FR2921670A1 - Specific culture medium, useful for growth, detection, identification and/or counting of coagulase-positive Staphylococcus bacteria, comprises aminoglycoside compound as inhibitor of coagulase-negative Staphylococcus bacteria - Google Patents

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Abstract

Specific culture medium for growth, detection, identification and/or counting of coagulase-positive Staphylococcusbacteria, comprises an aminoglycoside compound as an inhibitor of coagulase-negative Staphylococcusbacteria. An independent claim is included for a process of growth, detection, identification and/or counting of coagulase-positive Staphylococcusbacteria, comprising inoculating the culture medium with a biological sample, able to contain coagulase positive Staphylococcibacteria, placing the inoculated culture medium in suitable conditions to allow growth of coagulase-positive Staphylococcusbacteria and measuring the variation of fluorescence level in the culture medium using a fluorescence reader, where the variation corresponds to a change in pH in the culture medium.

Description

MILIEU DE CULTURE SPECIFIQUE POUR LA CROISSANCE, LA DETECTION, L'IDENTIFICATION ET/OU LA NUMERATION DES BACTERIES STAPHYLOCOQUES A COAGULASE POSITIVE La présente invention concerne, de façon générale, le domaine de l'analyse microbiologique. Plus particulièrement, la présente invention concerne un milieu de culture sélectif pour la croissance la détection, l'identification et/ou la numération des staphylocoques à coagulase positive. FIELD OF THE INVENTION The present invention relates generally to the field of microbiological analysis. More particularly, the present invention relates to a selective growth medium for the growth of the detection, identification and / or counting of coagulase-positive staphylococci.

Les bactéries du genre Staphylococcus ou staphylocoques sont responsables d'un grand nombre d'infections nosocomiales et représentent un problème hospitalier important. Ces bactéries sont des bactéries à Gram positif, qui peuvent être classées en deux grands groupes que l'on distingue par la production d'une enzyme, la coagulase, déclenchant la coagulation du plasma. On distingue ainsi les staphylocoques à coagulase négative, dont le représentant principal est Staphylococcus epidermidis et les staphylocoques à coagulase positive, dont le représentant principal est Staphylococcus aureus, bien connu pour sa virulence. Les Staphylocoques sont largement répandus dans l'environnement, la peau et les muqueuses de l'homme et de l'animal. La desquamation régulière de ces hôtes a pour effet de les disperser abondamment dans la nature (eau, sol, air, aliments, objets), et en milieu hospitalier, des mesures draconiennes d'hygiène et d'isolement des patients sont requises pour limiter la dissémination des souches épidermiques. Ainsi, Staphylococcus aureus, qui représente 80 à 90% des Staphylocoques isolés en clinique est un pathogène majeur de l'homme responsable de nombreuses infections en milieu hospitalier, telles que notamment lors de pneumonies nosocomiales, d'infections de plaies chirurgicales, d'infections de brûlures, d'infections des corps étrangers (valves cardiaques, prothèses de hanche, agrafes...) et d'infections systémiques ou de septicémies qui sont souvent dues à l'usage de cathéters intra vasculaires, ou à la dissémination de la bactérie à partir d'un autre foyer infectieux. Dans le domaine alimentaire, le risque constitué par les staphylocoques, et en particulier par les staphylocoques à coagulase positive, est lui aussi très important. En effet, certaines souches de Staphylococcus aureus sont capables de produire des entérotoxines, dont l'ingestion par le consommateur entraîne une intoxination, source de nausées, douleurs abdominales et surtout vomissements violents et répétés souvent accompagnés de diarrhée. Les toxi- infections alimentaires à staphylocoques représentent ainsi une des premières toxi- infections alimentaires d'origine bactérienne. Staphylococcus bacteria or staphylococci are responsible for a large number of nosocomial infections and represent an important hospital problem. These bacteria are Gram-positive bacteria, which can be classified into two broad groups that are distinguished by the production of an enzyme, coagulase, triggering plasma coagulation. Thus, coagulase-negative staphylococci are distinguished, the main representative being Staphylococcus epidermidis and coagulase-positive staphylococci, the main representative of which is Staphylococcus aureus, well-known for its virulence. Staphylococci are widely distributed in the environment, skin and mucous membranes of humans and animals. The regular desquamation of these hosts has the effect of dispersing them abundantly in nature (water, soil, air, food, objects), and in hospital, draconian measures of hygiene and isolation of patients are required to limit the dissemination of epidermal strains. Thus, Staphylococcus aureus, which accounts for 80 to 90% of clinically isolated Staphylococci, is a major human pathogen responsible for many infections in hospitals, such as nosocomial pneumonia, surgical wound infections, infections burns, infections of foreign bodies (heart valves, hip prostheses, staples ...) and systemic infections or septicemia that are often due to the use of intravascular catheters, or to the spread of the bacteria from another infectious focus. In the food sector, the risk posed by staphylococci, and in particular coagulase-positive staphylococci, is also very important. Indeed, some strains of Staphylococcus aureus are capable of producing enterotoxins, whose ingestion by the consumer leads to intoxination, source of nausea, abdominal pain and especially violent and repeated vomiting often accompanied by diarrhea. Food poisoning with staphylococci is one of the first bacterial foodborne infections.

