FR2933198A1 - Procede de fabrication d'un biocapteur sur substrat semi-conducteur - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne un procédé de fabrication d'un biocapteur sur une plaquette de semi-conducteur, comprenant des étapes consistant à : réaliser une zone photosensible centrale (116) comprenant au moins un dispositif d'analyse biologique de type pixel comprenant une couche photosensible, et une première zone périphérique (116) entourant la zone photosensible centrale, comprenant des circuits électroniques. La première zone périphérique (116) est recouverte d'un revêtement hydrophile, et la zone photosensible centrale est recouverte d'un revêtement hydrophobe. Une barrière d'une résine biocompatible (119) est formée sur la seconde zone périphérique (118).

Description

PROCEDE DE FABRICATION D'UN BIOCAPTEUR SUR SUBSTRAT SEMI- CONDUCTEUR
La présente invention concerne un dispositif d'analyse biologique de type pixel. La présente invention concerne également un biocapteur CMOS comportant une pluralité de dispositifs d'analyse biologique de type pixel disposés en une matrice de pixels. La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse biologique de type pixel et un procédé de fabrication d'un biocapteur CMOS comportant une pluralité de dispositifs d'analyse biologique de type pixel disposés en une matrice de pixels. La présente invention concerne de façon générale des perfectionnements aux techniques d'analyse biologique décrites dans le brevet US 6,325,977 ou dans la demande internationale WO 2006/082336. Ces techniques envisagent l'utilisation de dispositifs d'analyse biologique de type pixel comportant : - une couche photosensible et des moyens de collecte de photoélectrons dans la couche photosensible, et - des moyens de lecture et de traitement d'une grandeur électrique fournie par les moyens de collecte pour la fourniture d'une valeur caractéristique d'une intensité lumineuse détectée par la couche photosensible. Dans ces documents, des imageurs CCD ou CMOS du commerce sont utilisés pour l'étude de structures moléculaires organiques solides, c'est-à-dire structurellement stables et résistantes à des conditions expérimentales même extrêmes, telles que par exemple des oligonucléotides (ARN, ADN, ...). Dans ces applications, les oligonucléotides peuvent être directement greffés sur la surface externe des biocapteurs. Mais les biocapteurs réalisés à partir de tels imageurs sont beaucoup moins adaptés à protéines des structures plus fragiles telles que les qui, elles, perdent facilement leurs fonctionnalités, par modification de leur structure tridimensionnelle ou dénaturation, sous l'effet de la température ou de la déshydratation. Les propriétés intrinsèques des biomolécules de cette famille font que leur étude de manière standardisée, multiplexée et miniaturisée (au format d'un biocapteur) reste à l'heure actuelle, encore délicate. Pourtant, elles permettraient d'envisager des applications dans le domaine du test diagnostic de maladies infectieuses, d'allergies, de pollutions, dans la détection de drogues, ou dans le domaine de la défense, etc. Il peut ainsi être souhaité de prévoir un dispositif d'analyse biologique apte à utiliser des structures plus fragiles que les oligonucléotides envisagés dans les documents de l'état de la technique. Un mode de réalisation de l'invention concerne un procédé de fabrication d'un biocapteur sur une plaquette de semi-conducteur, comprenant des étapes consistant à réaliser une zone photosensible centrale comprenant au moins un dispositif d'analyse biologique de type pixel comprenant une couche photosensible, et une première zone périphérique entourant la zone photosensible centrale, comprenant des circuits électroniques, le procédé comprenant des étapes consistant à : recouvrir la première zone périphérique d'un revêtement hydrophile, recouvrir la zone photosensible centrale d'un revêtement hydrophobe dont la rugosité est choisie en sorte qu'une dose d'une solution pouvant être ultérieurement déposée
sur la zone photosensible centrale ne s'étale pas au-delà de celle-ci jusqu'à atteindre la première zone périphérique, et former une barrière d'une résine biocompatible sur la seconde zone périphérique, la résine se fixant naturellement, avant polymérisation, sur le revêtement hydrophile sans s'étendre sur le revêtement hydrophobe. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend également les étape consistant à réaliser, dans une seconde zone périphérique entourant la première zone périphérique, des plages de contact électrique reliées aux circuits électroniques de la première zone périphérique, et recouvrir la seconde zone périphérique au moyen du revêtement hydrophobe.
Selon un mode de réalisation, le revêtement hydrophile est de l'oxyde de silicium. Selon un mode de réalisation, le revêtement hydrophobe est du nitrure de silicium. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape de dépôt, sur la surface de la couche photosensible du dispositif d'analyse biologique de type pixel revêtue du revêtement hydrophobe, d'un mélange de capture comportant une protéine sonde greffée à un hydrogel, pour la capture de protéines cibles.
Selon un mode de réalisation, l'étape de dépôt du mélange de capture comporte des étapes de préparation de la surface externe de la couche photosensible destinée à recevoir le mélange de capture, comprenant une étape de silanisation de la surface externe ; oxydation de l'hydrogel et greffage de l'hydrogel oxydé sur la surface externe silanisée ; carboxylation et activation de l'hydrogel greffé ; et greffage de la protéine sonde dans l'hydrogel activé. Selon un mode de réalisation, l'étape de préparation de la surface externe par silanisation
comporte les phases suivantes : nettoyage de la surface externe par rinçages successifs à l'eau déminéralisée, à l'acétone et à l'éthanol absolu dans un bain à ultrasons ; oxydation alcaline de la surface externe par oxydation sous l'action d'un plasma ozone, puis traitement par une solution d'hydroxyde de potassium pendant plusieurs heures à température ambiante ; immersions successives dans de l'eau déminéralisée puis dans l'éthanol absolu sous ultrasons et séchage sous flux d'Argon silanisation de la surface externe au moyen d'une solution de 3-aminopropyltriethoxysilane dans de l'éthanol pendant plusieurs heures ; immersions successives dans de l'eau déminéralisée puis dans l'éthanol absolu sous ultrasons et séchage sous flux d'Argon ; et chauffage du dispositif pendant plusieurs heures puis maintien sous atmosphère inerte. Selon un mode de réalisation, l'étape d'oxydation et de greffage de l'hydrogel comporte les phases suivantes : dissolution de l'hydrogel dans de l'eau déminéralisée, puis traitement par une solution de périodate de sodium dont le volume est ajusté afin d'obtenir un mélange dont le ratio molaire entre le périodate de sodium et un motif monomère prédéterminé et répété de l'hydrogel est de l'ordre de 50%, protection du mélange réactionnel obtenu contre la lumière et agitation pendant plusieurs heures à température ambiante, pour obtenir un hydrogel oxydé, greffage de l'hydrogel oxydé sur la surface externe silanisée et agitation à température ambiante et à l'abri de la lumière pendant plusieurs heures, traitement de l'ensemble obtenu par une solution aqueuse de cyanoborohydrure de sodium pendant plusieurs heures afin de réduire des bases de Schiff formées, puis rinçage à l'eau déminéralisée, à l'éthanol et séchage sous flux d'Argon.
Selon un mode de réalisation, l'étape de carboxylation et d'activation de l'hydrogel greffé comporte les phases suivantes : traitement de l'hydrogel greffé par une solution d'acide bromoacétique dans du périodate de sodium pendant plusieurs heures à température ambiante et sous Argon, purge du mélange réactionnel obtenu puis rinçage à l'eau déminéralisée, à l'éthanol et séchage sous flux d'Argon, activation sous forme d'esters des résidus carboxylates formés, puis rinçage à l'eau. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape consistant à dimensionner la surface externe de la couche photosensible du dispositif d'analyse biologique de type pixel de manière à ce qu'elle corresponde à la taille d'une dose prédéterminée d'un mélange de capture pouvant être disposé sur la surface externe sous la forme d'une goutte. Selon un mode de réalisation, la surface externe de la couche photosensible du dispositif de type pixel est dimensionnée de manière à présenter une surface d'au moins 25500 10-12 m2. Selon un mode de réalisation, l'étape de réalisation de la couche photosensible du dispositif d'analyse biologique de type pixel comprend une étape de formation, dans la couche photosensible, de moyens de collecte de photoélectrons comportant plusieurs zones de collecte conformées en îlots et espacées les unes des autres dans la couche photosensible. Selon un mode de réalisation, les zones de collecte sont espacées les unes des autres d'une distance inférieure à une distance maximale prédéterminée et fixée en fonction d'une distance de recombinaison de photoélectrons émis dans la couche photosensible. Selon un mode de réalisation, la couche photosensible est réalisée de manière à présenter : une
première portion apte à détecter une intensité lumineuse incidente provenant d'un mélange de capture et destinée à fournir une première grandeur électrique et une seconde portion protégée contre l'intensité lumineuse incidente provenant du mélange de capture, destinée à fournir une seconde grandeur électrique. Selon un mode de réalisation, l'étape de formation de zone photosensible centrale comprend les étapes consistant à : former dans la zone photosensible centrale une matrice de dispositifs d'analyse biologique de type pixel comprenant chacun une couche photosensible, et former un joint isolant entre des pixels adjacents, le joint isolant étant conformé pour isoler électriquement une couche photosensible d'un pixel de la couche photosensible du pixel adjacent. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend la réalisation, dans chaque dispositif d'analyse biologique de type pixel, d'un convertisseur analogique numérique pour la conversion en données numériques d'une valeur caractéristique d'une intensité lumineuse détectée par le pixel. Des exemples de réalisation de l'invention seront décrits plus en détail dans la description qui suit, faite à titre non limitatif en relation avec les figures jointes parmi lesquelles : - la figure 1 représente schématiquement la structure d'un mode de réalisation d'un dispositif d'analyse biologique selon l'invention, - la figure 2 est le schéma électrique d'un biocapteur 30 comportant une pluralité de dispositifs tels que celui représenté sur la figure 1, - les figures 3a, 3b, 3c sont des organigrammes montrant des étapes successives d'un procédé de fabrication du dispositif de la figure 1, - la figure 4a représente un mode de réalisation de moyens électroniques d'un dispositif d'analyse biologique selon l'invention, - la figure 4b représente un autre mode de réalisation de 5 moyens électroniques d'un dispositif d'analyse biologique selon l'invention, - la figure 5 représente schématiquement une structure de pixel différentiel utilisable dans un dispositif d'analyse biologique selon l'invention, 10 - les figures 6a et 6b représentent des adaptations d'une structure de pixel différentiel incluant un convertisseur analogique/numérique, - la figure 6c est le schéma électrique d'un biocapteur comportant une pluralité de pixels différentiels tels que 15 celui représenté sur la figure 6a, - les figures 7 et 8 représentent par des vues en coupe des modes de réalisation d'une couche photosensible utilisable dans un dispositif d'analyse biologique selon l'invention, 20 - les figures 9a, 9b, 9c, 9d représentent plus en détail divers modes de réalisation de la structure de pixel différentiel, - la figure 10 représente une structure de pixels adjacents utilisable dans un biocapteur selon 25 l'invention, et - les figures 11A, 11B représentent schématiquement, respectivement par une vue de dessus et une vue en coupe, un mode de réalisation d'un biocapteur selon l'invention. Dans la description qui suit, divers détails 30 spécifiques sont donnés pour une meilleure compréhension de modes de réalisation de l'invention. Les modes de réalisation décrits peuvent être mis en œuvre en se passant d'un ou de plusieurs de ces détails, ou en utilisant d'autres méthodes, équipements, matériaux, etc. 35 Dans certains cas, des matériaux ou des opérations en soi
