FR2936529A1

FR2936529A1 - Characterizing DNA sample of known origin having copies of intact DNA fragment of size, before degradation, comprises measuring intact copies of target nucleotide sequence, by quantitative PCR, and calculating cut probability

Info

Publication number: FR2936529A1
Application number: FR0856494A
Authority: FR
Inventors: Marthe Colotte; Jacques Bonnet; Sophie Tuffet; Vincent Couallier
Original assignee: IMAGENE
Current assignee: IMAGENE
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2010-04-02
Anticipated expiration: 2028-09-26
Also published as: FR2936529B1

Abstract

Characterizing a DNA sample of known origin, having, before degradation, N copies of an intact DNA fragment of size B, comprises: (a) measuring a number N1 of intact copies of a target nucleotide sequence C1 of size L1, where L1 is = (B-1), by quantitative PCR; (b) measuring a number N2 of intact copies of a target nucleotide sequence C2 of size L2, where L2 is less than L1, by quantitative PCR; (c) calculating a cut probability by nucleotide (P c u t); and (d) determining at least one data characterizing DNA sample comprising e.g. probability that nucleotide sequence is intact, by P c u t. Characterizing a DNA sample of known origin, containing, before degradation, N copies of an intact DNA fragment of size B, comprises: (a) measuring a number N1 of intact copies of a target nucleotide sequence C1 of size L1, where L1 is = (B-1), by quantitative PCR; (b) measuring a number N2 of intact copies of a target nucleotide sequence C2 of size L2, where L2 is less than L1, by quantitative PCR; (c) calculating a cut probability by nucleotide (P c u t) according to the formula (1-(N1/N2)(1/(L1-L2))); and (d) determining at least one data characterizing DNA sample comprising: N mass of DNA contained in the sample corresponding to the initial number of copies of intact DNA fragment of size B; average size of DNA fragments contained in the sample; size distribution profile of fragments contained in the sample; mass distribution profile of fragments contained in the DNA sample; probability that a nucleotide sequence is intact; probability having a positive PCR; minimum quantity of sample to be used to have a positive PCR; maximum size of a target that can be amplified with a quantity of given DNA sample; or rate of degradation or modification of DNA, by P c u t. An independent claim is included for a kit for the implementation of the process comprising at least one: primer for amplifying a sequence C1 of size L1 and C2 of size L2, where L1 is less than L2 and L2 is = (B1); reagent to carry out quantitative PCR, known as buffer, enzymes and detection system by fluorescence; and an instruction explaining the implementation of the process.

Description

PROCEDE DE CARACTERISATION D'UN ECHANTILLON D'ADN METHOD OF CHARACTERIZING A DNA SAMPLE

La présente invention concerne un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue. L'invention se rapporte également à l'utilisation de ce procédé ainsi qu'à un kit pour sa mise en oeuvre. The present invention relates to a method of characterizing a DNA sample of known origin. The invention also relates to the use of this method as well as a kit for its implementation.

Beaucoup d'échantillons biologiques, tels que ceux rencontrés en médecine légale, dans les tissus archivés, l'ADN ancien, l'ADN extracellulaire ou encore dans le domaine alimentaire, conduisent à l'obtention d'ADN fortement dégradés et/ou en faibles quantités. La faible quantité et surtout l'état de dégradation de ces échantillons les rendent difficiles à analyser par les techniques actuelles. Or une estimation de la taille et de la quantité d'ADN contenu dans l'échantillon est nécessaire en particulier pour les analyses de STR (Short Tandem Repeat - Courtes séquences répétées en chaîne) en médecine légale ou pour la quantification d'organismes génétiquement modifiés (O6M) . Many biological samples, such as those found in forensic science, in archived tissues, old DNA, extracellular DNA or in the food field, lead to the obtaining of highly degraded and / or weak DNA. quantities. The small amount and especially the state of degradation of these samples makes them difficult to analyze by current techniques. An estimate of the size and quantity of DNA contained in the sample is necessary, particularly for short tandem repeat (STR) analyzes in forensic medicine or for the quantification of genetically modified organisms. (O6M).

Actuellement, la quantification de faibles quantités d'ADN peut être réalisée par fluorimétrie (avec des colorants dont la fluorescence augmente par fixation sur l'ADN) par hybridation avec des sondes contenant des séquences répétées, ou plus généralement par PCR ( Polymerase Chain Reaction - Réaction en Chaîne par Polymérase) quantitative en temps réel. Toutefois, si l'ADN contenu dans l'échantillon est dégradé, ces techniques conduisent à une sous-estimation systématique de la quantité d'ADN puisque la fixation de colorants sur l'ADN, son taux de rétention sur membrane d'un fragment d'ADN et sa capacité à s'hybrider chutent avec sa taille, et enfin, pour la PCR il est impossible d'amplifier des fragments comportant des coupures dans la séquence cible. Par ailleurs, pour de faibles masses, avec les techniques actuelles, la détermination de la taille des fragments d'ADN contenus dans un échantillon est encore plus difficile. L'électrophorèse avec révélation directe de la position d'ADN par coloration n'est pas assez sensible. Cette sensibilité peut être accrue par l'utilisation de la technique de Southern, plus compliquée et nécessitant, même ainsi, des quantités d'échantillons excessives pour certaines applications. Ainsi avec les méthodes d'analyse actuelles il est impossible de caractériser de façon simple et rapide un échantillon d'ADN. Il n'existe aucune technique validée et rigoureuse permettant simultanément de mesurer la masse d'ADN, d'estimer la taille moyenne et/ou établir le profil de distribution de la taille des fragments d'ADN à analyser. Il existe donc un besoin pour une méthode simple et fiable permettant de 15 caractériser des populations de fragments d'ADN, en particulier de fragments issus de la dégradation aléatoire d'un ADN intact. C'est pourquoi l'objectif de la présente invention est de répondre à ce besoin et de pallier les inconvénients des techniques de l'art antérieur en proposant un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue, efficace et 20 facile à mettre en oeuvre. A cet effet, la présente invention vise un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue, contenant, avant dégradation, N copies d'un fragment d'ADN intact de taille B, comprenant les étapes suivantes a) mesure par PCR quantitative du nombre NI de copies intactes 25 d'une séquence nucléotidique cible Cl de taille L1, Ll étant inférieure ou égale à (B-1), b) si la masse N n'est pas connue, mesure par PCR quantitative du nombre N2 de copies intactes d'une séquence nucléotidique cible C2 de taille L2, L2 étant inférieure à L1, c) calcul de la probabilité de coupure par nucléotide Pcut, en utilisant la formule : - Pcut = 1-(N1/N2)1112, si N n'est pas connu, ou - Pcut = 1-( N1 /N) 1/ Ll, si N est connu, d) à partir de Pcut, détermination d'une ou plusieurs données caractérisant l'échantillon d'ADN, choisies parmi : la masse N de l'ADN contenu dans l'échantillon, la taille moyenne des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon, le profil de distribution de la taille des fragments contenus dans l'échantillon, le profil de distribution de la masse des fragments contenus dans l'échantillon, la probabilité qu'une séquence nucléotidique C de taille L soit intacte, la probabilité d'avoir une PCR positive, la quantité minimum d'échantillon à utiliser pour avoir une PCR positive, la taille de fragment maximum qui peut être amplifiée avec une quantité d'échantillon d'ADN donnée, la vitesse de dégradation ou de modification de l'ADN. Par échantillon d'ADN d'origine connue , on entend une population d'ADN dont les éléments ont une taille unique B avant dégradation et pour lesquels on peut définir au moins deux couples d'amorces permettant l'amplification d'au moins deux fragments cibles de tailles différentes et connues. La masse N correspond au nombre initial N de copies du fragment d'ADN intact de taille B. La taille B correspond au nombre de nucléotides formant un fragment d'ADN cible d'origine connue, intact. La séquence nucléotidique cible Cl correspond à une séquence d'ADN située sur le fragment de taille B, de taille L1, L1 étant inférieure ou égale à (B-1) et exprimée en nombre de nucléotides. Currently, the quantification of small amounts of DNA can be carried out by fluorimetry (with dyes whose fluorescence increases by fixing on the DNA) by hybridization with probes containing repeated sequences, or more generally by PCR (Polymerase Chain Reaction - Chain Reaction by Polymerase) quantitative in real time. However, if the DNA contained in the sample is degraded, these techniques lead to a systematic underestimation of the amount of DNA since the fixing of dyes on the DNA, its retention rate on a membrane of a fragment of DNA and its ability to hybridize fall with its size, and finally, for PCR it is impossible to amplify fragments with cleavages in the target sequence. Moreover, for small masses, with the current techniques, the determination of the size of the DNA fragments contained in a sample is even more difficult. Electrophoresis with direct revelation of the position of DNA by staining is not sensitive enough. This sensitivity can be increased by the use of the Southern technique, more complicated and requiring, even so, excessive sample amounts for certain applications. Thus, with the current methods of analysis, it is impossible to characterize a DNA sample simply and quickly. There is no validated and rigorous technique for simultaneously measuring the DNA mass, estimating the average size and / or establishing the size distribution profile of the DNA fragments to be analyzed. There is therefore a need for a simple and reliable method for characterizing populations of DNA fragments, particularly fragments derived from the random degradation of intact DNA. This is why the objective of the present invention is to meet this need and to overcome the disadvantages of the prior art techniques by proposing a method of characterizing a DNA sample of known origin, which is efficient and effective. easy to implement. For this purpose, the present invention provides a method of characterizing a DNA sample of known origin, containing, before degradation, N copies of an intact DNA fragment of size B, comprising the following steps: a) measurement by quantitative PCR of the number NI of intact copies of a target nucleotide sequence C1 of size L1, L1 being less than or equal to (B-1), b) if the mass N is not known, measured by quantitative PCR of the N2 number of intact copies of a target nucleotide sequence C2 of size L2, L2 being less than L1, c) calculation of the cutoff probability per nucleotide Pcut, using the formula: - Pcut = 1- (N1 / N2) 1112 , if N is not known, or - Pcut = 1- (N1 / N) 1 / L1, if N is known, d) from Pcut, determination of one or more data characterizing the DNA sample , chosen from: the mass N of the DNA contained in the sample, the average size of the DNA fragments contained in the sample, the profile of di stribution of the size of the fragments contained in the sample, the distribution profile of the mass of the fragments contained in the sample, the probability that a nucleotide sequence C of size L is intact, the probability of having a positive PCR, the minimum amount of sample to be used to have a positive PCR, the maximum fragment size that can be amplified with a given amount of DNA sample, the rate of degradation or modification of the DNA. By DNA sample of known origin, is meant a population of DNA whose elements have a unique size B before degradation and for which we can define at least two pairs of primers allowing the amplification of at least two fragments targets of different and known sizes. The mass N corresponds to the initial number N of copies of the intact DNA fragment of size B. The size B corresponds to the number of nucleotides forming a target DNA fragment of known, intact origin. The target nucleotide sequence C1 corresponds to a DNA sequence located on the fragment of size B, of size L1, L1 being less than or equal to (B-1) and expressed in number of nucleotides.