La dissémination se produit généralement par les animaux et l'homme qu'ils soient malades ou porteurs sains, par le lait cru (mammites), par l'air et les surfaces ou le matériel contaminés au contact d'aliments et de porteurs sains ou infectés. Dissemination usually occurs in animals and humans, whether they are sick or healthy carriers, raw milk (mastitis), air and contaminated surfaces or equipment in contact with food and healthy carriers, or infected.

La détection et l'identification dans les aliments des staphylocoques et en particulier des staphylocoques à coagulase positive, tels que Staphylococcus aureus, constituent donc un enjeu de santé publique majeur. The detection and identification in foodstuffs of staphylococci, and in particular coagulase-positive staphylococci, such as Staphylococcus aureus, is therefore a major public health issue.

Parmi les milieux de culture utilisés pour la détection, l'identification et la numération des bactéries du genre Staphylococcus, on distingue les milieux non sélectifs tels le milieu Columbia ou la gélose trypticase-soja et les milieux lectifs, tels la gélose Chapman et la gélose Baird-Parker. S. aureus peut aussi être détecté sur une gélose au sang en fonction de ses caractéristiques morphologiques et de son profil d'hémolyse mais cette méthode n'est que peu ou pas utilisée dans l'industrie agro-alimentaire. Le bouillon coeur-cervelle est également employé de façon usuelle pour la recherche de staphylocoques. Among the culture media used for the detection, identification and counting of bacteria of the genus Staphylococcus, non-selective media such as Columbia medium or trypticase-soy agar and lective media such as Chapman agar and agar are distinguished. Baird-Parker. S. aureus can also be detected on blood agar according to its morphological characteristics and its hemolysis profile, but this method is little used or not used in the agri-food industry. Heart-brain broth is also used routinely for staphylococci.

Les milieux de culture bactériologiques spécifiques favorisent la croissance de certains microorganismes et limitent celle des autres. Ils contiennent au moins un agent inhibiteur de microorganismes autres que le pathogène cible. L'effet des inhibiteurs doit rester limité sur le microorganisme d'intérêt, d'autant que le dit microorganisme d'intérêt peut être endommagé dans les préparations alimentaires élaborées. La gélose Chapman correspond à un milieu hyper salin sur une base nutritive ordinaire, utilisant le mannitol comme substrat dont la fermentation est révélée par un indicateur de pH. Ledit indicateur de pH peut être un indicateur coloré ou un indicateur fluorescent. Dans le cas d'un indicateur fluorescent, on pourra mesurer soit une apparition, soit une extinction de fluorescence. Le milieu de Baird-Parker correspond à une base nutritive riche additionnée de tellurite de potassium et de chlorure de lithium, agents sélectifs communément utilisés pour la croissance de Staphylococcus aureus. Le chlorure de lithium est un inhibiteur des entérocoques. D'autres éléments chimiques peuvent être combinés avec le tellurite de potassium et le chlorure de sodium ou de lithium : le sulfate d'ammonium, l'acide sorbique, la glycine, la polymyxine B. Specific bacteriological culture media promote the growth of certain microorganisms and limit that of others. They contain at least one microorganism inhibiting agent other than the target pathogen. The effect of the inhibitors must remain limited on the microorganism of interest, especially since said microorganism of interest can be damaged in the prepared food preparations. Chapman Agar is a hyper-saline medium on an ordinary nutrient basis, using mannitol as a substrate whose fermentation is revealed by a pH indicator. The pH indicator may be a color indicator or a fluorescent indicator. In the case of a fluorescent indicator, it will be possible to measure either an appearance or a fluorescence quenching. Baird-Parker's medium is a rich nutrient base supplemented with potassium tellurite and lithium chloride, selective agents commonly used for the growth of Staphylococcus aureus. Lithium chloride is an inhibitor of enterococci. Other chemical elements can be combined with potassium tellurite and sodium or lithium chloride: ammonium sulphate, sorbic acid, glycine, polymyxin B.