bien connus ne sont pas décrits en détail pour éviter d'obscurcir certains aspects des modes de réalisation décrits. Le fait de faire référence à un "mode de réalisation" dans la description signifie qu'une caractéristique ou une structure particulière décrite en relation avec ce mode de réalisation est incluse dans ce mode de réalisation. Ainsi, l'utilisation des expressions "dans un mode de réalisation" ou "selon un mode de réalisation" en divers points de la description ne fait pas nécessairement référence au même mode de réalisation. Par ailleurs, les caractéristiques particulières relatives à chaque mode de réalisation peuvent être combinées de manière appropriée pour former un ou plusieurs autres modes de réalisation. Enfin, les analyses, commentaires, déductions et conclusions exposés dans ce qui suit en relation avec l'art antérieur sont réputés faire partie intégrante de la présente invention. La figure 1 représente la structure générale d'un dispositif d'analyse biologique 10 et d'un biocapteur selon un mode de réalisation de l'invention. Le dispositif d'analyse biologique 10 est réalisé sur un substrat semi-conducteur 25. Il comporte une couche d'un mélange de capture 12 comprenant une certaine quantité d'une protéine sonde 14 greffée à un hydrogel 16, 18 et destinée à capturer un certain type de protéine cible. L'hydrogel comprend un milieu hydrophile 16 incorporant des molécules d'eau 18, tel que par exemple du Dextran (marque déposée), de la nitrocellulose, de l'acide hyaluronique ou bien un dérivé de ces polymères de saccharides ou encore du polyamide. Plus généralement cet hydrogel est un polymère naturel ou synthétique capable, selon sa formulation, de retenir jusqu'à 99 d'eau. Chaque molécule de la protéine sonde 14 est adaptée pour s'apparier avec une molécule correspondante de protéine cible susceptible de se trouver dans une
substance à analyser. En cas d'appariement des deux molécules, lorsqu'une molécule tierce marquée est ajoutée et associée à la molécule cible, par exemple un anticorps secondaire, une quantité de lumière peut être émise, par exemple par chimioluminescence ou par fluorescence. Le dispositif d'analyse biologique 10 comporte en outre une couche photosensible 20. Cette couche photosensible comporte une surface externe 22 sur laquelle est disposée la couche de mélange de capture 12.
Cette couche photosensible 20 est adaptée pour absorber des photons émis par chimioluminescence ou fluorescence à partir du mélange de capture 12 et pour collecter des photoélectrons à l'aide d'au moins une zone de collecte non représentée sur la figure 1. Il s'agit par exemple d'une photodiode. De façon plus précise, la surface externe 22 est traitée, par exemple par silanisation, pour permettre le dépôt du mélange de capture 12 et notamment de l'hydrogel 16, 18 sur la couche photosensible 20.
Enfin, le dispositif d'analyse biologique 10 comporte des moyens électroniques 24 de lecture et de traitement d'une grandeur électrique fournie par les moyens de collecte de la couche photosensible 20, pour la fourniture d'une valeur caractéristique d'une intensité lumineuse détectée par la couche photosensible. Ces moyens électroniques, représentés ici schématiquement, sont implantés sur le substrat semi-conducteur 25 et sont configurés pour réaliser un transfert des charges générées dans la couche photosensible 20.
Le dispositif d'analyse biologique 10 permet de procéder à l'analyse d'une substance biologique susceptible de comporter une certaine quantité de la protéine cible correspondant à la protéine sonde greffée 14, à l'aide par exemple d'un protocole de détection par chimioluminescence.
Ce protocole de détection par chimioluminescence comporte les étapes suivantes : - la substance biologique peut être traitée ou non par un agent de lyse afin de décomposer chimiquement certains de ses composants : cette étape rend certaines molécules de la substance biologique accessibles aux molécules de la protéine sonde 14 et donc analysables ; le mélange obtenu est ensuite déposé sur la couche de mélange de capture 12 du dispositif d'analyse biologique 10 comportant la protéine sonde 14, puis incubé pour une durée variable selon les espèces traitées, - une solution d'anticorps "secondaire" couplé à un marqueur de chimioluminescence, par exemple l'enzyme HorseRadish Peroxidase ou HRP, est ajoutée et l'ensemble est mis en incubation pour quelques minutes : cet anticorps vient se coupler de manière spécifique et avec une forte affinité aux couples formés par les molécules de protéine sonde et de protéine cible ; les concentrations et durées d'incubation peuvent, là encore, varier et sont optimisées selon l'application visée de façon connue en soi, - plusieurs lavages sont ensuite effectués afin d'éliminer toute trace d'anticorps secondaire adsorbé de manière non spécifique à la surface du dispositif d'analyse biologique 10 et pouvant engendrer une fausse détection ; les types de lavage (temps, composition, concentration, nombre) sont variables et peuvent être adaptés de façon connue en soi selon les protéines manipulées lors du protocole de détection, - une activation d'un signal de chimioluminescence et une détection correspondante par le dispositif d'analyse biologique 10 est réalisée par l'ajout d'une solution révélatrice du substrat spécifique de l'enzyme HRP dans les conditions optimales de concentration et de pH pour un signal de chimioluminescence : cette solution
révélatrice peut être obtenue commercialement ou préparée, par exemple sous forme de luminol ; elle est ajoutée sur toute la surface du dispositif d'analyse biologique 10 et le signal est immédiatement collecté par la couche photosensible 20, - un post-traitement informatique peut éventuellement être nécessaire afin d'amplifier le signal obtenu, - enfin, la comparaison de la valeur d'intensité lumineuse obtenue par le dispositif d'analyse biologique 10 avec une courbe d'étalonnage prédéterminée, ou déterminée en même temps que la mesure biologique, permet d'estimer la quantité de protéine cible présente dans l'échantillon de substance biologique. Le dispositif d'analyse biologique 10 peut aussi être utilisé pour procéder à l'analyse d'une substance biologique à l'aide d'un protocole de détection par fluorescence. Un tel protocole de détection par fluorescence comporte les mêmes étapes que le protocole de détection par chimioluminescence si ce n'est que l'anticorps secondaire est couplé à un fluorophore au lieu d'un marqueur de chimioluminescence et qu'une lumière excitatrice est apportée au lieu d'une solution révélatrice, pour l'activation d'un signal de fluorescence.
Comme cela est représenté sur la figure 2, plusieurs dispositifs tels que le dispositif 10 de la figure 1, peuvent être agencés en une matrice de pixels d'un biocapteur. Chaque dispositif 10i,3 représente un pixel de ligne i et de colonne j de la matrice. Sur la figure 2, seules les deux premières lignes et les trois premières colonnes d'une matrice de pixels sont représentées, mais il est facile de généraliser cette représentation à m lignes et n colonnes pour former un biocapteur complet.
Les pixels 101,1, 101,2 et 101,3 sont reliés à un bus de première ligne 11 et les pixels 102,1r 102,2 et 102,3 à un bus de deuxième ligne 12 pour la transmission des valeurs d'intensité lumineuse. Les bus de lignes 11 et 12 sont quant à eux reliés à un registre à décalage horizontal 26. Les pixels 101,1 et 102,1 sont reliés à un bus de première colonne cl, les pixels 101,2 et 102,2 à un bus de deuxième colonne c2 et les pixels 101,3 et 102,3 à un bus de troisième colonne c3 pour la transmission des valeurs d'intensité lumineuse. Les bus de colonnes cl, c2 et c3 sont quant à eux reliés à un registre à décalage vertical 28. Les registres à décalage 26 et 28 sont reliés à un circuit de traitement des signaux 30 pouvant notamment comporter un circuit de numérisation des signaux. Pour réaliser un biocapteur agencé en matrice de pixels, d'autres structures que celle qui vient d'être décrite en référence à la figure 2 sont envisageables. Notamment, chaque pixel peut être muni de son propre convertisseur de signaux analogiques en signaux numériques. Des exemples de telles structures seront décrits ultérieurement en référence aux figures 6a, 6b et 6c. De façon classique, le mélange de capture 12 est disposé en deux temps sur le biocapteur. Dans un premier temps, l'hydrogel 16 est déposé sur toute la surface du biocapteur. Dans un second temps, une solution de protéine sonde 14 spécifique est déposée localement sous forme de goutte. Plusieurs protéines sondes différentes peuvent ainsi être déposées sur le même substrat d'hydrogel, goutte à goutte, chaque goutte comportant une protéine sonde spécifique. Il a été expérimenté qu'une goutte de protéine sonde de quelques nanolitres peut suffire pour permettre une photodétection de protéine cible par chimioluminescence ou par fluorescence, ce qui
correspond à une goutte d'environ 150 pm (micromètres) de diamètre. En dessous de cette taille, soit l'évaporation lors du dépôt de la solution de protéine sonde devient trop importante et ne permet plus le maintien de protéines sondes, soit la quantité de protéine sonde n'est pas suffisante pour permettre ensuite une photodétection par chimioluminescence (ou par fluorescence). Dans l'art antérieur, compte tenu de la taille des pixels d'un biocapteur classique, largement inférieure à 150 pm, une goutte de protéine sonde spécifique recouvre une pluralité de pixels d'un biocapteur du fait de leur faible surface, en général une dizaine, et les signaux électriques obtenus par la pluralité de pixels du biocapteur doivent être combinés par traitement a posteriori pour l'obtention d'une valeur effectivement révélatrice de la quantité de protéine cible dans l'échantillons biologique. Il vient que ce traitement a posteriori est complexe et peut être entaché d'erreurs.
