FR2920155A1

FR2920155A1 - Preparing sterile collagen comprises preparing purified acid solution of collagen, sterilizing the solution, precipitating the sterile solution in the form of suspension, and concentrating the collagen suspension

Info

Publication number: FR2920155A1
Application number: FR0757145A
Authority: FR
Inventors: Jean Louis Tayot; Florent Sapin
Original assignee: KHORIONYX SARL
Current assignee: KHORIONYX SARL
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2009-02-27
Anticipated expiration: 2027-08-23
Also published as: FR2920155B1

Abstract

Process for preparing sterile collagen, preferably injectable collagen, comprises: preparing purified acid solution of collagen; sterilizing the solution, preferably by filtration on a filter or a sterilizing membrane; precipitating the sterile solution in the form of suspension; and concentrating the collagen suspension, where the suspension is placed in a flexible elongated tubular filter having a porous filtering wall, the filter is fluid permeable but not permeable to collagen fiber, and the suspension is concentrated by slow passage of fluid through the wall. Process for preparing sterile collagen, preferably injectable collagen, comprises: preparing purified acid solution of collagen; sterilizing the solution, preferably by filtration on a filter or a sterilizing membrane; precipitating the sterile solution in the form of suspension; and concentrating the collagen suspension, where the suspension is placed in a flexible elongated tubular filter having a porous filtering wall, the filter is fluid permeable but not permeable to collagen fiber, and the suspension is concentrated by slow passage of fluid through the wall without any pressure other than gravity to avoid clogging of the filtering wall by the collagen fibers.

Description

1 Procédé de concentration stérile de préparations de collagènes et1 Process for sterile concentration of collagen preparations and