Néanmoins, l'analyse des matrices alimentaires pour les staphylocoques potentiellement toxinogènes présente des problèmes spéciaux qui limitent l'utilisation pratique des méthodes développées pour la clinique. En effet, les milieux couramment proposés permettent aussi la croissance et, selon le caractère phénotypique recherché, la détection des staphylocoques à coagulase négative qui ne sont pas considérés comme des agents de contamination alimentaire. Nevertheless, the analysis of food matrices for potentially toxigenic staphylococci presents special problems that limit the practical use of the methods developed for the clinic. Indeed, the currently proposed media also allow growth and, depending on the phenotypic character sought, the detection of coagulase-negative staphylococci which are not considered as food contaminants.

Les milieux de culture permettant la croissance des staphylocoques à coagulase positive, tout en inhibant au moins partiellement la croissance des staphylocoques à coagulase négative, reposent essentiellement sur l'utilisation de colistine, qui est un antibiotique de la famille des polymyxines. Bien que polyvalents en terme d'utilisation, de tels milieux sont plus particulièrement utilisés dans le domaine agroalimentaire, pour la détection des staphylocoques à coagulase positive potentiellement présents dans les produits alimentaires. Or, dans le cas de telles applications, il se produit des problèmes de spécificité dus à l'inactivation de la colistine par le prélèvement. En effet, la colistine s'avère être sensible aux cations. Aussi, lorsque le prélèvement est riche en cations, ce qui est le cas des produits laitiers en raison d'une teneur importante en Calcium, il peut se produire une inactivation totale de la colistine, empêchant par là même, toute discrimination entre les staphylocoques à coagulase positive et les staphylocoques à coagulase négative. Culture media for the growth of coagulase-positive staphylococci, while at least partially inhibiting the growth of coagulase-negative staphylococci, rely primarily on the use of colistin, which is an antibiotic of the polymyxin family. Although versatile in terms of use, such media are more particularly used in the agri-food field for the detection of coagulase-positive staphylococci potentially present in food products. However, in the case of such applications, there are specificity problems due to the inactivation of colistin by the sample. Indeed, colistin proves to be sensitive to cations. Also, when the sample is rich in cations, which is the case of dairy products because of a high content of calcium, there may be a total inactivation of colistin, thereby preventing any discrimination between staphylococci to coagulase positive and coagulase negative staphylococci.

Il ressort de cet état des lieux qu'il n'existe pas, à ce jour, de milieu de culture permettant à la fois de favoriser la croissance, la détection et le dénombrement de Staphylococcus aureus, et de limiter la croissance de staphylocoques à coagulase négative et celle des bactéries à Gram négatif, à partir d'échantillons complexes. It emerges from this inventory that, to date, there is no culture medium that makes it possible to promote the growth, detection and enumeration of Staphylococcus aureus, and to limit the growth of coagulase-staphylococci. negative and Gram-negative bacteria from complex samples.

Eu égard aux problèmes soulevés par l'état de la technique considéré ci dessus, un des objectifs essentiels de la présente invention est de favoriser la croissance des bactéries staphylocoques à coagulase positive dans le but de les détecter et/ou les identifier et/ou les dénombrer. In view of the problems raised by the state of the art considered above, one of the essential objectives of the present invention is to promote the growth of coagulase positive staphylococci bacteria in order to detect and / or identify them and / or count.

Un autre objectif essentiel de la présente hvention est de limiter, sur un milieu culture, la croissance des bactéries staphylocoques à coagulase négative susceptibles d'interférer dans la détection, l'identification ou la numération de bactéries à coagulase positive soit par une flore annexe trop importante (problème de sélectivité), soit par une réaction aspécifique (problème de spécificité du marqueur phénotypique recherché). Another essential objective of the present invention is to limit, on a culture medium, the growth of coagulase-negative staphylococcus bacteria that may interfere in the detection, identification or counting of coagulase-positive bacteria, either by an overgrowth important (problem of selectivity), either by an aspecific reaction (problem of specificity of the desired phenotypic marker).

Un autre objectif de l'invention est de pallier l'inhibition de la colistine ou des polymyxines, utilisées dans un milieu de culture, par les cations présents dans un 10 échantillon ou dans ledit milieu de culture. Another object of the invention is to overcome the inhibition of colistin or polymyxins used in a culture medium by the cations present in a sample or in said culture medium.

Ces objectifs, parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne en premier lieu un milieu de culture permettant la croissance sélective des staphylocoques à coagulase positive, ledit milieu comportant en outre au moins un composé du type 15 aminoglycoside à titre d'inhibiteur des bactéries à coagulase négative. These objectives, among others, are achieved by the present invention which relates firstly to a culture medium for the selective growth of coagulase-positive staphylococci, said medium further comprising at least one aminoglycoside-like compound as a inhibitor of coagulase negative bacteria.