En outre, pour éviter que des sources d'intensité lumineuse par chimioluminescence ou par fluorescence interfèrent entre deux gouttes de protéine sonde spécifique voisines, on doit espacer les gouttes de protéine sonde d'une distance suffisante. En général, cette distance peut représenter jusqu'à trois fois la taille d'une goutte de protéine sonde, soit environ 450 pm. Une surface photosensible non négligeable est ainsi perdue dans le biocapteur. Conformément à un mode de réalisation préféré de l'invention, chaque pixel est avantageusement dédié à la détection d'une protéine cible particulière et présente une surface photosensible qui a des dimensions plus importantes que celles d'un imageur classique, adaptées à la taille d'une telle goutte. Chaque pixel présente par exemple une largeur de 150 pm ou plus (pour un pixel de
forme carrée) correspondant à une surface de l'ordre de 25500 pm2 ou plus (soit 25500.10-12 m2 ou plus). Comme indiqué précédemment, cette surface minimale correspond à la taille d'une goutte de protéine sonde en deçà de laquelle soit l'évaporation lors du dépôt devient trop importante et ne permet plus le maintien de protéines sondes, soit la quantité de protéine sonde n'est pas suffisante pour permettre ensuite une photodétection par chimioluminescence ou par fluorescence. Sans ces contraintes, un pixel pourrait atteindre des dimensions largement inférieures, telles que 20 pm x 20 pm par exemple. Ainsi, une goutte de protéine sonde 14 spécifique est disposée sur le substrat d'hydrogel 16 au dessus de chaque dispositif d'analyse biologique, c'est-à-dire sur chaque pixel 10i,j de la matrice du biocapteur de manière à éviter tout traitement a posteriori tel que cité précédemment. Le protocole de détection par chimioluminescence ou par fluorescence peut être aisément adapté au biocapteur représenté sur la figure 2, en considérant chaque pixel de ce biocapteur comme un dispositif d'analyse biologique tel que le dispositif d'analyse 10 précédemment décrit : dans ce cas, chaque pixel comporte son propre type de protéine sonde et la substance biologique éventuellement décomposée chimiquement est déposée sur toute la surface externe photosensible du biocapteur. En fin de protocole, la comparaison des valeurs d'intensité lumineuse obtenues pour chaque pixel (donc pour chaque type de protéine sonde de chaque pixel) avec une courbe d'étalonnage prédéterminée, ou déterminée en même temps que la mesure biologique, permet de quantifier une importante quantité de protéines distinctes de l'échantillon de substance biologique.
Plus précisément, pour l'étalonnage des protéines à quantifier, une gamme de solutions protéiques de concentrations croissantes connues est systématiquement analysée par le biocapteur, dans les mêmes conditions qu'un test biologique réel. La valeur du pixel pour chacune des concentrations analysées est ensuite reportée sur un graphe en fonction de la concentration en protéine, ou stockée en mémoire sur le biocapteur. Lors du test biologique réel, il suffit alors de comparer la valeur de pixel obtenue avec le graphe précédemment tracé, ou avec la valeur précédemment stockée, pour obtenir une estimation de la concentration de la protéine cible dans l'échantillon biologique testé. Dépôt du mélange de capture Un mode de réalisation de certaines étapes d'un procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse biologique selon l'invention va maintenant être décrit en référence aux figures 3a, 3b et 3c. Ces étapes visent le dépôt d'une couche du mélange de capture 12 sur la surface externe 22 de la couche photosensible 20. Comme représenté sur la figure 3a, lors d'une première étape 5100, on fournit un ensemble électronique CMOS comprenant une couche photosensible 20 et des moyens électroniques 24 de lecture et de traitement d'une grandeur électrique fournie par la couche photosensible 20 (Fig. 1). La surface externe 22 de la couche photosensible comporte éventuellement un revêtement hydrophobe, par exemple de type Si3N4 qui sera décrit plus loin.
Ensuite, lors d'une étape S102, la surface externe 22 de la couche photosensible 20 de l'ensemble électronique CMOS est nettoyée par rinçages successifs à l'eau déminéralisée, à l'acétone et à l'éthanol absolu dans un bain à ultrasons.
Au cours d'une étape S104, la surface externe 22 est oxydée sous l'action d'un plasma ozone, par exemple pendant 15 minutes, puis traité par une solution de KOH 2.2M dans un mélange aqueux, par exemple un mélange H20/EtOH (2 :3), par exemple pendant 3 heures à température ambiante. Au cours d'une étape S106, l'ensemble électronique CMOS est ensuite immergé successivement dans l'eau déminéralisée puis dans l'éthanol absolu sous ultrasons avant d'être séché sous flux d'Argon. Au cours d'une étape S108, des résidus silanols 32 formés sur la surface externe 22 sont silanisés par une solution d'APTES dans de l'éthanol 0.4M, par exemple pendant 12 à 20 heures, à température ambiante et sous atmosphère inerte (Argon). Puis l'ensemble électronique CMOS est à nouveau lavé plusieurs fois à l'eau déminéralisée dans un bain à ultrasons, rincé à l'éthanol absolu et séché sous flux d'Argon.
Il est ensuite chauffé, par exemple à 85°C, pendant plusieurs heures, par exemple 5 heures, puis maintenu sous atmosphère inerte au cours d'une étape 5110, pour obtenir finalement une surface externe silanisée 34. Comme représenté sur la figure 3b, un hydrogel 16, 18, par exemple du Dextran (0.5 g, poids moléculaire d'environ 100 kiloDalton), est dissout dans 50 ml d'eau déminéralisée, puis traité par une solution de NaI04 0.1M dont le volume est ajusté afin d'obtenir un mélange de ratio molaire entre les moles de NaI04 et les moles de glucose monomère du Dextran de l'ordre de 50%, lors d'une étape S112. On remarque en effet sur la figure 3b que le Dextran est un polymère dont le motif de base est un dérivé du glucose : il s'agit donc d'ajuster le volume de solution de NaI04 0.1M de sorte que l'on ait deux fois plus de molécules du motif de base du Dextran que de
molécules de NaIO4. On obtient ainsi l'ouverture d'un motif de base sur deux dans le Dextran, comme illustré en sortie de l'étape S112 sur la figure 3b. Le mélange réactionnel est protégé de la lumière et agité vigoureusement pendant plusieurs heures à température ambiante, par exemple 20 heures, de manière à obtenir du Dextran oxydé 36. Ensuite, lors d'une étape S114, la surface externe silanisée 34 est traitée par la solution de Dextran oxydé 36 fraîchement préparé. La réaction est agitée à température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 48 heures par exemple. Le mélange réactionnel est ensuite purgé lors d'une étape S116 et l'ensemble électronique CMOS traité par une solution aqueuse de NaBH3CN 0.1M pendant par exemple 3 heures afin de réduire des bases de Schiff formées. Après aspiration de la suspension, l'ensemble électronique CMOS est rincé intensivement à l'eau déminéralisée puis à l'éthanol, et séché sous flux d'Argon, de manière à obtenir un hydrogel greffé 38. Comme représenté sur la figure 3c, l'hydrogel greffé 38 est ensuite carboxylé et activé. Pour ce faire, lors d'une étape S118, il est traité par une solution de BrCH2COOH 0.1M dans du NaOH 2M pendant par exemple 16 heures à température ambiante et sous Argon. Une fois cette oxydation terminée, le mélange réactionnel est purgé et le capteur rincé à l'eau déminéralisée et à l'éthanol, puis séché sous flux d'Argon. Les résidus carboxylates formés 40 sont alors activés en esters au cours d'une étape S120, par exemple au moyen d'une solution aqueuse d'EDC (0.2 M) / NHS (50 mM), et ce par exemple pendant 15 minutes à température ambiante. L'ensemble électronique CMOS est ensuite abondamment rincé à l'eau.
Enfin, lors d'une dernière étape S122, une solution appropriée de la protéine d'intérêt (protéine sonde) est greffée dans l'hydrogel activé. Pour réaliser la fabrication d'un biocapteur complet comme celui représenté sur la figure 2, il convient d'exécuter les étapes 5100 à S120 sur l'ensemble des pixels de ce biocapteur. Enfin, la dernière étape S122 est appliquée différemment à chaque pixel, pour le greffage d'une goutte de protéine sonde spécifique sur le substrat d'hydrogel activé au dessus de ce pixel. On prendra note des abréviations usuelles utilisées ci-dessus . (CH3)20 : Acétone C2HSOH ou EtOH : Ethanol 03 : Ozone KOH : Hydroxyde de potassium NaOH : Hydroxyde de sodium H20 : Eau Ar : Argon "APTES" 3-Aminopropyltriethoxysilane ou (H2N(CH2)3Si (OEt)3 ) NaI04 : Periodate de sodium NaBH3CN : Cyanoborohydrure de sodium BrCH2CO0H : Acide bromoacétique EDC Hydrochlorure de l-(3-dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimide NHS : N-Hydroxysuccinimide. On décrira maintenant des perfectionnements d'un dispositif d'analyse biologique et d'un biocapteur selon l'invention ou d'un procédé de fabrication d'un tel biocapteur. Ces perfectionnements peuvent être mis en oeuvre séparément ou en combinaison, au choix de l'homme de l'art en fonction du résultat visé et des contraintes économiques ou techniques qui devront éventuellement être
prises en compte pour la réalisation de biocapteurs selon l'invention. Prévision d'une structure de pixel différentiel Dans le dispositif d'analyse biologique 10 décrit précédemment, la couche photosensible 20 comporte par exemple une région dopée au sein du substrat semi-conducteur 25 (Fig. 1). L'énergie d'un photon incident extrait des électrons d'atomes situés dans la couche photosensible 20, générant ainsi une charge et donc un courant. La couche photosensible 20 du dispositif d'analyse biologique 10 utilise un champ électrique à une jonction P-N pour provoquer la séparation d'un ion et d'un photoélectron et prévenir d'une recombinaison et perte de signal. Cependant, ces jonctions P-N présentent un petit courant de perte que la couche photosensible 20 ne peut pas distinguer d'un courant qui serait effectivement généré par une intensité lumineuse incidente, en l'occurrence par chimioluminescence ou par fluorescence. Ce courant de perte est présent également dans l'obscurité, de sorte qu'il est couramment appelé courant d'obscurité. Le terme d'obscurité doit être compris comme étant une condition dans laquelle une intensité lumineuse incidente est soit absente, soit ne cause pas la photo-génération de charges dans la couche photosensible 20 du dispositif d'analyse biologique 10. Ceci peut être dû à une protection de la couche photosensible empêchant le passage de lumière incidente, ou au maintien de la couche photosensible 20 à un certain potentiel, par exemple un potentiel d'initialisation, qui empêche l'accumulation de charges. Ce courant d'obscurité est un facteur limitant de la performance du dispositif d'analyse biologique 10 ou plus généralement d'un biocapteur de type CMOS. Le courant d'obscurité dépend fortement de la température et est donc difficile à compenser. Il varie également
considérablement avec toute absence d'uniformité dans les gradients de dopage. Tout perfectionnement visant à supprimer ce courant d'obscurité est particulièrement avantageuse pour le dispositif d'analyse biologique ou le biocapteur précité, étant donné que l'intensité lumineuse émise par chimioluminescence ou par fluorescence est en général très faible. Dans ce type d'application, il est important que le dispositif d'analyse biologique ou le biocapteur soit très sensible.