La séquence nucléotidique cible C2 correspond à une séquence d'ADN placée sur le fragment de taille B, de taille L2, L2 étant inférieure à Ll et exprimée en nombre de nucléotides. La probabilité de coupure par nucléotide Pcut correspond à la probabilité que chaque (B-1) liaison nucléotide-nucléotide a de se rompre. Cette expression est une simplification car le site de rupture peut ne pas être situé entre deux nucléotides, mais au niveau d'un nucléotide lui-même. De même on entend par coupure tout évènement conduisant au blocage de la polymérase lors d'une expérience PCR. The target nucleotide sequence C2 corresponds to a DNA sequence placed on the fragment of size B, of size L2, L2 being lower than L1 and expressed in number of nucleotides. The cutoff probability per nucleotide Pcut corresponds to the probability that each (B-1) nucleotide-nucleotide link has to break. This expression is a simplification because the site of rupture can not be located between two nucleotides, but at the level of a nucleotide itself. Similarly, by cleavage is meant any event leading to the blocking of the polymerase during a PCR experiment.

Par taille moyenne des fragments d'ADN on entend la taille des fragments majoritaires en masse dans l'échantillon au moment de l'analyse, quand les coupures sont les seules altérations subies par l'ADN. C'est la taille correspondant au maximum de fluorescence de la population d'ADN lors de l'analyse par électrophorèse sur gel. Par extension, la taille d'un fragment correspond au nombre de nucléotides présents entre deux sites de blocage de la polymérase. Avantageusement, le procédé selon l'invention peut être utilisé dans différents domaines, tels que par exemple la médecine légale, la détection et le dosage d'organismes génétiquement modifiés (OGM), l'étude d'ADN ancien, la recherche dans le domaine médical ou dans tout domaine de recherche où l'on étudie la dégradation ou la modification de l'ADN. La présente invention a également pour objet l'utilisation de ce procédé pour diverses applications. Enfin, l'invention vise également un kit comprenant des éléments permettant la 25 mise en oeuvre du procédé. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description qui va suivre de l'invention, description donnée à titre d'exemple uniquement, en regard des dessins annexés sur lesquels - la figure 1 représente la schématisation d'un fragment d'ADN intact de taille B, - la figure 2 représente un échantillon d'ADN contenant initialement N fragments d'ADN intacts, avant dégradation, après dégradation, et les valeurs 5 NI et N2 obtenues par PCR quantitative, - la figure 3 représente le profil de distribution de la taille des fragments d'ADN contenus dans un échantillon avec B = 200 nucléotides et Pcut = 0,03, avec en abscisse L la longueur des fragments en nucléotides et en ordonnée QL la proportion de fragments de longueur L, 10 - la figure 4 représente le profil de distribution de la masse des fragments d'ADN contenus dans un échantillon avec B = 200 nucléotides et Pcut = 0,03, avec en abscisse L la longueur des fragments en nucléotides et en ordonnée ML la masse des fragments de longueur L, - la figure 5 représente une schématisation de la mise en oeuvre du 15 procédé selon l'invention, - la figure 6 représente un gel électrophorèse en conditions dénaturantes d'échantillons d'ADN génomique digérés à la DNase I, - la figure 7 est un diagramme représentant la quantification d'ADN dégradé pour 10 échantillons d'ADN génomique digérés à la DNase I, l'ordonnée 20 correspondant au nombre de copies d'une séquence nucléotidique à l'échelle logarithmique, et - la figure 8 est un diagramme comparant la taille moyenne calculée à partir de Pcut et mesurée sur gel, à l'échelle logarithmique, des fragments d'ADN dans 10 échantillons d'ADN génomique digérés à la DNase I. 25 L'invention concerne donc un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue, contenant à l'origine N copies d'un fragment d'ADN initial intact 10 tel que représenté sur la figure 1, de taille B constitué de nucléotides 12. By mean size of the DNA fragments is meant the size of the bulk majority fragments in the sample at the time of the analysis, when the cuts are the only alterations suffered by the DNA. This is the size corresponding to the maximum fluorescence of the DNA population during gel electrophoresis analysis. By extension, the size of a fragment corresponds to the number of nucleotides present between two sites of blocking of the polymerase. Advantageously, the method according to the invention can be used in various fields, such as, for example, forensics, detection and dosage of genetically modified organisms (GMOs), the study of old DNA, research in the field. or in any field of research where the degradation or modification of DNA is being studied. The present invention also relates to the use of this method for various applications. Finally, the invention also relates to a kit comprising elements allowing the implementation of the method. Other characteristics and advantages will become apparent from the following description of the invention, a description given by way of example only, with reference to the appended drawings in which - FIG. 1 represents the schematization of an intact DNA fragment of size B; FIG. 2 represents a DNA sample initially containing N intact DNA fragments, before degradation, after degradation, and the NI and N 2 values obtained by quantitative PCR; FIG. 3 represents the distribution profile of the size of the DNA fragments contained in a sample with B = 200 nucleotides and Pcut = 0.03, with the abscissa L the length of the fragments in nucleotides and the ordinate QL the proportion of fragments of length L, 10 - FIG. represents the distribution profile of the mass of the DNA fragments contained in a sample with B = 200 nucleotides and Pcut = 0.03, with the abscissa L the length of the fragments in nucleotides and the ordinate ML the ma 5 shows a schematization of the implementation of the method according to the invention, FIG. 6 represents a gel electrophoresis under denaturing conditions of DNase digested DNA genomic samples. FIG. 7 is a diagram showing the quantification of degraded DNA for 10 genomic DNA samples digested with DNase I, the ordinate corresponding to the number of copies of a nucleotide sequence at the logarithmic scale, and FIG. 8 is a diagram comparing the average size calculated from Pcut and measured on a gel, log-scale, DNA fragments in 10 genomic DNA samples digested with DNase I. The invention thus relates to a method of characterizing a DNA sample of known origin, originally containing N copies of an intact initial DNA fragment 10 as shown in Figure 1, of size B consisting of nucleotides 12 .

A chaque nucléotide, un évènement de coupure peut se produire soit sur le nucléotide lui-même soit entre ce nucléotide et un nucléotide voisin. On peut considérer qu'il s'agit de deux évènements équivalents. Dans le cas présent on considère que la coupure se fait entre deux nucléotides. Chaque liaison 14 nucléotide-nucléotide a une même probabilité Pcut de se rompre, pour donner deux fragments 16 et 18 de tailles inférieures à B. Le procédé consiste dans un premier temps à réaliser une PCR quantitative pour mesurer le nombre NI de copies intactes d'une séquence cible Cl de taille L1, Ll étant inférieure ou égale à (B-1). At each nucleotide, a cleavage event can occur either on the nucleotide itself or between this nucleotide and a neighboring nucleotide. It can be considered that these are two equivalent events. In the present case, it is considered that the cleavage is between two nucleotides. Each 14 nucleotide-nucleotide linkage has the same probability of breaking to give two fragments 16 and 18 of sizes smaller than B. The method consists first of all in carrying out a quantitative PCR to measure the number of intact copies of NIs. a target sequence C1 of size L1, L1 being less than or equal to (B-1).

Pour qu'une séquence d'ADN soit amplifiable par PCR, il faut qu'elle soit intacte sur la totalité de sa longueur, c'est-à-dire non coupée et ne présentant pas de modification chimique ou enzymatique capable de bloquer la progression de la polymérase dans l'étape d'extension de la PCR. La mesure par PCR quantitative du nombre de copies d'un fragment donné dans un échantillon donné d'origine connue donne donc directement le nombre de copies intactes de ce fragment cible. Si la masse N d'ADN, c'est-à-dire le nombre de copies du fragment d'ADN initial intact de taille B contenu dans l'échantillon, est connue, on détermine ensuite la probabilité de coupure par nucléotide Pcut, en appliquant la formule Pcut = 1-( Nl /N) ~~ Ll Si la masse N d'ADN n'est pas connue, le procédé selon l'invention consiste ensuite à réaliser une seconde PCR quantitative pour mesurer le nombre N2 de copies intactes d'une séquence cible C2 de taille L2, L2 étant inférieure à L1. Les étapes a) et b) peuvent consister à réaliser deux PCR quantitatives en monoplex ou une seule PCR quantitative en duplex. For a DNA sequence to be amplifiable by PCR, it must be intact over its entire length, that is to say uncut and without any chemical or enzymatic modification capable of blocking progression. of the polymerase in the PCR extension step. The quantitative PCR measurement of the number of copies of a given fragment in a given sample of known origin thus directly gives the number of intact copies of this target fragment. If the DNA mass N, that is the number of copies of the intact initial DNA fragment of size B contained in the sample, is known, then the cutoff probability per nucleotide Pcut is determined by applying the formula Pcut = 1- (Nl / N) ~~ Ll If the mass N of DNA is not known, the method according to the invention then consists in carrying out a second quantitative PCR to measure the number N2 of intact copies a C2 target sequence of size L2, L2 being less than L1. Steps a) and b) may consist of carrying out two quantitative PCRs in monoplex or a single quantitative PCR in duplex.