Le composé de la famille des aminoglycosides ou aminosides est préférentiellement choisi parmi les produits suivants : 1'amikacine, la gentamicine, la kanamycine, la néomycine, la nétilmicine, la paronomycine ou la streptomycine. Préférentiellement, les 20 aminoglycosides sont utilisés à une concentration comprise entre 0,2 et 10 mg/l. Selon un variante de l'invention, les composés de la famille des aminoglycosides sont utilisés en complément des autres agents sélectifs, éléments chimiques ou composés antibactériens, classiquement utilisés dans les milieux de culture et dont des exemples sont donnés supra. 25 Ainsi, le milieu de culture selon l'invention peut contenir de la colistine. Dans un mode de réalisation préférentiel, le milieu de culture selon l'invention se présente sous forme liquide. En effet, cette forme est particulièrement adaptée à 1' analyse microbiologique alimentaire, qui peut nécessiter une phase de malaxage des échantillons solides dans le milieu de culture, pour permettre la libération des microorganismes 30 potentiellement présents dans lesdits échantillons. The compound of the aminoglycoside or aminoglycoside family is preferably chosen from the following products: amikacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, netilmicin, paronomycin or streptomycin. Preferably, the aminoglycosides are used at a concentration of between 0.2 and 10 mg / l. According to a variant of the invention, the compounds of the aminoglycoside family are used in addition to other selective agents, chemical elements or antibacterial compounds, conventionally used in culture media and examples of which are given above. Thus, the culture medium according to the invention may contain colistin. In a preferred embodiment, the culture medium according to the invention is in liquid form. Indeed, this form is particularly suitable for microbiological food analysis, which may require a mixing phase of the solid samples in the culture medium, to allow the release of microorganisms potentially present in said samples.

Avantageusement, le milieu de culture selon l'invention peut comporter en outre un substrat permettant de révéler une activité enzymatique ou métabolique des microorganismes cibles. Pour une détection directe, ce substrat peut être lié à une partie faisant office de marqueur, fluorescent ou chromogène. Pour une détection indirecte, le milieu de culture selon l'invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant la croissance des microorganismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un fluorophore. On citera comme exemples de chromophores le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Les fluorophores comprennent par exemple la 4- méthylumbelliferone, les dérivés de 1'aminocoumarine ou les dérivés de la résorufine Advantageously, the culture medium according to the invention may further comprise a substrate making it possible to reveal an enzymatic or metabolic activity of the target microorganisms. For direct detection, this substrate may be bound to a marker portion, fluorescent or chromogenic. For indirect detection, the culture medium according to the invention may additionally comprise a pH indicator, sensitive to the pH variation induced by the consumption of the substrate and revealing the growth of the target microorganisms. The said pH indicator may be a chromophore or a fluorophore. Examples of chromophores include neutral red, aniline blue, bromocresol blue. The fluorophores include, for example, 4-methylumbelliferone, aminocoumarin derivatives or resorufin derivatives.

Selon un premier mode de réalisation, le milieu sélectif objet de l'invention est utilisé en contrôle microbiologique alimentaire. Préférentiellement, il est utilisé pour la croissance et la numération de Staphylococcus aureus dans les produits laitiers. According to a first embodiment, the selective medium which is the subject of the invention is used in food microbiological control. Preferably, it is used for growth and enumeration of Staphylococcus aureus in dairy products.

Selon un autre mode de réalisation, le milieu sélectif objet de l'invention est utilisé en contrôle microbiologique de l'environnement. Par environnement, on entend des prélèvements d'air, des prélèvements d'eau, ou des prélèvements de surfaces. Parmi les prélèvements de surfaces, l'objet de l'invention peut trouver une application particulière dans la détection en milieu hospitalier des staphylocoques à coagulase positive responsables d'infections nosocomiales. Selon un autre mode de réalisation, le milieu sélectif objet de l'invention est utilisé en analyse clinique pour détecter et/ou identifier et/ou dénombrer Staphylococcus aureus. Selon un mode de réalisation particulier, le milieu sélectif objet de l'invention peut comporter en outre un marqueur de résistance, par exemple dans le cadre d'un test de résistance d'une souche de Staphylococcus aureus à la méthicilline. According to another embodiment, the selective medium which is the subject of the invention is used in microbiological control of the environment. By environment, we mean air sampling, water sampling, or surface sampling. Among the surface samples, the object of the invention can find a particular application in the detection in hospital of coagulase-positive staphylococci responsible for nosocomial infections. According to another embodiment, the selective medium which is the subject of the invention is used in clinical analysis to detect and / or identify and / or enumerate Staphylococcus aureus. According to a particular embodiment, the selective medium which is the subject of the invention may further comprise a resistance marker, for example in the context of a resistance test of a strain of Staphylococcus aureus with methicillin.

Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation in vitro d'un aminoglycoside dans un milieu sélectif pour limiter la croissance des staphylocoques à coagulase négative et favoriser la croissance des staphylocoques à coagulase positive.30 Another object of the present invention is the in vitro use of an aminoglycoside in a selective medium to limit the growth of coagulase-negative staphylococci and to promote the growth of coagulase-positive staphylococci.

Enfin, un dernier objet de la présente invention concerne un procédé de détection et/ou l'identification des bactéries staphylocoques à coagulase positive, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : • Ensemencer un milieu de culture selon l'invention, avec un échantillon biologique, susceptible de contenir des bactéries staphylocoques à coagulase positive ; • Mettre le milieu de culture ainsi ensemencé dans des conditions aptes à permettre la croissance des bactéries staphylocoques à coagulase positive ; et • Mesurer la variation du niveau de fluorescence dans le milieu de culture à l'aide d'un lecteur de fluorescence, cette diminution correspondant à un variation du pH dans ledit milieu de culture. De façon préférentielle, l'échantillon biologique est un échantillon clinique, alimentaire ou environnemental. Finally, a final subject of the present invention relates to a method for detecting and / or identifying coagulase-positive staphylococci bacteria, said method comprising the steps of: • Seeding a culture medium according to the invention with a biological sample , likely to contain coagulase positive staphylococci bacteria; • Place the culture medium thus seeded under conditions that allow the growth of coagulase-positive staphylococci bacteria; and measuring the variation of the fluorescence level in the culture medium using a fluorescence reader, this reduction corresponding to a variation of the pH in said culture medium. Preferably, the biological sample is a clinical, food or environmental sample.

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. The following examples are given for illustrative purposes and are in no way limiting. They will help to better understand the invention.

Exemple 1: Effet de la Kanamycine sur la croissance de Staphylococcus aureus et de staphylocoques à coagulase négative en milieu type Chapman. Example 1 Effect of Kanamycin on the Growth of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci in Chapman Medium.

Une gamme de concentration de kanamycine a été ajoutée à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4- méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés comprennent respectivement 0 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 mg/1 de Kanamycine. A concentration range of kanamycin was added to a liquid culture medium having as a base composition the Chapman medium without agar. The pH indicator used is 4-methylumbelliferone. The detection of the acidification of Mannitol is carried out by means of a fluorimeter. The media tested respectively include 0; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 mg / l of Kanamycin.

Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés selon l'échelle suivante : + croissance +/-croissance moyenne - croissance nulle Les résultats sont présentés dans le tableau I ci-dessous : TABLEAU I Kanamycine à 0 g/I 1 mg/I 1.5 mg/I 2 mg/I 2.5 mg/I 3 mg/I souches croissance croissance croissance croissance croissance croissance Staphylococcus + + + + +1- +1- aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + +1- - aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + - - - - - arlettae 92 03 375 Staphylococcus + - - - - - carnosus 97 03 075 Staphylococcus + +/- +/- - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + +/- - - - lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + + - - warneri 04 07 185 Staphylococcus < 1 < 1 <1 94 170 ininterprétable gallinarum 85 07 67 D'après ce tableau il est possible de remarquer que les souches de S. aureus testées ne sont pas inhibées par la kanamycine avant 2.5 mg /1. On observe également que, à ces mêmes concentrations, la plupart des souches de staphylocoques à coagulase négative testées présentent un retard de croissance notable, voire une absence de croissance totale. Cet antibiotique permet donc l'inhibition des staphylocoques à coagulase négative sans inhibition de S. aureus. Microorganisms from the Applicant's collection have been included in these media from a 0.5 McFarland suspension. Media was incubated at 37 ° C for 24 hours. The readings are performed using a fluorimeter after 24 hours of incubation. The results are expressed according to the following scale: + growth +/- average growth - zero growth The results are shown in Table I below: TABLE I Kanamycin at 0 g / I 1 mg / I 1.5 mg / I 2 mg / I 2.5 mg / I 3 mg / I strains growth growth growth growth growth Staphylococcus + + + + + 1- + 1- aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + 1- aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + - - - - - arlettae 92 03 375 Staphylococcus + - - - - - carnosus 97 03 075 Staphylococcus + +/- +/- - - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + +/- - - - lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + + - - warneri 04 07 185 Staphylococcus <1 <1 <1 94 170 uninterpretable gallinarum 85 07 67 According to this table it is possible to notice that the strains of S. aureus tested are not not inhibited by kanamycin before 2.5 mg / l. It is also observed that, at these same concentrations, most of the strains of coagulase-negative staphylococci tested show a marked growth retardation, or even an absence of total growth. This antibiotic therefore allows the inhibition of coagulase-negative staphylococci without inhibition of S. aureus.