La figure 4a est un schéma électrique représentant un mode de réalisation du dispositif d'analyse biologique 10 ayant une sensibilité améliorée. Le dispositif d'analyse biologique 10 comprend une couche photosensible 20 comportant une première portion photosensible 42 et une seconde portion photosensible 44. Les portions photosensibles 42, 44 émettent des signaux appliqués aux moyens électroniques 24 de lecture et de traitement. Dans cet exemple de réalisation, le signal fourni par la portion photosensible 42 est appliqué à une entrée négative 46 d'un amplificateur opérationnel 50 et le signal fourni par la portion photosensible 44 est appliqué à une entrée positive 48 de l'amplificateur 50. Les portions photosensibles sont représentées par des photodiodes, mais tout autre type de capteur photosensible peut être utilisé. La première portion photosensible 42 est apte à détecter une intensité lumineuse incidente provenant du mélange de capture 12 (Fig. 1) par effet de chimioluminescence ou de fluorescence, tandis que la seconde portion photosensible 44 est protégée contre l'intensité lumineuse incidente provenant du mélange de capture 12 ou de toute autre source d'intensité lumineuse. Bien que la seconde portion photosensible 44 soit 35 protégée contre toute source d'intensité lumineuse, elle
est toujours qualifiée de photosensible en ce qu'elle présente les mêmes caractéristiques matérielles et électriques que la première portion photosensible 42. Ainsi, si elle n'était pas protégée de la lumière, elle générerait, comme la première portion photosensible 42, une charge en réponse à toute lumière incidente. Par exemple, chacune des première et seconde portions photosensibles peut comprendre des photodiodes qui, dans un mode de réalisation de l'invention, peuvent être de forme identique. Une protection opaque indépendante est alors formée au-dessus de la seconde portion photosensible 44. Par souci de clarté dans la suite de la description, la première portion photosensible 42 sera qualifiée de portion photosensible éclairée , tandis que la seconde portion photosensible 44 sera qualifiée de portion photosensible placée dans l'obscurité. Le dispositif d'analyse biologique 10 ainsi réalisé peut alors être qualifié de "pixel différentiel" par opposition à des pixels ne présentant pas ces deux portions photosensibles dont l'une est, par construction, protégée de la lumière incidente. La protection appliquée à la portion photosensible placée dans l'obscurité 44 est obtenue à l'aide de moyens mécaniques, par exemple par dépôt d'un métal ou d'une autre substance opaque au dessus de cette portion photosensible 44, soit directement sur sa surface externe, soit en tant que couche espacée de la surface externe de la portion photosensible 44 à l'aide d'une couche de passivation appropriée. Une couche métallique ou autre espacée de la surface externe par une couche de passivation est avantageuse pour réduire la capacité de couplage entre la protection métallique et la photodiode de la portion photosensible placée dans l'obscurité 44. En revanche, ce type de protection n'empêche pas le passage d'une intensité lumineuse arrivant par les côtés.
De façon alternative, la couche opaque peut être supprimée et remplacée par une barrière mécanique érigée entre la portion photosensible éclairée 42 et la portion photosensible placée dans l'obscurité 44, de sorte que le mélange de capture 12 soit contraint de rester au-dessus de la portion photosensible éclairée 42 sans déborder sur la portion photosensible placée dans l'obscurité 44. Par conséquent, la sortie de la portion photosensible placée dans l'obscurité 44 représente uniquement un courant d'obscurité dans le sens où aucune réaction de chimioluminescence ou de fluorescence ayant lieu dans le mélange de capture 12 ne génère d'intensité lumineuse susceptible d'être captée par la portion photosensible placée dans l'obscurité 44.
De façon alternative également, la protection mécanique peut prendre la forme d'un boîtier opaque du dispositif d'analyse biologique 10 qui peut comporter plusieurs portions de boîtier disposées de manière à couvrir une surface appropriée pour définir la portion photosensible placée dans l'obscurité 44. Chaque portion photosensible 42, 44 de la couche photosensible 20 est connectée à une tension d'initialisation VRT par l'intermédiaire de commutateurs MOS respectifs 52 et 54. Ces commutateurs MOS 52 et 54 sont représentés sur la figure 4 en tant que transistors pourraient être réalisés à partir de PMOS ou tout autre type de commutateur Un commutateur d'initialisation 56 est aussi parallèle d'une capacité de rétroaction Cfb référence 58 disposée elle aussi en parallèle sortie et l'entrée négative 46 de l'amplificateur opérationnel 50. Le commutateur d'initialisation 56 peut être commandé sélectivement pour décharger l'amplificateur opérationnel 50. NMOS mais transistors approprié. fourni en portant la entre la30
Il est important d'assurer que la portion photosensible éclairée 42 et la portion photosensible placée dans l'obscurité 44 soient aussi semblables que possible de manière à générer des courants d'obscurité les plus semblables possible. Les contraintes imposant cela, ainsi que les différentes options pour leur arrangement vont être détaillées ci-dessous. Pour cela, une capacité ajustable Cs portant la référence 59 est ajoutée entre la masse et l'entrée positive 48 de l'amplificateur opérationnel 50. Sur la figure 4a, les portions photosensibles 42 et 44 sont modélisées à l'aide de leurs capacités intrinsèques respectives Cpol portant la référence 42a et Cpd2 portant la référence 44a ainsi que de leurs sources de courant respectives portant les références 42b et 44b. Pour la portion photosensible éclairée 42, la source de courant vaut Iph + Idl, où Iph est le courant généré par effet de chimioluminescence ou de fluorescence et Id1 le courant d'obscurité, à travers la photodiode. Pour la portion photosensible placée dans l'obscurité 44, la source de courant comporte uniquement Id2, c'est-à-dire le courant d'obscurité qui la traverse. Au niveau de l'entrée positive 48 de l'amplificateur opérationnel 50, les valeurs de courant 25 et de tension impliquent l'équation suivante :
(Cpd2 + Cs)(5VINP/ôt) + Id2 = 0 (équation 1)
Au niveau de l'entrée négative 46 de 30 l'amplificateur opérationnel 50, les valeurs de courant et de tension impliquent l'équation suivante :
- Cpdl 6VINN/ôt + Cfb(5VOUT/5t - 5VINN/ôt ) - (Iph + Id1) = 0 (équation 2) 35
En réarrangeant l'équation précédente, on obtient l'équation suivante :
(Iph + Idl) + (Cpdl + Cfb)6VINN/5t - Cfb 5VOUT/5t = 0 (équation 3)
En sortie de l'amplificateur opérationnel 50, on a, dans le cas général, la relation suivante : 6VOUT / 5t = (IPH (Cs+Cpd2) + Idl (Cs + Cpd2) - Id2 (Cpdl + Cfb)) / (Cfb(Cs + Cpd2)) (équation 4)
A partir de l'équation 4, on en déduit que dans le cas général, l'effet du courant d'obscurité sur la tension de sortie peut être supprimé si la relation suivante est vérifiée :
Idl (Cs + Cpd2) = Id2 (Cpdl + Cfb) (équation 5) En particulier, l'équation 5 peut être satisfaite, et l'effet du courant d'obscurité annulé, si :
Idl = Id2 et (Cs + Cpd2) = (Cpdl + Cfb) (équation 6) En d'autres termes, on déduit des équations 5 et 6 que l'effet du courant d'obscurité est annulé lorsque le produit entre le courant d'obscurité dans la portion photosensible éclairée 42 et la somme de la capacité ajustable 59 et de la capacité intrinsèque de la portion photosensible placée dans l'obscurité 44 est égal au produit entre le courant d'obscurité dans la portion photosensible placée dans l'obscurité 44 et la somme de la capacité de rétroaction 58 de l'amplificateur opérationnel 50 et de la capacité intrinsèque de la
portion photosensible éclairée 42. En particulier, l'effet du courant d'obscurité est annulé dans la tension de sortie, si le courant d'obscurité est le même dans les deux portions photosensibles 42 et 44 et si la somme de la capacité ajustable 59 et de la capacité intrinsèque de la portion photosensible placée dans l'obscurité 44 est égale à la somme de la capacité de rétroaction 58 de l'amplificateur opérationnel 50 et de la capacité intrinsèque de la portion photosensible éclairée 42.
En outre, l'amplificateur opérationnel 50 peut-être conçu de manière à présenter un taux de réjection de mode commun à entrée élevée pour que les signaux qui apparaissent sur chaque sortie soient ignorés. Cela signifie que tout bruit sur la masse est ignoré et n'apparaît pas en sortie. Sur cette base, il y a plusieurs options pour concevoir un dispositif d'analyse biologique 10 correspondant à celui de la figure 4. La première est d'imposer des portions photosensibles 42 et 44 identiques et de régler la capacité ajustable 59 de manière à vérifier l'égalité (Cs + Cpd2) = (Cpdl + Cfb). En supposant que Cpdl = Cpd2, cela revient à régler la capacité ajustable 59 Cs à la capacité de rétroaction 58 Cfb. Plusieurs techniques permettant d'assurer une correspondance des portions photosensibles vont être discutées ci-dessous. Il peut être noté que le courant d'obscurité est très sensible au profil et aux niveaux précis de dopage d'un substrat dans lequel il circule, alors qu'en fait il existe généralement une différence sur ces paramètres entre pixels voisins d'une matrice de pixels ou même entre deux portions photosensibles d'un même pixel. Une autre complication vient des différences structurelles entre la capacité ajustable Cs, d'une part, et la capacité de rétroaction Cfb, d'autre part. La
capacité ajustable Cs a notamment une borne connectée à la masse alors que l'amplificateur opérationnel 50 requiert que les deux bornes du condensateur Cfd soient flottantes. Puisque ces structures sont différentes, il est difficile de les faire se correspondre. L'équation 5 montre que, même si les courants Idl et Id2 ne correspondent pas, l'effet du courant d'obscurité peut toujours être annulé tant que les produits Idl (Cs + Cpd2) et Id2 (Cpdl + Cfb) sont égaux.