préparations de collagène obtenues Collagen preparations obtained

La présente invention a trait à un procédé de concentration stérile de préparations de collagènes, notamment de collagènes de type I, II, III, IV,V, ou autres types dits mineurs, ou leurs mélanges par exemple de type 1+111, ces collagènes pouvant être d'origine animale, par exemple bovine ou porcine, ou humaine, et alors, de préférence d'origine placentaire ou dermique, le terme de collagène incluant naturellement les collagènes obtenus par synthèse, par exemple par expression dans des organismes recombinants. Les préparations de collagène, sous différentes formes injectables ou implantables, sont bien connues, comme le décrivent, par exemple, les brevets US 3,949,073 aux noms de Daniels et Knapp et US 4,488,911 aux noms de Luck et Daniels, qui sont à l'origine de la création de la société Collagen Corporation en 15 Californie et des implants de collagène bovin Zyderm . La difficulté bien connue pour préparer ces implants injectables est de réaliser leur concentration dans des conditions rigoureusement stériles. La concentration de solutions acides de collagène dans des boyaux de dialyse est décrite dans le brevet US 3949073, par absorption de l'eau grâce à un 20 tissu absorbant placé autour d'un tube de dialyse. Cependant, cette technique ne permet pas la préparation d'un produit physiologique directement injectable. La neutralisation du gel acide par dialyse contre une solution physiologique n'est pas envisagée, probablement à cause de la difficulté et du temps nécessaire pour dialyser une solution très visqueuse de collagène concentré. Par exemple, 25 lorsqu'une solution concentrée de collagène est soumise à la dialyse, la pression oncotique très élevée du gel de collagène entraîne rapidement un afflux de liquide dans le boyau qui peut éclater. En outre, cet afflux de liquide dilue le collagène et en diminue la concentration, rendant cette technique inopérante. Le même brevet mentionne que les suspensions fibrillaires de collagène sont concentrées par 30 centrifugation. Dans le brevet US 4,488,911, les deux extraits ci-dessous, donnent un état de l'art dans les années 1980, qui est encore pratiqué actuellement : 2 "Selon une technique simplifiée, le collagène en solution est dialysé contre une solution diluée d'acide carboxylique (...) à température ambiante, puis dialysé par cisaillement à rotation contre une solution diluée alcaline de .phosphate, par exemple une solution de phosphate de disodium à 0,02 M pendant'une période suffisante, jusqu'à ce que des micropolymères se forment. Généralement, 2 à 8 heures (de préférence, environ 4 à 6 heures) à température ambiante sont nécessaires, bien que des températures d'environ 15 C à 40 C peuvent être utilisées. Les NFMs qui sont formés sont collectés par centrifugation, lavés avec de l'eau et stockés. Les gammes discutées précédemment sont applicables à cette procédure. Après retrait du sac de dialyse de la solution, les micropolymères fibreux sont collectés par centrifugation. Ils peuvent être ensuite utilisés directement ou stockés humides à 4 C ou, de façon alternative, lyophilisés pour une période de stockage indéfinie." La collecte des fibres de collagène et leur concentration par centrifugation posent cependant le problème majeur de réaliser ces opérations sans risque d'introduire des agents infectieux contaminants, d'altérer ainsi le contenu des seringues sans garantie de stérilité bactérienne et fungique. En effet, la centrifugation suppose de répartir la suspension collagénique en godets de centrifugation préalablement stérilisés, de les introduire dans une machine non stérile, généralement en dehors du local stérile et de les ouvrir en fin de centrifugation, sans réintroduire de microbes dans le produit ou le local stérile qui le protège. La validation des conditions stériles dans un tel procédé est très difficile et les opérations manuelles nécessaires sont longues, très délicates, risquées et coûteuses. L'assurance de stérilité finale du produit injectable s'en trouve réduite, ce qui peut entraîner certaines infections locales et réactions d'intolérance après l'injection. Le brevet US 5,002,071 au nom de Harrell, apporte une solution au problème de la stérilité en soumettant le collagène injectable à une stérilisation finale par irradiation. Cependant, outre les risques d'altération du collagène, cette technique n'apporte pas de solution à l'élimination physique des microbes introduits lors des opérations manuelles. Certes ces microbes sont tués par l'irradiation, mais l'absence de corps bactériens n'est pas garantie et de ce fait des réactions pyrogènes à l'injection de ces produits ne peuvent être exclues. La présente invention concerne, notamment mais non exclusivement, les préparations injectables, en particulier pour le comblement des tissus, dont une application importante consiste dans le comblement des rides cutanées. On connaît déjà des procédés de préparation de collagène à partir