Exemple 2 : Effet de la Streptomycine sur la croissance de Staphylococcus aureus et de staphylocoques à coagulase négative en milieu type Chapman. Example 2 Effect of Streptomycin on Growth of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci in Chapman Medium.

Une gamme de concentration de Streptomycine a été ajoutée à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar. L'indicateur de pH utilisé A concentration range of streptomycin was added to a liquid culture medium having as base composition Chapman medium without agar. The pH indicator used

est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés comprennent respectivement 0 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 mg/1 de Kanamycine. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés selon l'échelle suivante : + croissance +/- croissance moyenne -croissance nulle Les résultats sont présentés dans le tableau II ci dessous : is 4-methylumbelliferone. The detection of the acidification of Mannitol is carried out by means of a fluorimeter. The media tested respectively include 0; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 mg / l of Kanamycin. Microorganisms from the Applicant's collection have been included in these media from a 0.5 McFarland suspension. Media was incubated at 37 ° C for 24 hours. The readings are performed using a fluorimeter after 24 hours of incubation. The results are expressed according to the following scale: + growth +/- average growth - zero growth The results are shown in Table II below:

TABLEAU II Streptomycine à 0 g/I 1 mg/I 1.5 mg/I 2 mg/I 2.5 mg/I 3 mg/I souches croissance croissance croissance croissance croissance croissance Staphylococcus + + + +1- - - aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + + + + + + arlettae 92 03 375 Staphylococcus + + - - - - carnosus 97 03 075 Staphylococcus + + + - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + + + +/-+/- lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + + + + warneri 04 07 185 Staphylococcus < 1 < 1 <1 94 170 ininterprétable gallinarum 85 07 67 15 D'après ce tableau il est possible de remarquer que les souches de S. aureus testées ne sont pas inhibées par la streptomycine à partir de 2.5 mg /1. A ces mêmes concentrations, S. carnosus et S. gallinarum présentent une absence de croissance totale. Cet antibiotique permet donc l'inhibition de certains staphylocoques à coagulase négative sans inhibition de S. aureus. TABLE II Streptomycin at 0 g / I 1 mg / I 1.5 mg / I 2 mg / I 2.5 mg / I 3 mg / I strains growth growth growth growth growth Staphylococcus + + + + 1- - - aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + + + + + + arlettae 92 03 375 Staphylococcus + + - - - - carnosus 97 03 075 Staphylococcus + + + - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + + + + / - + / - lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + + + + warneri 04 07 185 Staphylococcus <1 <1 <1 94 170 uninterpretable gallinarum 85 07 67 15 According to this table it is It may be noted that the S. aureus strains tested are not inhibited by streptomycin from 2.5 mg / l. At these same concentrations, S. carnosus and S. gallinarum show a lack of total growth. This antibiotic therefore allows the inhibition of certain coagulase-negative staphylococci without inhibition of S. aureus.

Exemple 3: Effet de l'Amikacine et de la Néomycine sur la croissance de Staphylococcus aureus et de staphylocoques à coagulase négative en milieu type Chapman. Example 3 Effect of Amikacin and Neomycin on Growth of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci in Chapman Medium.

Une gamme de concentration d'Amikacine ou de Néomycine a été ajoutée à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman mais sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. A concentration range of Amikacin or Neomycin was added to a liquid culture medium having as a base composition Chapman medium but without agar. The pH indicator used is 4-methylumbelliferone. The detection of the acidification of Mannitol is carried out by means of a fluorimeter.