Sur la figure 2 est représenté un échantillon d'ADN issu de la dégradation d'une population initiale de N copies d'un fragment intact de taille B nucléotides. Chaque fragment de longueur B porte deux séquences nucléotidiques spécifiques Cl et C2 de tailles Ll et L2 avec L2 < Ll < B-1. Après une certaine dégradation 20 il reste respectivement N1 et N2 copies intactes de chaque séquence cible C1 et C2. Selon l'invention, les nombres de copies intactes N1 et N2 sont mesurés par deux PCR quantitatives : une PCR quantitative 22 spécifique de la cible C1 de taille L1 et une PCR quantitative 24 spécifique de la cible C2 de taille L2. Toute méthode de PCR quantitative peut être utilisée pour mesurer N1 et N2. Il peut s'agir préférentiellement d'une PCR quantitative en temps réel, par exemple avec une sonde Taqman ou avec du SyberGreen. Les nombres N1 et N2 suivent les lois binomiales Bin(N,(1 - P.t)Li-1) et Bin(N,(1 - P.t)L2-1) avec la même probabilité de coupure Pcut. Les rapports N1/N et N2/N sont donc respectivement des estimateurs des probabilités (1 - Pcut)' 14 et (1 - Pcut)L2-1. Comme N est inconnu, ces quantités ne peuvent pas être calculées séparément mais le rapport N1/N2 est un estimateur de (1 - Pcut)L1-1 / (1 - Pcut)L2-1 c'est-à-dire de (1 - Pcut)1/L1-L2 On peut donc estimer la probabilité de coupure par nucléotide Pcut, en 15 appliquant la formule : P.t = 1-(N1/N2)1/(Ll-L2) A partir de Pcut, le procédé consiste à déterminer une ou plusieurs données caractérisant l'échantillon d'ADN, choisie(s) parmi : la masse N de l'ADN contenu dans l'échantillon, la taille moyenne des fragments d'ADN contenus dans 20 l'échantillon, le profil de distribution de la taille des fragments contenus dans l'échantillon, le profil de distribution de la masse des fragments contenus dans l'échantillon d'ADN simulant de manière approximative la distribution électrophorétique des fragments, la probabilité qu'une séquence nucléotidique C de taille L soit intacte, la probabilité d'avoir une PCR positive pour une taille de 25 cible L et pour un nombre de copies initiales N, la quantité minimum d'échantillon à utiliser pour avoir une PCR positive pour une taille de cible L, la taille de fragment L maximum qui peut être amplifiée avec une quantité d'échantillon d'ADN donnée N, la vitesse de dégradation ou de modification de l'ADN. FIG. 2 shows a DNA sample derived from the degradation of an initial population of N copies of an intact fragment of size B nucleotides. Each fragment of length B carries two specific nucleotide sequences C1 and C2 of sizes L1 and L2 with L2 <L1 <B-1. After some degradation, N1 and N2 remain intact copies of each C1 and C2 target sequence, respectively. According to the invention, the intact copy numbers N1 and N2 are measured by two quantitative PCRs: a quantitative PCR 22 specific for the target C1 of size L1 and a quantitative PCR 24 specific for the target C2 of size L2. Any quantitative PCR method can be used to measure N1 and N2. It may be preferentially a quantitative PCR in real time, for example with a Taqman probe or with SyberGreen. The numbers N1 and N2 follow the binomial laws Bin (N, (1 - Pt) Li-1) and Bin (N, (1 - Pt) L2-1) with the same probability of cut Pcut. The ratios N1 / N and N2 / N are respectively estimators of the probabilities (1 - Pcut) '14 and (1 - Pcut) L2-1. Since N is unknown, these quantities can not be calculated separately but the ratio N1 / N2 is an estimator of (1 - Pcut) L1-1 / (1 - Pcut) L2-1 that is to say of (1 - Pcut) 1 / L1-L2 One can thus estimate the cutoff probability per nucleotide Pcut, by applying the formula: Pt = 1- (N1 / N2) 1 / (L1-L2) From Pcut, the process consists of determining one or more data characterizing the DNA sample, chosen from: the mass N of the DNA contained in the sample, the average size of the DNA fragments contained in the sample, the profile of size distribution of the fragments contained in the sample, the distribution profile of the mass of the fragments contained in the DNA sample approximating the electrophoretic distribution of the fragments, the probability of a size C nucleotide sequence L is intact, the probability of having a positive PCR for a target size L and for a cop number N initials, the minimum amount of sample to be used to have a positive PCR for a target size L, the maximum L fragment size that can be amplified with a given amount of DNA sample N, the rate of degradation or modification of the DNA.

La masse N d'ADN peut être déterminée à partir de Pcut sachant que N = Ni / (1- Pcut)LI-1= N2 / (1- Pcut)-2-1. Ainsi, si N n'est pas connu, on peut déterminer cette caractéristique en utilisant la formule : N = N1 / (1- P)'1 ou N = N2 / (1- Pcut)L2-1. Une fois que N est déterminé ou si N est connu, on peut déterminer des intervalles de confiance à 95% selon la formule suivante : Interval le.conf(Pcut) =1ù (1ù Pcut) 1+/ 1,96 1 + 1 ù Z (1- Pculi-1 (1- Pcut)`2-1 Selon un autre aspect de l'invention, il est possible de déterminer à l'étape d) à partir de Pcut la distribution de la taille des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon. Pour cela, pour chaque fragment de longueur L nucléotides, il est nécessaire de considérer QL la probabilité qu'un fragment soit de longueur L après dégradation c'est-à-dire la proportion de fragments de longueur L nucléotides dans l'échantillon. Pour déterminer QL deux situations sont à distinguer. Si L est égal à B, alors QL correspond à la probabilité qu'aucune liaison nucléotide-nucléotide 14 ne se soit rompue, c'est-à-dire la probabilité que le fragment 10 d'origine reste intact. La probabilité pour qu'une liaison nucléotide- nucléotide reste intacte correspond à (1-Pcut). Etant donné qu'il s'agit d'évènements indépendants pour chaque liaison 14, la probabilité permettant aux (B-1) liaisons de rester intactes est (1- Pcut)B-1 Ainsi, si L =B, alors QL _ (1- Pcut)B-1. Si L est inférieur à B, alors le calcul de QL est plus complexe. The mass N of DNA can be determined from Pcut knowing that N = Ni / (1-Pcut) LI-1 = N2 / (1- Pcut) -2-1. Thus, if N is not known, this characteristic can be determined using the formula: N = N1 / (1- P) '1 or N = N2 / (1- Pcut) L2-1. Once N is determined or if N is known, 95% confidence intervals can be determined according to the following formula: Interval le.conf (Pcut) = 1ù (1ù Pcut) 1 + / 1,96 1 + 1 ù According to another aspect of the invention, it is possible to determine in step d) from Pcut the distribution of the size of the DNA fragments. contained in the sample. For this, for each fragment length L nucleotides, it is necessary to consider QL the probability that a fragment is of length L after degradation, that is to say the proportion of length L nucleotide fragments in the sample. To determine QL two situations are to be distinguished. If L is equal to B, then QL is the probability that no nucleotide-nucleotide link 14 has broken down, i.e. the probability that the original fragment remains intact. The probability that a nucleotide-nucleotide link remains intact corresponds to (1-Pcut). Since these are independent events for each link 14, the probability that the (B-1) links remain intact is (1- Pcut) B-1 Thus, if L = B, then QL _ ( 1- Pcut) B-1. If L is less than B, then the calculation of QL is more complex.

Un fragment de longueur L ne peut être formé qu'après un certain nombre s de coupures, et s coupures donnent (s+1) fragments. Le nombre de liaisons nucléotide-nucléotide rompues ne peut excéder (B-L) car dans ce cas au moins une des (L-1) liaisons formant le fragment de longueur L est rompue. La détermination de QL nécessite l'énumération de tous les chemins possibles pour générer un fragment de longueur L après avoir cassé s liaisons, s allant de 1 B-L à (B-1). Ainsi : QL s-~PS.PLis avec PS la probabilité de générer s coupures et PLIS la probabilité que le fragment soit de longueur L sachant qu'il y a eu s coupures. La probabilité de générer s coupures PS peut être déterminée à l'aide d'une loi binomiale de paramètre B-1 et Pcut, (Bin(B-1, Pcut)), c'est-à-dire qu'on considère que l'on renouvelle (B-1) fois de manière indépendante une épreuve de Bernoulli de paramètre Pcut. A fragment of length L can be formed only after a certain number of cuts, and cuts give (s + 1) fragments. The number of broken nucleotide-nucleotide bonds can not exceed (B-L) because in this case at least one of the (L-1) bonds forming the fragment of length L is broken. The determination of QL requires the enumeration of all possible paths to generate a fragment of length L after breaking s bonds, s ranging from 1 B-L to (B-1). Thus: QL s- ~ PS.PLis with PS the probability of generating s cuts and PLIS the probability that the fragment is of length L knowing that there were s cuts. The probability of generating PS cuts can be determined using a binomial law of parameter B-1 and Pcut, (Bin (B-1, Pcut)), that is to say that we consider that one renews (B-1) times independently a test of Bernoulli of parameter Pcut.