La figure 4b représente un mode de réalisation d'un dispositif d'analyse biologique 10 qui comporte des moyens pour réaliser la capacité ajustable Cs et annuler l'effet du courant d'obscurité même si les courants Idl et Id2 ne sont pas égaux.
Sur cette figure, les éléments identiques à ceux représentés sur la figure 4a comportent les mêmes références. La différence entre les deux figures réside dans la configuration de la capacité ajustable Cs, qui n'est pas représentée ici comme un seul condensateur 59, mais comme une pluralité de condensateurs 59a, 59b, 59c disposés en parallèle entre la masse et l'entrée positive 48 de l'amplificateur opérationnel 50. Une capacité d'entrée positive de base CsO (condensateur 59a) est connectée entre la masse et l'entrée positive 48 de l'amplificateur opérationnel 50. Des capacités d'entrée positive optionnelles Csl (condensateur 59b) et Cs2 (condensateur 59c) sont connectables sélectivement en parallèle, à l'aide de commutateurs Dl et D2. La capacité de rétroaction de base CsO présente une valeur inférieure à celle de Cfb. Bien entendu, seules trois capacités de rétroaction ont été représentées sur la figure 4b à titre purement illustratif et non limitatif, alors qu'un plus grand nombre peut être également prévu.
Ainsi, dans un mode de réalisation, les valeurs de CsO, Csl et Cs2 sont choisies pour que Csl = Cs2 et CsO + Csl = Cfb. Par conséquent, si le courant d'obscurité Idl est légèrement supérieur au courant d'obscurité Id2, alors pour maintenir l'égalité prévue par l'équation 5, Cs doit être inférieur à Cfb. Ceci est obtenu en laissant les interrupteurs Dl et D2 ouverts, de sorte que la capacité ajustable Cs est fournie par CsO seulement, qui est inférieure à Cfb. Si les deux courants d'obscurité Idl et Id2 sont identiques, alors on ouvre le commutateur Dl et on ferme le commutateur D2. Il en résulte que la capacité ajustable Cs résultante aux bornes de l'amplificateur opérationnel 50 vaut Cs = CsO + Csl = Cfb. Si le courant d'obscurité Idl est légèrement inférieur au courant d'obscurité Id2, alors pour maintenir l'égalité prévue par l'équation 5, Cs doit être supérieur à Cfb. Ceci est obtenu en fermant les interrupteurs Dl et D2, de sorte que la capacité ajustable Cs est fournie par CsO + Csl + Cs2. Cette méthode peut aussi être appliquée dans le cas où, même lorsque les courants d'obscurité des deux portions photosensibles 42 et 44 sont identiques, on souhaite tolérer un petit écart entre les valeurs des capacités Cfb et CsO. Dans un mode de réalisation, chaque capacité de la pluralité de condensateurs disposés en parallèle a une même valeur commune, de sorte que la capacité ajustable Cs réellement appliquée à l'entrée positive de l'amplificateur opérationnel 50 peut être incrémentée d'une valeur constante. Le nombre de condensateurs dans cette pluralité de condensateurs disposés en parallèle peut être augmenté, de manière à augmenter la résolution
ou l'amplitude des variations qui peuvent être envisagées. De façon alternative, les capacités de la pluralité de condensateurs disposés en parallèle peuvent avoir des valeurs différentes de manière à augmenter la flexibilité de l'ensemble. Un mode de réalisation préféré consiste à introduire un facteur deux entre chaque capacité optionnelle successive de la disposition en parallèle, ce qui permet de limiter le nombre de commutateurs requis à résolution constante. En fournissant ainsi une capacité d'entrée positive de base CsO et des capacités de 1, 2, 4, 8 et 16 fois un incrément Csl, on peut obtenir une capacité de ajustable Cs effective dont la valeur peut varier entre la capacité de base CsO et CsO + 31 Csl avec un incrément de Csl. D'une façon plus générale, lorsque l'on utilise N condensateurs optionnels en parallèle, pour permettre aux moyens électroniques 24 de s'adapter aux variations de fabrication, en général de l'ordre de +/- 25 %, la capacité CsO est choisie de manière à correspondre à 75 % Cfb et la somme Csl + ... + CsN est choisie de manière à correspondre à 50 % Cfb, de sorte que la capacité ajustable Cs puisse effectivement varier entre 75 % Cfb et 125 % Cfb. L'inégalité des courants d'obscurité Idl et Id2 n'est souvent pas connue à l'avance et une phase de calibration peut-être nécessaire pour la déterminer. Cette calibration peut être réalisée en tant que test de post fabrication appliqué au dispositif d'analyse biologique 10 et la configuration des commutateurs peut- être enregistrée en mémoire. Au contraire, la calibration peut aussi être réalisée à la volée, juste avant la mise en fonctionnement du dispositif. La tension de sortie VOUT peut être mesurée par toutes techniques appropriées, par exemple à l'aide d'un convertisseur analogique/numérique ou en utilisant le
dispositif 10 dans un fonctionnement de type éclairage/fréquence, dans lequel la tension VOUT est comparée à un signal de référence provoquant une réinitialisation du dispositif 10 lorsqu'il est atteint.
La tension de sortie est alors donnée par la fréquence des impulsions initialisées. Comme cela a été vu précédemment, il est préférable pour la suppression de l'effet du courant d'obscurité que les première et seconde portions photosensibles 42 et 44 correspondent le mieux possible. Mais en réalité, même si des portions photosensibles identiques sont fabriquées, le courant d'obscurité peut varier légèrement de l'une à l'autre en raison de facteurs intervenant lors de leur fabrication ou de leur fonctionnement. En pratique, les courants d'obscurité respectifs des deux portions photosensibles seront souvent différents. En effet, une égalité stricte peut difficilement être atteinte. Un objectif réaliste est donc de chercher à minimiser cette différence.
La minimisation de cette différence est l'objet du dispositif représenté sur la figure 4b. Cependant, la résolution de ce système est limitée par le nombre et la valeur des capacités prévues dans l'ensemble capacitif disposé en parallèle à l'entrée positive de l'amplificateur opérationnel 50. Un autre facteur sur lequel on peut jouer est la géométrie du dispositif d'analyse biologique 10 et la géométrie d'un ensemble de dispositifs d'analyse biologique en tant que pixels dans un biocapteur. Un exemple de géométrie de pixel est représenté sur la figure 5 par une vue de dessus. Sur cette figure, une portion photosensible placée dans l'obscurité 60 est disposée dans une partie supérieure gauche du pixel. Elle est adjacente à une portion photosensible éclairée 62 disposée dans une
partie supérieure droite du pixel. Les moyens électronique 64 de lecture et de traitement de ce pixel sont disposés dans une partie inférieure du pixel située sous les portions photosensibles 60 et 62.
Pour une bonne correspondance des photodiodes, les dimensions des portions photosensibles 60 et 62 peuvent être égales (DX1 = LX1 et DY1 = LY1) auquel cas RX1 = DX1 + LX1. De plus ces portions photosensibles peuvent être de forme carrée (DX1 = DY1). La taille de RY1 dépend de la composition précise des moyens électronique 64, mais il est préférable qu'elle soit égale aux dimensions DY1 et LY1, de sorte que le pixel soit globalement de forme carrée. Sur la base de cette configuration de pixel, plusieurs pixels peuvent ensuite être disposés de différentes manières en ligne et/ou en colonne pour former un biocapteur complet. Ils peuvent être arrangés en ligne et en colonne, par exemple, par simple translation verticale ou horizontale du pixel représenté sur la figure 6. De façon alternative, ils peuvent aussi être arrangés de sorte que deux lignes successives de pixels soient inversées verticalement l'une par rapport à l'autre et présentent ainsi leurs moyens électroniques 64 respectifs ou leurs portions photosensibles 60, 62 respectives en correspondance. Par ailleurs, au lieu d'être carrés, les pixels peuvent aussi être rectangulaires, les moyens électroniques 64 étant situés sous la portion photosensible placée dans l'obscurité 60, elle-même située sous la portion photosensible éclairée 62. Par ailleurs également, les portions photosensibles peuvent être triangulaires pour former une couche photosensible 20 de forme générale carrée, ou de formes plus complexes tout en ayant des surfaces égales.
Plusieurs variantes peuvent ainsi être imaginées par l'homme du métier et ne seront pas détaillées davantage. Pour réaliser un biocapteur agencé en matrice de pixels différentiels, la structure qui a été décrite en référence à la figure 2 est envisageable. Mais d'autres sont également possibles. Notamment, chaque pixel différentiel peut être muni de son propre convertisseur de signaux analogiques en signaux numériques. C'est également possible lorsque le pixel n'est pas différentiel. Un premier exemple est illustré sur la figure 6a. Sur cette figure, le pixel différentiel 10 comporte, en partie supérieure, une portion photosensible placée dans l'obscurité 60 et une portion photosensible éclairée 62. Ces deux portions photosensibles sont connectées à un circuit amplificateur 24', par exemple tel que les moyens électroniques 24 détaillés en figure 4a ou 4b. Ce circuit amplificateur fournit en sortie une tension analogique qui est transmise en entrée d'un convertisseur 120 de signaux analogiques en signaux numériques. Le pixel différentiel 10 comporte aussi un bloc de décodage numérique 122 dont les caractéristiques dépendent des coordonnées du pixel différentiel 10 dans la matrice de pixels du biocapteur considéré. Ce bloc de décodage numérique 122 surveille l'état d'un bus d'adresses 124 de sorte que, lorsqu'un signal transitant sur ce bus d'adresses 124 correspond à une valeur prédéterminée stockée par le bloc de décodage numérique 122 et spécifique au pixel différentiel 10, le bloc 122 transmet un signal d'activation Sa au convertisseur 120 qui fournit en réponse la tension analogique de sortie du circuit amplificateur convertie en une valeur numérique à un bus 126 de transmission de données.