Les milieux testés comprennent respectivement 0 ; 1 ; 1,5 ; 2 mg/1 d'Amikacine et 1 ; 1,5 et 2 mg/1 de Neomycine. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés selon l'échelle suivante : + croissance +/- croissance moyenne - croissance nulle Les résultats sont présentés dans le tableau III ci-dessous :25 TABLEAU III Amikacine Neomycine à 0 g/I 1 mg/I 1.5 mg/I 2 mg/I 1 mg/I 1.5 mg/I 2 mg/I souches croissance croissance croissance croissance croissance croissance croissance Staphylococcus + + + + + - -aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + + aureus 87 1 2 082 Staphylococcus + + + + +1- - - aureus QI 361 Staphylococcus + - - - - - -arlettae 92 03 375 Staphylococcus + - - - +1- +1- +1- carnosus 97 03 075 Staphylococcus + - - - - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + +/-+/- - - - lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + + - - - warneri 04 07 185 D'après ce tableau, l'amikacine permet l'inhibition de la majorité des staphylocoques à coagulase négative sans aucun impact sur la croissance de S. aureus. La neomycine, quant à elle, inhibe les staphylocoques à coagulase négative mais entraîne aussi un retard de croissance des S. aureus. Aussi cet exemple montre qu'en fonction du milieu, l'aminoglycoside et sa concentration sont à adapter. D'autre part, il est aussi envisageable de coupler plusieurs aminoglycosides ensemble en réduisant bien sûr les concentrations de chacun d'eux afin d'augmenter le nombre d'espèces à inhiber. The media tested respectively include 0; 1; 1.5; 2 mg / l Amikacin and 1; 1.5 and 2 mg / l of Neomycin. Microorganisms from the Applicant's collection have been included in these media from a 0.5 McFarland suspension. Media was incubated at 37 ° C for 24 hours. The readings are performed using a fluorimeter after 24 hours of incubation. The results are expressed according to the following scale: + growth +/- average growth - zero growth The results are shown in Table III below: TABLE III Amikacin Neomycin at 0 g / I 1 mg / I 1.5 mg / I 2 mg / I 1 mg / I 1.5 mg / I 2 mg / I strains growth growth growth growth growth Staphylococcus + + + + + - -aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + + aureus 87 1 2 082 Staphylococcus + + + + + 1- - - aureus QI 361 Staphylococcus + - - - - - -arlettae 92 03 375 Staphylococcus + - - - + 1- + 1- + carnosus 97 03 075 Staphylococcus + - - - - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + + / - + / - - - - lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + - - - - warneri 04 07 185 According to this table, amikacin inhibits the majority of staphylococci to coagulase negative without any impact on the growth of S. aureus. Neomycin, in turn, inhibits coagulase-negative staphylococci but also causes growth retardation of S. aureus. Also this example shows that depending on the medium, the aminoglycoside and its concentration are to be adapted. On the other hand, it is also conceivable to couple several aminoglycosides together, of course by reducing the concentrations of each of them in order to increase the number of species to be inhibited.

Exemple 4: Gamme croisée en aminoglycosides et un autre antibiotique la Colistine en milieu type Chapman Différentes concentrations d'Amikacine, de Kanamycine et de Colistine ont été ajoutées à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés sont les suivants : milieu 1 2 3 4 5 6 7 Colistine (en mg/1) 30 40 50 30 40 30 40 Amikacine (en mg/1) 1,5 1,5 1,5 2 2 1,5 1,5 Kanamycine (en mg/1) 0 0 0 0 0 1 1 Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés selon l'échelle suivante : + croissance +/- croissance moyenne - croissance nulle Les résultats sont présentés dans le tableau IV ci dessous : TABLEAU IV milieu 1 2 3 4 5 6 7 souches croissance croissance croissance croissance croissance croissance croissance Staphylococcus + + + + + + + Aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + + aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + +/- - + - +/- - lentus Q I34 Staphylococcus +1- +1- +1- +1- - - - pasteurii 88 06 012 D'après ce tableau, la combinaison de plusieurs antibiotiques permet d'améliorer l'inhibition des staphylocoques à coagulase négative sans inhiber de S. aureus. Ces EXAMPLE 4 Aminooglycoside cross-over and another Colistine antibiotic in Chapman type medium Various concentrations of Amikacin, Kanamycin and Colistin were added to a liquid culture medium having the Chapman medium without agar as base composition. The pH indicator used is 4-methylumbelliferone. The detection of the acidification of Mannitol is carried out by means of a fluorimeter. The media tested are as follows: Medium 1 2 3 4 5 6 7 Colistin (mg / 1) 30 40 50 30 40 30 40 Amikacin (in mg / l) 1.5 1.5 1.5 2 2 1.5 1.5 Kanamycin (in mg / l) 0 0 0 0 0 1 1 Microorganisms from the Applicant's collection were included in these media from a 0.5 McFarland suspension. Media was incubated at 37 ° C for 24 hours. The readings are performed using a fluorimeter after 24 hours of incubation. The results are expressed according to the following scale: + growth +/- average growth - zero growth The results are shown in Table IV below: TABLE IV middle 1 2 3 4 5 6 7 strains growth growth growth growth growth growth Staphylococcus + + + + + + + Aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + + aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + +/- - + - +/- - lentus Q I34 Staphylococcus According to this table, the combination of several antibiotics makes it possible to improve the inhibition of coagulase-negative staphylococci without inhibiting S. aureus. These