L'épreuve de Bernoulli de paramètre Pcut correspond à une expérience aléatoire à deux issues possibles : succès et échec , Putt étant la probabilité de succès et (1- Pcut) la probabilité d'échec. Les évènements sont indépendants et (Pcut)5 est la probabilité que s coupures se produisent. Pour qu'il y ait exactement s coupures, il est nécessaire que les ((B-1)-s) liaisons restantes du fragment restent intactes. Cela se produit avec une probabilité correspondant à (1- Pcut)(B-1)-s. Etant donné que les coupures peuvent se situer n'importe où sur le fragment, il faut prendre en compte le nombre de possibilités de placer s coupures sur un fragment de longueur B. Ainsi, PS = P(Bin(B-1, Pcut)) = CB 1 * s )(B-1}s *(1- Put où CB_1 est le nombre de combinaisons de s éléments parmi B-1. Par ailleurs, la probabilité Pais d'avoir un fragment de longueur L sachant qu'il y a sù1 eu s coupures est : Pais = ` BS1-L , où CB2,_L est le nombre de combinaisons de (s-1) CB-1 The Bernoulli test of Pcut parameter corresponds to a random experiment with two possible outcomes: success and failure, Putt being the probability of success and (1- Pcut) the probability of failure. The events are independent and (Pcut) 5 is the probability that s cuts occur. For there to be exactly cuts, it is necessary that the remaining ((B-1) -s) bonds of the fragment remain intact. This occurs with a probability corresponding to (1- Pcut) (B-1) -s. Since the cuts can be located anywhere on the fragment, it is necessary to take into account the number of possibilities to place s cuts on a fragment of length B. Thus, PS = P (Bin (B-1, Pcut) ) = CB 1 * s) (B-1} s * (1- Put where CB_1 is the number of combinations of s elements among B-1, and the probability of having a fragment of length L knowing that if there are cuts, it is: Pais = `BS1-L, where CB2, _L is the number of combinations of (s-1) CB-1

éléments parmi (B-1-L) et où CB_1 est le nombre de combinaisons de s éléments parmi (B-1). elements among (B-1-L) and where CB_1 is the number of combinations of s elements out of (B-1).

Donc la proportion de fragments de longueur L nucléotides dans l'échantillon peut être déterminée en appliquant la formule : B L Cs Ps (1û P ce 1 s Cs 1 BûL QL Bû1. cut cut B 1ûL ù s=1 Cs 1 Ps /1 ù PB 1-s Ps B Cs Bû1ûL cut• cut) s=1 -1 BûL QL = P (1ùP )L-1 L Cs-1 Ps-1 (1ùP )BûLûs cut cut BûLû1 cut cut s=1 Or, en utilisant la formule du binôme de Newton, on arrive à la simplification suivante : BûL sû1 sû1 BûLûs B 1 CB-Lû1' cut •(1û' cut) = 1 = 1. s=1 Ainsi, si L est inférieur à B, la proportion de fragments de longueur L se définit par : QL = Pcut(1- Pcut)L 1 Le procédé selon l'invention peut donc comprendre une étape basée sur QL la proportion de fragments de longueur L, en utilisant la formule : QL = (1- Pcut)B-1 si L = B, QL = Pcut(1- Pcut)L-1 si 1 L. < B. A partir du calcul des QL, il est possible de déterminer le profil de distribution de la taille des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon, tel que représenté sur la figure 3. En outre, le calcul de QL lorsque L est inférieur à B correspond à une loi géométrique de paramètre Pcut. L'espérance de QL est donc 1/ Pcut c'est-à-dire que la taille moyenne des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon est Lmoy=1/ Pcut si (1/ Pcut) B. Ainsi, selon l'invention, on peut déterminer la taille moyenne Lmoy des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon en utilisant la formule : Lmoy = min(B, 1/P.t). Lmoy correspond à la plus petite valeur choisie entre B et 1/Pcut, car Lmoy ne peut 25 pas être supérieure à B. Thus, the proportion of fragments of length L nucleotides in the sample can be determined by applying the formula: ## EQU1 ## ## EQU1 ## where: ## EQU1 ## PB 1-s Ps B Cs Bû1ûL cut • cut) s = 1 -1 BûL QL = P (1ùP) L-1 L Cs-1 Ps-1 (1ùP) Bûlûs cut cut BûLû1 cut cut s = 1 Gold, using the formula of Newton's binomial, we arrive at the following simplification: B sû sû 1 1 1 '' '' cut cut cut cut cut cut cut Ainsi Ainsi Ainsi Ainsi Ainsi Ainsi Ainsi Ainsi Ainsi Ainsi Ainsi fragments of length L is defined by: QL = Pcut (1-Pcut) L 1 The method according to the invention can therefore comprise a step based on QL the proportion of fragments of length L, using the formula: QL = (1 - Pcut) B-1 if L = B, QL = Pcut (1- Pcut) L-1 if 1 L. <B. From the calculation of QL, it is possible to determine the distribution profile of the fragment size contained in the sample, as shown in FIG. be, the calculation of QL when L is lower than B corresponds to a geometric law of parameter Pcut. The expectation of QL is therefore 1 / Pcut, that is, the average size of the DNA fragments contained in the sample is Lmoy = 1 / Pcut if (1 / Pcut) B. Thus, according to the According to the invention, the average size Lmoy of the DNA fragments contained in the sample can be determined using the formula: Lmoy = min (B, 1 / Pt). Lmoy corresponds to the smallest value chosen between B and 1 / Pcut, since Lmoy can not be greater than B.

Selon un autre aspect de l'invention, pour caractériser l'échantillon d'ADN après avoir déterminé Pcut on peut calculer le profil de distribution de la masse des fragments, et faire une simulation approximative de la distribution électrophorétique de la population de l'échantillon. According to another aspect of the invention, to characterize the DNA sample after determining Pcut, one can calculate the distribution profile of the mass of the fragments, and make an approximate simulation of the electrophoretic distribution of the population of the sample. .

Ce profil est déterminé par le calcul pour chaque fragment de longueur L de ML la masse des fragments de taille L. Selon l'invention, la masse de chaque fragment ML, correspond au produit de la taille L du fragment par sa proportion QL : ML = L.QL, car la masse d'un fragment peut être considérée comme proportionnelle à sa taille du fait que les nucléotides ont des masses voisines. Ainsi, pour déterminer ML, il faut appliquer la formule : - ML = LxPcutx(1-Pcut)L-1 , si 1 L < B-1 - ML = Bx(1-Pcut)B-1 si L=B. A partir du calcul des ML pour chaque fragment de taille L, il est possible d'obtenir une distribution qui pourrait être utilisée pour simuler le profil électrophorétique des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon, tel que représenté sur la figure 4. En particulier ce calcul permet de déterminer la taille correspondant au maximum de ML c'est-à-dire la taille des fragments majoritaires en masse correspondant à la taille moyenne des fragments Lmoy = min (B,1/Pcut). Celle-ci correspond sur gel au maximum d'intensité de fluorescence Imax= Mmax. Ainsi, selon une variante du procédé, il est possible réciproquement de calculer Prut à partir d'un profil électrophorétique expérimental, sans réaliser les étapes a) et b) du procédé, c'est-à-dire sans réaliser de PCR quantitative. En effet, un profil électrophorétique réalisé en conditions dénaturantes permet grâce à des marqueurs de taille, de déterminer la taille de tout fragment à partir de sa distance de migration. Chaque taille de fragment d'ADN est ensuite associée à une intensité. On visualise ainsi une population de fragments comprenant d'une part éventuellement le fragment B non encore dégradé et d'autre part un ensemble de fragments taille inférieure à B. Or, comme la taille relative au maximum d'intensité de ce dernier ensemble, correspond à Lmoy, il est donc possible de déterminer Pcut directement à partir du profil électrophorétique, dans n'importe quel échantillon. L'étape d) du procédé selon l'invention peut également consister à déterminer la probabilité PSeq d'avoir une séquence de L nucléotides spécifique intacte. Cette probabilité peut être déterminée par l'application de la formule : PSeq= (1-Pcut)L-1 Par ailleurs, l'étape d) du procédé selon l'invention peut consister à déterminer à partir de P.t, du nombre N et de la taille de cible L, la probabilité PPCR+ d'avoir une PCR positive, c'est-à-dire la probabilité d'obtenir l'amplification d'au moins une copie d'une séquence de L nucléotides considérée. La probabilité PPcR, correspond à la probabilité d'avoir au moins une séquence ou un petit nombre de séquences de L nucléotides intactes, non dégradée(s). Si on définit les évènements suivants : A : "Aucune séquence n'est intacte" _ "Au moins une coupure sur chacune des séquences" A : "Au moins une séquence est intacte" alors PPCR` =P(A)=1-P(A) Chacune des séquences a une même probabilité [1-(1- Pcut)L-1] d'avoir au moins une coupure. Ainsi, la probabilité que toutes les séquences spécifiques de L nucléotides aient au moins une coupure est : P(A) _ [1-(1- P~~t)L 1]N La probabilité d'avoir une PCR positive PPCR peut donc être déterminée en appliquant la formule : pPCR Pcut)L-1]N Selon un autre aspect de la présente invention, l'étape d) du procédé peut comprendre la détermination à partir de Pcut de la vitesse de dégradation de l'ADN ou constante de dégradation k. En effet, Pcut est une probabilité indépendante de la taille initiale du fragment, qui est fonction du temps t et de la constante de vitesse de coupure d'une liaison nucléotide-nucléotide k à une température donnée. This profile is determined by the calculation for each fragment of length L of ML the mass of the fragments of size L. According to the invention, the mass of each fragment ML, corresponds to the product of the size L of the fragment by its proportion QL: ML = L.QL, because the mass of a fragment can be considered proportional to its size because the nucleotides have neighboring masses. Thus, to determine ML, one must apply the formula: - ML = LxPcutx (1-Pcut) L-1, if 1 L <B-1 - ML = Bx (1-Pcut) B-1 if L = B. From the calculation of the MLs for each fragment of size L, it is possible to obtain a distribution that could be used to simulate the electrophoretic profile of the DNA fragments contained in the sample, as shown in FIG. In particular, this calculation makes it possible to determine the size corresponding to the maximum of ML, that is to say the size of the bulk majority fragments corresponding to the mean size of the fragments Lmoy = min (B, 1 / Pcut). This corresponds on gel to the maximum of fluorescence intensity Imax = Mmax. Thus, according to a variant of the method, it is possible reciprocally to calculate Prut from an experimental electrophoretic profile, without performing steps a) and b) of the method, that is to say without performing quantitative PCR. Indeed, an electrophoretic profile made under denaturing conditions allows, thanks to size markers, to determine the size of any fragment from its migration distance. Each size of DNA fragment is then associated with an intensity. A population of fragments is thus visualized, comprising on the one hand possibly fragment B not yet degraded and, on the other hand, a set of fragments smaller than B. However, since the relative size of the maximum intensity of this latter set corresponds to at Lmoy, it is therefore possible to determine Pcut directly from the electrophoretic profile, in any sample. Step d) of the method according to the invention may also consist in determining the probability PSeq of having a specific L nucleotide sequence intact. This probability can be determined by the application of the formula: PSeq = (1-Pcut) L-1 Moreover, step d) of the process according to the invention can consist in determining, from Pt, the number N and of the target size L, the probability PPCR + to have a positive PCR, that is to say the probability of obtaining the amplification of at least one copy of a sequence of L nucleotides considered. The probability PPcR, corresponds to the probability of having at least one sequence or a small number of intact nucleotide sequences, non-degraded (s). If the following events are defined: A: "No sequence is intact" _ "At least one cut on each of the sequences" A: "At least one sequence is intact" then PPCR` = P (A) = 1-P (A) Each of the sequences has the same probability [1- (1- Pcut) L-1] of having at least one cut. Thus, the probability that all the specific L nucleotide sequences will have at least one cleavage is: P (A) _ [1- (1- P ~~ t) L 1] N The probability of having a positive PCR PPCR can therefore to be determined by applying the formula: pPCR Pcut) L-1] N According to another aspect of the present invention, step d) of the method may comprise determining from Pcut the rate of degradation of the DNA or constant degradation k. Indeed, Pcut is a probability independent of the initial size of the fragment, which is a function of the time t and the cutoff rate constant of a nucleotide-nucleotide link k at a given temperature.