Un deuxième exemple, illustré sur la figure 6b et montrant deux pixels adjacents, représente une variante de l'exemple de la figure 6a. Pour simplifier l'illustration, les portions photosensibles 60 et 62 et le circuit amplificateur 24' de chaque pixel différentiel ne sont pas représentés sur cette figure bien que présents. Dans cette variante, le bloc de décodage numérique 122 est remplacé par un registre à décalage 128 dans chaque pixel, soit un registre à décalage 128a dans le pixel l0a et un registre à décalage 128b dans le pixel 10b. Chaque registre à décalage 128a, 128b reçoit un signal d'entrée SRI (de l'anglais Shift Register Input ) et fournit un signal de sortie SRO (de l'anglais Shift Register Output ). Le signal de sortie SRO du registre à décalage 128a forme le signal d'entrée SRI du registre à décalage 128b. De même, le signal de sortie SRO du registre à décalage 128b forme le signal d'entrée d'un registre à décalage de pixel suivant alors que le signal d'entrée SRI du registre à décalage 128a est formé par un signal de sortie d'un registre à décalage de pixel précédent. Le signal de sortie de chaque registre à décalage 128a, 128b est aussi fourni au convertisseur 120a, 120b correspondant du pixel 10a, 10b de manière à activer ce convertisseur pour qu'il transmette sa valeur numérique de sortie au bus de transmission de données 126 au moment souhaité. En outre, un signal d'horloge CLK (de l'anglais Clock ) est fourni aux registres à décalage 128a, 128b pour cadencer les transmissions de valeurs numériques de pixels au bus de transmission de données 126. Le fonctionnement de cette variante comporte les étapes suivantes :
- tout d'abord, chaque pixel de la matrice de pixels est mis à l'état logique 0 (inactif) pour bloquer la sortie des convertisseurs 120a, 120b, - un état logique est mis à 1 (actif) à l'entrée d'un premier pixel l0a de manière à activer le signal d'horloge pour ce pixel et mettre de cette façon le signal SRO de ce pixel l0a à l'état 1 , pour que le convertisseur 120a transmette sa valeur numérique de sortie au bus de transmission de données 126, - l'état logique du premier pixel l0a est ensuite mis à 0 (inactif) et le signal d'horloge est de nouveau activé pour activer le pixel 10b et désactiver le pixel 10a, - dans la suite du processus de lecture des valeurs numériques des convertisseurs de la matrice de pixels, le signal de sortie SRO du pixel 10a reste à l'état 0 et l'état actif sur le signal SRO se propage dans la matrice à chaque coup d'horloge. La variante de la figure 6b comporte l'avantage de présenter des circuits électroniques identiques sur tous les pixels du biocapteur, avec moins d'interconnexions que dans la figure 6a, de sorte que moins de plots de connexion sont nécessaires pour relier le biocapteur à un contrôleur externe. En revanche, la lecture des valeurs numériques des convertisseurs offre moins de souplesse puisqu'elle est prédéterminée par le câblage du biocapteur qui ne peut, par définition, pas être modifié au cours de son fonctionnement. L'accès aléatoire rendu possible par l'exemple de réalisation de la figure 6b est donc avantageux par rapport à la variante de la figure 6b. Comme cela est représenté sur la figure 6c, plusieurs dispositifs 10i,], tels que le dispositif 10 de la figure 6a, peuvent être agencés en une matrice de pixels d'un biocapteur. Chaque dispositif 10i,3 représente
un pixel de ligne i et de colonne j de la matrice. Sur la figure 6c, seules quatre lignes et quatre colonnes d'une matrice de pixels sont représentées, mais il est facile de généraliser cette représentation à m lignes et n colonnes pour former un biocapteur complet. Tous les pixels sont connectés au même bus d'adresses 124 qui détermine la séquence dans laquelle les pixels du biocapteur peuvent fournir leurs valeurs numériques de sortie. De même, tous les pixels sont connectés au même bus 126 de transmission de données qui récupère ces valeurs numériques de sortie. Prévision d'une pluralité de zones de collecte de photoélectrons La structure de pixel différentiel décrite en référence aux figures 4 à 6 est basée sur l'hypothèse que les portions photosensibles sont définies strictement par leurs frontières, c'est-à-dire que leurs dimensions externes définissent la zone de collecte des photoélectrons. Dans ce cas, l'exigence de correspondance entre les première et seconde portions photosensibles signifie que les surfaces de ces deux portions photosensibles doivent être sensiblement égales. Cependant, une amélioration possible dans la structure de la couche photosensible 20 du dispositif d'analyse biologique 10, et notamment dans la structure des moyens de collecte de photoélectrons, permet de concevoir des portions photosensibles de surfaces différentes tout en assurant la correspondance des courants d'obscurité générés.
Le principe permettant d'illustrer cette amélioration structurelle est décrit dans le brevet publié sous le numéro US 6,998,659. Un premier mode de réalisation de dispositif d'analyse biologique conformément au principe présenté dans ce brevet est illustré sur la figure 7. Une couche
P-épitaxiale 66 est formée sur un substrat P 68. Ce substrat 68 est le substrat semi-conducteur 25 décrit plus haut ou une région dopée de celui-ci. Une zone de collecte de photoélectrons 70 est conçue sous la forme d'un puits N en forme d'île dans la couche P-épitaxiale 66. La zone de collecte 70 collecte des photoélectrons el, ..., e8 générés par une radiation incidente 72, notamment une radiation de chimioluminescence ou de fluorescence. Des moyens électroniques 74 de lecture et de traitement comprennent un puits P 76 dans lequel un transistor NMOS 78 est logé. Dans un dispositif d'analyse biologique de type pixel conventionnel, le puits N 70 s'étendrait sur toute la longueur disponible entre les moyens électroniques 74 de pixels successifs. Mais dans le dispositif de la figure 7, le puits N 70 est conçu en tant qu'île, c'est-à-dire qu'il est entouré de matériau P-épitaxial non connecté à la masse et très peu dopé en comparaison avec le puits P 76.
La taille plus faible du puits N 70 signifie que la capacité de la portion photosensible est relativement faible. Mais l'efficacité de collecte n'est pas compromise. En effet, la grande majorité des photoélectrons, tels que les photoélectrons el, ..., e6 représentés sur la figure 7, se diffusent dans la couche P-épitaxiale 66 et sont finalement collectés par le puits N 70. L'électron e7 peut statistiquement s'orienter indifféremment soit vers le puits N 70, soit vers le puits P 76. Quant à l'électron e8, il s'orientera certainement vers le puits P 76 et sera perdu. Un second mode de réalisation de dispositif d'analyse biologique conformément au principe présenté dans le brevet US 6,998,659 est illustré sur la figure 8. Dans ce mode de réalisation, les moyens électroniques 80 de lecture et de traitement comportent une fine couche 84
de matériau P+ s'étendant sur une grande partie du dispositif, de sorte que la surface de la couche P-épitaxiale 66 autour du puits N 70 est couverte par cette fine couche, à l'exception d'une zone étroite au voisinage du puits N 70. La fine couche 84 s'étend depuis le puits P 82 des moyens électroniques 80 et est donc connectée à ce dernier. Le puits P 82 est en général connecté à la masse et donc la fine couche 84 aussi. La fine couche 84 est par ailleurs moins profonde et, se situant à un potentiel moins élevé que le puits N 70, les photoélectrons ont plus de chances de se diriger vers le puits N 70 et d'être collectés par celui-ci que par la fine couche 84 ou par le puits P 82. Par exemple, l'électron e7 sur la figure 8 a plus de chances de se diriger vers le puits N 70, alors que sur la figure 7 il a autant de chances de se diriger vers le puits N 70 que vers le puits P 76. La taille d'une zone de collecte telle que le puits N 70 est dépendante de la technologie de fabrication utilisée, mais peut en général descendre jusqu'à 1 pm x 1 pm. Cette taille minimale n'est cependant pas recommandée puisque dans ces dimensions, les aléas de fabrication engendrent des différences de tailles importantes entre les zones de collecte ce qui génère des différences importantes dans leurs caractéristiques. Puisque, dans un pixel différentiel, la portion photosensible placée dans l'obscurité doit nécessairement correspondre précisément à la portion photosensible éclairée, des zones de collecte de trop petite taille ne sont pas souhaitables.
D'un autre côté, une augmentation de la taille du puits N augmente sa surface et son périmètre, conduisant à une augmentation du courant d'obscurité et du bruit associé. Aujourd'hui, un bon compromis de taille pour une zone de collecte telle que le puits N, compte tenu des
contraintes précitées, est une taille comprise entre 5 pm et 15 pm. Une mise en œuvre du perfectionnement présenté en référence aux figures 7 et 8 est illustrée sur la figure 9a. Sur cette figure, un pixel différentiel 86 comporte une première portion photosensible éclairée 88 et une seconde portion photosensible placée dans l'obscurité 90. Comme indiqué précédemment, il n'est pas nécessaire que les dimensions des première et seconde portions photosensibles 88 et 90 soient identiques, il suffit que les dimensions des zones de collecte 92 et 94 le soient. Il est donc possible d'envisager une grande souplesse dans la géométrie des pixels différentiels. En revanche, il est nécessaire de prendre en compte la distance que peut parcourir un photoélectron dans un substrat avant de se recombiner. Cette distance est appelée distance de recombinaison. Elle est déterminée tout d'abord par le niveau de dopage du substrat et ensuite par les défauts du substrat. Plus le dopage est élevé, plus la distance de recombinaison est faible. Cette distance de recombinaison impose donc une distance maximale entre une zone de collecte et les bords de la portion photosensible dans laquelle elle se trouve pour que tous les photoélectrons puissent être collectés avant d'être recombinés. La taille limitée des zones de collecte 92 et 94 impose donc une taille limitée des portions photosensibles du pixel différentiel 86. Avec un substrat classique ayant une résistivité de 100 Ohms par centimètre, la distance de recombinaison est en générale comprise entre 30 et 50 pm. Or, il a été vu précédemment qu'il est avantageux de prévoir des pixels dont la surface photosensible ait des dimensions adaptées à la taille d'une goutte de protéine sonde de quelques nanolitres permettant une détection par
chimioluminescence ou par fluorescence, c'est-à-dire des dimensions de l'ordre de 150 pm. Avec une zone de collecte 92 dont la taille est comprise entre 5 et 15 pm, la portion photosensible 88 ne peut pas atteindre ces dimensions. Pour obtenir un pixel différentiel 86 de dimensions plus importantes, une solution représentée sur la figure 9b consiste à augmenter la taille des zones de collecte 92 et 94. Il est ainsi possible d'atteindre des dimensions de pixel de l'ordre de 150 pm. Cependant, comme déjà indiqué ci-dessus, l'augmentation de la taille des zones de collecte 92 et 94 augmente les effets du courant d'obscurité et de son bruit associé. Pour obtenir un pixel de dimensions plus importantes, il est aussi possible de prévoir plusieurs puits N en forme d'île formant zones de collecte dans un même dispositif d'analyse biologique de type pixel, espacées les unes des autres d'une distance inférieure à la distance de recombinaison.