de tissus animaux ou humains, par exemple le placenta humain. Ces procédés sont décrits, par exemple, dans les trois documents précédents et beaucoup d'autres cités en particulier dans le brevet US 5,436,135 aux noms de Tayot et Tardy. The present invention relates to a process for the sterile concentration of collagen preparations, especially collagens of type I, II, III, IV, V, or other so-called minor types, or their mixtures, for example of type 1 + 111, these collagens. which may be of animal origin, for example bovine or porcine, or human, and then, preferably of placental or dermal origin, the term collagen naturally including collagens obtained by synthesis, for example by expression in recombinant organisms. Collagen preparations, in various injectable or implantable forms, are well known, as described, for example, in U.S. Patent Nos. 3,949,073 to Daniels and Knapp and US 4,488,911 to Luck and Daniels, who are at the origin of the creation of Collagen Corporation in California and Zyderm bovine collagen implants. The well-known difficulty in preparing these injectable implants is to achieve their concentration under rigorously sterile conditions. The concentration of acid solutions of collagen in dialysis casings is described in US Patent 3949073, by absorbing water through an absorbent tissue placed around a dialysis tube. However, this technique does not allow the preparation of a directly injectable physiological product. Neutralization of the acid gel by dialysis against a physiological solution is not contemplated, probably because of the difficulty and time required to dialyze a highly viscous solution of concentrated collagen. For example, when a concentrated solution of collagen is subjected to dialysis, the very high oncotic pressure of the collagen gel rapidly causes an influx of liquid into the casing which can burst. In addition, this influx of liquid dilutes the collagen and decreases the concentration, making this technique inoperative. The same patent mentions that fibrillar suspensions of collagen are concentrated by centrifugation. In US Patent 4,488,911, the two extracts below, give a state of the art in the 1980s, which is still practiced today: 2 "According to a simplified technique, the collagen in solution is dialyzed against a diluted solution of carboxylic acid (...) at room temperature, then dialysed by rotary shear against a dilute alkaline solution of phosphate, for example a solution of 0.02 M disodium phosphate for a sufficient period of time, until Micropolymers are formed Generally 2 to 8 hours (preferably about 4 to 6 hours) at room temperature are required, although temperatures of about 15 to 40 ° C can be used The NFMs that are formed are collected by centrifugation, washed with water and stored.The ranges discussed previously are applicable to this procedure.After removal of the dialysis bag from the solution, the fibrous micropolymers are collected by c. They can then be used directly or stored wet at 4 C or, alternatively, freeze-dried for an indefinite storage period. " The collection of collagen fibers and their concentration by centrifugation, however, pose the major problem of carrying out these operations without the risk of introducing contaminating infectious agents, thus altering the contents of the syringes without guarantee of bacterial and fungal sterility. In fact, the centrifugation involves distributing the collagen suspension in pre-sterilized centrifugation cups, introducing them into a non-sterile machine, generally outside the sterile room and opening them at the end of centrifugation, without reintroducing microbes into the product or the sterile local that protects it. Validation of sterile conditions in such a process is very difficult and the necessary manual operations are long, very delicate, risky and expensive. The assurance of final sterility of the injectable product is reduced, which can lead to some local infections and intolerance reactions after injection. No. 5,002,071 to Harrell, provides a solution to the problem of sterility by subjecting the injectable collagen to final sterilization by irradiation. However, in addition to the risks of altering collagen, this technique does not provide a solution to the physical elimination of microbes introduced during manual operations. While these microbes are killed by irradiation, but the absence of bacterial bodies is not guaranteed and therefore pyrogenic reactions to the injection of these products can not be excluded. The present invention relates, in particular but not exclusively, to injectable preparations, in particular for the filling of tissues, an important application of which is the filling of skin wrinkles. Methods for the preparation of collagen from animal or human tissues, for example the human placenta, are already known. These methods are described, for example, in the three previous documents and many others cited in particular in US Pat. No. 5,436,135 to Tayot and Tardy.