P.t = 1- exp(-k.t) Ainsi, dans un échantillon isolé dont on connaît le temps de stockage t, après avoir effectué les étapes a) à c), il est possible de déterminer la valeur de la constante de vitesse de dégradation k. Cela permet notamment d'évaluer la durée de la conservation de l'ADN. Pt = 1- exp (-kt) Thus, in an isolated sample whose storage time t is known, after performing steps a) to c), it is possible to determine the value of the degradation rate constant k . This allows in particular to evaluate the duration of the conservation of the DNA.

Le procédé selon l'invention peut être en partie mis en oeuvre sur un ordinateur, en particulier les étapes c) et d). Sur la figure 5, les données de la colonne 30 sont les données fournies par l'utilisateur du procédé, celles de la colonne 40 les données déterminées expérimentalement et celles de la colonne 50 les données susceptibles d'être déterminées par un ordinateur. Dans la colonne 30, les données pouvant être fournies par l'utilisateur sont les suivantes - 31 la taille Ll d'une séquence nucléotidique Cl, - 32 la taille L2 d'une séquence nucléotidique C2, - 33 la masse N d'ADN de l'échantillon d'origine (nombre de copies du fragment de taille B intact à l'origine avant toute dégradation) - 34 la taille L d'une séquence nucléotidique C pour laquelle on souhaite réaliser une PCR, - 35 le volume V d'échantillon qui sera placé dans la réaction pour laquelle 25 on souhaite réaliser une PCR, et - 36 le temps t de dégradation. Dans la colonne 40, on a représenté en 43 un thermocycleur comprenant éventuellement un logiciel intégré, permettant de réaliser des PCR quantitatives sur l'échantillon étudié pour les cibles Cl et C2 et obtenir N1 et N2 respectivement représentés par les références 41 et 42. Les données 41 et 42 sont exportées dans un logiciel permettant la mise en oeuvre des étapes c) et/ou d) sur un ordinateur. The method according to the invention can be partly implemented on a computer, in particular steps c) and d). In Fig. 5, the data in column 30 is the data provided by the user of the method, those in column 40 are the experimentally determined data, and those in column 50 are data that can be determined by a computer. In column 30, the data that can be provided by the user are as follows - the size L1 of a nucleotide sequence C1, - the size L2 of a nucleotide sequence C2, - the mass N of DNA of the original sample (number of copies of the originally intact size B fragment before any degradation) - the size L of a nucleotide sequence C for which it is desired to carry out a PCR, - the volume V of sample which will be placed in the reaction for which it is desired to carry out a PCR, and the time of degradation. In column 40, there is shown at 43 a thermal cycler optionally comprising integrated software, making it possible to carry out quantitative PCRs on the sample studied for the targets C1 and C2 and to obtain N1 and N2 respectively represented by references 41 and 42. data 41 and 42 are exported in a software allowing the implementation of steps c) and / or d) on a computer.

Enfin, dans la colonne 50, les données pouvant être calculées à l'aide d'un logiciel mis en oeuvre sur un ordinateur sont : - 51 Pcut, - 52 la distribution des fragments (profil de distribution de la taille des fragments et/ou profil électrophorétique), - 53 N, - 54 la probabilité PPC, d'amplifier un fragment cible de taille Lx, - 55 le volume à utiliser pour avoir une PCR positive sur un fragment cible de taille Lx, et - 56 la vitesse de dégradation. Finally, in column 50, the data that can be calculated using software implemented on a computer are: - 51 Pcut, - 52 the fragment distribution (fragment size distribution profile and / or electrophoretic profile), - 53 N, - 54 the probability PPC, to amplify a target fragment of size Lx, - 55 the volume to be used to have a positive PCR on a target fragment of size Lx, and - 56 the rate of degradation .

Avantageusement, le procédé selon l'invention, qu'il soit ou non mis en oeuvre en partie sur un ordinateur, peut permettre de caractériser de faibles quantités d'ADN dégradés. Il peut être utilisé dans différents domaines. Il peut bien entendu être appliqué à la détermination de la taille des fragments et de la quantité d'ADN dans un échantillon. Il peut aussi être utile par exemple pour caractériser un échantillon avant de réaliser d'autres analyses et pour déterminer la quantité d'un échantillon minimum à utiliser pour avoir une PCR positive avec un fragment de taille donnée, ou la taille maximum qui peut être amplifiée avec une quantité donnée d'échantillon. Parmi les nombreuses applications du procédé selon l'invention on peut citer notamment la médecine légale, les études portant sur l'ADN ancien, la médecine par exemple pour la caractérisation d'ADN dans le sérum pour le diagnostic du cancer, la zoologie pour la caractérisation d'ADN à partir de plumes, poils ou déjections, la détection des fraudes pour la quantification de la contamination en OGM dans un produit alimentaire, l'UV dosimetry (Hegedus et al., 2003), l'étude de la dégradation de l'ADN en général ou encore pour la quantification des lésions induites par des produits chimiques, l'oxydation ou les radiations. Le procédé selon l'invention est particulièrement intéressant pour caractériser une contamination d'un produit par les OGM, c'est-à-dire pour la détection et le dosage d'un organisme génétiquement modifié dans un échantillon de produit donné, en particulier pour les produits alimentaires où l'ADN est souvent très dégradé à cause des traitements subis par le produit. En effet, actuellement le taux de contamination par les OGM peut être évalué par PCR quantitative en utilisant des cibles spécifiques respectivement de l'OGM et du produit. Généralement les deux PCR quantitatives sont conduites sur deux cibles de taille similaire dans le but d'avoir des efficacités d'amplification équivalentes. Cependant cette méthode repose sur l'hypothèse que les ADN des deux organismes (modifié et non modifié) se dégradent à la même vitesse, en particulier qu'ils ont subi le même traitement et donc les mêmes processus de dégradation ce qui n'est pas forcément le cas. Ceci est particulièrement vrai pour les produits alimentaires où l'ADN est souvent très dégradé à cause des traitements subis par le produit. Avantageusement le procédé selon l'invention pallie les inconvénients de l'art antérieur. Il peut être utilisé dans un échantillon d'un produit X contenant potentiellement des produits génétiquement modifiés XM. Il consiste alors à appliquer le procédé pour le produit génétiquement modifié XM et pour le produit non génétiquement modifié X, afin de déterminer la masse d'ADN du produit XM, la masse d'ADN du produit X, la taille moyenne des fragments d'ADN du produit XM, la taille moyenne des fragments d'ADN du produit X et le pourcentage de contamination de l'échantillon en produits XM. Il est possible de réaliser les étapes a) et b) du procédé pour X et pour XM en effectuant une PCR quantitative en quadruplex ou en effectuant deux PCR quantitatives en duplex ou encore quatre PCR quantitatives en monoplex, avec des amorces adéquates c'est-à-dire deux couples spécifiques de l'OGM XM et deux couples spécifiques du produit contaminé X. Le procédé selon l'invention est également particulièrement utile pour des analyses effectuées par la police scientifique ou encore pour un praticien de l'ADN ancien. En particulier, le procédé selon l'invention peut être utilisé pour déterminer la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage ou pour donner une indication sur les risques de contamination d'un ADN ancien par de l'ADN moderne. Advantageously, the method according to the invention, whether or not it is implemented in part on a computer, can make it possible to characterize small amounts of degraded DNA. It can be used in different areas. It can of course be applied to the determination of the size of the fragments and the amount of DNA in a sample. It may also be useful, for example, to characterize a sample before performing other analyzes and to determine the amount of a minimum sample to be used to have a positive PCR with a fragment of a given size, or the maximum size that can be amplified. with a given amount of sample. Among the numerous applications of the method according to the invention, mention may in particular be made of forensic medicine, studies relating to ancient DNA, medicine for example for the characterization of DNA in the serum for the diagnosis of cancer, zoology for the diagnosis of cancer. characterization of DNA from feathers, hairs or excrement, the detection of fraud for the quantification of GMO contamination in a food product, the UV dosimetry (Hegedus et al., 2003), the study of the degradation of DNA in general or for quantification of lesions induced by chemicals, oxidation or radiation. The process according to the invention is particularly advantageous for characterizing a contamination of a product by GMOs, that is to say for the detection and the determination of a genetically modified organism in a given product sample, in particular for food products where the DNA is often very degraded because of the treatments suffered by the product. Indeed, currently the rate of contamination by GMOs can be evaluated by quantitative PCR using specific targets of the GMO and the product respectively. Generally, the two quantitative PCRs are conducted on two targets of similar size in order to have equivalent amplification efficiencies. However, this method is based on the assumption that the DNAs of the two organisms (modified and unmodified) degrade at the same rate, in particular that they have undergone the same treatment and therefore the same degradation processes, which is not the case. necessarily the case. This is particularly true for food products where the DNA is often very degraded because of the treatments the product undergoes. Advantageously, the method according to the invention overcomes the disadvantages of the prior art. It can be used in a sample of a product X potentially containing XM genetically modified products. It then consists in applying the process for the genetically modified product XM and for the non-genetically modified product X, in order to determine the mass of DNA of the product XM, the mass of DNA of the product X, the average size of the fragments of XM product DNA, the average product X DNA fragment size, and the percentage of sample contamination of XM products. It is possible to perform steps a) and b) of the method for X and for XM by carrying out a quantitative PCR in quadruplex or by carrying out two quantitative PCRs in duplex or four quantitative PCRs in monoplex, with appropriate primers. that is to say, two specific pairs of the GMO XM and two specific pairs of the contaminated product X. The method according to the invention is also particularly useful for analyzes carried out by the forensic scientist or for a practitioner of the old DNA. In particular, the method according to the invention can be used to determine the optimal amount of sample to be used for a genotyping analysis or to give an indication of the risks of contamination of an old DNA by modern DNA.