Sur la figure 9c, un pixel différentiel 86 comprend deux portions photosensibles 88 et 90 comportant chacune quatre zones de collecte 92 et 94 respectivement. Comme illustré sur cette figure, la géométrie des deux portions photosensibles 88 et 90 n'est pas nécessairement la même.
De plus, les zones de collecte 92 ne sont pas nécessairement disposées de la même façon dans la portion photosensible éclairée 88 que les zones de collecte 94 dans la portion photosensible placée dans l'obscurité 90. En revanche, les quatre zones de collecte 92, d'une part, et les quatre zones de collecte 94, d'autre part, ont les mêmes dimensions : elles sont par exemple de 5 ou 10 pm. Par ailleurs, les quatre zones de collecte 92 sont espacées les unes des autres de 75 pm. On peut ainsi obtenir un pixel différentiel 86 dont la portion photosensible éclairée 88 est un carré de 150 pm de côté
et dont la portion photosensible placée dans l'obscurité 90 est un rectangle de 150 pm par 20 pm. Sur la figure 9d, le pixel différentiel 86 comprend deux portions photosensibles 88 et 90 comportant chacune neuf zones de collecte 92 et 94 respectivement. Les dimensions des zones de collecte 92 et 94 sont par exemple de 5 im. Par ailleurs, les neuf zones de collecte 92 sont espacées les unes des autres de 50 pm par exemple. On peut ainsi obtenir un pixel différentiel 86 dont la portion photosensible éclairée 88 est un carré de 150 pm de côté et dont la portion photosensible placée dans l'obscurité 90 est un rectangle de 150 pm par 20 pm. On peut généraliser à des pixels (non représentés) comprenant davantage de zones de collecte (16 ou plus).
On notera que, puisque les géométries des portions photosensibles 88 et 90 ne sont pas nécessairement les mêmes, la présence d'une pluralité de zones de collecte sur les figures 9c et 9d permet même d'envisager une géométrie dans laquelle la portion photosensible placée dans l'obscurité 90 entoure la portion photosensible éclairée 88. Prévision d'un joint isolant entre deux pixels adjacents Il a été décrit comment les pixels d'un biocapteur selon l'invention peuvent être dimensionnés pour correspondre à la taille d'une goutte de protéine sonde. Ce dimensionnement avantageux permet un traitement plus simple des signaux obtenus. Cependant, pour que deux gouttes de protéine sonde voisines n'interfèrent pas par chimioluminescence ou par fluorescence, il est en général nécessaire d'imposer une distance minimale entre deux gouttes voisines, en général de plusieurs centaines de micromètres. Un autre perfectionnement pouvant être apporté à un 35 biocapteur selon invention, représenté sur la figure 10,
permet de réduire considérablement la distance nécessaire entre deux gouttes voisines. Cette figure représente deux pixels voisins 86a et 86b, dimensionnés pour recevoir chacun une goutte de protéine sonde spécifique. Le premier pixel 86a comporte une portion photosensible éclairée 88a, ici de forme carrée, par exemple de 150 pm de côté. Il comporte en outre une portion photosensible placée dans l'obscurité 90a de forme rectangulaire, de 150 pm de longueur et de 20 pm de largeur. Le second pixel 86b comporte une portion photosensible éclairée 88b de forme carrée de 150 pm de côté. Il comporte en outre une portion photosensible placée dans l'obscurité 90b de forme rectangulaire, de 150 pm de longueur et de 20 pm de largeur.
Le premier pixel 86a est séparé du second pixel 86b par un joint isolant 92 conformé pour isoler électriquement la portion photosensible éclairée 88a de ce pixel de la portion photosensible éclairée 88b du second pixel 86b et pour isoler mécaniquement les deux portions photosensibles éclairées, de sorte qu'une source de chimioluminescence ou de fluorescence située dans l'une des deux portions photosensibles éclairées ne soit pas détectable par l'autre portion photosensible éclairée.
Ainsi, un photoélectron el émis dans la portion photosensible éclairée 88a, en bordure de celle-ci, et pouvant notamment se diriger vers la portion photosensible éclairée 88b, serait absorbé par le joint isolant 92 au cas où il se dirigerait effectivement vers la portion photosensible éclairée 88b. Réciproquement, un photoélectron e2 émis dans la portion photosensible éclairée 88b, en bordure de celle-ci, et pouvant notamment se diriger vers la portion photosensible éclairée 88a, serait absorbé par le joint isolant 92 au cas où il se dirigerait effectivement vers la portion photosensible éclairée 88a. De même, une molécule excitée sur le premier pixel 86a diffusant une intensité lumineuse vers le second 5 pixel 86b verrait cette intensité lumineuse absorbée par le joint isolant, et réciproquement. Pour assurer une bonne protection réciproque des deux pixels voisins, le joint isolant peut avoir une épaisseur de quelques micromètres au maximum, ce qui est 10 largement inférieur à la taille d'un pixel ou d'une goutte de protéine sonde. Ainsi, la présence d'un tel joint isolant 92 permet de rapprocher considérablement les pixels d'un biocapteur selon invention et donc d'augmenter considérablement le nombre de gouttes de 15 protéine sonde spécifiques qui peuvent être disposées sur une surface prédéterminée de biocapteur. Les molécules ou photoélectrons piégés par le joint isolant 92 sont perdus pour la détection. Cependant, si l'on considère la vitesse de diffusion des molécules 20 émettrices de photons par chimioluminescence (ou par fluorescence) et l'épaisseur du joint isolant 92, on estime à environ 2 % au maximum, dans la configuration la moins favorable, la perte de photoélectrons ou photons générés sur un pixel mais non détectés par celui-ci. 25 En complément, un joint isolant supplémentaire peut aussi être interposé entre les portions photosensibles (88a, 90a, et 88b, 90b) de chaque pixel 86a, 86b et leurs moyens électroniques de lecture et de traitement respectifs. En effet, les moyens électroniques ne sont 30 pas de même nature que les portions photosensibles et peuvent être une source d'électrons parasites qui contribuent aux effets du courant d'obscurité des portions photosensibles. En outre, les moyens électroniques ont un potentiel plus élevé que celui des 35 portions photosensibles attirant ainsi les photoélectrons
se diffusant dans les portions photosensibles. Ces phénomènes sont susceptibles de détériorer la détection de protéines par chimioluminescence ou par fluorescence. Ainsi, la présence du joint isolant supplémentaire permet d'éviter cette migration d'électrons indésirables. Ce joint isolant supplémentaire comprend par exemple un puit P+/P- connecté à la masse et un puits N+/N- au potentiel positif. Traitement de la surface du biocapteur La surface d'un biocapteur selon l'invention est représentée sur la figure 11A en vue de dessus. Le biocapteur est agencé sur une plaquette de semi-conducteur et comporte une zone centrale photosensible 114 destinée à être mise en contact avec une substance biologique, la zone 114 formant ici une matrice de pixels du type décrit précédemment, et une zone périphérique 116 qui entoure la zone photosensible centrale 114, la zone 116 comprenant divers circuits électriques (par exemple circuits de lecture numérique, circuit logique de contrôle, etc.) et des connexions électriques entre ces éléments (câblage). Le biocapteur comporte enfin des plages de contact électrique 117 destinées par exemple à permettre le câblage du biocapteur ("bonding pads") sur un support d'interconnexion. Lors de sa fabrication ou de son utilisation, le biocapteur est soumis à un milieu humide, notamment des solutions biologiques ou réactifs chimiques, voire des solutions acides/basiques ou oxydantes/réductrices. La zone 116 est ainsi susceptible d'être au contact du milieu humique, ce qui pourrait endommager les parties électriques qu'elle comporte. Un perfectionnement visé ici est de protéger la zone 116 des milieux humides destinés à être en contact avec la zone photosensible centrale 114, et par ailleurs de favoriser le dépôt du mélange de capture tel que décrit plus haut. Ce perfectionnement comprend la
prévision des dispositions ou étapes suivantes, lors de la fabrication du biocapteur : - éloigner les plages de contact 117 de la zone photosensible centrale 114, par exemple à une distance de 850 m micromètres de celle-ci, en les agençant dans une zone périphérique 118 qui en entoure la zone périphérique 116. Cet éloignement évite leur contact avec les liquides lors des traitements chimiques du capteur ou pendant le déroulement du test biologique ; - recouvrir la zone périphérique 116 avec un revêtement hydrophile à forte rugosité. Ce revêtement hydrophile est par exemple de l'oxyde de silicium (SiO2) et forme une sorte d'"anneau", par exemple d'une largeur d'environ 700 pm, autour de la zone photosensible centrale 114 ; - recouvrir la zone photosensible centrale 114 avec un revêtement hydrophobe à faible rugosité, par exemple du nitrure de silicium (Si3N4). De préférence, on recouvre également le reste de la surface du biocapteur avec le revêtement hydrophobe à faible rugosité, soit la zone périphérique 118, les zones 114 et 118 pouvant être traitées simultanément. Ce revêtement permet une démarcation nette entre la zone périphérique 116 à protéger et la zone photosensible centrale 114. Une fois ces étapes conduites, la zone périphérique 116 peut être recouverte d'une épaisse couche de résine 119 biocompatible et non conductrice, formant une sorte de barrière qui encercle complètement la zone centrale, comme illustré sur la figure 11B par une vue en coupe. Cette barrière de résine isole du milieu humide la zone 118 recevant les plages de contact 117 tout en protégeant également la zone de câblage 116, qu'elle recouvre entièrement. Sa hauteur peut être de plusieurs
millimètres et est ainsi très supérieure à l'épaisseur du biocapteur, par exemple 30 à 100 pm. Grâce à la variation d'hydrophilie entre les zones 116 et 114, 118, la résine protectrice 119 a tendance, avant de se durcir par polymérisation, à se répartir automatiquement tout autour de la zone photosensible centrale 114, sans empiéter sur celle-ci ni même Y adhérer et sans recouvrir les plages de contact 117. En d'autres termes, le traitement de surface hydrophobe a un effet "répulsif" vis-à-vis de la résine et limite son étalement, jusqu'à ce que celle-ci soit polymérisée. Le revêtement hydrophobe sur la zone photosensible centrale 114 permet en outre de s'assurer que des solutions déposées sur la zone 114 pendant les étapes de préparation biologique ne s'étendent pas au-delà de la matrice de pixel en allant attaquer chimiquement des éléments appartenant à la zone 116 et se trouvant sur la bordure intérieure de celle-ci. De tels éléments situés en bordure intérieure de la zone 116, par exemple des conducteurs en aluminium, pourraient en effet être imparfaitement recouverts par la résine 119 et donc être imparfaitement protégés. En particulier, le procédé de formation de l'hydrogel tel que décrit plus haut comprend l'étape S104 de dépôt d'une solution d'hydroxyde de potassium (KOH) qui est susceptible d'attaquer chimiquement des éléments fragiles en bordure de la zone 116. La solution est déposée sur la matrice de pixel selon un dosage déterminé. Le revêtement hydrophobe empêche que la dose de solution d'hydroxyde de potassium se s'étale au-delà de la zone photosensible centrale 114, sous l'effet des forces de tension superficielle. A titre d'exemple numérique, une rugosité de l'ordre de 50 nm a été mesurée sur un revêtement de nitrure de silicium (Si3N4) en utilisant des techniques