Les étapes habituelles consistent en des lavages des tissus à traiter, leur digestion partielle par des protéases telles que la pepsine ou la trypsine, l'extraction et la purification du collagène acido- soluble par des précipitations salines. Le collagène obtenu, par exemple sous forme précipitée ou sous forme de poudre séchée, est ensuite dissout dans une solution acide, par exemple pour subir une stérilisation par filtration sur une membrane stérilisante. Cette solubilisation se fait en générai à une faible concentration de 1 à 3 mg/ml, pour obtenir une viscosité réduite permettant la filtration stérilisante. Comme l'indique l'état de l'art déjà cité, la préparation de suspensions fibrillaires, concentrées, stériles et injectables implique ultérieurement une reprécipitation du collagène formant une suspension extrêmement diluée. Celle-ci est très difficile à filtrer ou à concentrer dans des conditions aseptiques rigoureuses, pour obtenir une suspension injectable stérile à une concentration de l'ordre de 30 à 60 mg/ml (soit 3 à 6 %). En effet, le collagène en suspension colmate très rapidement les filtres et dans tous les cas, la récupération de la pâte sur les filtres habituels est très difficile. Généralement, comme discuté précédemment, on effectue donc cette concentration par centrifugation, ce qui, compte tenu des volumes importants à concentrer, représente des opérations manuelles longues, très délicates et impliquant de toute façon des risques de rupture de la stérilité, lors des opérations hors zone stérile. The usual steps are washing of the tissues to be treated, partial digestion by proteases such as pepsin or trypsin, extraction and purification of acid-soluble collagen by salt precipitation. The collagen obtained, for example in precipitated form or in the form of a dried powder, is then dissolved in an acid solution, for example to undergo sterilization by filtration on a sterilizing membrane. This solubilization is generally done at a low concentration of 1 to 3 mg / ml, to obtain a reduced viscosity for sterilizing filtration. As indicated by the state of the art already cited, the preparation of fibrillar, concentrated, sterile and injectable suspensions subsequently involves reprecipitation of the collagen forming an extremely dilute suspension. This is very difficult to filter or concentrate under strict aseptic conditions, to obtain a sterile injectable suspension at a concentration of the order of 30 to 60 mg / ml (ie 3 to 6%). In fact, the collagen in suspension clogs the filters very quickly and in any case, the recovery of the dough on the usual filters is very difficult. Generally, as discussed above, this concentration is therefore carried out by centrifugation, which, given the large volumes to be concentrated, represents long manual operations, very delicate and in any case involving the risk of sterility breaking, in operations outside sterile area.