Le procédé selon l'invention est également utile pour des chercheurs dans le domaine médical par exemple pour des analyses d'ADN extracellulaires ou en bactériologie ou encore dans tout domaine de recherche où l'on étudie la dégradation et/ou la modification de l'ADN. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un kit pour la mise en 15 oeuvre du procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN. Ce kit comprend au moins : - des amorces pour amplifier respectivement des séquences Cl de taille Ll et C2 de taille L2, L2 étant inférieure à L1, et Ll inférieure ou égale à (B-1), - des réactifs pour effectuer la ou les PCR quantitative(s), à savoir au 20 moins des tampons, des enzymes et un système de détection par fluorescence, et - une notice explicative expliquant la mise en oeuvre du procédé. Le kit peut également comprendre un programme d'ordinateur permettant la mise en oeuvre sur un ordinateur des étapes c) et d) du procédé. Ainsi, un technicien de la police scientifique qui souhaite analyser un échantillon 25 d'ADN d'origine connue, peut à partir d'un kit selon l'invention : - effectuer une PCR quantitative en duplex avec des amorces pour Cl et C2, ou deux PCR quantitatives en monoplex, - exporter les données obtenues (N1 et N2) et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à la médecine légale, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'échantillon, sa taille moyenne, la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage, déterminer la taille maximum de cible que l'on peut amplifier à partir d'un échantillon donné, et déterminer la probabilité d'une PCR positive pour une masse et une taille de cible données. Un praticien de l'ADN ancien qui souhaite analyser un échantillon d'ADN ancien d'origine connue, peut à partir d'un kit selon l'invention - effectuer une PCR quantitative en duplex avec des amorces pour Cl et C2, ou deux PCR quantitatives en monoplex, - exporter les données obtenues (N1 et N2) et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à l'ADN ancien, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'échantillon, sa taille moyenne, la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage, déterminer la taille maximum de cible que l'on peut amplifier à partir d'un échantillon donné, déterminer la probabilité d'une PCR positive pour une masse et une taille de cible données et donner une indication sur les risques de contamination. The method according to the invention is also useful for researchers in the medical field for example for extracellular DNA or bacteriology or in any field of research where the degradation and / or modification of the research is studied. DNA. In another aspect, the present invention relates to a kit for carrying out the method of characterizing a DNA sample. This kit comprises at least: primers for amplifying respectively C1 sequences of size L1 and C2 of size L2, L2 being less than L1, and L1 less than or equal to (B-1), reagents for carrying out the Quantitative PCR (s), namely at least buffers, enzymes and a fluorescence detection system, and an explanatory note explaining the implementation of the method. The kit may also include a computer program for implementing steps c) and d) of the method on a computer. Thus, a forensic technician who wishes to analyze a DNA sample of known origin, can from a kit according to the invention: carry out a quantitative duplex PCR with primers for C1 and C2, or two quantitative PCRs in monoplex, - export the obtained data (N1 and N2) and other data into a specific computer program suitable for forensic medicine, and - use this software to determine the DNA mass of the sample , its average size, the optimal amount of sample to be used for a genotyping analysis, determine the maximum target size that can be amplified from a given sample, and determine the probability of a positive PCR for a given sample. mass and a given target size. An old DNA practitioner who wishes to analyze an old DNA sample of known origin, can from a kit according to the invention - perform a quantitative duplex PCR with primers for Cl and C2, or two PCRs in monoplex, - export the obtained data (N1 and N2) and other data into a specific computer program suitable for the old DNA, and - use this software to determine the DNA mass of the sample, its average size, the optimal amount of sample to be used for a genotyping analysis, determine the maximum target size that can be amplified from a given sample, determine the probability of a positive PCR for a mass and a given target size and give an indication of the risk of contamination.

Pour la détection et le dosage d'un OGM dans un produit alimentaire, un praticien peut à partir d'un kit selon l'invention : - effectuer une PCR quantitative en quadruplex, ou deux PCR quantitatives en duplex ou quatre PCR quantitatives en monoplex, avec deux couples d'amorces spécifiques de l'OGM C1 et C2, et deux couples d'amorces spécifiques du produit alimentaire Cl' et C2', - exporter les données obtenues (N1, N2, Ni' et N2') et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à la recherche, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'OGM et du produit alimentaire, leurs tailles moyennes, et le pourcentage de contamination du produit alimentaire. Pour un chercheur qui souhaite analyser un échantillon d'ADN très dégradé, il peut à partir d'un kit selon l'invention : - effectuer une PCR quantitative en duplex avec des amorces pour Cl et C2, ou deux PCR quantitatives en monoplex, - exporter les données obtenues (N1 et N2) et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à la recherche, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'échantillon, sa taille moyenne, la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage, déterminer la taille maximum de cible que l'on peut amplifier à partir d'un échantillon donné, déterminer la probabilité d'une PCR positive pour une masse et une taille de cible données, et déterminer une vitesse de modification ou de dégradation. Pour un chercheur qui souhaite analyser un échantillon d'ADN peu dégradé, par exemple, il peut à partir d'un kit selon l'invention : - effectuer une pré-amplification d'un grand fragment d'ADN, - effectuer une PCR quantitative en duplex avec des amorces pour C1 et C2, 20 ou deux PCR quantitatives en monoplex, la séquence Cl étant prise dans le fragment préamplifié, - exporter les données obtenues (N1 et N2) et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à la recherche, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'échantillon, sa 25 taille moyenne, et une vitesse de dégradation et/ou de modification. L'invention est à présent illustrée par un exemple réalisé sur des échantillons d'ADN génomique. For the detection and the assay of a GMO in a food product, a practitioner can from a kit according to the invention: - carry out a quantitative PCR in quadruplex, or two quantitative PCR duplex or four quantitative PCR in monoplex, with two pairs of primers specific for the GMO C1 and C2, and two pairs of specific primers of the food product Cl 'and C2', - exporting the data obtained (N1, N2, Ni 'and N2') and of other data in a specific computer program suitable for research, and - use this software to determine the DNA mass of the GMO and the food product, their average sizes, and the percentage of contamination of the food product. For a researcher who wishes to analyze a highly degraded DNA sample, he can from a kit according to the invention: - carry out a quantitative duplex PCR with primers for C1 and C2, or two quantitative PCR monoplex, - export the obtained data (N1 and N2) and other data into a specific computer program suitable for research, and - use this software to determine the DNA mass of the sample, its average size, the optimal amount sample to be used for genotyping analysis, determine the maximum target size that can be amplified from a given sample, determine the probability of a positive PCR for a given target mass and size, and determine a rate of change or degradation. For a researcher who wishes to analyze a sample of little degraded DNA, for example, it can from a kit according to the invention: - carry out a pre-amplification of a large DNA fragment, - perform a quantitative PCR in duplex with primers for C1 and C2, or two quantitative PCRs in monoplex, the C1 sequence being taken in the preamplified fragment, - exporting the obtained data (N1 and N2) and other data in a specific computer program Suitable for research, and - use this software to determine the sample DNA mass, its average size, and a rate of degradation and / or modification. The invention is now illustrated by an example made on genomic DNA samples.