Claims (12)

REVENDICATIONS 1. Milieu de culture spécifique pour la croissance, la détection, l'identification et/ou la numération des bactéries staphylocoques à coagulase positive, ledit milieu étant caractérisé par le fait qu'il comporte au moins un composé du type aminoglycoside, à titre d'inhibiteur des bactéries staphylocoques à coagulase négative. A specific culture medium for the growth, detection, identification and / or counting of coagulase-positive staphylococci bacteria, said medium being characterized in that it comprises at least one aminoglycoside-type compound, as a inhibitor of coagulase-negative staphylococcal bacteria. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, dans lequel la concentration en aminoglycoside est comprise entre 0,2 et 10 mg/1 inclus. 2. Culture medium according to claim 1, wherein the aminoglycoside concentration is between 0.2 and 10 mg / l inclusive. 3. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le(s) composé(s) du type aminoglycoside est pris dans le groupe comprenant : l'amikacine, la gentamicine, la kanamycine, la néomycine, la nétilmicine, la paronomycine ou la streptomycine. 3. Culture medium according to one of the preceding claims, wherein the compound (s) of the aminoglycoside type is taken from the group comprising: amikacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, netilmicin, paronomycin or streptomycin. 4. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, comportant en outre de la colistine. 4. Culture medium according to one of the preceding claims, further comprising colistin. 5. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, se présentant sous forme 20 liquide. 5. Culture medium according to one of the preceding claims, being in liquid form. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, comportant en outre un marqueur direct de la croissance des staphylocoques à coagulase positive, ledit marqueur étant un substrat chromogène ou fluorescent. 6. Culture medium according to one of the preceding claims, further comprising a direct marker of the growth of coagulase-positive staphylococci, said marker being a chromogenic or fluorescent substrate. 7. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comportant en outre un substrat et un marqueur indirect de la croissance des staphylocoques à coagulase positive, ledit marqueur étant un indicateur de pH chromogène ou fluorescent. 30 The culture medium according to any one of claims 1 to 5, further comprising a substrate and an indirect marker of growth of coagulase positive staphylococci, said marker being a chromogenic or fluorescent pH indicator. 30 8. Utilisation in vitro d'aminoglycosides dans un milieu de culture sélectif pour limiter la croissance des staphylocoques à coagulase négative et favoriser la croissance des staphylocoques à coagulase positive. 15 25 8. In vitro use of aminoglycosides in a selective culture medium to limit the growth of coagulase-negative staphylococci and promote the growth of coagulase-positive staphylococci. 15 25 9. Utilisation d'un milieu de culture selon les revendications 1 à 7, pour détecter et/ou caractériser et/ou dénombrer des bactéries staphylocoques à coagulase positive dans un échantillon complexe. 9. Use of a culture medium according to claims 1 to 7, for detecting and / or characterizing and / or enumerating coagulase-positive staphylococci bacteria in a complex sample. 10. Utilisation d'un milieu de culture selon les revendications 1 à 7, pour le contrôle microbiologique alimentaire, le contrôle microbiologique de l'environnement ou l'analyse médicale. 10 10. Use of a culture medium according to claims 1 to 7 for microbiological food control, microbiological control of the environment or medical analysis. 10 11. Procédé de croissance, de détection, d'identification et/ou de numération des bactéries staphylocoques à coagulase positive, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : • Ensemencer un milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, avec un échantillon biologique, susceptible de contenir des bactéries staphylocoques à coagulase positive ; 15 • Mettre le milieu de culture ainsi ensemencé dans des conditions aptes à permettre la croissance des bactéries staphylocoques à coagulase positive ; et • Mesurer la variation du niveau de fluorescence dans le milieu de culture à l'aide d'un lecteur de fluorescence, cette variation correspondant à un variation du pH dans ledit milieu de culture. 20 A method of growing, detecting, identifying and / or counting coagulase-positive staphylococcal bacteria, said method comprising the steps of: • Seeding a culture medium according to one of claims 1 to 7, with a biological sample, which may contain coagulase-positive staphylococci bacteria; • Place the culture medium thus seeded in conditions that allow the growth of coagulase-positive staphylococci bacteria; and measuring the variation of the fluorescence level in the culture medium using a fluorescence reader, this variation corresponding to a variation of the pH in said culture medium. 20 12. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon clinique, alimentaire ou environnemental.5 12. Method according to the preceding claim, wherein the biological sample is a clinical sample, food or environmental.5
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