La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients, et de fournir un procédé de concentration simple, rapide et n'impliquant pas de transfert entre diverses installations, de sorte que l'étape de concentration, ainsi que la répartition finale dans des récipients stériles, peut être effectuée dans le même 4 environnement stérile, par exemple dans une enceinte ou sous une hotte stérile à flux laminaire vertical ou horizontal. L'invention a pour objet un procédé de préparation de collagène stérile, notamment de collagène injectable, comprenant les étapes de préparation d'une solution acide purifiée de collagène, de stérilisation de cette solution, notamment par filtration sur un filtre ou une membrane stérilisante, de précipitation de la solution stérile sous forme de suspension, et de concentration de la suspension de collagène, procédé dans lequel ladite suspension est placée dans un filtre tubulaire souple allongé constituant une paroi filtrante poreuse, perméable au liquide, mais non perméable aux fibres de collagène, et est concentrée par passage lent du liquide à travers ladite paroi, sans pression autre que la pesanteur, pour éviter le colmatage de la paroi filtrante par les fibres de collagène. Le passage du liquide peut être augmenté, notamment en fin de concentration par absorption du liquide par une couche absorbante, préalablement stérilisée, appliquée sur ladite paroi, ou faisant partie de celle-ci. Dans ce cas, le liquide est relargué à l'extérieur de la couche absorbante en s'écoulant de la couche absorbante lorsqu'elle est saturée, ou/et s'évaporant au contact d'un flux d'air stérile. Dans une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, lesdites étapes sont conduites dans un même environnement stérile, dans lequel, de préférence, on peut aussi conduire les étapes préalables de filtration stérile du collagène purifié et/ou ultérieures de répartition du collagène concentré en récipients ou seringues stériles. En effet, le faible encombrement des moyens de concentration selon l'invention, permet de procéder à toutes ces opérations, par exemple, dans une même enceinte ou hotte stérile à flux d'air stérile par un dispositif automatique, sous le contrôle d'un opérateur au début et à la fin de la concentration. De préférence, ladite paroi perméable est constituée d'une simple nappe filtrante souple, de forme tubulaire, pouvant être obturée à son extrémité inférieure et contenir la suspension de collagène. Ladite nappe peut être, à sa face opposée, en contact avec ladite couche absorbante, par exemple une nappe de cellulose ou de papier absorbant préalablement stérilisée par irradiation. The present invention proposes to overcome these disadvantages, and to provide a method of concentration simple, fast and not involving transfer between various facilities, so that the concentration step, as well as the final distribution in sterile containers can be carried out in the same sterile environment, for example in an enclosure or under a sterile vertical or horizontal laminar flow hood. The subject of the invention is a process for preparing sterile collagen, in particular injectable collagen, comprising the steps of preparing a purified acid solution of collagen, sterilizing this solution, in particular by filtration on a filter or a sterilizing membrane, precipitating the sterile suspension solution, and concentrating the collagen suspension, wherein said suspension is placed in an elongated flexible tubular filter constituting a porous, liquid-permeable, but non-permeable collagen fiber filter wall and is concentrated by slow passage of liquid through said wall, without pressure other than gravity, to prevent clogging of the filter wall by the collagen fibers. The passage of the liquid can be increased, especially at the end of the concentration by absorption of the liquid by an absorbent layer, previously sterilized, applied to said wall, or part of it. In this case, the liquid is salted out of the absorbent layer by flowing from the absorbent layer when it is saturated, and / or evaporating on contact with a sterile air flow. In a particularly preferred embodiment of the invention, said steps are carried out in the same sterile environment, in which, preferably, it is also possible to carry out the preliminary stages of sterile filtration of the purified collagen and / or subsequent distribution of the concentrated collagen. in sterile containers or syringes. Indeed, the small size of the concentration means according to the invention makes it possible to carry out all these operations, for example, in the same enclosure or sterile sterile airflow hood by an automatic device, under the control of a operator at the beginning and at the end of the concentration. Preferably, said permeable wall consists of a simple, flexible, tubular-shaped filter sheet which can be closed at its lower end and contain the collagen suspension. Said sheet may be, on its opposite face, in contact with said absorbent layer, for example a sheet of cellulose or paper absorbent previously sterilized by irradiation.