Dans l'exemple les échantillons génomiques sont digérés à la DNase I pour générer des populations de fragments de tailles décroissantes et de masse connue. Ces populations sont ensuite analysées par PCR quantitative en temps réel sur deux tailles de fragments et en parallèle analysées par électrophorèse dénaturante pour évaluer la taille moyenne majoritaire en masse, c'est-à-dire où il y a le maximum d'intensité. Les résultats de la PCR quantitative permettent de calculer Pcut et donc de déterminer le nombre de copies introduites dans la PCR et la taille moyenne des échantillons. Ces données sont comparées à la quantité d'ADN connue introduite et à la taille déterminée sur gel. In the example, the genomic samples are digested with DNase I to generate populations of fragments of decreasing size and known mass. These populations are then analyzed by quantitative PCR in real time on two sizes of fragments and in parallel analyzed by denaturing electrophoresis to evaluate the average mass majority, that is to say, where there is the maximum intensity. The results of the quantitative PCR make it possible to calculate Pcut and thus to determine the number of copies introduced into the PCR and the average size of the samples. These data are compared with the amount of known DNA introduced and the size determined on gel.

I. Matériel et méthode Les échantillons d'ADN génomique utilisés sont extraits de prélèvements sanguins par la méthode au phénol chloroforme. I.1 Dégradation de l'ADN génomique en solution à la DNaseI Pour obtenir une collection d'échantillons contenant chacun une même masse d'ADN et des fragments d'ADN de tailles décroissantes, la réaction enzymatique est réalisée à 37°C dans un tube unique et des aliquotes de volumes identiques sont prélevées à divers temps de dégradation. La DNase I est utilisée en présence de MgCl2 et catalyse la formation aléatoire de coupures simple brin. I. Material and method The genomic DNA samples used are extracted from blood samples by the phenol chloroform method. I.1 Degradation of genomic DNA in solution with DNaseI To obtain a collection of samples each containing the same mass of DNA and DNA fragments of decreasing size, the enzymatic reaction is carried out at 37 ° C. in a single tube and aliquots of identical volumes are taken at various degradation times. DNase I is used in the presence of MgCl2 and catalyzes the random formation of single-strand breaks.

La solution de DNase I est préparée comme suit : une dilution d'une solution de DNase I (Sigma D5025 650 pg.mL-1) est réalisée au 1/2166ème par dilutions successives dans de l'eau ultra-pure (5 pL de DNase I + 45 pL d'eau puis 10 pL + 90 pL d'eau puis 20 pL + 180 pL d'eau puis 115,4 pL + 134,6 pL d'eau). On utilise un pré-mix d'ADN contenant dans un volume de 900 pL, 200 pg d'ADN génomique dans un tampon Tris HCI 55 mM, en présence de 4mM de MgCl2. Un volume réactionnel de 75 pL contenant 15 pg d'ADN est prélevé en cours de digestion à des temps donnés. La réaction est bloquée par ajout de 37,5 pL d'EDTA 0,1 M suivi d'un chauffage de 10 minutes à 70°C et d'un refroidissement dans la glace. The DNase I solution is prepared as follows: a dilution of a solution of DNase I (Sigma D5025 650 μg.mL-1) is carried out at 1 / 2166th by successive dilutions in ultrapure water (5 μl of DNase I + 45 μL of water then 10 μL + 90 μL of water then 20 μL + 180 μL of water then 115.4 μL + 134.6 μL of water). A pre-mix of DNA containing in a volume of 900 μl, 200 μg of genomic DNA in a 55 mM Tris HCl buffer, is used in the presence of 4 mM of MgCl 2. A reaction volume of 75 μL containing 15 μg of DNA is taken during digestion at given times. The reaction is blocked by adding 37.5 μl of 0.1 M EDTA followed by heating for 10 minutes at 70 ° C. and cooling in ice.

Une fraction de 50 pL de chaque échantillon est prélevée et stockée à -20°C pour les analyses par PCR quantitatives. Le reste des échantillons est précipité pour être concentré, par ajout de 2 volumes d'éthanol absolu en présence de 0,1 volume de NaCl 5 M et de 1 pL de glycogène à 20 mg.mL-1. Après incubation d'une nuit à -20°C et centrifugation 20 min à 13 000 rpm à 4°C, les surnageants sont éliminés et les culots d'ADN sont lavés avec 500 pL d'éthanol à 70%. Le lavage est répété et les culots sont remis en solution dans 10 pL de Tris HCI 0,01 M à pH 7,5. A 50 μL fraction of each sample is taken and stored at -20 ° C for quantitative PCR assays. The rest of the samples are precipitated to be concentrated, by adding 2 volumes of absolute ethanol in the presence of 0.1 volume of 5M NaCl and 1 μl of glycogen at 20 mg.mL-1. After overnight incubation at -20 ° C and centrifugation for 20 min at 13,000 rpm at 4 ° C, the supernatants are removed and the DNA pellets are washed with 500 μl of 70% ethanol. The washing is repeated and the pellets are redissolved in 10 μl of 0.01 M Tris HCl pH 7.5.

I.2. Analyses par PCR I.2. PCR analyzes

Les amorces utilisées sont dessinées à l'aide du logiciel Primer 3. Les amorces sont choisies de manière à avoir une taille de 20 nucléotides, une "température de fusion" leur permettant de s'hybrider à 55°C et un pourcentage de G + C (Guanine + Cytosine) de 45%. The primers used are drawn using the Primer 3 software. The primers are chosen so as to have a size of 20 nucleotides, a "melting temperature" enabling them to hybridize at 55 ° C. and a percentage of G + C (Guanine + Cytosine) 45%.

Séquences des amorces (5'->3') p-2-micro-globuline sur ADN génomique de cheval B2M-328-s CCT TAG CTG CTG ACG GTT GT 328 pb 20 B2M-328-as GCA GGG CTT ACA GAC AA GG B2M-161-s CAC CCC CAA TGT TTC TCA CT B2M-161-as CCT GCC AGA GGT TAC TGG AG 25 Pour chaque PCR, le mélange suivant est réalisé, les concentrations données étant les concentrations finales : 2,5 pL de tampon 10x Platinum Taq Polymerase (Invitrogen) lx 0,75 pL de MgCl2 (Invitrogen) 1,5mM 161 pb Sequences of primers (5 '-> 3') p-2-micro-globulin on genomic horse DNA B2M-328-s CCT TAG CTG CTG ACG GTT GT 328 bp 20 B2M-328-as GCA GGG CTT ACA GAC AA GG B2M-161-s CAC CCC CAA TGT TTC TCA CT B2M-161-AS CCT GCC AGA GGT TAC TGG AG For each PCR, the following mixture is carried out, the concentrations given being the final concentrations: 2.5 μl of buffer 10x Platinum Taq Polymerase (Invitrogen) 1x 0.75 μl MgCl 2 (Invitrogen) 1.5 mM 161 bp

