Michigan,USA). Dans tous les cas, il a été possible d'identifier la présence d'une incompatibilité entre ces sérums et les globules rouges porteurs des antigènes cibles. Les titres des anticorps ont variés du 1/2 au 1/64. 35 Troisième exemple : Démonstration d'un revêtement érythrocytaire par des auto-Anticorps. 2937143 V Cette invention a été appliquée à des globules rouges provenant d'animaux atteints d'auto immunisation anti- érythrocytaire attesté par la présence d'un test de Coombs direct positif. Cette technique a parfaitement visualisé la persistance de l'agglutination de ce type de globules rouges revêtus par des auto-anticorps. Cette technique représente donc une alternative facile et rapide au 5 test de Coombs direct qui peut être appliqué dans les espèces que nous avons étudié (Chien, chat, cheval, bovins, ovins, caprins, cochons, furet....) Second example: compatibility between the dog serum of different groups of DEA systems and target red blood cells carrying the DEA antigens of interest. Serum containing anti DEA1.1, 1.2, DEA-2, DEA-3, DEA-4, DEA-7 antibodies obtained from Midwest Animal Blood Services (Michigan, USA) was evaluated. In all cases, it has been possible to identify the presence of incompatibility between these sera and the red blood cells carrying the target antigens. Antibody titers ranged from 1/2 to 1/64. Third Example: Demonstration of an erythrocyte coating by autoantibodies. This invention has been applied to red blood cells from animals with anti-erythrocyte autoimmunization attested by the presence of a positive direct Coombs test. This technique perfectly visualized the persistence of the agglutination of this type of red blood cells coated with autoantibodies. This technique therefore represents an easy and quick alternative to the direct Coombs test which can be applied in the species we have studied (dog, cat, horse, cattle, sheep, goats, pigs, ferret ...).
Application industrielle : L'invention est particulièrement destinée à fabriquer une trousse contenant l'ensemble du 10 matériel (cupules, bâtonnets agitateurs, embouts de pipette, mode d'emploi), les réactifs (tampons) et les membranes nitrocellulose nécessaires à la réalisation du test de compatibilité immunochromatographique. 10 15 20 INDUSTRIAL APPLICATION: The invention is particularly intended to manufacture a kit containing all the equipment (cups, stir sticks, pipette tips, instructions for use), the reagents (buffers) and the nitrocellulose membranes necessary for carrying out the procedure. immunochromatographic compatibility test. 10 15 20