En allongeant suffisamment un tel tube, et en le connectant au réservoir stérile contenant la suspension à concentrer, on peut de manière surprenante obtenir une concentration progressive d'un flux continu de suspension. La porosité, ou le maillage dans le cas d'un tissu textile, doit être telle que le liquide aqueux traverse facilement la paroi alors que le collagène a tendance à la colmater. L'humidité dans la paroi s'évacue spontanément par suintement, en l'absence de pression autre que la simple pesanteur. Plus le précipité de collagène est fin, plus la porosité de la paroi ou nappe filtrante doit être réduite. Pour les précipités les plus fins, celle ci peut être par exemple un tissu textile dont les fils sont très serrés et offrent une porosité estimée à 1 micron par le fabricant. Pour les précipités les plus structurés ou à larges fibrilles, une porosité allant jusqu'à environ 100 microns peut être utilisée. Le liquide peut aussi être pris en charge par la couche absorbante, si elle est présente, par exemple en fin de concentration, et parvient à la paroi extérieure de celle-ci, où elle s'écoule ou s'évapore. Le matériau formant ladite couche absorbante doit être tel qu'il absorbe cette humidité mais sans la retenir à demeure, de sorte que lorsqu'il est saturé, il relargue facilement cette humidité à sa face opposée, éloignée de ladite paroi perméable au liquide aqueux de la suspension. La couche absorbante peut être, par exemple, un papier filtre usuel en cellulose, ou en d'autres polymères hydrophiles de type polyesters ou autres, en une ou plusieurs épaisseurs, préalablement stérilisé par irradiation bêta ou gamma. Le dispositif mettant en oeuvre l'invention peut comporter un moyen, récipient ou conduit de recueil du liquide qui s'écoule, ou encore un dispositif de ventilation pour évaporer le liquide à la paroi externe de ladite couche absorbante. On peut aussi prévoir de créer un vide partiel autour de ladite paroi externe, en fin de concentration. L'invention a également pour objet les préparations stériles concentrées de collagène obtenues, et notamment de collagène injectable, par exemple pour le 30 comblement des tissus, par exemple les rides cutanées. Au lieu d'une préparation injectable, on peut, cependant aussi continuer à traiter le collagène, à partir de la suspension concentrée obtenue, pour préparer d'autres matériaux collagéniques implantables, solides ou non, et stériles ou stérilisables. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Exemple 1: Concentration d'une suspension de précipité neutre de collagène fibrillaire By sufficiently extending such a tube, and connecting it to the sterile reservoir containing the suspension to be concentrated, it is surprisingly possible to obtain a progressive concentration of a continuous flow of suspension. The porosity, or the mesh in the case of a textile fabric, must be such that the aqueous liquid easily passes through the wall while the collagen tends to clog it. The moisture in the wall is evacuated spontaneously by oozing, in the absence of pressure other than simple gravity. The finer the collagen precipitate, the more the porosity of the wall or filter layer must be reduced. For the finest precipitates, it may be for example a textile fabric whose son are very tight and have an estimated porosity of 1 micron by the manufacturer. For the most structured or broad fibril precipitates, porosity up to about 100 microns may be used. The liquid can also be supported by the absorbent layer, if it is present, for example at the end of concentration, and reaches the outer wall thereof, where it flows or evaporates. The material forming said absorbent layer must be such that it absorbs this moisture but does not retain it permanently, so that when it is saturated, it easily relapses this moisture to its opposite face, remote from said wall permeable to the aqueous liquid of suspension. The absorbent layer may be, for example, a filter paper customary cellulose, or other hydrophilic polymers of polyester or other type, in one or more thicknesses, previously sterilized by beta or gamma irradiation. The device embodying the invention may comprise a means, container or conduit for collecting the liquid that flows, or a ventilation device for evaporating the liquid to the outer wall of said absorbent layer. It is also possible to create a partial vacuum around said outer wall at the end of concentration. The subject of the invention is also the concentrated sterile preparations of collagen obtained, and in particular of injectable collagen, for example for the filling of tissues, for example cutaneous wrinkles. Instead of an injectable preparation, it is possible, however, also continue to treat the collagen, from the concentrated suspension obtained, to prepare other implantable collagen materials, solid or otherwise, and sterile or sterilizable. Other advantages and features of the invention will appear on reading the following description, given by way of non-limiting example. Example 1 Concentration of a suspension of neutral precipitate of fibrillar collagen