0,5 pL de dNTPs à 10mM de chaque (Promega) 0,2mM 0,5 pL de chacune des amorces à 10 pM 0,2 pM 0,1 pL de Platinum Taq polymerase (Invitrogen) 1 IL de Sybr Green I au 1/1 000ème (Molecular probes) q.s.p. 25 pL avec de l'eau ultra-pure selon le volume d'ADN utilisé. Concernant les dispositifs utilisés, le Rotor Gene 3000 de Corbett Research est utilisé. Les cycles de PCR sont programmés comme suit : Dénaturation / activation de l'enzyme 2 minutes à 94°C Dénaturation 30 secondes à 94°C Hybridation 30 secondes à 55°C 45 cycles Elongation 1 minute à 72°C Elongation finale 1 minute à 72°C Une courbe de fusion (melt) est programmée en fin de réaction. Elle permet pour chaque réaction de mesurer la température de fusion (Jennerwein & Eastman) des produits amplifiés afin de vérifier la spécificité de la PCR et l'unicité des produits obtenus (absence de dimères d'amorces notamment). Au cours des cycles, l'acquisition du signal de fluorescence du SybrGreen est réalisée à la fin de chaque étape d'élongation (lorsque les produits de la PCR sont sous forme double brin). I.3. Electrophorèses Les échantillons sont additionnés de tampon de charge dénaturant (NaOH 0,3M, EDTA 6mM, glycérol 30%, bleu de bromophénol 0,25%, xylène cyanol 0,25%). Le gel d'agarose est additionné de 50mM de NaOH. Les échantillons et des standards de taille sont déposés et mis à migrer à 20V pendant 16 heures en chambre froide. Après migration, le gel est placé dans un bain de neutralisation (Tris HCI 1M pH 7,5, NaCl 1,5 M) pendant 40 min. Il est ensuite coloré dans un bain de SybrGreen II dilué au 10 000ème dans du TAE 0,5x pendant 7 h sous agitation. Le gel est ensuite placé sur un transilluminateur UV et photographiés par un appareil de photographie numérique équipé du filtre approprié grâce au système Visio-mic (Genomic SA). Une fois le gel photographié, le logiciel permet de repérer chaque piste (le lieu de passage des molécules à partir de chaque puits) et trace le profil d'intensité en fonction de la distance de migration. D'autre part, les profils d'intensités des marqueurs sont enregistrés avec les tailles qui leur correspond, celles-ci servant d'étalon pour la détermination des tailles des fragments d'ADN selon leur distance de migration. Ces profils sont exportés dans le logiciel Microsoft Excel et pour chaque échantillon analysé, la taille du maximum d'intensité (Lmoy) est déterminée. II. Exemple Des échantillons d'ADN génomique de concentration connue sont digérés à la DNase I. Ils sont analysés par gel dénaturant et par qPCR (SybrGreen) en triple afin de déterminer les nombres N1 et N2 de copies amplifiables des fragments C1 et C2 de taille L1 = 328 et L2 = 161 dans les échantillons digérés. Les résultats de la digestion à la DNase I sont présentés sur la figure 6. Sur cette figure t1 à t10 correspondent respectivement à 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 40, 50 et 60 minutes et M1 au marqueur A/Hind III(Promega), M2 au marqueur 100bp DNA ladder (Invitrogen) et M3 au marqueur 1kb DNA ladder (NEB). On constate que la digestion à la DNase I permet d'obtenir des fragments de tailles moyennes décroissantes. La détermination directe des tailles moyennes étant difficile à partir du gel, elle est réalisée avec le tracé des profils dans Excel. La taille correspondant au maximum d'intensité est déterminée pour chaque temps de dégradation. Les résultats de la PCR quantitative ainsi que le calcul du nombre de copies du fragment introduit à l'origine N par N = N1 / (1- P.-F)' 14 ou N = N2 / (1- P.-F)-24 sont présentés sur la figure 7 pour 10 échantillons. On constate que le nombre de copies est constant au cours de la digestion et que le procédé selon l'invention permet d'obtenir une bonne estimation de N. La quantification donne bien la valeur de nombre de copies N attendu. En outre, la figure 8 permet de comparer pour chaque échantillon la taille 5 moyenne des fragments, mesurée sur gel et calculée par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention avec Lmoy = min (B, 1/Prut). On constate qu'il y a une très bonne corrélation entre les tailles calculées et mesurées. Le procédé selon l'invention permet donc une bonne détermination de la taille moyenne des fragments dégradés Lmoy• 0.5 μl of dNTPs at 10 mM of each (Promega) 0.2 mM 0.5 μl of each of the primers at 10 μM 0.2 μM 0.1 μL Platinum Taq polymerase (Invitrogen) 1 μL Sybr Green I at 1 / 1000th (Molecular probes) qsp 25 μl with ultrapure water depending on the volume of DNA used. For the devices used, the Rotor Gene 3000 from Corbett Research is used. The PCR cycles are programmed as follows: Denaturation / activation of the enzyme 2 minutes at 94 ° C Denaturation 30 seconds at 94 ° C Hybridization 30 seconds at 55 ° C 45 cycles Elongation 1 minute at 72 ° C Final elongation 1 minute at 72 ° C A melting curve (melt) is programmed at the end of the reaction. For each reaction, it makes it possible to measure the melting point (Jennerwein & Eastman) of the amplified products in order to verify the specificity of the PCR and the uniqueness of the products obtained (absence of primer dimers in particular). During the cycles, the SybrGreen fluorescence signal is acquired at the end of each elongation step (when the PCR products are in double-stranded form). I.3. Electrophoresis The samples are treated with denaturing loading buffer (0.3M NaOH, 6mM EDTA, 30% glycerol, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol). The agarose gel is added with 50 mM NaOH. Samples and size standards are deposited and migrated at 20V for 16 hours in a cold room. After migration, the gel is placed in a neutralization bath (1M Tris HCl pH 7.5, 1.5 M NaCl) for 40 min. It is then stained in a SybrGreen II bath diluted to 10,000th in 0.5x TAE for 7 hours with stirring. The gel is then placed on a UV transilluminator and photographed by a digital camera equipped with the appropriate filter using the Visio-mic system (Genomic SA). Once the gel has been photographed, the software tracks each track (the place where the molecules pass from each well) and traces the intensity profile according to the migration distance. On the other hand, the intensity profiles of the markers are recorded with corresponding sizes, which serve as a standard for determining the size of the DNA fragments according to their migration distance. These profiles are exported in the Microsoft Excel software and for each sample analyzed, the size of the maximum intensity (Lmoy) is determined. II. EXAMPLE Genomic DNA samples of known concentration are digested with DNase I. They are analyzed by denaturing gel and by qPCR (SybrGreen) in triplicate in order to determine the numbers N1 and N2 of amplifiable copies of fragments C1 and C2 of size L1. = 328 and L2 = 161 in the digested samples. The results of DNase I digestion are shown in FIG. 6. In this figure t1 to t10 correspond respectively to 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 40, 50 and 60 minutes and M1 to marker A respectively. / Hind III (Promega), M2 to the 100bp DNA ladder marker (Invitrogen) and M3 to the 1kb DNA ladder marker (NEB). It is found that digestion with DNase I makes it possible to obtain fragments of decreasing average sizes. The direct determination of the average sizes being difficult from the freezing, it is realized with the drawing of the profiles in Excel. The size corresponding to the maximum intensity is determined for each degradation time. The results of the quantitative PCR as well as the calculation of the number of copies of the fragment originally introduced N by N = N1 / (1-P.-F) '14 or N = N2 / (1-P.-F) -24 are shown in Figure 7 for 10 samples. It can be seen that the number of copies is constant during digestion and that the method according to the invention makes it possible to obtain a good estimate of N. The quantification gives the expected number of copies N. In addition, FIG. 8 compares for each sample the average size of the fragments, measured on gel and calculated by the implementation of the process according to the invention with Lmoy = min (B, 1 / Prut). It is found that there is a very good correlation between the calculated and measured sizes. The method according to the invention therefore allows a good determination of the average size of the degraded fragments Lmoy •

Claims

REVENDICATIONS1. A method of characterizing a DNA sample of known origin, containing, prior to degradation, N copies of an intact DNA fragment of size B, comprising the following steps: a) quantitative PCR measurement of the number N1 of copies intact of a target nucleotide sequence Cl of size L1, L1 being less than or equal to (B-1), b) quantitative PCR measurement of the number N2 of intact copies of a target nucleotide sequence C2 of size L2, L2 being less than at L1, c) calculation of the cutoff probability per nucleotide Pcut, using the formula: Pcut = 1- (NI / N2) 1 / ('I-2), d) from Pcut, determination of a or several data characterizing the DNA sample, chosen from: the mass N of the DNA contained in the sample corresponding to the initial number of copies of the intact DNA fragment of size B, the average size of the DNA fragments contained in the sample; - the size distribution profile of the fragments contained in the sample; sample, the distribution profile of the mass of the fragments contained in the DNA sample, the probability that a nucleotide sequence is intact, the probability of having a positive PCR, the minimum quantity of sample to use to have a positive PCR, - the maximum size of a target that can be amplified with a given amount of DNA sample, - the rate of degradation or modification of the DNA.

2. A method of characterizing a DNA sample of known origin, containing, prior to degradation, N copies of an intact DNA fragment of size B, wherein N is known, comprising the steps of: a) measurement by Quantitative PCR of the N1 number of intact copies of a target nucleotide sequence Cl of size L1, L1 being less than or equal to (B-1), c) calculation of the cutoff probability per nucleotide Pcut, using the formula: Pcut = 1- (N1 / N) 1 / L1 d) from Pcut, determination of one or more data (s) characterizing the DNA sample, chosen from: - the average size of the fragments of DNA contained in the sample, - the size distribution profile of the fragments contained in the sample, - the distribution profile of the mass of the fragments contained in the DNA sample, - the probability that a nucleotide sequence is intact, - the probability of having a positive PCR, - the minimum quantity of sample n to use to have a positive PCR, - the maximum size of a target that can be amplified with a given amount of DNA sample, - the rate of degradation or modification of the DNA.

3. A method of characterizing a DNA sample of known origin according to claim 1, characterized in that step d) comprisesdetermination from Pcut of the mass N of the DNA contained in the sample, corresponding to the initial copy number of the intact DNA fragment of size B, using the formula: N = N1 / (1- Pcut) '14 or N = N2 / (1- P)' 24.

4. A method of characterizing a DNA sample of known origin according to one of claims 1 to 3, characterized in that step d) comprises the determination from Pcut of the average size Lmoy fragments of d DNA contained in the sample using the formula: Lmoy = min (B, 1 / Prut).

5. A method of characterizing a DNA sample of known origin according to one of the preceding claims, characterized in that step d) comprises the determination from Pcut of the distribution profile of the size of the fragments. DNA contained in the sample by calculating for each target C of length L, QL the proportion of fragments of length L, using the formula: - QL = (1- Pt) B-1 if L = B, - QL = Pt (1-Pt) L-1 if 1 L <B.

6. A method of characterizing a DNA sample of known origin according to one of the preceding claims, characterized in that step d) comprises the determination from Pcut of the distribution profile of the mass of the fragments contained. in the sample by calculating for each target C of length L, ML the mass of fragments of size L, using the formula: - ML = LxP.tx (1-Pcut) L-1, if 1 L <B-1 ML = Bx (1-Pcut) B-1 if L = B.

7. A method of characterizing a DNA sample of known origin according to any one of the preceding claims, characterized in that part of said method is carried out on a computer.

8. A method of characterizing a DNA sample of known origin according to claim 7, characterized in that steps c) and d) are implemented on a computer.

9. Use of the method according to any one of the preceding claims for detecting and assaying a genetically modified organism in a given product sample.

10. Use of the method according to one of claims 1 to 8, in a sample of a product X, potentially containing XM genetically modified products, characterized in that it consists in applying the process for the genetically modified product XM and for the non-genetically modified product X, in order to determine the XM product DNA mass, the product X DNA mass, the average XM product DNA fragment size, the average size of the XM product DNA fragments, product X and the percentage of contamination of the sample with XM products.

11. Use of the method according to one of claims 1 to 8, to determine the optimal amount of sample to be used for a genotyping analysis.

12. Use of the method according to one of claims 1 to 8, to give an indication of the risk of contamination of an old DNA by modern DNA.

13. Use of the method according to one of claims 1 to 8, to study the rate of degradation and / or modification of the DNA.

14. Kit for carrying out the method according to one of claims 1 to 8, characterized in that it comprises at least - primers for amplifying a C1 sequence of size L1 and C2 of size L2, L1 being less than L2, and L2 less than or equal to (B-1), - reagents for carrying out the quantitative PCR (s), namely at least buffers, enzymes and a fluorescence detection system, and - a explanatory note explaining the implementation of the method.

15. Kit according to claim 14, characterized in that it also comprises a computer program for implementing on a computer steps c) and d) of the method according to one of claims 1 to 8.