de mesure classiques de la profondeur de rugosité. Le revêtement de nitrure de silicium a été déposé en utilisant un procédé de fabrication classique mis en œuvre dans les unités de production de la demanderesse et a permis d'obtenir le résultat visé en limitant l'étalement de la solution d'hydroxyde de potassium. L'homme de l'art pourra toutefois déterminer d'autres revêtements voire des procédés de traitement de surface permettant de rendre hydrophobe la surface de la zone photosensible centrale 114. Ainsi, la combinaison de ces caractéristiques permet une disposition et une adhérence optimale de la résine protectrice 119 aussi bien par les caractéristiques chimique des surfaces traitées que par la disposition des composants du biocapteur et leur espacement. Il apparaîtra clairement à l'homme de l'art qu'un dispositif d'analyse biologique et un biocapteur selon invention, auxquels sont éventuellement ajoutés les perfectionnement précités, permettent notamment l'utilisation de la technologie des imageurs CMOS pour l'analyse par chimioluminescence ou par fluorescence de substances biologiques comportant des protéines cibles fragiles. Il apparaîtra également à l'homme de l'art que les divers modes de réalisation ainsi que les diverses perfectionnements décrits plus haut peuvent être combinés pour obtenir d'autres modes de réalisation. Par ailleurs, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux modes de réalisation décrits ci-dessus, à la lumière de l'enseignement qui vient de lui être divulgué. Dans les revendications qui suivent, les termes utilisés ne doivent pas être interprétés comme limitant les revendications aux modes de réalisations exposés dans la présente description, mais doivent être interprétés pour y inclure tous les équivalents que les revendications visent couvrir du fait de leur formulation et dont la prévision est à la portée de l'homme de l'art en appliquant ses connaissances générales à la mise en œuvre de l'enseignement qui vient de lui être divulgué.

Claims (16)

  1. REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un biocapteur sur une plaquette de semi-conducteur, comprenant des étapes 5 consistant à réaliser : - une zone photosensible centrale (116) comprenant au moins un dispositif d'analyse biologique de type pixel (10i,j) comprenant une couche photosensible (20), et - une première zone périphérique (116) entourant la zone 10 photosensible centrale, comprenant des circuits électroniques, caractérisé en ce qu'il comprend des étapes consistant à : - recouvrir la première zone périphérique (116) d'un 15 revêtement hydrophile, - recouvrir la zone photosensible centrale d'un revêtement hydrophobe dont la rugosité est choisie en sorte qu'une dose d'une solution pouvant être ultérieurement déposée sur la zone photosensible centrale 20 ne s'étale pas au-delà de celle-ci jusqu'à atteindre la première zone périphérique, et - former une barrière d'une résine biocompatible (119) sur la seconde zone périphérique (118), la résine se fixant naturellement, avant polymérisation, sur le 25 revêtement hydrophile sans s'étendre sur le revêtement hydrophobe.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant également les étape consistant à : 30 - réaliser, dans une seconde zone périphérique (118) entourant la première zone périphérique (116), des plages de contact électrique (117) reliées aux circuits électroniques de la première zone périphérique, et - recouvrir la seconde zone périphérique (118) au moyen 35 du revêtement hydrophobe. 475
  3. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, dans lequel le revêtement hydrophile est de l'oxyde de silicium.
  4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le revêtement hydrophobe est du nitrure de silicium. 10
  5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, comprenant une étape de dépôt, sur la surface (22) de la couche photosensible (20) du dispositif d'analyse biologique de type pixel revêtue du revêtement hydrophobe, d'un mélange de capture (12) comportant une 15 protéine sonde (14) greffée à un hydrogel (16, 18), pour la capture de protéines cibles.
  6. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'étape de dépôt du mélange de capture comporte des 20 étapes de : - préparation (S100, S102, S104, S106, S108, 5110) de la surface externe (22) de la couche photosensible (20) destinée à recevoir le mélange de capture, comprenant une étape de silanisation de la surface externe, 25 - oxydation (S112) de l'hydrogel et greffage (S114, S116) de l'hydrogel oxydé sur la surface externe silanisée, - carboxylation (S118) et activation (S120) de l'hydrogel greffé, et - greffage (S122) de la protéine sonde dans l'hydrogel 30 activé.
  7. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'étape de préparation de la surface externe par silanisation comporte les phases suivantes : - nettoyage (S102) de la surface externe par rinçages successifs à l'eau déminéralisée, à l'acétone et à l'éthanol absolu dans un bain à ultrasons, - oxydation alcaline (S104) de la surface externe par oxydation sous l'action d'un plasma ozone, puis traitement par une solution d'hydroxyde de potassium pendant plusieurs heures à température ambiante, - immersions successives (S106) dans de l'eau déminéralisée puis dans l'éthanol absolu sous ultrasons et séchage sous flux d'Argon, - silanisation (S108) de la surface externe au moyen d'une solution de 3-aminopropyltriethoxysilane dans de l'éthanol pendant plusieurs heures, - immersions successives (S108) dans de l'eau 15 déminéralisée puis dans l'éthanol absolu sous ultrasons et séchage sous flux d'Argon, - chauffage du dispositif (5110) pendant plusieurs heures puis maintien sous atmosphère inerte. 20
  8. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 et 7, dans lequel l'étape d'oxydation et de greffage de l'hydrogel comporte les phases suivantes : - dissolution (S112) de l'hydrogel dans de l'eau déminéralisée, puis traitement par une solution de 25 périodate de sodium dont le volume est ajusté afin d'obtenir un mélange dont le ratio molaire entre le périodate de sodium et un motif monomère prédéterminé et répété de l'hydrogel est de l'ordre de 50%, - protection (S112) du mélange réactionnel obtenu contre 30 la lumière et agitation pendant plusieurs heures à température ambiante, pour obtenir un hydrogel oxydé, - greffage (S114) de l'hydrogel oxydé sur la surface externe silanisée et agitation à température ambiante et à l'abri de la lumière pendant plusieurs heures, - traitement (S116) de l'ensemble obtenu par une solution aqueuse de cyanoborohydrure de sodium pendant plusieurs heures afin de réduire des bases de Schiff formées, puis rinçage à l'eau déminéralisée, à l'éthanol et séchage sous flux d'Argon.
  9. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, dans lequel l'étape de carboxylation et d'activation de l'hydrogel greffé comporte les phases suivantes : - traitement (S118) de l'hydrogel greffé par une solution d'acide bromoacétique dans du périodate de sodium pendant plusieurs heures à température ambiante et sous Argon, - purge (S118) du mélange réactionnel obtenu puis rinçage à l'eau déminéralisée, à l'éthanol et séchage sous flux d'Argon, - activation (S120) sous forme d'esters des résidus carboxylates formés, puis rinçage à l'eau.
  10. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, comportant une étape consistant à dimensionner la surface externe (22) de la couche photosensible du dispositif d'analyse biologique de type pixel de manière à ce qu'elle corresponde à la taille d'une dose prédéterminée d'un mélange de capture pouvant être disposé sur la surface externe sous la forme d'une goutte.
  11. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel la surface externe (22) de la couche photosensible du dispositif de type pixel est dimensionnée de manière à présenter une surface d'au moins 25500 10-12 m2.
  12. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel l'étape de réalisation de la couche photosensible (20) du dispositif d'analyse biologique de type pixel comprend une étape de formation, dans la couche photosensible, de moyens de collecte de photoélectrons comportant plusieurs zones de collecte (70 ; 92) conformées en îlots et espacées les unes des autres dans la couche photosensible (20).
  13. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel les zones de collecte (70 ; 92) sont espacées les unes des autres d'une distance inférieure à une distance maximale prédéterminée et fixée en fonction d'une distance de recombinaison de photoélectrons émis dans la couche photosensible.
  14. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel la couche photosensible est réalisée de 15 manière à présenter : - une première portion (42) apte à détecter une intensité lumineuse incidente provenant d'un mélange de capture (12) et destinée à fournir une première grandeur électrique (Iph+Idl) et 20 - une seconde portion (44) protégée contre l'intensité lumineuse incidente provenant du mélange de capture (12), destinée à fournir une seconde grandeur électrique (Id2).
  15. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, 25 dans lequel l'étape de formation de zone photosensible centrale (116) comprend les étapes consistant à : - former dans la zone photosensible centrale une matrice de dispositifs d'analyse biologique de type pixel (10i,i) comprenant chacun une couche photosensible, et 30 - former un joint isolant (92) entre des pixels adjacents (86a, 86b), le joint isolant (92) étant conformé pour isoler électriquement une couche photosensible (88a, 90a, 88b, 90b) d'un pixel de la couche photosensible du pixel adjacent. 35
  16. 16. Procédé selon la revendication 15, comprenant la réalisation, dans chaque dispositif d'analyse biologique de type pixel (10i,j), d'un convertisseur analogique numérique (120) pour la conversion en données numériques d'une valeur caractéristique d'une intensité lumineuse détectée par le pixel.
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