Une solution acide de collagène de type 1 ou 1+111, de pH compris entre 2 et 10 3, est préparée par dissolution d'une poudre lyophilisée ou acétonique de fibres de collagène en acide chlorhydrique 0,02N. Cette poudre peut être d'origine commerciale ou préparée selon l'enseignement des brevets déjà cités, dont en particulier le brevet US 5,436,135. La solution d'un volume de 1,5 litre est ajustée à une concentration en collagène de 3 gll. Elle est filtrée stérilement sur une 15 membrane en acétate de cellulose, de porosité 0,22 à 0,45 micron pour éliminer les bactéries et autres microbes éventuellement présents dans le produit de départ. La solution filtrée est recueillie dans un flacon stérile, sous une hotte à flux laminaire stérile et ne quittera plus cet espace avant d'être concentrée et répartie en seringues. Tous les accessoires nécessaires sont stérilisés par irradiation 20 préalable à 30 kGray. La solution acide filtrée est ensuite réchauffée à une température de 20 à 25 C, puis additionnée de phosphate disodique Na2HPO4, 12H2O, pour atteindre une concentration finale de 20 mM, ce qui entraîne une précipitation du collagène sous forme colloïdale, puis fibrillaire. La précipitation est complétée par ajustement du pH à 7,2 avec de la soude NaOH 1 N. 25 La suspension diluée de fibrilles de collagène est ensuite introduite par gravité dans un entonnoir réservoir relié au tube de toile filtrante, lui-même fermé à l'autre extrémité par une pince. La toile filtrante commercialisée par la société de droit helvétique Sefar Fyltis, située à Freibach CH 9425 Thal, sous la référence Nycom PA 1 42072 AC, 03-1/1, de vide de maille 1 micron, convient parfaitement 30 à cette application. Cette toile peut être réalisée sous la forme d'un tube continu, de diamètre interne de 10 à 60 mm, dont les côtés sont soudés par ultrasons. La référence du produit choisi est un tube Sefar Nitex 03-1/1, de diamètre 20 mm. Pour un diamètre de tube filtrant de 20 mm et une longueur de 60 cm, il est5 possible de concentrer jusqu'à environ 20 fois la suspension de 1,5 litre de collagène, en une nuit. Le lendemain matin, le réservoir de collagène à filtrer est vide. La concentration finale dans le tube filtrant peut ensuite être complétée par entourage du tube avec un enroulement de papier filtre en cellulose. Il est ainsi possible de préparer un gel fibrillaire, sans bulles d'air, à une concentration de 3 à 6 %. Le gel fibrillaire de collagène stérile étant contenu dans un tube cylindrique, son transfert dans un récipient stérile peut se faire par simple pression manuelle sur les parois souples du tube. La répartition stérile du gel de collagène en seringues de l ml, par une machine automatique, sous le flux stérile, s'en trouve ainsi facilitée. L'augmentation d'échelle est facilement réalisée par l'addition côte à côte de plusieurs systèmes filtrants identiques dans l'enceinte stérile. Ces systèmes peuvent être reliés à un même réservoir contenant plusieurs dizaines de litres de la suspension à concentrer. An acidic solution of collagen type 1 or 1 + 111, with a pH of between 2 and 10 3, is prepared by dissolving a lyophilized or acetonic powder of collagen fibers in 0.02N hydrochloric acid. This powder may be of commercial origin or prepared according to the teaching of the aforementioned patents, in particular US Patent 5,436,135. The solution of 1.5 liter volume is adjusted to a collagen concentration of 3 gll. It is sterilely filtered through a 0.22 to 0.45 micron cellulose acetate membrane to remove bacteria and other microbes possibly present in the starting material. The filtered solution is collected in a sterile flask under a sterile laminar flow hood and will not leave this space until it is concentrated and dispensed into syringes. All necessary accessories are sterilized by irradiation prior to 30 kGray. The filtered acid solution is then warmed to a temperature of 20 to 25 C, then added disodium phosphate Na2HPO4, 12H2O, to reach a final concentration of 20 mM, which causes a colloidal collagen precipitation, then fibrillar. Precipitation is completed by adjusting the pH to 7.2 with 1N NaOH NaCl. The dilute suspension of collagen fibrils is then introduced by gravity into a reservoir funnel connected to the filter cloth tube, which is closed at the same time. other end by a clamp. The filter cloth marketed by the Swiss company Sefar Fyltis, located at Freibach CH 9425 Thal, under the reference Nycom PA 1 42072 AC, 03-1 / 1, 1 micron mesh vacuum, is perfectly suitable for this application. This fabric can be made in the form of a continuous tube, with an internal diameter of 10 to 60 mm, the sides of which are ultrasonically welded. The reference of the chosen product is a Sefar Nitex 03-1 / 1 tube, with a diameter of 20 mm. For a filter tube diameter of 20 mm and a length of 60 cm, it is possible to concentrate up to about 20 times the 1.5 liter suspension of collagen overnight. The next morning, the collagen reservoir to be filtered is empty. The final concentration in the filter tube can then be completed by surrounding the tube with a cellulose filter paper winding. It is thus possible to prepare a fibrillar gel, without air bubbles, at a concentration of 3 to 6%. The fibrillar gel of sterile collagen being contained in a cylindrical tube, its transfer into a sterile container can be done by simple manual pressure on the flexible walls of the tube. The sterile distribution of the collagen gel in 1 ml syringes by an automatic machine under the sterile flow is thus facilitated. The increase in scale is easily achieved by the side-by-side addition of several identical filter systems in the sterile enclosure. These systems can be connected to the same tank containing several tens of liters of the suspension to be concentrated.

L'intérêt majeur de ce procédé est qu'il ne nécessite qu'un minimum d'opérations manuelles et s'effectue exclusivement dans l'enceinte stérile. Le niveau de stérilité final obtenu est donc optimal. The major advantage of this process is that it requires only a minimum of manual operations and is carried out exclusively in the sterile enclosure. The final level of sterility obtained is therefore optimal.

Exemple 2 : Concentration d'une suspension de précipité acide de collagène 20 Certains collagènes comme le collagène de type IV, ne forment pas de précipité fibrillaire en présence de phosphate à pH neutre. Pour ce collagène, comme pour tous les autres types fibrillaires ou non, une précipitation acide par addition de NaCl, à une concentration finale de 40 à 50 gll est possible. Example 2: Concentration of Acid Collagen Precipitate Suspension Certain collagens such as type IV collagen do not form a fibrillar precipitate in the presence of neutral pH phosphate. For this collagen, as for all other fibrillar types or not, an acid precipitation by addition of NaCl at a final concentration of 40 to 50 gll is possible.

25 Le précipité acide de l'un quelconque des types de collagène peut alors être récolté par le même mode opératoire que dans l'exemple 1. Si la solution initiale acide a été filtrée stérilement sur membranes de porosité 0,22 ou 0,45 micron, on obtient en final un précipité concentré stérile. Ce précipité acide concentré est contenu dans le tube filtrant qui peut ensuite être fermé à sa partie 30 supérieure, comme à sa partie inférieure, puis baigné dans une solution physiologique de pH neutre si nécessaire, pour en corriger lentement le pH. L'avantage majeur par rapport à un tube de dialyse est que la paroi de ce tube filtrant laisse passer l'eau par filtration (et non pas par osmose très lente) et ne 8 risque donc pas d'éclater. Pour la même raison, l'effet osmotique de dilution est largement évité et la préparation de concentrés acides ou neutres de tous les types de collagène est ainsi. possible. Ces concentrés peuvent servir à la fabrication des biomatériaux 5 coflagéniques connus, gels, films, éponges, granules, lentilles optiques, matériaux imprégnés, selon les techniques connues et publiées.The acidic precipitate of any of the collagen types can then be harvested by the same procedure as in Example 1. If the initial acidic solution was sterile filtered on membranes of 0.22 or 0.45 micron porosity finally, a sterile concentrated precipitate is obtained. This concentrated acidic precipitate is contained in the filter tube which can then be closed at its upper part, as at its lower part, then bathed in a physiological solution of neutral pH if necessary, to slowly correct the pH. The major advantage over a dialysis tube is that the wall of this filter tube allows the water to pass through filtration (and not by very slow osmosis) and therefore can not burst. For the same reason, the osmotic effect of dilution is largely avoided and the preparation of acidic or neutral concentrates of all types of collagen is as well. possible. These concentrates can be used for the production of known coflagenic biomaterials, gels, films, sponges, granules, optical lenses, impregnated materials, according to known and published techniques.

Claims

1. A process for preparing sterile collagen, especially injectable collagen, comprising the steps of preparing a purified acid solution of collagen, sterilizing this solution, in particular by filtration on a filter or a sterilizing membrane, precipitation of the collagen, sterile solution in suspension form, and concentration of the collagen suspension, wherein said suspension is placed in an elongated flexible tubular filter constituting a porous, liquid-permeable but non-permeable collagen fiber filter wall, and is concentrated by slowly passing the liquid through said wall, without pressure other than gravity, to prevent clogging of the filter wall by the collagen fibers.

2. The method of claim 1 wherein the liquid is absorbed by an absorbent layer, previously sterilized, applied to said wall, or part thereof, and salted out of said absorbent layer.

The method of claim 2, wherein said absorption is effected toward the end of the concentration.

4. Method according to one of claims 1 to 3, wherein said steps are conducted in the same sterile environment, including a sterile hood.

5. The method according to claim 4, wherein the prior steps of obtaining the purified collagen and / or subsequent distribution of the concentrated collagen in sterile containers or syringes are also conducted in the same sterile environment.

6. Method according to one of claims 1 to 5, wherein said tubular filter is formed by a textile web.

7. Method according to one of claims 1 to 6, wherein the filter has a porosity of about 1 micron.

8. Method according to one of claims 2 to 5, wherein the absorbent layer is selected from cellulose, hydrophilic polyesters and other hydrophilic polymers.

9. Method according to one of claims 1 to 8, wherein there is a means for collecting liquid flowing from said side remote from said absorbent layer, and / or a device for evaporation of said liquid.

10. Concentrated sterile preparations of collagen, in particular of injectable collagen, in particular for filling the tissues, or skin wrinkles, obtained by the process according to any one of the preceding claims.